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TWI735210B - Ａｄａｍ９抑制劑作為免疫調節劑之用途 - Google Patents

Ａｄａｍ９抑制劑作為免疫調節劑之用途 Download PDF

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TWI735210B
TWI735210B TW109113682A TW109113682A TWI735210B TW I735210 B TWI735210 B TW I735210B TW 109113682 A TW109113682 A TW 109113682A TW 109113682 A TW109113682 A TW 109113682A TW I735210 B TWI735210 B TW I735210B
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adam9
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tumor
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佘玉萍
楊顓丞
劉璟霈
黃裕鍇
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中國醫藥大學
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Abstract

本發明提供一種ADAM9抑制劑之用途，係用於製備免疫調節劑。藉此，所述免疫調節劑可用於增強癌症免疫療法的有效性。

Description

ADAM9抑制劑作為免疫調節劑之用途
本發明是有關於一種ADAM9抑制劑之用途，特別是ADAM9抑制劑作為免疫調節劑之用途。
癌症又名為惡性腫瘤，為細胞不正常增生，且這些增生的細胞可能侵犯身體的其他部分，為由控制細胞分裂增殖機制失常而引起的疾病。全世界罹患癌症的人口有不斷增加的趨勢，癌症係國人十大死因之一，且已連續二十七年為居十大死因之榜首。癌轉移的發生為癌症高死亡的主因，如肺癌發生腦轉移的預後極差。即使早期的肺癌病人可以開刀切除腫瘤，仍有25%將發展成遠端癌轉移。常見的抗癌藥物雖可用於抑制癌細胞生長，但對防止癌復發仍有限。針對促進轉移的分子作用可視為前瞻的作法。
含有去整合素和金屬蛋白酶結構域的蛋白質9(Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 9,ADAM9)在許多腫瘤中過度表達，例如胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌和肺癌，且ADAM9高表現量與癌症病人預後差有關，可當作預測標 記。因ADAM9表達可幫助腫瘤細胞適應不利的環境，使ADAM9被認為可促進腫瘤發展，並且被認為是比其他與癌症相關的金屬蛋白酶更好的治療靶點。ADAM9因具有切割和釋放許多參與癌症進展相關分子的能力而參與腫瘤發生(tumorigenesis)，由於其能夠切割和釋放參與癌症進展的許多分子而參與腫瘤發生，並且腫瘤周圍的基質細胞所分泌的ADAM9可藉由新血管形成(neovascularization)促進腫瘤發展。
先前研究的結果顯示，抑制ADAM9表達及其下游信號傳導可顯著延長肺腫瘤小鼠的存活時間。而從肺癌和乳腺癌的臨床樣本明顯可見，腫瘤標本中ADAM9表現水平低的患者存活時間長於ADAM9表現水平高的患者。此外，由於ADAM9缺陷鼠並無明顯表型，代表以ADAM9當標靶蛋白可能有良好的藥物耐受性。
本發明之一態樣是在提供一種ADAM9抑制劑之用途，其係應用於製備免疫調節劑。
依據前述之ADAM9抑制劑之用途，其中所述免疫調節劑可用於增強癌症免疫療法的有效性。較佳地，所述癌症免疫療法之施用對象可為免疫功能低下之患者。
依據前述之ADAM9抑制劑之用途，其中所述免疫調節劑可用於刺激免疫細胞浸潤到腫瘤中。較佳地，所述免疫細胞可為T細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中 性球、樹突狀細胞或骨髓來源的抑制細胞。
依據前述之ADAM9抑制劑之用途，其中所述免疫調節劑可用於改變腫瘤微環境的趨化因子種類。
依據前述之ADAM9抑制劑之用途，其中所述免疫調節劑可用於處理具有免疫治療抗性的腫瘤。較佳地，所述具有免疫治療抗性的腫瘤可對檢查點抑制劑、過繼細胞轉移、治療性抗體、治療疫苗、細胞因子、免疫細胞療法或其組合具有抗性。其中所述檢查點抑制劑可為抗CTLA-4抗體、抗PDL1抗體或抗PD-1抗體。
依據前述之ADAM9抑制劑之用途，其中所述免疫調節劑可與一檢查點抑制劑共同配製。較佳地，所述檢查點抑制劑可為抗CTLA-4抗體、抗PDL1抗體或抗PD-1抗體。
依據前述之ADAM9抑制劑之用途，其中所述ADAM9抑制劑可為式(I)之化合物，或其醫藥上可接受的鹽類或立體異構體，
Figure 109113682-A0101-12-0003-1
 其中R為包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的C1-C18的烴基，或為經選自氮、硫和氧之雜原子取代之包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的C1-C18的 烴基，且R包含C5-C10有機環，該有機環為包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的芳基。
依據前述之ADAM9抑制劑之用途，其中R可為NHR1，且R1為2-噻唑-4-基-乙基-異吲哚啉-1,3-二酮。
藉此，本發明實施例之ADAM9抑制劑能藉由改變腫瘤內免疫細胞的分布，增加免疫細胞的浸潤，而具有免疫調節功能，適用於製備免疫調節劑。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：
第1A圖和第1B圖為式(I)化合物抑制ADAM9活性的分析結果圖；
第2A圖、第2B圖、第2C圖、第2D圖、第2E圖、第2F圖、第2G圖和第2H圖為式(I)化合物於體外試驗的特性分析結果圖；
第3圖為剔除ADAM9對於腫瘤生長影響的分析結果圖；
第4A圖、第4B圖、第4C圖和第4D圖為剔除ADAM9後腫瘤組織中ADAM9、CD4、CD8和IFN-γ的RNA分析結果圖；
第5A圖和第5B圖為剔除ADAM9對於肺轉移性腫瘤生長和免疫細胞浸潤影響的分析結果圖；
第6圖為共同培養目標細胞和效應細胞24小時後的細胞凋 亡率分析結果圖；
第7A圖為ADAM9抑制劑抗腫瘤作用的分析結果圖；
