TWI860394B - Ｒｎａ作用抑制劑及其利用 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種基於RNA干擾或ASO的目標RNA之作用抑制劑。關於RNA干擾劑，係具備針對目標RNA之隨從股(passenger strand)及引導股(guide strand)，前述隨從股與前述引導股配對而成之雙股RNA的兩端係構成平端， 且使其於以下(a)及(b)： (a)前述隨從股的5’末端側及3’末端側 (b)前述引導股的3’末端側 具備選自由以下式(1)及(2)表示之單元所成群組的1種或2種以上； (惟，X表示氧原子或硫原子)；

Description

RNA作用抑制劑及其利用

(相關申請案之相互參照) 本案係基於2019年8月23日所申請之日本專利申請案之日本特願2019-153235，主張其優先權，此申請案的所有內容係載入本案以供引用。 本說明書係有關於一種以RNA為目標之更實用的RNA之作用抑制劑。

業界目前已有人著手開發將以RNA為目標之siRNA或反義寡核苷酸(ASO)等的小分子RNA作為有效成分的RNA藥劑。為了提高此種RNA藥劑在生物體內的穩定性或輸送性等，已有人嘗試對RNA進行各種化學修飾(專利文獻1)。 [先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本特開2019-30312號公報

[發明所欲解決之課題]

然而，現況在於對於核酸酶耐性或RNA藥劑的基因減弱效應(knockdown effect)具實效性之化學修飾的樣態尚未充分獲得研究。對於siRNA，尚有抑制其脫靶效應之必要。本說明書係提供一種具有作為基於RNA干擾或ASO的目標RNA之作用抑制劑等之更具有用性的化學修飾形態之寡核苷酸及其利用等。

本案發明人等發現，作為替代寡核苷酸中的核糖/去氧核糖之骨架要素，使用在具有碳原子數為3個的鏈狀部分之L-蘇胺醇(Threoninol)經由醯胺鍵而具有鹼基類似物的構成單元及/或在絲胺醇經由醯胺鍵而具有鹼基類似物的構成單元，並藉由將該構成單元導入至作為siRNA之雙股寡核苷酸的3’末端及5’末端，可提升其核酸酶耐性並同時抑制脫靶效應，甚而可提高在靶活性。

又，本案發明人等亦發現，在作為反義miRNA寡核苷酸(AMO)之單股RNA亦具有上述構成單元的寡核苷酸可發揮高反義效應。

進而，本案發明人等亦發現其係有用於作為具有上述構成單元之間隔體。

再者，本案發明人等亦發現，具有上述構成單元等的信標探針係有用於miRNA之檢測。

本說明書係基於以上見解而以下提供手段：

[1]一種RNA干擾劑，其中， 其係具備針對目標RNA之隨從股及引導股， 前述隨從股與前述引導股配對而成之雙股RNA的兩端係構成平端， 且於以下(a)及(b)： (a)前述隨從股的5’末端側及3’末端側 (b)前述引導股的3’末端側 具備選自由以下式(1)及(2)表示之單元所成群組的1個或2個以上； (惟，X表示氧原子或硫原子)； (惟，X表示氧原子或硫原子)。 [2]如[1]之RNA干擾劑，其中， 於前述(a)具備式(2)表示之單元， 於前述(b)具備式(1)表示之單元。 [3]如[1]或[2]之RNA干擾劑，其中前述單元係具備可提升選自由RNase耐性、在靶活性及抑制脫靶活性所成群組的1種或2種以上之種類及個數。 [4]如[1]～[3]中任一項之RNA干擾劑，其係以抑制NeK2基因的表現為目的。 [5]一種方法，其係利用RNA雙股來抑制目標基因的表現，該RNA雙股係具備針對目標RNA之隨從股及引導股， 前述隨從股與前述引導股配對而成之雙股RNA的兩端係構成平端， 且於以下(a)及(b)： (a)前述隨從股的5’末端側及3’末端側 (b)前述引導股的3’末端側 具備選自由以下式(1)及(2)表示之單元所成群組的1個或2個以上； (惟，X表示氧原子或硫原子)； (惟，X表示氧原子或硫原子)。 [6]一種反義核酸，其中， 其係具備針對目標RNA之反義股， 前述反義股係包含選自由以下式(1)及式(2)表示之單元所成群組的1個或2個以上，且具備可與前述目標RNA專一性地進行雜交之雜交區； (惟，X表示氧原子或硫原子)； (惟，X表示氧原子或硫原子)。 [7]如[6]之反義核酸，其中前述目標RNA為miRNA。 [8]一種反義核酸，其係具備： 反義股，其係針對目標RNA；及 2條側鏈，其係於前述反義股的兩末端分別包含選自由以下式(1)及式(2)表示之單元所成群組的1個或2個以上； (惟，X表示氧原子或硫原子)； (惟，X表示氧原子或硫原子)。 [9]一種目標RNA之檢測劑，其係具備： 探針股，其係包含選自由以下式(1)及式(2)表示之單元所成群組的1個或2個以上，且具有可與目標RNA專一性地進行雜交之雜交區；及具備： 訊息要素，其顯示前述探針股與前述目標RNA進行雜交； (惟，X表示氧原子或硫原子)； (惟，X表示氧原子或硫原子)。

