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TWI732761B - 生物可裂解之四胜肽連接劑 - Google Patents

生物可裂解之四胜肽連接劑 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種用於將第一化合物可逆連接至含胺第二化合物之四胜肽連接劑。亦描述含有四胜肽連接劑之化合物及使用該等四胜肽連接劑之方法。

Description

生物可裂解之四胜肽連接劑
生理學不穩定連接劑或修飾劑適用於多種方法，包含治療藥物遞送。若連接劑之裂解再產生未經修飾狀態之初始組分中之至少一者而不剩餘連接劑或修飾劑，則連接劑或修飾劑之效用可進一步增強。
已在臨床及臨床前環境中研究若干策略以可逆連接或修飾化合物。此類可逆結合物用以減輕毒性作用且改良化合物之藥理學特性。為達到效果，可逆結合物必須在血流中保持穩定，然而在結合物與靶細胞之交互作用之後釋放化合物。另外，連接劑或修飾劑之裂解必使化合物達到其生物化學目標且與其有效相互作用。通常，化合物必須以未修飾之狀態釋放。
可逆結合物之實例包括前藥，其藥物之衍生物在其原型形式下保持不活化但在體內代謝以產生活性藥物，及載劑，諸如抗體-藥物結合物。已展示可逆結合物之形成適用於抗腫瘤化學治療藥物之開發及核苷酸遞送。
Rozema等人(美國專利8137695)已展示使用二甲基順丁烯二酸酐可逆修飾多胺，由此形成pH敏感性順丁烯二醯胺鍵聯。將經修飾之聚合物遞送至細胞中且內化導致在降低之內體pH環境下順丁烯二醯胺鍵聯裂解以再產生聚合物胺。
除pH敏感性鍵聯以外，已開發活體內藉由蛋白酶活化之含胜肽 鍵聯。Rozema等人(美國專利8426554)提供一種使用經由二胜肽對胺基苯甲基-胺基甲酸酯間隔子(PABC)結合至聚合含胺基側鏈之空間穩定劑或靶向基團可逆調節膜活性多胺之膜分裂活性之方式。根據公開設計，在蛋白水解酶存在下，醯苯胺鍵之水解觸發1,6-消去級聯，由此產生具有復原溶膜特性之未修飾之聚陽離子聚合物。
自分解型PABC間隔子於前藥設計中之應用原先由Carl等人(1981)提出。此策略組合共價醯苯胺鍵之裂解與所需受質之自發釋放。已充分研究PABC間隔子之治療劑的控制藥物釋放，尤其抗癌療法(Dorywalska等人2015，Zhang等人2014，Florent等人1998，Toki等人2002，Shamis等人2004，Amir等人2005，Amir等人2005，Gopin等人2006，Zhang等人2013，Zhang等人2013)，然而，關注到在PABC消去期間產生之亦稱為醌亞胺甲基化物(QIM)之氮雜-醌甲基化物因其傾向於與N、O及S-親核試劑反應故可為毒性之來源(Reboud-Ravaux等人2009)。
Figure 105116747-A0202-12-0002-2
已描述缺乏PABC間隔子之某些可胜肽蛋白水解之前藥(Zhong等人2013，Cho KY等人2012)。然而，先前所述可胜肽蛋白水解之前藥的侷限性為其並不會以與自分解PABC類類似物相當之速率釋放親本藥物之一級胺組分。在前藥蛋白水解期間藉由內胜肽酶裂解C端胺基酸殘基似乎為限速步驟(Masquelier等人1980，Schmid等人2007,Schmid等人2007,Elsadek等人2010,Trouet等人1982)。
本發明係關於用於將第一化合物可逆連接至含胺第二化合物之四胜肽連接劑。生理學可裂解連接劑(連接劑)包含具有以下通式之四胜肽：-A4-A3-A2-A1-，其中A4為疏水性L-胺基酸，A3為親水性L-胺基酸，A2為疏水性L-胺基酸，且A1為L-脯胺酸、L-白胺酸或L-N-甲基丙胺酸。四胜肽連接劑藉由生物體，尤其哺乳動物、組織、細胞或亞細胞區室或細胞器中存在之蛋白水解酶，諸如內源性蛋白酶裂解(消化)。另外，蛋白水解酶會容易且快速裂解A1之C端側上之胜肽鍵以釋放含胺第二化合物。另外描述含有所述四胜肽連接劑之組合物及使用該等四胜肽可逆連接兩個部分或可逆修飾胺或含胺化合物之方法。所述可逆連接劑及修飾劑提供血清穩定修飾且可活體內裂解。
本文描述四胜肽連接劑，其包含：R5-A4-A3-A2-A1-R7，其中R5包含第一化合物，A4為疏水性L-胺基酸，A3為親水性L-胺基酸，A2為疏水性L-胺基酸且A1為L-脯胺酸、L-白胺酸或L-N-甲基丙胺酸，且R7為胺反應性基團。R7經選擇以使得與胺或含胺化合物反應與A1形成醯胺鍵。在一些實施例中，A3為極性不帶電L-胺基酸。在一些實施例中，四胜肽連接劑可用以將第一化合物可逆連接至含胺化合物。在一些實施例中，四胜肽連接劑可用以可逆修飾含胺化合物。在一些實施例中，四胜肽連接劑可用以可逆修飾多胺。在一些實施例中，多胺為膜活性多胺。
在一些實施例中，描述包含第一化合物經由四胜肽連接劑連接至第二化合物之組合物，其中該四胜肽連接劑由A4A3A2A1組成，其中A4為疏水性L-胺基酸，A3為親水性L-胺基酸，A2為疏水性L-胺基酸，A1為L-脯胺酸、L-白胺酸或L-N-甲基丙胺酸，且A1經由醯胺鍵連接至第二化合物。在一些實施例中，A3為極性不帶電L-胺基酸。活體外或活體內藉由蛋白水解酶裂解(消化)四胜肽導致A1與第二化合物之 間裂解以釋放第二化合物。在一些實施例中，A4A3A2A1具有序列：FCitFP(SEQ ID NO：12)、VCitFP(SEQ ID NO：19)、ACitFP(SEQ ID NO：3)、FKFP(SEQ ID NO：16)、FCitVP(SEQ ID NO：13)、FCitFL(SEQ ID NO：11)、FCitF(Nme)A(SEQ ID NO：9)或FCitAP(SEQ ID NO：8)，其中F為L-苯丙胺酸，Cit為L-瓜胺酸，P為L-脯胺酸，V為L-纈胺酸，A為L-丙胺酸，K為L-離胺酸，L為L-白胺酸，(Nme)A為L-N-甲基-丙胺酸。
在一些實施例中，描述包含經可逆修飾之多胺之組合物。多胺藉由經本文所述之四胜肽連接劑可逆修飾多胺上之多個胺進行修飾。在一些實施例中，多胺為兩性膜活性多胺。在一些實施例中，組合物進一步包含RNAi觸發子。多胺可共價連接至RNAi觸發子。在一些實施例中，用於多胺共價連接至RNAi觸發子之鍵聯含有生理學不穩定鍵聯，諸如二硫鍵。在一些實施例中，多胺不共價連接至RNAi觸發子且RNAi觸發子共價連接至靶向基團。在一些實施例中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，描述第一化合物連接至含胺第二化合物之方法，該等方法包含：將第一化合物連接至四胜肽之胺基末端及在四胜肽末端羧基末端與含胺第二化合物之間形成醯胺鍵，其中該四胜肽具有胺基酸序列A4A3A2A1，其中A4為疏水性L-胺基酸，A3為親水性L-胺基酸，A2為疏水性L-胺基酸，且A1為L-脯胺酸、L-白胺酸或L-N-甲基丙胺酸。在一些實施例中，A4為苯丙胺酸。在一些實施例中，A3為極性不帶電L-胺基酸。在一些實施例中，極性不帶電胺基酸為L-瓜胺酸。在一些實施例中，A2為苯丙胺酸。在一些實施例中，A1為脯胺酸。
在一些實施例中，四胜肽連接劑或連接劑具有四個選自由以下組成之群的胺基酸序列：FCitFP(SEQ ID NO：12)、VCitFP(SEQ ID NO：19)、ACitFP(SEQ ID NO：3)、FKFP(SEQ ID NO：16)、FCitVP(SEQ ID NO：13)、FCitFL(SEQ ID NO：11)、FCitF(Nme)A(SEQ ID NO：9)、FCitAP(SEQ ID NO：8)，其中F為L-苯丙胺酸，Cit為L-瓜胺酸，P為L-脯胺酸，V為L-纈胺酸，A為L-丙胺酸，K為L-離胺酸，L為L-白胺酸，(Nme)A為L-N-甲基-丙胺酸。
本文描述使用苯丙胺酸-瓜胺酸-苯丙胺酸-脯胺酸(FCitFP(SEQ ID NO：12))四胜肽以形成生理學可裂解連接劑。FCitFP連接劑藉由於哺乳動物、哺乳動物組織、哺乳動物細胞或哺乳動物亞細胞區室或細胞器中蛋白水解酶而快速裂解。在一些實施例中，含胺化合物經由醯胺鍵連接至脯胺酸。脯胺酸C端醯胺鍵在活體內藉由蛋白酶有效裂解以釋放含胺化合物。
在一些實施例中，第一化合物可選自包含以下之群：靶向基團、細胞受體配位體、整合素配位體、RGD配位體、RGD模擬物、去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)配位體、半乳糖、半乳糖衍生物、N-乙醯基半乳糖胺、葉酸、空間位阻穩定劑、聚乙二醇(PEG)、聚核苷酸、聚合物、多胺、抗體、藥品、半抗原、地高辛、維生素、生物素、螢光團、抗體、單株抗體及抗體片段。
在一些實施例中，含胺第二化合物可選自包含以下之群：：靶向基團、細胞受體配位體、整合素配位體、RGD配位體、RGD模擬物、去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)配位體、半乳糖、半乳糖衍生物、N-乙醯基半乳糖胺、葉酸、空間位阻穩定劑、聚乙二醇(PEG)、聚核苷酸、聚合物、多胺、抗體、藥品、半抗原、地高辛、維生素生物素、抗體、單株抗體及抗體片段。
在一些實施例中，描述活體內將RNAi觸發子遞送至細胞之組合物。
圖1. 用於製備或測試所述四胜肽連接劑之一些組分之結構。
圖2. 說明A)化合物39之消化速率，及B)化合物29之消化速率之圖。
圖3. 說明化合物29及39之反應動力學，隨時間(hr)推移產生中間物之速率(%)(C=瓜胺酸)之圖。
描述適用於第一化合物與含胺第二化合物可逆連接及/或可逆修飾含胺第二化合物之四胜肽連接劑及四胜肽連接劑。所述四胜肽連接劑對於用於前藥遞送之上述胜肽連接劑呈現改良之裂解動力學(Rejmanova等人. 1983，Malugin等人.2007，Miller等人.2009，Soler等人.2015，Chu等人.2012)。四胜肽連接劑對不存在蛋白水解酶下之水解穩定。在活體外或活體內存在蛋白水解酶(亦稱為蛋白酶、蛋白酶或胜肽酶)下，四胜肽容易裂解。更特定言之，所述四胜肽連接劑及四胜肽連接劑在四胜肽之羧基末端胺基酸與含胺第二化合物之間快速裂解，從而釋放含胺第二化合物。
在一些實施例中，描述四胜肽連接劑，四胜肽連接劑包含由以下表示之結構：
Figure 105116747-A0202-12-0006-3
Figure 105116747-A0202-12-0006-5
或
Figure 105116747-A0202-12-0006-6
其中， R4為天然、非天然異構或合成疏水性L胺基酸之R-基團(側鏈)，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為41或大於41， R3為不帶電親水性或鹼性親水性L胺基酸，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為-28或小於-28，及 R2為天然、非天然異構或合成疏水性L胺基酸之R基團(側鏈)，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為41或大於41。
在一些實施例中，R2及R4獨立地選自由以下組成之群：-CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3及-CH2C6H6(苯丙胺酸)。
在一些實施例中，R3選自由以下組成之群：-(CH2)3NHC(=O)NH2、-CH2CONH2、-(CH2)4NH3 +及-(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2。在一些實施例中，R3為-(CH2)3NHC(=O)NH2。
