TWI842139B

TWI842139B - 用於改善皮膚狀態的組合物以及新型油鞘氨醇單胞菌菌株及其溶解產物、培養液、提取物

Info

Publication number: TWI842139B
Application number: TW111139530A
Authority: TW
Inventors: 崔源祐; 朴敏知; 金永在; 金元德
Original assignee: 南韓商科優迪絲生物技術有限公司
Priority date: 2021-10-18
Filing date: 2022-10-18
Publication date: 2024-05-11
Also published as: CN120617136A; TW202317749A; KR102361015B1

Abstract

本發明關於一種用於改善皮膚狀態的油鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas olei）的用途，其中，包含所述油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分的組合物藉由加快受損表皮的修復、增加皮膚屏障相關因子的表達、降低炎症因子的表達，從而有效地用於改善皮膚狀態。

Description

用於改善皮膚狀態的組合物以及新型油鞘氨醇單胞菌菌株及其溶解產物、培養液、提取物

本發明關於一種油鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas olei）用於改善皮膚狀態的用途。更具體地，本發明關於一種包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物（lysate）、培養液或提取物作為有效成分的組合物藉由加快受損表皮的修復、增加皮膚屏障相關因子的表達、並降低炎症因子的表達，從而改善皮膚狀態的用途。

由於人體皮膚表面有大量角質、汗液、皮脂等代謝廢物，故各種微生物棲息並形成皮膚微生物群落（skin microbiome)，即皮膚常居菌群。在皮膚常居菌群中，有益菌和有害菌共存，皮膚越健康，有益菌的分佈越多，而特應性皮膚或痤瘡性皮膚的情況下，有害菌的分佈越多。因此，眾所周知，維持皮膚中存在的常居菌的平衡有助於維持健康的皮膚狀態。然而，關於這些皮膚常居菌對皮膚的影響的研究仍然較少。

通常，常駐於皮膚上的皮膚常居菌會形成皮膚屏障，以防止其他更有害的微生物（病原體）的入侵，且有助於皮膚的免疫作用。由於皮膚有益菌不會引起疾病，也不刺激免疫系統，故如果可以使用皮膚有益菌製造藥物或化妝品等，則可以以不產生刺激皮膚等的副作用的狀態安心使用。

當皮膚出現傷口或發生感染時，皮膚組織會受損或發炎，如果其程度不嚴重，皮膚通常會自行治癒。在本發明中，為了開發有助於皮膚再生和修復以及炎症治癒過程的皮膚常居菌而進行研究的結果，鑒定出了可以藉由皮膚再生和炎症治癒來改善皮膚狀態的皮膚有益菌，從而完成了本發明。

[發明要解決的問題]

基於此，本發明提供一種用於改善皮膚狀態的化妝品材料組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分。

本發明提供一種用於改善皮膚狀態的醫藥部外品組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分。

本發明提供一種用於改善皮膚狀態的皮膚外用劑組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分。

本發明提供一種用於改善皮膚狀態的保健功能食品組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分。

本發明提供一種用於預防或治療炎症性皮膚病或治療或改善皮膚傷口的藥物組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物以及藥學上可接受的載體。

本發明提供一種以寄存編號KACC 81169BP寄存的油鞘氨醇單胞菌菌株。

本發明提供一種油鞘氨醇單胞菌菌株的溶解產物、培養液、提取物或它們的混合物。 [用於解決問題的手段]

在一實施方式中，本發明提供一種用於改善皮膚狀態的化妝品材料組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分。

在本發明中，油鞘氨醇單胞菌可以是活菌（活著的菌）或死菌（死亡的菌）。更詳細地，死菌可以是藉由熱處理的死菌。

在一實施例中，油鞘氨醇單胞菌可以是以寄存編號KACC 81169BP寄存的油鞘氨醇單胞菌菌株。

本文所用的術語“溶解產物”是指如裂解的油鞘氨醇單胞菌的微生物的細胞的水性培養基中的溶液或懸浮液。細胞溶解產物包括如DNA、RNA、蛋白質、肽、碳水化合物、脂質等的大分子和/或如氨基酸、糖、脂肪酸等的小分子或其級分。另外，溶解產物還包括細胞碎片，其可以是光滑的或顆粒狀的結構。

作為實現微生物的細胞裂解的方法，可以使用各種公知的方法，可以使用能夠實現微生物的細胞裂解的任意方法。例如，細胞的打開/破壞可藉由酶、化學性或物理性方式進行。酶和酶混合物的非限制性示例為如蛋白酶K的蛋白酶、脂肪酶或糖苷酶；化學物質的非限制性示例為離子載體、如十二烷基硫酸鈉的洗滌劑、酸或鹼；物理手段的非限制性示例為如法式擠壓的高壓、滲透壓、如熱或冷的溫度。另外，也可以適當組合使用除蛋白水解酶之外的酶、酸、鹼等的方法。