[實施發明之形態]

本說明書之揭示內容係有關於一種以RNA為目標之更具實用性RNA之作用抑制劑。根據本說明書所揭示之RNA干擾劑，可提供一種可提升核酸酶耐性與在靶活性並同時可抑制脫靶效應之實用性優良的RNA干擾劑。

又，根據本說明書所揭示之ASO劑，能有助於提升例如以miRNA為目標RNA之ASO之AMO或間隔體的實用性。

再者，根據本說明書所揭示之目標RNA之檢測劑，能有助於提升關於檢測出目標RNA的實用性。

以下針對本案內容的代表性且非限定性具體實例，適宜參照圖式詳細加以說明。此詳細之說明僅單純意圖對本業者表示供實施本案內容之較佳實例的細節，而非意圖限定本案內容的範圍。又，以下所揭示之追加的特徵以及揭示係為了提供進一步獲改善之RNA作用抑制劑及其利用，係有別於其他特徵或揭示，或可與之共用。

此外，以下詳細說明中所揭示之特徵或步驟的組合，在以最廣意義實施本案內容時非為必須者，尤其是僅為了說明本案內容的代表性具體例而記載者。再者，上述及下述代表性具體例的各種特徵，以及獨立項及附屬項所記載者的各種特徵，在提供本案內容之追加且有用的實施形態時，並非必須如此處所記載之具體例，或如所列舉之順序般地組合。

本說明書及/或請求項所記載的所有特徵係有別於實施例及/或請求項所記載之特徵的構成，就對於起初申請時之揭示以及所請求之特定事項之限定，係意圖個別且彼此獨立地揭示。再者，與所有數值範圍及群組或群體有關之記載，就對於起初申請時之揭示以及所請求之特定事項之限定，係具有揭示彼等之中間構成的意圖而完成者。

以下，就本說明書之揭示內容詳細加以說明。

(RNA干擾劑) 本說明書所揭示之RNA干擾劑(以下簡稱為本RNA干擾劑)係具備針對目標RNA之隨從股及引導股，藉由此等之雜交的雙股RNA的兩末端可構成平端。作為本劑，可採用例如圖1所示構造。圖1中，各圓圈係表示核苷酸，濃色圓圈係特別提及作為3’末端側及5’末端側的核苷酸。

本RNA干擾劑之目標RNA不特別限定，只要是可藉由RNA干擾而抑制其作用的RNA即可。典型可舉出mRNA、pre-mRNA、miRNA等的非編碼RNA等。辨識為目標RNA之部位的長度亦不特別限定，可採例如15mer～25 mer左右。此外，隨從股的5’末端及3’末端以及引導股的3’末端為羥基，引導股的5’末端為磷酸基或羥基。

作為目標RNA，例如除了與癌症或各種基因疾病的引發基因或該基因的表現控制有關之基因外，尚可適宜選擇各種領域。例如作為癌症的治療目標之基因，可舉出與胰臟癌有關之NeK2基因。

(隨從股) 本RNA干擾劑之隨從股可構成正義股(SS)，亦即與目標RNA大致相同的鹼基序列。隨從股的股長不特別限定，可具備例如17mer～27mer左右之對應目標RNA的股長。隨從股的股長又例如為18mer～25mer，又例如為19mer～24 mer，又例如為20mer～23mer。與引導股進行雜交而構成平端時，可設為與引導股長相同。

(隨從股的3’末端側) 隨從股的3’末端側的鹼基序列，典型上係具備TT(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)等、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)及胞嘧啶(C)等的嘧啶鹼基或者其衍生物作為鹼基，但不限定於此；只要是可發揮作為RNA干擾劑之機能的範圍，則亦可適宜組合其他種類的鹼基或修飾鹼基。本RNA干擾劑，在隨從股的3’末端為平端時，係考量到與引導股的5’末端側之鹼基序列的互補性。此外，就引導股的5’末端側的鹼基序列，係於後段說明。

隨從股中的3’末端側的骨架部分，例如可具備選自由以下式(1)或式(2)表示之單元(以下，統稱此兩單元時，係稱式(1)等的單元)所成群組的1個或2個以上。

式(1)及式(2)中的Base(鹼基)可適宜具備週知之天然或人造的各種鹼基。又，式(1)及式(2)中的X為氧原子時，係藉由磷酸二酯鍵與3’末端側鍵結；X為硫原子時，則藉由硫代磷酸酯鍵與3’末端側鍵結。

於隨從股的3’末端側，可具備例如1個～4個，又例如1個～3個，又例如1個～2個，又例如2個式(1)等表示之單元。該3’末端側所具備之2個以上的單元可為單一種類之單元，即全為式(1)或式(2)表示之單元，惟亦可為式(1)及式(2)表示之單元的組合，或者式(1)或式(2)表示之單元與天然核苷酸或其他核苷衍生物的組合。

