TWI856979B - 三特異性抗ｃｄ３８、抗ｃｄ２８和抗ｃｄ３結合蛋白和用於治療病毒感染的使用方法 - Google Patents
三特異性抗ｃｄ３８、抗ｃｄ２８和抗ｃｄ３結合蛋白和用於治療病毒感染的使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本公開文本提供使用三特異性結合蛋白治療病毒感染的方法，所述三特異性結合蛋白包含形成特異性地結合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽)、CD28多肽和CD3多肽的三個抗原結合位點的四條多肽鏈。
Description
本申請主張下述申請案的優先權利益：2018年10月9日提交的國際申請號PCT/US2018/055084；2019年4月9日提交的美國臨時申請序列號62/831,572；2019年4月9日提交的美國臨時申請序列號62/831,608；和2019年9月11日提交的歐洲申請號19306097.7；所有上述申請都是通過引用以其整體併入本文。
【ASCII文本文件序列表的提交】
將以下提交的ASCII文本文件的內容通過引用以其整體併入本文：計算機可讀形式(CRF)的序列表(文件名：183952032140SEQLIST.TXT，記錄日期：2019年10月2日，大小：144KB)。
本公開文本涉及使用三特異性結合蛋白擴增記憶T細胞(例如，病毒特異性記憶T細胞)和/或治療慢性病毒感染的方法，所述三特異性結合蛋白包含形成特異性結合CD38多肽(例如，人和/或食蟹猴CD38多肽)、CD28多肽和CD3多肽的三個抗原結合位點的四條多肽鏈。
作為人類適應性免疫的一部分，T細胞免疫在控制病毒感
染、消除感染細胞方面具有關鍵作用，這導致病毒感染的清除。在如皰疹病毒感染(HSV、CMV、EBV等)、HIV和HBV的慢性感染性疾病中，病毒通過包括免疫抑制、T細胞耗竭和潛伏期建立在內的多種機制在人體內建立其持久性。然而，病毒感染通常誘導包括抗原特異性CD8 T細胞的病毒抗原特異性免疫，所述抗原特異性CD8 T細胞可以容易地識別感染細胞，用於通過細胞因子釋放或細胞毒性T細胞(CTL)介導的殺傷過程來進行控制或殺傷。
因此，在體內和/或體外的病毒抗原特異性T細胞激活和/或擴增可以提供針對慢性病毒感染的治療策略。
本文提供了抗CD38/CD28xCD3三特異性抗體，開發並評價了其在激活T細胞以及隨後增生和/或擴增抗原特異性T細胞方面的潛力。這些三特異性Ab可以有效地在體外擴增CD4和CD8效應和記憶群體，所述群體包括抗原特異性CD8 T中樞記憶細胞和效應記憶細胞。具體地，證明了CMV、EBV、HIV-1、流感特異性CD8中樞記憶細胞和效應記憶細胞的體外擴增。本文所述的抗CD38/CD28xCD3三特異性抗體通過接合CD3/CD28/CD38，從而提供刺激並擴增T細胞的信號傳導途徑來展現新穎特性，這可以提供治療慢性感染性疾病(如HSV、CMV、EBV、HIV-1和HBV感染)的有效策略。
為了滿足這些和其他需求，本文提供了結合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)、CD28多肽和CD3多肽的結合蛋白。
在一些實施例中，本文提供了擴增病毒特異性記憶T細胞的方法，其包括使病毒特異性記憶T細胞與結合蛋白接觸，其中所述結合蛋白包含形成所述三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且
其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，
其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且
其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點。
在一些實施例中，本文提供了包含形成所述三個抗原結合位點的四條多肽鏈的結合蛋白，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且
其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點，從而使所述結合蛋白用於擴增病毒特異性記憶T細胞。
在一些實施例中，在體外或離體使所述病毒特異性記憶T細胞與所述結合蛋白接觸。在一些實施例中，使所述病毒特異性記憶T細胞與所述結合蛋白接觸引起病毒特異性記憶T細胞的激活和/或增生。
在一些實施例中，本文提供了擴增T細胞的方法，其包括在體外或離體使T細胞與結合蛋白接觸，其中所述結合蛋白包含形成三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且
其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，
其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且
其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點。
在一些實施例中，本文提供了包含形成所述三個抗原結合位點的四條多肽鏈的結合蛋白，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且
其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，
其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且
其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點，從而使所述結合蛋白用於擴增T細胞的方法。
在一些實施例中，所述T細胞是記憶T細胞或效應T細胞。在一些實施例中，所述T細胞在其細胞表面上表現嵌合抗原受體(CAR)或包含編碼CAR的多核苷酸。
在一些實施例中，本文提供了治療慢性病毒感染的方法，其包括向有需要的個體投予有效量的結合蛋白，其中所述結合蛋白包含形成所述三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且
其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，
其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且
其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點。
在一些實施例中，本文提供了包含形成所述三個抗原結合位點的四條多肽鏈的結合蛋白，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點，從而使所述結合蛋白用於治療慢性病毒感染的方法，其中所述方法包括向有需要的個體投予有效量的所述結合蛋白。在一些實施例中，本文提供了用於治療慢性病毒感染的方法的結合蛋白，其中所述方法包括向有需要的個體投予有效量的所述結合蛋白，其中所述結合蛋白包含形成所述三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中所述結合蛋白的第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
並且所述結合蛋白的第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]
並且所述結合蛋白的第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且所述結合蛋白的第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；並且
其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，
其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且
其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點。
在一些實施例中，所述個體是人。在一些實施例中，將所述結合蛋白以包含所述結合蛋白和醫藥上可接受的載劑的藥物配製品的形式投予至所述個體。在一些實施例中，所述結合蛋白的投予導致所述個體體內病毒特異性記憶T細胞的激活和/或增生。
在可以與本文所述的任何其他實施例組合的一些實施例中，所述記憶T細胞是CD8+或CD4+記憶T細胞。在一些實施例中，所述記憶T細胞是中樞記憶T細胞(TCM)或效應記憶T細胞(TEM)。
在可以與本文所述的任何其他實施例組合的一些實施例中，所述CD28多肽是人CD28多肽，其中所述CD3多肽是人CD3多肽，並且其中所述CD38多肽是人CD38多肽。
在可以與本文所述的任何其他實施例組合的一些實施例中，所述VH3結構域包含：含有GYTFTSFN(SEQ ID NO：31)的胺基酸序
列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO：32)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；並且所述VL3結構域包含：含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO：34)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO：35)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，所述VH3結構域包含：含有GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；並且所述VL3結構域包含：含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO：39)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，所述VH3結構域包含：含有GFTFSSYG(SEQ ID NO：41)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IWYDGSNK(SEQ ID NO：42)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO：43)的胺基酸序列的CDR-H3序列；並且所述VL3結構域包含：含有QGIRND(SEQ ID NO：44)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO：45)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO：46)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，所述VH3結構域包含
(SEQ ID NO：5)的胺基酸序列，並且所述VL3結構域包含
(SEQ ID NO：6)的胺基酸序列。在一些實施例中，所述VH3結構域包含
(SEQ ID NO：13)的胺基酸序列，並且所述VL3結構域包含
(SEQ ID NO：14)的胺基酸序列。在一些實施例中，所述VH3結構域包含
(SEQ ID NO：17)的胺基酸序列，並且所述VL3結構域包含
(SEQ ID NO：18)的胺基酸序列。在一些實施例中，所述VH3結構域包含
(SEQ ID NO：21)的胺基酸序列，並且所述VL3結構域包含
(SEQ ID NO：18)的胺基酸序列。在一些實施例中，所述VH3結構域包含
(SEQ ID NO：23)的胺基酸序列，並且所述VL3結構域包含
(SEQ ID NO：18)的胺基酸序列。在一些實施例中，所述VH3結構域包含
(SEQ ID NO：9)的胺基酸序列，並且所述VL3結構域包含
(SEQ ID NO：10)的胺基酸序列。
在可以與本文所述的任何其他實施例組合的一些實施例中，所述VH1結構域包含：含有GYTFTSYY(SEQ ID NO：108)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO：109)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO：110)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL1結構域包含：含有QNIYVW(SEQ ID NO：111)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO：112)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO：113)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，所述VH1結構域包含：含有GFSLSDYG(SEQ ID NO：114)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IWAGGGT(SEQ ID NO：115)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARDKGYSYYYSMDY(SEQ ID NO：116)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL1結構域包含：含有ESVEYYVTSL(SEQ ID NO：117)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO：118)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQSRKVPYT(SEQ ID NO：119)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，所述VH1結構域包含
(SEQ ID NO：49)的胺基酸序列，並
且所述VL1結構域包含
(SEQ ID NO：50)的胺基酸序列。在一些實施例中，所述VH1結構域包含
(SEQ ID NO：51)的胺基酸序列，並且所述VL1結構域包含
(SEQ ID NO：52)的胺基酸序列。
在可以與本文所述的任何其他實施例組合的一些實施例中，所述VH2結構域包含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO：120)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO：121)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO：122)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL2結構域包含：含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO：123)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO：124)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO：125)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，所述VH2結構域包含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO：126)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO：127)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有GVYYALSPFDY(SEQ ID NO：128)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL2結構域包含：含有QSLVHNNGNTY(SEQ ID NO：129)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO：130)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO：131)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，所述VH2結構域包含
(SEQ ID NO：53)的胺基酸序列，並且所述VL2結構域包含
(SEQ ID NO：54)的胺基酸序列。在一些實施例中，所述VH2結構域包含
(SEQ ID NO：84)的胺基酸序列，並且所述VL2結構域包含
(SEQ ID NO：85)的胺基酸序列。
在可以與本文所述的任何其他實施例組合的一些實施例中，L1、L2、L3或L4中的至少一個獨立地為0個胺基酸的長度。在一些實施例中，L1、L2、L3和L4各自獨立地為零個胺基酸的長度或包含選自以下項的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：57)、GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)。在一些實施例中，L1、L2、L3和L4各自獨立地包含選自以下項的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：57)、GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)。在一些實施例中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：57)，L3包含序列S，並且L4包含序列RT。
在可以與本文所述的任何其他實施例組合的一些實施例中，所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234和235的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A和L235A。在一些實施例中，所述第二和所述第三多肽鏈
的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置233-236的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236處的缺失。在一些實施例中，所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P和R409K。在一些實施例中，所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG1鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置234、235和329的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些實施例中，所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG1鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置298、299和300的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S298N、T299A和Y300S。在一些實施例中，所述第二多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；並且其中所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。在一些實施例中，所述第二多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；並且其中所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：
61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列。
在可以與本文所述的任何其他實施例組合的一些實施例中，所述病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、巨細胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-barr virus)(EBV)、人泡沫病毒(HFV)、單純皰疹病毒1(HSV-1)或單純皰疹病毒2(HSV-2)。
應當理解，可以將本文描述的各個實施例的一個、一些或所有特性進行組合以形成本發明的其他實施例。本發明的這些和其他態樣對於業內熟習此項技術者將變得清楚。本發明的這些和其他實施例由隨後的具體實施方式進行進一步描述。
圖1提供了包含四條多肽鏈的三特異性結合蛋白的示意圖，所述四條多肽鏈形成結合以下三種靶蛋白的三個抗原結合位點：CD28、CD3和CD38。第一對多肽擁有具有交叉取向的雙重可變結構域(VH1-VH2
和VL2-VL1)，所述雙重可變結構域形成識別CD3和CD28的兩個抗原結合位點，並且第二對多肽擁有單一可變結構域(VH3和VL3)，所述單一可變結構域形成識別CD38的單一抗原結合位點。圖1中所示的三特異性結合蛋白使用具有「杵臼結構(knob-into-hole)」突變的IgG4恒定區，其中杵位於具有單一可變結構域的第二對多肽上。
圖2概述了如通過SPR所測量的所指示三特異性結合蛋白針對其同源抗原(人CD3、CD28和CD38)的結合親和力。
圖3概述了如通過SPR或流式細胞術(FACS)所測量的所指示的抗CD38x抗CD28x抗CD3三特異性結合蛋白對人CD38的結合親和力。
圖4A至圖4D顯示了對響應於CD38VH1/CD3midxCD28sup三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。通過在不存在外源細胞因子的情況下用350ng/孔的CD38三特異性Ab塗覆井孔(coating well)來對T細胞亞群擴增進行評價。在所指示的時間點測量T細胞群。使用具有三個突變的抗原結合結構域的三特異性Ab作為陰性對照。使用流式細胞術確定中樞(Tcm)和效應記憶(Tem)CD4 T細胞(圖4A)、T輔助細胞(Th1、Th17、Th2)(圖4B)、中樞(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8 T細胞(圖4C)以及巨細胞病毒(CMV)pp65特異性CD8細胞(圖4D)，如實例3中所述。通過對來自用CD38三特異性或三重陰性對照抗體處理的HLA-A2 CMV+供體的外周血單核細胞(PBMC)的五聚體染色進行對CMV特異性pp65效應細胞的分析。
圖5A至圖5B顯示了對從CMV感染的供體B收集的PBMC中響應於CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。在所指示的時間點測量T細胞群。使用三重突變體三特異性抗體作為陰性對照。使用流式細胞術對CMV特異性記憶CD8+ T細胞(圖5A)以及CMV特異性中樞記憶(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8+ T細胞(圖5B)進行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進CMV特異性記憶CD8+ T細胞的增生。
圖6A至圖6B顯示了對從CMV感染的供體C收集的PBMC中響應於CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。在所指示的時間點測量T細胞群。使用三重突變體三特異性抗體作為陰性對照。使用流式細胞術對CMV特異性記憶CD8+ T細胞(圖6A)以及CMV特異性中樞記憶(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8+ T細胞(圖6B)進行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進CMV特異性記憶CD8+ T細胞的增生。
圖7A至圖7B顯示了對從愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)感染的供體A收集的PBMC中響應於CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。在所指示的時間點測量T細胞群。使用三重突變體三特異性抗體作為陰性對照。使用流式細胞術對EBV特異性記憶CD8+ T細胞(圖7A)以及EBV特異性中樞記憶(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8+ T細胞(圖7B)進行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進EBV特異性記憶CD8+ T細胞的增生。
圖8A至圖8B顯示了對從EBV感染的供體B收集的PBMC中響應於CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。在所指示的時間點測量T細胞群。使用三重突變體三特異性抗體作為陰性對照。使用流式細胞術對EBV特異性記憶CD8+ T細胞(圖8A)以及EBV特異性中樞記憶(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8+ T細胞(圖8B)進行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進EBV特異性記憶CD8+ T細胞的增生。
圖9顯示了在基線時(第0天；在與三特異性抗體一起孵育之前)針對HIV Gag特異性CD8+ T細胞(與PE綴合的A*02：01-SLYNTVATL(HIV-1 gag p17 76-84)五聚體，ProImmune)測定的來自所指示的人類免疫缺陷病毒(HIV)陽性供體(底部圖和頂部右側圖)的PBMC的流式細胞術譜。使用來自HIV陰性供體的PBMC作為陰性對照(頂部左側圖)。提供了Gag特異性CD8+ T細胞群的百分比並顯示為插入框。在基線時，來自HIV陽性供體的PBMC含有HIV Gag特異性CD8+ T細胞。圖9中的供體A-C與圖10A至圖12B中所示的供體D-F相同。
圖10A至圖10B顯示了對從HIV陽性供體D收集的PBMC中響應於CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。在所指示的時間點測量T細胞群。使用三重突變體三特異性抗體作為陰性對照。使用流式細胞術對HIV特異性記憶CD8+ T細胞(圖10A)以及HIV特異性中樞記憶(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8+ T細胞(圖10B)進行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進效應記憶(Tem)CD8+ T細胞的增生。
圖11A至圖11B顯示了對從HIV陽性供體E收集的PBMC中響應於CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。在所指示的時間點測量T細胞群。使用三重突變體三特異性抗體作為陰性對照。使用流式細胞術對HIV特異性記憶CD8+ T細胞(圖11A)以及HIV特異性中樞記憶(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8+ T細胞(圖11B)進行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進效應記憶(Tem)CD8+ T細胞的增生。
圖12A至圖12B顯示了對從HIV陽性供體F收集的PBMC中響應於CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。在所指示的時間點測量T細胞群。使用三重突變體三特異性抗體作為陰性對照。使用流式細胞術對HIV特異性記憶CD8+ T細胞(圖12A)以及HIV特異性中樞記憶(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8+ T細胞(圖12B)進行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進效應記憶(Tem)CD8+ T細胞的增生。
圖13A至圖13B顯示了對從流感感染的供體A收集的PBMC中響應於CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體的體外T細胞亞群擴增的表徵。在所指示的時間點測量T細胞群。使用三重突變體三特異性抗體作為陰性對照。使用流式細胞術對流感(流行性感冒(Flu))特異性記憶CD8+ T細胞(圖13A)以及流行性感冒特異性中樞記憶(Tcm)和效應記憶(Tem)CD8+ T細胞(圖13B)進行定量。CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進Tem CD8+ T細胞(例如，參見第7天、第11天)和Tcm CD8+ T細胞(例如，參見第7天)的增生。
本公開文本提供了包含四條多肽鏈的三特異性結合蛋白，所述四條多肽鏈形成特異性結合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)、CD28多肽和CD3多肽的三個抗原結合位點，所述三特異性結合蛋白可以用於例如擴增記憶T細胞(例如，病毒特異性記憶T細胞)和/或治療慢性病毒感染。
I.通用定義
除非另有說明，否則如根據本公開文本所用，以下術語應理解為具有以下含義。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括複數，並且複數術語應包括單數。除非上下文另有明確說明，否則如在本說明書及所附申請專利範圍中所使用的，單數形式「一種/一個(a)」、「一種/一個(an)」和「所述」包括複數指示物。因此，例如，提及「一種分子」任選地包括兩種或更多種這樣的分子的組合等。
應理解的是，本文所述的本公開文本的態樣和實施例包括「包含(comprising)」多個態樣和實施例，「由......組成(consisting)」以及「基本上由......組成(consisting essentially of)」。
如本文所用術語「多核苷酸」是指長度為至少10個核苷酸的單鏈或雙鏈核酸聚合物。在某些實施例中，構成多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或者任一類型的核苷酸的修飾形式。此類修飾包括鹼基修飾，如溴尿苷(bromuridine)；核糖修飾，如阿糖胞苷(arabinoside)和2',3'-二脫氧核糖；和核苷酸間連接修飾，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯、胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、phoshoraniladate和胺基磷酸酯(phosphoroamidate)。術語「多核苷酸」具體地包括單鏈和雙鏈形式的DNA。
「分離的多核苷酸」是基因組、cDNA或合成來源的多核苷酸或其某種組合的多核苷酸，所述分離的多核苷酸：(1)不與在自然界中發
現其所在的多核苷酸的全部或一部分結合，(2)與在自然界中其並不連接的多核苷酸連接，或(3)在自然界中不作為更大序列的一部分存在。
