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TWI856019B - 減少嬰兒腹絞痛的支援褪黑素的細菌的選擇和應用 - Google Patents

減少嬰兒腹絞痛的支援褪黑素的細菌的選擇和應用 Download PDF

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TWI856019B
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Abstract

本發明提供某些乳酸菌菌株，所述乳酸菌菌株經過針對它們增加褪黑素水準以預防和/或治療腹絞痛(或與褪黑素水準降低相關的其它疾病)的能力包括產生褪黑素的前體和其它重要組分的能力進行選擇；選擇這些菌株的方法；以及含有這些菌株的產品。此外，本發明涉及包含底物組分的製備物，所述底物組分被特定選擇以增強這些菌株的功效。

Description

減少嬰兒腹絞痛的支援褪黑素的細菌的選擇和應用
本發明提供某些乳酸菌菌株，所述菌株經過針對增加用於預防和/或治療腹絞痛(或與褪黑素水準降低相關的其它疾病)的褪黑素水準的能力的選擇，包括產生前體和其它用於褪黑素釋放的重要組分的能力；選擇這些菌株的方法；以及含有這些菌株的產品。此外，本發明涉及包含底物組分的製劑，所述底物組分被特別選擇以增強這些菌株的功效。
儘管在流行和困苦方面都有顯著性，但嬰兒腹絞痛的性質和原因仍然知之甚少。有也不同的術語用來描述病情。這些術語包括“嬰兒腹絞痛”，“夜間腹絞痛”因為疼痛主要局限於晚上，和以它在出生後約三個月後消失為托詞的“三個月腹絞痛”。不同的作者使用了不同的定義。Wessels的定義是腹絞痛是在至少三周的時間內每週三天 或更多時間每天哭3小時或更長時間的陣發，這在文獻中已被大多數人接受。2006年，出版了羅馬III標準，其修改這一標準以考慮診斷為“嬰兒腹絞痛”，適用於易怒、煩躁或哭鬧的嬰兒，無明顯原因的起始和停止，每天持續3小時或更長時間，並發生每週至少3天，但持續至少1星期(有時稱為修改的Wessel's標準)。羅馬IV標準中進行了進一步微調；(Benninga等人；Gastroenterology 2016；150：1443-1455)。這些定義中的任何一個(羅馬III或羅馬IV)都與本發明相關。
迄今為止，嬰兒腹絞痛的主要討論的可能致病因素被分成：社會心理、胃腸道包括微生物生態失調、和神經發育障礙。
社會心理因素包括：正常哭鬧的變化、非典型育兒行為影響和在父母與嬰兒的互動問題的表現。
腹絞痛牽連胃腸功能紊亂，因為嬰兒的腿位置和哭咒時臉部扭曲。胃腸道因素簡述如下：
不當的餵養技術如奶瓶餵奶、在水準位置餵食和餵食後沒有打隔都被認為是致病因素。已發現前六個月的母乳餵養是保護因素。嬰兒腹絞痛的風險在非母乳餵養嬰兒中是1.86倍(Saavedra MA,Dacosta JS,Garcias G,Horta BL,Tomasi E,Mendoca R.Infantile colic incidence and associated risk factors：a cohort study.Pediatr(Rio J)2003；79(2)：115-122)。
目前還沒有完全治癒腹絞痛的方法。目前用於腹絞痛 的治療範例包括藥理學和/或非藥理學方法，最多可減輕症狀。對父母提供的腹絞痛的典型治療干預屬於四類，包括飲食、身體、行為和藥理學。飲食操作包括各種餵養技術的專業建議，或使用低過敏性牛奶、大豆或無乳糖配方奶、食品補充劑如各種益生菌和益生元、以及早期引入固體。
用於治療腹絞痛的非處方藥大部分包括給予西甲矽油或二甲基聚矽氧烷，一種非吸收的非處方藥，其減少腸氣氣泡的大小。西甲矽油具有安全性，並且經常被推薦，儘管一些研究表明，西甲矽油對於嬰兒腹絞痛的有效性並不比安慰劑好。
已經有一些報告涉及腹絞痛嬰兒中微生物群模式改變，使得一些研究人員執行和發佈不同的隨機臨床對照試驗(RCT)，其中評估了例如羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri)DSM 17938減少這些嬰兒啼哭時間的能力。例如，Savino等人(Pediatrics 2010；126：e526-33)在2010年進行了RCT以測試該菌株對嬰兒腹絞痛的功效。根據修改的Wessel's的標準診斷的50名完全母乳餵養的腹絞痛嬰兒被隨機分配為每天接受羅伊氏乳酸桿菌DSM 17938(108菌落形成單位)或安慰劑，持續21天。父母問卷每天監測哭鬧時間和不良反應。46名嬰兒(羅伊氏乳酸桿菌組：25名；安慰劑組：21名)完成了試驗。在第0天，每天哭鬧時間以分鐘/天表示(中位數)為370比300；在第21天，為35.0比90.0(P=.022)。
在2013年，Szajewska等人(J Pediatr 2013；162：257-62)發表了一項類似設計的研究，對80名年齡<5個月的嬰兒進行了RCT，確定益生菌組的治療反應率明顯高於安慰劑組。在第7天，分鐘/天(中位數)為180比180，在第14天為75比128，和在第21天為52比120(P<0.05)。也有一些其它研究顯示了羅伊氏乳酸桿菌DSM 17938在腹絞痛嬰兒中顯著減少母乳餵養嬰兒哭鬧時間的效果。然而，需要甚至更有效的干預措施以在腹絞痛兒童中以更高的比率減少哭鬧，包括在配方奶餵養的兒童中以更高的比率減少哭鬧。
因此，目前需要證明可用於治療嬰兒腹絞痛的新的(並且優選改進的)安全有效的化合物和組合物和技術。本發明的組合物和方法回應這種需求，提供了可以安全有效地預防和治療嬰兒腹絞痛(或與腹絞痛相關的症狀)的產品。
根據以下公開內容，其它目的和優點將更加明顯。
新生兒激素不成熟被認為是腸道運動發展的早期問題的主要因素，因此也引起嬰兒的疼痛和哭泣，例如嬰兒腹絞痛。褪黑素是一種激素，其具有支援生物節律的能力並且對人類和動物的許多功能具有重要作用。褪黑素的前體是5-羥色胺，本身是一種神經遞質，其可以源自胺基酸色胺酸。
褪黑素是先前被認為主要由松果腺分泌的神經遞質。 然而，存在松果腺之外的褪黑素產生部位，例如視網膜和胃腸道。
嬰兒中產生與不同晝夜節律之間的同步性和隨後5-羥色胺和褪黑素的釋放對於避免腸運動性障礙和疼痛例如嬰兒腹絞痛(IC)可能是重要的。
5-羥色胺增加腸道平滑肌收縮，和褪黑素使腸道平滑肌鬆弛。如果不通過其它藥物(其中褪黑素是重要的一種)來平衡，5-羥色胺濃度峰值可引起腸痙攣。5-羥色胺和褪黑素都具有晝夜節律。雖然當嬰兒出生時產生5-羥色胺和發展出5-羥色胺晝夜節律，但是內源性褪黑素產生和褪黑素晝夜節律在許多嬰兒中直到在生命的第3個月之後才開始。該時間與嬰兒腹絞痛正常消失的時間一致。
可以說嬰兒腹絞痛是褪黑素缺乏症的一種病症。因此，建議將外源性褪黑素給予患有IC的嬰兒，但許多醫師和家長都不願意給激素嬰兒。
所有新生兒中估計有5%至25%的IC患病率，這在某些方面對於社會、父母和嬰兒本身是繁重和高成本的。
因此，儘管有些兒童似乎能從他們的食物和/或他們的腸道細菌中產生和釋放需要的褪黑素並因此不太可能發展嬰兒腹絞痛，但是也有很多其他兒童並非如此，因而需要額外的支援以預防或治療IC。
因此，有需要發現和開發出在處於IC發展風險或患有IC的兒童中支援褪黑素產生和釋放的產品和方法。
本發明基於以下發現：可以選擇能夠產生腺苷的細 菌，例如乳酸菌。產生腺苷的乳酸菌在本領域中尚未見報道，並且這樣的細菌可例如用於增加芳基烷基胺-N-乙醯轉移酶(AANAT)的產生，AANAT是褪黑素合成中的限速酶。雖然AANAT酶在松果腺中被發現，但它也在松果腺之外的褪黑素產生部位例如胃腸道中產生。因此，AANAT產生的增加(例如通過增加腺苷產生)提供了在胃腸道中增加褪黑素產生或增加褪黑素水準的手段。因此，這種細菌可用於治療或預防嬰兒腹絞痛或與減少的、低的或缺乏的褪黑素產生或合成相關或以其為特徵的其它疾病。
因此，本發明提供了一種細菌菌株，例如能夠產生或誘導腺苷產生的乳酸菌菌株，其用於在受試者中產生腺苷(例如增加腺苷水準或增加或促進腺苷的產生)，或用於在受試者中產生褪黑素(例如增加褪黑素水準或增加或促進褪黑素的產生)。
本發明還提供一種方法，其用於在受試者中產生腺苷或褪黑素(例如增加腺苷或褪黑素水準，或者增加或促進腺苷或褪黑素產生)，所述方法包括以下步驟：將有效量的能夠產生或誘導產生腺苷的細菌菌株例如乳酸菌菌株給予所述受試者。
本發明還提供能夠產生或誘導產生腺苷的細菌菌株例如乳酸菌菌株用於製備用於在受試者中產生腺苷或褪黑素(例如增加腺苷或褪黑素水準，或增加或促進腺苷或褪黑素的產生)的藥物或組合物的用途。
更一般地說，本發明還提供細菌，例如乳酸菌，其能 夠產生或誘導產生褪黑素。因此，這種細菌可用於產生褪黑素，例如用於增加受試者中褪黑素的產生或水準。
