TWI858977B - 生物標記物組、為個體提供老化標記物水平表示的方法、用於提供對個體的生物年齡預測的方法及套組 - Google Patents

Abstract

本發明提供生物標記物組、為個體提供老化標記物水平表示的方法、用於提供對個體的生物年齡預測的方法及套組。此等組成物及方法可用於預測生物年齡。本發明提供生物年齡預測的生物標記物組包括脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸以及犬尿胺酸。

Description

生物標記物組、為個體提供老化標記物水平表示的方法、用於提供對個體的生物年齡預測的方法及套組

本發明涉及用代謝物生物標記物預測生物年齡的方法及組成物。

老化為生理功能不可避免的長期衰退且為諸如癌症及心血管病的高衝擊慢性疾病的主要風險因素。[1]老化涉及幾十年來廣泛的生理變化及代謝調適。[2]現代「組學」平台，包含基因體、轉錄體、蛋白質體以及代謝體剖析分析，已為生物老化的系統性及不可知表徵提供新的機會。

提供老化標記物、老化標記物組以及用於獲得樣本的老化標記物水平表示的方法。此等組成物及方法可用於多種應用程式，包含例如預測生物年齡。

在本發明的一些態樣中，提供一組老化標記物，所述組包括選自由以下各者組成的群組的一或多個老化標記物：脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸以及犬尿胺酸。

在本發明的一些態樣中，提供一種為個體提供老化標記物水平表示的方法。在一些實施例中，方法包括評估來自個體的血液樣本中的一組老化標記物以測定血液樣本中的各老化標記物的水平；以及基於組中的各老化標記物的水平而獲得老化標記物水平表示。在一些實施例中，組包括選自由以下各者組成的群組的一或多個老化標記物：脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸。在一些實施例中，方法更包括提供老化標記物水平表示的報告。

在本發明的一些態樣中，提供用於進行樣本的老化評定的套組。在一些實施例中，套組包括一或多個偵測元件，所述一或多個偵測元件用於量測包括選自由以下各者組成的群組的一或多個老化標記物的一組老化標記物的樣本中的標記物的量：脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸。

提供老化標記物、老化標記物組以及用於獲得樣本的老化標記物水平表示的方法。此等組成物及方法可用於預測生物年齡。在閱讀下文所更充分描述的組成物及方法的細節後，本發明的此等及其他目標、優點及特徵將對所屬領域中具有通常知識者變得顯而易見。

在描述本發明方法及組成物之前，應理解，本發明並不限於所描述的特定方法或組成物，因此當然可變化。亦應理解，本文所使用的術語僅出於描述特定實施例的目的，且不意欲為限制性的，因為本發明的範疇將僅由隨附申請專利範圍限制。

除非另外定義，否則本文中所使用的所有技術及科學術語具有與本發明所屬領域的所屬領域中具有通常知識者通常所理解相同的含義。儘管類似或等效於本文所描述的方法及材料的任何方法及材料可用於本發明的實踐或測試中，但現描述一些潛在及較佳方法及材料。本文所提及的所有公開案均以引用的方式併入本文中以揭示及描述與所引用的公開案相關的方法及/或材料。應理解，在存在矛盾的情況下，本揭露取代所併入公開案的任何揭露內容。

如所屬領域中具有通常知識者在閱讀本發明之後將顯而易見，本文中所描述及說明的個別實施例中的各者具有離散組分及特徵，其可容易地與其他若干實施例中的任一者的特徵分離或與其組合而不會背離本發明的範疇或精神。任何所列舉方法均可按所列舉事件的次序或按邏輯上有可能的任何其他次序來進行。

必須注意，除非上下文另外明確說明，否則如本文及隨附申請專利範圍所用的單數形式「一(a/an)」及「所述(the)」包含多個參照物。因此，舉例而言參考「細胞」包含多個此類細胞，及參考「胺基酸」包含參考一或多個胺基酸及其等效物，例如，所屬領域中具有通常知識者已知的精胺酸、酪胺酸、蘇胺酸等。

如上文所概述，本發明的態樣包含可用於為個體提供生物年齡預測的方法、組成物、系統以及套組。

在描述本發明時，將首先描述可用於提供生物年齡評定的組成物，繼而描述其使用的方法、系統以及套組。 老化標記物及組

在本發明的一些態樣中，提供老化標記物及老化標記物組。「老化標記物」意謂樣本中的表示與生物年齡相關聯的分子實體。

老化標記物可包含與生物年齡相關聯的胺基酸、肽、脂以及代謝物。

如本發明的實例中所證實，本發明人已鑑別出與生物年齡相關且可組合使用（亦即，作為組）以提供生物年齡預測的多種代謝實體。此等包含但不限於脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸以及其類似物。

如上文所提及，本文中亦提供老化組。藉由老化標記物的「組」，其意謂兩個或大於兩個老化標記物，當組合地或個別地考慮時，其水平可用於提供生物年齡預測。備受關注的為包括老化標記物脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸的組。舉例而言，在一些實施例中，老化組可包括脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸。 方法