「分離的多肽」是如下多肽，其：(1)不含通常與其一起被發現的至少一些其他多肽，(2)基本上不含來自相同來源(例如，來自相同物種)的其他多肽，(3)由來自不同物種的細胞表現，(4)已經從至少約50%的在自然界中與所述分離的多肽結合的多核苷酸、脂質、碳水化合物或其他物質分離，(5)不與在自然界中與所述「分離的多肽」結合的多肽的部分(通過共價或非共價相互作用)結合，(6)與在自然界中不與所述分離的多肽結合的多肽可操作地(通過共價或非共價相互作用)結合，或(7)在自然界中不存在。這種分離的多肽可以由基因組DNA、cDNA、mRNA或具有合成來源的其他RNA或其任何組合來編碼。較佳地，分離的多肽基本上不含在其自然環境中發現的會干擾其應用(治療、診斷、預防、研究或其他應用)的多肽或其他污染物。
天然存在的抗體通常包含四聚體。每種這樣的四聚體通常由兩個相同的多肽鏈對構成，每一對具有一條全長「輕」鏈(通常具有約25kDa的分子量)和一條全長「重」鏈(通常具有約50-70kDa的分子量)。如本文所用術語「重鏈」和「輕鏈」是指具有足以賦予對靶抗原的特異性的可變結構域序列的任何免疫球蛋白多肽。每條輕鏈和重鏈的胺基末端部分通常包括約100至110或更多個胺基酸的可變結構域，所述可變結構域通常負責抗原識別。每條鏈的羧基末端部分通常定義負責效應子功能的恒定結構域。因此，在天然存在的抗體中，全長重鏈免疫球蛋白多肽包括一個可變結構域(VH)和三個恒定結構域(CH1、CH2和CH3)，其中所述VH結構域位於多肽的胺基末端並且CH3結構域位於羧基末端，並且全長輕鏈免疫球蛋白多肽包括一個可變結構域(VL)和一個恒定結構域(CL)，其中所述VL結構域位於多肽的胺基末端並且所述CL結構域位於羧基末端。
通常將人輕鏈分類為κ和λ輕鏈，並且通常將人重鏈分類為μ、δ、γ、α或ε，並將抗體的同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾個亞類，包括但不限於IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有多個亞類，包括但不限於IgM1和IgM2。將IgA類似地細分為多個亞類，包
括但不限於IgA1和IgA2。在全長輕鏈和重鏈內，可變結構域和恒定結構域通常通過約12個或更多個胺基酸的「J」區接合，並且重鏈還包括約10個或更多個胺基酸的「D」區。參見例如，Fundamental Immunology(Paul,W.，編輯，Raven Press，第2版，1989)，所述文獻是出於所有目的通過引用以其整體併入。每個輕/重鏈對的可變區通常形成抗原結合位點。天然存在的抗體的可變結構域通常展現通過三個高變區(也稱為互補決定區或CDR)接合的相對保守的框架區(FR)的相同總體結構。來自每一對的兩條鏈的CDR通常通過框架區對齊，這可以使得能夠結合至特異性表位。從胺基末端到羧基末端，輕鏈和重鏈可變結構域二者通常均包含結構域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。
術語「CDR組」是指一組存在於能夠結合抗原的單一可變區中的三個CDR。這些CDR的確切邊界已經根據不同系統以不同方式加以定義。Kabat所述的系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest(美國國立衛生研究院(National Institutes of Health)，貝塞斯達(Bethesda)，馬里蘭州)(1987)和(1991))不僅提供適用於抗體的任何可變區的明確殘基編號系統，還提供定義三個CDR的準確殘基邊界。這些CDR可以被稱為Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196：901-17；Chothia等人，1989,Nature 342：877-83)發現，雖然在胺基酸序列水平上具有顯著多樣性，但是Kabat CDR內的某些子部分採用幾乎相同的肽骨架構象。這些子部分被命名為L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中「L」和「H」分別指定輕鏈和重鏈區域。這些區域可以被稱為Chothia CDR，它們具有與Kabat CDR重疊的邊界。與Kabat CDR重疊的定義CDR的其他邊界已經描述於以下文獻中：Padlan,1995,FASEB J.9：133-39；MacCallum,1996,J.Mol.Biol.262(5)：732-45；和Lefranc,2003,Dev.Comp.Immunol.27：55-77。仍有其他CDR邊界定義可能不嚴格遵循本文中的一個系統，但仍然會與Kabat CDR重疊，不過鑒於特定殘基或殘基組或甚至整個CDR不顯著影響抗原結合的預測或實驗發現，所述其他CDR邊界可能會被縮短或延長。本文所用方法可以利用根據這些系統中的任一個系統定義的CDR，但是某些實施例使用Kabat或Chothia定義的CDR。使用胺基
酸序列鑒定所預測的CDR是業內所熟知的，如在以下文獻中：Martin,A.C.「Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains,」In Antibody Engineering，第2卷.Kontermann R.,Dübel S.，編輯Springer-Verlag，柏林，第33-51頁(2010)。還可以通過其他常規方法(例如，通過與其他重鏈和輕鏈可變區的已知胺基酸序列進行比較以確定具有序列超變性的區域)來檢查重鏈和/或輕鏈可變結構域的胺基酸序列以鑒定CDR的序列。可以通過目測，或通過採用比對程序(如CLUSTAL程序套件中的一種)來比對已編號的序列，如以下文獻中所述：Thompson,1994,Nucleic Acids Res.22：4673-80。便捷地使用分子模型來正確描繪框架和CDR區域，並由此校正基於序列的比對。
在一些實施例中，免疫球蛋白輕鏈或重鏈中的CDR/FR定義應基於IMGT定義(Lefranc等人Dev.Comp.Immunol.,2003,27(1)：55-77；www.imgt.org)來確定。
如本文所用術語「Fc」是指包含得自抗體消化或通過其他手段產生的非抗原結合片段的序列的分子，所述分子呈單體或多聚體形式，並且所述「Fc」可以含有鉸鏈區。天然Fc的原始免疫球蛋白來源較佳地是人來源的，並且可以是任何免疫球蛋白。Fc分子由可通過共價(即，二硫鍵)和非共價結合連接成二聚體或多聚體形式的單體多肽組成。取決於類別(例如，IgG、IgA和IgE)或亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2和IgG4)，天然Fc分子的單體亞基之間分子間二硫鍵的數目在1至4範圍內。Fc的一個例子是得自IgG的木瓜蛋白酶消化的二硫鍵合的二聚體。如本文所用術語「天然Fc」是單體、二聚體和多聚體形式通用的。
F(ab)片段通常包括一條輕鏈以及一條重鏈的VH和CH1結構域，其中F(ab)片段的VH-CH1重鏈部分無法與另一個重鏈多肽形成二硫鍵。如本文所用，F(ab)片段也可以包括含有被胺基酸連接子隔開的兩個可變結構域的一條輕鏈，以及含有被胺基酸連接子隔開的兩個可變結構域和CH1結構域的一條重鏈。
F(ab')片段通常包括一條輕鏈和含有更多恒定區的一條重鏈的一部分(在CH1與CH2結構域之間)，使得可以在兩條重鏈之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab')2分子。
如本文所用術語「結合蛋白」是指非天然存在的(或重組的或工程化的)分子，所述分子與至少一種靶抗原(例如，本公開文本的CD38多肽)特異性地結合。
「重組」分子是已經通過重組手段製備、表現、產生或分離的分子。
本公開文本的一個實施例提供了對介於一種與三種之間的靶抗原具有生物和免疫特異性的結合蛋白。本公開文本的另一個實施例提供了包含核苷酸序列的核酸分子，所述核苷酸序列編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈。本公開文本的另一個實施例提供了包含核酸分子的表現載體，所述核酸分子包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核苷酸序列。本公開文本的又另一個實施例提供了表現此類結合蛋白(即，包含編碼形成此類結合蛋白的多肽鏈的核酸分子或載體)的宿主細胞。
如本文所用術語「可交換性」(swapability)是指在結合蛋白形式內並且在保持折疊和最終結合親和力的情況下可變結構域的互換性。「完全可交換性」是指在維持結合蛋白的完全功能性(如通過結合親和力的保持所證實)的同時，交換式I的多肽鏈或式II的多肽鏈中的VH1和VH2結構域二者的順序，並且由此交換VL1和VL2結構域的順序(即，顛倒所述順序)的能力。另外，應注意，名稱VH和VL僅是指結構域在呈最終形式的特定蛋白質鏈上的位置。例如，VH1和VH2可以衍生自親代抗體中的VL1和VL2結構域並被置入結合蛋白中的VH1和VH2位置中。同樣，VL1和VL2可以衍生自親代抗體中的VH1和VH2結構域並被置於結合蛋白中的VH1和VH2位置中。因此，VH和VL名稱是指目前的位置而不是在親代抗體中的原始位置。VH和VL結構域因此是「可交換的」。
如本文所用術語「抗原」或「靶抗原」或「抗原靶標」是指分子或分子的一部分，所述分子或分子的一部分能夠被結合蛋白結合，並且另外能夠被用於動物中以產生能夠與該抗原的表位結合的抗體。靶抗原
可具有一個或多個表位。關於由結合蛋白識別的每種靶抗原，所述結合蛋白能夠與識別所述靶抗原的完整抗體競爭。
「CD38」是分化簇38多肽，並且是在許多免疫細胞的表面上發現的糖蛋白。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白結合一種或多種CD38多肽的細胞外結構域。示例性CD38細胞外結構域多肽序列包括但不限於人CD38的細胞外結構域(例如，如由SEQ ID NO：1表示)和食蟹猴CD38的細胞外結構域(例如，如由SEQ ID NO：30表示)。
術語「T細胞銜接器(engager)」是指針對宿主的免疫系統(更具體地針對T細胞的細胞毒活性)以及針對腫瘤靶蛋白的結合蛋白。
術語「單特異性結合蛋白」是指與一種抗原靶標特異性地結合的結合蛋白。
術語「單價結合蛋白」是指具有一個抗原結合位點的結合蛋白。
術語「雙特異性結合蛋白」是指與兩種不同抗原靶標特異性地結合的結合蛋白。在一些實施例中，雙特異性結合蛋白與兩種不同抗原結合。在一些實施例中，雙特異性結合蛋白與相同抗原上的兩種不同表位結合。
術語「二價結合蛋白」是指具有兩個結合位點的結合蛋白。
術語「三特異性結合蛋白」是指與三種不同抗原靶標特異性地結合的結合蛋白。在一些實施例中，三特異性結合蛋白與三種不同抗原結合。在一些實施例中，三特異性結合蛋白與相同抗原上的一種、兩種或三種不同表位結合。
術語「三價結合蛋白」是指具有三個結合位點的結合蛋白。在特定實施例中，三價結合蛋白可以與一種抗原靶標結合。在其他實施例中，三價結合蛋白可以與兩種抗原靶標結合。在其他實施例中，三價結合蛋白可以與三種抗原靶標結合。
「分離的」結合蛋白是已經鑒定並且從其天然環境的組分分離和/或回收的結合蛋白。其天然環境的污染物組分是會干擾結合蛋白的診斷或治療應用的物質，並且可能包括酶、激素和其他蛋白質的或非蛋白質
的溶質。在一些實施例中，將結合蛋白純化至：(1)如通過勞裡法(Lowry method)所確定的抗體重量大於95%，並且最佳重量大於99%，(2)足以獲得通過使用旋杯式序列分析儀所測的至少15個殘基的N末端或內部胺基酸序列的程度，或(3)通過在還原或非還原條件下的SDS-PAGE使用考馬斯藍或較佳銀染色，達到同質。分離的結合蛋白包括重組細胞內的原位結合蛋白，因為結合蛋白的天然環境中的至少一種組分將不存在。
如本文所用術語「基本上純的」或「基本上純化的」是指作為存在的主要種類(即，以摩爾計，其比組合物中的任何其他單獨種類更豐富)的化合物或種類。在一些實施例中，基本上純化的級分是如下組合物，在所述組合物中所述種類占存在的所有大分子種類的至少約50%(以摩爾計)。在其他實施例中，基本上純的組合物將包含組合物中存在的大於約80%、85%、90%、95%或99%的所有大分子種類。在仍其他實施例中，將所述種類純化至基本同質(通過常規偵檢方法不能偵檢到組合物中的污染物種類)，其中所述組合物基本上由單一大分子種類組成。
術語「表位」包括能夠與免疫球蛋白或T細胞受體特異性地結合的任何決定簇、較佳多肽決定簇。在某些實施例中，表位決定簇包括分子的化學活性表面基團(grouping)，如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，並且在某些實施例中，可以具有特定的三維結構特徵和/或特定的電荷特徵。表位是抗原中被抗體或結合蛋白結合的區域。在某些實施例中，當結合蛋白在蛋白質和/或大分子的複雜混合物中優先識別其靶抗原時，稱結合蛋白特異性地結合抗原。在一些實施例中，當平衡解離常數
10-8M時、更佳地在平衡解離常數
10-9M時並且最佳地在解離常數
10-10M時，稱結合蛋白特異性地結合抗原。
結合蛋白的解離常數(KD)可以例如通過表面等離子體共振來確定。通常，表面等離子體共振分析通過表面等離子體共振(SPR)使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor；皮斯卡塔韋(Piscataway)，新澤西州)測量配體(生物感測器基質上的靶抗原)與分析物(溶液中的結合蛋白)之間的實時結合相互作用。表面等離子體分析也可以通過固定分析物
(生物感測器基質上的結合蛋白)並呈遞配體(靶抗原)來進行。如本文所用術語「KD」是指特定結合蛋白與靶抗原之間的相互作用的解離常數。
如本文所用的關於結合蛋白的術語「與......結合」是指結合蛋白或其抗原結合片段以至少約1 x 10-6M、1 x 10-7M、1 x 10-8M、1 x 10-9M、1 x 10-10M、1 x 10-11M、1 x 10-12M或更大的Kd與含有表位的抗原結合的能力，和/或以比所述結合蛋白或其抗原結合片段對非特異性抗原的親和力大至少兩倍的親和力與表位結合的能力。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白與兩種或更多種抗原(例如，人和食蟹猴CD38多肽)結合。
在一些實施例中，本公開文本的抗原結合結構域和/或結合蛋白與人和食蟹猴CD38多肽(例如，CD38細胞外結構域，如SEQ ID NO：1(人CD38亞型A)、SEQ ID NO：105(人CD38亞型E)和SEQ ID NO：30(食蟹猴CD38))「交叉反應」。在對以下兩種抗原的EC50在類似範圍內時，與抗原1(Ag1)結合的結合蛋白可與抗原2(Ag2)「交叉反應」。在本申請中，當Ag2的親和力與Ag1的親和力的比率等於或小於10(例如5、2、1或0.5)時，與Ag1結合的結合蛋白可與Ag2交叉反應，兩種抗原的親和力是用相同方法測量的。
在對兩種抗原的親和力極為不同時，與Ag1結合的結合蛋白與Ag2「不顯著地交叉反應」。如果結合反應過低，對Ag2的親和力可能無法測量。在本申請中，當在相同實驗環境中和在相同抗體濃度下，結合蛋白與Ag2的結合反應小於相同結合蛋白與Ag1的結合反應的5%時，與Ag1結合的結合蛋白與Ag2不顯著地交叉反應。在實踐中，所用結合蛋白濃度可以是EC50或達到用Ag1獲得的飽和平穩狀態所需的濃度。
如本文所用術語「連接子」是指在免疫球蛋白結構域之間插入的一個或多個胺基酸殘基，它們為輕鏈和重鏈的結構域提供足夠的移動性，以折疊成在雙重可變區免疫球蛋白上的交叉。在序列水平上，連接子分別是在可變結構域之間或可變結構域與恒定結構域之間的過渡處插入。因為免疫球蛋白結構域的大致大小已經被充分理解，所以可以鑒定結構域之間的過渡。結構域過渡的準確位置可以通過定位沒有形成(如通過實驗數據所顯示或者如通過建模或二級結構預測的技術可以假定的)二級結構
元件(如β片層或α螺旋)的肽延伸段來確定。本文所述連接子被稱為L1，其位於VL2結構域的C末端與VL1結構域的N末端之間的輕鏈上；以及L2，其位於VL1結構域的C末端與CL結構域的N末端之間的輕鏈上。重鏈連接子被稱為L3，其位於VH1結構域的C末端與VH2結構域的N末端之間；以及L4，其位於VH2結構域的C末端與CH1結構域的N末端之間。
如本文所用術語「載體」是指用於將編碼信息轉移至宿主細胞的任何分子(例如，核酸、質體或病毒)。術語「載體」包括能夠運輸已經與其連接的另一個核酸的核酸分子。一種類型的載體是「質體」，它是指可以將另外的DNA區段插入其中的環狀雙鏈DNA分子。另一種類型的載體是病毒載體，其中可以將另外的DNA區段插入病毒基因組中。某些載體能夠在引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加型哺乳動物載體)可以在被引入宿主細胞中之後整合至宿主細胞的基因組中，並由此與宿主基因組一起複製。另外，某些載體能夠指導與其可操作連接的基因的表現。此類載體在本文中被稱為「重組表現載體」(或者簡單地，「表現載體」)。一般來說，用於重組DNA技術中的表現載體通常呈質體形式。術語「質體」和「載體」在本文中可以互換使用，因為質體是最常用的載體形式。然而，本公開文本意圖包括發揮同等功能的其他形式的表現載體，如病毒載體(例如，複製缺陷性逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒)。
如本文所用短語「重組宿主細胞」(或「宿主細胞」)是指已經將重組表現載體引入其中的細胞。重組宿主細胞或宿主細胞意圖不僅是指特定的個體細胞，而且是指這種細胞的子代。因為後代中可能由於突變或環境影響而發生某些修飾，所以這種子代可能實際上與親代細胞不同，但是此類細胞仍包括在如本文所用術語「宿主細胞」的範圍內。眾多種宿主細胞表現系統可以用於表現結合蛋白，所述表現系統包括細菌、酵母、杆狀病毒和哺乳動物表現系統(以及噬菌體展示表現系統)。合適的細菌表現載體的例子是pUC19。為了重組表現結合蛋白，用攜帶編碼結合蛋白多肽鏈的DNA片段的一種或多種重組表現載體轉化或轉染宿主細胞，
使得在所述宿主細胞中表現所述多肽鏈並且較佳地分泌到培養所述宿主細胞的培養基中，從而可以從所述培養基回收所述結合蛋白。
如本文所用術語「轉化」是指細胞的遺傳特徵的變化，並且當細胞被修飾而含有新DNA時，所述細胞已經被轉化。例如，如果細胞從其天然狀態進行遺傳修飾，則所述細胞被轉化。在轉化後，轉化DNA可以通過物理整合至細胞的染色體中與細胞的DNA重組，或者可以在不被複製的情況下短暫維持為附加型元件，或者可以作為質體獨立複製。當DNA隨著細胞分裂進行複製時，認為細胞已經被穩定轉化。如本文所用術語「轉染」是指細胞攝取外來或外源DNA，並且當已經將外源DNA引入細胞膜內時，細胞已經被「轉染」。多種轉染技術是業內熟知的。此類技術可以用於將一種或多種外源DNA分子引入合適的宿主細胞中。
如本文所用並應用於對象的術語「天然存在的」是指以下事實：所述對象可以在自然界中發現並且尚未被人操縱。例如，可以從自然界中的來源分離並且尚未被人有意修飾的存在於生物體(包括病毒)中的多核苷酸或多肽是天然存在的。類似地，如本文所用的「非天然存在的」是指在自然界中沒有發現或者已經被人進行結構修飾或合成的對象。
如本文所用，二十種常規胺基酸和它們的縮寫遵循常規用法。二十種常規胺基酸的立體異構物(例如，d-胺基酸)；非天然胺基酸和類似物(如α-,α-二取代胺基酸、N-烷基胺基酸、乳酸和其他非常規胺基酸)也可以是結合蛋白多肽鏈的合適組分。非常規胺基酸的例子包括：4-羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸、ε-N,N,N-三甲基離胺酸、ε-N-乙醯基離胺酸、O-磷酸絲胺酸、N-乙醯基絲胺酸、N-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組胺酸、5-羥離胺酸、σ-N-甲基精胺酸以及其他類似胺基酸和亞胺基酸(例如，4-羥脯胺酸)。在本文所用的多肽表示法中，根據標準用法和慣例，左手方向是胺基末端方向並且右手方向是羧基末端方向。
可以基於常見側鏈特性將天然存在的殘基分為多個類別：
(1)疏水性的：Met、Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Tyr、Pro；
(2)極性親水性的：Arg、Asn、Asp、Gln、Glu、His、Lys、Ser、Thr；
(3)脂肪族的：Ala、Gly、Ile、Leu、Val、Pro；
(4)脂肪族疏水性的：Ala、Ile、Leu、Val、Pro；
(5)中性親水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(6)酸性的：Asp、Glu；
(7)鹼性的：His、Lys、Arg；
(8)影響鏈取向的殘基：Gly、Pro；
(9)芳香族的：His、Trp、Tyr、Phe；和
(10)芳香族疏水性的：Phe、Trp、Tyr。
保守胺基酸取代可以涉及這些類別中一個類別的成員與同一類別中另一個成員的交換。非保守取代可以涉及這些類別中一個類別的成員與另一個類別的成員的交換。
熟習此項技術者將能夠使用熟知的技術確定結合蛋白多肽鏈的合適變異體。例如，業內熟習此項技術者可以通過靶向被認為對活性不重要的區域來鑒定多肽鏈中可以在不破壞活性的情況下改變的合適區域。可替代地，業內熟習此項技術者可以鑒定分子中在相似多肽之間保守的殘基和部分。另外，甚至也可以使可能對生物活性或對結構重要的區域在不破壞生物活性的情況下或在不對多肽結構造成不良影響的情況下經歷保守胺基酸取代。
如本文所用術語「患者」包括人和動物個體(例如，哺乳動物，如狗、豬、馬、貓、牛等)。
如本文所用術語「治療」(treatment或treat)是指治療性治療和預防性的或預防的措施二者。需要治療的那些包括患有障礙的那些以及易患障礙的那些或要預防障礙的那些。在特定實施例中，結合蛋白可以用於治療患有慢性病毒感染的人，或改善人類個體的慢性病毒感染。
如本文所用術語「醫藥組合物」或「治療組合物」是指在適當投予至患者時能夠誘導所需治療效果的化合物或組合物。
如本文所用術語「醫藥上可接受的載劑」或「生理上可接受的載劑」是指適於實現或增強結合蛋白的遞送的一種或多種配製材料。
術語「有效量」和「治療有效量」在關於包含一種或多種結合蛋白的醫藥組合物使用時是指足以產生所需治療結果的量或劑量。更具
體地，治療有效量是足以將與所治療病症相關的一種或多種臨床上定義的病理過程抑制一定時間段的結合蛋白的量。有效量可以根據所用的特定結合蛋白而變化，並且還取決於與所治療患者和障礙的嚴重程度相關的多種因素和狀況。例如，如果要在體內投予結合蛋白，則諸如患者的年齡、體重和健康狀況以及在臨床前動物工作中獲得的劑量反應曲線和毒性數據等因素將屬於所考慮的那些因素。給定的醫藥組合物的有效量或治療有效量的確定是業內熟習此項技術者熟練掌握的。
本公開文本的一個實施例提供包含醫藥上可接受的載劑和治療有效量的結合蛋白的醫藥組合物。
三特異性結合蛋白
本公開文本的某些態樣涉及三特異性結合蛋白(例如，其結合CD38、CD28和CD3多肽)。本文所述的任何抗原結合蛋白的任何CDR或可變結構域可以用於本公開文本的三特異性結合蛋白中。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白是包含四條多肽鏈的三特異性結合蛋白，所述四條多肽鏈形成結合一種或多種(例如，三種)不同抗原標靶或靶蛋白的三個抗原結合位點。在一些實施例中，第一多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3[II]
並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：
VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]
並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：
VL3-CL [IV]
其中：
VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；
VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；
VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；
CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；
CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；
CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；
CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；
鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且
L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；
其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對。在一些實施例中，第一多肽鏈和第二多肽鏈具有形成兩個不同抗原結合位點的交叉取向。
在一些實施例中，VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點。在一些實施例中，CD28多肽是人CD28多肽。在一些實施例中，CD3多肽是人CD3多肽。在一些實施例中，CD38多肽是人CD38多肽。在一些實施例中，三特異性結合蛋白包含下文所述的一個或多個抗原結合位點。
本公開文本的結合蛋白可以使用從任何人抗體或非人抗體(包括例如，人抗體、鼠抗體或人源化抗體)獲得或衍生的結構域或序列來製備。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白是抗體。在一些實施例中，抗體是單克隆抗體。在一些實施例中，抗體是嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
抗CD38結合位點
本公開文本的某些態樣涉及包含結合CD38多肽(例如，人和食蟹猴CD38多肽)的抗原結合位點的結合蛋白。
在一些實施例中，結合蛋白或其抗原結合片段與人CD38(例如，人CD38亞型A和/或亞型E多肽)和食蟹猴CD38交叉反應。在一些實施例中，結合蛋白誘導CD38+細胞的細胞凋亡。在一些實施例中，結合
蛋白將T細胞募集至CD38+細胞並任選地(例如，通過TCR刺激和/或共刺激)激活T細胞。
在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO：31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO：32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO：34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO：39)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO：35)或GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO：31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO：32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO：34)或QSVSSYGQG(SEQ ID NO：132)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO：35)或GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，結合蛋白包含來自以下項的抗體VH和/或VL結構域序列的1、2、3、4、5或6個CDR：抗CD38_C2-CD38-1、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1、抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3、CD38HHY1370(在本文中也可以稱為抗CD38_1370)、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA、CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA、CD38HHY1370xCD28supxCD3mid
IgG1LALAP329A或CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA，如表G、H或I中所示。
在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO：31)或GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO：32)或IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO：34)或QSVSSYGQGF(SEQ ID NO：39)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO：35)或GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO：31)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO：32)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO：34)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO：35)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSFN(SEQ ID NO：31)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNGGT(SEQ ID NO：32)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有ESVDSYGNGF(SEQ ID NO：34)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有LAS(SEQ ID NO：35)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在其他實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含
有IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO：39)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO：39)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