因此，在一個方面，本發明提供了能夠產生或誘導產生褪黑素的乳酸菌菌株，其用於在受試者中產生褪黑素(例如增加褪黑素水準或增加或促進褪黑素的產生)。
另一方面，本發明提供了在受試者中產生褪黑素(例如增加褪黑素水準或增加或促進褪黑素的產生)的方法，所述方法包括向所述受試者施用有效量的乳酸菌菌株的步驟，該菌株能夠產生或誘導產生褪黑素。
另一方面，本發明提供了能夠產生或誘導產生褪黑素的乳酸菌菌株用於製備用於在受試者中產生褪黑素(例如，增加褪黑素的水準或增加或促進褪黑素的產生)的藥物或組合物的用途。
如上所述，此類菌株可用於治療或預防嬰兒腹絞痛，或與降低的、低的或缺乏的褪黑素產生或合成或水準相關或以其為特徵的其它疾病。
因此，本發明進一步提供了能夠產生或誘導產生褪黑素的乳酸菌菌株，其用於在受試者中治療或預防嬰兒腹絞痛，或與減少的、低的或缺乏的褪黑素產生或合成或水準有關的其它疾病。
另一方面，本發明提供在受試者中治療或預防嬰兒腹絞痛或與減少的、低的或缺乏的褪黑素產生或合成或水準有關或以其為特徵的其它疾病的方法，所述方法包括以下步驟：將有效量的能夠產生或誘導產生褪黑素的乳酸菌菌 株給予所述受試者。
另一方面，本發明提供了能夠產生或誘導產生褪黑素的乳酸菌菌株在製備用於在受試者中治療或預防嬰兒腹絞痛或與減少的、低的或缺乏的褪黑素產生或合成或水準相關或以其為特徵的其它疾病的藥物或組合物中的用途。
此類菌株可能能夠產生或誘導產生腺苷，從而產生或誘導產生(例如下游產生)褪黑素，如本文其它地方所述。
本發明的其它目的和優點對於讀者來說將變得顯而易見，並且這些目的和優點旨在包括在本發明的範圍內。
[圖1]是顯示褪黑素產生途徑的示意圖。
[圖2]是顯示能夠產生腺苷的本發明細菌如何影響褪黑素產生途徑的示意圖。
[圖3]顯示了在羅伊氏乳酸桿菌細菌細胞的上清液中5'-核苷酸酶活性的測量。
[圖4]顯示通過添加羅伊氏乳酸桿菌細菌細胞的上清液在腸的腸樣模型中產生褪黑素。
[圖5]顯示了羅伊氏乳酸桿菌DSM 33198細菌細胞的上清液中5'-核苷酸酶活性的測量。
因此，如上所述，本發明提供細菌菌株，例如乳酸菌菌株，其能夠產生或刺激或誘導或支持產生褪黑素，例如 增加褪黑素的水準，特別是在胃腸(GI)道中。這些菌株本身可產生褪黑素，例如分泌褪黑素，從而直接提供或產生褪黑素。
然而，還提供了間接導致褪黑素產生的菌株，例如通過產生或刺激或誘導產生褪黑素合成途徑的上游組分(或褪黑素的前體)，從而支持或增加褪黑素產生。優選的實例是產生或誘導芳烷基胺-N-乙醯基轉移酶(AANAT)，其是5-羥色胺向N-乙醯基5-羥色胺轉化的限速酶，N-乙醯基5-羥色胺繼而轉化為褪黑素。
如上所述，另一種特別優選的乳酸菌菌株是能夠在受試者中特別是在胃腸(GI)道中產生或誘導腺苷的菌株。這種腺苷可以作用於合適的細胞表面腺苷受體(例如A2A受體、A2B受體、A3或A4受體，優選A2A受體)並導致產生升高水準的細胞內cAMP。已知A2A和其它腺苷受體存在於GI道中發現的細胞中。細胞內cAMP繼而參與AANAT的產生(參見圖2)。因此，增加的細胞內cAMP水準可導致AANAT水準增加並因此增加褪黑素水準。因此，應優選在細胞外提供腺苷，以便能夠結合細胞表面腺苷受體。為此，腺苷可以在細菌細胞內產生，並在細胞外(或分泌)運輸。或者，腺苷可以在細胞外產生，例如在細菌細胞表面上或上清液中產生。這種細胞外產生可以例如通過細胞壁(或細胞表面)錨定的5'-核苷酸酶(或胞外5'-核苷酸酶)的存在方便地進行，所述酶可以將合適的底物轉化為腺苷。這種細胞外產生同樣可以通過細胞上清液或細胞外空間中5'- 核苷酸酶(或胞外5'-核苷酸酶)的存在來進行。如本文所示，細菌菌株可以將這種5'-核苷酸酶(或胞外5'-核苷酸酶)提供或釋放到細胞上清液或細胞外空間中，其中它可以隨後將適當的底物轉化為腺苷。合適的底物包括AMP。
因此，當細菌菌株在本文中被稱為能夠產生腺苷時，這包括細菌細胞本身直接產生腺苷，並且還包括細菌細胞通過以下細胞產生腺苷：所述細胞具有活性5'-核苷酸酶(例如存在於細菌細胞表面上或釋放到細胞上清液或細胞外空間中)，並從而轉化或能夠轉化合適的底物(例如AMP)為腺苷。這種底物可以天然存在，例如在環境中內源存在，或者可以例如通過外源手段提供給細菌。
因此，這樣的菌株可以導致褪黑素水準增加，例如與不存在這種菌株的水準相比。
已知褪黑素在胃腸道中產生，因此在該區域中產生或增加的產生應該是生理學上有效的。優選地，產生的褪黑素的量在臨床上或治療上是顯著的。因此，本發明的菌株可用於治療與褪黑素減少或水準降低有關(或以其為特徵)的任何疾病或病症或與褪黑素缺乏有關(或以其為特徵)的任何疾病或病症，或可用於治療會受益於褪黑素水準的增加的任何疾病或病症。這種疾病的優選實例是嬰兒腹絞痛。用於這種治療用途的優選菌株是產生褪黑素或腺苷的那些。
因此，本發明更進一步的方面提供能夠產生或誘導產生褪黑素的乳酸桿菌菌株(例如因為所述菌株能夠產生或 誘導產生腺苷)，或能夠產生或誘導產生腺苷的乳酸菌菌株。還提供了這些菌株的治療用途。優選地，所述菌株具有編碼5'-核苷酸酶的基因，或者此類菌株具有活性5'-核苷酸酶，例如將AMP底物(或其它合適的底物)轉化為腺苷。本文其它地方描述了腺苷產生的示例性水準或5'-核苷酸酶活性或褪黑素產生的水準。
本發明的優選菌株是羅伊氏乳酸桿菌菌株，更優選羅伊氏乳酸桿菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198(其保藏細節在本文別處提供)，和這些菌株例如分離的菌株或生物學純培養物或此類菌株的製備物構成本發明的進一步的方面，還有包含所述菌株的組合物(例如藥物組合物或營養組合物例如食品增補劑，或益生菌組合物)，或這種菌株治療用途，例如如本文其它地方所述，特別是用於治療或預防嬰兒腹絞痛(或本文其它地方描述的其它疾病)的治療用途。在一些實施方案中，不使用DSM 17938菌株。因此，本發明提供羅伊氏乳酸桿菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198，其用於治療，例如用於疾病的治療或預防，如本文別處所述。本發明還提供羅伊氏乳酸桿菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM33198，其用於治療或預防嬰兒腹絞痛。
因此，本發明的又一方面提供了在受試者中治療或預防嬰兒腹絞痛或本文其它地方所述的其它疾病的方法，所 述方法包括向所述受試者施用有效量的羅伊氏乳酸桿菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198的步驟。
另一方面，本發明提供羅伊氏乳酸桿菌菌株DSM 32846，DSM 32847，DSM 32848，DSM 32849和/或DSM 33198在製備用於在受試者中治療或預防嬰兒腹絞痛或如本文其它地方所述其它疾病的藥物或組合物中的用途。
如本文其它地方所述的本發明的替代和優選實施方案和特徵同樣適用於本文此處和其它地方描述的本發明的治療方法和用途。
菌株羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198已經被針對其產生腺苷能力進行選擇(例如，通過具有編碼5'-核苷酸酶的基因，和可以將AMP底物轉化成腺苷的活性5'-核苷酸酶)，並且不僅適用於增加腺苷水準(例如相比於其中菌株不存在的水準)，而且還適用於增加褪黑素水準，例如通過增加AANAT的水準，如本文其它地方所述。菌株包含活性細胞壁錨定的5'-核苷酸酶，並且在它們各自的上清液中也顯示出5'-核苷酸酶活性(參見圖3和圖5A/B)。
這些羅伊氏乳酸桿菌菌株已經從天然存在的菌株中開發(換言之，已被修飾或改造或進化)，並且還被針對一種或多種其它改善的性質進行選擇，例如增加的對膽汁的抗性或增加對粘膜表面例如胃腸道表面的粘附。因此，DSM 32846和DSM 32847已經進化為對膽汁酸更耐受，從而例 如在GI道中以更大的數量存活。DSM 32848和DSM 32849已經進化成更好地粘附於粘液，目的是在GI道中更好地定殖，從而例如根據本發明更好地起作用。所述羅伊氏乳酸桿菌菌株DSM 33198也已在包括反復冷凍乾燥過程的多步驟選擇過程改性，以允許其比其天然分離物更耐受和在產生過程中得到更高的存活率。因此，這樣的菌株不對應於天然存在的菌株，並被迫進化並且為非天然菌株。所有羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846，DSM 32847，DSM 32848，DSM 32849和DSM 33198菌株都經過選擇。優選的菌株是DSM 32846、DSM 32847、DSM 32849或DSM 33198。更優選的菌株是DSM 32846、DSM32847或DSM 33198。