本文所用的術語“培養液”可以與“培養上清液”、“條件培養液”或“條件培養基”互換使用，並且可以意指包括在培養基中培養油鞘氨醇單胞菌一段時間而獲得的微生物、其代謝物和殘餘營養物質的整體培養基，其中，培養油鞘氨醇單胞菌的培養基為能夠提供營養物質而使得油鞘氨醇單胞菌可以在體外生長和存活的培養基。此外，該培養液也可以指從培養微生物而獲得的菌體培養液中去除菌體的培養液。另一方面，從該培養基中去除菌體的液體也稱為“上層液”，其可以藉由如下方式獲得：僅取除將培養液靜置一段時間而下沉至下層的部分之外的上層液體；或藉由過濾去除菌體；或藉由離心培養液來去除下層沉澱後僅取上層液體。該“菌體”意指本發明的微生物本體，包括藉由從皮膚試樣等中分離而篩選出的微生物本體、或藉由培養該微生物後從培養液中分離出的微生物。該菌體可以藉由如下方式獲得：即離心後取下沉至下層的部分；或由於其會因重力而下沉至培養液的下層，故可以藉由靜置一段時間後，再去除上層液體而獲得。

在一實施方式中，本發明的油鞘氨醇單胞菌的培養物可以使用本領域技術人員根據目的而從用於培養微生物的培養基中輕易進行選擇的培養基，具體地，可以使用用於培養鞘氨醇單胞菌的培養基，例如強化梭菌培養基（Reinforced Clostridium Medium；RCM）、胰蛋白酶大豆肉湯（Tryptic Soy Broth；TSB）或腦心浸液（Brain Heart Infusion；BHI）培養基，但不限於此。根據一實施例，本發明的油鞘氨醇單胞菌培養物藉由在微生物培養基中接種油鞘氨醇單胞菌，並根據本領域公知的微生物培養方法（例如，靜置培養等）製備。

上述培養液可以包括藉由培養微生物而獲得的培養液、其濃縮物或凍乾物、或從培養液中去除微生物而獲得的培養上清液、其濃縮物或凍乾物。

上述培養液可以藉由將油鞘氨醇單胞菌在合適的培養基（例如，R2A培養基或TSB培養基）中，以10℃至40℃中的任何溫度培養一定時間（例如，4至50小時）而獲得。

在一實施例中，微生物的培養上清液可以藉由將微生物培養液離心或過濾以去除微生物的步驟而獲得。

在另一實施例中，濃縮物可以藉由對微生物培養液、或將該培養液藉由離心或使用篩檢程式過濾後獲得的上清液進行濃縮的步驟而獲得。

用於培養該油鞘氨醇單胞菌的培養用培養基及培養條件可以藉由本領域技術人員進行適當選擇或變更。

本文所用的術語“提取物”意指從溶解產物、培養液或其濃縮物中提取的物質，且其可以是提取液、提取液的稀釋液或濃縮物、藉由乾燥提取液而獲得的乾燥物、或這些的粗提物或純化物、對其進行分級的級分。

油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物具有皮膚狀態改善效果，例如，選自由改善皮膚屏障、皮膚保濕、改善皮膚免疫力、增強皮膚抵抗力、抑制皮膚炎症、鎮靜皮膚和皮膚再生所組成的組中的一種以上的皮膚狀態改善效果。

本文所用的術語“改善皮膚屏障”是指包括強化皮膚屏障或保護功能的含義，其中，皮膚屏障（skin barrier）是表皮的最外層，即角質層（stratum corneum），主要由無核扁平角質細胞（corneocyte）組成。由藉由正常表皮細胞的分裂和分化過程維持的皮膚屏障的角質細胞所合成的神經醯胺、膽固醇和脂肪酸等細胞間脂質形成的多層脂質膜（multi lamella lipid layer）起著保護屏障的作用，以防止皮膚水分蒸發。該改善皮膚屏障意指緩解由皮膚屏障功能減弱引起的皮膚病（如牛皮癬、接觸性皮炎、濕疹性皮炎、光敏性皮炎、脂漏性皮炎、皰疹樣皮炎、扁平式苔蘚、硬化性苔蘚、壞疽性膿皮病、天皰瘡、大皰性表皮鬆弛症、全身性硬化症或麻風病），或提高受損皮膚屏障功能的所有作用。

本文所用的術語“皮膚保濕”意指保持皮膚水分或防止水分流失的所有作用。

本文所用的術語“皮膚再生”意指皮膚重新再生的所有情況，不僅包括由於老化引起的皮膚的再生，還包括因劃傷等受損的表皮被治癒的情況等。

上述皮膚炎症選自由皮炎、過敏性皮炎、刺激性皮炎、脂漏性皮炎、特應性皮炎、敏感性皮膚病、瘙癢症、濕疹性皮膚病、乾性濕疹、紅斑、蕁麻疹、牛皮癬、藥疹和痤瘡所組成的組中的任意一種。

油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物促進受損皮膚表面上的角質形成細胞（keratinocyte）的遷移，以加快受損表皮的修復。

油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物，可以增加皮膚屏障相關因子（例如兜甲蛋白（Loricrin），其為一種角質形成所需的蛋白質）的表達。

此外，油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物可以降低炎症因子，例如特應症和瘙癢相關因子（如胸腺基質淋巴細胞生成素（Thymicstromal lymphopoietin；TSLP））及促炎細胞因子（如IL-6、IL-8或IL-1α）的表達。

在一實施例中，油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物可促進角質形成細胞的遷移，或者增加兜甲蛋白的表達，或者降低選自由TSLP、IL-6、IL-8和IL-1α所組成的組中的一種以上的表達。