在一些實施例中，VH結構域從N末端至C末端包含序列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4；其中FR1包含序列QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS(SEQ ID NO：86)、QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS(SEQ ID NO：87)或QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS(SEQ ID NO：88)；其中FR2包含序列MHWVKEAPGQRLEWIGY(SEQ ID NO：90)或MHWVKEAPGQGLEWIGY(SEQ ID NO：91)；其中FR3包含序列NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO：93)或NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC(SEQ ID NO：94)；並且其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：96)。在一些實施例中，VL結構域從N末端至C末端包含序列FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4；其中FR1包含序列DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS(SEQ ID NO：97)；其中FR2包含序列MHWYQQKPGQPPRLLIY(SEQ ID NO：99)；其中FR3包含序列SRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO：101)；並且其中FR4包含序列FGGGTKLEIK(SEQ ID NO：103)。
在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：5的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且/或者VL結構域包含與SEQ ID NO：6的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：17的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且/或者VL結構域包含與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：21的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且/或者VL結構域包含與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：23的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且/或者VL結構域包含與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：13的胺基酸序列至少
85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且/或者VL結構域包含與SEQ ID NO：14的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：5的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且VL結構域包含與SEQ ID NO：6的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：17的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且VL結構域包含與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：21的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且VL結構域包含與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：23的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少
93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且VL結構域包含與SEQ ID NO：18的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：13的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且VL結構域包含與SEQ ID NO：14的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；並且VL結構域包含SEQ ID NO：6的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO：17的胺基酸序列；並且VL結構域包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO：21的胺基酸序列；並且VL結構域包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO：23的胺基酸序列；並且VL結構域包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列；並且VL結構域包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列。
在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：含有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的抗體重鏈和/或含有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的抗體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的抗體重鏈和/或含有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的抗體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的抗體重鏈和/或含有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的抗體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：24的胺基酸序列的抗體重鏈和/或含有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的抗體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：15
的胺基酸序列的抗體重鏈和/或含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的抗體輕鏈。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的抗體重鏈和含有SEQ ID NO：8的胺基酸序列的抗體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：19的胺基酸序列的抗體重鏈和含有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的抗體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：22的胺基酸序列的抗體重鏈和含有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的抗體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：24的胺基酸序列的抗體重鏈和含有SEQ ID NO：20的胺基酸序列的抗體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：15的胺基酸序列的抗體重鏈和含有SEQ ID NO：16的胺基酸序列的抗體輕鏈。
在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO：41)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IWYDGSNK(SEQ ID NO：42)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO：43)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QGIRND(SEQ ID NO：44)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO：45)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO：46)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，結合CD38的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GFTFSSYG(SEQ ID NO：41)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IWYDGSNK(SEQ ID NO：42)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARMFRGAFDY(SEQ ID NO：43)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QGIRND(SEQ ID NO：44)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO：45)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有LQDYIYYPT(SEQ ID NO：46)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
在一些實施例中，VH結構域從N末端至C末端包含序列FR1-CDR-H1-FR2-CDR-H2-FR3-CDR-H3-FR4；其中FR1包含序
列QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS(SEQ ID NO：89)；其中FR2包含序列MHWVRQAPGKGLEWVAV(SEQ ID NO：92)；其中FR3包含序列YYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC(SEQ ID NO：95)；並且其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：96)。在一些實施例中，VL結構域從N末端至C末端包含序列FR1-CDR-L1-FR2-CDR-L2-FR3-CDR-L3-FR4；其中FR1包含序列AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS(SEQ ID NO：98)；其中FR2包含序列GWYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：100)；其中FR3包含序列SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC(SEQ ID NO：102)；並且其中FR4包含序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：104)。
在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：9的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且/或者VL結構域包含與SEQ ID NO：10的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH結構域包含與SEQ ID NO：9的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列；並且VL結構域包含與SEQ ID NO：10的胺基酸序列至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同的胺基酸序列。在一些實施例中，VH結構域包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列；並且VL結構域包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的抗體重鏈或含有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的抗
體輕鏈。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含：含有SEQ ID NO：11的胺基酸序列的抗體重鏈和含有SEQ ID NO：12的胺基酸序列的抗體輕鏈。
抗CD28結合位點
本公開文本的某些態樣涉及包含結合CD28多肽(例如，人CD28多肽)的抗原結合位點的結合蛋白。
在一些實施例中，結合CD28的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSYY(SEQ ID NO：108)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO：109)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO：110)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QNIYVW(SEQ ID NO：111)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO：112)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO：113)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，結合CD28的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GYTFTSYY(SEQ ID NO：108)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO：109)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO：110)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QNIYVW(SEQ ID NO：111)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO：112)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO：113)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
在一些實施例中，結合CD28的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GFSLSDYG(SEQ ID NO：114)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IWAGGGT(SEQ ID NO：115)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARDKGYSYYYSMDY(SEQ ID NO：116)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有ESVEYYVTSL(SEQ ID NO：117)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO：118)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQSRKVPYT(SEQ ID NO：119)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，結合
CD28的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GFSLSDYG(SEQ ID NO：114)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IWAGGGT(SEQ ID NO：115)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARDKGYSYYYSMDY(SEQ ID NO：116)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有ESVEYYVTSL(SEQ ID NO：117)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有AAS(SEQ ID NO：118)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQSRKVPYT(SEQ ID NO：119)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
抗CD3結合位點
本公開文本的某些態樣涉及包含結合CD3多肽(例如，人CD3多肽)的抗原結合位點的結合蛋白。
在一些實施例中，結合CD3的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GFTFTKAW(SEQ ID NO：120)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO：121)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO：122)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO：123)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO：124)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO：125)的胺基酸序列的CDR-L3序列。在一些實施例中，結合CD3的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GFTFTKAW(SEQ ID NO：120)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO：121)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO：122)的胺基酸序列的CDR-H3序列；和抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO：123)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO：124)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO：125)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
在一些實施例中，結合CD3的結合位點包含：抗體重鏈可變(VH)結構域，其包含含有GFTFTKAW(SEQ ID NO：126)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO：127)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有GVYYALSPFDY(SEQ ID NO：128)的胺基酸序
列的CDR-H3序列；和/或抗體輕鏈可變(VL)結構域，其包含含有QSLVHNNGNTY(SEQ ID NO：129)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO：130)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO：131)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
在本公開文本的任何三特異性結合蛋白的一些實施例中，一個抗原結合結構域與CD3多肽(例如，人CD3)結合並且一個抗原結合結構域與CD28多肽(例如，人CD28)結合。在一些實施例中，VH1結構域包含如表H中所示的來自SEQ ID NO：49或51的三個CDR，並且VL1結構域包含如表H中所示的來自SEQ ID NO：50或52的三個CDR。在一些實施例中，VH2結構域包含如表H中所示的來自SEQ ID NO：49或51的三個CDR，並且VL2結構域包含如表H中所示的來自SEQ ID NO：50或52的三個CDR。在一些實施例中，VH1結構域包含如表H中所示的來自SEQ ID NO：53或84的三個CDR，並且VL1結構域包含如表H中所示的來自SEQ ID NO：54或85的三個CDR。在一些實施例中，VH2結構域包含如表H中所示的來自SEQ ID NO：53或84的三個CDR，並且VL2結構域包含如表H中所示的來自SEQ ID NO：54或85的三個CDR。
在一些實施例中，VH1結構域包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列，VL1結構域包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列，VH2結構域包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列，並且VL2結構域包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列。在一些實施例中，VH2結構域包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列，VL2結構域包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列，VH1結構域包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列，並且VL1結構域包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列。在一些實施例中，VH1結構域包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列，VL1結構域包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列，VH2結構域包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列，並且VL2結構域包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列。在一些實施例中，VH2結構域包含SEQ ID NO：51的胺基酸序列，VL2結構域包含SEQ ID NO：52的胺基酸序列，VH1結構域包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列，並且VL1結構域包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列。
在一些實施例中，VH1結構域包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列，VL1結構域包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列，VH2結構域包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列，VL2結構域包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列，VH3結構域包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，並且VL3結構域包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列。在一些實施例中，VH1結構域包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列，VL1結構域包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列，VH2結構域包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列，VL2結構域包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列，VH3結構域包含SEQ ID NO：9的胺基酸序列，並且VL3結構域包含SEQ ID NO：10的胺基酸序列。
在某些實施例中，第一多肽鏈包含與SEQ ID NO：61的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第二多肽鏈包含與SEQ ID NO：60的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第三多肽鏈包含與SEQ ID NO：62的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，並且第四多肽鏈包含與SEQ ID NO：63的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列。在某些實施例中，第一多肽鏈包含與SEQ ID NO：61的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第二多肽鏈包含與SEQ ID NO：64的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第三多肽鏈包含與SEQ ID NO：65的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，並且第四多肽鏈包含與SEQ ID NO：63的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列。在某些實施例中，第一多肽鏈包含與SEQ ID NO：61的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第二多肽鏈包含與SEQ ID NO：66的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第三多肽鏈包含與SEQ ID NO：67的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，並且第四多肽鏈包含與SEQ ID NO：63的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列。在某些實施例中，第一多肽鏈包含與SEQ ID NO：61的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第二多肽鏈包含與SEQ ID NO：60的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第三多肽鏈包含與SEQ ID NO：68的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，並且第四多肽鏈包含與SEQ ID NO：69的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列。在某些實施例中，第一多肽鏈包含與SEQ ID NO：61的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第二多肽鏈包含與SEQ ID NO：64的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第
三多肽鏈包含與SEQ ID NO：70的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，並且第四多肽鏈包含與SEQ ID NO：69的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列。在某些實施例中，第一多肽鏈包含與SEQ ID NO：61的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第二多肽鏈包含與SEQ ID NO：66的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，第三多肽鏈包含與SEQ ID NO：71的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列，並且第四多肽鏈包含與SEQ ID NO：69的胺基酸序列至少95%相同的多肽序列。
在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列。在某些實施例中，所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含表G中所示的抗體序列的1、2、3、4、5或6個CDR序列。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含表H中所示的抗體序列的1、2、3、4、5或6個CDR
序列、VH結構域序列和/或VL結構域序列。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含表I中所示的抗體序列的1、2、3、4、5或6個CDR序列、VH結構域序列和/或VL結構域序列。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含表I中所示的1、2、3或4個多肽序列。
表G.抗CD38結合蛋白的CDR序列。
表H.抗CD38和其他結合蛋白的可變結構域序列。
表I.結合蛋白的全長序列。
表J.結合蛋白的全長多核苷酸序列。
CD38多肽
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含結合人CD38多肽的細胞外結構域和食蟹猴CD38多肽的細胞外結構域的抗原結合位點。用於確定抗原結合位點是否結合抗原的示例性測定描述于本文中並且是業內已知的。在一些實施例中，結合是通過ELISA測定來確定的，例如，如下文所述。在一些實施例中，結合是通過SPR測定來確定的，例如，如下文所述。在一些實施例中，結合是通過流式細胞術測定使用在其細胞表面上表現CD38多肽的細胞來確定的，例如，如下文所述。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白結合包含SEQ ID NO：1和/或30的胺基酸序列的純化的多肽或其片段(例如，如通過ELISA或SPR所測量)。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白結合當在細胞表面上表現時包含SEQ ID NO：1和/或30的胺基酸序列的多肽(例如，如通過流式細胞術所測量)。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白與CD38亞型A多肽(例如，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列)結合。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白與CD38亞型E多肽(例如，包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列並且不包含SEQ ID NO：1的完整胺基酸序列，由SEQ ID NO：105的胺基酸序列組成，或者基本上由SEQ ID NO：105的胺基酸序列組成)結合。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白與CD38亞型A多肽(例