在一個實施方案中，選擇或使用羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和/或DSM 32849菌株。優選的菌株是DSM 32846、DSM 32847或DSM 32849。更優選的菌株是DSM 32846或DSM 32847，例如在一些實施方案中優選DSM 32846。在一些實施方案中，選擇或使用菌株DSM 33198。
本發明提供了能夠產生或誘導產生腺苷(例如增加腺苷水準，或增加或促進產生腺苷)的細菌菌株例如乳酸菌菌株在製造用於在受試者中產生腺苷的藥物或組合物中的用途。
此類方法和用途可用於治療或預防嬰兒腹絞痛或本文其它地方所述的其它疾病，例如腸躁症候群(IBS)、睡眠障礙或神經退行性疾病或病症例如阿爾茨海默病或其它類 型的癡呆例如其它類型的老年癡呆症。此類疾病也是與褪黑素缺乏或減少相關(或以其為特徵)的疾病或者例如受益於褪黑素水準升高或增加的疾病的實例。
胃腸運動是指胃腸道中肌肉的伸展和收縮，以轉移被消化的食物。這些肌肉的同步收縮稱為蠕動。
存在大量的局部釋放的因數，包括在胃腸道中調節運動和分泌的激素。消化系統的活動以及其內部內含物的運輸決定了所述運動。當在消化道的任何部分中神經和/或肌肉，胃腸運動功能，不以正常的力量和協調性運作時，個人發展出與運動紊亂相關的症狀。
已經描述了運動功能的紊亂例如在患有嬰兒腹絞痛的受試者中在各個腸道區域中產生各種症狀。
嬰兒腹絞痛是用於描述在出生後頭三個月內無明顯原因而過度哭鬧的嬰兒的術語。腹絞痛是嬰兒期最令人痛苦的問題之一。對於嬰兒、父母和醫療保健提供者來說，這是令人痛苦的。腹絞痛的原因尚不完全清楚。
新生兒激素不成熟被認為是腸道運動發展的早期問題的主要因素，因此也引起嬰兒的疼痛和哭泣，例如在嬰兒腹絞痛中。
褪黑素是一種能夠支持生物節律並且對人類和動物許多功能具有重要作用的激素。所述激素通過在平滑肌和胃腸道腸肌叢細胞上表達的選擇性受體(褪黑素受體)影響胃腸道運動。胃腸平滑肌收縮的潛在基本機制是迴圈產生電流。胃腸道肌電活動由兩種電勢組成：在移行性綜合肌電 中組織的慢波和峰電活動。
褪黑素的前體是5-羥色胺，本身是一種神經遞質，可以源自胺基酸色胺酸。
已經表明，5-羥色胺誘導的食物轉運減少被褪黑素部分阻斷。它是褪黑素和5-羥色胺在腸道活動調節中的平衡系統(counterbalancing system)。
此外，功能性和平衡的褪黑素-5-羥色胺系統通過腦和胃腸道中內分泌以及旁分泌作用影響食欲和消化過程。
兩種激素的作用似乎對運動具有相反的效果，並且最終的效果是劑量依賴的。還已知褪黑素和5-羥色胺參與過敏反應和疼痛傳導。
褪黑素，也稱為N-乙醯基-5-甲氧基色胺，是一種激素和早期認為主要由松果腺分泌的神經遞質。但存在松果腺之外的重要褪黑素產生部位，例如視網膜和胃腸道。目前還有報告顯示在胃腸道中的褪黑素是松果腺的至少400倍。胃腸褪黑素的晝夜變化似乎不受光照(如松果腺那樣)的控制，而是受攝食和食物組成的控制。
嬰兒中產生和不同晝夜節律之間的同步和隨後5-羥色胺和褪黑素釋放對於避免腸道運動障礙和疼痛例如嬰兒腹絞痛(IC)是重要的。
5-羥色胺增加腸道平滑肌收縮，和褪黑素使腸道平滑肌鬆弛。如果不被其它藥物(其中褪黑素是重要的一種)平衡，5-羥色胺濃度峰值可引起腸痙攣。5-羥色胺和褪黑素均有晝夜節律。雖然當嬰兒出生時產生5-羥色胺和發展出 5-羥色胺晝夜節律，但是內源性褪黑素產生和褪黑素晝夜節律在許多嬰兒中直到在生命的第3個月之後才開始。該時間與嬰兒腹絞痛正常消失的時間一致。已經表明，患有腹絞痛的嬰兒在生命早期在早上褪黑素是低的，而沒有腹絞痛的嬰兒則是高的(Cengiz et al 2015,Turkish journal of family medicine and primary care；9(1)/10-15)。這些嬰兒(例如患有與缺乏褪黑素或褪黑素平衡相關的嬰兒腹絞痛的多種形式的嬰兒，例如在早上例如在上午6點、上午8點、上午10點或中午12點之前褪黑素水準缺乏)是可以使用本發明治療的受試者的實例。
因此，雖然有些兒童看起來能夠從他們的食物和/或他們的腸道細菌內源性地產生和釋放所需的褪黑素，並且因此不太可能發展出嬰兒腹絞痛，但是還有許多兒童並非如此，因此需要額外的支援以預防或治療IC。這些嬰兒(例如患有由例如未完全發展的腸道微生物群引起的褪黑素缺乏的嬰兒或患有營養問題或餵養問題的嬰兒)也是可以使用本發明治療的受試者的實例。
可以說嬰兒腹絞痛是褪黑素缺乏症的一種病症。這對於處於壓力情況下的兒童或者不太能夠應對壓力的兒童(例如對於在完全妊娠時間之前出生或者沒有完全功能性的食物代謝等的兒童)尤為重要。這樣的嬰兒(例如在完全妊娠時間之前出生的褪黑素缺乏的嬰兒、或通過剖腹產的嬰兒、或沒有完全功能的食物代謝的嬰兒)也是可以使用本發明治療的受試者的實例。
涉及褪黑素功能平衡的病症的另一個例子是腸躁症候群(IBS)，其是特徵如下的常見病症：復發性腹痛或不適，連同在沒有可識別的原因的情況下紊亂的排便習慣。褪黑素被認為對疼痛感知和排便習慣顯示出積極效果(Siah KTH et al,2014,World J Gastroenterol；20(10)：2492-2498)。因此，患有IBS的受試者，特別是與缺乏褪黑素或褪黑素平衡相關的IBS形式，也是可以使用本發明治療的受試者的實例。
褪黑素缺乏症主要在松果腺、血液迴圈、唾液、腦脊液中並通過測定在尿液中代謝物6-羥基硫酸褪黑素調查。
腸內有超過20種腸內分泌細胞，這使其成為人體中最大的內分泌器官。腸嗜鉻細胞(EC)細胞是一種腸內分泌和神經內分泌細胞。它們位於消化道內腔襯裡的上皮細胞旁，並且在胃腸道調節特別是腸道運動和分泌中起著至關重要的作用。EC細胞在腸神經系統(ENS)中通過分泌神經遞質5-羥色胺和其它肽調節神經元信號傳導，它們進一步表達腺苷受體並具有褪黑素的活性合成。
褪黑素信號不足的常見症狀是睡眠障礙，並且褪黑素是我們這個時代最流行的天然健康補充劑之一。褪黑素通常被稱為“黑暗激素”，因為它的合成和分泌在身體的某些位置被黑暗增強並被光抑制。睡眠障礙在兒童中非常普遍，並且如果沒有適當的治療，可能會變成慢性且持續多年(Esposito et al.2019,J Transl Med,17：77)。據報導，即使是老年人也會出現睡眠障礙。隨著年老定期觀察到夜間 褪黑素峰值減小。因此，具有或患有睡眠障礙或睡眠病症(特別是與缺乏褪黑素或褪黑素平衡相關的睡眠障礙或睡眠病症的形式)的受試者也是可以使用本發明治療的受試者的實例。
褪黑素水準的降低也在神經退行性疾病中被重複描述，特別是在阿爾茨海默病和其它類型的老年性癡呆中(Blumenbach Johann Friedrich,2012,The Scientific World Journal Volume 2012,Article ID 640389)。因此，具有這種神經退行性疾病(特別是與缺乏褪黑素或褪黑素平衡相關的此類神經退行性疾病的形式)的受試者也是可以使用本發明治療的受試者的實例。
褪黑素形成的速率取決於松果腺中芳基烷基胺-N-乙醯基轉移酶(AANAT)的活性(圖1和圖2)，但也取決於松果腺之外的褪黑素產生部位例如胃腸道中的活性。
腺苷通過腺苷受體增加細胞內cAMP水準，這增加了AANAT的產生，AANAT是褪黑素合成中的限速酶。
本發明的一個目的是使用產生腺苷的乳酸菌株來預防和/或治療嬰兒腹絞痛。
本發明的另一個目的是使用產生腺苷的乳酸菌株來預防和/或治療IBS。
本發明的另一個目的是使用產生腺苷的乳酸菌株來預防和/或治療睡眠障礙。
本發明的另一個目的是使用產生腺苷的乳酸菌株來預防和/或治療神經退行性疾病，例如阿爾茨海默氏病和其 它類型的癡呆，例如其它類型的老年性癡呆。
本發明還涉及用於選擇能夠產生腺苷的特定細菌菌株包括乳酸菌菌株的方法，和這樣的菌株向患有腹絞痛或處於腹絞痛風險的嬰兒遞送有益效果的用途。本發明的另一個目的是提供能夠產生腺苷的新的細菌菌株。
人體中一個重要的代謝過程是嘌呤代謝，其中嘌呤被特定的酶代謝並降解。那些酶的一個實例是胞外-5'-核苷酸酶(CD73)，其被認為是在腺苷的生成中的關鍵酶。
發明人預料不到地發現一些特定的益生菌菌株能夠產生腺苷。
因此，本發明包括用於選擇有效產生腺苷的特異性細菌菌株包括乳酸菌菌株的新方法。選擇特定細菌菌株的目的是將它們用於治療某些疾病，例如嬰兒腹絞痛(或本文其它地方描述的其它疾病)。
本發明提供了用於選擇可用作益生菌並用於治療例如作為藥物或作為食品補充劑的細菌菌株特別是乳酸菌菌株的方法。