第7B圖為ADAM9抑制劑用於治療同基因原位乳腺腫瘤動物模型的流程圖；
第8A圖和第8B圖為ADAM9抑制劑對於免疫細胞浸潤影響的分析結果圖；
第9圖為共同處理ADAM9抑制劑和檢查點抑制劑的分析結果圖；以及
第10A圖、第10B圖和第10C圖為ADAM9抑制劑刺激腫瘤細胞分泌細胞因子的分析結果圖。
以下對於特定實施方式和實施例的描述僅用於說明而非為限制，對本發明所屬領域之技術人員而言可依據其所進行各種修改或改變各種非關鍵參數以產生基本相似結果。本發明提供多種實施方式。
本發明提供一種ADAM9抑制劑之用途，其係應用於製備免疫調節劑。所述免疫調節劑可用於刺激免疫細胞浸潤到腫瘤中。較佳地，所述免疫細胞可為T細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性球、樹突狀細胞或骨髓來源的抑制細胞。此外，所述免疫調節劑可用於改變腫瘤微環境的趨化因子種類或用於增強癌症免疫療法的有效性。特別是，所述癌症免疫療法之施用對象可為免疫功能低下之患者。
本發明另提供一種ADAM9抑制劑之用途，其係應用於製備免疫調節劑。所述免疫調節劑可用於處理具有免疫治療抗性的腫瘤。較佳地，所述具有免疫治療抗性的腫瘤可對檢查點抑制劑、過繼細胞轉移、治療性抗體、治療疫苗、細胞因子、免疫細胞療法或其組合具有抗性。其中所述檢查點抑制劑可為在免疫細胞活化中用於抑制免疫檢查點蛋白的分子，較佳地，可為抗CTLA-4抗體、抗PDL1抗體或抗PD-1抗體。
前述之ADAM9抑制劑更可以與檢查點抑制劑搭配使用，以增強癌症免疫療法的有效性。此外，前述之ADAM9抑制劑更可以與化學治療劑和/或檢查點抑制劑搭配使用，以作為治療癌症的醫藥組合物。
所述ADAM9抑制劑可為式(I)之化合物，或其醫藥上可接受的鹽類或立體異構體，
Figure 109113682-A0101-12-0006-2
 其中R為包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的C1-C18的烴基，或為經選自氮、硫和氧之雜原子取代之包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的C1-C18的烴基，且R包含C5-C10有機環，該有機環為包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的芳基。
依據前述之式(I)化合物，其中R可為二級胺、醯胺、NHR1、NHCOR2或如式(i)所示之一結構：
Figure 109113682-A0101-12-0007-3
 其中R1可為包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的芳基。較佳地，R1可為2-噻唑-4-基-乙基-異吲哚啉-1,3-二酮(2-thiazol-4-yl-ethyl-isoindoline-1,3-dione)。R2可為包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的苯基或苯並雜環基。較佳地，R2可為苯並噻吩(benzothiophene)。R3可為任選地取代包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的苯基、苯並雜環基或雜環基。
除非另有說明，本文中及本說明書所述之「一」及「一個」意指文章中的文法對象為一或多個(即至少一個)。此外，類別為包含於該類別的所有成員的縮寫，例如，C1-C3的烷基為對所有C1-C3的烷基的縮寫，舉例而言，C1-C3的烷基包含甲基、乙基、丙基及其異構體。
下列用語、片語和符號通常旨在具有以下闡述的含義，除非使用它們的上下文中另有說明。以下縮寫詞和術語具有指示的含義。
本說明書所述之「烯基」是指選自包含至少一個 C=C雙鍵和碳原子數為2-18個、2-12個或2-6個的直鏈和支鏈的烴基。烯基的實例可選自但不限於乙烯基或乙烯基、丙-1-烯基、丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基和六-1,3-二烯基團。
本說明書所述之「芳基」是指選自以下的基團：5-和6-元碳環芳環，例如苯基、雙環系統和三環系統。其中所述之雙環系統可為7-12元雙環系統，其中至少一個環是碳環和芳香環，其選自但不限於萘、二氫化茚和1,2,3,4-四氫喹啉。所述之三環系統可為10-15元三環系統，其中至少一個環是碳環和芳香環，例如芴。舉例而言，芳基選自與任選地包含至少一個選自氮、氧和硫的雜原子的5-至7-元環烷基或雜環稠合的5-和6-元碳環芳環。當碳環芳環與雜環稠合時，連接點在碳環芳環上，當碳環芳環與環烷基稠合時，連接點可以在碳環芳環或環烷基上。由取代的苯衍生物形成並在環原子上具有自由價的二價基團被稱為取代的亞苯基基團。藉由從具有自由價的碳原子移除一個氫原子而源於名稱以“-基(-idene)”結尾的單價多環烴基團的二價基團通過添加“-亞基(-yl)”至相應單價基團的名稱中來命名，例如具有兩個連接點的萘基被稱為亞萘基。然而，芳基不包含雜芳基或與雜芳基重疊，本說明書下文分別定義。因此，如果一個或多個碳環芳環與雜環芳環稠合，則所得的環系統是雜芳基，而非本說明 書所定義的芳基。
本說明書所述之「雜芳基」是指選自以下的基團：5-至7-元芳族單環，包含1、2、3或4個選自氮、氧和硫的雜原子，其餘的環原子為碳；包含1、2、3或4個選自氮、氧和硫的雜原子的8-至12-元雙環，其餘環原子為碳，並且其中至少一個環為芳族且至少一個雜原子存在於芳香環。例如，雜芳基包含與5-至7-元環烷基環稠合的5-至7-元雜環芳環。前述稠合的雙環雜芳基環系統，其中僅一個環包含至少一個雜原子，連接點可以在雜芳環或環烷基環上。當雜芳基中硫和氧原子的總數超過1時，該些雜原子彼此不相鄰。在一些實施方案中，雜芳基中硫和氧原子的總數不大於2，在另一些實施方案中，芳族雜環中硫和氧原子的總數不大於1。雜芳基的實例包含但不限於(從分配優先級1的鏈接位置開始編號)吡啶基(如2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基)、喹啉基、吡嗪基、2,4-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,4-咪唑基、咪唑並吡啶基、異噁唑基、噁唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、四唑基、噻吩基、三嗪基、苯並噻吩基、呋喃基、苯並呋喃基、苯並咪唑基、吲哚基、異吲哚基、二氫吲哚基、酞嗪基、吡嗪基、噠嗪基、吡咯基、三唑基、喹啉基、異喹啉基、吡唑基、吡咯並吡啶基(如1H-吡咯並[2,3-b]吡啶-5-基)、吡唑並吡啶基(如1H-吡唑並[3,4-b]吡啶-5-基)、苯並噁唑基(如苯並[d]噁唑-6-基)、哌啶基、嘌呤基、1-氧雜-2,3-二唑基、1-氧雜-2,4-二唑基、1-氧雜-2,5-二唑基、1-氧雜-3,4- 二唑基、1-噻吩-3,4-二唑基、呋喃基、苯並呋咱基、苯並噻吩基、苯並噻唑基、苯並噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、呋喃並吡啶基、苯並噻唑基(如苯並[d]噻唑-6-基)、吲唑基(如1H-吲唑)-5-基)和5,6,7,8-四氫異喹啉。