於隨從股的3’末端側，可在其末端具備1個式(1)等表示之單元。又，具備2個以上之式(1)等表示之單元時，可接續該末端單元地於5’末端側具備約1個或2個左右之(1)等表示之單元。

(隨從股的5’末端側) 隨從股的5’末端側的鹼基序列不特別限定，當本RNA干擾劑在隨從股的5’末端構成平端時，係考量到與引導股的3’末端側之鹼基序列的互補性。就引導股的3’末端側的鹼基序列，係於後段說明。

隨從股的5’末端側的骨架部分，可具備1個或2個以上之式(1)等表示之單元。於該5’末端側，可具備例如1個～4個，又例如1個～3個，又例如1個～2個，又例如2個式(1)等表示之單元。該5’末端側所具備之2個以上的單元，於該5’末端側，可為單一種類之單元，即全為式(1)或式(2)表示之單元，惟亦可為式(1)及式(2)表示之單元的組合，或者式(1)或式(2)表示之單元與天然核苷酸或其他核苷衍生物的組合。

於隨從股的5’末端側，可在其末端具備1個式(1)等表示之單元。又，具備2個以上之式(1)等表示之單元時，可接續該末端單元地於3’末端側具備約1個或2個左右之(1)等表示之單元。

(引導股) 本RNA干擾劑之引導股可構成反義股(AS)，亦即可與目標RNA進行雜交，且大致與目標RNA的鹼基序列呈互補的鹼基序列。引導股的股長不特別限定，可具備例如17 mer～27mer左右之對應目標RNA的股長。引導股的股長又例如為18mer～25mer，又例如為19mer～24mer，又例如為20mer～23mer。

(引導股的3’末端側) 引導股的3’末端側的鹼基序列，典型可具備TT(胸腺嘧啶-胸腺嘧啶)等、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)及胞嘧啶(C)等的嘧啶鹼基或者其衍生物；只要是可發揮作為RNA干擾劑之機能的範圍，則亦可適宜組合其他種類的鹼基或修飾鹼基。

引導股的3’末端側的鹼基序列可採用與目標mRNA呈互補的序列。其結果，例如鹼基有時會構成為具有胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)或者其衍生物。於引導股的3’末端側，在與隨從股的5’末端側之間，亦可使其形成作為鹼基對之TA、UA等的天然型鹼基對或與其類似的鹼基對。例如，於引導股的3’末端側，可具備T或U。更具體而言，例如於引導股的3’末端可具備T，甚而於其5’末端側可具備T(TT，惟其表示自3’末端起的2個鹼基)，或同樣地可具備U(TU，惟其表示自3’末端起的2個鹼基)。

本RNA干擾劑之引導股的3’末端側的骨架部分，例如可具備選自由式(1)等表示之單元所成群組的1個或2個以上。於引導股的3’末端，可具備例如1個～4個，又例如1個～3個，又例如1個～2個，又例如2個式(1)等表示之單元。該3’末端側所具備之2個以上的單元可為單一種類之單元，即全為式(1)或式(2)表示之單元，惟亦可為式(1)及式(2)表示之單元的組合，或者式(1)或式(2)表示之單元與天然核苷酸或其他核苷衍生物的組合。

於引導股的3’末端側，可在其末端具備選自由1個式(1)等表示之單元所成群組的1個或2個以上。又，具備2個以上之式(1)等表示之單元時，可接續該末端單元地於5’末端側具備約1個或2個左右之(1)等表示之單元。

(引導股的5’末端側) 引導股的5’末端側的鹼基序列不特別限定，只要是可發揮作為RNA干擾劑之機能的範圍，則亦可適當組合其他種類的鹼基或修飾鹼基。

引導股的5’末端側的鹼基序列，例如鹼基係構成為具有胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)或者其衍生物。於引導股的5’末端側，係設定為與隨從股的3’末端側的鹼基序列呈互補。從而，於該5’末端側，有時形成有作為鹼基對之AU、CG等的天然型鹼基對或與其類似的鹼基對。例如，於引導股的5’末端側，可具備C或U。更具體而言，例如於引導股的5’末端可具備U，甚而於其3’末端側可具備C (UC，惟其表示自5’末端起的2個鹼基)。

引導股之5’末端側的骨架部分，可具備源自天然核糖核苷酸或其衍生物等的單元。如此一來，便容易將引導股5’末端選擇性地導入於RISC中，而能夠抑制脫靶效應。此外，亦可與3’末端側同樣地具備式(1)等表示之單元。引導股的5’末端係以經磷酸化為佳。

本RNA干擾劑之隨從股及引導股可於上述兩末端側之結構以外的部分適宜具備天然或經化學修飾之鹼基，或者具有天然核糖或其2’位經化學修飾之骨架的核苷或其衍生物。又，各核苷或其衍生物的鍵結可為磷酸二酯鍵或硫代磷酸酯鍵。此外，隨從股及引導股可適宜具備週知之化學修飾。