如，包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列)和CD38亞型E多肽(例如，包含SEQ ID NO：105的胺基酸序列並且不包含SEQ ID NO：1的完整胺基酸序列，由SEQ ID NO：105的胺基酸序列組成，或者基本上由SEQ ID NO：105的胺基酸序列組成)結合。不希望受理論束縛，認為與CD38亞型E多肽結合可以例如，在使本公開文本的結合蛋白靶向表現CD38亞型E多肽的一種或多種細胞方面是有利的。
人CD38亞型A細胞外結構域多肽序列
人CD38亞型E多肽序列
在一些實施例中，人CD38多肽的細胞外結構域包含SEQ ID NO：1的胺基酸序列。在一些實施例中，食蟹猴CD38多肽的細胞外結構域包含SEQ ID NO：30的胺基酸序列。
食蟹猴CD38多肽序列
連接子
在一些實施例中，連接子L1、L2、L3和L4在無胺基酸(長度=0)至約100個胺基酸的長度的範圍內，或小於100、50、40、30、20或15個胺基酸或更小。連接子還可以是10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸的長度。一種結合蛋白中的L1、L2、L3和L4可以都具有相同胺基酸序列或者可以都具有不同胺基酸序列。
合適的連接子的例子包括單個甘胺酸(Gly)殘基；二甘胺酸肽(Gly-Gly)；三肽(Gly-Gly-Gly)；具有四個甘胺酸殘基的肽；具有五個甘胺酸殘基的肽；具有六個甘胺酸殘基的肽；具有七個甘胺酸殘基的肽；和具有八個甘胺酸殘基的肽。可以使用胺基酸殘基的其他組合，如肽GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、肽GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、肽TKGPS(SEQ ID NO：57)、肽GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和肽GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)。上文列出的例子不意圖以任何方式限制本公開文本的範圍，並且已經顯示包含選自以下項的隨機選擇的胺基酸的連接子在結合蛋白中是合適的：擷胺酸、白胺酸、異白胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、離胺酸、精胺酸、組胺酸、天門冬胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺酸、麩醯胺酸、甘胺酸和脯胺酸。對於連接子序列的其他描述，參見例如，WO 2012135345和國際申請號PCT/US2017/027488。
連接子中胺基酸殘基的身份和序列可以根據連接子中需要實現的二級結構元件的類型而變化。例如，甘胺酸、絲胺酸和丙胺酸對於具有最大柔性的連接子是最佳的。如果需要剛性更強且延長的連接子，則可使用甘胺酸、脯胺酸、蘇胺酸和絲胺酸的一些組合。根據所需的特性，必要時可以將任何胺基酸殘基與其他胺基酸殘基的組合視為連接子，以構建較大肽連接子。
在一些實施例中，L1、L2、L3或L4中至少一個獨立地為0個胺基酸的長度。在一些實施例中，L1、L2、L3或L4各自獨立地為至少一個胺基酸的長度。在一些實施例中，L1的長度是L3的長度的至少兩倍。在一些實施例中，L2的長度是L4的長度的至少兩倍。在一些實施例中，L1的長度是L3的長度的至少兩倍，並且L2的長度是L4的長度的至少兩倍。在一些實施例中，L1為3至12個胺基酸殘基的長度，L2為3至14個胺基酸殘基的長度，L3為1至8個胺基酸殘基的長度，並且L4為1至3個胺基酸殘基的長度。在一些實施例中，L1為5至10個胺基酸殘基的長度，L2為5至8個胺基酸殘基的長度，L3為1至5個胺基酸殘基的長度，並且L4為1至2個胺基酸殘基的長度。在一些實施例中，L1為7個胺基酸殘基的長度，L2為5個胺基酸殘基的長度，L3為1個胺基酸殘基的長度，並且L4為2個胺基酸殘基的長度。在一些實施例中，L1為10個胺基酸殘基的長度，L2為10個胺基酸殘基的長度，L3為0個胺基酸殘基的長度，並且L4為0個胺基酸殘基的長度。在一些實施例中，L1、L2、L3和L4各自具有0至15個胺基酸(例如，0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸)的獨立選擇的長度，其中至少兩種連接子具有1至15個胺基酸(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸)的長度。在一些實施例中，L1、L2、L3和L4各自為0個胺基酸的長度。
在一些實施例中，L1、L2、L3和/或L4在抗體可變結構域與抗體恒定結構域之間的接合處包含衍生自天然存在的序列的序列(例如，如WO 2012/135345中所述)。例如，在一些實施例中，連接子包含在內源VH與CH1結構域之間或在內源VL與CL結構域(例如，κ或λ)之間的過渡處發現的序列。在一些實施例中，連接子包含在內源人VH與CH1結構域之間或在內源人VL與CL結構域(例如，人κ或λ)之間的過渡處發現的序列。
在一些實施例中，L1、L2、L3和L4各自獨立地為零個胺基酸的長度，或者包含選自以下項的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：57)、GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)。在一些實施例中，L1、L2、L3和L4各自獨立地包含選自以下項的序列：
GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：57)、GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)。
在一些實施例中，L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：57)，L3包含序列S，並且L4包含序列RT。在一些實施例中，L1包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)，L2包含序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)，L3為0個胺基酸的長度，並且L4為0個胺基酸的長度。在一些實施例中，L1包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)，L2包含序列GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)，L3為0個胺基酸的長度，並且L4為0個胺基酸的長度。在一些實施例中，L1包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)，L2為0個胺基酸的長度，L3包含序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)，並且L4為0個胺基酸的長度。
Fc區域和恒定結構域
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含全長抗體重鏈或含有Fc區域的多肽鏈。在一些實施例中，Fc區域是人Fc區域，例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區域。在一些實施例中，Fc區域包括抗體鉸鏈、CH1、CH2、CH3以及任選的CH4結構域。在一些實施例中，Fc區域是人IgG1 Fc區域。在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域。在一些實施例中，Fc區域包括下文所述的一種或多種突變。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包括一個或兩個Fc變異體。如本文所用術語「Fc變異體」是指從天然Fc修飾但仍包含補救受體FcRn(新生兒Fc受體)的結合位點的分子或序列。示例性Fc變異體及其與補救受體的相互作用是業內已知的。因此，術語「Fc變異體」可以包含從非人天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包含如下區域，所述區域可以被去除，因為其提供本發明的抗體樣結合蛋白不需要的結構特徵或生物活性。因此，術語「Fc變異體」包含缺少一個或多個天然Fc位點或殘基或其中一個或多個Fc位點或殘基已經被修飾的分子或序列，所述
位點或殘基影響或涉及：(1)二硫鍵形成，(2)與所選宿主細胞的不相容性，(3)在所選宿主細胞中表現後的N末端異質性，(4)糖基化，(5)與補體的相互作用，(6)與除了補救受體以外的Fc受體的結合，或(7)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
在一些實施例中，Fc區域包含一個或多個突變，所述突變降低或消除Fc區域的Fc受體結合和/或效應子功能(例如，Fc受體介導的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)和/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC))。
在一些實施例中，Fc區域是人IgG1 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置234、235和/或329的位置處的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是L234A、L235A和/或P329A。在一些實施例中，Fc區域是人IgG1 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置298、299和/或300的位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是S298N、T299A和/或Y300S。
在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域，其包含降低或消除FcγI和/或FcγII結合的一個或多個突變。在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域，其包含降低或消除FcγI和/或FcγII結合但不影響FcRn結合的一個或多個突變。在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228和/或409的位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是S228P和/或R409K。在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234和/或235的位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是F234A和/或L235A。在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、234、235和/或409的位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是S228P、F234A、L235A和/或R409K。在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置233-236的位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236處的缺失。在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、
233-236和/或409的取代處的胺基酸突變。在一些實施例中，胺基酸突變是S228P；E233P、F234V、L235A和在236處的缺失；和/或R409K。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含一個或多個突變以例如通過調節對純化試劑的親和力來改善純化。例如，已知如果異二聚體形式的兩個Fc區域中的一個含有降低或消除與蛋白A的結合的一個或多個突變，則可以將異二聚體結合蛋白從其同二聚體形式選擇性純化出來，因為與任一同二聚體形式相比，異二聚體形式將具有對基於蛋白A的純化的中間親和力並且可以例如通過使用不同pH從蛋白A選擇性地洗脫(參見例如，Smith,E.J.等人(2015)Sci.Rep.5：17943)。在一些實施例中，突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置435和436的位置處的取代，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F。在一些實施例中，結合蛋白包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；和第三多肽鏈，所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；並且其中第一和第二Fc區域中僅一個包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含杵和臼突變以及用於改善純化的一個或多個突變。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG1 Fc區域。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG4 Fc區域。
在一些實施例中，一個或兩個Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置233-236的位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236處的缺失。在一些實施例中，Fc區域是人IgG4 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、233-236和/或409的取代處的胺基酸突變。在一些實施例中，胺基酸突變是S228P；E233P、F234V、L235A和在236處的缺失；和/或R409K。在一些實施例中，一個或兩個Fc區域是人IgG1 Fc區域，所述人IgG1 Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1
的位置234、235和/或329的位置處的一個或多個胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是L234A、L235A和/或P329A。在一些實施例中，Fc區域是人IgG1 Fc區域，其包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置298、299和/或300的位置處的胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代是S298N、T299A和/或Y300S。
為了提高一些結合蛋白(例如，雙特異性或三特異性結合蛋白)的產量，可以通過「杵臼結構」技術改變CH3結構域，所述杵臼結構技術通過幾個例子詳細描述於例如以下文獻中：國際公開號WO 96/027011；Ridgway等人，1996,Protein Eng.9：617-21；和Merchant等人，1998,Nat.Biotechnol.16：677-81。具體地，改變兩個CH3結構域的相互作用表面以增加含有這兩個CH3結構域的兩條重鏈的異二聚化。(兩條重鏈的)兩個CH3結構域中的每一個可以是「杵」，而另一個是「臼」。二硫橋的引入進一步穩定異二聚體(Merchant等人，1998；Atwell等人，1997,J.Mol.Biol.270：26-35)並增加產量。在特定實施例中，杵位於具有單一可變結構域的第二對多肽上。在其他實施例中，杵位於具有交叉取向的第一對多肽上。在又其他實施例中，CH3結構域不包括臼中的杵。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白(例如，三特異性結合蛋白)包含第二多肽鏈上的「杵」突變和第三多肽鏈上的「臼」突變。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含第三多肽鏈上的「杵」突變和第二多肽鏈上的「臼」突變。在一些實施例中，「杵」突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和/或366的位置處的一個或多個取代。在一些實施例中，胺基酸取代是S354C、T366W、T366Y、S354C和T366W，或S354C和T366Y。在一些實施例中，「杵」突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的取代。在一些實施例中，胺基酸取代是S354C和T366W。在一些實施例中，「臼」突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置407以及任選的349、366和/或368的位置處的一個或多個取代。在一些實施例中，胺基酸取代是Y407V或Y407T以及任選的Y349C、T366S和/或L368A。在一些實施例中，「臼」突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、
368和407的位置處的取代。在一些實施例中，胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置366以及任選的354的位置處的一個或多個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是T366W或T366Y以及任選的S354C；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置407以及任選的349、366和/或368的位置處的一個或多個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y407V或Y407T以及任選的Y349C、T366S和/或L368A。
在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置407以及任選的349、366和/或368的位置處的一個或多個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y407V或Y407T以及任選的Y349C、T366S和/或L368A；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置366以及任選的354的位置處的一個或多個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是T366W或T366Y以及任選的S354C。
在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是T366W；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1
或IgG4的位置366、368和/或407的位置處的一個或多個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是T366S、L368A和/或Y407V。
在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4位置366、368和/或407的位置處的一個或多個胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是T366S、L368A和/或Y407V；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是T366W。
在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。在一些實施例中，第一和/或第二
Fc區域是人IgG1 Fc區域。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG4 Fc區域。
在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，其中所述第一Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、354、366和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P、S354C、T366W和R409K；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，其中所述第二Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、349、366、368、407和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K。在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，其中所述第一Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、349、366、368、407和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，其中所述第二Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、354、366和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P、S354C、T366W和R409K。
在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，其中所述第一Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234、235、354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A、L235A、S354C和T366W；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二
Fc區域，其中所述第二Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234、235、349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A和Y407V。在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，其中所述第一Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234、235、349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A和Y407V；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，其中所述第二Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234、235、354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A、L235A、S354C和T366W。
在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，其中所述第一Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、234、235、354、366和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P、F234A、L235A、S354C、T366W和R409K；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，其中所述第二Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、234、235、349、366、368、407和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K。在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，其中所述第一Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構
域，其中所述第一Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、234、235、349、366、368、407和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P、F234A、L235A、Y349C、T366S、L368A、Y407V和R409K；並且其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，其中所述第二Fc區域是人IgG4 Fc區域，所述人IgG4 Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228、234、235、354、366和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P、F234A、L235A、S354C、T366W和R409K。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含一個或多個突變以提高血清半衰期(參見例如，Hinton,P.R.等人(2006)J.Immunol.176(1)：346-56)。在一些實施例中，突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置428和434的位置處的取代，其中所述胺基酸取代是M428L和N434S。在一些實施例中，結合蛋白包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；和第三多肽鏈，所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一和/或第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置428和434的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是M428L和N434S。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含杵和臼突變以及用於提高血清半衰期的一個或多個突變。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG1 Fc區域。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG4 Fc區域。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含一個或多個突變以改善例如IgG4的鉸鏈區和/或二聚體界面的穩定性(參見例如，Spiess,C.等人(2013)J.Biol.Chem.288：26583-26593)。在一些實施例中，突變包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228和409的位置處的取代，其中所述胺基酸取代是S228P和R409K。在一些實施例中，結合蛋白包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc
區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；和第三多肽鏈，所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；其中所述第一和第二Fc區域是人IgG4 Fc區域；並且其中所述第一和第二Fc區域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P和R409K。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含杵和臼突變以及用於改善穩定性的一個或多個突變。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG4 Fc區域。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含一個或多個突變以例如通過調節對純化試劑的親和力來改善純化。例如，已知如果異二聚體形式的兩個Fc區域中的一個含有降低或消除與蛋白A的結合的一個或多個突變，則可以將異二聚體結合蛋白從其同二聚體形式選擇性地純化出來，因為與任一同二聚體形式相比，異二聚體形式將具有對基於蛋白A的純化的中間親和力並且可以例如通過使用不同pH從蛋白A選擇性地洗脫(參見例如，Smith,E.J.等人(2015)Sci.Rep.5：17943)。在一些實施例中，突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置435和436的位置處的取代，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F。在一些實施例中，結合蛋白包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；和第三多肽鏈，所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；並且其中第一和第二Fc區域中僅一個包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置435和436的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是H435R和Y436F。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含杵和臼突變以及用於改善純化的一個或多個突變。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG1 Fc區域。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG4 Fc區域。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含一個或多個突變以提高血清半衰期(參見例如，Hinton,P.R.等人(2006)J.Immunol.