在本發明的一些態樣中，提供用於獲得個體的老化標記物水平表示的方法。藉由老化標記物水平表示，其意謂來自個體的生物樣本中的個體老化標記物中的一或多者，例如，老化標記物組的水平的表示。術語「生物樣本」涵蓋自有機體獲得的多種樣本類型且可用於預測分析。術語涵蓋血液及生物源的其他液體樣本或自其衍生的細胞及其後代。所述術語涵蓋已在樣本採購之後以任何方式操控的樣本，諸如藉由用試劑進行處理、溶解或對某些組分增濃來加以操控。所述術語涵蓋臨床樣本且亦包含細胞上清液、細胞裂解物、血清、血漿、生物體液及組織樣本。用於本發明的方法中的臨床樣本可自多種源獲得，尤其是血液樣本。

備受關注的樣本源包含血液樣本或其製劑，例如，全血或血清或血漿以及尿液。在許多實施例中，適用於人類樣本的初始源為血液樣本。因此，個體分析中所用的樣本通常為血液衍生的樣本。血液衍生樣本可衍生自全血或其部分，例如，血清、血漿等，其中在一些實施例中，樣本衍生自血液，使其凝結，且血清經分離及收集以用於分析。

在一些實施例中，樣本為血清或血清衍生的樣本。可採用用於產生流體血清樣本的任何方便的方法。在許多實施例中，方法採用藉由皮膚穿刺（例如，手指刺入、靜脈穿刺）將靜脈血抽取至凝固或血清分離管中，使血液凝結，且使血清與凝結的血液離心。接著收集血清且儲存直至分析為止。一旦獲得患者衍生樣本，則分析樣本以測定老化標記物的水平。

一旦獲得樣本，其可直接使用、冷凍或在適當溫度下維持較短時間段。典型地，樣本將來自人類患者，但可用動物模型，例如馬、牛、豬、犬、貓、嚙齒動物（例如，小鼠、大鼠、倉鼠）、靈長類動物等。典型地，適合的樣本源將衍生自已釋放所關注的分子實體（亦即，代謝物、胺基酸或蛋白質）的流體。

個體樣本可以多種方式處理以便增強一或多個老化標記物的偵測。舉例而言，在樣本為血液的情況下，紅細胞可在分析之前自樣本移除（例如，藉由離心）。此類處理可用以使用親和試劑降低偵測老化標記物的水平的非特異性背景水平。老化標記物的偵測亦可藉由使用所屬領域中眾所周知的程序（例如，酸沈降、酒精沈降、鹽沈降、疏水性沈降、過濾）濃縮樣本來增強。在一些實施例中，測試及對照樣本的pH值將調節至接近中性的pH值且維持在所述pH值處。此類pH值調節將防止複合體形成，藉此提供對樣本中的標記物的水平的更準確定量。在樣本為尿液的實施例中，調節樣本的pH值且濃縮樣本以便增強標記物的偵測。

在實踐本發明方法時，評估來自個人的生物樣本中老化標記物的水平。個體樣本的一或多個老化標記物的水平可藉由任何便利方法評估。舉例而言，老化相關代謝物水平可由量測一或多種老化相關代謝物的血液中的一或多種代謝物（例如，脯胺醯白胺酸）的水平/量來偵測。術語「評估」、「分析」、「量測」、「評定」以及「測定」可互換地用於指任何形式的量測，包含測定元素是否存在，及包含定量測定及定性測定兩者。評估可為相對的或絕對的。

舉例而言，至少一個老化標記物的水平可藉由在樣本中偵測達到生物標記物水平表示的一或多個胺基酸或多肽或其片段的量或水平來評估。如本申請案中所用的術語「胺基酸」及「多肽」為可互換的。「多肽」是指胺基酸的聚合物（胺基酸序列）且不指代分子的特定長度。由此，胜肽及寡肽包含於多肽的定義內。此術語亦指或包含轉譯後經修飾胺基酸及多肽，例如糖基化多肽、乙醯基化多肽、磷酸化多肽及類似者。定義內包含例如含有具有經取代側鏈及鍵聯的一或多種胺基酸類似物的多肽，以及所屬領域中已知的天然存在及非天然存在的其他修飾。

前述格式可藉由首先使樣本結合至分析盤來改變。接著，將初級抗體與分析盤一起培育，繼而使用對初級抗體具有特異性的經標記第二抗體偵測經結合的初級抗體。

一或多個抗體固定於其上的固體基底可由廣泛多種材料製成，且呈廣泛多種形狀，例如微量滴定盤、微珠粒、量桿、樹脂粒子等。可選擇基板以使信號雜訊比最大化，從而使背景結合最小化，以及為了易於分離及成本。洗滌可以最適合於所使用的基底的方式實現，例如藉由自儲集器移除珠粒或量桿，排空或稀釋諸如微量滴定盤孔的儲集器，或用洗滌溶液或溶劑沖洗珠粒、粒子、層析管柱或過濾器。