在活體內暴露於蛋白酶，諸如溶酶體之後，四胜肽C端醯胺鍵快速裂解(消化)。
在一些實施例中，四胜肽連接劑包含由以下表示之結構：
Figure 105116747-A0202-12-0008-7
在一些實施例中，描述生物學不穩定化合物，其中生物學不穩定化合物包括第一化合物經由四胜肽連接劑連接至含胺第二化合物，該四胜肽連接劑包含：R5-A4-A3-A2-A1-R6 (式IV)
其中R5表示第一化合物，R6表示含胺第二化合物，A4為天然、非天然異構或合成疏水性L胺基酸，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為41或大於41，A3為不帶電或鹼性親水性L胺基酸，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為-28或小於-28，A2為天然、非天然異構或合成疏水性公升胺基酸，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為41或大於41，A1為L-脯胺酸、L-白胺酸或L-N-甲基丙胺酸，且A1經由醯胺鍵連接至R6。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L- 纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺或L-離胺酸(分別-(CH2)3NHCONH2、-CH2CONH2、-(CH2)4NH3 +或-(CH2)3-NH-C(=NH)-NH2之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2及A4為L-苯丙胺酸，且A3為L-瓜胺酸(FCitFP(SEQ ID NO：12))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-離胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FKFP(SEQ ID NO：16))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-纈胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-苯丙胺酸(FCitVP(SEQ ID NO：13))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-纈胺酸(VCitFP(SEQ ID NO：19))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-苯丙胺酸(FCitAP(SEQ ID NO：8))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-丙胺酸(ACitFP(SEQ ID NO：3))。
在一些實施例中，A1為白胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺或L-離胺酸或L-精胺酸(分別-(CH2)3NHCONH2、-CH2CONH2或-(CH2)4NH3 +之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-白胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FCitFL(SEQ ID NO：11))。
在一些實施例中，A1為L-N-甲基-丙胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之 側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺、L-離胺酸、L-精胺酸(分別-(CH2)3NHCONH2、-CH2CONH2或-(CH2)4NH3 +或-(CH2)4NH3 +之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-N-甲基-丙胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FCitF(Nme)A(SEQ ID NO：9))。
在一些實施例中，R5包含由包含以下之清單中選出之化合物：空間位阻穩定劑、PEG、H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1-500-O0-1-(CH2)0-2-、PEG1-100、靶向基團、細胞受體配位體、整合素配位體、RGD配位體、RGD模擬物、去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)配位體、半乳糖、半乳糖衍生物、N-乙醯基半乳糖胺、葉酸、聚核苷酸、聚合物、多胺、抗體、藥品、半抗原、地高辛、維生素、生物素、螢光團、抗體、免疫球蛋白、單株抗體及抗體片段。
R6為選自包含以下之群的含一級胺化合物：空間位阻穩定劑、PEG、H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1-500-O0-1-(CH2)0-2-、PEG1-100、靶向基團、細胞受體配位體、整合素配位體、RGD配位體、RGD模擬物、去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)配位體、半乳糖、半乳糖衍生物、N-乙醯基半乳糖胺、葉酸、聚核苷酸、經胺修飾之聚核苷酸、聚合物、含胺聚合物、多胺、兩性膜活性多胺、抗體、藥品、半抗原、地高辛、維生素、生物素、螢光團、抗體、單株抗體及抗體片段。
在一些實施例中，描述用於第一化合物經由生物學不穩定四胜肽連接劑可逆連接至含胺第二化合物之四胜肽修飾劑，該等四胜肽修飾劑包含：R5-A4-A3-A2-A1-R7 (式V)
其中R5表示第一化合物，A4為天然、非天然異構或合成疏水性L胺基酸，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性 指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為41或大於41，A3為不帶電或鹼性親水性L胺基酸，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為-28或小於-28，A2為天然、非天然異構或合成疏水性公升胺基酸，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為41或大於41，A1為L-脯胺酸、L-白胺酸或L-N-甲基丙胺酸，且R7包含胺反應性基團，諸如(但不限於)：TFP(四氟苯基)或NHS(N-羥基丁二醯亞胺)2-MT(2-巰基噻唑啉)之活化酯。
在一些實施例中，A1為脯胺酸，A2及A4獨立地為丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸或苯丙胺酸(分別為-CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)，且A3為瓜胺酸天冬醯胺天冬醯胺(分別為-(CH2)3NHCONH2或-CH2CONH2之側鏈)。
在一些實施例中，A1為脯胺酸，A2及A4為苯丙胺酸，且A3為瓜胺酸(FCitFP(SEQ ID NO：12))。在一些實施例中，A1為脯胺酸，A2為苯丙胺酸，A3為瓜胺酸且A4為丙胺酸(ACitFP(SEQ ID NO：3))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺或L-離胺酸(分別-(CH2)3NHCONH2、-CH2CONH2或-(CH2)4NH3 +之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2及A4為L-苯丙胺酸，且A3為L-瓜胺酸(FCitFP(SEQ ID NO：12))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-離胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FKFP(SEQ ID NO：16))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-纈胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-苯丙胺酸(FCitVP(SEQ ID NO：13))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-纈胺酸(VCitFP(SEQ ID NO：19))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-苯丙胺酸(FCitAP(SEQ ID NO：8))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-丙胺酸(ACitFP(SEQ ID NO：3))。
在一些實施例中，A1為白胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺或L-離胺酸(分別-(CH2)3NHCONH2、-CH2CONH2或-(CH2)4NH3 +之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-白胺酸，A2為L-苯丙胺酸，且A3為L-離胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FKFL(SEQ ID NO：15))。
在一些實施例中，A1為L-白胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FCitFL(SEQ ID NO：11))。
在一些實施例中，A1為L-N-甲基-丙胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺或L-離胺酸(分別-(CH2)3NHCONH2、-CH2CONH2或-(CH2)4NH3 +之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-N-甲基-丙胺酸，A2為L-苯丙胺酸，且A3為L-瓜胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FCitF(Nme)A(SEQ ID NO：9))。
在一些實施例中，R5包含由包含以下之清單中選出之化合物：空間位阻穩定劑、PEG、H-(CH2)0-2-(O-CH2-CH2)1-500-O0-1-(CH2)0-2-、 PEG1-100、靶向基團、細胞受體配位體、整合素配位體、RGD配位體、RGD模擬物、去唾液酸醣蛋白受體(ASGPr)配位體、半乳糖、半乳糖衍生物、N-乙醯基半乳糖胺、葉酸、聚核苷酸、聚合物、多胺、脂質、脂質體、抗體、藥品、半抗原、地高辛、維生素、生物素、螢光團、抗體、免疫球蛋白、單株抗體及抗體片段。
在一些實施例中，靶向基團包含細胞表面受體配位體。細胞表面受體可包括(但不限於)去唾液酸醣蛋白受體及整合素受體。去唾液酸醣蛋白受體配位體可包括(但不限於)半乳糖、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、N-丙醯基-半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺或其二聚體、三聚體或四聚體。整合素受體可包括(但不限於)αvβ3整合素及αvβ6整合素。整合素受體配位體可包括(但不限於)RGD或RGD模擬物(參見例如美國專利公開案US-2015-0045573 A1，以引用之方式併入本文中)。
