TWI860001B - 於體外纖維化模式量測細胞力學的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，包括：(a)提供複數個顯微鏡裝置並以共軸方式組成顯微鏡共軸系統，進行成像；(b)將待測樣品放置於載物台，經由顯微鏡共軸系統掃描待測樣品；(c)以顯微鏡共軸系統擷取出待測樣品的第一影像及第二影像，將第一影像及第二影像生成為第三影像，透過第三影像劃分出細胞邊界；(d)在第三影像中定義出複數個感興趣區域；(e)確認待測樣品的力學特性，包含計算細胞的第一彈性模量及感興趣區域中蛋白質的第二彈性模量；及(f)依據第三影像，並比對第一彈性模量與第二彈性模量，獲得待測樣品的細胞狀態。
Description
本發明係關於一種於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，尤指一種使用顯微鏡共軸系統同時收集細胞形貌影像及力學特性，以評估細胞狀態的方法。
習知技術中，觀察細胞的方法主要依賴於螢光顯微鏡技術，螢光顯微鏡是一種利用螢光標記的方法來觀察生物樣品的顯微鏡技術，通過將特定分子或結構標記上螢光染劑，並使用特定的激發光源激發所標記的螢光染劑，觀察到染劑發出的螢光訊號，藉由提供高對比度及高解析度的成像，使得使用者可觀察及研究細胞的分子分佈與生理過程。其中，共軛焦顯微鏡為螢光顯微鏡的基礎上進一步發展的技術，利用共軛焦原理，通過將光束經過一個狹縫，將激發光集中在樣品的焦點上，同時將非焦點處的散射光排除在外，可以提高成像的解析度和深度，同時減少背景雜訊的影響，獲得更清晰及更深入的三維成像。
另外一種觀察細胞的方法為使用原子力顯微鏡，原子力顯微鏡則是一種基於力學感測的顯微鏡技術，可即時觀察細胞表面的形態與結構。包含使用一非接觸性的細針探頭掃描細胞表面，通過探測表面的力交互作用，可獲得細胞的結構、紋理等形貌信息。另一方面，原子力顯微鏡可以獲得細胞的力學特性，例如表面形貌特徵、硬度、彈性模量及粘附力等。且透過原子力顯微鏡技術還可實現對單一個生物分子的力學特性的測量，進一步可用於研究細胞膜蛋白、細胞外基質和細胞間相互作用的力學特性。
然而，上述技術在細胞觀察中存在一些限制。目前，這些技術仍然需要分開進行細胞影像的擷取，無法實現合併使用。因此，使用者需要花費更多時間獨立操作螢光顯微鏡和原子力顯微鏡，以及確認獨立操作下掃描區域之準確性，並需要足夠的空間來放置這兩種不同的顯微鏡設備。
纖維化已知為一種人類疾病中不可逆的病理狀態，因正常器官或組織受到損傷已超過身體可修復能力後，受損位置會轉化為由成纖維母細胞與含有膠原蛋白、纖連蛋白的細胞外基質構成的纖維化組織的過程。另外，組織的硬度增加已被認為是器官纖維化的病理指標之一，且乙型轉化生長因子的刺激會導致肌纖維母細胞的活化，也與細胞外基質的硬度具有相關性。目前僅能透過細胞實驗用於研究纖維化疾病例如蟹足腫，仍缺凡合適的活體模型研究纖維化疾病之各個階段的細胞發展進程。
有鑑於此，本發明提出一種於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，以解決先前技術中所面臨的問題。
本發明之目的在於提供一種於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，旨在有效觀察且評估待測樣品中的細胞及細胞外蛋白質之結構與力學特性。且本發明的方法包含使用一種新穎的顯微鏡共軸系統，特別在於以共軸方式結合螢光顯微鏡與原子力顯微鏡，藉由兩種顯微鏡共軸系統的技術，使用者能夠同時獲得細胞與細胞外蛋白質的形態結構和力學性質的詳細訊息，而不需要進行獨立的操作。藉此，使用本發明的方法提供了一個高方便性、高效率及高精準度的方式來觀察並評估細胞狀態。