替代地，可採用量測樣本中的一或多種胺基酸、代謝物以及蛋白質的水平的非ELISA基方法。代表性實例包含但不限於質譜分析、蛋白質體陣列、xMAP™微球體技術、流式細胞測量術、西方印漬術以及免疫組織化學。

為了量測胺基酸、代謝物、脂質濃度，包含樣本中的比率，將採用包含層析術、光譜學以及質譜分析的定量分析方法。液相層析質譜法尤其較佳。層析術可包括GC、LC、HPLC以及UPLC；光譜學可包括UV/Vis、IR以及NMR；以及質譜法可包括ESI-QqQ、ESI-QqTOF、MALDI-QqQ、MALDI-QqTOF以及MALDI-TOF-TOF。較佳使用FIA及HPLC串聯質譜法（高解析度）。此等分析方法通常為所屬領域中具有通常知識者已知。

為量測胺基酸、胺基酸類似物以及代謝物量，靶向代謝體學用於量化樣本中的代謝物，包含胺基酸、生物胺、醯基肉鹼、己醣、鞘脂以及甘油磷脂的分析物類別。定量在經同位素標記的（重）內部標準物存在下進行使用且藉由如上文所描述的方法測定。

所得資料提供關於已經探測的標記中的各者的樣本中的水平的資訊，其中所述資訊係關於是否存在標記物，且通常在何種水平下，且其中資料可為定性及定量兩者。因此，在偵測為定性的情況下，方法提供目標標記物（例如，胺基酸、代謝物或蛋白質）是否存在於所分析樣本中的讀數或評估，例如，評定。在又其他實施例中，方法提供所分析樣本中是否存在目標標記物的定量偵測，亦即所分析樣本中的目標分析物的實際量或相對豐度的評估或評定，例如，胺基酸、代謝物或蛋白質。在此類實施例中，定量偵測可為絕對的，或若方法為相對地偵測樣本中的兩種或大於兩種不同分析物（例如，靶核酸或蛋白質）的方法。因此，當用於定量樣本中的目標分析物（例如，胺基酸、代謝物或蛋白質）的上下文中時，術語「定量」可指絕對或相對定量。絕對定量可藉由包含一或多種對照分析物的已知濃度且用已知對照分析物參考目標分析物的所偵測水平（例如，經由標準曲線的產生）來實現。替代地，相對定量可藉由比較兩種或大於兩種不同目標分析物之間的所偵測水平或量以提供兩種或大於兩種不同分析物中的各者（例如，相對於彼此）的相對定量來實現。

一旦已測定一或多個老化標記的水平，可以多種方式中的任一者分析量測以獲得老化標記物水平表示。

舉例而言，可個別地分析一或多個老化標記物的量測以產生老化特徵曲線。如本文中所使用，「老化特徵曲線」為患者樣本中的一或多個老化標記物的正規化水平，例如患者樣本中血清學胺基酸濃度的正規化水平。可藉由所屬領域中已知的多種方法中的任一種產生特徵曲線。舉例而言，各標記物的水平可相對於選定管家基因的表現或相對於整個組的信號等經log ₂轉化及正規化。計算老化特徵曲線的其他方法將為所屬領域中具有通常知識者容易地已知。

在一些情況下，組中的各標記物的加權因子，或僅「權重」可為樣本中的分析物水平的改變的反映。舉例而言，各老化標記物的分析物水平可經對數轉化且加權為1或-1，且測定經增加標記物的總和相較於經減少標記物之間的比率以達到老化簽名。在其他情況下，在進行診斷、預後或監測評定時，權重可反映各標記物對標記物組的特異性、敏感性及/或準確性的重要性。可藉由任何方便的統計機學習方法測定此類權重，例如，可使用主成分分析法（Principle Component Analysis；PCA）、線性回歸、支援向量機（support vector machine；SVM）及/或自其中獲得樣本的資料集的隨機森林。在一些情況下，各標記物的權重由獲得患者樣本的資料集定義。在其他情況下，可基於參考資料集或「訓練資料集」而定義各標記物的權重。

所屬領域中具有通常知識者可易於藉由採用基於電腦的系統（例如，使用所屬領域中已知的任何硬體、軟體及資料儲存媒體）及採用便於此類分析的任何演算法來執行分析的此等方法。舉例而言，資料探勘演算法可經由「雲端計算」、基於智慧型手機或基於主從式的平台及其類似者應用。

在某些實施例中，評估僅一種標記物的豐度，例如，胺基酸水平，以產生標記物水平表示。在又其他實施例中，評估兩個或大於兩個（亦即，組）標記物的水平。因此，在本發明方法中，評估樣本中至少一個標記物的豐度。在某些實施例中，所作出的評估可視為蛋白質體的評估，因為所述術語用於所屬領域中。

在一些情況下，測定或獲得個體的老化標記物表示（例如，老化特徵曲線）的本發明方法更包括提供老化標記物表示作為報告。由此，在一些情況下，本發明方法可更包含產生或輸出提供樣本中的老化標記物評估的結果的報告的步驟，所述報告可呈電子媒體（例如，電腦監視器上的電子顯示）的形式或呈有形媒體（例如，列印於紙張或其他有形媒體上的報告）的形式提供。可提供任何形式的報告，例如，所屬領域中已知的或如下文更詳細地描述。 效用