空間位阻穩定劑可包含(但不限於)聚乙二醇(PEG)。PEG含有1-120個乙烯單元、3-30個乙烯單元或3-24個乙烯單元。
在一些實施例中，描述用於第一化合物經由生物學不穩定四胜肽連接劑可逆連接至含胺第二化合物之化合物，該等化合物包含由以下表示之結構：
Figure 105116747-A0202-12-0013-8
Figure 105116747-A0202-12-0013-9
或
Figure 105116747-A0202-12-0014-10
其中R5表示第一化合物，R4為天然、非天然異構或合成疏水性L胺基酸之R-基團(側鏈)，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為41或大於41R3為不帶電親水性或鹼性親水性L胺基酸，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為-28或小於-28，及R2為天然、非天然異構或合成疏水性L胺基酸之R基團(側鏈)，其中當其係關於胺基酸側鏈(R-基團)之組合物時，針對甘胺酸校正之pH 7下之疏水性指數(Monera等人，J.Protein Sci.1995,1,319)為41或大於41。
R7包含胺反應性基團。
R7經選擇以使得與胺或含胺化合物反應與A1形成醯胺鍵。在一些實施例中，胺反應性基團為TFP(四氟苯基)或NHS(N-羥基丁二醯亞胺)。
在一些實施例中，R2及R4獨立地選自由以下組成之群：-CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3及-CH2C6H6。
在一些實施例中，R3選自由以下組成之群：-(CH2)3NHCONH2及-CH2CONH2。
在一些實施例中，描述用於第一化合物經由生物學不穩定四胜 肽連接劑可逆連接至含胺第二化合物之化合物，該等化合物包含由以下表示之結構：
Figure 105116747-A0202-12-0015-11
其中R5表示第一化合物R7包含胺反應性基團。R7經選擇以使得與胺或含胺化合物反應與A1形成醯胺鍵。在一些實施例中，胺反應性基團為TFP(四氟苯基)或NHS(N-羥基丁二醯亞胺)。
在一些實施例中，描述經可逆修飾之多胺，經可逆修飾之多胺包含：(R5-A4-A3-A2-A1)n-P (式X)
其中R5、A4、A3、A2及A1各如上文所述，P包含多胺，n為大於或等於1之整數，且各A1經由醯胺鍵連接至多胺上之胺。
在一些實施例中，多胺為膜活性多胺。在一些實施例中，膜活性多胺為兩性膜活性多胺。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺或L-離胺酸(分別-(CH2)3NHCONH2、- CH2CONH2或-(CH2)4NH3 +之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2及A4為L-苯丙胺酸，且A3為L-瓜胺酸(FCitFP(SEQ ID NO：12))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-離胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FKFP(SEQ ID NO：16))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-纈胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-苯丙胺酸(FCitVP(SEQ ID NO：13))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-纈胺酸(VCitFP(SEQ ID NO：19))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-苯丙胺酸(FCitAP(SEQ ID NO：8))。
在一些實施例中，A1為L-脯胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸且A4為L-丙胺酸(ACitFP(SEQ ID NO：3))。
在一些實施例中，A1為白胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺或L-離胺酸(分別-(CH2)3NHCONH2、-CH2CONH2或-(CH2)4NH3 +之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-白胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-離胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FKFL(SEQ ID NO：15))。
在一些實施例中，A1為L-白胺酸，A2為L-苯丙胺酸，A3為L-瓜胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FCitFL(SEQ ID NO：11))。
在一些實施例中，A1為L-N-甲基-丙胺酸，A2及A4獨立地為L-丙胺酸、L-纈胺酸、L-白胺酸、L-異白胺酸或L-苯丙胺酸(分別-CH3、-CHCH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2、-CH(CH3)CH2CH3或-CH2C6H6之側鏈)且A3為L-瓜胺酸、L-天冬醯胺或L-離胺酸(分別- (CH2)3NHCONH2、-CH2CONH2或-(CH2)4NH3 +之側鏈)。
在一些實施例中，A1為L-N-甲基-丙胺酸，A2為L-苯丙胺酸，且A3為L-瓜胺酸，且A4為L-苯丙胺酸(FCitF(Nme)A(SEQ ID NO：9))。
在一些實施例中，經可逆修飾之多胺由使多胺與多種所述四胜肽修飾劑反應而形成。在一些實施例中，四胜肽修飾劑連接至膜活性多胺會藉由形成遮蔽多胺或遞送聚合物遮蔽膜活性多胺之膜活性。
在一些實施例中，多胺上之胺之大於50%經修飾(n值大於多胺上之胺數量之50%)。在一些實施例中，多胺上之胺之大於60%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於70%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於75%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於80%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於85%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於90%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於95%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之100%經修飾。
在一些實施例中，R5包含靶向基團且經可逆修飾之多胺進一步結合至RNAi觸發子。RNAi觸發子可逆修飾之多胺結合物可用以活體內將RNAi觸發子遞送至細胞，以達到減少靶基因表現之目的。形成結合物且向患者投與。投與可為(但不限於)血管內注射及皮下注射。藉由蛋白水解酶活體外或活體內裂解(消化)四胜肽導致A1與多胺之間裂解以釋放多胺。多胺之釋放速率足以提供藥物或RNAi觸發子遞送。
在一些實施例中，描述經可逆修飾之多胺，經可逆修飾之多胺包含：(R9-A4-A3-A2-A1)n-P-(A1'-A2'-A3'-A4'-R8)m (式XI)
其中A4、A3、A2及A1各如上文所述，A1'、A2'、A3'及A4'獨立地如上文分別針對A1、A2、A3及A4所述， R9包含靶向基團，R8包含空間位阻穩定劑P包含多胺，n及m各為大於或等於1之整數，且A1及A1'各經由醯胺鍵連接至多胺上之胺。
經可逆修飾之多胺由多胺與多種所述四胜肽修飾劑反應形成。
在一些實施例中，多胺為膜活性多胺。在一些實施例中，膜活性多胺為兩性膜活性多胺。
在一些實施例中，多胺上之胺之大於50%經修飾(n+m值大於多胺上之胺數量之50%)。在一些實施例中，多胺上之胺之大於60%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於70%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於75%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於80%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於85%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於90%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之大於95%經修飾。在一些實施例中，多胺上之胺之100%經修飾。
在一些實施例中，經可逆修飾之多胺進一步結合至RNAi觸發子。RNAi觸發子可逆修飾之多胺結合物可用以活體內將RNAi觸發子遞送至細胞，以達到減少靶基因表現之目的。形成結合物且向患者投與。投與可為(但不限於)血管內注射及皮下注射。藉由蛋白水解酶活體外或活體內裂解(消化)四胜肽導致A1與多胺之間裂解以釋放多胺。多胺之釋放速率足以提供藥物或RNAi觸發子遞送。
出人意料地，展示四胜肽連接劑之C端L-脯胺酸殘基之插入大大改良連接劑之裂解特徵。當L-脯胺酸存在於A1處時，H2N-R6(來自式X及XI之H2N-P)之再生以顯著更快之速率發生。不希望受理論束縛，內源性酶似乎使四胜肽在A3與A2之間快速裂解，以產生連接至A4-A3 二胜肽(R5-A4-A3-CO2H)之第一化合物及連接至A2-A1二胜肽(H2N-A2-A1-N(H)-R6)之第二化合物。A1處存在脯胺酸會遏制A2與A1之間的裂解。若若干不為脯胺酸之胺基酸存在於位置A1，則內源性蛋白酶似乎自(H2N-A2-A1-N(H)-R6)快速裂解A2以產生H2N-A2-CO2H加H2N-A1-N(H)-R6。自第二化合物裂解單個胺基酸似乎緩慢，從而緩慢再生初始含胺化合物(H2N-R6)。在位置A1不存在脯胺酸下，觀察到藉由A2與A1之間原始裂解或藉由A2與A1之間裂解之後A3與A2之間裂解容易形成單一胺基酸結合物(H2N-A1-N(H)-R2)。相反，若位置A1存在脯胺酸，則二胜肽A2-A1似乎藉由內源性二胜肽酶快速裂解，產生H2N-A2-Pro-CO2H及釋放之第二化合物H2N-R6。類似結果以L-白胺酸或N-甲基丙胺酸及位置A1實現。
如本文所用，膜活性多胺為表面活性、兩性聚合物，其能夠誘導針對生物膜之以下效應中之一或多者：膜變化或破裂，從而允許不可透過膜的分子進入細胞或穿越膜；膜中形成孔隙；膜分裂；或膜破裂或溶解。如本文所用，膜或細胞膜包含脂質雙層。膜變化或破裂在功能上可藉由至少一種以下分析中之聚合物活性定義：紅血球溶胞(溶血)、脂質體洩漏、脂質體融合、細胞融合、細胞溶解及核內體釋放。可使細胞膜溶胞之膜活性聚合物亦稱為膜溶胞聚合物。優先引起質膜中之核內體或溶酶體破裂的聚合物視為核內體裂解。膜活性聚合物對細胞膜之影響可為短暫的。膜活性聚合物對膜具有親和力且引起雙層結構發生變性或變形。膜活性聚合物可為合成或非天然兩性聚合物。