藉由在本RNA干擾劑之構成平端的3’末端側及/或5’末端側具備式(1)等表示之單元，能有效提升RNase耐性、在靶活性及脫靶效應的抑制活性。其中，藉由在隨從股的3’及5’末端側及引導股的3’末端側具備式(1)等表示之單元，能有效提升上述任一種活性。

就本RNA干擾劑，較佳為隨從股及引導股分別為22mer～24mer，兩端末形成平端構造，且隨從股的3’末端側及5’末端側，自其端末起，均具備1個或連續具備2個式(1)等表示之單元(例如僅由式(2)表示之單元所構成，又例如僅由式(1)表示之單元所構成，又例如由式(1)表示之單元及式(2)表示之單元的組合所構成)。又，隨從股的3’末端側的鹼基序列自其端末起為例如AG，5’末端側的鹼基序列自其端末起為例如AA。又，引導股的3’末端側自其端末起係具備1個或連續具備2個式(1)等表示之單元。再者，引導股的3’末端側的鹼基序列自其端末起為例如TT或TU，5’末端側的鹼基序列自其端末起為例如UC。

又，例如就本RNA干擾劑之各鏈的末端側之式(1)表示之單元及式(2)表示之單元，除了僅具備其中任一單元的形態外，亦可採用兩單元組合而成的形態。例如可採用在隨從股及引導股間以式(1)表示之單元及式(2)表示之單元配對的方式配置之混合型、於隨從股或引導股存在此兩單元之嵌合型、混合型與嵌合型組合而成之混合型等的各種形態。

本RNA干擾劑除了可用作例如供抑制與疾病有關的基因表現之醫藥外，亦可作為研究用途使用。作為醫藥用途使用時，係依據疾病的種類或目標部位，適當使用用於DDS之要素，而選用靜脈內投予、皮下投予、腦室內投予、經鼻腔投予及腹腔內投予等適當的投予路徑。

(基因表現之抑制方法) 根據本說明書，亦提供一種方法，其係利用構成本RNA干擾劑的雙股RNA來抑制基因的表現。若於體外或體內投予本RNA干擾劑，在哺乳動物細胞的細胞內，本RNA干擾劑會作用於目標RNA，藉由RNA干擾而分解目標RNA等。藉此，可抑制該目標RNA之作用，即典型上為mRNA轉譯成蛋白質，結果便可抑制基因的表現。本抑制方法在體外使用時，可使用於例如非人類哺乳動物。

構成本RNA干擾劑的雙股RNA可藉由週知之RNA合成方法來取得。具有式(1)及式(2)表示之單元及該單元的寡核苷酸可依循例如日本特開2016-130232號公報、日本特開2011-135824號公報等來合成。

(目標核酸之檢測劑) 本說明書所揭示之目標核酸之檢測劑(下稱本檢測劑)可具備：探針股，其係包含選自由式(1)等表示之單元所成群組的1個或2個以上，且具有可與目標核酸專一性地進行雜交之雜交區；及訊息要素，其顯示探針股與目標核酸進行雜交。根據本檢測劑，可高靈敏度地檢測出細胞內的目標核酸。

本檢測劑之目標核酸不特別限定。可為DNA或RNA。當目標核酸為DNA時，能以特定基因的特定區域、SNPs等的突變等為目標。當目標核酸為RNA時，可舉出mRNA、pre-mRNA、miRNA等非編碼RNA等。目標核酸的序列長度亦不特別限定，可取例如4mer～25mer左右。

本檢測劑中的探針股係具有可與目標核酸專一性地進行雜交之雜交區。雜交區可具有對應目標核酸之序列的長度。探針股全體可取例如15mer～35mer左右。例如構成雜交區的骨架部分係由式(1)等表示之單元所構成。如此一來，便能以高專一性使其與目標RNA進行雜交，例如縱為SNPs等的突變，亦能以高精確度檢測出。除雜交區外，例如如後述，主幹形成區亦由式(1)等表示之單元所構成。

探針股係具備1種或2種以上之訊息要素。訊息要素不特別限定，例如由螢光色素與消光色素之組合所構成，當探針股未與目標核酸進行雜交時，螢光色素便藉由消光色素而消光；當探針股與目標核酸進行雜交時，則提示螢光色素所產生的訊息。此種螢光色素與消光色素之組合，除例如日本特開2012-170373號公報、日本再表2011/105610號公報、日本特開2013-78298號公報等所記載之化合物外，亦可適宜組合使用週知化合物。

例如此種螢光色素與消光色素，可針對雜交區以各種形態而具備。可舉出例如於圈環具有雜交區的至少一部分，且於主幹形成區具有螢光色素與消光色素的分子信標。此外，雜交區亦可及於主幹形成區的一部分。此時，可於單股探針股之其中一端部的主幹形成區配置螢光色素，並於另一端部的主幹形成區配置消光色素。此外，當主幹形成區具備螢光色素與消光色素時，可於主幹形成區的各端末具備此等色素。