176(1)：346-56)。在一些實施例中，突變包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置428和434的位置處的取代，其中所述胺基酸取代是M428L和N434S。在一些實施例中，結合蛋白包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；和第三多肽鏈，所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域，其中所述第一和/或第二Fc區域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置428和434的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是M428L和N434S。在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含杵和臼突變以及用於提高血清半衰期的一個或多個突變。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG1 Fc區域。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG4 Fc區域。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含一個或多個突變以降低效應子功能，例如，Fc受體介導的抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)、補體依賴性細胞毒性(CDC)和/或抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；其中所述第一和第二Fc區域是人IgG1 Fc區域；並且其中所述第一和第二Fc區域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置234和235的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是L234A和L235A。在一些實施例中，第二和第三多肽鏈的Fc區域是人IgG1 Fc區域，並且其中所述Fc區域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置234和235的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是L234A和L235A。在一些實施例中，第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；其中所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；
其中所述第一和第二Fc區域是人IgG1 Fc區域；並且其中所述第一和第二Fc區域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置234、235和329的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些實施例中，第二和第三多肽鏈的Fc區域是人IgG1 Fc區域，並且其中所述Fc區域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置234、235和329的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是L234A、L235A和P329A。在一些實施例中，第二和第三多肽鏈的Fc區域是人IgG4 Fc區域，並且所述Fc區域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234和235的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A和L235A。在一些實施例中，結合蛋白包含第二多肽鏈，所述第二多肽鏈進一步包含與CH1連接的第一Fc區域，所述第一Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；和第三多肽鏈，所述第三多肽鏈進一步包含與CH1連接的第二Fc區域，所述第二Fc區域包含免疫球蛋白鉸鏈區以及CH2和CH3免疫球蛋白重鏈恒定結構域；並且其中所述第一和第二Fc區域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234和235的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A和L235A。
在一些實施例中，本公開文本的結合蛋白包含杵和臼突變以及用於降低效應子功能的一個或多個突變。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG1 Fc區域。在一些實施例中，第一和/或第二Fc區域是人IgG4 Fc區域。關於在位置329處的Fc突變的進一步描述，參見例如，Shields,R.L.等人(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604和WO 1999051642。
在一些實施例中，上述突變的類型可以以任何順序或組合來組合。例如，本公開文本的結合蛋白可以包含上述的兩個或更多個「杵」和「臼」突變、用於提高血清半衰期的一個或多個突變、用於改善IgG4穩定性的一個或多個突變、用於改善純化的一個或多個突變和/或用於降低效應子功能的一個或多個突變。
核酸
使用標準重組DNA方法構建編碼形成結合蛋白的多肽的多核苷酸，將這些多核苷酸併入重組表現載體中，並將此類載體引入宿主細胞中。參見例如，Sambrook等人，2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第3版)。可以根據製造商的說明書來進行酶反應和純化技術，如本領域通常所實現的或如本文所述。除非提供具體定義，否則關於本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學使用的術語以及本文所述的分析化學、合成有機化學以及醫學和藥物化學的實驗室程序和技術是業內熟知且常用的那些。類似地，常規技術可以用於化學合成、化學分析、藥物製備、配製、遞送和患者的治療。
本公開文本的其他態樣涉及分離的核酸分子，其包含編碼任何本文所述的結合蛋白的核苷酸序列。在一些實施例中，分離的核酸分子包含與SEQ ID NO：60-83至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同和/或顯示於表J中的序列。
本公開文本的某些態樣涉及多核苷酸的套組。在一些實施例中，一個或多個多核苷酸是載體(例如，表現載體)。所述套組尤其可以用於產生一種或多種本文所述的結合蛋白，例如，本公開文本的三特異性結合蛋白。在一些實施例中，所述套組包含一種、兩種、三種或四種表J中所示的多核苷酸(例如，抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A、抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA、CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA、CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A或CD38HHY1370CD28supxCD3mid IgG1 NNSA)。在一些實施例中，多核苷酸的套組包含：含有SEQ ID NO：73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO：72的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO：74的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO：75的序列的第四多核苷酸。在一些實
施例中，多核苷酸的套組包含：含有SEQ ID NO：73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO：76的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO：77的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO：75的序列的第四多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸的套組包含：含有SEQ ID NO：73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO：78的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO：79的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO：75的序列的第四多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸的套組包含：含有SEQ ID NO：73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO：72的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO：80的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO：81的序列的第四多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸的套組包含：含有SEQ ID NO：73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO：76的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO：82的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO：81的序列的第四多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸的套組包含：含有SEQ ID NO：73的序列的第一多核苷酸、含有SEQ ID NO：78的序列的第二多核苷酸、含有SEQ ID NO：83的序列的第三多核苷酸和含有SEQ ID NO：81的序列的第四多核苷酸。
在一些實施例中，分離的核酸與異源啟動子可操作地連接，以指導編碼結合蛋白的核酸序列的轉錄。啟動子可以是指指導核酸的轉錄的核酸控制序列。在第一核酸序列被置於與第二核酸序列具有功能性關係的位置中時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表現，則所述啟動子與結合蛋白的編碼序列可操作地連接。啟動子的例子可以包括但不限於從病毒(如多瘤病毒、雞痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細胞病毒、逆轉錄病毒、乙型肝炎病毒、猿猴病毒40(SV40)等)的基因組獲得的啟動子、異源真核啟動子(如肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子等)、CAG啟動子(Niwa等人，Gene 108(2)：193-9,1991)、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、四環素誘導型啟動子(Masui等人，Nucleic Acids Res.33：e43,2005)、lac系統、trp系統、tac系統、trc系統、噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區域、3-磷酸甘油酸激酶的啟動子、酵母酸性磷酸酶的啟動子和酵母α交配因子的啟動子。編碼本公開文本的結合蛋白的多核苷酸
可以處於以下啟動子的控制下：組成型啟動子、誘導型啟動子、或本文所述的任何其他合適的啟動子、或業內熟習此項技術者將易於識別的其他合適的啟動子。
在一些實施例中，將分離的核酸併入載體中。在一些實施例中，載體是表現載體。表現載體可以包括與要表現的多核苷酸可操作地連接的一個或多個調控序列。術語「調控序列」包括啟動子、強化子和其他表現控制元件(例如，多腺苷酸化信號)。合適的強化子的例子可以包括但不限於來自哺乳動物基因的強化子序列(如球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白、胰島素等)、和來自真核細胞病毒的強化子序列(如複製起點的後側上的SV40強化子(bp 100-270)、巨細胞病毒早期啟動子強化子、複製起點的後側上的多瘤強化子、腺病毒強化子等)。合適的載體的例子可以包括例如質體、粘粒、附加體、轉座子和病毒載體(例如，腺病毒、痘苗病毒、辛德畢斯病毒(Sindbis-viral)、麻疹、皰疹病毒、慢病毒、逆轉錄病毒、腺相關病毒載體等)。表現載體可以用於轉染宿主細胞，例如細菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。能夠在宿主體內表現並複製的生物功能病毒和質體DNA載體是業內已知的，並且可以用於轉染感興趣的任何細胞。
本公開文本的其他態樣涉及載體系統，所述載體系統包括編碼任何本文所述結合蛋白的第一、第二、第三和第四多肽鏈的一種或多種載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一多肽鏈的第一載體、編碼結合蛋白的第二多肽鏈的第二載體、編碼結合蛋白的第三多肽鏈的第三載體和編碼結合蛋白的第四多肽鏈的第四載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一和第二多肽鏈的第一載體、和編碼結合蛋白的第三和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一和第三多肽鏈的第一載體、和編碼結合蛋白的第二和第四多肽鏈的第二載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一和第四多肽鏈的第一載體、和編碼結合蛋白的第二和第三多肽鏈的第二載體。在一些實施例中，載體系統包括編碼結合蛋白的第一、第二、
第三和第四多肽鏈的第一載體。載體系統的一種或多種載體可以是任何本文所述載體。在一些實施例中，所述一種或多種載體是表現載體。
分離的宿主細胞
本公開文本的其他態樣涉及分離的宿主細胞，所述分離的宿主細胞包含本文所述的一種或多種分離的多核苷酸、多核苷酸套組、載體和/或載體系統。在一些實施例中，宿主細胞是細菌細胞(例如，大腸桿菌(E.coli)細胞)。在一些實施例中，宿主細胞是酵母細胞(例如，釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞)。在一些實施例中，宿主細胞是昆蟲細胞。昆蟲宿主細胞的例子可以包括例如果蠅屬(Drosophila)細胞(例如，S2細胞)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)細胞(例如，High FiveTM細胞)和草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞(例如，Sf21或Sf9細胞)。在一些實施例中，宿主細胞是哺乳動物細胞。哺乳動物宿主細胞的例子可以包括例如人胚腎細胞(例如，293細胞或亞克隆用於在懸浮培養物中生長的293細胞)、Expi293TM細胞、CHO細胞、幼倉鼠腎細胞(例如，BHK，ATCC CCL 10)、小鼠支持細胞(例如，TM4細胞)、猴腎細胞(例如，CV1 ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(例如，VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宮頸癌細胞(例如，HELA，ATCC CCL 2)、犬腎細胞(例如，MDCK，ATCC CCL 34)、布法羅(buffalo)大鼠肝細胞(例如，BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺細胞(例如，W138，ATCC CCL 75)、人肝細胞(例如，Hep G2，HB 8065)、小鼠乳房腫瘤細胞(例如，MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI細胞、MRC 5細胞、FS4細胞、人肝細胞瘤系(例如，Hep G2)和骨髓瘤細胞(例如，NS0和Sp2/0細胞)。
結合蛋白的方法和用途
本公開文本的某些態樣涉及用於擴增病毒特異性記憶T細胞的方法。在一些實施例中，所述方法包括使病毒特異性記憶T細胞與本公開文本的結合蛋白接觸，所述結合蛋白是例如包含結合CD28多肽的第一抗原結合位點、結合CD3多肽的第二抗原結合位點和結合CD38多肽的第三抗原結合位點的三特異性結合蛋白。
在一些實施例中，在體外或離體使所述病毒特異性記憶T細胞與所述結合蛋白接觸。
在一些實施例中，使所述病毒特異性記憶T細胞與所述結合蛋白接觸引起病毒特異性記憶T細胞的激活和/或增生。
本公開文本的其他態樣涉及擴增T細胞的方法。在一些實施例中，所述方法包括使T細胞與本公開文本的結合蛋白接觸，所述結合蛋白是例如包含結合CD28多肽的第一抗原結合位點、結合CD3多肽的第二抗原結合位點和結合CD38多肽的第三抗原結合位點的三特異性結合蛋白。
在一些實施例中，所述T細胞是記憶T細胞或效應T細胞。
在一些實施例中，所述T細胞在其細胞表面上表現嵌合抗原受體(CAR)或包含編碼CAR的多核苷酸。
本公開文本的其他態樣涉及例如在有需要的個體中治療慢性病毒感染的方法。在一些實施例中，所述方法包括向有需要的個體投予有效量的本公開文本的結合蛋白，所述結合蛋白是例如包含結合CD28多肽的第一抗原結合位點、結合CD3多肽的第二抗原結合位點和結合CD38多肽的第三抗原結合位點的三特異性結合蛋白。
在一些實施例中，所述個體是人。
在一些實施例中，將所述結合蛋白以包含所述結合蛋白和醫藥上可接受的載劑的藥物配製品的形式投予至所述個體。
在一些實施例中，所述結合蛋白的投予導致所述個體體內病毒特異性記憶T細胞的激活和/或增生。
在任何上述方法中，記憶T細胞可以是CD8+或CD4+記憶T細胞。在任何上述方法中，記憶T細胞可以是中樞記憶T細胞(TCM)或效應記憶T細胞(TEM)。
任何本文所述結合蛋白可以用於本公開文本的方法。
在用於偵檢和定量一種或多種靶抗原的任何已知的測定方法，如競爭性結合測定、直接和間接夾心式測定、和免疫沈澱測定中可以
使用所述結合蛋白。結合蛋白將以適合於所用測定方法的親和力結合所述一種或多種靶抗原。
在某些實施例中，對於診斷應用，可以用可偵檢部分標記結合蛋白。可偵檢部分可以是能夠直接或間接產生可偵檢信號的任何部分。例如，可偵檢部分可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S、125I、99Tc、111In或67Ga；熒光或化學發光化合物，如異硫氰酸熒光素、羅丹明或螢光素；或者酶，如鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶。
結合蛋白也可以用於體內成像。可以將用可偵檢部分標記的結合蛋白投予至動物，較佳地投予至血流中，並測定宿主中經標記的抗體的存在和位置。可以用在動物中通過核磁共振、放射學或業內已知的其他偵檢手段可偵檢的任何部分標記結合蛋白。
在某些實施例中，對於臨床或研究應用，可以將結合蛋白與細包毒性劑綴合。與細胞毒性劑偶聯的多種抗體(即，抗體-藥物綴合物)已經用於將細胞毒性有效負載靶向特異性腫瘤細胞。將所述藥劑與抗體綴合的細胞毒性劑和連接子是業內已知的；參見例如，Parslow,A.C.等人(2016)Biomedicines 4：14；和Kalim,M.等人(2017)Drug Des.Devel.Ther.11：2265-2276。
本公開文本還涉及包含結合蛋白和可用於偵檢生物樣品中的靶抗原水平的其他試劑的套組。此類試劑可以包括可偵檢標記、封閉血清、陽性和陰性對照樣品以及偵檢試劑。在一些實施例中，套組包含組合物，所述組合物包含本文所述的任何結合蛋白、多核苷酸、載體、載體系統和/或宿主細胞。在一些實施例中，套組包含容器以及在所述容器上或與所述容器相連的標簽或包裝說明書。合適的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。所述容器可以由諸如玻璃或塑料的多種材料製成。容器容納有效治療、預防和/或診斷病症的組合物本身或與另一種組合物組合的所述組合物，並且可以具有無菌進入口(例如，容器可以是靜脈輸液袋或具有可由皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。在一些實施例中，標簽或包裝說明書指示，所述組合物用於預防、診斷和/或治療所選病症。可替代地或另外地，製品或套組可以進一步包含含有醫藥上可接受的緩衝液(如注
射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液)的第二(或第三)容器。所述製品或套組可以進一步包括從商業和用戶角度所需的其他材料，包括其他緩衝液、稀釋劑、過濾器、針和注射器。
結合蛋白治療組合物及其投予
包含結合蛋白的治療或醫藥組合物在本公開文本的範圍內。此類治療或醫藥組合物可以包含與選擇的適合於所述投予方式的藥學上或生理上可接受的配製劑混合的治療有效量的結合蛋白或結合蛋白-藥物綴合物。這些醫藥組合物可以用於本文所述的任何方法和用途(例如，離體、體外和/或體內)。
可接受的配製材料較佳地在所用劑量和濃度下對接受者無毒。
醫藥組合物可以含有用於修改、維持或保存例如組合物的pH、摩爾滲透壓濃度、粘度、澄清度、顏色、等滲性、氣味、無菌度、穩定性、溶解或釋放速率、吸附或滲透的配製材料。合適的配製材料包括但不限於胺基酸(如甘胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸)、抗微生物劑、抗氧化劑(如抗壞血酸、亞硫酸鈉或亞硫酸氫鈉)、緩衝液(如硼酸鹽、碳酸氫鹽、Tris-HCl、檸檬酸鹽、磷酸鹽或其他有機酸)、膨脹劑(如甘露醇或甘胺酸)、螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))、絡合劑(如咖啡因、聚乙烯吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精)、填充劑、單糖、二糖和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白質(如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)、著色劑、調味劑和稀釋劑、乳化劑、親水聚合物(如聚乙烯吡咯啶酮)、低分子量多肽、成鹽抗衡離子(如鈉)、防腐劑(如苯紮氯銨、苯甲酸、柳酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或過氧化氫)、溶劑(如丙三醇、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(如甘露醇或山梨醇)、懸浮劑、表面活性劑或潤濕劑(如普朗尼克(pluronics)；PEG；脫水山梨糖醇酯；聚山梨酯(如聚山梨酯20或聚山梨酯80)；triton；胺丁三醇；卵磷脂；膽固醇或泰洛沙