由此獲得的老化標記物水平表示為個體提供生物年齡的預測。舉例而言，標記物水平表示可用以預測個體生物年齡。

在一些實施例中，提供生物年齡預測的本發明方法可包括比較所獲得老化標記物水平表示與老化表現型測定元素以鑑別與表現型測定元素的相似性或差異，其中所鑑別的相似性或差異接著用以提供生物年齡預測。藉由「表現型測定元素」，其意謂表示表現型（在此實例中，老化表現型）且可用以測定個體的表現型（例如，個體的生物年齡）的元素，例如，組織樣本、標記物特徵曲線、值（例如，分數）、值的範圍及其類似者。 報告

如本文中所描述，「報告」為電子或有形文件，其包含提供與對個體的評定及其結果相關的所關注資訊的報告元素。在一些實施例中，個體報告包含至少一個老化標記物表示，例如，老化特徵曲線，如上文更詳細地論述。在一些實施例中，個體報告包含至少一個工匠的生物年齡預測。可完全或部分地以電子方式產生個體報告。個體報告可更包含以下中的一或多者：1）關於測試設施的資訊；2）服務提供商資訊；3）患者資料；4）樣本資料；5）評定報告，其可包含含有以下的各種資訊：a）所用參考值及b）測試資料，其中測試資料可包含；6）其他特徵。

報告可包含關於測試設施的資訊，所述資訊與在其中進行樣本收集及/或資料產生的醫院、診所或實驗室相關。樣本收集可包含自個體獲得流體樣本，例如，血液、唾液、尿液等；組織樣本，例如，組織切片等。資料產生可包含量測個體中的標記物濃度。此資訊可包含一或多個關於例如測試設施的名稱及位置、進行分析及/或鍵入輸入資料的實驗室技術員的身分、進行及/或分析的日期及時間、儲存樣本及/或結果資料的位置、分析中所用的試劑（例如，套組等）的批號及其類似者的細節。具有此資訊的報告欄位通常可使用由使用者提供的資訊來填充。

報告可包含關於服務提供商的資訊，所述資訊可位於使用者所位於的醫療設施外部或醫療設施內。此類資訊的實例可包含服務提供商的名稱及位置、檢閱者的名稱，且在必要時或所要的情況下包含進行樣本收集及/或資料產生的個人的名稱。具有此資訊的報告欄位通常可使用由使用者鍵入的資料填充，所述資料可選自預腳本化的選擇（例如，使用下拉式選單）中。報告中的其他服務提供商資訊可包含關於結果及/或關於解譯性報告的技術資訊的連絡人資訊。

報告可包含患者資料節，包含患者病史（其可包含例如，年齡、人種、血清型）以及給藥患者資料，諸如用以鑑別患者的資訊（例如，名稱、患者出生日期（date of birth；DOB）、性別、郵遞及/或居住位址、病歷編號（medical record number；MRN）、醫療設施中的房間及/或床號）、保險資訊以及類似者），排班監測評定患者的醫師或其他健康專業人員的名稱，且若不同於排班醫師，則負責患者的照顧的臨床醫師的名稱（例如，主治醫師）的名稱。

報告可包含樣本資料節，其可提供關於監測評定中所分析的生物樣本的資訊，諸如自患者獲得的生物樣本的來源（例如，血液、唾液或組織類型等），樣本如何處置（例如，儲存溫度、預備協定）以及收集的日期及時間。具有此資訊的報告欄位通常可使用由使用者鍵入的資料填充，所述資料中的一些可提供為預腳本化的選擇（例如，使用下拉式選單）。報告可包含結果部分。

報告可包含評定報告部分，其可包含在如本文所描述的資料的處理之後所產生的資訊。解譯性報告可包含生物年齡的預測。

亦將容易瞭解，報告可包含額外元素或經修飾元素。舉例而言，在電子情況下，報告可含有指向內部或外部資料庫的超連結，所述內部或外部資料庫提供關於報告的選定元素的更詳細資訊。舉例而言，報告的患者資料元素可包含至電子患者記錄的超連結或用於存取此患者記錄的位點，所述患者記錄維持在機密資料庫中。此後一實施例可在醫院系統或臨床環境中受到關注。當在電子格式中時，報告記錄於適合實體媒體上，諸如電腦可讀媒體上，例如電腦記憶體、壓縮磁碟、CD、DVD等中。

應易於瞭解，報告可包含以上所有或一些元素，其限制條件為報告通常包含至少足以提供使用者請求的分析的元素（例如，所計算的老化標記物水平表示；生物年齡的預測）。 試劑、系統以及套組