又例如整體而言，當其為於恆常時具有髮夾狀部與其一端延伸的單股區之探針股，且雜交區與目標核酸進行雜交時，構成為髮夾狀部敞開時，亦可於探針股的髮夾形成區配置螢光色素與消光色素。

本檢測劑可例如在供辨識目標DNA或者RNA之部位具備1個或2個以上之單元，該單元係具備替代腺嘌呤(A)之2,6-二胺基嘌呤作為鹼基。藉由配置所述鹼基，在辨識目標DNA或者RNA時透過使雙股穩定化，可使髮夾更容易敞開而提升螢光強度，由此可提升訊號(S)/背景(B)比，此外可提升本檢測劑之檢測靈敏度(檢測極限)。具備該鹼基時，可使S/B比為例如100以上，又例如為150以上，又例如為180以上，又例如為190以上，又例如為200以上等。具有該鹼基的單元可具備例如1個或4個以下，又例如為1個以上3個以下，又例如為1個以上2個以下。

當探針股構成具有分子信標或髮夾狀部之探針時，宜在具備螢光色素及消光色素之二個主幹形成區或髮夾形成區的附近具備該鹼基。此外，具有該鹼基的單元能以不妨礙雜交區之雜交的方式配置。

本檢測劑可與本RNA干擾劑同樣地藉由週知之DNA合成方法取得。式(1)及式(2)表示之單元及具有該單元的寡核苷酸可例如依循日本特開2016-130232號公報、日本特開2011-135824號公報等來合成。

(間隔體型反義寡核苷酸劑) 本說明書所揭示之間隔體型反義寡核苷酸劑(以下簡稱為本反義劑)可具備：反義股，其係針對目標RNA；及側鏈，其係於前述反義股的兩末端分別包含選自由式(1)等表示之單元所成群組的1個或2個以上。

本反義劑之目標RNA不特別限定，可舉出mRNA、pre-mRNA、miRNA等的非編碼RNA等。辨識為目標核酸之部位的長度亦不特別限定，可採例如6mer～30mer左右。

反義股可具有可針對目標RNA專一性地進行雜交的鹼基序列。所述反義股的骨架部分能以DNA構成。又，此反義股的骨架部分的核苷酸可含有磷酸二酯鍵，惟例如亦能以硫代磷酸酯鍵結。此外，當反義股包含CG時，為抑制TLR9的活化，C(胞嘧啶)亦可將其5位甲基化。

本反義劑可於反義股的兩側具備包含1個或2個以上之式(1)等表示之單元的側鏈。所述側鏈的長度不特別限定，可取例如1mer至15mer左右，又例如為1mer至10mer左右，又例如為1mer至8mer左右，又例如為1mer至6 mer左右，又例如為1mer至4mer左右。此等側鏈中之式(1)等表示之單元的個數不特別限定，亦可具備其他核苷酸單元。

側鏈的鹼基構成不特別限定，可採用例如與目標RNA之兩末端的鹼基序列互補的鹼基序列。又，側鏈與反義股之間能以硫代磷酸酯鍵結，此外，側鏈的單元間亦能以硫代磷酸酯鍵結。

本反義劑可與本RNA干擾劑同樣地藉由週知之DNA等的合成方法取得。式(1)及式(2)表示之單元及具有該單元的寡核苷酸可例如依循日本特開2016-130232號公報、日本特開2011-135824號公報等來合成。 [實施例]

以下揭示將本說明書之揭示內容具體化的實施例，惟此等係僅供說明本說明書之揭示內容者，非意圖限定其範圍地記載。 [實施例1]

(NeK2-RNA干擾劑的製作及評定) 屬絲胺酸-蘇胺酸激酶的Nek2係與細胞增生有關之蛋白質，週知在胰臟癌細胞會過度表現。由此，NeK2可望作為胰臟癌的治療目標。於本實施例中，係製作以Nek2基因之mRNA作為目標RNA的RNA干擾劑。

RNA干擾劑之目標RNA的序列係基於既有論文(Kokuryoet al. , Cancer Sci., 2016, 107, 1315-1320)中所採用的鹼基序列。RNA干擾劑的設計係作成平端型RNA干擾劑，將引導股的5’末端以外的3處末端以下式(3)表示之單元(SNA)及(4)表示之單元(L-αTNA)取代。下表示出鹼基序列及單元的取代形態。

使用Lipofectamin2000將製作之RNA干擾劑與pmiR-Nek2 質體共同轉染於播種於96孔井盤的HELA細胞。自轉染起48小時後，利用Dual-Glo luciferase assay system (promega)進行冷光酵素啟動子分析。將結果示於圖2。如圖2所示，製作之RNA干擾劑均顯示與由天然核苷酸所構成之RNA干擾劑(SiNek2)同等程度的RNAi活性。

其次，就隨從股(正義股)的脫靶效應，使用製作成具有與隨從股呈互補之序列的質體，以與上述同樣的方式藉由冷光酵素啟動子分析來確認。將結果示於圖3。如圖3所示，可知隨從股的脫靶效應，比天然siRNA更進一步獲得抑制。其中，導入有TNA的RNA干擾劑顯示高脫靶效應的抑制能力。