泊(tyloxapal))、穩定性增強劑(如蔗糖或山梨醇)、張力調節劑(如鹼金屬鹵化物(較佳地氯化鈉或氯化鉀)或甘露醇山梨醇)、遞送媒劑、稀釋劑、賦形劑和/或藥物佐劑(參見例如，Remington's Pharmaceutical Sciences(第18版，A.R.Gennaro，編輯，Mack Publishing Company 1990)和其後續版本，所述文獻出於任何目的通過引用併入本文)。
最佳醫藥組合物將由熟習此項技術者根據例如計劃的投予途徑、遞送形式和所需劑量來決定。此類組合物可以影響結合蛋白的物理狀態、穩定性、體內釋放速率和體內清除速率。
醫藥組合物中的主要媒劑或載劑在性質上可以是水性或非水性的。例如，適用於注射的媒劑或載劑可以是水、生理鹽水溶液或人工腦脊液，可能補充有用於腸胃外投予的組合物中常用的其他材料。中性緩衝鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是其他示例性媒劑。其他示例性醫藥組合物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩衝液或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩衝液，它們可以進一步包括山梨醇或合適的替代物。在本公開文本的一個實施例中，結合蛋白組合物可以通過將具有所選純度的組合物與呈凍幹餅或水溶液形式的任選配製劑混合來製備用於儲存。此外，可以使用適當賦形劑如蔗糖將結合蛋白配製為凍幹物。
可以選擇本公開文本的醫藥組合物用於腸胃外遞送或皮下遞送。可替代地，可以選擇組合物用於吸入或用於經消化道遞送，如口服。此類醫藥上可接受的組合物的製備在本領域的技術範圍內。
配製品組分是以投予部位可接受的濃度存在。例如，使用緩衝液將組合物維持在生理pH或略低的pH，通常在約5至約8的pH範圍內。
當考慮腸胃外投予時，所用治療組合物可以呈無熱原的、腸胃外可接受的水溶液形式，其包含在醫藥上可接受的媒劑中的所需結合蛋白。特別適用於腸胃外注射的媒劑是無菌蒸餾水，其中將結合蛋白配製為適當保存的無菌等滲溶液。又另一種製備可以涉及用提供產物的控制或持續釋放的藥劑(如可注射微球、生物蝕解性顆粒、聚合化合物(如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂質體)配製所需分子，隨後可將所述分子通過積存注射來遞送。還可以使用透明質酸，並且這可以具有促進在循環中的持
久的持續時間的作用。用於引入所需分子的其他合適的手段包括可植入的藥物遞送裝置。
在一個實施例中，可以將醫藥組合物配製用於吸入。例如，可以將結合蛋白配製為乾粉用於吸入。也可以將結合蛋白吸入溶液用推進劑來配製用於氣溶膠遞送。在又另一個實施例中，可以將溶液霧化。
還考慮到可以將某些配製品口服投予。在本公開文本的一個實施例中，可以將以這種方式投予的結合蛋白用或不用在固體劑型(如片劑和膠囊)的混配中通常使用的那些載劑來配製。例如，膠囊可以設計為在胃腸道中在生物利用度最大化且前系統性降解最小化時釋放配製品的活性部分。可以包括另外的試劑以有利於結合蛋白的吸收。還可以採用稀釋劑、調味劑、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑和粘合劑。
另一種醫藥組合物可以包含在具有適合於製造片劑的無毒賦形劑的混合物中的有效量的結合蛋白。通過將片劑溶解于無菌水或另一種適當媒劑中，可以以單位劑量形式製備溶液。合適的賦形劑包括但不限於惰性稀釋劑，如碳酸鈣、碳酸鈉或碳酸氫鈉、乳糖或磷酸鈣；或者結合劑，如澱粉、明膠或阿拉伯膠；或者潤滑劑，如硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。
本公開文本的另外的醫藥組合物對於業內熟習此項技術者將是明顯的，所述醫藥組合物包括在持續或控制遞送配製品中包含結合蛋白的配製品。用於配製多種其他持續或控制遞送手段的技術(如脂質體載劑、生物蝕解性微粒或多孔珠粒和積存注射)也是業內熟習此項技術者已知的。持續釋放製劑的另外的例子包括呈成型物品(例如薄膜)或微膠囊形式的半滲透性聚合物基質。持續釋放基質可以包括聚酯、水凝膠、聚丙交酯、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸酯的共聚物、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、乙烯乙酸乙烯酯或聚-D(-)-3-羥丁酸。持續釋放組合物還可以包括脂質體，所述脂質體可以通過業內已知的幾種方法中的任何方法來製備。
要用於體內投予的醫藥組合物通常必須是無菌的。這可以通過經無菌濾膜過濾來實現。在將組合物凍幹的情況下，可以在凍幹和重構之前或之後使用這種方法進行滅菌。用於腸胃外投予的組合物可以以凍幹形式或溶液形式儲存。此外，通常將腸胃外組合物置於具有無菌進入口的
容器中，所述容器例如具有可由皮下注射針刺穿的塞子的靜脈輸液袋或小瓶。
一旦已經配製醫藥組合物，就可以將其作為溶液、懸浮液、凝膠、乳液、固體或作為脫水或凍幹粉末儲存在無菌小瓶中。可以將此類配製品以即用形式或以需要在投予前重構(例如，凍幹)的形式儲存。
本公開文本還涵蓋用於產生單一-劑量投予單位的套組。套組可以各自含有具有乾燥蛋白質的第一容器和具有水性配製品的第二容器二者。本公開文本的範圍內還包括含有單室和多室預填充注射器(例如，液體注射器和冷凍注射器(lyosyringe))的套組。
在治療上採用的結合蛋白醫藥組合物的有效量將取決於例如治療背景和目標。業內熟習此項技術者將瞭解，治療的適當劑量水平將因此部分根據以下項而變化：所遞送的分子、結合蛋白所用於的適應證、投予途徑以及患者的體型(體重、體表或器官大小)和狀況(年齡和一般健康狀況)。因此，臨床醫師可以滴定劑量並改變投予途徑以獲得最佳治療效果。
給藥頻率將取決於所用配製品中結合蛋白的藥代動力學參數。通常，臨床醫師將投予組合物直至達到實現所需效果的劑量為止。因此，可以將組合物作為單一劑量、作為隨時間的兩次或更多次劑量(它們可以含有或不含等量的所需分子)或作為連續輸注通過植入裝置或導管來投予。適當劑量的進一步改進是由業內熟習此項技術者以常規方式進行，並且在業內熟習此項技術者常規進行的任務範圍內。適當劑量可以通過使用適當的劑量-反應數據來確定。
醫藥組合物的投予途徑與已知方法一致，例如，口服；通過靜脈內、腹膜內、大腦內(腦實質內)、腦室內、肌內、眼內、動脈內、門靜脈內或病灶內途徑注射；通過持續釋放系統；或者通過植入裝置。在需要時，可以將組合物通過推注注射投予，或通過輸注連續投予，或通過植入裝置投予。
還可以將組合物通過已經使所需分子吸附或包封於其上的膜、海綿狀物或其他適當材料的植入局部地投予。在使用植入裝置的情況
下，可以將所述裝置植入任何合適的組織或器官中，並且所需分子的遞送可以通過擴散、定時釋放推注或連續投予來進行。
實例
以下實例說明本公開文本的具體實施例，以及它們的各種用途。所述實例僅出於解釋性目的來陳述，並且不應被視為以任何方式限制本發明的範圍。
在本文的實例和附圖中，以下術語可以互換使用，是指特異性抗CD38抗原結合結構域或抗體：
抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1或CD38VH1
抗CD38_1370或CD38HHY1370
抗CD38_SB19或艾薩妥昔單抗(isatuximab)
實例1：抗CD38抗體誘導交叉反應性和細胞凋亡
針對與人和食蟹猴CD38多肽的結合以及針對細胞凋亡的誘導來表徵人源化抗CD38變異體。
材料和方法
對可溶性CD38細胞外結構域的結合親和力
使用BIAcore 2000(BIAcore Inc.，烏普薩拉，新澤西州)評價抗CD38 mAb的結合特性。簡單來說，將CM5 BIAcore生物感測器芯片對接至儀器中並用250μL的1：1 NHS/EDC在室溫下激活。將小鼠抗人Fc IgG1(GE Healthcare #BR-1008-39)(13.5μg/mL，在0.05M乙酸鹽緩衝液中，pH 5)固定在流動池1中的激活芯片上。所述固定是以5μL/min的流速來實施。然後通過注射55μL乙醇胺鹽酸鹽(pH 8.5)，然後用50mM NaOH、1M NaCl洗滌五次來封閉芯片。為了測量抗CD38 mAb與人CD38蛋白或食蟹猴CD38蛋白的結合，將抗體以2μg/mL用於BIAcore運行緩衝液(HBS-EP)中。以3至1000nM注射抗原(人CD38-histag(ID2)或食蟹猴CD38-histag(ID3))。在注射階段完成後，以相同流速在BIAcore運行
緩衝液中監測解離360秒。在注射之間使用30μL的50mM NaOH-1M NaCl使表面再生。使用BIAsimulation軟體分析單獨的感測圖。
對表現人CD38的前B細胞的結合親和力
通過流式細胞術確定抗CD38抗體與在重組鼠前B：：300.19細胞的表面上表現的CD38的結合。重組細胞株描述於以下文獻中：J.Deckket等人2014 Clin.Cancer Res 20：4574-4583。將表現CD38的鼠前B：：300.19細胞以40,000個細胞/孔包被于96孔高結合板(MSD L15XB-3)上，並在4℃下添加100μL/孔的抗CD38抗體持續45min，並用PBS 1% BSA洗滌三次。在4℃下添加100μL/孔的與Alexa488(Jackson ImmunoResearch；# 109-545-098)綴合的山羊抗人IgG持續45min，並用PBS 1% BSA洗滌三次。在細胞的離心和重懸後通過添加200μl/孔PBS 1% BSA評價抗體結合，並使用Guava® easyCyteTM 8HT流式細胞術系統讀取。分別使用BIOST@T-BINDING和BIOST@T-SPEED軟體估計表觀KD和EC50值。
重組CD38蛋白
使用衍生自亞型A的具有不同標記和點突變的各種重組CD38蛋白(SEQ ID NO：2、3、4和28)，以及涵蓋來自R45-P203的CD38細胞外結構域的CD38亞型E的標記的形式(SEQ ID NO：105)。所述蛋白質是通過在哺乳動物細胞中的瞬時表現來產生的。將編碼DNA序列克隆至哺乳動物表現質體中，在CMV強化子/啟動子和SV40多聚A信號下。使用FreeStyleTM MAX 293表現系統根據製造商的說明書用所述表現質體對HEK293細胞(Invitrogen；#K9000-10)進行瞬時轉染。
細胞凋亡誘導測定
將細胞以2 x 105個細胞/mL在含有1.5μg/mL(10nM)所指示抗體的完全培養基(RPMI-1640，10% FBS、2mM L-麩醯胺酸)中在37℃和5% CO2下孵育20小時。將細胞根據製造商說明書(Life Technologies)用AnnexinV-FITC染色。通過流式細胞術在BD FACSAriaTM流式細胞儀上使用用於採集控制和數據分析的BD FACSDiva軟體(二者均來自BD Biosciences)來分析樣品。
ELISA測定
用PBS中的CD38以0.5μg/孔包被96孔板，並將100μL/孔的抗體添加至板。將所述板在37℃下孵育1h並用含有0.05% Tween-20的PBS(PBS-T)洗滌五次。然後，將100μL的1：25,000稀釋度的與辣根過氧化物酶(Jackson Ref：109-035-098)綴合的抗人IgG添加至每個孔。在37℃下在黑暗中孵育1h後，將板用PBS-T洗滌五次。通過添加TMB-H2O2緩衝液將抗體結合可視化並在450nm的波長下讀取。使用BIOST@T-SPEED軟體估計EC50值。
結果
使用ELISA和表面等離子體共振(SPR)測定，使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor；皮斯卡塔韋，新澤西州)檢查所選抗人CD38抗體與可溶人CD38和食蟹猴CD38的結合特性。使用ELISA數據確定對於人源化抗CD38抗體抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1、抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3和人抗CD38抗體抗CD38_1370的抗體與人和食蟹猴CD38結合的EC50。
還使用SPR測定來評價人源化抗CD38變異體或人抗CD38 mAb與CD38的結合。使用SPR數據確定對於人源化抗CD38抗體抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1、抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3和人抗CD38抗體抗CD38_1370的抗體與人和食蟹猴CD38結合的KD和koff。表K中概述的結合數據顯示，所有抗CD38 mAb都以相似的結合特徵與CD38結合。
表K. 如通過表面等離子體共振測定所確定的抗CD38 mAb對人CD38和食蟹猴CD38的可溶性細胞外結構域的結合親和力。
使用上述基於FACS的結合測定評估人源化抗CD38變異體與表現CD38的細胞結合的能力。使用FACS數據確定對於人源化抗CD38抗體抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1、抗CD38_C2-CD38-1_VH3-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH5-VL3、抗CD38_C2-CD38-1_VH6-VL3和人抗CD38抗體抗CD38_1370的抗體與人和食蟹猴CD38結合的EC50。表L中所示的結合數據顯示，所有人源化抗CD38變異體都展現相似的對細胞表面CD38的結合親和力。
表L. 抗CD38 mAb對表現CD38的鼠前B：：300.19細胞的結合親和力。
來自上文ELISA、SPR和FACS測定的結合數據以及VH和VL結構域與人V區域的序列同一性一起概述於表L2中。
表L2. 表徵所指示抗體與人(Hu)和食蟹猴(Cyno)CD38多肽的結合的ELISA、SPR和FACS測定的概述。
還檢查了抗CD38抗體與人CD38亞型A和E二者結合的能力。對於評價與CD38亞型A和亞型E的結合，通過使用亞型A和亞型E蛋白(如上所述製備)作為捕獲抗原來進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)。用PBS中的任一亞型以0.5μg/孔包被96孔板，並將100μL/孔的抗體添加至板。將所述板在37℃下孵育1h並用含有0.05% Tween-20的PBS(PBS-T)洗滌五次。然後，將100μL的1：25,000稀釋度的與辣根過氧化物酶(Jackson Ref：109-035-098)綴合的抗人IgG添加至每個孔。在37℃下在黑暗中孵育
1h後，將板用PBS-T洗滌五次。通過添加TMB-H2O2緩衝液將抗體結合可視化並在450nm的波長下讀取。使用BIOST@T-SPEED軟體估計EC50值。
確定各種抗體與CD38亞型A(SEQ ID NO：1)和亞型E(SEQ ID NO：105)的結合親和力，如表L3中所示。表M提供各種抗CD38抗體的結合特性的比較。
表L3. 如通過ELISA所確定的基於EC50的抗CD38抗體對CD38亞型A和E的結合親和力。
表M. 各種抗CD38抗體的結合特徵。
總之，只有抗CD38_C2-CD38-1以亞納摩爾親和力與人和食蟹猴CD38二者結合並與CD38亞型A和E結合。
實例2：三特異性抗CD38結合蛋白的產生
接著，分析在圖1中所描繪的三特異性形式中，實例1中所述的所選抗CD38抗體的抗原結合結構域的結合特性。
材料和方法
三特異性結合蛋白的產生和純化
三特異性結合蛋白是通過根據製造商的方案使用ExpiFectamineTM 293轉染套組(Thermo Fisher Scientific)將4種表現質體瞬時轉染至Expi293細胞中來產生。簡單來說，將25%(w/w)的每種質體稀釋至Opti-MEM中，在室溫(RT)下與預稀釋的ExpiFectamine試劑混合20-30分鐘，並添加至Expi293細胞(2.5 x 106個細胞/ml)中。通常使用用於確定質體最佳比率的轉染優化以產生具有良好產量和純度的三特異性結合蛋白。
在轉染後4-5天，從轉染的細胞收集上清液並使其通過0.45μm過濾裝置(Nalgene)過濾。使用3步式程序純化上清液中的三特異性結合蛋白。第一，使用蛋白A親和純化，並使用「IgG洗脫緩衝液」(Thermo Fisher Scientific)洗脫所結合的Ab。第二，將產物針對PBS(pH 7.4)透析過夜，其中2次更換PBS緩衝液。在下一步驟之前，通過0.45μm過濾裝置(Nalgene)進行過濾來清除任何沈澱物。第三，使用尺寸排阻層析(SEC)純化(Hiload 16/600 Superdex 200pg，或Hiload 26/600 Superdex 200pg，GE Healthcare)去除聚集體和製劑中的不同種類。在還原性和非還原性
SDS-PAGE上分析所述級分以鑒定含有單體三特異性結合蛋白的級分，然後合併所述級分。可以將純化的抗體等分並在-80℃下長期儲存。
ELISA測定
使用ELISA或SPR方法分析純化的抗體的結合特性。對於ELISA，在4℃下使用三特異性結合蛋白中每個結合位點的相應抗原，使用PBS(pH 7.4)中的2μg/ml的每種抗原包被96孔免疫板(Nunc 439454，Thermo Fisher Scientific)過夜。使用PBS中的5%脫脂乳+2% BSA將所包被的板在RT下封閉1小時，然後用PBS+0.25% Tween 20洗滌三次(Aqua Max 400，Molecular Devices)。製備抗體(三特異性和對照Ab)的連續稀釋液並將其添加至ELISA板(100μl/孔，一式兩份)上，在RT下孵育1小時，然後用PBS+0.25% Tween 20洗滌5次。
在洗滌後，將HRP綴合的二級抗人Fab(1：5000，目錄號109-035-097，Jackson ImmunoResearch Inc)添加至每個孔並在RT下孵育30分鐘。在用PBS+0.25% Tween 20洗滌5次後，將100μl的TMB Microwell過氧化物酶受質(KPL，蓋瑟斯堡，馬里蘭州，美國)添加至每個孔。通過添加50μl 1M H2SO4終止反應，並使用SpectraMax M5(Molecular Devices)測量OD450，並使用SoftMax Pro6.3軟體(Molecular Devices)進行分析。將最終數據傳輸至GraphPad Prism軟體(GraphPad Software，加利福尼亞州，美國)，並如所示繪圖。使用相同軟體計算EC50。
使用ELISA測定來確定抗CD38xCD28xCD3三特異性抗體或同種型對照抗體(人IgG4)與人CD3(Cambridge Biologics LLC目錄號03-01-0051)、CD28(Cambridge Biologics LLC目錄號03-01-0303)和CD38(Cambridge Biologics LLC目錄號03-01-0369)的結合。使用辣根過氧化物酶(HRP)綴合的抗Fab二級抗體(Jackson ImmunoResearch Inc #109-035-097)偵檢結合的抗體。
結果
使用SPR在三特異性形式(抗CD38x抗CD28x抗CD3)中測試抗CD38抗原結合結構域在其他抗原結合結構域與其同源配體結合時結合CD38的能力。對於三種抗原與每種三特異性Ab的順序結合，注射飽和
濃度(>10KD)的每種抗原8min，然後進行5min解離。通過在60秒內以30μl/min注射10mM甘胺酸鹽酸鹽(pH 2.5)來進行表面再生。將數據用1：1動力學結合模型擬合，並使用Biacore S200評價軟體1.0版進行分析。使用結合速率常數(kon)和解離速率常數(koff)計算平衡解離常數(KD)。
這種基於SPR的測定顯示，不管CD3和/或CD28抗原結合結構域是否也與它們的同源抗原結合，三特異性結合蛋白都能夠結合CD38。如通過SPR測量的動力學參數提供於表M2中。
表M2. 三特異性抗CD38x抗CD28x抗cd3結合蛋白與1、2或3種同源抗原的結合。
這些結果顯示，所有三種靶標都可以同時與三特異性結合蛋白結合。使三特異性結合蛋白與CD28、CD3或二者(以任何順序)預結合沒有改變與CD38的結合動力學或結合親和力。
接著，通過SPR評價CD38SB19xCD28supxCD3mid三特異性結合蛋白的每個抗原結合結構域在其他兩個抗原結合結構域處於或不處於飽和的情況下結合同源抗原的能力。表M3和表M4顯示這些測定的結果。
表M3. 在不存在其他靶標的情況下的靶標結合。
表M4. 在其他靶標處於飽和的情況下的靶標結合。
如表M3和表M4中所示，通過與抗原預結合使兩個靶標飽和不影響第三靶標對CD38或CD28的動力學或結合親和力。在CD3結合的情況下，預結合的CD38和/或CD28導致較快的動力學(對kon和koff值的影響為約4倍)。
在具有兩個抗CD28抗原結合結構域(超激動劑「sup」，和常規激動劑「cvn」)和兩個抗CD3抗原結合結構域(「mid」和「low」)的三特異性形式中測試抗CD38抗原結合結構域。提供這些抗原結合結構域的可變結構域序列如下：抗CD28sup：SEQ ID NO：49(VH)和SEQ ID NO：50(VL)；抗CD28cvn：SEQ ID NO：51(VH)和SEQ ID NO：52(VL)；抗CD3mid：SEQ ID NO：53(VH)和SEQ ID NO：54(VL)；抗CD3low：SEQ ID NO：84(VH)和SEQ ID NO：85(VL)。檢查三特異性結合蛋白的結合的SPR測定的結果顯示於圖2中。三個抗CD38結合結構域在三特異性結合蛋白形式中具有與在單特異性形式中大致相同的結合親和力。兩個CD3結合結構域在單特異性、雙特異性和三特異性形式中具有大約相同的結合親和力。如與在單特異性形式中相比，CD28結合結構域在雙特異性或三特
異性形式中顯示略低(但仍是納摩爾的)結合親和力。與在其他兩個抗原結合結構域未與抗原結合時相比，在其他兩個抗原結合結構域飽和時，抗CD38SB19和抗CD28sup結合結構域具有類似的結合親和力。然而，在其他兩個抗原結合結構域飽和時，抗CD3mid結合結構域顯示更快的動力學。這些結果顯示，抗CD38、抗CD28和抗CD3結合結構域適用於三特異性結合蛋白形式。