亦提供用於實踐上述方法中的一或多者的其試劑、系統以及套組。其個體試劑、系統以及套組可極大地改變。所關注試劑包含特定設計以用於自樣本產生老化標記物的上述標記物水平表示的試劑，例如一或多個偵測元件，例如，用於偵測蛋白質、胺基酸、代謝物以及蛋白質等的抗體或胺基酸。在一些情況下，偵測元件包括用以偵測單一老化標記物的豐度的試劑，例如偵測元件可為量桿、板、陣列或包括一或多個偵測元件的混合物，例如，一或多種抗體、一或多個胺基酸、一或多組核苷酸等，其可用以同時偵測一或多個老化標記物的豐度。

一種特定定製用於產生例如老化標記物水平表示的標記物水平表示的試劑為特定結合於胺基酸標記物的抗體的集合，例如，呈ELISA格式、xMAP™微球體格式、在陣列上、在懸浮液中用於藉由流式細胞測量術、藉由西方印漬術、藉由點印漬術或藉由免疫組織化學進行分析。使用其的方法在所屬領域中已充分瞭解。此等抗體可提供於溶液中。替代地，其可經提供預結合至固體基質，例如多孔培養皿的孔或xMAP微球體的表面。

另一類型的此類試劑為靶向胺基酸或代謝物的探針陣列，其中呈現所關注生物標記物。多種不同陣列格式為所屬技術領域中已知，具有廣泛多種不同探針結構、基底組成物以及附接技術(例如，點漬墨法陣列、微陣列等)。所關注代表性陣列結構包含以下美國專利號中所描述的彼等陣列結構：5,143,854；5,288,644；5,324,633；5,432,049；5,470,710；5,492,806；5,503,980；5,510,270；5,525,464；5,547,839；5,580,732；5,661,028；5,800,992；所述美國專利的揭露內容以引用的方式併入本文中；以及WO 95/21265；WO 96/31622；WO 97/10365；WO 97/27317；EP 373 203；以及EP 785 280。

特定定製用於產生代謝物（例如，老化代謝物）的標記物水平表示的另一種類型的試劑為設計成選擇性偵測及定量此類胺基酸或代謝物（例如，使用質譜法技術）的含有胺基酸的重同位素的集合。標記物的重同位素及其使用方法描述於美國專利第5,994,076號中，其揭露內容以引用的方式併入本文中。

備受關注的為探針陣列、引子集合或抗體集合，其包含對選自由以下各者組成的群組中的至少1種標記物具有特異性的探針、引子或抗體（亦稱為試劑）：脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸或與代謝路徑相關的生物化學基底。在某些實施例中，探針、重同位素以及抗體的集合包含對以下具有特異性的試劑：脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸以及在相關路徑中特異的生物化學基底。本發明探針、重同位素或抗體集合或試劑可包含僅對於上文所列的胺基酸及代謝物具有特異性的試劑，或其可包含對上文未列的額外基因/蛋白質/脂/輔因子具有特異性的試劑，諸如對表現模式為所屬技術領域中已知與生物年齡相關聯的基因/蛋白質/脂/輔因子具有特異性的探針、重同位素、引子或抗體。

在一些情況下，可提供一種系統。如本文中所使用，術語「系統」是指例如藉由採購來自相同或不同來源的試劑的集合而經編譯的試劑的集合。在一些情況下，可提供一種套組。如本文中所使用，術語「套組」是指一起提供，例如一起出售的試劑的集合。舉例而言，樣本核酸或蛋白質的基於核酸或抗體的偵測分別可與電化學生物感測器平台耦接，所述平台將允許對此等生物標記物進行多重測定以用於個性化生物年齡預測。

本發明的系統及套組可包含上述陣列、胺基酸特異性抗體集合、重原子標準或蛋白質特異性抗體集合。系統及套組可更包含在多種方法中採用的一或多種額外試劑，諸如用於產生目標標準、重原子標準、可預混合或分離的目標抗原標準的引子、一或多個獨特標記的染料、具有不同散射光譜的金粒子或銀粒子，或其他合成後標記試劑，諸如螢光染料/酶的化學活性衍生物、酶，諸如螢光素酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、及其類似者，各種緩衝介質，例如，雜交及洗滌緩衝液、預製探針陣列、經標記探針純化試劑及組分，如自旋柱等，信號產生及偵測試劑，例如，經標記二級抗體、鏈球菌親生物素蛋白-鹼性磷酸酶共軛、化學螢光或化學發光基底及其類似者。

除以上組分以外，本發明套組將更包含用於實踐本發明方法的說明書。此等說明書可以各種形式存在於個體套組中，套組中可存在一或多個說明書。可存在此等說明書的一種形式為作為適合介質或基底上的列印資訊，例如在其上列印有資訊的一或多頁紙張、於所述套組的封裝中、於藥品說明書中等。又另一方式為上面已記錄有資訊的電腦可讀取媒體，例如磁片、CD等。可能存在的又一方式為可用於經由網際網路在經移除位點處存取資訊的網址。任何方便工具均可存在於套組中。