為達上述目的，本發明揭露一種於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，該方法包括：(a)提供複數個顯微鏡裝置，並將所述顯微鏡裝置以共軸方式組合成一顯微鏡共軸系統，進行待測樣品的成像；(b)將待測樣品放置於載物台，經由該顯微鏡共軸系統掃描待測樣品；(c)以該顯微鏡共軸系統擷取出待測樣品的一第一影像及一第二影像，再將該第一影像及該第二影像生成為一第三影像，並透過該第三影像劃分出一細胞邊界；(d)在該第三影像中，分別就細胞及蛋白質定義出複數個感興趣區域；(e)確認待測樣品的力學特性，包含計算細胞的一第一彈性模量及所述感興趣區域中蛋白質的一第二彈性模量；及(f)依據該第三影像，並比對該第一彈性模量與該第二彈性模量，獲得待測樣品中的細胞狀態。
於一實施例中，所述感興趣區域為非固定形狀感興趣區域，所述顯微鏡裝置包含螢光顯微鏡、電子顯微鏡、雷射掃描共軛焦顯微鏡、超高解析度螢光顯微鏡、掃描式探針顯微鏡、磁鑷式顯微鏡、光鑷式顯微鏡、或原子力顯微鏡。
於一實施例中，所述顯微鏡裝置為雷射掃描共軛焦顯微鏡及原子力顯微鏡的組合。
於一實施例中，該第一影像為一螢光圖像。
於一實施例中，該第一影像擷取自雷射掃描共軛焦顯微鏡。
於一實施例中，該第二影像為一高度圖像，該第三影像為一融合圖像。
於一實施例中，該第二影像擷取自原子力顯微鏡。
於一實施例中，所述蛋白質包含彈性蛋白纖維、纖連蛋白纖維、膠原蛋白纖維、或層黏連蛋白纖維。
於一實施例中，所述蛋白質為單一結構形式之膠原蛋白纖維。
於一實施例中，該待測樣品為一纖維化疾病的一活體單元。
於一實施例中，該活體單元為一活體細胞。
於一實施例中，該纖維化疾病包含肝臟纖維化、骨髓纖維化、心臟纖維化、肺臟纖維化、皮膚纖維化、癌症纖維化、或腎臟纖維化。
於一實施例中，該活體細胞為一腎臟纖維母細胞。
在參閱圖式及隨後描述之實施方式後，此技術領域具有通常知識者便可瞭解本發明之其他目的，以及本發明之技術手段及實施態樣。
以下將透過實施例來解釋本發明內容，本發明的實施例並非用以限制本發明須在如實施例所述之任何特定的環境、應用或特殊方式方能實施。因此，關於實施例之說明僅為闡釋本發明之目的，而非用以限制本發明。需說明者，以下實施例及圖式中，與本發明非直接相關之元件已省略而未繪示，且圖式中各元件間之尺寸關係僅為求容易瞭解，並非用以限制實際比例。
請參閱圖1，所繪示係本發明所提供之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法之流程圖，其主要步驟為：步驟(a)提供複數個顯微鏡裝置，並將所述顯微鏡裝置以共軸方式組合成一顯微鏡共軸系統，進行待測樣品的成像；(b)將待測樣品放置於載物台，經由顯微鏡共軸系統掃描待測樣品；(c)以顯微鏡共軸系統擷取出待測樣品的第一影像及第二影像，再將第一影像及第二影像生成第三影像，並透過第三影像劃分出細胞邊界；(d)在第三影像中，分別就細胞及蛋白質定義出複數個感興趣區域；(e)確認待測樣品的力學特性，包含計算細胞的第一彈性模量及所述感興趣區域中一蛋白質的第二彈性模量；(f)依據第三影像，並比對第一彈性模量與第二彈性模量，獲得待測樣品中的細胞狀態。
步驟(a)為本發明之方法中最主要的技術特徵之一，包含使用複數個顯微鏡裝置。具體而言，本實施例中使用兩種不同類型的顯微鏡裝置，並將所述兩個不同類型的顯微鏡裝置以共軸方式組合成一顯微鏡共軸系統，接著進行待測樣品的成像。其中，所述顯微鏡裝置包含螢光顯微鏡、電子顯微鏡、雷射掃描共軛焦顯微鏡、超高解析度螢光顯微鏡、掃描式探針顯微鏡、磁鑷式顯微鏡、光鑷式顯微鏡、或原子力顯微鏡等，而兩種不同類型的顯微鏡裝置主要區分成用於擷取待測樣品螢光影像的顯微鏡裝置，以及用於擷取細胞力學特性、結構樣貌等影像的顯微鏡裝置。於本實施例中，本發明之方法所使用的顯微鏡裝置組合為雷射掃描共軛焦顯微鏡與原子力顯微鏡，形成一雷射掃描共軛焦顯微鏡與原子力顯微鏡之顯微鏡共軸系統。須說明的是，在本實施例中之顯微鏡裝置可依實際情境或使用需求而調整，在此不作限制。