其次，將製作之RNA干擾劑，使用Lipofectamin2000轉染於KLM1細胞，於48小時後回收細胞，利用anti-NeK2抗體並藉由西方墨點法解析潛在性Nek2基因的表現。將結果示於圖4。如圖4所示，可知導入有SNA或TNA的RNA干擾劑，比天然的siRNA顯示更高的RNA干擾能力。

進而，由於Nek2係與細胞增生有關之蛋白質，而透過評定使siRNA-Nek2(10nM)作用之細胞的增生能力，而藉由MTT分析法來評定RNA干擾劑的效果。亦即，於轉染後，將WST-1試劑與細胞以既定時間混合，其後，解析465nm的吸光度。將結果示於圖5。如圖5所示，可知與天然的siRNA相比，siNek2-T2最為有效。

再者，將末端導入有SNA的RNA干擾劑(siNek2-S2)(1μM)在37℃下保存於40%人類血清中時，以20%變性PAGE解析其分解物。將結果示於圖6。如圖6所示，可知末端導入有SNA的RNA干擾劑具有高酵素耐性。 [實施例2]

(間隔體型反義核酸的製作及評定) SGLT2(sodium glucose cotransporter2, SLC5A2)為表現於腎及近曲小管細胞的葡萄糖轉運子，係負責原尿中經過濾之葡萄糖的再吸收的分子。又，已知糖尿病會亢進其表現。於本實施例中，係製作以人類SGLT2基因之mRNA為目標的間隔體型反義核酸，並針對其基因減弱活性、尿糖排泄及副作用(肝功能損害、脫靶效應(SGLT1、SGLT5等其他表現於近曲小管的轉運子)等進行評定。

於本實施例中，係製作以下構成之反義核酸。具體而言，係製作由採硫代磷酸酯鍵的去氧核糖核苷酸構成英文大寫字部分的骨架部分，且()內的骨架部分藉由硫代磷酸酯鍵，由2’MOE(2’-O-甲氧基乙基核糖核苷酸)、SNA(式(5))及L-α-TNA(式(6))之任一者全部取代的合計3種反義核酸。

依循圖7所示實驗指南，對小鼠(C57BL6/J，公，9～10週大，購入自日本SLC股份有限公司)以10 mg/kg/次、3次/週藉由皮下注射(背部)投予製作之反義核酸共計10次。皮下注射係於異氟烷的吸入麻醉下施行。於最終投予的翌日採集尿液，於2日後宰殺並採取腎臟、肝臟、血清。

測定採取之小鼠的腎臟中之SGLT2的mRNA量及表現蛋白質量。將結果示於圖8及圖9。如圖8及圖9所示，可知導入有SNA及L-aTNA之反義核酸的皮下投予均可使腎臟中的SGLT2的mRNA水平及SGLT2蛋白質量顯著降低。此外，同時對於SGLT1及SGLT5的mRNA水平亦進行測定。將結果示於圖10。就任一種反義核酸，均確認此等基因的mRNA水平並未降低。亦即，對於使用之反義核酸，並未觀察到針對目標之SGLT2以外的分子之非專一性(非取決於鹼基序列)表現抑制效果(脫靶效應)。

利用採取之尿液來評定尿糖排泄。將結果示於圖11。如圖11所示，就PBS投予群並未看出尿糖，而就任一反義核酸投予群均確認排泄出尿糖。由此等結果可知，SGLT2的作用大幅減弱，腎小管之葡萄糖的再吸收能力降低。 [實施例3]

(分子信標型探針的製作及評定) 於本實施例中，目標RNA係採包含EGFR基因之T790的30mer(野生型及突變型(一鹼基取代))，並將與其對應的分子信標型探針設計成使目標RNA之辨識部位的長度為14 mer～18mer而相異，同時將包含另一主幹形成區的全體作為以SNA(式(1))為骨架部分的探針股，將螢光色素及消光色素導入至兩末端而製作(表2)。此外，螢光色素及消光色素在野生型檢測用分子信標中為苝及蒽醌，在突變型檢測用分子信標(T790M)中則採Cy3及硝基甲基紅。

測定將此等野生型檢測用及突變型檢測用分子信標型探針在37℃且探針(0.2μM)及目標RNA(0.2μM，野生型或異常型EGFR基因的mRNA)的存在下，以100mM NaCl、10mM 磷酸緩衝液(pH7.0)且激發波長取440nm、發光波長取472nm(以上為苝)或激發波長取546nm、發光波長取565nm(以上為Cy3)，於各種溫度下進行培養(5分鐘)時的螢光強度。此外，為了算出S/B，亦測定無目標RNA而僅有探針時的螢光強度。以下，下表示出37℃下的螢光強度。

如以上表所示，就所有的分子信標探針，均可檢測出作為目標RNA的野生型及突變型RNA，且就任一探針，S/B均顯示15以上，可知可辨識野生型與突變型。 [實施例4]