提供以下實例作為說明而非作為限制。 實例

提出以下實例以便為所屬技術領域中具有通常知識者提供如何製備及使用本發明的描述，且不意欲限制本發明人視為其發明的內容的範疇，其亦不意欲表示以下實驗為所執行的所有實驗或唯一實驗。已努力確保關於所用數量（例如，量、溫度等）的準確性，但應考量存在一些實驗性誤差及偏差。除非另外指明，否則份數為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度以攝氏度計，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。 實例1

老化為生理功能不可避免的長期衰退且為諸如癌症及心血管病的高衝擊慢性疾病的主要風險因素。[1]老化涉及幾十年來廣泛的生理變化及代謝調適。[2]現代「組學」平台，包含基因體、轉錄體、蛋白質體以及代謝體剖析分析，已為生物老化的系統性及不可知表徵提供新的機會。

稱為「DNAm年齡」的基於全基因體DNA甲基化可跨大部分組織及單元類型以高準確性預測實齡。併入複合臨床措施，稍後研發出「DNAm PhenoAge」[3]作為老化的單一表觀遺傳生物標記，以捕捉跨越多個組織及細胞的一系列不同結果的風險。基於七個DNAm代替物及基於DNAm的吸菸包-年的估計量，研發「DNAm GrimAge」[4]作為複合生物標記物以研究老化及年齡相關的性狀。

發現代謝症候群[5]與諸如mTOR、AMP-活化蛋白質激酶（AMP-activated protein kinase；AMPK）及胰島素/胰島素生長因子（insulin growth factor；IGF）的關鍵代謝蛋白質相關且緊密調節。[6，7]代謝控制失調似乎與老化的長期致病效應有關，且與高衝擊慢性病風險的增加相關。在前所未有的高解析度代謝體覆蓋的情況下，研發代謝體學年齡模型[8，9]以評定生物年齡。代謝體學及表觀遺傳老化時鐘使用不同生物標記物，但兩者均可與捕捉老化的時序相關[9]。

在此研究中，吾人使用深度代謝體學表型來調查來自跨越50歲的一般群體個人的超過三千健康個人的整體代謝體學模式變化。吾人假設高解析度代謝體學剖析可展現預測實齡的獨特年齡相關模式。 材料及方法

患者及公眾參與 .患者或公眾不涉及吾人的研究的設計或進行或報告或傳播計劃。

健康一般人群個體 .若個體為至少18歲，未服用抵抗高衝擊慢性疾病（包含心血管病、糖尿病等)的任何藥物或經診斷患有任何類型的腫瘤或癌症，則符合條件。登記及排除任何癌症病變及/或慢性疾病的三年隨訪。排除之後，有總計3002名健康一般人群樣本用於此研究中。自每個人收集一個血清樣本。

樣本製備 .在樣本收集標準操作程序（standard operating procedure；SOP）之後收集患者全血樣本以產生血清。自-80℃冷凍器擷取血清樣本且在冰上解凍。將由甲醇、乙腈以及ddH2O（5:3:2 v/v）組成的240微升萃取緩衝液（儲存在-20℃下）的混合物添加至10微升各樣本中。樣本在4℃下渦旋且接著在相同溫度下以12,000公克離心30分鐘。將來自各樣本的上清液（170微升）轉移至小瓶中且在注射之前儲存在-20℃下。

MS 獲取 .流動注射分析（Flow-injection analysis；FIA）用QE-Plus質譜儀（賽默飛（Thermo Fisher））執行。用由含0.1%甲酸的5%乙腈組成的移動相（以50微升/分鐘的流動速率）以每3分鐘10微升注射樣本。所注射樣本在4千伏及325℃下噴射且在60-900的m/z範圍內以140,000的解析度經掃描。游離模式設定成陽性及陰性兩者，繼而收集各樣本的完整代謝譜。同時，亦在資料相依性獲取（data-dependent acquisition；DDA）模式中根據先前公開的協定用液相層析-串聯質譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry；LC-MS/MS）分析此等樣本。

MS QA/QC.與實驗樣本共同分析若干類型的對照：測試基質樣本；藉由獲取小體積的各實驗樣本產生的池；QC基質樣本；充分表徵的人類血清（定義西格瑪-阿爾德里奇（Sigma-Aldrich）、S1M、人類血清、正常）的池充當整個資料集中的技術複製；提取的水樣本充當處理空白。藉由計算在注射至質譜儀中之前添加至各樣本的標準物的中值相對標準差（relative standard deviation；RSD）來測定儀器變化。布蘭德-奧爾特曼（Bland-Altman）圖2用於分析品質控制的兩個不同運行之間的一致性。藉由計算100%所彙集QC基質樣本中存在的所有內源性代謝物的中值RSD來測定總過程可變性。實驗樣本在平台運行中隨機分配。為了減輕潛在血液處理及批次差異，QC基質樣本在注射中均勻間隔（每10個測試血清）以確保來自代謝體學分析的批次內及批次間一致性（補充表4）。使用R（版本4.0.3）程式設計語言及R套裝軟體執行此研究中的所有資料分析。用R Stats（版本4.0。3，統計分析）封裝來執行單變量統計分析。