化合物可含有不對稱中心，因此可作為鏡像異構物存在。當化合物具有兩個或更多個不對稱中心時，可另外作為非鏡像異構物存在。鏡像異構物和非鏡像異構物屬於更廣泛的立體異構體類別。所有可能的立體異構體包含如實質上純的可分離的鏡像異構物、其外消旋混合物以及非鏡像異構物的混合物。化合物的所有立體異構體和/或其藥學上可接受的鹽皆被包含在適用的情況下。除非另有說明，否則提及的異構體適用於任何可能的異構體。而當異構體組合物未指定時，包含所有可能的異構體。
本說明書所述之「藥學上可接受的鹽」包含但不限於與無機酸形成的鹽以及與有機酸形成的鹽。與無機酸形成的鹽可選自例如鹽酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、亞磺酸鹽和硝酸鹽。與有機酸形成的鹽可選自例如馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、2-羥乙基磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、鏈烷酸鹽(例如乙酸鹽)以及與HOOC-(CH2)n-COOH形成的鹽，其中n為0至4。藥學上可接受的陽離子的實例包含但不限於鈉、鉀、鈣、鋁、鋰和銨。
此外，若化合物是作為酸加成鹽，則可以藉由鹼化酸式鹽的溶液來獲得游離鹼。相反，如果產物是游離鹼，則可以通過將游離鹼溶解在合適的有機溶劑中並以酸處理所述溶液，再依照鹼化合物製備酸加成鹽的常規方法來製備加成鹽(例如藥學上可接受的加成鹽)。本領域技術人員可在沒有過度實驗的情況下使用的各種合成方法來製備無毒的藥學上可接受的加成鹽。
本說明書所述之「治療」是指將至少一種化合物和/或至少一種立體異構體和/或至少一種其藥學上可接受的鹽施用予有需要的受試者，例如癌症患者。
本說明書所述之「有效量」是指有效「治療」受試者的疾病或病症的至少一種化合物和/或其至少一種立體異構體和/或至少一種其藥學上可接受的鹽的量。有效量與所施用的組織、系統、動物或人的生物或醫學反應有一定程度上的相關性，例如當施用時其足以在一定程度上防止一種或多種疾病或病症的發展或減輕一種或多種所治療的病症或病症的症狀。治療有效量將根據化合物、疾病及其嚴重程度以及待治療的哺乳動物的年齡和體重等而變化。
本說明書所述之「癌症」是指或描述哺乳動物中以細胞生長失調為典型特徵的生理狀況。「腫瘤」包括一種或多種癌細胞。癌症的實例包含但不限於：癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴惡性腫瘤。此類癌症的更具體的實例包含鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包含小細胞肺癌、非小細胞肺癌(NSCLC)、肺腺瘤和肺鱗癌) 、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(包含胃腸癌)、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌，以及頭頸癌。
本發明之化合物、其立體異構體及其藥學上可接受的鹽可單獨使用或與至少一種其它治療劑合併使用進行治療。在一些實施方案中，化合物、其立體異構體及其藥學上可接受的鹽可以與至少一種另外的治療劑合併使用。所述至少一種另外的治療劑可以選自抗過度增殖劑、抗癌劑和化學治療劑。本說明書揭示的化合物和/或一種藥學上可接受的鹽可以與單一劑型中的至少一種其他治療劑一起施用，或作為單獨劑型施用。當作為單獨劑型施用時，可以在施用本說明書揭示的化合物和/或一種藥學上可接受的鹽之前，同時或之後施用至少一種其他治療劑。
本說明書所述之「化學治療劑」是指用於治療癌症的化學化合物而不論其作用機理。化學治療劑包含用於「靶向治療」和常規化療的化合物。合適的化學治療劑可以選自：誘導細胞凋亡試劑、多核苷酸(例如核酶)、多肽(例如酶)、藥物、生物模擬物、生物鹼、烷化劑、抗腫瘤抗生素、抗代謝藥物、激素、鉑化合物、與抗癌藥物、毒素和/或放射性核素結合的單株抗體、生物反應調節劑(例如IFN-α等干擾素和IL-2等白細胞介素)、過繼免疫治療劑、造血生長因子、誘導腫瘤細胞分化的藥劑(例如全反式維甲酸)、 基因治療試劑、反義治療試劑和核苷酸、腫瘤疫苗以及血管生成抑制劑。
化學治療劑的實例包含但不限於厄洛替尼(Erlotinib,Talecech®,Genentech/OSI Pharm)；硼替佐米(Bortezomib,VELCADE®,Millennium Pharm)；氟維司群(Fulvestrant,FASLODEX®,AstraZeneca)；舒尼替尼(Sunitinib,SUTENT®，輝瑞)；來曲唑(Letrozole,FEMARA®，諾華)；甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate,GLEEVEC®，Novartis)；PTK787/ZK 222584(諾華)；奧沙利鉑(Oxaliplatin,Eloxatin®,Sanofi)；5-FU(5-氟尿嘧啶)；亞葉酸鈣(Leucovorin)；雷帕黴素(Rapamycin，西羅莫司，RAPAMUNE®,Wyeth)；拉帕替尼(Lapatinib,TYKERB®,GSK572016,Glaxo Smith Kline)；洛那法尼(Lonafarnib,SCH 66336)；索拉非尼(Sorafenib,NEXAVAR®，拜耳)；伊立替康(Irinotecan,CAMPTOSAR®，輝瑞)和吉非替尼(Gefitinib,IRESSA®，阿斯特捷利康)；AG1478、AG1571(SU 5271,Sugen)；烷基化劑，例如噻替哌(thiotepa)和環磷醯胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸鹽，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和呱泊舒凡(piposulfan)；氮雜環庚烷，例如苯並二氮(benzodepa)、碳喹啉(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙烯亞胺和甲基 