聚核苷酸遞送至細胞係藉由膜活性聚合物介導，其使質膜或內部微脂粒膜(諸如核內體或溶酶體)破裂或不穩定，包括在膜中形成孔隙，或使核內體或溶酶體微脂粒破裂，由此允許微脂粒內含物釋放至細胞質中。
如本文所用，空間位阻穩定劑為非離子型親水性聚合物(天然、合成或非天然)，相對於不含空間位阻穩定劑之分子，其防止或抑制與其所連接之分子發生分子內或分子間相互作用。空間穩定劑阻礙與其連接的分子參與靜電相互作用。靜電相互作用為兩種或兩種以上物質由於正電荷與負電荷之間的吸引力而發生之非共價結合。空間穩定劑可抑制與血液組分發生相互作用且因此抑制網狀內皮系統之助噬、吞噬及吸收。空間穩定劑因此可使與其連接之分子的循環時間延長。空間穩定劑亦可抑制分子聚集。在一些實施例中，空間位阻穩定劑為聚乙二醇(PEG)或PEG衍生物。適合PEG分子具有約1-120個乙二醇單體。
靶向基團(亦為靶向配位體)係用於使化合物靶向或遞送至靶細胞或組織或特定細胞類型。靶向基團增強分子與靶細胞之結合。因此，靶向基團可增強其所連接之結合物之藥物動力學或生物分佈特性以改良結合物之細胞分佈及細胞吸收。靶向基團(諸如配位體)與細胞或細胞受體之結合可起始內飲作用。靶向基團可選自包含以下之群：對細胞表面分子具有親和力之化合物、細胞受體配位體及抗體、抗體片段及對細胞表面分子具有親和力之抗體模擬物。在一些實施例中，靶向基團包含細胞受體配位體。已使用多種配位體使藥物及基因靶向細胞及特定細胞受體。細胞受體配位體可選自包含以下之群：碳水化合物、聚醣、醣類(包括(但不限於)：半乳糖、半乳糖衍生物、甘露糖及甘露糖衍生物)、維生素、葉酸、生物素、適體、胜肽(包括(但不限於)：含RGD之胜肽、胰島素、EGF及轉鐵蛋白)及RGC模擬物。
如本文所用，ASGPr配位體(或ASGPr配位體)包含對ASGPr之親和力等於或大於半乳糖之半乳糖及半乳糖衍生物。半乳糖靶向基團與ASGPr之結合有助於將遞送胜肽細胞特異性靶向肝細胞及遞送胜肽至肝細胞之內飲作用。ASGPr配位體可選自包含以下之群：乳糖、半乳 糖、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖胺、N-甲醯基半乳糖胺、N-乙醯基-半乳糖胺、N-丙醯基半乳糖胺、N-正丁醯基半乳糖胺及N-異丁醯基半乳糖胺(Iobst,S.T.及Drickamer,K.J.B.C.1996,271,6686)。ASGPr配位體可為單體的(例如具有單個半乳糖胺)或多聚合的(例如具有多個半乳糖胺)。
RNAi觸發子(亦稱作dsRNAi觸發子)經由RNA干擾(RNAi)之生物方法抑制基因表現。RNAi觸發子包含通常含有15至50個鹼基對或18至26個鹼基對之雙股RNA或RNA樣結構，且具有與細胞內之所表現靶基因之編碼序列在核心區上至少90%互補之核鹼基序列。RNAi觸發子包括(但不限於)：短干擾RNAs(siRNAs)、雙股RNAs(dsRNA)、微RNAs(miRNAs)、短髮夾RNAs(shRNA)及內切酶受質(美國專利第8,084,599號、第8,349,809號及第8,513,207號)。
藉由抑制、下調或減少基因表現，意謂如藉由自基因轉錄之mRNA之含量或自mRNA轉譯之多胜肽、蛋白或蛋白次單元之含量所量測，基因之表現降至低於在不存在本文所述之阻斷聚核苷酸-結合物下觀察到。經由本文所述之組合物遞送之聚核苷酸抑制、下調或減少基因表現低於在存在對照不活化核酸(具有雜亂序列或具有失活錯配之核酸)下或不存在聚核苷酸與經可逆修飾之聚合物之結合下觀察到之表現量。
在藥理學及毒理學上，投藥途徑為藥物、體液、毒素或其他物質接觸身體之路徑。一般而言，投與藥物及核酸以便治療哺乳動物的方法在此項技術中已熟知且可應用於本文所述之組合物投與。在針對彼途徑適當定製之製劑中，本文所述之組合物可經由任何適合途徑(包含非經腸)投與。因此，本文所述之化合物可藉由注射投與，例如靜脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹膜內注射。因此，本文所述之組合物可包括於醫藥組合物中及/或可形成醫藥學上可接受之載劑或賦形 劑之一部分。
非經腸投與途徑包括使用注射器及針或導管之血管內(靜脈內、動脈內)、肌肉內、腦實質內、皮內、皮下(subdermal)、皮下(subcutaneous)、瘤內、腹膜內、鞘內、硬膜下、硬膜外及淋巴管內注射。
所述組合物以醫藥學上可接受之載劑溶液注射。醫藥學上可接受係指自藥理學/毒理學觀點來看哺乳動物可接受之特性及/或物質。片語醫藥學上可接受係指生理學上可耐受且通常向哺乳動物投與時不產生過敏性或其他不良或毒性反應之分子實體、組合物及特性。術語醫藥學上可接受意謂能夠經聯邦政府或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他一般公認之藥典中列出適用於動物，且更特定言之適用於人類。
如本文所用，「醫藥組合物」包含藥理學有效量之活性醫藥成分(API，亦為治療性產品，例如RNAi觸發子)、醫藥學上可接受之載劑及視情況存在之一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑(賦形劑)為已適當評估安全性之非API之物質且有意包括於藥物遞送系統中。賦形劑在預定劑量下不發揮或不意欲發揮治療作用。賦形劑可用於a)在製造期間有助於藥物遞送系統的處理；b)保護、支持或增強API之穩定性、生物可用性或患者可接受性；c)有助於產物鑑別；及/或d)在儲存或使用期間增強API遞送之總體安全性、有效性之任何其他屬性。
賦形劑包括(但不限於)：吸收增強劑、抗黏劑、消泡劑、抗氧化劑、黏合劑、緩衝劑、載劑、塗佈劑、顏料、遞送增強劑、葡聚糖、右旋糖、稀釋劑、崩解劑、乳化劑、增量劑、填充劑、調味劑、滑動劑、保濕劑、潤滑劑、油狀物、聚合物、防腐劑、生理食鹽水、鹽、溶劑、糖類、懸浮劑、持續釋放型基質、甜味劑、增稠劑、張力劑、 媒劑、驅水劑及濕潤劑。醫藥學上可接受之賦形劑可為或可不為惰性物質。
本文所述之醫藥組合物可含有一般見於醫藥組合物中之其他額外組分。醫藥學活性材料可包括(但不限於)：止癢劑、收斂劑、局部麻醉劑或消炎劑(例如抗組胺劑、苯海拉明(diphenhydramine)等)。亦設想表現或包含本文所定義之RNAi觸發子的細胞、組織或經分離器官可用作「醫藥組合物」。如本文所用，「藥理學有效量」、「治療有效量」或簡單的「有效量」係指產生預定藥理學、治療性或預防性結果之RNAi觸發子之量。
含有四胜肽連接劑之藥劑亦為本發明之目標，作為製造此類藥劑之方法，該等方法包含使一或多種含有四胜肽連接劑之化合物及必要時一或多種其他有治療價值之物質呈蓋倫投藥形式。
實例
實例1.合成四胜肽連接劑及具有四胜肽連接劑之結合物.
A)合成胜肽及AENA標記之胜肽。
Figure 105116747-A0202-12-0023-12
(i)固相合成化合物1-21：胜肽酸由預載脯胺酸、白胺酸、丙胺酸或N-甲基丙胺酸之市售2-Cl-Trt樹脂(EMD Millipore,Billerica,MA)合成。使用固相合成技術中已知之標準方法進行逐步添加。使用PYBOP(4eq)、胺基酸(4eq)及DIEA(8eq)進行偶合。用含20%哌啶之DMF脫除Fmoc保護基。
在胜肽合成之後，使N端胺基酸脫除保護基且與指定R5基團偶合。使用2 eq NAG(OAc)3(如US 8802773及Rozema等人. 2015中所製 備)或PEG12(Quanta Biodesign,Plain City,OH,CAS號：756525-94-7)之NHS活化酯於含有4 eq DIEA之DMF中進行偶合。可使用類似合成連接其他R5基團。在R5連接之後，使用於DCM中之HFIP(30%)自樹脂裂解胜肽維持0.25小時。在溶劑移除之後，用Et2O濕磨殘餘物。受質隨後未經進一步純化即使用。
(ii)通用製備化合物22-43(22a、24a、25a、32a、34a)：向粗胜肽受質(1-21)之溶液中依序添加PyBOP(2eq)、DIEA(2ea)、AENA(2eq)且在室溫下攪拌1h。完成時真空移除溶劑。化合物24a、25a、32a及34a隨後未經進一步純化即使用。所有其他受質使用HPLC用Scientific Aquasil C18逆相管柱(250×21.2,Waltham,MA)用經0.1%甲酸緩衝之乙腈及水之梯度溶離來純化。純化之後，所有化合物藉由凍乾乾燥。
(iii)製備化合物22b、24b、25b、32b及34b： 化合物24a及25a用含2%肼之DMF處理15min且隨後真空移除所有溶劑。化合物32a用含50% TFA之DCM處理1h且隨後真空移除所有溶劑。化合物34a用含無溶劑甲酸處理18h且隨後真空移除所有溶劑。一部分未純化之化合物22a用MeOH(25%)、H2O(45%)及TEA(35%)處理，在室溫下攪拌隔夜且隨後真空移除所有溶劑。如所描述脫除保護基之所有化合物隨後如步驟(ii)中所述藉由HPLC純化。
B. 通用製備化合物44a、44b、45a、45b及34b，胜肽受質之酯活法(iv)：
Figure 105116747-A0202-12-0024-13
粗化合物01a、01b、08a、08b、15b及20首先如步驟(ii)中所述經HPLC純化。在藉由HPLC純化之前，化合物01a及08a用MeOH(25%)、H2O(45%)及TEA(35%)處理，如步驟(iii)中所述製備22b中一 般。隨後如下活化所有化合物。在火焰乾燥之燒瓶中，在0℃下向0.2M濃度之含有於DMF或DCM中之純化受質之溶液中添加NHS(3eq)及DCC(3eq)，且在室溫下在氬氣下攪拌隔夜。完成時，混合物經部分濃縮，冷卻至-20℃，過濾且接著真空移除所有溶劑。將殘餘物溶解於最少之DCM及MeOH中，沈澱於冷Et2O中且藉由在離心之後傾析溶劑來收集。重複沈澱於Et2O中直至如藉由NMR所確定不可偵測到殘餘二環已基脲。所有製備之化合物隨後未經進一步純化即使用。
C)合成EDANS標記之受質，通用製備化合物48-59：
Figure 105116747-A0202-12-0025-62
各胜肽酸由預載乙醇胺之市售2-Cl-Trt樹脂(EMD Millipore,Billerica,MA)合成。如步驟(i)中所述逐步固相合成。胜肽合成之後，移除N端FMOC且序列使用DCM於中之5% TFA、5% H2O由樹脂裂解0.5小時且如步驟(ii)中所述藉由HPLC純化。純化之前，化合物52及53用於DCM中之50% TFA、5% TIS、5% H2O處理1小時。
D)製備化合物60(vi)，合成用於消化分析之對照：
Figure 105116747-A0202-12-0025-14
向含有於DMF(400μL)中之如先前所述製備之PEG12-ACit-PABC-PNP(0.052mmol，56mg)(US 8802733,Rozema等人.2015,Carlson等人. 2015)及TEA(0.078mmol,10.8μL)之溶液中添加EDANS(0.052mmol，14mg)且在室溫下在氬氣下攪拌懸浮液隔夜。完成時真空移 除所有溶劑，粗殘餘物用Et2O濕磨且使用SiO2用於CHCl3中之甲醇(10-20%)之梯度溶離來純化。產量58mg(92%)。
Figure 105116747-A0202-12-0026-15
Figure 105116747-A0202-12-0027-16
一些組分之結構示於圖1中。
實例2. 四胜肽連接劑之裂解速率.