MS 資料處理 .用ProteoWizard轉換及集中原始MS文件且將其儲存為mzXML文件3。注射區及m/z帶用proFIA（版本1.15.0，質譜資料預處理分析）封裝4偵測。偵測帶接著經對準以自xcms（版本3.12.0，高解析度質譜分析）封裝5用MzClust方法得到相同批次中的樣本的資料矩陣。將局部估計散佈圖平滑（locally estimated scatterplot smoothing；LOESS）模型應用於各組對準帶以移除沿注射過程6的批次內漂移。藉由標準化至各組對準帶的正常基線的中值（亦即，代謝特徵）來移除批次間差異。移除具有超過30%漏測值的代謝特徵。經過濾資料矩陣經log2轉化，以各代謝特徵中的正常群體的平均值及標準差（standard deviation；SD）為中心且按比例調整。最後，漏測值為使用來自設算（impute）(版本1.64.0，KNN設算分析)封裝的k-最近相鄰（kNN）演算法設算。

質譜特徵註解 .健康一般人群個體隨機分成訓練（75%）集或測試（25%）集。在年齡相關聯路徑的下游彈性淨分析期間，不同單變量|r|臨限值（0.3、0.4、0.5、0.6）用於選擇與實齡相關的LCMS特徵。訓練集中的LCMS代謝特徵首先與實齡相關且保留具有絕對相關係數的彼等特徵|r|≧0.3。如由代謝體學標準起始方案7所定義，存在四級代謝物鑑別可信度：確信鑑別的化合物（1級）、假定註解的化合物（2級）以及假定註解的化合物類別（3級）以及未知化合物（4級）。經由KEGG化合物資料庫9用xMSannotator8以百萬分之5的公差對保留的特徵進行註解（2級或3級）。

結構鑑別及代謝物生物標記物發現決定性（1級）鑑別需要比較所關注的代謝物的諸如留存時間、m/z以及碎片質譜的兩個或大於兩個正交性質與相同分析條件下觀察到的真實化學標準的相同性質。根據MSI 10，代謝物生物標記物鑑別作為化學標準的1級鑑別執行。藉由血清樣本的串聯質譜（MS/MS，Thermo Q Exactive plus，賽默飛）資料及人工審查確認，在以下公共資料庫中搜尋所產生的MS1/MS2對：HMDB11 （http://www.hmdb.ca/）、MoNA （http://mona.fiehnlab.ucdavis.edu/）、MassBank （http://www.massbank.jp/）、METLIN12 （https://metlin.scripps.edu）以及NIST (https://www.nist.gov/)。使用與樣本分析相同的LCMS/MS協定，取得所關注的代謝物且使其經受1級鑑別，比較留存時間、MS1及MS2模式與生物標記物候選項。代謝物生物標記物候選項選自滿足所有以下準則的代謝物：（a）代謝物出現於重要性分數＞0的貢獻路徑中；（b）代謝物的對應代謝特徵滿足 ；（c）藉由結構鑑別驗證代謝物。 結果

一般人群的研究定群 .研究設計及方法概述於圖1中。總計3002名健康一般人群。

獨特的全球代謝體學模式經鑑別回歸至實齡. 使用高解析度質譜法剖析血清學代謝體，鑑別1,603個非靶向代謝特徵。在59種代謝路徑的註解中，1,603種代謝特徵中的157種發現與50年的時間段內的老化（皮爾森相關性，|r|≧0.3）相關聯。將經註解質譜特徵聚集至相關KEGG路徑中，且各路徑的值經計算為路徑上的代謝物的正規化濃度除以經映射代謝物的數目的加權和。使用彈性網路方法對此等59條路徑按實齡回歸，且發現59條路徑中的42條對多變量回歸有貢獻，重要性分數為正。42條路徑共同地實現對實齡的改良回歸（補充圖1）：訓練，r=0.88, 95%CI 0.88-0.89，斜率=0.98，95%CI 0.95-1.00；測試，r=0.81，95%CI 0.80-0.83，斜率=0.96，95%CI 0.90-1.01。藉由實齡的皮爾森相關性進行排序的前10條代謝路徑包含：膽汁分泌、類固醇激素生物合成、ABC轉運蛋白、組胺酸代謝、核黃素代謝、化學性癌生成、苯丙胺酸代謝、檸檬酸鹽循環、嘧啶代謝、泛醌以及其他萜類醌生物合成。單獨對所有患者（所有）、男性以及女性執行基於路徑的多變量回歸分析：訓練及測試中的皮爾森相關係數（r）分別為0.88/0.90/0.91（所有/男性/女性）及0.81/0.78/0.87（所有/男性/女性）。此等三個人群中的皮爾森相關係數在統計學上顯著（ p值=0.0001）。正貢獻路徑特徵的重要性分數的分級在所有、男性以及女性當中類似。舉例而言，類固醇激素生物合成路徑在「所有」及「男性」的模型中排序前2，且在女性的模型中排序前3。