本發明一個方面因此提供用於選擇能夠產生腺苷的細菌菌株優選乳酸菌菌株的方法，其中所述方法包括：a)根據編碼5'-核苷酸酶(例如細胞壁錨定的5'-核苷酸酶)的基因的存在情況篩選細菌菌株，例如乳酸菌菌株；和/或b)根據活性5'-核苷酸酶(例如細胞壁錨定的5'-核苷酸酶)的存在情況篩選細菌菌株，例如乳酸菌菌 株，或其上清液。
這種5'-核苷酸酶(5'NT)也可稱為胞內-5'核苷酸酶或CD73(分化簇73)。然後可以選擇出能夠產生腺苷的菌株。
或者，本發明提供了用於選擇細菌菌株優選乳酸菌菌株的方法，所述方法通過針對其產生腺苷能力篩選細菌菌株例如乳酸菌菌株和選出具有所述能力的菌株來進行。
一旦使用本發明的方法選出合適的菌株，就可以將其用於在受試者中產生例如局部產生腺苷。
通過本發明的方法選擇、產生、獲得或可獲得的細菌菌株例如乳酸菌菌株(其中所述菌株能夠在受試者中產生腺苷，例如局部產生腺苷)是本發明另一個方面。
還提供了本發明選擇的菌株在嬰兒腹絞痛(或本文其它地方描述的其它疾病)中的治療用途。
因此，本發明的另一個方面提供通過本發明的方法選擇、產生、獲得或可獲得的細菌菌株例如乳酸菌菌株(其中所述菌株具有5'-核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶和能夠產生腺苷)用於在受試者中產生例如局部產生腺苷的用途。
本發明的替代實施方案提供一種細菌菌株，例如乳酸菌菌株，其中所述菌株具有5'-核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶和能夠產生腺苷，所述細菌菌株用於在受試者中產生例如局部產生腺苷。該菌株及其用途的優選特徵在本文其它地方描述。
如本文其它地方所述，本發明的一個具體實施方案是 預防和/或治療嬰兒腹絞痛(或本文其它地方描述的其它疾病)。
還提供了治療方法或在受試者中產生例如局部產生腺苷的方法，所述方法包括以在受試者中有效產生例如局部產生腺苷的量向所述受試者給予通過本發明的選擇方法選擇、產生、獲得或可獲得的細菌菌株例如乳酸菌菌株，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶並且能夠產生腺苷。所述菌株及其治療用途(例如在嬰兒腹絞痛(或本文其它地方描述的其它疾病)中)的優選特徵在本文別處描述。
本發明還提供了通過本發明的選擇方法選擇、產生、獲得或可獲得的細菌菌株例如乳酸菌株在製備用於在受試者中產生(例如局部產生)腺苷的組合物或藥物中的用途，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'核苷酸酶並且能夠產生腺苷。替代實施方案提供了細菌菌株例如乳酸菌菌株在製備用於在受試者中產生例如局部產生腺苷的組合物或藥物中的用途，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶並且能夠產生腺苷。該菌株的優選特徵及其治療用途，例如在嬰兒腹絞痛(或本文其它地方描述的其它疾病)中，在本文別處描述。
產品或組合物，例如藥物組合物，益生菌組合物或飲食/營養組合物，其包含如本文所述的細菌菌株(例如包含一種或多種細菌菌株)(例如能夠產生或誘導腺苷，褪黑素等的細菌菌株)和所述產品或組合物在方法中的應用和如 本文所述的應用構成本發明的又進一步的方面。
聯合國糧食及農業組織將益生菌定義為“活的微生物，當以足夠的量施用時，賦予宿主健康益處”。如今，許多不同的細菌被用作益生菌，例如乳酸產生細菌，例如乳桿菌(Lactobacillus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)的菌株。
如本文其它地方所述的本發明的替代和優選實施方案和特徵同樣適用於本發明的治療方法、用途和產品。
如以上描述的，本發明涉及能夠產生腺苷的細菌菌株的選擇和用途。
所述有效產生腺苷的菌株可用於在受試者(例如哺乳動物，優選人)中局部產生腺苷。
因此，如上所述，本發明提供了用於選擇或篩選能夠產生腺苷的細菌菌株的各種方法。
某些方法包括根據編碼5'-核苷酸酶(例如細胞壁錨定5'-核苷酸酶)的基因的存在情況進行篩選的步驟(例如步驟a))。這樣篩選可使用任何適當的方法進行並且選出5'-核苷酸酶基因陽性的菌株。這樣的方法將可以方便地在體外進行，例如會是基於遺傳或核酸的方法以檢測序列是本領域已知的5'-核苷酸酶例如細胞壁錨定5'-核苷酸酶(或其識別片段)的編碼基因的存在情況。例如，可以容易地設計PCR方案(或其它基於核酸的技術)以基於編碼酶的已知核酸序列來實現這一點，或者作為替代方案，可以仔細檢查候選菌株的基因組序列以便鑒定所述編碼5'-核苷酸酶(例 如細胞壁錨定5'-核苷酸酶)的基因，例如，基於與已知5'-核苷酸酶序列的同源性，包括例如如下面所討論的LPXTG基序的存在情況。
在本發明的方法中待檢測的示例性基因是來自羅伊氏乳酸桿菌的細胞壁錨定(胞內)5'-核苷酸酶基因(例如Genbank登錄號：AEI56270.1，LPXTG-基序細胞壁錨定結構域蛋白[羅伊氏乳酸桿菌SD2112])，或來自其它細菌種類的適當同源物/5'核苷酸酶，例如其它乳酸菌。在實驗實施例中描述了示例性技術。
一些方法包括根據活性(功能性)5'-核苷酸酶(例如細胞壁錨定5'-核苷酸酶)的存在情況進行篩選的步驟(例如步驟b))。這樣的步驟可以使用任何合適的方法進行，例如，使用酶測定法。5'-核苷酸酶催化以下反應：AMP+H2O
Figure 108126201-A0305-02-0025-3
腺苷+磷酸(AMP是腺苷一磷酸)和測量該反應的測定法可以容易地用於確定活性5'-核苷酸酶的存在情況(或5'-核苷酸酶活性)。換句話說，本文提及的活性或功能性5'-核苷酸酶是能夠在合適的條件下例如當提供合適的底物例如AMP時催化該反應的酶。如果需要，對該5'-核苷酸酶的活性進行定量，例如通過測量在所述反應產生和可以被測量或定量的磷酸或腺苷或腺苷的其它適當的下游產物的量或濃度。可以方便地對細菌細胞樣品或來自細菌細胞的上清液進行活性測量。
用於進行這種測定的方法對於本領域技術人員來說是熟知的。例如，合適的試劑盒是可商購的，例如Crystal Chem 5’-Nucleotidase Assay Kit(Crystal Chem，目錄#80229，Downers Grove，IL，USA)，其中通過染料(醌染料)的產生來測量5'-核苷酸酶活性，所述染料作為AMP轉化為腺苷的下游產物形成(即作為腺苷產生的結果)。提供AMP作為底物。在實施例部分中描述了示例性技術。適當的方法也可以從其它試劑供應商，例如Sigma，以及它們的5'-核苷酸酶試劑中容易地獲得。
具有高或顯著的5'-核苷酸酶產生水準(或5'-核苷酸酶活性)的菌株是優選的，例如具有至少或大於2單位/L(單位每升)的5'-核苷酸酶活性和/或能夠以至少或大於2μmol L-1 min-1(每分鐘每升μmol)產生腺苷的菌株。因此，在優選實施方案中，選擇以下菌株：具有至少或大於3，4，5，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150單位/L的水準的5'-核苷酸酶活性，和/或能夠以至少或大於3，4，5，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140或150μmol L-1 min-1的水準產生腺苷。在一些實施方案中，這些值可表示上限。這些值通常是指在細菌細胞的樣品，例如在細菌細胞的表面，或在培養細菌細胞的上清液中，優選在上清液中測定的5'-核苷酸酶活性的值。這些值通常是指在細菌細胞樣品中例如在培養細菌細胞的上清液中測量的腺苷水準(優選細胞外腺苷水準)。當用109細菌/ml的濃度或來自這種培養物的上清液進行測量時，這些值通常是指5'-核苷酸酶活性 (或腺苷水準)的值。一個單位被定義為產生1μmol產物/分鐘(例如1μmol產物/升/分鐘)所需的酶的量。以單位/升的濃度然後對應於以1μM/分鐘增加濃度所需的酶濃度(例如1μM/升/分鐘)。使用來自Crystal Chem Inc的5'-核苷酸酶試劑盒(#80229)在實施例中顯示了用於測量該活性的合適和示例性的測定法。因此，在優選的實施方案中，上述單位和值是指當使用該試劑盒和/或實施例中所述的條件特別是以109細菌/ml的濃度或者來自所述培養物的上清液或等同的測定法進行測量時的單位和值。因此，這些方法將可以方便地在體外進行。
包含至少步驟b)的方法將是優選的，因為編碼5'-核苷酸酶的基因的存在並不總是表明存在活性5'-核苷酸酶。在該方法中，本發明的用途和乳酸菌、腺苷產生或腺苷活性應該發生在細胞外的，即乳酸菌的外部或表面上，由此它可以是例如存在於上清液中或由乳酸菌產生的其它細胞外液中。因此，細胞表面的活性5'-核苷酸酶(例如以細胞壁錨定的5'-核苷酸酶形式)或來自細菌細胞胞外的活性5'-核苷酸酶(例如在上清液中)的存在可以是有用的特徵，使得產生腺苷的反應發生在細胞外，例如在細菌細胞的表面上。