接下來的步驟(b)為將待測樣品放置於顯微鏡共軸系統之載物台上，並經由顯微鏡共軸系統掃描待測樣品；步驟(c)為使用顯微鏡共軸系統擷取出待測樣品的一第一影像及一第二影像，再將第一影像及第二影像重疊生成為一第三影像，並透過第三影像劃分出一細胞邊界。具體而言，第一影像為一待測樣品的螢光圖像、第二影像為一待測樣品的表面高度圖像、及第三影像為第一影像及第二影像重疊生成的圖像。其中，第一影像擷取自可獲得螢光影像的顯微鏡裝置，例如雷射掃描共軛焦顯微鏡。第二影像擷取自可獲得細胞力學特性、結構樣貌等影像的顯微鏡裝置，例如原子力顯微鏡。接著，步驟(d)為在第三影像中自細胞邊界向內或外，自行定義出複數個且非固定形狀感興趣區域。在本實施例中，可由圖三清楚界定細胞及周圍蛋白質，而所述感興趣區域為方形感興趣區域，是以隨機或非隨機方式選取一平方微米的方形區域作為所述感興趣區域。須說明的是，在本實施例中之像素數量及感興趣區域可依實際情境或使用需求而調整，在此不作限制。
依上述步驟所取得的影像資訊後，接下來可進行步驟(e)。確認待測樣品的力學特性，例如待測樣品的硬度(rigidity)，包含分別計算待測樣品中細胞的一第一彈性模量及所述感興趣區域中蛋白質的一第二彈性模量，以軟體分析第一彈性模量及第二彈性模量後，可分別得到細胞及周圍蛋白質的力學特性資訊。具體而言，感興趣區域中蛋白質可包含彈性蛋白纖維、纖連蛋白纖維、膠原蛋白纖維、或層黏連蛋白纖維，其中，較佳實施例之蛋白質為單一結構形式之膠原蛋白纖維。
最後進行步驟(f)，依據前述待測樣品的第一影像即由共軛焦顯微鏡(或螢光顯微鏡)所擷取之螢光圖像，以及待測樣品的第二影像即由原子力顯微鏡所擷取之高度圖像，結合第一影像及第二影像(即第三影像)可精準地確認待測樣品中所擷取區域的細胞分布、形貌及力學特性結構，並比對細胞的第一彈性模量與蛋白質的第二彈性模量，可獲得待測樣品中的細胞狀態。
在本實施例中，待測樣品為一纖維化疾病的一活體單元，其中，活體單元為一活體細胞，且較佳實施例之活體細胞為一腎臟纖維母細胞。另外，纖維化疾病包含肝臟纖維化、骨髓纖維化、心臟纖維化、肺臟纖維化、皮膚纖維化、癌症纖維化、或腎臟纖維化，其中，較佳實施例之纖維化疾病為腎臟纖維化及蟹足腫疾病。
[材料與方法]
為了明顯可分辨細胞與位於細胞周圍作用之蛋白質，本發明之方法包含使用複數個不同的螢光蛋白進行標記。本實施例將大鼠腎臟纖維母細胞(下稱NRK-49F細胞)轉染並表現多肽紅色螢光蛋白(下稱Lifeact-RFP)，培養於與螢光蛋白之異硫氰酸螢光素(下稱FITC)偶聯的膠原蛋白凝膠上，所述膠原蛋白凝膠包含以異硫氰酸螢光素標記的第I型膠原蛋白，接著分成使用乙型轉化生長因子(下稱TGF-β1)處理刺激的組別及未使用TGF-β1的控制組(control)組別。須說明的是，此處加入TGF-β1為模擬纖維化疾病(例如腎臟纖維化及蟹足腫)中由其他纖維細胞活化成肌纖維母細胞的過程，且後續將進一步確認細胞收縮與膠原蛋白纖維之間的相互作用。
[共軸之原子力顯微鏡與共軛焦顯微鏡]
本實施例中所使用的顯微鏡共軸系統為結合了雷射掃描共軛焦顯微鏡(FV3000, Olympus)及原子力顯微鏡(BioScope Resolve, Bruker)，此顯微鏡共軸系統還具有配備尖銳的探針的使用。在使用此顯微鏡共軸系統測量之前，使用原子力顯微鏡中的非接觸(No-Touch)模式及在共軛焦顯微鏡的視野下進行校準探針的彈簧常數、偏轉靈敏度及探針位置。
另外，在測量之前，需先將疏水性物質以鍍膜方式鍍至原子力顯微鏡之尖銳探針上，如此可使原子力顯微鏡於進行待測樣品掃描時，避免探針沾黏至膠原蛋白纖維上，而導致檢測的精準度下降。
經校準之後，可透過原子力顯微鏡和共軛焦顯微鏡的共軸系統選擇、捕獲以及測量感興趣區域(regions of interest, ROIs)。本發明所量測的彈性模量為依據測得之力-距離曲線並使用經修改的斯內登模型(Sneddon model)透過Bruker數據分析軟體進行計算，並使用軟體(NanoScope Analysis，v1.9，Bruker)分析膠原蛋白纖維及細胞的形貌和硬度。