相對於總重量，可包含0.00001wt%至80wt%的，例如可包含0.00001wt%至60wt%、0.00001wt%至40wt%、0.00001wt%至30wt%、0.00001wt%至20wt%、0.00001wt%至10wt%、0.00001wt%至5wt%、0.05wt%至60wt%、0.05wt%至40wt%、0.05wt%至30wt%、0.05wt%至20wt%、0.05wt%至10wt%、0.05wt%至5wt%、0.1wt%至60wt%、0.1wt%至40wt%、0.1wt%至30wt%、0.1wt%至20wt%、0.1wt%至10wt%或0.1wt%至5wt%的微生物、或其溶解產物、培養液或提取物。

本文所用的術語“包含……作為有效成分”意指以可以表現出該效果的程度添加微生物或其溶解產物、培養液或提取物，並且還包括為了藥物遞送和穩定化等，添加各種成分作為副成分而配製（formulation）出的各種形式。

上述化妝品材料組合物可以製備成包括化妝水（潤膚乳液）、潤膚劑（skin）、潤膚柔膚劑（skin softner）、潤膚爽膚水（skin toner）、收斂劑（astringent）、乳液（lotion）、牛奶乳液（milk lotion）、保濕乳液（moisture lotion）、營養乳液、按摩霜、營養霜、保濕霜、護手霜、手部清潔劑、粉底、精華、營養精華、面膜（pack）、香皂、潔面泡沫、潔面乳液、潔面霜、身體乳、沐浴露、懸浮液、啫喱（jelly）、粉末、糊劑、貼片式面膜（mask pack）及片劑的劑型。這種劑型的組合物可以根據本領域常規方法製備。本領域技術人員可以在不損害本發明的目的和效果的範圍內，容易地選擇如上所述的保濕劑等添加成分的混合量。

上述化妝品材料組合物中除本發明所公開的有效成分之外，還可以進一步包括功能性添加劑及包含於普通化妝品材料組合物中的成分，還可以包括常用的純淨水、增稠劑、防腐劑、穩定劑、增溶劑、表面活性劑、載體、香料或它們的組合。上述功能性添加劑可以包括選自水溶性維生素、油溶性維生素、高分子肽、高分子多糖、鞘脂和海藻提取物所組成的組中的成分。上述載體的示例包括醇、油、表面活性劑、脂肪酸、矽油、潤濕劑、保濕劑、黏度調節劑、乳劑、穩定劑、紫外線散射劑、紫外線吸收劑、顯色劑、香料等。用於上述醇、油、表面活性劑、脂肪酸、矽油、潤濕劑、保濕劑、黏度調節劑、乳液、穩定劑、紫外線散射劑、紫外線吸收劑、著色劑、香料的化合物/組合物等是本領域公知的，故本領域的技術人員可以選擇並使用適當的相應物質/組合物。此外，在化妝品材料組合物中，根據需要還添加紫外線阻斷劑、抗氧化劑（丁基羥基苯甲醚、沒食子酸丙酯、異抗壞血酸、生育酚乙酸酯、丁基化羥基甲苯等）、防腐劑（對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丁酯等、對羥基苯甲酸丙酯、苯氧乙醇、咪唑烷基脲、氯苯甘醚等）、著色劑、pH調節劑（三乙醇胺、檸檬酸（citric acid）、枸櫞酸、檸檬酸鈉、蘋果酸、蘋果酸鈉、富馬酸、富馬酸鈉、琥珀酸、琥珀酸鈉、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉等）、保濕劑（甘油、山梨糖醇、丙二醇、丁二醇、己二醇、雙甘油、甜菜鹼、甘油聚醚-26、甲基葡糖醇聚醚-20等）、潤滑劑等。

此外，在各種劑型的化妝品材料組合物中，可以根據化妝品材料的劑型或使用目的來選擇適當的成分混合。由於混合成分和方法可以遵循常規技術，故本發明中將省略其詳細描述。

另一實施方式，本發明提供一種用於改善皮膚狀態的醫藥部外品組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分。

其中，油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物、及其皮膚狀態改善效果與上述說明相同。

本文所用的術語“醫藥部外品”意指用於診斷、治療、改善、緩解、治療或預防人類或動物疾病的物品中的作用比藥物溫和的物品。例如，根據藥事法，醫藥部外品意指除了以醫藥品的用途使用的物品之外的物品，其包括用於治療或預防人類和動物疾病的纖維/橡膠製品、對人體的作用輕微或不直接作用於人體且並非儀器或機器的物品及其類似物、用於預防傳染病的消毒劑和殺蟲劑等。

本發明的醫藥部外品組合物的種類或劑型沒有特別限定，但它可以是繃帶、紗布、脫脂棉、創可貼、消毒清潔劑、沐浴泡沫、漱口水、濕紙巾、洗衣皂、洗手液、加濕器填充物、面罩或篩檢程式填充物等。

為改善皮膚狀態的用途而將本發明的組合物包含於醫藥部外品中時，可以直接將組合物本身包含於醫藥部外品來使用，也可以與其他醫藥部外品成分一同使用，其可根據常規方法適當地使用。有效成分的混合量可以根據使用目的適當地確定，相對於組合物總重量，本發明的醫藥部外品組合物可以包含0.01wt%至20wt%的微生物及其溶解產物、培養液或它們的混合物。

又一實施方式，本發明提供一種用於改善皮膚狀態的皮膚外用劑組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分。