(高靈敏度分子信標型探針的製作) 於本實施例中，係如圖12所示，製作以miR21為目標RNA，且以具有以下特徵的核苷酸作為探針股的分子信標型探針：在與該目標RNA進行雜交之雜交區的兩末端側配置主幹形成區，且主幹形成區附近之配置有腺嘌呤的部位改採2,6-二胺基嘌呤外，亦導入有作為螢光色素之Cy3及作為消光色素之甲基紅者。此外，所有的骨架部分係採用SNA(式(1))。

對此分子信標型探針，在20℃、探針(1μM)及目標RNA(2μM)的存在下，以100mM NaCl、10mM 磷酸緩衝液(pH7.0)，激發波長取546nm、發光波長取565nm，測定由80℃以1℃/分降溫時的螢光光譜。除將探針濃度設為0.5μM及將目標RNA濃度設為0～2000pM，且將發光波長設為564nm以外係於同樣的條件下，以各目標RNA濃度測定螢光強度。將結果示於圖12及圖13。

如圖12所示，S(訊息)/B(背景)比為205倍，係超出100倍。又，如圖13所示，目標RNA的檢測極限為200pM。如以上所述，可知以SNA為骨架部分且於主幹形成區的附近具備2,6-二胺基嘌呤的分子信標型探針可發揮優良的檢測性能。此外，針對除未變更為2,6-二胺基嘌呤以外係以與上述同樣方式製作的分子信標，同樣地確認S/B比及檢測極限的結果，均比具備2,6-二胺基嘌呤的分子信標低，但顯示良好的數值。 [實施例5]

(間隔體型反義核酸的製作及評定之2) 依循實施例2製作以人類SGLT2基因之mRNA作為目標的間隔體型反義核酸，並針對其基因減弱活性、尿糖排泄及副作用(肝功能損害)進行評定。

於本實施例中，係製作以下構成之反義核酸。具體而言，係製作由採硫代磷酸酯鍵的去氧核糖核苷酸構成英文大寫字部分的骨架部分，且()內的骨架部分藉由硫代磷酸酯鍵，由2’MOE(2’-O-甲氧基乙基核糖核苷酸)、SNA、5甲基dC之任一者全部取代的合計4種反義核酸。

針對此等反義核酸，依循圖14所示實驗指南，對小鼠(C57BL6/J，公，9～10週大，購入自日本SLC股份有限公司)以10mg/kg/次、3次/週藉由皮下注射(背部)投予製作之反義核酸共計10次。於最終投予的翌日採集尿液，於2日後宰殺並採取血液及腎組織。

將依循實施例2，測定採取之小鼠腎臟中之SGLT2的mRNA量及表現蛋白質量的結果示於圖15及圖16。如圖15及圖16所示，可知於兩端僅導入1個SNA之反義核酸的皮下投予均可使腎臟中之SGLT2的mRNA水平及SGLT2蛋白質量降低。另一方面，就以分別自兩端算起第2個硫代磷酸酯作為磷酸二酯鍵之SNA的反義核酸，則僅使腎臟中之SGLT2的mRNA水平降低15%左右，且僅使SGLT2蛋白質量降低10%左右。

又，將依循實施例2，使用採取之尿液評定尿糖排泄的結果示於圖17。如圖17所示，就PBS投予群雖未看出尿糖，但除了以自最末端算起第2個硫代磷酸酯作為磷酸二酯鍵之SNA的間隔體外，就任一反義核酸投予群均確認排泄出尿糖，可知SGLT2的作用減弱，腎小管之葡萄糖的再吸收能力降低。

又，使用採取之血液評定AST、ALT、ALP。將結果示於圖16及圖19及圖20。如圖19及圖20所示，與實施例2之結果相比，可知對肝功能的副作用均獲得減輕。 [實施例6]

(間隔體型反義核酸的製作及評定之3) 依循實施例2，製作以SGLT2基因之mRNA作為目標的間隔體型反義核酸，並針對其基因減弱活性及效果的持續性進行評定。於本實施例中，係製作以下構成之反義核酸。具體而言，係製作由採硫代磷酸酯鍵的去氧核糖核苷酸構成英文大寫字部分的骨架部分，且()內的骨架部分藉由硫代磷酸酯鍵，由SNA全部取代的合計3種反義核酸。

針對此等反義核酸，依循圖21所示實驗指南，對小鼠(C57BL6/J，公，9～10週大，購入自日本SLC股份有限公司)在Day0，以10mg/Kg藉由皮下注射投予作成之各反義核酸2次。於最終投予的2日後、9日後、16日後宰殺，採取腎組織。將依循實施例2測定採取之小鼠腎臟中之SGLT2的mRNA量的結果分別示於圖22、23、24。

如圖22所示，可知在最終投予起2日後，於兩側各導入1個或各導入2個SNA之反義核酸，及由DNA構成之反義核酸的皮下投予均可使腎臟中之SGLT2的mRNA水平降低。再者，如圖23所示，在最終投予起9日後，於兩側各導入1個或各導入2個SNA之反義核酸的皮下投予可使SGLT2的mRNA水平分別降低70%、75%，而另一方面由DNA構成之反義核酸的皮下投予僅降低30%。再者，如圖24所示，在最終投予起16日後，於兩側各導入1個或各導入2個SNA之反義核酸的皮下投予可使SGLT2的mRNA水平皆降低63%，而另一方面由DNA構成之反義核酸的皮下投予僅降低42%。