[用於評估細胞及蛋白纖維間的力學相互作用]
請一併參閱圖2，所繪示係本發明所提供之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法中使用共軛焦軛顯微鏡及原子力顯微鏡共軸系統選取感興趣區域並檢測待測樣品的簡易實驗流程之示意圖。所進行的實驗流程包含製備FITC標記的膠原蛋白凝膠後，接種Lifeact-RFP轉染的NRK-49F細胞。於細胞培養24小時後添加指定藥物，並進一步更新培養液。下一步，將準備好的樣品放置在顯微鏡共軸系統上後，標記掃描區域的位置，再將所選樣品的位置調整至預先標記的區域。接著，透過共軸之共軛焦顯微鏡及原子力顯微鏡擷取影像。最後，合併螢光及形貌圖像，再以軟體分析細胞與膠原蛋白的力學性質。
首先，為了區分細胞與纖維的邊界，使用共軛焦顯微鏡顯微鏡擷取出原始螢光圖像，如圖3之(A)所示。呈上，接著讀取原子力顯微鏡之原始高度圖像，如圖3之(B)所示。接著，再依前述所得細胞邊界如圖3之(C)所示。最後，選取方形感興趣區域，如圖5所示。原子力顯微鏡擷取之圖像經由數據分析後，顯示出TGF-β1處理的組別明顯增加了膠原蛋白纖維及NRK-49F細胞的硬度，分別增加了6.5倍和6.7倍，如圖6所示。此外，亦可觀察到較硬的膠原蛋白纖維經常出現在靠近NRK-49F細胞的區域，如圖7之所示。
接下來，為了檢測膠原蛋白纖維及活體細胞的形態與力學特性，使用本發明中的原子力顯微鏡與共軛焦顯微鏡之顯微鏡共軸系統。所獲得之影像結果如圖3所示，由共軛焦顯微鏡影像顯示，透過螢光蛋白FITC可清楚辨識出膠原蛋白纖維，及螢光蛋白Lifeact-RFP可清楚辨識出NRK-49F細胞，分別如圖3之(A1)及(A2)所示。再將兩種螢光標記的共軛焦顯微鏡影像融合後，如圖3之(A3)所示，也可在選定之同一區域中確認膠原蛋白纖維及NRK-49F細胞的相對位置。另一方面，同時可從原子力顯微鏡影像之高度圖像及三維重塑圖像可得到細胞及膠原蛋白纖維的形貌及力學特性，如圖3之(B1)及(B2)所示。進一步確認顯微鏡同軸系統的準確性，將共軛焦顯微鏡影像及原子力顯微鏡影像融合分析，如圖3之(C1)所示。發現融合兩者的影像具有高度重疊性，有利於更精準地分析選定區域內細胞及膠原蛋白纖維的相互作用。
另外，如圖3及圖4所示，在TGF-β1刺激後，膠原蛋白纖維的密度明顯增加。再經由原子力顯微鏡影像檢測膠原蛋白纖維的直徑(D1)、NRK-49F細胞與膠原蛋白纖維之間的角度(A)，以及膠原蛋白纖維與NRK-49F細胞的硬度，如圖5所示。接下來，由數據分析顯示後，在TGF-β1處理後，膠原蛋白纖維的直徑和膠原蛋白纖維與NRK-49F細胞之間的角度沒有差異(圖未示)。此外，還可針對單一結構之膠原蛋白纖維進行觀察，如圖7所示，測量單一膠原蛋白纖維上的變化倍數，以細胞周邊(CP)區域進行數值標準化，由結果可發現接近NRK-49F細胞的單一結構的膠原蛋白纖維(M)比遠端NRK-49F細胞的單一結構的膠原蛋白纖維(D)更加堅硬。
經上述的實驗結果與數據可證實，本發明所提供的於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，包含使用一種新穎的顯微鏡共軸系統，特別是結合雷射掃描共軛焦顯微鏡與原子力顯微鏡之顯微鏡共軸系統，可同時在一活體單元上觀察細胞與位於細胞周圍作用之蛋白質的分布、型態變化與力學特性，本發明中的顯微鏡共軸系統可達到於一選定感興趣區域同時進行螢光影像及力學特性影像的擷取，大幅減少獨立操作兩種顯微鏡裝置及須對準同一選定之區域所需花費時間，且可減少兩種顯微鏡裝置所需的放置空間，達到具有高效率且高精準率可獲得細胞狀態的功效。
上述之實施例僅用來例舉本發明之實施態樣，以及闡釋本發明之技術特徵，並非用來限制本發明之保護範疇。任何熟悉此技術者可輕易完成之改變或均等性之安排均屬於本發明所主張之範圍，本發明之權利保護範圍應以申請專利範圍為準。
無。