其中，油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物及其皮膚狀態改善效果與上述說明相同。

皮膚外用劑可以是霜劑、凝膠劑、軟膏劑、皮膚乳化劑、皮膚混懸劑、透皮貼劑、乳液或它們的組合。該皮膚外用劑可根據需要適當與普通化妝品或醫藥品等皮膚外用劑中使用的成分（例如水性成分、油性成分、粉末成分、醇類、保濕劑、增稠劑、紫外線吸收劑、美白劑、防腐劑、抗氧化劑、表面活性劑、香料、著色劑、各種皮膚營養劑或它們的組合）進行混合。該皮膚外用劑也可以適當地與金屬封鎖劑（依地酸二鈉、依地酸三鈉、檸檬酸鈉、聚磷酸鈉、偏磷酸鈉、葡萄糖酸等）、藥劑（咖啡因、單寧、維拉帕米、甘草提取物、光甘草定、飛廉草果實的熱水提取物、各種生藥，醋酸生育酚、甘草酸、傳明酸及其衍生物或其鹽等）、糖類（維生素C、抗壞血酸磷酸酯鎂、抗壞血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸、葡萄糖、果糖、海藻糖等）等進行混合。

相對於組合物總重量，根據本發明的皮膚外用劑組合物可以包含0.00001wt%至80wt%的微生物、其溶解產物、培養液或它們的混合物。

上述皮膚包括面部、手部、手臂、腿部、足部、胸部、腹部、背部、臀部和頭皮的身體的所有皮膚部位。

又一實施方式，本發明提供一種用於改善皮膚狀態的保健功能食品組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分。

上述保健功能食品組合物可以單獨使用油鞘氨醇單胞菌或其培養液，也可以與其他食品或食品成分一同使用、還可以根據常規方法適當地使用。有效成分的混合量可以根據使用目的（預防、保健或治療性處理）適當地確定。通常，在製造食品或飲料時，相對於原料，可添加15 重量份以下的本申請說明書的組合物。

對上述保健功能食品的種類沒有特別限制。可以添加上述物質的食品的示例包括選自散劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、丸劑、凝膠劑、果凍劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑、茶包劑、浸出茶和保健飲料組成的組中選擇的劑型等，且包括常規意義上的所有保健食品。如常規飲料，保健功能食品種類中的飲料組合物可以包含各種調味劑或天然碳水化合物等作為附加成分。

上述天然碳水化合物可以為單糖（如葡萄糖和果糖），二糖（如麥芽糖和蔗糖），多糖（如糊精和環糊精）以及糖醇（如木糖醇、山梨糖醇和赤蘚糖醇等）。作為甜味劑，可以使用天然甜味劑（如索馬甜、甜葉菊提取物）、合成甜味劑（如糖精、阿斯巴甜）等。該保健食品組合物還可以包含：營養劑、維生素、電解質、調味劑、著色劑、果膠酸及其鹽；海藻酸及其鹽；有機酸；保護膠體增稠劑；pH調節劑；穩定劑；防腐劑；甘油；醇；用於碳酸飲料的碳酸化劑或其組合。該保健功能食品組合物還可以包含用於製造天然果汁、果汁飲料、蔬菜飲料的果肉或其組合。

又一實施方式，本發明提供一種用於預防或治療炎症性皮膚病或治療或改善皮膚傷口的藥物組合物，其包含油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養液或提取物以及藥學上可接受的載體作為有效成分。

其中，對於油鞘氨醇單胞菌或其溶解產物、培養基和提取物的描述與上述說明相同。

上述炎症性皮膚病可以為選自皮炎、過敏性皮炎、刺激性皮炎、脂漏性皮炎、特應性皮炎、敏感性皮膚病、瘙癢症、濕疹性皮膚病、乾性濕疹、紅斑、蕁麻疹、牛皮癬、藥疹和痤瘡所組成的組中的任意一種。

皮膚傷口也被稱為“創傷”，意指活體的損傷。上述損傷可以為由外部因素（如物理損傷、輻射、因化學物質的刺激、微生物增殖等）或內部因素（如壓力）引起的，但不限於此。該傷口可以包括切創、刺創、砍創、挫傷、裂傷、射傷和咬傷等所有種類的傷口。“傷口治療”可以指修復傷口的一系列生物反應。“改善傷口”可以指減輕面部或身體上的傷口或減少其程度的所有作用。

本文所用的術語“藥物組合物”可以指當施用於受試者時賦予某些有益效果的分子或化合物。有益效果可以包括：使診斷決策成為可能；疾病、症狀、障礙或病態的改善；減少或預防疾病、症狀、障礙或病症的發作；以及通常對疾病、症狀、障礙或病態的應對。

本文所用的術語“預防（prevention）”是指部分或完全延遲或防止病症、障礙或其附屬症狀的發作或復發；防止病症或障礙的獲得或重新獲得；或減少獲得病症或障礙的風險。例如，上述預防是指藉由施用根據本發明的組合物，以抑制或延遲皮膚損傷或症狀的發生的所有行為。

本文所用的術語“治療”包括抑制、減輕或消除疾病的發展。

本文所用的術語“改善”可以意指至少減小與狀態的緩解或治療相關的參數（例如，症狀的程度）的所有行為。

上述藥物組合物在臨床給藥時可以以非口服方式給藥，並且可以以常規醫藥品製劑的形式使用。非口服給藥可以意指藉由除口服給藥之外的途徑給藥，例如直腸、靜脈、腹膜、肌肉、動脈、經皮、鼻腔（Nasal）、吸入、眼部和皮下給藥。當本發明的藥物組合物用於醫藥品時，可以進一步包含一種以上的具有相同或相似功能的有效成分。