使用多種胺基酸組合四肽連接多個第一部分(R5)及AENA報導基團第二化合物(R6)以形成分析受質(受質)。胜肽之裂解速率藉由在大鼠溶酶體萃取物存在下對受質消化之分析評估。
如上文針對UV-vis監測所述，報導基團偶合至胜肽受質之C端以藉由HPLC探索胺基酸序列對胜肽降解動力學之影響。因在自胜肽裂解之後吸收率及λ最大皆不受影響，使用N-(2-胺基乙基)-4-硝基苯胺(AENA)或N-(胺基乙基)-5-萘胺-1-磺酸(EDANS)作為用於HPLC監測之報導基團。各胜肽受質之N端經甲氧基聚乙二醇(PEG12)或N-乙醯基半乳糖胺(NAG(OR)3)修飾(圖1)。
消化分析：蛋白水解消化實驗在固定受質濃度(0.51μmol)下使用肝臟溶酶體(酶)萃取物(0.45μg/μL)於含有1%CHAPS及1.8mM DTT之25mM MES溶液(緩衝至pH 5)中進行，在37℃下培育。酶萃取物在37℃下在DTT存在下活化15分鐘，之後添加AENA標記之胜肽受質。在多個時間點下，長達26h，移除20μL等分試樣且用TFA酸化至pH 3。使用HPLC用Aquasil C18逆相管柱(250×4.6，Thermofisher,Waltham,MA)在390nm及335nm下分別針對AENA及EDANS監測來對溶離份進行分析。用經0.1%甲酸緩衝之乙腈及水之梯度進行溶離。量測未修飾之報導子分子之產生。為使凍融循環減至最少，將溶酶體萃取物分配成多個等分試樣，之後存儲於-80℃。各研究使用新穎等分試樣且解凍後立即使用。溶酶體萃取物藉由不同密度梯度離心來源於雌性Hans Wistar大鼠(Graham等人. 2000)。溶酶體萃取物之蛋白濃度藉由標準BCA蛋白分析方案來確定。化合物60用於校正實驗間之速度(表2-4)。經多個分析觀察到60之平均實驗速度為123.8nmol/h。校正之樣品速度如下計算：[(平均化合物60速度÷實驗化合物60速度)]×樣品實驗速度。
在早期線性轉換期間外推速率(亦稱作降解之速度或速度)(表2)。如本文所用，在完成小於50%下速率定義為報導基團產生之線性速率(完成小於50%下消化速率假定為線性的)。對於裂解偏離連續一階動力學之受質，消化終點釋放之報導基團之百分比用作比較度量。
表2中之日期指示在位置A2及A4具有龐大疏水性胺基酸，在位置A3具有龐大親水性(極性)胺基酸且在位置A1具有脯胺酸或白胺酸之四胜肽下觀察到最快裂解速率。在一些實施例中，位置A1之胺基酸為脯胺酸。
在A1位置具有脯胺酸之四胜肽連接劑具有最高速度。若化合物30(FCitAP(SEQ ID NO：8))及23(FCitFP(SEQ ID NO：12))之脯胺酸 變為丙胺酸，化合物33(FCitAA(SEQ ID NO：7))及39(FCitFA(SEQ ID NO：10))，則觀察到速率及消化完成時間之顯著降低。如化合物23所示，用脯胺酸取代化合物27中A1處之白胺酸會使含脯胺酸四胜肽之速度有相當大增加。與含白胺酸化合物25b相比，含脯胺酸化合物24b亦觀察到速度之小增加。
在位置A2及A4具有較大(龐大)疏水性胺基酸之四胜肽一般亦展示較高速度。化合物30、26及23之A2位置側鏈體積增加會增加消化速度。類似地，分別如化合物31、28及23中所示，A4位置處側鏈體積增加會增加消化速度。
位置A3處具有龐大極性(中性或帶正電)胺基酸之四胜肽展示更快裂解速率，參見化合物23、24b、32b及34b。
化合物39在A1處N-甲基化以產生化合物29會導致更快速率及更快完成消化(亦參見圖2)。
Figure 105116747-A0202-12-0030-17
對於既定四胜肽，裂解速率(未修飾之H2N-R6之釋放速率)不顯著受化合物R5之標識影響。化合物22a及23對於蛋白水解消化速率基本上相等(表3)。類似地，展示當與未修飾之類似物化合物22b相比時，經乙醯基修飾之NAG(OAc)3化合物22a，對消化速度具有可忽略之影響(表3)。
Figure 105116747-A0202-12-0031-18
實例3. 胺基酸A 1 及A 2 對二肽消化速率之影響. 對具有胺末端及C端(R6)EDANS報導子之二胜肽受質進一步分析胺基酸A1及A2對裂解速率之影響。在胺基酸A2與A3之間的四胜肽首先發生裂解之後，二胜肽受質模擬四胜肽連接劑。二胜肽用萃取物處理且如上文所述分析消化產物。如表4中所見，在A1處具有脯胺酸之二肽展示空腹裂解速率。與表2中之資料一致，發現裂解速率視位置A1之胺基酸及位置A2之胺基酸之尺寸及電荷而定(表4)。位置A1具有脯胺酸之胜肽具有最大裂解速率。裂解速率亦隨A2胺基酸之尺寸及疏水性增加而增加，如化合物48、49、50、52、55及58所見。
儘管存在額外胺基酸，但將苯丙胺酸添加至化合物57及59(分別產生化合物54及56)中會導致消化速度實質上增加。
Figure 105116747-A0202-12-0031-19
Figure 105116747-A0202-12-0032-20
實例4. 使用來自不同來源之萃取物分析消化.觀察到之裂解速率不視蛋白水解酶來源而定。當使用市售大鼠及人類肝臟S9萃取物消化時維持速度增加次序(23>30>37>42)(Xenotech LLC,Lenexa,KS)(表5)。因此期望不同物質及單元類型之裂解速率類似。
Figure 105116747-A0202-12-0032-21
實例5. 分析肽連接劑消化中間物.來自實例2及3之等分試樣藉由HPLC及電噴霧電離質譜分析進一步分析以鑑別消化中間物。對於受質降解之起始內蛋白分解情況，分析指示多個易裂開部位。位置A1具有脯胺酸之四胜肽連接劑(22a、22b、23、24b、26、28、30、31、34b、37及42)似乎不產生大量H2N-Pro-R6中間物，亦即A1之脯胺酸與位置A2之胺基酸之間似乎不發生顯著消化。僅觀察到A2-脯胺酸-AENA或游離AENA。當A1為丙胺酸或白胺酸時，限速步驟為最終殘基之蛋白水解。圖2中展示化合物39(FCitFA(SEQ ID NO：10))及29(FCitF(Nme)A(SEQ ID NO：9))之消化中間物。
實例6. H 2 N-R 6 之釋放不受R 6 之聚合化合物之空間體積不利影響。
PEG四胜肽修飾劑藉由使用R5之PEG基團及R7之活化酯合成(式V)。如先前所述(US專利8137695及8426554)，膜活性多胺(參見下文)經因子VII siRNA、CDM-NAG及指定四胜肽(45b、46)或三胜肽對照 (47)修飾劑修飾以形成動態多聚結合物遞送聚合物。接著將1mg/kg聚合物與0.25mg/kg siRNA之結合物注入至小鼠中。第5天，收集樣品且分析因子VII。因子VII之基因表現減少需要以與前述CDM遮蔽劑及二肽-PABC遮蔽劑類似之速率自多胺裂解修飾劑。如表6中所示，當與DPC介導之siRNA遞送使用(美國專利8137695及8426554)時，所述四胜肽藥劑(45b、46)為有效修飾劑，指示在細胞中快速裂解以釋放膜活性多胺。有效活體外基因表現減少亦指示PEG基團之存在不會不利地影響連接劑之活體內消化。對於經PEG12官能化四肽修飾之動態多聚結合物遞送聚合物，活體內基因表現減少增加之次序(45b>46>47)與活體外動力學結果相關。動力學評估之活體外模型之驗證藉由動物研究中所獲得之結果展示。
Figure 105116747-A0202-12-0033-22
實例7. 不穩定性之活體內分析.藉由測試用於DPC介導之siRNA遞送之作為修飾劑之連接劑分析四胜肽之活體內不穩定性及可逆性。
A)RNA干擾觸發子(siRNA).
siRNA合成：以下序列之對照siRNAs使用標準胺基磷酸酯化學方法合成。
siF7有義股：5'-(NH2-C6)-GfcAfaAfgGfcGfuGfcCfaAfcUfcAf(invdT)-3' SEQ ID NO：4
siF7反義股：5'dTsGfaGfuUfgGfcAfcGfcCfuUfuGfcdTsdT-3'SEQ ID NO：6
(小寫字母，2'-OMe取代；f，2'-F取代；d，2'-去氧取代；且s， 硫代磷酸酯鍵聯。)
用DBCO二硫鍵修飾胺siRNA：經DBCO修飾之siRNAs藉由在4℃下5'胺修飾之siRNA與1重量當量(wt.eq.)二苯并環辛炔-S-S-N-羥基丁二醯亞胺基酯(ALDRICH目錄號761532)及0.36wt.eq.之NaHCO3於水中反應16小時來合成。經修飾之siRNAs接著藉由添加9體積之乙醇來沈澱且在-80℃下培育2h。將沈澱溶解於無RNase之PBS緩衝液中且藉由量測260nm下之吸光度定量。
B)聚合物合成：
N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯與丙烯酸第二丁酯(EAB)之RAFT共聚物：製備AIBN(1.00mg/mL)及RAFT劑CPCPA(10.0mg/mL)於乙酸丁酯中之溶液。單體莫耳饋料為55% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯、45%丙烯酸第二丁酯(CAS號2998-08-5)。理論Mw為100,000。
將N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯(0.890g，3.43mmol)、丙烯酸第二丁酯(0.391mL，0.360g，2.81mmol)、CPCPA溶液(0.350mL，0.0125mmol)、AIBN溶液(0.308mL，0.00188mmol)及乙酸丁酯(5.3mL)添加至具有攪拌棒之20mL玻璃瓶中。小瓶用含墊片蓋密封且使用長注射器用氮氣對溶液進行鼓泡1小時，其中以第二注射器作為出口。移除注射器且使用油浴將小瓶加熱至80℃維持16小時。使溶液冷卻至室溫且轉移至一個50mL離心管中，之後向溶液中添加己烷(35mL)。以4,400rpm將溶液離心2min。小心地傾析清液層且用己烷沖洗底層(固體或凝膠樣)。接著將底層再溶解於DCM(7mL)中，於己烷(40mL)中沈澱且再次離心。傾析清液層且用己烷沖洗底層，之後將聚合物減壓乾燥數小時。粗EAB共聚物之產量為0.856g。對粗聚合物樣品實施多角度光散射(MALS)。將經乾燥之粗共聚物溶解於DCM(100mg/mL)中。添加己烷，直至剛好達到濁點之後。將所得乳白色溶液離心。萃取底層且完全沈澱於己烷中。將溶離份離心，其後分離 出共聚物，且真空乾燥。分離之EAB共聚物溶離份之產率為0.478g。對分離之共聚物之樣品進行1H-NMR及MALS。藉由1H-NMR確定之組成為61% N-Boc-乙氧基乙胺及丙烯酸酯及39%丙烯酸第二丁酯。
MALS分析：將約10mg共聚物溶解於0.5mL 75%二氯甲烷、20%四氫呋喃、5%乙腈中。使用Jordi 5μ 7.8×300混合床層LS DVB管柱，使用連接至Shimadzu Prominence HPLC的Wyatt Heleos II多角度光散射偵測器量測分子量及多分散性(PDI)。粗聚合物：MW：59,000(PDI 1.3)，分離之聚合物：MW 70,000(PDI：1.1)。
脫除保護基/透析：經乾燥之樣品用2M HCl之乙酸溶液(約7ml)處理1h以移除BOC保護基。接著用20mL水稀釋反應物且攪拌10-15min。接著使用3500 MW透析管，使溶離份在高鹽、高鹽及水中分別透析15h、8h及15h。接著將溶離份轉移至50ml離心管中且凍乾3天或直至乾燥。使乾燥樣品在水中達成20mg/mL用於進一步研究。
C)形成經可逆修飾之siRNA-多胺結合物：使用1.5wt% N-羥基丁二醯亞胺基活化PEG4疊氮化物(疊氮基-dPEG4-NHS酯，得自Quanta Biodesign)調節5mM pH 8.0 HEPES緩衝液中的聚丙烯酸酯EAB，以提供隨後連接siRNA之疊氮基。經疊氮基修飾之聚合物接著用60mg/mL HEPES鹼稀釋至5mg/mL。向此溶液中添加15mg/mL(3wt eq)之指定蛋白酶可裂解PEG修飾劑(本文所述之四胜肽藥劑或PEG12-FCit-PABC-PNP(8426554)以修飾40-50%可獲得之胺基。1h之後，向聚合物溶液中添加經DBCO修飾之嚙齒動物因子VII siRNA(0.25wt eq，相對於聚合物)。在培育隔夜之後，結合物藉由添加相對於可獲得之胺基莫耳過量之N-乙醯基半乳糖胺衍生物CDM-NAG、NAG-A4-A3-A2-A1-NHS或NAG-ACit-PABC-PNP(美國專利8426554，Rozema等人. 2015，Carlson等人. 2015)進一步修飾且培育30min以可逆修飾剩餘聚合物EAB胺。
D)活體內分析.