蜜胺類，例如六甲蜜胺(altretamine)、三亞乙基蜜胺(triethylenemelamine)、三亞乙基磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三亞乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；乙醯生合成物(acetogenins)，例如布拉它辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone)；喜樹鹼(camptothecin)，例如合成類似物托泊替康(topotecan)；苔蘚抑素(bryostatin)；海綿多烯酮(callystatin)、CC-1065及其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物；隱藻素(cryptophycins)，例如隱藻素I和隱藻素8；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin)及其合成類似物(例如KW-2189和CB1-TM1)；艾槽素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；sarcodictyin；海綿抑素(spongistatin)；氮芥類(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、膽磷醯胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽甾醇(phenesterine)、潑尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿 嘧啶芥末(uracil mustard)；亞硝基脲類，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，例如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車黴素(calicheamicin)，尤其是加利車黴素γ1I和加利車黴素ωI1；蒽環類抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；二膦酸鹽類(bisphosphonates)，例如氯膦酸鹽(clodronate)；埃斯波黴素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)發色團和相關色蛋白烯二炔類抗生素發色團、阿克拉黴素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴黴素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來黴素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌黴素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅黴素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸；ADRIAMYCIN®多柔比星(doxorubicin)，包含嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星和去氧多柔比星；表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素類(mitomycins)例如絲裂黴素C、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾拉黴素(nogalamycin)、橄 欖黴素(olivomycin)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(potfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，例如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如二甲葉酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶羅呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，例如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，例如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素類，例如卡魯睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯(testolactone)；抗腎上腺類，例如氨魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，例如亞葉酸(folinic acid)；醋葡醛內酯(aceglatone)；醛磷醯胺糖苷 (aldophosphamide glycoside)；氨基乙醯丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼達明(lonidamine)；美登木素生物鹼類(maytansinoids)，例如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫呱達醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基醯肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖複合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根黴素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2，2'，2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)，尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)；烏拉坦(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘 露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；呱泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環磷醯胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；類紫杉醇類(taxoids)，例如TAXOL®帕利他塞(paclitaxel,Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANE®不含克列莫佛(Cremophor)、清蛋白改造納米顆粒劑型帕利他塞(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE®多西他塞(doxetaxel,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；GEMZAR®吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤(thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；鉑類似物，例如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)和卡鉑(carboplatin)；長春鹼(vinblastine)；鉑(platinum)；依託泊苷(etoposide)(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長春新堿(vincristine)；NAVELBINE®長春瑞濱(vinorelbine)；能滅瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希羅達(xeloda)；伊本膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康 (irinotecan)(Camptosar，CPT-11)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維生素A(例如維甲酸)；以及上述任一種藥學上可接受的鹽、酸和衍生物。
「化學治療劑」還可以選自：(i)用來調節或抑制激素對腫瘤的作用的抗激素藥，例如抗雌激素(anti-estrogens)和選擇性雌激素受體調節劑(selective estrogen receptor modulators,SERM)，包含他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX®、他莫昔芬檸檬酸鹽(tamoxifen citrate))、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON®；(ii)抑制調節腎上腺中的雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE®(醋酸甲地孕酮)、AROMASIN®(依西美坦；輝瑞)、福美坦(formestanie)、法羅唑(fadrozole)、RIVISOR®(伏羅唑)、FEMARA®(來曲唑；諾華)和ARIMIDEX®(阿那羅唑；阿斯特捷利康)；(iii)抗雄激素類，例如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二 氧戊環胞嘧啶核苷類似物)；(iv)蛋白激酶抑制劑，例如MEK抑制劑(W02007/044515)；(v)脂質激酶抑制劑；(vi)反義寡核苷酸，特別是抑制與異常的細胞增殖相關的信號轉導途徑中的基因例如PKC-α、Raf和H-Ras；(vii)核酶，例如VEGF表達抑制劑(例如ANGIOZYME®)和HER2表達抑制劑；(viii)疫苗，例如基因治療疫苗，例如ALLOVECTIN®、LEUVECTIN®和VAX1D®；PROLEUHN® r1L-2；拓撲異構酶I抑制劑，例如LURTOTECAN®和ABARELIX© rmRH；(ix)抗血管生成劑，例如貝伐珠單抗(AVASTIN®,Genentech)；以及上述任一種的藥學可接受的鹽、酸和衍生物。
「化學治療劑」也可以選自治療性抗體，例如阿侖珠單株抗體(Campath)、貝伐珠單株抗體(AVASTIN®,Genentech)；西妥昔單株抗體(ERBITUX®,Imclone)；帕木單株抗體(VECTIBIX®,Amgen)、利妥昔單株抗體(RITUXAN®,Genentech/Biogen Idee)、帕妥珠單株抗體(OMNITARGTM,2C4,Genentech)、曲司珠單株抗體(HERCEPTIN®,Genentech)、托西莫單株抗體(Bexxar,Corixia)，以及抗體藥物偶聯物，吉妥珠單株抗體奧加米星(MYLOTARG®，Wyeth)。
具有作為化學治療劑的治療潛力的人源化單株抗體，與其目標化合物、其立體異構體及其藥學上可接受的鹽可以選自：阿侖珠單抗(alemtuzumab)、阿泊珠單株抗體(apolizumab)、阿塞珠單株抗體(aselizumab)、 阿利珠單株抗體(atlizumab)、巴匹珠單株抗體(bapineuzumab)、貝伐單株抗體(bevacizumab)、比伐珠單株抗體美登素(bivatuzumab mertansine)、美坎珠單株抗體美登素(cantuzumab mertansine)、西利珠單株抗體(cedelizumab)、賽妥珠單株抗體(certolizumab pegol)、cidfusituzumab、cidtuzumab、達珠單株抗體(daclizumab)、依庫珠單株抗體(eculizumab)、依法利珠單株抗體(efalizumab)、依帕珠單株抗體(epratuzumab)、厄利珠單株抗體(erlizumab)、泛維珠單株抗體(felvizumab)、芳妥珠單株抗體(fontolizumab)、吉妥珠單株抗體奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、伊珠單株抗體奧佐米星(inotuzumab ozogamicin)、伊匹木單株抗體(ipilimumab)、拉貝珠單株抗體(labetuzumab)、林妥珠單抗(lintuzumab)、馬妥珠單株抗體(matuzumab)、美泊利單株抗體(mepolizumab)、莫維珠單株抗體(motavizumab)、motovizumab、那他珠單株抗體(natalizumab)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、nolovizumab、numavizumab、奧瑞珠單株抗體(ocrelizumab)、奧馬珠單株抗體(omalizumab)、帕利珠單株抗體(palivizumab)、帕考珠單株抗體(pascolizumab)、pecfusituzumab、pectuzumab、帕妥珠單株抗體(pertuzumab)、培克珠單株抗體(pexelizumab)、ralivizumab、雷珠單株抗 