上述藥物組合物可以進一步包含一種以上藥學上可接受的載體來製備。藥學上可接受的載體可以與鹽水、無菌水、林格氏液、緩衝鹽水、葡萄糖溶液（dextrose solution）、麥芽糖糊精溶液、甘油、乙醇及這些成分中的一種以上混合使用，並且可以根據需要添加其他常規添加劑（如抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑等）。此外，還可以額外添加稀釋劑、分散劑、表面活性劑、黏合劑及潤滑劑來製劑化成注射用劑型（如水溶液、懸浮液、乳濁液等）、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑。更進一步地，可以藉由本領域適當的方法，根據每種病症或成分較佳地進行製劑化。

當對上述藥物組合物進行製劑化時，可利用通常使用的填充劑、增量劑、黏合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑等稀釋劑或賦形劑來進行調製。用於非口服給藥的製劑包括無菌水溶液、非水溶劑、混懸劑、乳劑、凍乾製劑和栓劑。作為非水溶劑和懸浮液劑可使用丙二醇（Propylene glycol）、聚乙二醇（Plyethylene glycol）、植物油（如橄欖油）和可注射酯（如油酸乙酯）等。作為栓劑的基質，可以使用半合成脂肪酸酯（Witepsol）、聚乙二醇（Macrogol）、吐溫（Tween）61、可哥脂、月桂酸甘油酸酯（Laurin oil）、甘油明膠等。

為了提高上述藥物組合物的穩定性和吸收性，可以使用碳水化合物（如葡萄糖、蔗糖或右旋糖）、抗氧化劑（Antioxidants）（如抗壞血酸（Ascorbic acid）或谷胱甘肽（Glutathione））、螯合劑（Chelatingagents）和低分子蛋白質或其他穩定劑（Stabilizers）作為藥劑。

又一實施方式，本發明提供一種預防、改善或治療個體狀態的方法，其包括將該藥物組合物施用於個體的步驟。

上述個體的狀態可以是與皮膚有關的狀態或與炎症有關的狀態。

可以藉由本領域已知的方法進行給藥。可以藉由任何方式直接施用於個體，例如靜脈內、肌內、口服、經皮（transdermal）、黏膜、鼻內（intranasal）、氣管內（intratracheal）或皮下給藥。上述給藥可以是全身性地或局部性地進行給藥。

上述個體可以是哺乳動物，例如人、牛、馬、豬、狗、綿羊、山羊或貓。上述個體可以是需要改善皮膚狀態或治療炎症性皮膚病的個體。

上述給藥可以為向每名個體每天施用0.00001mg至1000mg的根據本發明的組合物，例如，可施用0.00001mg至500mg、0.00001mg至100mg、0.00001mg至50mg、0.00001mg至25mg、1mg至1000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg或10mg至25mg的根據本發明的組合物。然而，給藥量可以根據製劑化方法、給藥方式、患者年齡、體重、性別、病理狀態、食物、給藥時間、給藥途徑、排泄速率和反應敏感性等因素以各種方式處方，並且，本領域技術人員可以考慮這些因素來適當地調整給藥量。給藥次數可以是一天一次，或在臨床上可接受副作用的範圍內，給藥次數可以是兩次以上；就給藥部位而言，可以在1處或2處以上進行給藥；就給藥天數而言，可以以每天或間隔2～5天的方式，在1至30 天的範圍內進行給藥。如有必要，在適當時間後，可以重複相同的治療。對於除人之外的動物，可以以與人相同的每kg給藥量進行給藥，或者可以以換算的給藥量進行給藥，如基於以目標動物與人的器官（心臟等）的體積比（如平均值）等進行換算的量。

又一實施方式，本發明提供一種以寄存編號KACC 81169BP寄存的油鞘氨醇單胞菌菌株。

上述油鞘氨醇單胞菌菌株可以是包括SEQ ID NO: 3的16S rRNA的菌株。

上述菌株可以具有皮膚狀態改善效果，例如，具有選自由改善皮膚屏障、皮膚保濕、改善皮膚免疫力、增強皮膚抵抗力、抑制皮膚炎症、鎮靜皮膚和皮膚再生所組成的組中的一種以上的皮膚狀態改善效果。

上述菌株可以促進在受損皮膚表面的角質形成細胞的遷移，從而加快受損表皮的修復。上述菌株可以增加皮膚屏障相關因子（如兜甲蛋白）的表達。此外，上述菌株還可降低炎症因子的表達，例如，特應性和瘙癢相關因子（如TSLP）及促炎細胞因子（如IL-6、IL-8或IL-1α）的表達。

又一實施方式，本發明提供一種油鞘氨醇單胞菌菌株的溶解產物、培養液、提取物或它們的混合物。

對於上述油鞘氨醇單胞菌菌株、其溶解產物、培養液以及提取物的描述與上述說明相同。發明的效果

根據本發明的一實施方式的包含油鞘氨醇單胞菌、其溶解產物、培養液或提取物作為有效成分的組合物，其具有加快受損表皮的修復、增加皮膚屏障相關因子的表達、降低炎症因子的表達的效果，故可以有效地用於改善皮膚狀態。