小鼠及注射程序. 6至8週齡之雄性Wistar Han大鼠及雌性ICR小鼠獲自Harlan Sprague-Dawley(Indianapolis,IN)。動物均在Arrowhead Madison Inc.根據動物照護及使用委員會(Animal Care and Use Committee)所批准之動物使用方案處置。嚙齒動物以12小時光/暗循環維持，讓其自由接取水及食物(Harlan Teklad嚙齒動物膳食，Harlan,Madison,WI)。向動物注射1mg/kg聚合物與0.25mg/kg siRNA之結合物。注射後第5天收集樣品。
血清FVII活性量測. 根據標準程序，藉由頜下放血至含有0.109M檸檬酸鈉抗凝血劑之微量離心管(1體積)中，藉由收集血液來製備血清樣品。使用測試套組(BIOPHEN VII,Aniara,Mason,OH)遵循製造商之建議，利用顯色方法來量測血清中之FVII活性。使用Tecan Safire-2微盤讀取器在405nm下量測比色發展過程中之吸收。
表7中之資料展示經四胜肽修飾之DPC遞送聚合物在活體內遞送siRNA中有效。此外，四胜肽藥劑與上述二胜肽PABC修飾劑一樣有效。含有蛋白水解FCitFP(SEQ ID NO：12)四聚體之帶有44a及44b之結合物展示與利用基因表現減少用之PABC介導之降解得到之結合物相等之活性(表7)。有效siRNA遞送指示有效修飾及靶向多胺及成功消化及在遞送至細胞之後於肝細胞中釋放聚合物。
活體內活性及功能與經FCitFP(SEQ ID NO：12)修飾之DPC遞送聚合物存在下之活體外消化速度資料相關，從而展示與經FCitAP修飾之DPC遞送聚合物相比較佳之siRNA遞送。因此，活體外消化速度資料精確預測活體內消化及釋放資料。
表7. 注射用蛋白酶不穩定NAG試劑靶向之聚合物-siRNA結合物後之校正之因子VII含量.
Figure 105116747-A0202-12-0037-23
實例8. RGD模擬物四胜肽及PEG-四胜肽修飾之DPC遞送聚合物.
A)合成APN 1170-100A(100A)及APN 1203-006(006)兩性膜活性多胺.
Figure 105116747-A0202-12-0037-24
i)材料. 2,2'-偶氮雙(2,4-二甲基戊腈)(V-65，自由基引發劑)購自Wako Pure Chemical Industries。丙烯酸丙酯購自Polysciences Inc。N-Boc-乙氧基-乙胺丙烯酸酯獲自WuXi Inc。2-(十二烷硫基-碳硫醯基硫基)-2-甲基丙酸(DDMAT，RAFT劑)、1,1'-偶氮雙-(環己烷甲腈)(ACHN)、1-乙基哌啶次磷酸酯(EPHP)、五氟苯酚、N,N'-二環己基碳化二亞胺及N,N-二異丙基-乙胺購自Sigma Aldrich。O-(2-胺基乙基)-O'-(2-疊氮基乙基)三乙二醇(疊氮基-PEG4-胺)購自Biomatrik Inc。
ii). N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯與丙烯酸丙酯(EAP)之RAFT共聚物. 製備V-65(2mg/mL)及RAFT劑DDMAT(10mg/mL)於乙酸丁酯中之溶液。單體莫耳濃度之饋料為52% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯、48%丙烯酸丙酯。理論Mw為75,000。RAFT劑(DDMAT)與引發劑(V-65)之莫耳比為6.67：1。
將N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯(1.778g，6.86mmol)、丙烯酸丙酯(0.794mL，0.722g，6.33mmol)、DDMAT溶液(1.215mL，0.0333mmol)、V-65溶液(0.621mL，0.005mmol)及乙酸丁酯(10.2mL)添加 至具有攪拌棒之20mL玻璃瓶中。小瓶用含墊片蓋密封且使用長針、用氮氣對溶液進行鼓泡1小時，其中以第二針作為出口。移除針且在攪拌下將小瓶加熱至50℃維持24h。使溶液冷卻至室溫且等量轉移至兩個50mL離心管中，之後向兩個管中添加己烷(35mL)。以4400rpm將溶液離心2min。小心傾析清液層且用己烷沖洗底層。接著將各管之底層再溶解於二氯甲烷(7mL)中，於己烷(40mL)中沈澱且再次離心。傾析清液層且用己烷沖洗底層，之後將各層合併至一個50mL離心管中，且減壓乾燥聚合物數小時。粗EAP共聚物之產量為2.1g。對共聚物樣品實施多角度光散射(MALS)及1H-NMR。
聚合物006：藉由1H-NMR確定之組成為55% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯及45%丙烯酸丙酯。藉由MALS確定之006之Mw為58,600g/mol，多分散指數(PDI)為1.04。
聚合物100A：藉由1H-NMR得到之組成：56% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯及44%丙烯酸丙酯。藉由MALS得到之MW：65,150，PDI為1.122。
iii). 自由基誘導之ω端基移除(僅聚合物006). 製備1,1'-偶氮雙-(環己烷甲腈)(ACHN，20mg/mL)及1-乙基哌啶次磷酸酯(EPHP，100mg/mL)於甲苯中之溶液。將EAP(2g，0.035mmol)、ACHN(0.213mL，0.5eq，0.0174mmol)、EPHP(1.25mL，20eq，0.697mmol)及甲苯(25.2mL)添加至具有攪拌棒之40mL玻璃瓶中。小瓶用含墊片蓋密封且使用長針、用氮氣對溶液進行鼓泡1小時，其中以第二針作為出口。移除針且將小瓶加熱至100℃維持2h。使溶液冷卻至室溫且藉由旋轉蒸發移除約20mL甲苯。將剩餘溶液轉移至50mL離心機小瓶中，且添加己烷(35mL)。以4400rpm將溶液離心2min。小心傾析清液層且用己烷沖洗底層。接著將底層再溶解於二氯甲烷(7mL)中，於己烷(40mL)中沈澱且再次離心。傾析清液層且用己烷沖洗底層，之 後將聚合物減壓乾燥約1h。將聚合物溶解於甲基第三丁基醚(80mL)中且轉移至分液漏斗中。接著用3×30mL體積之H2O，之後藉由3×30mL體積之飽和NaCl洗滌溶液。接著聚合物溶液經硫酸鈉乾燥，且經由0.45μm GHP過濾器真空過濾。經由旋轉及高真空蒸發移除MTBE。使用UV分光光度計監測樣品之端基移除。端基移除經計算為99%。對樣品實施MALS、GC-FID及1H-NMR。藉由1H-NMR得到之006的組成為55% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯及45%丙烯酸丙酯。藉由GC-FID確定006之轉化為N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯為81.4%且丙烯酸丙酯為77.3%。藉由GC-FID轉化確定之100A之轉化為N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯為87%且丙烯酸丙酯為83%。藉由MALS確定之聚合物006之Mw為57,700g/mol，多分散指數(PDI)為1.06。
iv). α-端基之五氟苯酚活化. 將EAP聚合物(2g，0.0347mmol)、五氟苯酚(63.8mg，0.3466mmol)、N,N'-二環己基碳化二亞胺(71.5mg，0.3466mmol)及二氯甲烷(40mL)添加至具有攪拌棒之100mL圓底燒瓶中。用橡膠隔膜塞住燒瓶且用氮氣吹掃系統15min。在室溫下攪拌溶液16h。再添加五氟苯酚(63.8mg，0.3466mmol)及N,N'-二環己基碳化二亞胺(71.5mg，0.3466mmol)，燒瓶用橡膠隔膜塞住，且用氮氣吹掃系統15min。在室溫下攪拌所得溶液3h。用己烷(約10倍體積)使聚合物沈澱，離心且傾析溶劑。將聚合物溶解於最小二氯甲烷中，用己烷(約10倍體積)沈澱，離心且傾析溶劑。將聚合物溶解於最小乙酸乙酯中，用己烷(約10倍體積)沈澱，離心且傾析溶劑。高真空乾燥聚合物沈澱直至固體達到恆重。
v). α端基之疊氮官能化. 在配備有橡膠隔膜及攪拌棒之100ml圓底燒瓶中，將來自先前步驟之聚合物(1.9g，0.0329mmol)溶解於二氯甲烷(38mL)中。在攪拌下將疊氮基-PEG4-胺(86.4mg，0.3293mmol)及N,N-二異丙基乙胺(46.8mg，63.1μL，0.3622mmol)添加至 燒瓶中。用氮氣吹掃系統15min，且在室溫下攪拌反應物隔夜。再將疊氮基PEG4胺(86.4mg，0.3293mmol)及N,N-二異丙基乙胺(46.8mg，63.1μL，0.3622mmol)添加至燒瓶中，用N2氣體吹掃系統，且在室溫下攪拌反應物3h。用己烷(約10倍體積)使聚合物沈澱，離心且傾析溶劑。將聚合物溶解於最小二氯甲烷中，用己烷(約10倍體積)沈澱，離心且傾析溶劑。高真空乾燥聚合物沈澱直至固體達到恆重。疊氮官能化EAP之產量為1.77g。對共聚物樣品實施多角度光散射(MALS)及1H-NMR。
聚合物006：藉由1H-NMR確定之組成為56% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯及44%丙烯酸丙酯。藉由MALS確定之Mw為60,330g/mol，多分散指數(PDI)為1.05。
聚合物100A：藉由1H-NMR得到之組成為56% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯及44%丙烯酸丙酯。藉由MALS確定之Mw：64,430，PDI為1.217。
單疊氮化物：術語「單疊氮化物」或「單疊氮化物聚合物」指示進行上文程序之步驟D及E且將疊氮基團偶合成聚合物之α端基。
vi). 脫除Boc保護基及切向流過濾. 在100mL圓底燒瓶中，將2M HCl之乙酸溶液(28mL)添加至疊氮官能化EAP共聚物(1.67g，0.0277mmol)中。在室溫下攪拌反應物1小時。添加去離子H2O(56mL)且攪拌10min。接著溶液立即使用配備有切向流過濾系統(KrosFlo Research)之mPES 30kD 115cm2濾波器模組用10當量體積之5mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液(pH 5)交換。接著使用設備濃縮溶液，得到55mL最終體積。記錄5.1之pH值。藉由頂空氣相層析法對樣品進行濃度確定。將等分試樣凍乾且接著用濃度為10mg/mL之含33.3%乙腈-d之氧化氘復原以進行1H-NMR分析。對於006及100A，理論MW分別計算為43,026g/mol、45,765g/mol。
vii). 使用類似技術，可容易形成類似兩性膜活性多胺。詳言之，兩性膜活性多胺之分子量(Mw)為40-120k(經保護)(25k至85k(脫除保護基))，PDI範圍為1.03至1.2，且單體比率為35%胺單體/65%疏水性基團單體至70%胺單體/30%疏水性基團單體。
B)合成APN 1095-126(126).