體(ranibizumab)、瑞利珠單株抗體(reslivizumab)、瑞利珠單株抗體(reslizumab)、resyvizumab、羅維珠單株抗體(rovelizumab)、盧利珠單株抗體(ruplizumab)、西羅珠單株抗體(sibrotuzumab)、西利珠單株抗體(siplizumab)、松妥珠單株抗體(sontuzumab)、他珠單株抗體替塞坦(tacatuzumab tetraxetan)、他度珠單株抗體(tadocizumab)、他利珠單株抗體(talizumab)、替非珠單株抗體(tefibazumab)、托珠單株抗體(tocilizumab)、托利珠單株抗體(toralizumab)、曲妥珠單株抗體(trastuzumab)、西莫白介素單株抗體(tucotuzumab celmoleukin)、tucusituzumab、umavizumab、烏珠單株抗體(urtoxazumab)和維西珠單株抗體(visilizumab)。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
本發明提出一種ADAM9抑制劑的新穎用途，其係應用於製備免疫調節劑，於本發明之說明書中以式(I)化合物作為ADAM9抑制劑的實施例，以說明ADAM9抑制劑具有本發明範圍所請之功效。
一、式(I)化合物的化學合成與結構鑑定
本發明實施例之具有式(I)所示結構的衍生物，係 針對能抑制ADAM9活性之結構設計合成，並使用分子對接方法來實際篩選可以適合ADAM9的金屬蛋白酶結構域的催化位點的化合物結構。
請參照下表一，為式(I)化合物之實施例1至實施例32的結構式。
Figure 109113682-A0101-12-0023-4
Figure 109113682-A0101-12-0024-5
Figure 109113682-A0101-12-0025-6
Figure 109113682-A0101-12-0026-7
Figure 109113682-A0101-12-0027-8
Figure 109113682-A0101-12-0028-9
試驗上於實施例1至實施例32中選擇化合物6X-0310的衍生物進行試驗。所挑選出的化合物分別為化合物4X-0296、化合物SW1、化合物2X-0295、化合物SW2、化合物12W-0264和化合物6X-0310。試驗上另包含非以化合物6X-0310為核心結構的化合物9R-0655、化合物MS-1176、化合物5W-0369和化合物161。
請參照第1A圖、第1B圖和表二，為式(I)化合物抑制ADAM9活性的分析結果圖。第1A圖為將Bm7肺癌細胞分別處理前述之化合物6X-0310的衍生物後，在無貼附培養條件下進行培養，再以西方墨點法偵測Bm7肺癌細胞中ADAM9和CDCP1表現，其中EF1α為內部參照，陰性對照組為未處理藥物的Bm7肺癌細胞。第1A圖的結果顯示，化合物4X-0296、化合物SW1、化合物2X-0295、化合物SW2、化合物12W-0264和化合物6X-0310皆可降低CDCP1的表現。試驗上進一步將實施例1至實施例32的式(I)化合物進行細胞毒性測定，以測量本發明之式(I)化合物在肺癌細胞系中的IC50值，測試結果請參照第1B圖和表二，第1B圖為化合物9R-0655、化合物4X-0296、化合物SW1、化合物2X-0295、化合物SW2、化合物12W-0264、化合物MS-1176和化合 物6X-0310對Bm7肺癌細胞的細胞毒性測定分析結果圖，表二為實施例1至實施例32的對不同的腫瘤細胞株的細胞毒性測定分析結果，其中「+」表示具有抑制腫瘤細胞生長的效果，數字為IC50值(單位為μM)。
Figure 109113682-A0101-12-0029-10
Figure 109113682-A0101-12-0030-11
第1B圖和表二的結果顯示，實施例1至實施例32對於腎臟癌細胞(293)、乳癌細胞(231-brm)和不同的肺癌細胞(A549、H1299、TC1、Bm7brmx2、Bm7brmx2-1st、Bm7brmx2-2nd和PE10 WBC)均有毒殺作用，且與核心結構-化合物6X-0310相比，化合物SW1、化合物SW2、化合物12W-0264、化合物2X-0295和化合物4X-0296具有更加地腫瘤細胞毒殺效果，特別是化合物SW1和化合物SW2。
試驗上進一步利用Autodock v.4.2計算基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase,MMP)抑制劑-CGS27023A(Novartis)和化合物SW1和化合物SW2的Ki(抑制常數)，以評估其是否為潛在的ADAM9抑制劑。評估結果請參照表三。
Figure 109113682-A0101-12-0030-12
表三的結果顯示，化合物SW1和化合物SW2的Ki值均低於MMP抑制劑-CGS27023A，預測其可以較低濃度達到與較高濃度的CGS27023A相同的抑制ADAM9活性效果。
二、式(I)化合物的抑制ADAM9活性的效果
為了測量式(I)化合物抑制ADAM9活性的功效，試驗上使用重組人類ADAM9和螢光肽底物(R & D系統)建立了ELISA系統，其中包含廣效型MMP抑制劑-BB-94作為正對照組，而於此試驗中所使用的式(I)化合物為化合物SW1和化合物SW2。
第2A圖、第2B圖、第2C圖、第2D圖、第2E圖、第2F圖、第2G圖和第2H圖，為本發明實施例之化合物SW1和化合物SW2於體外試驗的特性分析結果圖。
第2A圖為以不同濃度的化合物SW1和化合物SW2進行抑制ADAM9活性分析，第2B圖為以不同濃度的化合物SW1和化合物SW2進行抑制ADAM17活性分析，第2A圖和第2B圖的結果顯示，化合物SW1和化合物SW2對於ADAM9活性具有相似抑制效果，且為劑量依賴性，但化合物SW1和化合物SW2對於ADAM17皆不具有抑制效果。
為了進一步評估化合物SW1和化合物SW2的特異性，試驗上將對照Bm7肺癌細胞(處理過shGFP)和ADAM9剔除Bm7肺癌細胞(處理過shADAM9)分別處理25μM的化合物SW1或化合物SW2，再進行細胞遷移抑制測定。請參照第2C圖，結果顯示，處理化合物SW1或化合物SW2可以顯著降低了對照Bm7肺癌細胞的遷移能力。
為了驗證化合物SW1和化合物SW2可阻斷癌細胞的抗失巢凋亡能力，試驗上測定化合物SW1和化合物SW2 在無貼附培養條件下對肺癌腦轉移細胞系-Bm7brmx2、乳癌腦轉移細胞系-MDA-231brm和白血球中失巢凋亡(無貼附誘導的細胞凋亡)的IC50值(單位為μM)。請參照下表四，結果顯示化合物SW1和化合物SW2可以在無貼附培養條件下誘導細胞死亡，並且在乳癌腦轉移細胞系-MDA-231brm中提供良好的治療效果。