在下文中，將藉由實施例更詳細地描述本發明。然而，這些實施例僅用於示例性地說明本發明，本發明的範圍不限於這些實施例。

實施例1. 菌株的分離和鑒定

從健康的韓國人的皮膚中採集樣本，將其放入磷酸鹽緩衝液（Phosphate Buffered Saline，PBS）溶液中混合，然後藉由連續稀釋法（Serial dilution）接種到R2A（Reasoner’s 2A agar）培養基中。篩選在30℃的培養箱中培養139小時而形成於平板上的細菌菌落，並在相同的培養基和條件下，使用劃線法（Streaking）進行純化分離。為了確認已完成培養的菌株的分子系統學特徵，進行了16S rRNA基因鹼基序列分析。PCR（Polymerase chain reaction）擴增以如下方式實施：以95℃條件30秒、 55℃條件30秒、72℃條件1分45秒的方式重複32次，最後以72℃條件處理5分鐘。此時，使用了以實現細菌共同基因的特異性反應而提出的引物（SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2）。藉由對PCR擴增產物進行純化，並確認了鹼基序列（Macrogen，韓國），並且使用美國國立生物技術資訊中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的BLAST程式分析了該序列。與先前登記的其他菌株相比，將具有99%以上鹼基序列同源性的物種確定為近緣種。在本實施例中分離的菌株具有SEQ ID NO: 3（互補DNA（complementary DNA））的16S rRNA序列，其被鑒定為油鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas olei）。本發明人將該菌株命名為油鞘氨醇單胞菌CBN003（Sphingomonas olei CBN003），於2021年9月10日寄存於農業遺傳資源保藏中心，獲得的寄存編號為KACC 81169BP。

實施例2：菌株的培養

對於藉由實施例1分離的菌株，利用胰蛋白酶大豆肉湯（Tryptic Soy Broth；TSB）培養基在34℃的培養箱中進行培養，在生長曲線上的分裂期（對數期（Log phase））的最後時間點收集菌株培養液和菌體。以6000rpm離心30分鐘，然後使用0.2μm篩檢程式進行過濾和滅菌，從而製備了培養液，當用於評價和活性分析時，在製備後不超過1天的時間內進行了評價和活性分析。

實驗例1：細胞毒性評價

確認了藉由實施例1中分離的菌株是否對細胞具有毒性。

具體而言，首先，利用包含10%胎牛血清（Fetal bovine serum；FBS）、100μg/mL鏈黴素和100U/mL青黴素的DMEM培養基（Dubelcco’s modified eagle medium），在37℃的5% CO ₂培養箱中培養人角質形成細胞系（Human epidermal keratinocyte cellline；HaCaT）。

藉由MTT分析法對於菌株的培養液進行了細胞毒性評價。將培養的細胞系以8×10 ³/孔分裝在96孔板中，然後在相同條件下培養24小時後，分別以0（僅用TSB培養基處理）、1、2、5、10%（v/v）的濃度處理上述菌株的培養液，並且在相同條件下繼續培養24小時。此時，以0%處理組作為陰性對照組，以每孔的總體積為100μL的方式進行。隨後，在每個細胞培養孔中加入20μL 5mg/mL MTT，在相同條件下繼續培養4小時後，加入100μL DMSO，測定590 nm處的吸光度，並將其結果示於圖1中。

圖1是顯示藉由MTT分析來評價利用實施例1分離的菌株的培養液處理的人角質形成細胞生存能力的結果的圖。

如圖1所示，當以1、2、5和10%（v/v）處理菌株培養液時，與未用菌株培養液處理的陰性對照組相比，在人角質形成細胞的存活能力上沒有顯著差異，可見該菌株的培養液無細胞毒性。這樣的結果意味著將該菌株的培養液塗敷於皮膚上是安全的。

實驗例2：皮膚再生功能活性分析

分析了在實施例1中分離的菌株對皮膚再生功能的影響。

具體而言，首先，利用包含10%胎牛血清（Fetal bovine serum；FBS）、100μg/mL鏈黴素和100U/mL青黴素的DMEM培養基（Dubelcco’s modified eagle medium），在37℃的5% CO ₂培養箱中培養人角質形成細胞系（Human epidermal keratinocyte cellline；HaCaT）。將培養的細胞系以5×10 ⁵/孔分裝在6孔板中，之後，為了使細胞貼附而在相同條件下培養24小時。在單層細胞上劃出一個直線劃痕（scratch）後，利用以0（僅處理TSB培養基）、1、2、5、10%（v/v）包含菌株的培養液的無血清DMEM培養基（Dubelcco’s modified eagle medium），在37℃的5% CO ₂培養箱中培養24小時。作為陽性對照組，以10ng/mL處理表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF），並以相同方式培養。在顯微鏡下對0小時的劃痕間隔和24小時的間隔進行觀察比較，並將其結果示於圖2中。

圖2是顯示評價利用藉由實施例1分離的菌株的培養液處理的人角質形成細胞的遷移的結果（N-CNT，陰性對照組（0% FBS）；P-CNT，陽性對照組（EGF 10ng/mL）；培養基CNT（Media CNT），TSB培養基）。

如圖2所示，當利用藉由實施例1分離的菌株的培養液進行處理時，整體上可確認，與0小時的劃痕間隔相比，培養24小時的角質形成細胞的遷移活躍，使得劃痕間隔顯著縮短。這樣的結果表明，該菌株可以有效地用於皮膚再生和傷口治療。