還將本文所產生的抗CD38抗原結合結構域與現有的抗CD38_SB19的抗CD38抗原結合結構域(分別地，VH序列參見SEQ ID NO：47，並且VL序列參見SEQ ID NO：48)進行了比較。通過流式細胞術確定三特異性分子與在重組鼠前B：：300.19細胞的表面上表現的CD38的結合，並且平行測定相應的抗CD38單價抗體。重組細胞株描述於以下文獻中：J.Deckket等人2014 Clin.Cancer Res 20：4574-4583。將表現CD38的鼠前B：：300.19細胞以40,000個細胞/孔包被于96孔高結合板(MSD L15XB-3)上，並在4℃下添加100μL/孔的三特異性分子持續45min，並用PBS 1% BSA洗滌三次。在4℃下添加100μL/孔的與Alexa488(Jackson ImmunoResearch；# 109-545-098)綴合的山羊抗人IgG持續45min，並用PBS 1% BSA洗滌三次。在細胞的離心和重懸後通過添加200μl/孔PBS 1% BSA評價抗體結合，並使用Guava® easyCyteTM 8HT流式細胞術系統讀取。分別使用BIOST@T-BINDING和BIOST@T-SPEED軟體估計表觀KD和EC50值。
如上所述使用流式細胞術來檢查抗CD38_SB19抗體或具有抗CD38_SB19抗CD38抗原結合結構域的三特異性結合蛋白與在其細胞表面上表現人或食蟹猴CD38多肽的鼠前B細胞的結合。具有抗CD38_SB19抗CD38抗原結合結構域的CD38xCD28supxCD3mid三特異性結合蛋白以比抗CD38_SB19單特異性抗體(EC50=0.5nM)低8倍的表觀親和力(EC50=4nM)與表現人CD38的細胞結合。抗CD38_SB19單特異性抗體或具有抗CD38_SB19抗CD38抗原結合結構域的三特異性結合蛋白都不與表現食蟹猴CD38的細胞結合。
還在三特異性形式中針對與表現人或食蟹猴CD38多肽的細胞的結合測試了人源化抗CD38抗體抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1的結合結構域。與抗CD38_SB19不同，具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原結合結構域的CD38xCD28supxCD3mid和CD38xCD28cvnxCD3mid三特異性結合蛋白，以及抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1單特異性抗體能夠結合人和食蟹猴CD38多肽二者。具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原結合結構域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特異性結合蛋白以比親代抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗體(EC50=0.5nM)低9倍的表觀親和力(EC50=4.4nM)與表現人CD38的細胞結合。具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原結合結構域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特異性結合蛋白以比親代抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗體(EC50=1nM)低7.5倍的表觀親和力(EC50=7.5nM)與表現食蟹猴CD38的細胞結合。具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原結合結構域的CD38xCD28supxCD3mid三特異性結合蛋白以比具有抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38抗原結合結構域的CD38xCD28cvnxCD3mid三特異性結合蛋白(EC50=4.4nM)低2.5倍的表觀親和力(EC50=11nM)與表現人CD38的細胞結合。
還針對與表現人或食蟹猴CD38多肽的細胞的結合將人源化抗CD38抗體抗CD38_1370的結合結構域與抗CD38_1370單特異性抗體進行了比較。儘管抗CD38_1370單特異性抗體在nM範圍內與表現人(EC50=11.2nM)或食蟹猴(EC50=6.6nM)CD38多肽的細胞結合，但具有抗CD38_1370抗CD38抗原結合結構域的CD38xCD28supxCD3mid三特異性結合蛋白在沒有飽和的情況下與表現人或食蟹猴CD38多肽的細胞結合。
總之，不論是通過SPR檢查與重組人CD38的結合或是通過流式細胞術檢查與在細胞表面上表現的人CD38的結合，發現CD38SB19xCD28supxCD3mid三特異性結合蛋白(抗CD38_SB19抗CD38結合結構域)與人CD38結合的親和力在相同範圍內(圖3)。類似地，CD38VH1xCD28supxCD3mid/low(抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38結合
結構域)和CD38VH1xCD28cvnxCD3mid/low三特異性結合蛋白(抗CD38_C2-CD38-1_VH1-VL1抗CD38結合結構域)與人CD38的結合的親和力在兩種測定中也在相同範圍內。對於CD38HHY1370xCD28supxCD3mid(抗CD38_1370抗CD38結合結構域)，通過SPR確定結合人CD38的KD是1nM，而通過流式細胞術無法估計準確的EC50值(圖3)。對具有各種抗CD38結合結構域的三特異性結合蛋白的表觀KD值(通過FACS分析獲得)的概述提供於表M5中。
表M5. 對通過流式細胞術測定獲得的表觀KD值的概述。
如所預期，缺少抗CD38結合結構域的△CD38xCD28supxCD3mid三特異性結合蛋白未與表現人或食蟹猴CD38多肽的細胞結合。這指示，在這個測定中觀察到的結合是CD38抗原結合結構域所特有的。
實例3：CD38/CD3xCD28 Ab刺激中樞記憶CD4和CD8、Th1和抗原特異性反應
為了確定CD38/CD3xCD28三特異性Ab是否可以增強細胞免疫功能，評價了體外擴增的T細胞的表型。
材料和方法
從由Research Blood Components,LLC(波士頓，馬薩諸塞州)收集的健康人供體的血液分離外周血單核細胞。如上文先前所述將PBMC添加至抗體包被的板(350ng/孔)(5 x 105個細胞/mL)，並在37℃下孵育3天和7天。在特定時間點收集細胞並通過流式細胞術分析T細胞亞群：原初(CCR7+ CD45RO-)、Tcm(CCR7+ CD45RO+)、Tem(CCR7- CD45RO+)、Tregs(CD4+ Foxp3+ CD25hi)。還用莫能菌素(GolgiStop)(BD Biosciences，加利福尼亞州)將細胞處理至少6小時，之後進行流動染色以確定細胞內細胞因子表現：Th1(CD4+ IFN-γ+)、Th2(CD4+ IL-4+)和Th17(CD4+ IL-17+)。使用限制於PBMC供體的HLA(A*02：01/NLVPMVATV)(ProImmune，牛津，英國)的熒光綴合的五聚體偵檢CMV pp65特異性CD8+ T細胞。PBMC是從HemaCare(範奈斯，加利福尼亞州)從具有已知CMV陽性群體和HLA類型的供體獲得的。使用來自對限制HLA類型呈陰性的供體的PMBC作為陰性對照。根據製造商的方案進行染色。
結果
將來自CMV感染的供體的人PBMC與三特異性Ab或具有三個突變的抗原結合位點的陰性對照三特異性抗體一起在不存在細胞因子的情況下孵育7天。對CD4亞群的分析揭示中樞記憶池中的最大增生，以及效應記憶細胞的較小增加(圖4A)。對CD4亞群的分析也揭示Th1細胞與Th2或Th17細胞相比的最大增生(>6倍)(圖4B)。在CD8亞群中，截至第7天存在中樞記憶CD8亞群的>150倍的增加，以及效應記憶細胞的較小增加(圖4C)。重要的是，與陰性對照相比，使用四聚體染色針對血清反應陽性HLA-A2供體中的pp65表位(Gratama JW,van Esser JW，等人Blood 98：1358-1364(2001))的預先存在的對CMV的抗原特異性CD8反應在存在CD38三特異性的情況下增加>44倍(圖4D)。
總而言之，這些數據指示，CD38三特異性Ab刺激可能增強體內抗腫瘤抗病毒免疫力的Th1功能和保護性CD8記憶T細胞反應。
實例4：CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進CMV特異性免疫反應
病毒抗原特異性T細胞的激活和/或增生可以提供針對病毒感染(如巨細胞病毒(CMV)感染)的治療策略。確定CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進CMV特異性T細胞的激活和擴增的能力。
材料和方法
ELISA測定
通過ELISA測量CD38/CD28xCD3 T細胞銜接器與每種靶抗原的結合親和力。簡單來說，在4℃下使用每種抗原，使用PBS(pH7.4)中的200ng/孔的每種抗原包被96孔免疫板(Thermo Fisher Scientific)過夜。使用PBS中的5%脫脂乳+2% BSA將所包被的板在RT下封閉1小時，然後用PBS+0.25% Tween 20洗滌三次(Aqua Max 400，Molecular Devices)。製備抗體(三特異性和對照Ab)的連續稀釋液並將其添加至ELISA板(100μl/孔，一式兩份)上，在RT下孵育1小時，然後用PBS+0.25% Tween 20洗滌5次。在洗滌後，將HRP綴合的二級抗人Fab(1：5000，目錄號109-035-097，Jackson ImmunoResearch Inc)添加至每個孔並在RT下孵育
30分鐘。在用PBS+0.25% Tween 20洗滌5次後，將100μl的TMB Microwell過氧化物酶受質(KPL，蓋瑟斯堡，馬里蘭州，美國)添加至每個孔。通過添加50μl 1M H2SO4終止反應，並使用SpectraMax M5(Molecular Devices)測量OD450，並使用SoftMax Pro6.3軟體(Molecular Devices)進行分析。將最終數據傳輸至GraphPad Prism軟體(GraphPad Software，加利福尼亞州，美國)，並繪圖。使用相同軟體計算EC50。
SPR測定
使用人CD38-His抗原(Cambridge Biologics，Cambridge，馬薩諸塞州)進行全面動力學分析。使用SPR技術在BIACORE 3000(GE Healthcare)上對純化的抗體進行動力學表徵。使用捕獲測定，其利用所研究抗體的人IgG1特異性抗體捕獲和取向。對於含有Fc的蛋白質構建體的捕獲，使用人抗體捕獲套組(GE Healthcare)。對於His標記的抗原的捕獲，使用抗His抗體捕獲套組(GE Healthcare)。使用標準程序通過研究級CM5芯片(GE Life Sciences)上的伯胺基團(11000RU)固定捕獲抗體。使用將導致通常30RU的最大分析物結合信號的調節的RU值以10μL/min的流速捕獲所分析的抗體。針對三特異性抗體測量結合動力學。以30μl/min的流速使用HBS EP(10mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005%表面活性劑P20)作為測定緩衝液。用相應捕獲套組的再生溶液使芯片表面再生。在BIA評價程序包v4.1中使用不具有所捕獲抗體的流動池作為參照和具有質量轉移的1：1朗繆爾(Langmuir)結合模型分析並計算動力學參數。
體外T細胞增生測量
通過負向選擇使用磁性全T細胞分離套組(Miltenyi Biotec GmbH，德國)從人外周血單核細胞(PBMC)供體分離T細胞。通過製備無菌PBS中的抗體並分配50uL至每個孔中(350ng/孔)將抗體包被于96孔細胞培養板上。然後將所述板在37℃下孵育至少2小時，然後用無菌PBS洗滌。將未接觸的T細胞添加至抗體包被的板(5 x 105個細胞/mL)並在37℃下孵育多日。在第4天用新的細胞培養基將所述細胞傳代至新鮮的抗體包被板上。在使用7天孵育的某些實驗中，在不更換的情況下僅添加新
鮮培養基至新鮮的抗體包被板。在特定時間點收集細胞並使用CountBrightTM計數珠粒來計算細胞數。
體外T細胞增生分析和T細胞亞群測定
從由Research Blood Components,LLC(波士頓，馬薩諸塞州)收集的健康人供體的血液分離外周血單核細胞。如上文先前所述將PBMC添加至抗體包被的板(350ng/孔)(5 x 105個細胞/mL)，並在37℃下孵育3天和7天。在特定時間點收集細胞並通過流式細胞術分析T細胞亞群：原初(CCR7+ CD45RO-)、Tcm(CCR7+ CD45RO+)、Tem(CCR7- CD45RO+)、Tregs(CD4+ Foxp3+ CD25hi)。還用莫能菌素(GolgiStop)(BD Biosciences，加利福尼亞州)將細胞處理至少6小時，之後進行流動染色以確定細胞內細胞因子表現：Th1(CD4+ IFN-γ+)、Th2(CD4+ IL-4+)和Th17(CD4+ IL-17+)。分別使用限制於PBMC供體的HLA/病毒肽(A*02：01/NLVPMVATV；SEQ ID NO：26)、(A*02：01/GLCTLVAML；SEQ ID NO：27)、(A*02：01/GILGFVFTL；SEQ ID NO：28)和(A*02：01/SLYNTVATL；SEQ ID NO：25)(ProImmune，牛津，英國)的熒光綴合的五聚體偵檢CMV pp65特異性、EBV BMLF特異性、甲型流感MP特異性和HIV-1 Gag特異性CD8+ T細胞。對於具有已知CMV、EBV或甲型流感的供體，PBMC是從HemaCare(Van Nuys，加利福尼亞州)獲得，並且對於具有已知HIV-1陽性和HLA類型的供體，PBMC是從BioIVT(Westbury，紐約州)獲得。使用來自對限制HLA類型呈陰性的供體的PMBC作為陰性對照。根據製造商的方案進行染色。
CMV特異性T細胞的定量
如上所述，從已知感染CMV的人供體的血液分離PBMC並將其添加至含有三特異性抗體或對照抗體的板。將所述板在37℃下孵育。在所指示的時間點收集細胞並如上所述對其進行分析。
結果
在與從CMV感染的人供體B(圖5A至圖5B)和CMV感染的人供體C(圖6A至圖6B)分離的PBMC一起孵育長達10天后，CD38VH1/CD28sup x CD3中三特異性抗體激活T細胞並促進CMV特異性記
憶CD8+ T細胞的增生。如圖5A(CMV供體B)和圖6A(CMV供體C)中所示，相對於三重突變體對照抗體，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體導致CMV特異性記憶CD8+ T細胞(細胞/μl)增加。另外，相對於三重突變體對照抗體，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體增加CMV特異性CD8+效應記憶(Tem)和中樞記憶(Tcm)細胞的百分比(CMV供體B，圖5B；CMV供體C，圖6B)。
總而言之，這些數據指示，CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進CMV特異性T細胞(如CMV特異性CD8+ T細胞、CMV特異性效應記憶(Tem)CD8+ T細胞和CMV特異性中樞記憶(Tcm)CD8+ T細胞)的激活和擴增。
實例5：CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進EBV特異性免疫反應
接著，確定CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)特異性T細胞的激活和擴增的能力。
材料和方法
EBV特異性T細胞的定量
如上所述，從已知感染EBV的人供體的血液分離PBMC並將其添加至含有三特異性抗體或對照抗體的板。將所述板在37℃下孵育。在所指示的時間點收集細胞並如上所述對其進行分析。
結果
在與從EBV感染的人供體A(圖7A至圖7B)和EBV感染的人供體B(圖8A至圖8B)分離的PBMC一起孵育長達11天后，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進EBV特異性記憶CD8+ T細胞的增生。如圖7A(EBV供體A)和圖8A(EBV供體B)中所示，相對於三重突變體對照抗體，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體導致EBV特異性記憶CD8+ T細胞(細胞/μl)增加。另外，相對於三重突變體對照抗體，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體增加EBV特異性CD8+ Tem細胞和Tcm細胞的百分比(EBV供體A，圖7B；EBV供體B，圖8B，例如，參見第7天)。
總而言之，這些數據指示，CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進EBV特異性T細胞(如EBV特異性CD8+ T細胞、EBV特異性效應記憶(Tem)CD8+ T細胞和EBV特異性中樞記憶(Tcm)CD8+ T細胞)的激活和擴增。
實例6：CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進HIV特異性免疫反應
接著，確定CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進人類免疫缺陷病毒(HIV)特異性T細胞的激活和擴增的能力。
材料和方法
HIV特異性T細胞的定量
如上所述，從已知感染HIV的人供體的血液分離PBMC並將其添加至含有三特異性抗體或對照抗體的板。將所述板在37℃下孵育。在所指示的時間點收集細胞並如上所述對其進行分析。
結果
在第0天(在與三特異性抗體一起孵育之前)，來自HIV陽性供體的PBMC展現HIV Gag特異性CD8 T細胞(與PE綴合的A*02：01-SLYNTVATL(HIV-1 gag p17 76-84)五聚體，ProImmune)(圖9)。例如，與來自HIV陰性供體的PBMC中0.33%的Gag特異性CD8 T細胞相比，三種HIV陽性PBMC供體具有0.86%(HIV供體A)、0.95%(HIV供體B)和2.27%(HIV供體C)的Gag特異性CD8 T細胞。
將PBMC與CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體一起孵育長達10天來激活T細胞並促進HIV特異性T細胞的增生。如圖10A(HIV供體D)、圖11A(HIV供體E)和圖12A(HIV供體F)中所示，相對於三重突變體對照抗體，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體導致HIV特異性記憶CD8+ T細胞(細胞/μl)增加。另外，相對於三重突變體對照抗體，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體增加HIV特異性CD8+效應記憶(Tem)細胞的百分比(例如，參見第7天和第10天)，並且還以較低程度增加CD8+中樞記憶(Tcm)細胞的百分比(HIV供體D，圖10B；HIV供體E，圖11B；HIV供體F，圖12B)。
實例7：CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進流感特異性免疫反應
確定CD38/CD28xCD3三特異性抗體促進流感特異性T細胞的激活和擴增的能力。
材料和方法
流感特異性T細胞的定量
如上所述，從已知感染甲型流感的人供體的血液分離PBMC並將其添加至含有三特異性抗體或對照抗體的板。將所述板在37℃下孵育。在所指示的時間點收集細胞並如上所述對其進行分析。
結果
在與從已知感染流感的人供體(圖13A至圖13B(流感供體A))分離的PBMC一起孵育長達11天后，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體激活T細胞並促進流感特異性記憶CD8+ T細胞的增生。如圖13A中所示，相對於三重突變體對照抗體，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體導致流感特異性記憶CD8+ T細胞(細胞/μl)增加。另外，相對於三重突變體對照抗體，CD38VH1/CD28sup x CD3mid三特異性抗體增加流感(流行性感冒)特異性CD8+ Tem細胞(例如，參見第7天和第11天)和Tcm細胞(例如，參見第7天)的百分比(圖13B)。
總而言之，實例1-7中呈現的數據顯示三特異性抗CD38/CD3/CD28抗體刺激針對多種病毒的有效抗病毒免疫力。不希望受理論束縛，人們相信，CD38/CD3/CD28三特異性抗體可以通過接合T細胞上的所有三種配體來激活並促進T細胞的增生。具體地，人們相信，CD38/CD3/CD28三特異性抗體接合T細胞上的CD3/CD28啟動了T細胞激活、增生和分化為記憶T細胞。此外，不希望受理論束縛，人們相信，接合CD28提供有利的共刺激信號，所述共刺激信號增強免疫反應的持續時間和量級，並促進T細胞增生和存活。
雖然本公開文本包括各個實施例，但是應理解業內熟習此項技術者將想到多種變化和修改。因此，所附的申請專利範圍意圖涵蓋在本公開文本的範圍內的所有此類等效變化。另外，本文使用的章節標題只是出於組織的目的，而不應解釋為限制所描述的主題。
除非明確指示相反含義，否則本文所述的每個實施例可以與其他任何一個或多個實施例組合。具體地，除非明確指示相反含義，否則指示為較佳或有利的任何特徵或實施例可以與指示為較佳或有利的其他任何一個或多個特徵或一個或多個實施例組合。
本申請中引用的所有參考文獻均以引用的方式明確地併入本文。
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<213> 人工序列
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<223> 合成構建體
<400> 111
<210> 112
<211> 3
<212> PRT
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<212> PRT
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<400> 131
<210> 132
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構建體
<400> 132
Claims (41)