Figure 109113682-A0101-12-0032-13
進一步測試處理過化合物SW1和化合物SW2的腫瘤細胞的種植效率，試驗上先將對照Bm7肺癌細胞(處理過shGFP)和ADAM9剔除Bm7肺癌細胞(處理過shADAM9)分別處理20μM的化合物SW1或化合物SW2，以及將野生型TC1肺癌細胞和ADAM9剔除TC1肺癌細胞分別處理10μM的化合物SW1或化合物SW2，再以菌落形成測定(colony-forming assay)確認各試驗組的種植效率。請參照第2D圖和第2E圖，其中陰性對照組為未經化合物SW1或化合物SW2處理的腫瘤細胞株，菌落形成測定的代表性圖像顯示在底部，統計數據為6個獨立的孔的平均值±SD。結果顯示，處理化合物SW1或化合物SW2可以大幅降低對照Bm7肺癌細胞和野生型TC1肺癌細胞的種植效率，顯示其可降低對照Bm7肺癌細胞和野生型TC1肺癌細胞的生長。
試驗上進一步將野生型TC1肺癌細胞和ADAM9剔除TC1肺癌細胞以化合物SW1或化合物SW2處理24小時後，再以Annexin V和PI染色，偵測細胞的凋亡狀況。請參照第2F圖，其中Annexin V+細胞(凋亡細胞)百分比為3次獨立實驗的統計結果，具有平均值±SD。第2F圖的結果顯示，與ADAM9剔除TC1肺癌細胞相比，化合物SW1和化合物SW2可以顯著降低對照肺癌細胞生長並誘導細胞凋亡。
此外，試驗上另檢測化合物SW1和化合物SW2對於胰腺癌細胞的IC50值(單位為μM)，結果請參照第2G圖和下表五。結果顯示，本發明之化合物SW1和化合物SW2對於不同的胰腺癌細胞皆具有毒殺作用。
Figure 109113682-A0101-12-0033-14
試驗上另將Bm7肺癌細胞分別處理25μM的化合物SW1或化合物SW2後12小時，測定其形成癌細胞球體的數量。請參照第2H圖，其中陰性對照組為未處理藥物的Bm7肺癌細胞。結果顯示，處理化合物SW1和化合物SW2可以大幅降低癌細胞球體的形成數量(*表示p<0.05，**表示p<0.01)。
三、ADAM9抑制劑用於癌症免疫治療的效果
為了驗證ADAM9對於腫瘤進展免疫反應的影響，試驗上分別將野生型TC1肺癌細胞(n=10)和ADAM9剔除TC1肺癌細胞(n=10)以皮下注射至具正常免疫力的C57BL/6小鼠中，以建立皮下肺腫瘤小鼠模型，並在細胞注射後第22天犧牲TC1-野生型組和TC1-ADAM9剔除組的小鼠，並取出其腫瘤組織，測量腫瘤組織的體積，以及每組三個單獨的腫瘤樣本利用RT-qPCR分析腫瘤組織中ADAM9、CD4、CD8和IFN-γ的RNA表現量。
請參照第3圖為剔除ADAM9對於腫瘤生長影響的分析結果圖，其為TC1-野生型組和TC1-ADAM9剔除組的小鼠的腫瘤組織大小照片圖和統計結果圖。第3圖的結果顯示，ADAM9剔除TC1肺癌細胞減少了皮下肺腫瘤小鼠模型中的腫瘤大小和轉移性結節。
請再參照第4A圖、第4B圖、第4C圖和第4D圖，為剔除ADAM9後腫瘤組織中ADAM9、CD4、CD8和IFN-γ的RNA分析結果圖，其中野生型表示TC1-野生型組的小鼠，剔除表示TC1-ADAM9剔除組的小鼠。結果顯示，在TC1-ADAM9剔除組的小鼠的腫瘤中CD8和IFN-γ的RNA過度表達。由於在培養的ADAM9剔除TC1肺癌細胞中均未檢測到CD8和IFN-γ，但在TC1-ADAM9剔除組的小鼠的腫瘤中卻檢測到CD8和IFN-γ的過度表達，前述結果顯示ADAM9基因剔除增加了腫瘤組織中CD8+ T細胞的浸潤和IFN-γ的表達，可 誘導抑制TC1腫瘤進展的免疫反應。
為了進一步確認ADAM9基因剔除是否也會影響肺轉移腫瘤的免疫反應，試驗上將野生型TC1肺癌細胞(n=5)和ADAM9剔除TC1肺癌細胞(n=5)以尾靜脈注射至具正常免疫力的C57BL/6小鼠中，以建立肺轉移模型，並在細胞注射後第28天犧牲TC1-野生型組和TC1-ADAM9剔除組的小鼠，取出其肺臟組織，對肺臟組織切片進行免疫組織化學染色法分析免疫細胞圖譜，並統計免疫組織化學染色法分析結果圖每個範圍內的免疫細胞數。
請參照第5A圖和第5B圖，為剔除ADAM9對於肺轉移性腫瘤生長和免疫細胞浸潤影響的分析結果圖，其中第5B圖為針對T細胞(CD3)、巨噬細胞(F4/80)和嗜中性球(MPO)的抗體對肺臟組織中的炎症細胞進行免疫組織化學染色，以偵測TC1-野生型組和TC1-ADAM9剔除組的腫瘤組織中T細胞、巨噬細胞和嗜中性球的表現。第5A圖和第5B圖的結果顯示，ADAM9剔除TC1肺癌細胞減少了肺轉移性腫瘤的大小，此外，可在TC1-ADAM9剔除組的小鼠的腫瘤中偵測到增加的CD8+ T細胞浸潤，而嗜中性球細胞的數量減少。
由前述結果可見ADAM9基因對於腫瘤生長和免疫細胞浸潤具有影響，本試驗進一步地藉由肺腫瘤RNA定序參與ADAM9介導的免疫抑制的基因進行全面分析，發現癌細胞中的ADAM9可能影響微環境中的免疫細胞並與 之相互作用，進而有助於腫瘤的發生、發展和轉移。為了更精確鑑定ADAM9調控的基因，我們鑑定了表達圖譜在癌細胞系與TC1-野生型組和TC1-ADAM9剔除組的小鼠的皮下腫瘤中一致的基因，作為ADAM9介導的腫瘤基因(329個基因)。請參照表六，為在培養的細胞和腫瘤中影響的329個ADAM9介導的腫瘤基因的功能分析。
Figure 109113682-A0101-12-0036-15
由前述分析可見，ADAM9介導的腫瘤基因作用於調節IFN-γ以及生產和響應IFN-γ的細胞因子。因此試驗上將C57BL/6小鼠的目標細胞(野生型TC1肺癌細胞或ADAM9剔除TC1肺癌細胞)和效應細胞(C57BL/6小鼠的脾細胞)以1：40的比例共培養24小時後，測定細胞凋亡率，以驗證前述分析結果。
請參照第6圖，為共同培養目標細胞和效應細胞24小時後的細胞凋亡率分析結果圖，其中野生型表示野生 型TC1肺癌細胞，ADAM9剔除表示ADAM9剔除TC1肺癌細胞。結果顯示，野生型TC1肺癌細胞比ADAM9剔除TC1肺癌細胞對免疫細胞攻擊的抵抗力更高。這些結果表明腫瘤中ADAM9的剔除可以增加免疫細胞的浸潤，並且會對免疫細胞的反應更加敏感。
為了進一步評估處理ADAM9抑制劑是否會得到與ADAM9基因剔除的相同結果，試驗上將野生型TC1肺癌細胞以皮下注射至具正常免疫力的C57BL/6小鼠中，建立TC1皮下肺腫瘤小鼠模型，並藉由皮下注射處理ADAM9抑制劑(化合物SW1，10mg/kg)。從第15天到第24天，每天注射1次化合物SW1，持續9天。並分別在第12天、第20天和第27天觀察腫瘤體積。
請參照第7A圖，為ADAM9抑制劑抗腫瘤作用的分析結果圖。其中對照組為注射DMSO作為處理ADAM9抑制劑的對照。第7A圖的結果顯示，與處理DMSO的對照組相比，處理化合物SW1減少了TC1皮下肺腫瘤小鼠的腫瘤生長(每組N=5)。