基於九種血清代謝物的代謝老化時脈 .線性模型將代謝路徑連結至老化。自顯著老化相關聯路徑產生的包含清單中選擇，吾人建立以鑑別一組代謝物生物標記物以充當「代謝老化時脈」意義評定老化。代謝物生物標記物候選項（單變量分析：|r|≧0.3）的特徵在於：（1）1級化合物鑑別以及（2）多變量回歸以共同地回歸實齡。藉由彈性網路正規化迴歸的正重要性分數，鑑別九種代謝物（結構鑑別：圖2的A）來建構基於化合物的組以定量各健康或CRC個體的代謝年齡。此基於九種化合物的組在此研究中定義為「代謝老化時脈」。多變量分析（重要性分數，IS（importance scores；IS）圖2的B ）及單變量分析（皮爾森相關係數，r，圖2的C）兩者的結果概述於表1中。基於九種生物標記物（各具有|r|＞0.4）的代謝老化時脈共同實現對實齡的改良回歸（圖3）：訓練，r=0.95，95%CI 0.946-0.954，斜率=1.00，95%CI 0.97-1.03；測試，r=0.87，95%CI 0.85-0.89，斜率=0.96，95%CI 0.90-1.03。分別對所有、男性以及女性執行基於九種生物標記物的多變量回歸分析：訓練及測試中的皮爾森相關係數（r）分別為0.95/0.97/0.97（所有/男性/女性，p值，0.24）及0.87/0.81/0.89（所有/男性/女性，p值＜ 0.0001）。 表 1

代謝物	KEGG/HMDB項	R	IS
脯胺醯白胺酸		0.534	100
脫氫表雄固酮硫酸鹽 （DHEAS）	C04555	-0.599	74.30
瓜胺酸	C00327	0.586	52.06
3-(4-羥基苯基)乳酸鹽	C00642	0.443	43.37
檸檬酸鹽	C00157	0.518	42.27
古洛糖酸	C00800	0.571	27.85
鳥胺酸	C00077	0.499	25.86
苯丙胺酸	C00079	0.414	2.92
犬尿胺酸	C00328	0.442	1.04

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無

當結合隨附圖式閱讀時，自以下詳細描述最佳地理解本發明。專利或申請案文件含有至少一個圖式。強調的是，根據慣例，圖式的各種特徵未按比例。相反地，為清楚起見，任意地擴展或減小各種特徵的尺寸。在圖式中包含以下諸圖。 圖 1.老化研究的代謝體資料產生及分析工作流程。 圖 2.老化相關的生物標記物的結構鑑別。（A）藉由標準化合物確認預測基於路徑的代謝老化時脈之下的實齡的代謝物。（B）基於生物標記物的代謝老化時脈中的經鑑別生物標記物的重要性分數。C1：脯胺醯白胺酸；C2：DHEAS；C3：瓜胺酸；C4：3-(4-羥基苯基)乳酸鹽；C5：檸檬酸鹽；C6：古洛糖酸；C7：鳥胺酸；C8：苯丙胺酸；C9：犬尿胺酸。（C）老化生物標記物隨實齡而變化的單變量軌跡。 圖 3.基於九種代謝物的代謝老化時脈。來自健康一般人群的訓練（A.75%）及測試（B.25%）中的代謝老化的預測。

Claims (5)

1. 一種提供生物年齡預測的生物標記物組，包括脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸以及犬尿胺酸。
2. 一種為個體提供老化標記物水平表示的方法，包括：評估來自個體的生物樣本中的一組老化標記物，以測定所述生物樣本中的每一所述老化標記物的水平；以及基於一組所述老化標記物的水平而獲得所述老化標記物水平表示，個別地分析所述老化標記物的量測以產生老化特徵曲線，所述老化特徵曲線為所述老化標記物的正規化水平，其中一組所述老化標記物包括脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸。
3. 如請求項2所述的為個體提供老化標記物水平表示的方法，更包括提供所述老化標記物水平表示的報告。
4. 一種用於提供對個體的生物年齡預測的方法，包括：獲得來自個體的樣本的老化標記物水平表示，個別地分析老化標記物的量測以產生老化特徵曲線，所述老化特徵曲線為所述老化標記物的正規化水平；以及基於所述老化標記物水平表示而提供對所述個體的生物年齡預測，比較所述老化標記物水平表示與老化表現型測定元素，以鑑別與所述老化表現型測定元素的相似性或差異，所鑑別的相似性或差異用以提供所述生物年齡預測，其中所述老化標記物水平表示是基於包括脯胺醯白胺酸、 DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸的一組老化標記物中的每一所述老化標記物的水平而獲得。
5. 一種用於進行生物年齡預測的套組，包括：一或多個偵測元件，用於量測包括脯胺醯白胺酸、DHEAS、瓜胺酸、3-(4-羥基苯基)乳酸鹽、檸檬酸鹽、古洛糖酸、鳥胺酸、苯丙胺酸、犬尿胺酸的一組老化標記物的樣本中的標記物的量；以及對於所述標記物具有特異性的探針、引子或抗體。