因此，產生良好水準的腺苷(例如由5'-核苷酸酶產生的細胞外腺苷)也可以是5'-核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶的存在的指標。因此，本發明的選擇方法還可以涉及選擇產生腺苷的菌株的步驟。具有高或顯著的腺苷例如細胞 外腺苷產生水準的菌株是優選的，例如以在受試者中治療有效的水準或者以觀察到增加的褪黑素水準(和優選治療有效水準)的水準產生腺苷的菌株。這些值通常是指在培養菌株的上清液中或(體外)培養菌株的細胞表面上測量的腺苷值並且某些示例性的具體值在上文提供。
然而，在一些實施方案中，適當的是指在受試者中例如局部例如在施用部位例如在胃腸道中產生的腺苷的值、水準或量。例如，優選的菌株可以導致增加的腺苷產生，例如增加體內產生，例如腺苷的局部產生(例如在胃腸道中)，例如與本文其它地方描述的相關對照(例如當沒有給予菌株時腺苷的水準，或特定受試者中腺苷的基本或天然水準)相比。
在本文所述的本發明的所有方面中，局部產生可以指施用位元點處腺苷的產生或水準，例如胃腸道中腺苷的產生或水準(例如當口服給藥時)。在一個方面，局部產生腺苷可具有全身下游效應和可能增加腺苷或褪黑素在循環系統例如在血液或血漿中或胃腸道外的其它地方的水準。
因此優選能夠引起腺苷(或褪黑素)局部水準增加的菌株，例如在受試者的胃腸道中，特別是當口服給藥菌株時觀察到這種效果。優選地，所述增加是可測量的或顯著增加的，例如在統計學上或臨床上顯著的。例如，可產生至少或高達2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的腺苷(或褪黑素)水準例如腺苷(或褪黑素)的局部水準增加的菌株是優選的。可以使用任何適當的比較，例如與 未給予菌株時觀察到的水準相比增加，或者給予對照製劑例如不含相關菌株的對照製劑時的水準。
測量腺苷(或褪黑素)產生水準的適當方法對於本領域技術人員來說是熟知的。因此，在本發明的一些實施方案中，選擇方法將包括檢測或測定候選菌株產生的腺苷的量或水準(例如濃度)的步驟。
任選地，可以方便地將腺苷產生水準或5'-核苷酸酶活性與陽性或陰性對照菌株進行比較。合適的陽性對照菌株可以是DSM17938，其已在實施例中顯示產生顯著水準的腺苷/5'-核苷酸酶活性，例如在細菌細胞的上清液中。一些菌株將產生比DSM 17938更高水準，有時顯著更高水準的腺苷/5'-核苷酸酶活性，例如在細菌細胞的上清液中。因此，能夠比DSM 17938產生更高(增加)水準或顯著更高(增加)水準的5'核苷酸酶活性的菌株(例如在細菌細胞的上清液中，例如當在體外評估時)構成了本發明的另一個方面。示例性菌株是DSM 32846、DSM 32847、DSM 32849和DSM 33198(參見圖3和圖5A/B)。或者，與DSM 17938相比，能夠產生或誘導產生更高(增加)水準或顯著更高(增加)水準的腺苷的菌株構成本發明的又一方面。例如，與DSM 17938相比，能夠在受試者中產生或誘導產生更高(增加)水準或顯著更高(增加)水準的腺苷例如在受試者中更高等的局部水準的腺苷的菌株構成了本發明的又一方面，特別是當口服給予菌株時觀察到這種效果的情況。
優選地，所述增加(在腺苷產生或5'核苷酸酶活性中) 是可測量的或顯著的增加，例如在統計學上或臨床上是顯著的。例如，與DSM 17938水準相比，可產生至少或至多10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、550%或更高的腺苷水準例如腺苷的局部水準或5'核苷酸酶活性水準(例如當體外評估時)的增加的菌株是優選的。或者，與DSM17938的水準相比，可以產生至少或高達2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的腺苷水準(例如局部腺苷水準)或者5'-核苷酸酶活性水準增加的菌株是優選的。優選地，這種增加是腺苷的細胞外水準或5'-核苷酸酶活性的增加，例如如在細菌培養物的上清液中例如在體外測量。
合適的陰性對照菌株可以是不含編碼5'-核苷酸酶的基因或不含活性5'-核苷酸酶(或不具有如本文其它地方所述的5'-核苷酸酶活性)的菌株。
由於通過本發明方法選擇的菌株的下游應用，在選擇或分離產生腺苷的菌株後，其它實施方案將涉及以下進一步的步驟：培養或繁殖或產生此類菌株，並任選地將所述培養或繁殖或產生的菌株配製成包含所述菌株的組合物，例如藥物或營養組合物，例如本文其它地方所述，或者可能存儲這些菌株用於將來的用途，例如通過凍乾或冷凍乾燥。在一個實施方案中，細菌菌株以凍乾形式提供。
本發明方法的選擇步驟(以及實際上如本文所述的治療方法)通常需要在適當的支援腺苷產生的培養基(或體內 環境)中進行。優選的培養基(或體內環境)將含有適當的碳源，其將支持所述菌株產生腺苷，優選與合適底物(例如AMP)一起通過5'-核苷酸酶用於產生腺苷。
雖然這樣的測定法可以方便地在體外進行，但另一種選擇是在適當的離體測定中評估菌株，例如使用合適的腸的腸樣模型(參見例如實施例5中描述的腸樣模型和測定法，其中例如可以評估褪黑素的水準)。
因此，用於評估菌株的優選體外或離體模型是腸的腸樣模型，優選人腸的腸樣模型。此類模型優選包含腸內分泌細胞，例如如實施例5中所述。
本發明的優選菌株能夠產生或誘導至少或高達10、20、30、40、50、60或70pg/ml褪黑素的產生。在一些實施方案中，此類值可表示上限。這些值通常是指當在合適的體外或離體測定法測定時由所述菌株誘導的褪黑素產生的水準，例如是指當所述細胞與本發明的菌株或從所述菌株中取出的上清液接觸時由腸內分泌細胞(優選人細胞)產生或在包含腸內分泌細胞的腸的腸樣模型(優選包含人細胞的模型)中產生(例如以腸內分泌細胞的%表示，如本文其它地方所描述)的褪黑素水準。用於測量該活性的合適且示例性的測定法在實施例中顯示，使用包含腸內分泌細胞的人腸的腸樣模型，例如至少20%或30%，例如20-40%、30-40%或高達40%的腸內分泌細胞。因此，在優選實施方案中，上述值是指使用該測定法(或等同的測定法，例如使用上述的腸內分泌細胞%)和/或實施例所述的 條件測定的值。
一些菌株能夠產生或誘導比DSM 17938更高水準有時顯著更高水準的褪黑素，例如從腸內分泌細胞或如上所述的腸的腸樣模型中。因此，與DSM 17938相比，能夠產生或誘導更高(增加)水準或顯著更高(增加)水準的褪黑素的菌株(例如當如上所述評估時，例如使用腸內分泌細胞或腸的腸樣模型)構成發明的另一個方面。與DSM 17938的水準相比，示例性菌株可以產生至少或高達2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的褪黑素產生水準的增加，並且是優選的。
因此，本發明的篩選方法可任選地包括選擇菌株的另一步驟，所述菌株能夠產生或誘導產生褪黑素，例如使用如上所述的方法。選擇的菌株可以優選地以如上所述的水準誘導產生褪黑素。
在使用本發明的方法篩選多於一種細菌菌株的實施方案中，可任選地定量產生的腺苷或5'-核苷酸酶活性(或褪黑素)的量，並且可以選出具有5'-核苷酸酶的最高活性或水準、或5'-核苷酸酶的足夠高活性或水準(例如具有本文其它地方描述的活性或水準，例如具有比DSM17938更高(優選顯著更高)的活性或水準)的細菌菌株，例如乳酸菌菌株；或者產生腺苷或褪黑素的最高量或水準、或腺苷或褪黑素的足夠高的量或水準(例如具有本文其它地方所述的量或水準，或者具有比DSM17938更高(優選顯著更高)的量或水準)的菌株。
因此，本發明的再一方面是提供用於選擇有效產生腺苷(或褪黑素)的細菌菌株優選乳酸菌菌株的方法，包括：a)針對編碼5'-核苷酸酶的基因例如細胞表面錨定的5'核苷酸酶的存在情況篩選乳酸菌菌株，和；b)定量5'-核苷酸酶活性和；任選c)選擇具有最高或足夠高的5'-核苷酸酶活性的乳酸菌菌株。
包含如本文所述的某些步驟的方法在適當時還包括由這些步驟組成的方法。
如上所述，通過本發明的方法選擇、產生、獲得或可獲得的細菌菌株，例如乳酸菌菌株(其中所述菌株能夠產生腺苷，並且優選地繼而產生或支持產生例如增加產生褪黑素)是本發明的又一方面。
可以對任何合適的細菌菌株，例如益生菌菌株，例如任何益生菌，進行本發明的選擇方法，並且可以在本發明的方法或用途中例如在本文所述的治療方法或用途中使用能夠產生腺苷的任何適當的細菌菌株，例如益生菌菌株。