實驗例3：增強皮膚屏障及保濕活性分析

分析了藉由實施例1分離的菌株對皮膚屏障的強化和皮膚保濕活性的影響。

具體而言，分析了皮膚屏障功能標誌物兜甲蛋白的表達。首先，對人表皮角質形成細胞系（Human epidermal keratinocyte cellline，HaCaT）進行了分化。將細胞系以5×10 ⁵/孔分裝在6孔板中，並利用包含0.09mM低濃度鈣、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）和牛腦垂體提取物（Bevine pituirary extract，BPE）的無血清培養基，在37℃的5% CO ₂培養箱中培養2天，以誘導分化。之後，利用包含2.8mM高濃度鈣、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）和牛腦垂體提取物（Bevine pituirary extract，BPE）的無血清培養基，在37℃的5% CO ₂培養箱中培養7天，並且每2~3天更換一次培養基。向藉由上述過程分化的細胞系添加Poly I:C（10μg/mL）和IL-4（50ng/mL），以誘導炎症反應。在相同條件的培養箱中培養24小時後，以0（僅TSB培養基）、10％（v/v）處理菌株培養液並繼續培養24小時。作為陰性對照組使用了未處理組（僅處理Poly I:C+IL-4），作為陽性對照組使用了1μM地塞米松（dexamethasone）處理組。隨後，使用TRIZOL（Invitrogen，美國）從用每個樣品處理的細胞中提取RNA，並使用奈米分光光度計定量RNA，然後分別使用1μg RNA在擴增儀中合成cDNA。以合成的cDNA作為範本，將SYBRV綠（SYBR Green）（Thermo Fisher Scientific，美國）與引物一起加入靶基因進行即時（Real-time）PCR。此時，靶基因使用了作為皮膚屏障功能標誌物兜甲蛋白基因，最後藉由GAPDH（甘油醛3-磷酸脫氫酶）基因的校正來分析了基因的表達量，並將其結果示於圖3中。

圖3是顯示藉由即時PCR來測定利用本發明一實施例的菌株的培養液處理的人角質形成細胞中兜甲蛋白（LOR）mRNA表達變化的結果的圖（相對於空白組（None）（Poly I:C+IL-4未處理組）時為#；相對於Poly I:C + IL-4處理組時為*；#，* p＜0.05；##，** p＜0.001；###，*** p＜0.0001；紅色，顯著負值（減少）；藍色，顯著正值（增加））。

如圖3所示，當利用藉由實施例1分離的菌株進行10％培養液處理時，與陰性對照組相比，兜甲蛋白的表達顯著增加。這樣的結果表明，該菌株可以有效地用於皮膚屏障的強化和皮膚保濕。

實驗例4：抗炎症活性分析

為了分析藉由實施例1分離的菌株對抗炎活性的影響，分析了TSLP的表達和促炎細胞因子IL-6、IL-8和IL-1α的表達。

具體而言，首先，對人表皮角質形成細胞系（Human epidermal keratinocyte cellline；HaCaT）進行了分化。將細胞系以5×10 ⁵/孔分裝在6孔板中，並利用包含0.09mM低濃度鈣、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）和牛腦垂體提取物（Bevine pituirary extract，BPE）的無血清培養基，在37℃的5% CO ₂培養箱中培養2天，以誘導分化。之後，利用包含2.8mM高濃度鈣、表皮生長因子（Epidermal growth factor，EGF）和牛腦垂體提取物（Bevine pituirary extract；BPE）的無血清培養基，在37℃的5% CO ₂培養箱中培養7天，並且每2~3天更換一次培養基。向藉由上述過程分化的細胞系添加Poly I:C（10μg/mL）和IL-4（50ng/mL），以誘導炎症反應。在相同條件的培養箱中培養24小時後，以0（僅TSB培養基）、10％（v/v）處理菌株培養液並繼續培養24小時。作為陰性對照組使用了未處理組（僅處理Poly I:C+IL-4），作為陽性對照組使用了1μM地塞米松（dexamethasone）處理組。隨後，使用TRIZOL（Invitrogen，美國）從用每個樣品處理的細胞中提取RNA，並使用奈米分光光度計定量RNA，然後分別使用1μg RNA在擴增儀中合成cDNA。以合成的cDNA為範本，將SYBR Green（Thermo Fisher Scientific，美國）與引物一起加入靶基因進行即時（Real-time）PCR。此時，靶基因使用了TSLP基因和促炎細胞因子IL-6、IL-8和IL-1α基因，最後藉由GAPDH（甘油醛3-磷酸脫氫酶）基因的校正來分析了基因的表達量，並將其結果示於圖4和圖5中。

圖4是顯示藉由即時PCR來測定利用藉由實施例1分離的菌株的培養基處理的人角質形成細胞中TSLP mRNA表達變化的結果的圖（相對於空白組（None）（Poly I:C+IL-4未處理組）時為#；相對於Poly I:C + IL-4處理組（陰性對照）時為*；#，* p＜0.05；##，** p ＜0.001；###，*** p＜0.0001；紅色，顯著負值（減少）；藍色，顯著正值（增加））。