圖1為本發明一實施例之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法流程圖；
圖2為本發明一實施例之使用共軛焦軛顯微鏡及原子力顯微鏡共軸系統選取感興趣區域並檢測待測樣品的簡易實驗流程的示意圖；
圖3為本發明一實施例之待測樣品之控制組與經乙型轉化生長因子(TGF-β1)處理後的螢光影像圖(第一影像)、形貌圖(第二影像)及融合圖(第三影像)；
圖4為本發明一實施例之待測樣品之控制組與經乙型轉化生長因子-(TGF-β1)處理後的待測樣品中異硫氰酸螢光素(FITC)含量的示意圖；
圖5為本發明一實施例之待測樣品中感興趣區域的示意圖；
圖6為本發明一實施例之待測樣品之控制組與經乙型轉化生長因子-(TGF-β1)處理後的彈性模量的示意圖；及
圖7為本發明一實施例之待測樣品之控制組與經乙型轉化生長因子-(TGF-β1)處理後的感興趣區域的彈性模量的示意圖。
Claims (9)
- 一種於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，該方法包括：(a)提供複數個顯微鏡裝置，並將所述顯微鏡裝置以共軸方式組合成一顯微鏡共軸系統，進行待測樣品的成像，所述顯微鏡裝置包含螢光顯微鏡、電子顯微鏡、雷射掃描共軛焦顯微鏡、超高解析度螢光顯微鏡、掃描式探針顯微鏡、磁鑷式顯微鏡、光鑷式顯微鏡、或原子力顯微鏡，其中，所述顯微鏡裝置為雷射掃描共軛焦顯微鏡及原子力顯微鏡的組合；(b)將待測樣品放置於載物台，經由該顯微鏡共軸系統掃描待測樣品；(c)以該顯微鏡共軸系統擷取出待測樣品的一第一影像及一第二影像，再將該第一影像及該第二影像生成為一第三影像，並透過該第三影像劃分出一細胞邊界，該第一影像為一螢光圖像，該第二影像為一高度圖像，該第三影像為一融合圖像；(d)以該顯微鏡共軸系統在該第三影像中，分別就細胞及蛋白質定義出複數個感興趣區域，所述感興趣區域為非固定形狀感興趣區域；(e)以該顯微鏡共軸系統確認待測樣品的力學特性，包含計算細胞的一第一彈性模量及所述感興趣區域中蛋白質的一第二彈性模量；及 (f)以該顯微鏡共軸系統依據該第三影像，並比對該第一彈性模量與該第二彈性模量，獲得待測樣品中的細胞狀態。
- 如請求項1所述之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，其中，該第一影像擷取自雷射掃描共軛焦顯微鏡。
- 如請求項1所述之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，其中，該第二影像擷取自原子力顯微鏡。
- 如請求項1所述之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，其中，所述蛋白質包含彈性蛋白纖維、纖連蛋白纖維、膠原蛋白纖維、或層黏連蛋白纖維。
- 如請求項4所述之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，其中，所述蛋白質為單一結構形式之膠原蛋白纖維。
- 如請求項1所述之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，其中，待測樣品為一纖維化疾病的一活體單元。
- 如請求項6所述之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，其中，該活體單元為一活體細胞。
- 如請求項6所述之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，其中，該纖維化疾病包含肝臟纖維化、骨髓纖維化、心臟纖維化、肺臟纖維化、皮膚纖維化、癌症纖維化、或腎臟纖維化。
- 如請求項7所述之於體外纖維化模式量測細胞力學的方法，其中，該活體細胞為一腎臟纖維母細胞。
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