Figure 105116747-A0202-12-0041-25
與用於合成100A及006之三硫代碳酸酯部分RAFT劑及V-65 RAFT引發劑相比，APN 1095-126之合成使用二硫代苯甲酸酯部分RAFT劑及AIBN RAFT引發劑。用於此聚合反應之條件需要不同加熱溫度及時間。另外，此聚合物需要部分沈澱。聚合物未封端，但疊氮化物添加方法與100A及006相同。
i). 材料. 丙烯酸丙酯購自Polysciences Inc。N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯獲自WuXi Inc。4-氰基-4-(苯基硫代甲醯硫基)戊酸(CPCPA，RAFT劑)、2,2'-偶氮雙(2-甲基丙腈)(AIBN，自由基引發劑)、五氟苯酚、N,N'-二環己基碳化二亞胺及N,N-二異丙基乙胺購自Sigma Aldrich。O-(2-胺基乙基)-O'-(2-疊氮基乙基)三乙二醇(疊氮基-PEG4-胺)購自Biomatrik Inc。
ii)N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯與丙烯酸丙酯(EAP)之RAFT共聚物.重複以下程序8次以產生總計4.5513g分離之EAP共聚物。製備AIBN(1.035mg/mL)及RAFT劑CPCPA(50.54mg/mL)於乙酸丁酯中之溶液。單體莫耳濃度之饋料為52% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯、48%丙烯酸丙酯。理論Mw為75,000。RAFT劑(CPCPA)與引發劑(AIBN)之莫耳比為6.67：1。
將N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯(1.7879g，6.9mmol)、丙烯酸丙酯(0.774mL，0.7121g，6.24mmol)、CPCPA溶液(0.184mL，0.0333 mmol)、AIBN溶液(0.793mL，0.005mmol)及乙酸丁酯(11.02mL)添加至具有攪拌棒之20mL玻璃瓶中。小瓶用含墊片蓋密封且使用長針、用氮氣對溶液進行鼓泡1小時，其中以第二針作為出口。移除針且且在攪拌下將小瓶加熱至50℃維持24h。使溶液冷卻至室溫且轉移至50mL離心管中，之後添加己烷(35mL)。以4400rpm將溶液離心2min。小心傾析清液層且用己烷沖洗底層。接著將各管之底層再溶解於二氯甲烷(7mL)中，於己烷(40mL)中沈澱且再次離心。傾析清液層且用己烷沖洗底層，之後將聚合物減壓乾燥數小時。粗EAP共聚物之產量為1.734g。對粗共聚物樣品實施多角度光散射(MALS)及1H-NMR。將經乾燥之粗共聚物溶解於DCM(100mg/mL)中。添加己烷，直至剛好達到濁點之後。將所得乳白色溶液離心。萃取底層且完全沈澱於己烷中。將溶離份離心，其後分離出共聚物，且真空乾燥。分離之EAP共聚物溶離份之產率為0.602g。對分離之共聚物之樣品進行1H-NMR及MALS。藉由1H-NMR確定之組成為56% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯及44%丙烯酸丙酯。藉由MALS確定之Mw為62,010g/mol，多分散指數(PDI)為1.14。
iii). α-端基之五氟苯酚活化. 將EAP聚合物(2g，0.0347mmol)、五氟苯酚(63.8mg，0.3466mmol)、N,N'-二環己基碳化二亞胺(71.5mg，0.3466mmol)及二氯甲烷(40mL)添加至具有攪拌棒之100mL圓底燒瓶中。用橡膠隔膜塞住燒瓶且用氮氣吹掃系統15min。在室溫下攪拌所得溶液16h。再添加五氟苯酚(63.8mg，0.3466mmol)及N,N'-二環己基碳化二亞胺(71.5mg，0.3466mmol)，燒瓶用橡膠隔膜塞住，且用氮氣吹掃系統15min。在室溫下攪拌所得溶液3h。用己烷(約10倍體積)使聚合物沈澱，離心且傾析溶劑。將聚合物溶解於最小二氯甲烷中，用己烷(約10倍體積)沈澱，離心且傾析溶劑。將聚合物溶解於最小乙酸乙酯中，用己烷(約10倍體積)沈澱，離心且傾析溶 劑。高真空乾燥聚合物沈澱直至固體達到恆重。
iv). α端基之疊氮官能化. 在配備有橡膠隔膜及攪拌棒之100ml圓底燒瓶中，將來自先前步驟之聚合物(1.9g，0.0329mmol)溶解於二氯甲烷(38mL)中。在攪拌下將疊氮基-PEG4-胺(86.4mg，0.3293mmol)及N,N-二異丙基乙胺(46.8mg，63.1μL，0.3622mmol)添加至燒瓶中。用氮氣吹掃系統15min，且在室溫下攪拌反應物隔夜。再將疊氮基PEG4胺(86.4mg，0.3293mmol)及N,N-二異丙基乙胺(46.8mg，63.1μL，0.3622mmol)添加至燒瓶中，用N2氣體吹掃系統，且在室溫下攪拌反應物3h。用己烷(約10倍體積)使聚合物沈澱，離心且傾析溶劑。將聚合物溶解於最小二氯甲烷中，用己烷(約10倍體積)沈澱，離心且傾析溶劑。高真空乾燥聚合物沈澱直至固體達到恆重。疊氮官能化EAP之產量為1.77g。對共聚物樣品實施多角度光散射(MALS)及1H-NMR。藉由1H-NMR確定之組成為56% N-Boc-乙氧基乙胺丙烯酸酯及44%丙烯酸丙酯。藉由MALS確定之Mw為66,670g/mol，多分散指數(PDI)為1.11。
v). 脫除Boc保護基及切向流過濾. 在100mL圓底燒瓶中，將2M HCl之乙酸溶液(28mL)添加至疊氮官能化EAP共聚物(1.67g，0.0277mmol)中。在室溫下攪拌反應物1小時。添加去離子H2O(56mL)且攪拌10min。接著溶液立即使用配備有切向流過濾系統(KrosFlo Research)之mPES 30kD 115cm2濾波器模組用10當量體積之5mM磷酸鹽-檸檬酸鹽緩衝液(pH 5)交換。接著使用設備濃縮溶液，得到55mL最終體積。記錄5.1之pH值。藉由頂空氣相層析法對樣品進行濃度確定。將等分試樣凍乾且接著用濃度為10mg/mL之含33.3%乙腈-d之氧化氘復原以進行1H-NMR分析。理論MW計算為43,026g/mol。
C). RGD-PEG n -FCitFP-TFP及PEG n -FCitFP-TFP劑合成. 修飾劑前驅物(di-Boc)RGD(OtBu)-APBA-PEGn-FCitFP-COOH使用通用Fmoc 化學物質固相合成使用預載Fmoc-Proline-OH之2-Cl-Trt樹脂來製備。向樹脂-Pro-Fmoc中依序添加(在各步驟脫除Fmoc保護基之後)：FMoc-Phe-OH、Fmoc-Cit-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-NH-PEGn-COOH、4-(N-Fmoc-對胺基苯氧基)-丁酸(APBA)、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH及二第三丁氧羰基間胍基苯甲酸。
將(diboc)RGD(OtBu)-APBA-PEGn-FCitFP-COOH(458mg，0.200mmol)及TFP(66.5mg，0.400mmol)溶解於無水DCM(5.0mL)中且於冰/水浴槽中冷卻至0℃，同時在氬氣下攪拌。添加EDC(77mg，0.400mmol)且在0℃下於冰/水浴槽中攪拌反應混合物30min。藉由TLC(8.5：1.5 CHCl3：MeOH)監測反應進展且在90min之後完成，藉由TLC觀察到無起始物質。用DCM將反應混合物稀釋至100mL總體積，用DI H2O(pH=5)洗滌3×40mL，且用1×40mL飽和NaCl水溶液洗滌。有機物接著經Na2SO4乾燥且經旋轉蒸發器濃縮以產生448mg(產率92%)褐色/橙色泡沫。結構藉由1H NMR及ESI MS確定(反應如上針對PEG20所示(n=20))。
Figure 105116747-A0202-12-0044-26
 (diboc)RGD(OtBu)-APBA-PEGn-FCitFP-TFP(針對n=20所示)
將(diboc)RGD(OtBu)-PEGn-FCitFP-TFP(497mg，0.204mmol)溶解於[9.25：0.75：0.50]TFA：H2O：苯硫基甲烷(5.0mL)中且在室溫下於封閉燒瓶中攪拌45min。反應完成藉由MS(ESI，陰性掃描，300-3000)確定，未觀察到與起始物質有關之物質或部分脫除保護基之中間物。 接著使反應混合物沈澱於45mL乙醚中，短暫離心，傾出清液層且2×10mL乙醚洗滌且高真空乾燥隔夜。最終產物經製備型HPLC使用Thermo Aquasil C18 5um半製備型管柱純化，其中移動相為含0.1% TFA之H2O及ACN。各注射為溶解於3.0mL含0.1% TFA之[61：39]H2O：ACN中之50mg粗物質，經(以B%指示)39-(5)-39-(35)-43-(5)-95-(10)-95-(2)-39-(5)-39之梯度操作。各注射樣品在注射15分鐘內製備(溶解)，且將陽性溶離份彙集於一個燒瓶中且於冷凍器中保持冷卻直至最後注射日結束。陽性溶離份接著經旋轉蒸發器在32℃之浴溫下濃縮至乾燥，接著用ACN/甲苯追逐2次，接著用ACN 3次，且接著經高真空乾燥隔夜。自257mg注射之粗物質中，分離180mg(70%)純物質(反應如上針對PEG20所示(n=20))。
Figure 105116747-A0202-12-0045-27
 RGD-PEGn-FCitFP-TFP(針對n=20所示)
4-(N-Fmoc-對胺基苯氧基)-丁酸1合成. 使對硝基酚(2)(7.5g，53.9mmole)與4-溴丁酸乙酯(8.45ml，59mmol)及K2CO3(7.5g，54mmole)於DMF(75mL)中組合。在100℃下攪拌混合物2h。移除DMF且用2N NaOH及甲醇之3：1混合物稀釋粗產物且在室溫下攪拌4h。反應混合物用6M HCl酸化。收集白色沈澱以產生4-(對硝基苯氧基)-丁酸3：(10.9g，產率90%)。
將4-(對硝基苯氧基)-丁酸3(37.1g，165mmol)溶解於MeOH(1L)中且添加甲酸銨(35g，555mmole)及10% Pd/C(德固賽型)(3.5g)。 在65℃下使混合物回流隔夜。用矽藻土過濾反應物，以產生淡紅棕色固體，產物4-(對胺基苯氧基)-丁酸4(30.5g，產率95%)。