- 一種在體外或離體擴增病毒特異性記憶T細胞的方法，所述方法包括使病毒特異性記憶T細胞在體外或離體與結合蛋白接觸，其中所述結合蛋白包含形成三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：VL3-CL [IV]其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且 其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點；且所述VH1結構域包含：含有GYTFTSYY(SEQ ID NO：108)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO：109)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO：110)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL1結構域包含：含有QNIYVW(SEQ ID NO：111)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO：112)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO：113)的胺基酸序列的CDR-L3序列；所述VH2結構域包含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO：120)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO：121)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO：122)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL2結構域包含：含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO：123)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO：124)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO：125)的胺基酸序列的CDR-L3序列；且所述VH3結構域包含：含有GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL3結構域包含：含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO：39)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
- 如請求項1的方法，其中使所述病毒特異性記憶T細胞與所述結合蛋白接觸引起病毒特異性記憶T細胞的激活和/或增生。
- 一種擴增T細胞的方法，所述方法包括在體外或離體使T細胞與結合蛋白接觸，其中所述結合蛋白包含形成所述三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構： VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：VL3-CL [IV]其中：VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點；且所述VH1結構域包含：含有GYTFTSYY(SEQ ID NO：108)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO：109)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO：110)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL1結構域包含：含有QNIYVW(SEQ ID NO：111)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO：112)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO：113)的胺基酸序列的CDR-L3序列；所述VH2結構域包 含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO：120)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO：121)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO：122)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL2結構域包含：含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO：123)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO：124)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO：125)的胺基酸序列的CDR-L3序列；且所述VH3結構域包含：含有GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL3結構域包含：含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO：39)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
- 如請求項3的方法，其中所述T細胞是記憶T細胞或效應T細胞。
- 如請求項3或請求項4的方法，其中所述T細胞在其細胞表面上表現嵌合抗原受體(CAR)或包含編碼CAR的多核苷酸。
- 一種結合蛋白用於製備治療慢性病毒感染的藥物之用途，其中所述結合蛋白包含形成所述三個抗原結合位點的四條多肽鏈，其中第一多肽鏈包含由下式表示的結構：VL2-L1-VL1-L2-CL [I]並且第二多肽鏈包含由下式表示的結構：VH1-L3-VH2-L4-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [II]並且第三多肽鏈包含由下式表示的結構：VH3-CH1-鉸鏈-CH2-CH3 [III]並且第四多肽鏈包含由下式表示的結構：VL3-CL [IV]其中： VL1是第一免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL2是第二免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VL3是第三免疫球蛋白輕鏈可變結構域；VH1是第一免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH2是第二免疫球蛋白重鏈可變結構域；VH3是第三免疫球蛋白重鏈可變結構域；CL是免疫球蛋白輕鏈恒定結構域；CH1是免疫球蛋白CH1重鏈恒定結構域；CH2是免疫球蛋白CH2重鏈恒定結構域；CH3是免疫球蛋白CH3重鏈恒定結構域；鉸鏈是連接所述CH1與CH2結構域的免疫球蛋白鉸鏈區；並且L1、L2、L3和L4是胺基酸連接子；其中式I的多肽和式II的多肽形成交叉輕鏈-重鏈對；其中VH1和VL1形成結合CD28多肽的第一抗原結合位點，其中VH2和VL2形成結合CD3多肽的第二抗原結合位點，並且其中VH3和VL3形成結合CD38多肽的第三抗原結合位點；且所述VH1結構域包含：含有GYTFTSYY(SEQ ID NO：108)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGNVNT(SEQ ID NO：109)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有TRSHYGLDWNFDV(SEQ ID NO：110)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL1結構域包含：含有QNIYVW(SEQ ID NO：111)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KAS(SEQ ID NO：112)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQGQTYPY(SEQ ID NO：113)的胺基酸序列的CDR-L3序列；所述VH2結構域包含：含有GFTFTKAW(SEQ ID NO：120)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IKDKSNSYAT(SEQ ID NO：121)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有RGVYYALSPFDY(SEQ ID NO：122)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL2結構域包含：含有QSLVHNNANTY(SEQ ID NO：123)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有KVS(SEQ ID NO：124)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有GQGTQYPFT(SEQ ID NO：125) 的胺基酸序列的CDR-L3序列；且所述VH3結構域包含：含有GYTFTSYA(SEQ ID NO：37)的胺基酸序列的CDR-H1序列、含有IYPGQGGT(SEQ ID NO：38)的胺基酸序列的CDR-H2序列和含有ARTGGLRRAYFTY(SEQ ID NO：33)的胺基酸序列的CDR-H3序列，並且所述VL3結構域包含：含有QSVSSYGQGF(SEQ ID NO：39)的胺基酸序列的CDR-L1序列、含有GAS(SEQ ID NO：40)的胺基酸序列的CDR-L2序列和含有QQNKEDPWT(SEQ ID NO：36)的胺基酸序列的CDR-L3序列。
- 如請求項6的用途，其中所述個體是人。
- 如請求項6或請求項7的用途，其中所述藥物包含所述結合蛋白和醫藥上可接受的載劑。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述T細胞是CD8+或CD4+記憶T細胞。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述T細胞是中樞記憶T細胞(TCM)或效應記憶T細胞(TEM)。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述CD28多肽是人CD28多肽，其中所述CD3多肽是人CD3多肽，並且其中所述CD38多肽是人CD38多肽。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中：所述VH3結構域包含(SEQ ID NO：13)的胺 基酸序列，並且所述VL3結構域包含(SEQ ID NO：14)的胺基酸序列。
- 如請求項6的用途，其中所述VH3結構域包含SEQ ID NO：13的胺基酸序列，且所述VL3結構域包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中：所述VH1結構域包含(SEQ ID NO：49)的胺 基酸序列，並且所述VL1結構域包含(SEQ ID NO：50)的胺基酸序列。
- 如請求項6的用途，其中所述VH1結構域包含SEQ ID NO：49的胺基酸序列，且所述VL1結構域包含SEQ ID NO：50的胺基酸序列。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中：所述VH2結構域包含(SEQ ID NO：53) 的胺基酸序列，並且所述VL2結構域包含(SEQ ID NO：54)的胺基酸序列。
- 如請求項6的用途，其中所述VH2結構域包含SEQ ID NO：53的胺基酸序列，且所述VL2結構域包含SEQ ID NO：54的胺基酸序列。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中L1、L2、L3或L4中的至少一個獨立地為0個胺基酸的長度。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中(a)L1、L2、L3和L4各自獨立地為零個胺基酸的長度或包含選自以下組成群組的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：57)、GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)；或者(b)L1、L2、L3和L4各自獨立地 包含選自以下組成群組的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：57)、GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：57)，L3包含序列S，並且L4包含序列RT。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234和235的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A和L235A。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置233-236的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236處的缺失。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P和R409K。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG1鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置234、235和329的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是L234A、L235A和P329A。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG1鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置298、299和300的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S298N、T299A和Y300S。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述第二多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；並且其中所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述第二多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；並且其中所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中：(a)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；(b)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；(c)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；(d)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列； (e)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列；或者(f)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列。
- 如請求項1或請求項3的方法，其中所述病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、巨細胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、人泡沫病毒(HFV)、單純皰疹病毒1(HSV-1)或單純皰疹病毒2(HSV-2)。
- 如請求項6的用途，其中L1、L2、L3或L4中的至少一個獨立地為0個胺基酸的長度。
- 如請求項6的用途，其中(a)L1、L2、L3和L4各自獨立地為零個胺基酸的長度或包含選自以下組成群組的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：57)、GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)；或者(b)L1、L2、L3和L4各自獨立地包含選自以下組成群組的序列：GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：55)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：56)、S、RT、TKGPS(SEQ ID NO：57)、GQPKAAP(SEQ ID NO：58)和GGSGSSGSGG(SEQ ID NO：59)。
- 如請求項6的用途，其中L1包含序列GQPKAAP(SEQ ID NO：58)，L2包含序列TKGPS(SEQ ID NO：57)，L3包含序列S，並且L4包含序列RT。
- 如請求項6的用途，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置234和235的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是F234A和L235A。
- 如請求項6的用途，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置233-236的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是E233P、F234V、L235A和在236處的缺失。
- 如請求項6的用途，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG4的位置228和409的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S228P和R409K。
- 如請求項6的用途，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG1鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置234、235和329的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是L234A、L235A和P329A。
- 如請求項6的用途，其中所述第二和所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域是人IgG1鉸鏈-CH2-CH3結構域，並且其中所述鉸鏈-CH2-CH3結構域各自包含根據EU索引在對應於人IgG1的位置298、299和300的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S298N、T299A和Y300S。
- 如請求項6的用途，其中所述第二多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V；並且其中所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W。
- 如請求項6的用途，其中所述第二多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置354和366的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是S354C和T366W；並且其中所述第三多肽鏈的鉸鏈-CH2-CH3結構域包含根據EU索引在對應於人IgG1或IgG4的位置349、366、368和407的位置處的胺基酸取代，其中所述胺基酸取代是Y349C、T366S、L368A和Y407V。
- 如請求項6的用途，其中： (a)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：62的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；(b)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：65的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；(c)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：67的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：63的胺基酸序列；(d)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：60的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：68的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列；(e)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：64的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：70的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列；或者(f)所述第一多肽鏈包含SEQ ID NO：61的胺基酸序列，所述第二多肽鏈包含SEQ ID NO：66的胺基酸序列，所述第三多肽鏈包含SEQ ID NO：71的胺基酸序列，並且所述第四多肽鏈包含SEQ ID NO：69的胺基酸序列。
- 如請求項6的用途，其中所述病毒是人類免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、巨細胞病毒(CMV)、乙型肝炎病毒(HBV)、人乳頭瘤病毒(HPV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)、人泡沫病毒(HFV)、單純皰疹病毒1(HSV-1)或單純皰疹病毒2(HSV-2)。
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