優選的細菌菌株是乳酸菌，例如乳桿菌(Lactobacillus)或雙歧桿菌(Bifidobacterium)。特別優選的細菌菌株是羅伊氏乳酸桿菌，尤其是菌株羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849，它們根據布達佩斯條約在2018年7月4日保藏於DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig)；和羅伊氏 乳酸桿菌DSM 33198，它根據布達佩斯條約在2019年7月9日保藏於DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig)。在一些實施方案中，羅伊氏乳酸桿菌菌株DSM 17938不被使用。因此，本發明的又一方面提供了這種菌株用於治療或預防本文所述的一種或多種疾病的用途。
本發明的另一個目的是提供改善本文所述特定疾病的治療用途和效果的方法，包括使所選菌株例如乳酸菌的5'-核苷酸酶活性最大化、增加或改善，優選導致腺苷產生增加或改善。這可以通過以下方式實現：在特定生長條件下培養細菌以獲得高產率的腺苷(或更高，例如顯著更高產率的腺苷，例如與在沒有特定生長條件的情況下觀察到的產率相比)。在本發明的一個實施方案中，特定生長條件可以是例如在正常生長培養基中培養乳酸菌，所述培養基補充有用於通過5'核苷酸酶產生腺苷的合適底物(例如AMP)或AMP的適當上游組分例如ADP和/或ATP。
在本發明的另一相關實施方案中，為了使5'-核苷酸酶的活性最大化，可以施用更高濃度的細菌，例如乳酸菌。示例性的濃度可能為常規劑量的2至10倍。
在本發明的另一個相關實施方案中，5'-核苷酸酶基因可以通過適當的方法在細菌菌株中過表達或誘導，例如在合適的啟動子例如誘導型啟動子的控制下插入具有5'-核苷酸酶基因的質粒載體。或者，可以在適當的啟動子例如誘 導型或天然啟動子的控制下，通過將一個或多個額外的基因拷貝插入細菌細胞中例如插入細菌細胞的染色體上來過表達5'-核苷酸酶基因。
如上所述，本發明的菌株，或通過本發明的方法選擇、產生、獲得或可獲得的菌株可用於治療。因此，本發明的另一方面提供了本發明的產生腺苷的菌株，或使用本發明的選擇方法選擇、獲得或可獲得的菌株，其用於在受試者中產生例如局部產生腺苷，並從而優選產生褪黑素。在本發明的優選的實施方案中，所述腺苷等和優選褪黑素的產生被用於治療嬰兒腹絞痛(和如本文所述的其它疾病)，其將受益於腺苷和進一步的褪黑素的產生或增加的產生，例如產生。
本發明的治療方法和用途中細菌菌株的給予是按藥學上、治療上、或生理學上有效量對需要治療的受試者(動物/哺乳動物)進行。因此，所述方法和用途可涉及鑒定需要治療的受試者的額外步驟。
根據本發明治療疾病或病症(例如治療已存在的疾病)包括治癒所述疾病或病症，或疾病或疾病症狀的任何減輕或緩解(例如疾病嚴重程度的降低)。
本發明的方法和用途適用於預防疾病或病症以及治療疾病或病症。因此，預防性治療也包括在本發明中。因此，在本發明的方法和用途中，治療或療法還包括適當時的預防或防止。
這些預防(或)方面可以方便地如本文所述對健康或正 常受試者進行，並且可以包括完全預防和顯著預防。類似地，顯著的預防可以包括與未給予治療時預期的嚴重性或症狀相比，疾病或疾病症狀的嚴重性降低(例如可測量地或顯著地降低)的情況。
本發明的又一方面提供用於本文其它地方所定義的治療用途的菌株或產品，其中所述用途還包括給予至少一種另外的藥劑，例如另外的治療劑或營養劑。示例性藥劑可能是增加或增強腺苷產生的底物組分(可以增加或增強腺苷產生的組分)，或者所述組分的來源。
因此，在本發明的又一個實施方案中，當涉及產生腺苷的細菌時，所述菌株或產品的給予還包括給予底物組分例如AMP和/或產生該組分的物質或藥劑。優選的底物是AMP，或AMP的來源。
在這樣的實施方案中，可以在給予受試者之前將底物組分或其它另外的組分直接添加到細菌製備物中。或者，可以在製造過程結束時例如在發酵結束時將其添加到細菌製備物中，之後可以將細菌儲存以備將來使用，例如通過冷凍乾燥或凍乾。或者，它可以如下所述單獨給藥。
在此類實施方案中，另外的治療劑可以是可用於治療目標疾病的任何其它藥劑。
所述其它藥劑可以與本發明的菌株或產品一起給予(例如作為組合製劑)或可以分開給予。此外，所述其它藥劑可以與本發明的菌株或產品同時給予或在不同時間點給予，例如序貫給予。本領域技術人員可以根據所述其它目 標藥劑容易地確定合適的給藥方案和時機。
本發明還提供一種組合物(或組合產品或試劑盒)，其包含：(i)由本發明的選擇方法選擇、產生、獲得或可獲得的細菌菌株，例如乳酸菌菌株(或如本文另外定義的能夠產生或誘導產生腺苷的細菌菌株)，其中所述細菌菌株具有編碼細胞表面錨定的5'-核苷酸酶的基因或活性5'-核苷酸酶，並且能夠產生腺苷；和(ii)一種或多種底物會增加或增強腺苷產生的組分或藥劑，或這些組分或藥劑的來源。
上文概述了示例性組分或藥劑。優選的組分是AMP或AMP的來源。
本發明還提供適用於增加受試者中褪黑素或腺苷產生的組合物(或組合產品或試劑盒)，其包含：(i)第一細菌菌株，例如乳酸菌菌株，能夠產生或誘導產生褪黑素或腺苷，如本文所述；和(ii)另一來源的褪黑素和/或腺苷，或增加或提高所述乳酸菌菌株產生或誘導褪黑素和/或腺苷的一種或多種底物組分或藥劑，或這些組分或藥劑的來源，如適當時。
優選的組分是AMP或AMP的來源。
在本發明的試劑盒或組合產品中，組分(i)和(ii)通常在分開的隔室或容器中提供，或作為試劑盒或產品的單獨 組分提供。試劑盒可包含進一步的組分，其也可以在單獨的隔室或容器中。優選地，試劑盒(或組合產品)用於本文所述的本發明的方法或用途，例如用於治療或預防本文所述的其它疾病，特別是嬰兒腹絞痛。可任選地提供在本發明的方法和用途中使用的試劑盒或產品的說明書。
本文所用的術語“受試者”包括哺乳動物，特別是人，尤其是嬰兒。在本發明優選的實施方案中，所選擇的菌株，例如乳酸菌菌株，被給予人類。
根據本發明的優選受試者是小於或最多12個月，優選小於或最多5或6個月，優選小於或最多3或4個月大的嬰兒。當待治療或預防的疾病是嬰兒腹絞痛時，這些受試者特別合適。因此，受試者可以從出生開始，或在生命的最初幾周內(例如在最初第1、2、3或4周內)或在生命的最初幾個月內(例如在最初第1、2、3或4個月內)進行治療。
如本文其它地方所述，優選的受試者是那些患有嬰兒腹絞痛或被認為或懷疑患有嬰兒腹絞痛的受試者。由於本發明的治療用途也可用於預防疾病，因此適當的受試者包括有患嬰兒腹絞痛風險的受試者。
示例性受試者將包括唯獨(僅僅)母乳餵養的嬰兒、和唯獨(僅僅)配方奶餵養的嬰兒(非母乳餵養的嬰兒)或已經母乳餵養和配方奶餵養兩者的嬰兒。
其他示例性受試者包括嬰兒，特別是患有腹絞痛、懷疑患有腹絞痛或有發生腹絞痛的風險的嬰兒，他們尚未產生或釋放褪黑素或者另外不能產生或釋放褪黑素，例如其 中褪黑素晝夜節律週期尚未發展或開始的的嬰兒，或無法從其食物和/或其腸道細菌中產生或釋放所需褪黑素的嬰兒；或者包括褪黑素水準低、降低(或異常)或褪黑素缺乏的嬰兒，例如與正常或健康受試者的水準(例如相同、等同或相當年齡的正常或健康受試者的水準)相比。
其他示例性受試者包括具有某種營養或飲食問題或困難的嬰兒，例如導致褪黑素水準低或不足的嬰兒。這些受試者可能包括在完全妊娠時間之前出生的嬰兒，例如早產嬰兒或妊娠36周前出生的嬰兒，或缺乏完全功能性食物代謝的嬰兒，或有餵養問題或其他營養不良或有不良飲食或次優飲食的嬰兒。
其他示例性受試者包括例如與相同年齡的正常嬰兒或受試者相比具有激素不成熟(換句話說次優、低於正常、未發育、缺乏、低或未成熟的激素產生)例如褪黑素不成熟的那些，優選嬰兒，特別是由於所述激素不成熟而具有腸道運動缺陷的那些受試者。這種激素不成熟，例如褪黑素不成熟或褪黑素減少或缺乏，可以例如與患有嬰兒腹絞痛的一些嬰兒相關。待治療的其它優選疾病(和因此受試者)是與褪黑素缺乏症相關的疾病或病症(或患有所述疾病的受試者)。
在所有這些受試者中，如果合適或必要，可以使用本領域容易獲得和已知的技術容易地測量所述受試者中褪黑素的水準。例如，可以容易地在血清/血液或唾液樣品中測量褪黑素的水準。用於此類測量的商業試劑盒也是可獲 得的。
可以使用任何適當的給藥方式。方便地，所述給藥是口服、經直腸或通過管飼。因此，可根據需要或適當地將細菌給予胃腸道或口腔。細菌可以包含在嬰兒配方奶或食品補充劑或油滴中，以及包含藥物製劑中。
根據待治療的疾病(或病症)、給藥方式和所涉及的製劑，可以容易地選擇本文所定義的本發明的菌株，產品和組合物的適當劑量。
例如，選擇劑量和給藥方案，使得根據本發明給予受試者的細菌可以導致腺苷(或褪黑素)的產生增加，例如局部產生，並在嬰兒腹絞痛(或其它待治療的疾病)中產生所需的治療效果或健康益處。因此，優選地，所述劑量是治療有效劑量，其適合於所治療的哺乳動物和病症的類型，並且例如被給予有需要的受試者。例如，可以使用細菌的104-1012例如105-109或106-108或108-1010或1010-1012總CFU的每日劑量，例如單個每日劑量。