由此等結果可知，於兩側各導入1個或各導入2個SNA之反義核酸的皮下投予，與由DNA構成之反義核酸的皮下投予相比，可持續減弱SGLT2的作用。由以上可知，此種反義核酸係對於核酸酶耐性或基因減弱效果具實效性的藥劑。 [序列表自由文字]

序列編號1～10：siRNA 序列編號11：間隔體型反義核酸 序列編號14～21：分子信標探針

[圖1]為表示RNA干擾劑之一例的圖。 [圖2]為表示實施例1中所製作之RNA干擾劑之RNA干擾(冷光酵素啟動子分析)的評定結果的圖。 [圖3]為表示實施例1中所製作之RNA干擾劑之脫靶效應的評定結果的圖。 [圖4]為表示實施例1中所製作之RNA干擾劑之RNA干擾(NeK2蛋白質之西方墨點法)的評定結果的圖。 [圖5]為表示實施例1中所製作之RNA干擾劑之藉由MTT分析法之細胞增生能力的評定結果的圖。 [圖6]為表示實施例1中所製作之RNA干擾劑之耐酵素性能的評定結果的圖。 [圖7]為表示使用實施例2中所製作之間隔體型反義核酸的小鼠投予實驗之實驗指南的概要的圖。 [圖8]為表示實施例2中所製作之間隔體型反義核酸之SGLT2的基因減弱活性(mRNA量)的評定結果的圖。 [圖9]為表示實施例2中所製作之間隔體型反義核酸之SGLT2的基因減弱活性(蛋白質量)的評定結果的圖。 [圖10]為表示實施例2中所製作之間隔體型反義核酸之脫靶效應的評定結果的圖。 [圖11]為表示實施例2中所製作之間隔體型反義核酸之增進尿糖排泄的評定結果的圖。 [圖12]為表示實施例4中所製作之分子信標型探針與目標RNA進行雜交時之螢光光譜的圖。 [圖13]為表示實施例4中所製作之分子信標型探針之目標RNA的檢量線的圖。 [圖14]為表示使用實施例5中所製作之間隔體型反義核酸的小鼠投予實驗之實驗指南的概要的圖。 [圖15]為表示實施例5中所製作之間隔體型反義核酸之SGLT2的基因減弱活性(mRNA量)的評定結果的圖。 [圖16]為表示實施例5中所製作之間隔體型反義核酸之SGLT2的基因減弱活性(蛋白質量)的評定結果的圖。 [圖17]為表示實施例5中所製作之間隔體型反義核酸之增進尿糖排泄的評定結果的圖。 [圖18]為表示實施例5中所製作之間隔體型反義核酸對肝臟的副作用的評定結果(AST)的圖。 [圖19]為表示實施例5中所製作之間隔體型反義核酸對肝臟的副作用的評定結果(ALT)的圖。 [圖20]為表示實施例5中所製作之間隔體型反義核酸對肝臟的副作用的評定結果(ALP)的圖。 [圖21]為表示使用實施例6中所製作之間隔體型反義核酸的小鼠投予實驗之實驗指南的概要的圖。 [圖22]為表示實施例6中所製作之間隔體型反義核酸對腎臟中的SGLT2之mRNA量(0W)的評定結果的圖。 [圖23]為表示實施例6中所製作之間隔體型反義核酸對腎臟中的SGLT2之mRNA量(1W)的評定結果的圖。 [圖24]為表示實施例6中所製作之間隔體型反義核酸對腎臟中的SGLT2之mRNA量(2W)的評定結果的圖。

Claims (4)

1. 一種RNA干擾劑，其中，其係具備針對目標RNA之隨從股(passenger strand)及引導股(guide strand)，前述隨從股與前述引導股配對而成之雙股RNA的兩端係構成平端，且於以下(a)及(b)：(a)前述隨從股的5’末端側及3’末端側(b)前述引導股的3’末端側具備2個下述式(2)表示之單元；

   

   (惟，X表示氧原子或硫原子)。
2. 如請求項1之RNA干擾劑，其係以抑制NeK2基因的表現為目的。
3. 如請求項2之RNA干擾劑，其中前述隨從股具有序列編號9所示之鹼基序列，前述引導股具有序列編號10所示之鹼基序列。
4. 一種在非人類動物之活體內或動物的活體外利用RNA雙股來抑制目標基因的表現之方法，該RNA雙股係具備針對目標RNA之隨從股及引導股， 前述隨從股與前述引導股配對而成之雙股RNA的兩端係構成平端，且於以下(a)及(b)：(a)前述隨從股的5’末端側及3’末端側(b)前述引導股的3’末端側具備2個下述式(2)表示之單元；

   

   (惟，X表示氧原子或硫原子)。