請再參照第7B圖，為ADAM9抑制劑用於治療同基因原位乳腺腫瘤動物模型的流程圖。試驗上另將4T1-luc乳癌細胞(5×104)移植至BALB/c小鼠的乳腺脂肪墊中建立了同基因原位乳腺腫瘤動物模型，利用IVIS成像系統進行檢測，腫瘤大小以IVIS圖像的光通量表示。在第15天檢測到腫瘤圖像之後，藉由皮下注射於第16天、第18天和第20天預處理ADAM9抑制劑(化合物 SW1，10mg/kg)。並於第21進行手術切除腫瘤後，再於第23天、第25天、第27天、第29天和第31天繼續處理ADAM9抑制劑(化合物SW1，10mg/kg)。其中手術切除的同基因原位乳腺腫瘤動物模型腫瘤進行免疫組織化學染色。試驗上另有對照組注射DMSO作為處理ADAM9抑制劑的對照。
請再參照第8A圖和第8B圖，為ADAM9抑制劑對於免疫細胞浸潤影響的分析結果圖。其中第8A圖為於原發性4T1乳腺腫瘤計算浸潤的T細胞和嗜中性球的分析結果，第8B圖為肺轉移性乳腺腫瘤計算浸潤的T細胞和嗜中性球的分析結果。第8A圖和第8B圖的結果顯示，4T1乳腺腫瘤經由ADAM9抑制劑(化合物SW1)治療後，浸潤性T細胞數量增加，特別是肺轉移性乳腺腫瘤。而在4T1原發性乳腺腫瘤和肺部轉移性乳腺腫瘤中，浸潤性嗜中性球數量皆大幅減少。顯示ADAM9抑制劑可增加4T1乳腺腫瘤中浸潤的T細胞，並減少浸潤性嗜中性球。
進一步地我們欲分析ADAM9抑制劑和檢查點抑制劑是否具有協同作用，試驗上將TC1皮下肺腫瘤小鼠單獨處理ADAM9抑制劑(化合物SW1)、檢查點抑制劑(抗-PDL1抗體)和共同處理ADAM9抑制劑(化合物SW1)和檢查點抑制劑(抗-PDL1抗體)，並分析TC1皮下肺腫瘤小鼠的腫瘤中CD8+ T細胞和調節性T細胞(TReg)的比率。試驗上另包含處理載體(DMSO)的對照組。
請參照第9圖，為共同處理ADAM9抑制劑和檢 查點抑制劑的分析結果圖。結果顯示，與處理載體、單獨處理化合物SW1和抗-PDL1抗體的組別相比，在共同處理化合物SW1和抗-PDL1抗體的組別中，CD8+ T細胞和調節性T細胞(TReg)的比率顯著地增加，顯示ADAM9抑制劑和檢查點抑制劑具有協同作用。
我們進一步地分析處理ADAM9抑制劑是否會刺激腫瘤細胞分泌細胞因子，以激活ADAM9抑制劑抗腫瘤免疫力。試驗上分別以12.5μM的化合物SW1處理人類結腸癌細胞SW620和人類胰腺癌細胞PANC-1，以及以5μM的化合物SW1處理人類食道癌細胞CE146T，24小時後收集細胞並利用RT-qPCR偵測CXCL10、CXCL11、CXC3CL1和IFNB的RNA表現量。其中CXCL10、CXCL11和CXCL1為促進CD8+ T細胞免疫應答的細胞因子，IFNB為具有抗癌作用的細胞因子。
請參照第10A圖、第10B圖和第10C圖，為ADAM9抑制劑刺激腫瘤細胞分泌細胞因子的分析結果圖。第10A圖至第10C圖的結果顯示，處理化合物SW1可以增加人類結腸癌細胞、人類胰腺癌細胞和人類食道癌細胞中CXCL10、CXCL11、CXC3CL1和IFNB的表現，顯示ADAM9抑制劑可以刺激癌細胞分泌與免疫激活相關的細胞因子。
綜上所述，本發明提出了一種ADAM9抑制劑的新用途，其可做為免疫調節劑，用於增強癌症免疫療法的有效性。並經由實驗數據證實，其可降低腫瘤的生長、改 變腫瘤的微環境、刺激免疫細胞浸潤到腫瘤中、刺激癌細胞分泌與免疫激活相關的細胞因子，進而可用於處理具有免疫治療抗性的腫瘤。是以ADAM9抑制劑可用於癌症免疫治療並可治療癌症，且其可與檢查抑制劑共同配製時具有協同作用，更能增加癌症免疫療法的有效性，具有運用於生醫保健市場之潛能。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

Claims (12)

  1. 一種ADAM9抑制劑之用途，其係用於製備一免疫調節劑，其中該ADAM9抑制劑為式(I)之化合物，或其醫藥上可接受的鹽類或立體異構體，
    Figure 109113682-A0305-02-0042-1
     其中R為包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的C1-C18的烴基，或為經選自氮、硫和氧之雜原子取代之包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的C1-C18的烴基，且R包含C5-C10有機環，該有機環為包含0至3個獨立地選自氮、硫和氧之雜原子的芳基。
  2. 如請求項1所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該免疫調節劑用於增強一癌症免疫療法的有效性。
  3. 如請求項2所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該癌症免疫療法之施用對象為一免疫功能低下之患者。
  4. 如請求項2所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該免疫調節劑用於刺激一免疫細胞浸潤到一腫瘤中。
  5. 如請求項4所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該免疫細胞為T細胞、自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性球、樹突狀細胞或骨髓來源的抑制細胞。
  6. 如請求項2所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該免疫調節劑用於改變腫瘤微環境的趨化因子種類。
  7. 如請求項2所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該免疫調節劑用於處理一具有免疫治療抗性的腫瘤。
  8. 如請求項7所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該具有免疫治療抗性的腫瘤對一檢查點抑制劑、一過繼細胞轉移、一治療性抗體、一治療疫苗、一細胞因子、一免疫細胞療法或其組合具有抗性。
  9. 如請求項8所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該檢查點抑制劑為一抗CTLA-4抗體、一抗PDL1抗體或一抗PD-1抗體。
  10. 如請求項1所述之ADAM9抑制劑之用途，其中該免疫調節劑與一檢查點抑制劑共同配製。
  11. 如請求項10述之ADAM9抑制劑之用途， 其中該檢查點抑制劑為一抗CTLA-4抗體、一抗PDL1抗體或一抗PD-1抗體。
  12. 如請求項1所述之ADAM9抑制劑之用途，其中R為NHR1，且R1為2-噻唑-4-基-乙基-異吲哚啉-1,3-二酮。
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