在一個實施方案中，每日劑量(例如105-109或106-108或108-1010或1010-1012的CFU)被分成若干次給藥，例如2-8次給藥(例如3-5次給藥)或與受試者的次餵養(母乳和/或配方奶)相關聯。在一個實施方案中，給予較高劑量，例如起始期後劑量的2至10倍或10至100倍，和/或更頻繁給予的劑量作為起始劑量持續3-14天(例如5-10天，例如7天)以便在受試者中更快地緩解。
本文所用術語“增加”或“增強”或“更高”(或等同術語) 包括與適當對照相比時任何可測量的增加或提升。適當的對照將容易地被本領域技術人員來確定，並且可能包括不存在菌株時的水準，或在未治療或用安慰劑治療的受試者中的水準，或在健康或正常受試者例如年齡匹配的受試者或治療前的同一受試者中的水準。優選地，該增加將是顯著的，例如臨床上或者統計學顯著的，例如概率值
Figure 108126201-A0305-02-0041-4
0.05。
優選地，這種增加(和實際上如本文其它地方提到的其它增加、改善或積極效果)是可測量的增加等(作為合適的)，更優選地，它們是顯著增加，優選臨床上顯著或統計學顯著增加，例如概率值
Figure 108126201-A0305-02-0041-5
0.05，當與適當的對照水準或值比較時(例如，與未治療或用安慰劑治療的受試者相比或與健康或正常受試者或治療前相同受試者相比)。
本文所述術語“減少”或“降低”(或等同術語)包括與適當對照相比時任何可測量的減少或降低。本領域技術人員可以容易地確定適當的對照，並且可以包括不存在菌株時的水準，或在未治療或用安慰劑治療的受試者中的水準，或在健康或正常受試者例如年齡匹配的受試者或治療前的同一受試者中的水準。優選地，該減少或降低將是顯著的，例如臨床上或者統計學顯著的，例如概率值
Figure 108126201-A0305-02-0041-6
0.05。
因此，優選地，這種減少(並且實際上如本文其它地方提到的其它減少、降低或負面效果)是可測量的減少等(作為合適的)，更優選地，它們是顯著減少，優選臨床上顯著或統計學顯著減少，例如概率值
Figure 108126201-A0305-02-0041-7
0.05，當與適當的 對照水準或值比較時(例如，與未治療或用安慰劑治療的受試者相比或與健康或正常受試者或治療前相同受試者相比)。
根據以下非限制性實施例和所附權利要求，其它目的和優點將更加完全明顯。
實施例
實施例1
鑒定具有編碼位於細胞表面的5'-核苷酸酶的基因的菌株的方法
在MRS平板上在37℃下厭氧環境中培養細菌16小時。用無菌塑膠環收集10個細菌菌落，並懸浮在100微升無菌水中(PCR品質)。(替代方案：使用合適的方法從細菌培養物中製備DNA)。
可以通過PCR檢查5'-核苷酸酶基因的存在，例如通過使用PuReTaq Ready To Go PCR珠(GE HealthCare)和下述任何引物對(各0.4mM)。應在PCR混合物中加入細菌懸浮液或DNA製備物(0.5微升)，並且並通過95℃，5分鐘，30x(95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s)；72℃，10分鐘運行程序進行PCR反應。可以通過使用標準瓊脂糖凝膠電泳分離和顯現PCR產物，並通過標準Sanger測序(使用用於PCR的正向引物)測定序列。
可以使用以下任何引物檢測基因：
引物對1(產品大小233bp)
LrNuc1f：GGAACTTTGGGAAACCATGA
LrNuc1r：CGGGCAACTTTACCATCACT
引物對2(產品大小212bp)
LrNuc2f：TACTCGTGAAAATGCCGTTG
LrNuc2r：GTGCCCCTGTCATTTCAACT
引物對3(產品大小232bp)
LrNuc3f：AGCTTTACCAAATTGACCCTGA
LrNuc3r：TTGATATTAGGCGCATCCTTTT
序列
編碼細胞表面錨定5'-核苷酸酶的基因，Genbank登錄號：AEI56270.1，LPXTG-基序細胞壁錨定域蛋白[羅伊氏乳酸桿菌SD2112]
Figure 108126201-A0305-02-0044-1
細胞表面錨定5'-核苷酸酶蛋白，Genbank登錄號：AEI56270.1，LPXTG-基序細胞壁錨定域蛋白[羅伊氏乳酸桿菌SD2112]
Figure 108126201-A0305-02-0045-2
實施例2
分析5'-核苷酸酶活性的方法
使用Crystal Chem 5’-Nucleotidase Assay Kit(Crystal Chem，Elk Grove Village，IL，USA)用於測定細菌細胞和發酵上清液的5'-核苷酸酶活性。簡而言之，程序如下。
在兩個步驟中，將試劑CC1和CC2加入到含有細菌或上清液的樣品中。試劑1含有通過來自細菌的5'-核苷酸酶轉化為腺苷的AMP。通過試劑1中的組分將腺苷進一步水解成肌苷和次黃嘌呤。在第二步中，將次黃嘌呤轉化為尿酸和過氧化氫，其用於產生醌染料，所述染料在分光光度計中在550nm下動態測量。通過計算3和5分鐘之間吸光度的變化並與校準樣品的值進行比較來確定活性。
實施例3
羅伊氏乳酸桿菌菌株中的5'-核苷酸酶活性
使用上述實施例2中描述的方法生成實驗資料，所述 實驗資料表示在羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849以及在羅伊氏乳酸桿菌DSM 17938(在2006年1月30日根據布達佩斯條約保藏在DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b,D-38124 Braunschweig)中)中的5'-核苷酸酶活性。結果如圖3所示。
實施例4
選擇菌株
上述實施例3中的所有新菌株，即羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849在細菌上清液中顯示出5'-核苷酸酶活性。對濃度為每毫升109個細菌的細菌培養物的上清液進行分析。
羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849已經發展/進化為改善性能。DSM 32846和DSM 32847已經進行了進化成為更耐膽汁酸，從而在胃腸道以更大的數量生存。DSM 32848和DSM 32849已經進化成更好地粘附於粘液，目的是在胃腸道中更好地定殖，從而根據本發明更好地起作用。
選擇所有羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849菌株。優選的菌株是DSM 32846、DSM 32847和DSM 32849。
實施例5
益生菌菌株對人腸的腸樣模型中褪黑素產生的影響
背景
源自腸隱窩幹細胞的人腸的類腸(HIE，human intestinal enteroids)在腸上皮細胞的體外模型中是生物學相關的。HIE含有所有腸上皮細胞類型；然而，與人腸類似，HIE通常以少量(約1%)產生腸內分泌細胞(EEC)，這限制了它們的研究。為了增加HIE中EEC的數量，使用慢病毒轉導來穩定地工程改造具有多西環素誘導的神經元素-3(NGN3)(一種驅動EEC分化的轉錄因數)表達的空腸HIE(tetNGN3-HIE)。在該遺傳工程改造的細胞系中，培養物中存在的腸內分泌細胞的數量從
Figure 108126201-A0305-02-0047-8
1%增加至約40%。
材料與方法
人腸的類腸
從經歷減肥手術的成年患者的空腸組織分離的隱窩產生HIE培養物。這些已經確立的培養物獲自Texas Medical Center Digestive Diseases Center Study Design and Clinical Research Core的Baylor College of Medicine。從組織樣品製備三維HIE培養物並保持在培養物中。為了增加HIE中EEC的數量，使用慢病毒轉導來穩定地工程改造具有多西環素誘導的神經元素-3(NGN3)(一種驅動EEC分化的轉錄因數)表達的空腸HIE(tetNGN3-HIE)。在該遺傳工程改造的細胞系中，培養物中存在的腸內分泌細胞的數量從
Figure 108126201-A0305-02-0047-9
1%增加至約40%。根據標準方案，所有類腸以96孔單層形式 繁殖和分化。關於該類腸細胞系的更多資訊、如何培養以及測定的一般方法描述於Chang-Graham等人(Chang-Graham et al.,Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology,2019,S2352-345X(19)30049-9，印刷中，線上出版可用)中。