將4-(對胺基苯氧基)-丁酸4(5.1g，26mmole)溶解於飽和NaHCO3水性(3.36g，40mmol)於H2O(450mL)及THF(300ml)中之6：4混合物中，得到白色漿液。添加Fmoc-OSu(8.82g，26.1mmol)且攪拌反應物4h。移除丙酮，將反應物酸化(HCl)，且收集灰白色沈澱且用1N HCl濕磨以產生9.6g產物4-(N-Fmoc-對胺基苯氧基)-丁酸1(產率88%)。
Figure 105116747-A0202-12-0046-28
二第三丁氧羰基-間胍基-苯甲酸 5根據Riches AG等人，Tetrahedron(2012)68，第9448-9455頁合成。
PEGn-FCitFP修飾劑使用類似化學方法製得。
D)聚合物之遮蔽(修飾)在室溫下使單疊氮聚合物與蛋白酶可裂解-RGD劑(RGD-PEG8-ACit-PNP、RDG-PEG8-FCitFP-TFP、RGD-PEG15-FCitFP-TFP、RGD-PEG19-FCitFP-TFP或RGD-PEG20-FCitFP-TFP)以1：0.125、1：0.25、1：0.5、1：1、1：1.5、1：2(聚合物：RGD)之重量比於50mM HEPES pH 8.5緩衝液中反應4h。接著在室溫下使經修飾之聚合物與蛋白酶可裂解-PEG劑(PEG6-ACit-PABC-PNP、PEG12-ACit-PABC-PNP、PEG12-FCit-PABC-PNP、PEG12-FCitFP-TFP)以1：8(聚合物：PEG)於50mM HEPES pH 8.5緩衝液中之重量比反應2h。在室溫下以1：0.3(聚合物：炔烴-RNAi觸發子)之重量比將炔烴-RNAi觸發子添加至於100mM乙酸鈉-乙酸緩衝溶液(pH 5.0)中之經修飾之聚合物中5天。對完整結合物進行TFF純化且確定結合效率。
E)使用四胜肽修飾之DPC遞送聚合物評估活體內遞送.負載腎臟 RCC腫瘤之小鼠用單次尾靜脈注射等滲葡萄糖(G1)或指定Hif2α-ITG-DPC(Hif2α-ITG-DPC=Hif2α RNAi觸發子-遞送聚合物結合物。遞送聚合物用RGD配位體及PEG遮蔽劑修飾)處理。在注射之後72h將小鼠安樂死，且總RNA由腎臟腫瘤使用Trizol試劑遵循製造商之建議來製備。如所述藉由RT-qPCR確定相對HiF2α mRNA含量且與僅經遞送緩衝液(等滲葡萄糖)處理之小鼠進行比較(表8)。
Figure 105116747-A0202-12-0048-29
實例9. 說明所述四胜肽連接劑之效用的額外結構.
Figure 105116747-A0202-12-0049-30
 R5-FCitFP-地高辛(藥物分子)
Figure 105116747-A0202-12-0049-31
 R5-FCitFP-葉酸酯(細胞受體配位體)
Figure 105116747-A0202-12-0049-32
 R5-FCitFP-PSMA
Figure 105116747-A0202-12-0049-33
 RGD-FCitFP-TFT反應性基團(細胞受體(含RGD模擬物之修飾劑))
<110> 美商愛羅海德製藥公司 (ARROWHEAD PHARMACEUTICALS,INC.)
<120> 生物可裂解之四胜肽連接劑
<150> 62168244
<151> 2015-05-29
<150> 62235833
<151> 2015-10-01
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 1
Figure 105116747-A0305-02-0052-2
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 2
Figure 105116747-A0305-02-0052-1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 3
Figure 105116747-A0202-12-0051-36
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子7 siRNA有義股
<220>
<221> modified_base
<222> (1)..(19)
<223> 核糖核苷酸
<400> 4
Figure 105116747-A0202-12-0051-37
<210> 5
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 5
Figure 105116747-A0202-12-0051-38
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子7 siRNA反義股
<220>
<221> modified_base
<222> (2)..(19)
<223> 核糖核苷酸
<400> 6
Figure 105116747-A0202-12-0051-39
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<22O>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 7
Figure 105116747-A0202-12-0052-40
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 8
Figure 105116747-A0202-12-0052-41
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=N-甲基丙胺酸
<400> 9
Figure 105116747-A0202-12-0052-42
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 10
Figure 105116747-A0202-12-0053-43
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 11
Figure 105116747-A0202-12-0053-44
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 12
Figure 105116747-A0202-12-0053-45
<210> 13
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 13
Figure 105116747-A0202-12-0054-46
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<400> 14
Figure 105116747-A0202-12-0054-47
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<400> 15
Figure 105116747-A0202-12-0054-48
<210> 16
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<400> 16
Figure 105116747-A0202-12-0054-49
<210> 17
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<400> 17
Figure 105116747-A0202-12-0054-50
<210> 18
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<400> 18
Figure 105116747-A0202-12-0055-51
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 四胜肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa=瓜胺酸
<400> 19
Figure 105116747-A0202-12-0055-52
Figure 105116747-A0202-11-0002-1

Claims (11)

  1. 一種四胜肽連接劑，其包含由以下表示之結構：
    Figure 105116747-A0305-02-0058-4
  2. 一種組合物，其包含：R5-A4-A3-A2-A1-R6 (式IV)其中R5為第一化合物；R6為含胺第二化合物；A4為L-苯丙胺酸；A3為L-瓜胺酸；A2為L-苯丙胺酸；A1為L-脯胺酸；且A1經由醯胺鍵連接至R6。
  3. 如請求項2之組合物，其中R6為多胺。
  4. 如請求項2之組合物，其中R6為膜活性多胺。
  5. 一種組合物，其包含：(R5-A4-A3-A2-A1)n-P其中R5包含靶向基團或空間位阻穩定劑； A4為L-苯丙胺酸；A3為L-瓜胺酸；A2為L-苯丙胺酸；A1為L-脯胺酸；P包含多胺；n為大於或等於1之整數；且各A1經由醯胺鍵連接至該多胺上之胺。
  6. 如請求項5之組合物，其中P為膜活性多胺。
  7. 如請求項5之組合物，其中n為該多胺上大於50%、大於60%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%或大於95%之胺數量。
  8. 一種組合物，其包含：(R5-A4-A3-A2-A1)n-P-(A1'-A2'-A3'-A4'-R8)m其中A4為L-苯丙胺酸；A3為L-瓜胺酸；A2為L-苯丙胺酸；A1為L-脯胺酸；A4'為L-苯丙胺酸；A3'為L-瓜胺酸；A2'為L-苯丙胺酸；A1'為L-脯胺酸；R5包含靶向基團；R8包含空間位阻穩定劑；P包含多胺；n及m各為大於或等於1之整數；且 A1及A1'各經由醯胺鍵連接至該多胺上之胺。
  9. 如請求項8之組合物，其中P為膜活性多胺。
  10. 如請求項8之組合物，其中n+m之值為該多胺上大於50%、大於60%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%或大於95%之胺數量。
  11. 一種四胜肽修飾劑，其用於經由生物學不穩定四胜肽連接劑將第一化合物可逆連接至含胺化合物，其中該四胜肽修飾劑具有由以下表示之結構：
    Figure 105116747-A0305-02-0060-5
     其中R5表示該第一化合物，且R7包含胺反應性基團。
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