圖5是顯示藉由即時PCR來測定利用藉由實施例1分離的菌株的培養基處理的人角質形成細胞中IL-6、IL-8和IL-1α mRNA表達變化的結果的圖。圖5的a是顯示IL-6 mRNA表達結果的圖，圖5的b是顯示IL-8 mRNA表達結果的圖，圖5的c是顯示IL-1α mRNA表達結果的圖（相對於空白組（None）（Poly I:C+IL-4未處理組）時為#；相對於Poly I:C + IL-4處理組時為*；#，* p＜0.05；##，** p＜0.001；###，*** p＜0.0001；紅色，顯著負值（減少）；藍色，顯著正值（增加））。

如圖4所示，當利用藉由實施例1分離的菌株進行10％培養液處理時，與陰性對照相比，TSLP的表達量顯著降低。

此外，如圖5所示，當利用藉由實施例1分離的菌株進行10%培養液處理時，與陰性對照組相比，IL-6、IL-8和IL-1α的表達量顯著降低，尤其，IL-6和IL-1α顯示出了與陽性對照組相似水準的顯著降低的表達。

上述結果表明，上述菌株可以有效地用於預防、改善和治療炎症性皮膚病。

無

圖1是顯示藉由MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑，3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）分析來評價利用本發明一實施例的菌株的培養液處理的人角質形成細胞生存能力的結果的圖。

圖2是評價利用本發明一實施例的菌株的培養液處理的人角質形成細胞的遷移的結果（N-CNT（陰性對照組）-陰性對照組（0% FBS）；P-CNT（陽性對照組）-陽性對照組（EGF 10ng/mL）；培養基CNT（Media CNT）（對照組），TSB培養基）。

圖3是顯示藉由即時PCR來測定利用本發明一實施例的菌株的培養液處理的人角質形成細胞中兜甲蛋白mRNA表達變化的結果的圖（相對於空白組（None）（Poly I:C+IL-4未處理組）時為#；相對於Poly I:C + IL-4處理組時為*；#，* p＜0.05；##，** p＜0.001；###，*** p＜0.0001；紅色，顯著負值（減少）；藍色，顯著正值（增加））。

圖4是顯示藉由即時PCR來測定利用本發明一實施例的菌株的培養基處理的人角質形成細胞中TSLP mRNA表達變化的結果的圖（相對於空白組（None）（Poly I:C+IL-4未處理組）時為#；相對於Poly I:C + IL-4處理組（陰性對照）時為*；#，* p＜0.05；##，** p ＜0.001；###，*** p＜0.0001；紅色，顯著負值（減少）；藍色，顯著正值（增加））。

圖5是顯示藉由即時PCR來測定利用本發明一實施例的菌株的培養基處理的人角質形成細胞中IL-6、IL-8和IL-1α mRNA表達變化的結果的圖。圖5的a是顯示IL-6 mRNA表達結果的圖，圖5的b是顯示IL-8 mRNA表達結果的圖，圖5的c顯示了IL-1α mRNA表達結果的圖（相對於空白組（None）（Poly I:C+IL-4未處理組）時為#；相對於Poly I:C + IL-4處理組時為*；#，* p＜0.05；##，** p＜0.001；###，*** p＜0.0001；紅色，顯著負值（減少）；藍色，顯著正值（增加））。

[登錄號] 寄存機構：韓國農業遺傳資源保藏中心（KACC）寄存編號：KACC 81169BP 寄存日期：2021年9月10日

TWI842139B_111139530_SEQL.xml

Claims

一種作為有效成分的油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)、其溶解產物、培養液或提取物在製備用於改善皮膚狀態的化妝品材料組合物中的用途。
如請求項1所述之用途，其中，所述改善皮膚狀態為選自由改善皮膚屏障、皮膚保濕、改善皮膚免疫力、增強皮膚抵抗力、抑制皮膚炎症、鎮靜皮膚和皮膚再生所組成的組中的一種以上。
如請求項1所述之用途，其中，所述油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)、其溶解產物、培養液或提取物能促進角質形成細胞的遷移，或者增加兜甲蛋白的表達，或者降低選自TSLP、IL-6、IL-8和IL-1α所組成的組中的一種以上的表達。
如請求項1所述之用途，其中，所述油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)為以寄存編號KACC 81169BP寄存的油鞘氨醇單胞菌菌株。
一種作為有效成分的油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)、其溶解產物、培養液或提取物在製備用於改善皮膚狀態的醫藥部外品組合物中的用途。
一種作為有效成分的油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)、其溶解產物、培養液或提取物在製備用於改善皮膚狀態的皮膚外用劑組合物中的用途。
一種作為有效成分的油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)、其溶解產物、培養液或提取物在製備用於改善皮膚狀態的保健功能食品組合物中的用途。
一種油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)、其溶解產物、培養液或提取物，以及藥學上可接受的載體在製備用於預防或治療炎症性皮膚病或者用於治療或改善皮膚傷口的藥物組合物中的用途。
如請求項8所述之用途，其中，所述炎症性皮膚病為選自由皮炎、過敏性皮炎、刺激性皮炎、脂漏性皮炎、特應性皮炎、敏感性皮膚病、瘙癢症、濕疹性皮膚病、乾性濕疹、紅斑、蕁麻疹、牛皮癬、藥疹和痤瘡所組成的組中的任意一種。
一種以寄存編號KACC 81169BP寄存的油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)菌株。
一種如請求項10所述之油鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas olei)菌株的溶解產物、培養液或提取物。