細菌菌株和製備物
在該實驗中，研究了兩種不同的羅伊氏乳酸桿菌菌株(DSM 17938和DSM 32846)關於它們增加腸中褪黑素產生的能力。
本研究中使用在Lactobacillus Defined Media 4(LDM4)培養基中培養直至它們達到穩定期的來自羅伊氏乳酸桿菌DSM 17938和羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846的條件培養基(上清液)，參見下文更多細節。
從MRS瓊脂平板上挑取細菌菌株的單菌落，用於接種10mL MRS肉湯，並在密閉的錐形管中於37℃水浴中孵育。8小時後，進行1：10的培養物稀釋，並用分光光度計讀取600nm處的光密度，然後在起始OD為0.1(計算如下)下接種25mL預熱的LDM4並置於水浴中孵育16小時。
○OD=0.307。1：10稀釋=OD為3.07
25mL*(0.1OD)=3.07x x=0.814mL
○將814μL與24.19mL LDM4合併
16小時後，取出培養物。最終OD為2.6。通過以4700rpm離心沉澱細胞，並將上清液轉移到新的50mL錐形 管中。將上清液在-20℃下儲存過夜。
使用的化學品
AMP=腺苷5'-一磷酸，99%(Acros Organics)代碼：102790259，批號：A0395274。
在MiliQ水中製備10mL儲備溶液(2mM的儲備溶液=6.9mg/ml(FW=347.224))，並通過0.22μM過濾器過濾滅菌。
實驗設置
對誘導的類腸的對照治療：￭LDM4(培養基)，￭LDM4+20uM AMP，￭LDM4+200uM AMP
DSM 32846和DSM 17938上清液對誘導的類腸的實驗性治療：
￭僅DSM 32846上清液
￭DSM 32846上清液+20uMAMP
￭DSM 32846上清液+200uMAMP
￭僅DSM 17938上清液
￭DSM 17938上清液+20uMAMP
￭DSM 17938上清液+200uMAMP
在將上清液或其它添加物準備施用於類腸之前，中和 pH並將上清液過濾除菌。使用10-30μL的10M氫氧化鈉溶液將pH調節至7.0，並通過將2uL上清液施加到pH試紙(Fisher Brand-Cat.13-640-510範圍6.0-8.0)上來測量pH。使用0.22uM過濾器(Thermo Scientific Nalgene Rapid Flow 0.22uM過濾器代碼：00158)對上清液進行過濾滅菌。
將100uL(總體積)治療物置於類腸上。在37℃，5% CO2組織培養箱中對類腸進行孵育1小時。溫育後，除去上清液並儲存在-20℃直至下游分析。
通過ELISA(Eagle Biosciences Inc，Amherst，NH，USA)檢測褪黑素。遵循標準方案之前完成的唯一步驟是將上清液解凍，並使其達到室溫。(大約20-21攝氏度)。
結果
人腸的類腸(HIE)作為腸上皮的體外模型在生物學上是相關的。如圖4所示，DSM 32846單獨沒有顯著效果，但是當補充AMP時它顯示了對HIE產生褪黑素的明顯作用。較高濃度的AMP獲得甚至更高的褪黑素產生。與對照相比，DSM 17938具有增加的褪黑素產生，但小於DSM 32846。因此，DSM 32846是用於在腸中產生褪黑素的良好候選菌株。
實施例6
羅伊氏乳酸桿菌菌株中的5'-核苷酸酶活性
使用上述實施例2中描述的方法產生顯示羅伊氏乳酸 桿菌DSM 33198中5'-核苷酸酶活性的實驗資料。結果顯示在圖5A中，其中它們已經被相對於來自相同實驗的DSM17938(DSM17938活性=1)的5'-核苷酸酶活性標準化。根據圖3的結果，也已進行相對於DSM17938的5'-核苷酸酶活性(DSM17938活性=1)的相同類型的標準化，並且這在圖5B中顯示，使得對於不同的細菌菌株易於比較相對於DSM17938的5'-核苷酸酶活性的倍數變化。
實施例7
選擇菌株
上述實施例6中的新菌株，即羅伊氏乳酸桿菌DSM 33198在細菌上清液中顯示出高的5'-核苷酸酶活性。對濃度為每毫升109個細菌的細菌培養物的上清液進行分析。
羅伊氏乳酸桿菌DSM 33198已被開發用於改善性質。羅伊氏乳酸桿菌DSM 33198已經在多步驟選擇過程中進行了修飾，包括重複的冷凍乾燥程序，使其在產生過程中比其天然分離物更耐受並提供更高的存活率。
選擇羅伊氏乳酸桿菌DSM 33198。
【生物材料寄存】
國內生物材料
1.食品工業發展研究所2019/11/20；BCRC 910955
2.食品工業發展研究所2019/11/20；BCRC 910956
3.食品工業發展研究所2019/11/20；BCRC 910957
4.食品工業發展研究所2019/11/20；BCRC 910958
5.食品工業發展研究所2019/11/20；BCRC 910959
國外生物材料
1.德國；DSMZ；2018/07/04；DSM 32846
2.德國；DSMZ；2018/07/04；DSM 32847
3.德國；DSMZ；2018/07/04；DSM 32848
4.德國；DSMZ；2018/07/04；DSM 32849
5.德國；DSMZ；2018/07/09；DSM 33198
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Claims (12)

  1. 一種羅伊氏乳酸桿菌菌株，其能夠產生或誘導產生褪黑素，其中該菌株係用於在受試者中產生褪黑素，其中該菌株是用於治療與褪黑素缺乏或減少有關的疾病；其中所述該菌株具有5'-核苷酸酶活性、和/或能夠產生或誘導產生腺苷、和/或能夠產生或誘導產生褪黑素，其水準相比於羅伊氏乳酸桿菌DSM 17938為增加，其中該菌株是羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846(BCRC 910955)、DSM 32847(BCRC 910956)、DSM 32849(BCRC 910958)、或DSM 33198(BCRC 910959)。
  2. 如請求項1之菌株，其中該菌株係用於治療嬰兒腹絞痛。
  3. 如請求項1或2之菌株，其中該菌株是羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846。
  4. 如請求項1或2之菌株，其中相較於DSM 17938的水準，該菌株引起5'-核苷酸酶活性和/或腺苷的水準和/或褪黑激素的水準介於1.5倍與5倍之間、介於2倍與5倍之間、介於3倍與5倍之間、或介於4倍與5倍之間的增加。
  5. 如請求項1或2之菌株，其中該菌株具有大於8個單位/L的5'-核苷酸酶活性、和/或能夠以大於8μmol L-1 min-1的水準產生或誘導產生腺苷、和/或能夠以大於20pg/ml的水準產生或誘導產生褪黑素。
  6. 如請求項1或2之菌株，其中該受試者是達至12個月、或6個月、或5個月、或4個月或3個月的嬰兒；和/或其中該受試者用母乳餵養或用配方奶餵養或其組合。
  7. 如請求項1或2之菌株，其中該菌株進一步與AMP組合來給予。
  8. 一種細菌菌株，其中該菌株是羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846(BCRC 910955)、DSM 32847(BCRC 910956)、DSM 32849(BCRC 910958)或DSM 33198(BCRC 910959)。
  9. 如請求項8之菌株，其中該菌株是羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846。
  10. 一種如請求項8或如請求項9之菌株用於製造供治療嬰兒腹絞痛的藥物之用途。
  11. 一種適用於增加受試者中褪黑素或腺苷產生之組合產品，其包含：(i)能夠誘導褪黑素的產生或產生腺苷的羅伊氏乳酸桿菌菌株，其中該菌株是羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846(BCRC 910955)、DSM 32847(BCRC 910956)、DSM 32849(BCRC 910958)、或DSM 33198(BCRC 910959)；和(ii)增加或增強該羅伊氏乳酸桿菌菌株誘導褪黑素的產生和/或產生腺苷的底物組分，其中該底物組分是AMP。
  12. 如請求項11之組合產品，其中該菌株是羅伊氏乳酸桿菌DSM 32846。
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