TWI724890B - 虎乳靈芝菌絲體活性物質用於製備抗病毒組合物之用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種虎乳靈芝菌絲體活性物質的嶄新用途，係用於製備抗腸病毒及/或流感病毒之組合物。所述虎乳靈芝菌絲體活性物質之製備方法包括下列步驟：（a）取一虎乳靈芝菌絲體（ Lignosus rhinocerusmycelia）於平板培養基上，於15至30℃之溫度下培養1至2周；（b）將步驟（a）培養後之虎乳靈芝菌絲體接種至一燒瓶內，於15至30℃、pH 2至6之環境培養3至14天；以及（c）將步驟（b）培養後之虎乳靈芝菌絲體接種於一發酵槽內，於15至30℃、pH 2至6之環境下攪拌培養3至21天，形成含有活性物質的虎乳靈芝菌絲體發酵液。

Description

虎乳靈芝菌絲體活性物質用於製備抗病毒組合物之用途

本發明關於一種虎乳靈芝菌絲體活性物質之用途，特別是指其在抵抗腸病毒及/或流感病毒的用途，以及用於製備抗腸病毒及/或流感病毒之組合物的用途。

病毒是由一個核酸分子（DNA或RNA）與蛋白質構成的非細胞形態，介於生物與非生物間，目前分類上不把它歸於五界（原核生物、原生生物、真菌、植物和動物）之中，其無法自行表現出生命現象，必須靠寄生才能存活與繁衍，介於生命體及非生命體之間的有機物種。病毒結構主要是由一個保護性外殼包裹的一段DNA或者RNA，藉由感染的機制，這些簡單的有機體可以利用宿主的細胞系統進行自我複製，但無法獨立生長和複製。

病毒由兩到三個成份組成：遺傳物質（RNA或DNA）；蛋白質形成的衣殼，用來包裹和保護其中的遺傳物質；此外，部分病毒在到達細胞表面時能夠形成脂質包膜環繞在外。病毒的形態各異，從簡單的螺旋形和正二十面體形到複合型結構都有。病毒顆粒大約是細菌大小的千分之一。

大部分病毒都會造成生物體的疾病，但並非全部，許多病毒的複製並不會對受感染的器官產生明顯的傷害。少部分病毒，如愛滋病毒，可以與人體長時間共存，並且依然能保持感染性而不受到宿主免疫系統的影響，即「病毒持續感染」（viral persistence）。但在通常情況下，病毒感染能夠引發免疫反應，消滅入侵的病毒。而這些免疫反應能夠通過注射疫苗來產生，從而使接種疫苗的人或動物能夠終生對相應的病毒免疫。不同的病毒有著不同的致病機制，主要取決於病毒的種類。在細胞層面上，病毒主要的破壞作用是導致細胞裂解，從而引起細胞死亡。在多細胞生物中，一旦機體內有足夠多的細胞死亡，就會對機體的健康產生影響。雖然病毒可以引發疾病，卻也可以無害地存在於機體內。例如，能夠引起唇疱疹的單純疱疹病毒可以在人體內保持休眠狀態；這種狀態又稱為「潛伏」（latency），這也是所有疱疹病毒的特點。進入潛伏狀態的水痘－帶狀疱疹病毒在「甦醒」後，能夠引起帶狀疱疹。

腸病毒71型（EV71）是一種單鏈的核糖核酸病毒，也是引致手足口病的病原體之一。EV71型感染常見於東南亞地區，多數於夏天及初秋時分發生。澳洲、中國、馬來西亞、新加坡、台灣等都曾出現爆發，EV71型感染在幼童較為常見。其病徵一般與手足口病相同，主要包括發燒、口腔有疼痛的潰瘍，以及帶水疱的皮疹。病發時通常首先出現發燒、食慾不振、疲倦或喉嚨痛等病徵。發燒後一至兩天，口腔可能會出現疼痛的水疱，這些水疱初時呈細小的紅點，然後會形成潰瘍。潰瘍通常位於舌頭、牙肉以及口腔的兩腮內側。另外，手掌及腳掌，甚至臀部及/或生殖器亦會出現不痕癢或帶有小水疱的紅疹。手足口病患者亦可能沒有病徵，或者只出現皮疹或口腔潰瘍等病徵。EV71型較嚴重的情況，包括病毒性腦膜炎、腦炎、類小兒麻痺症癱瘓及心肌炎。現時並沒有疫苗能預防EV71型感染，在藥物開發方面，目前也沒有有效藥物能治療EV71，僅有少數藥物能紓緩發燒及潰瘍引致的痛楚。因此找尋有效藥物來預防/治療EV71是必要的。

H1N1新型流感屬A型流感病毒，傳染途徑與季節性流感相同，皆為飛沫傳染與接觸傳染，潛伏期估計1-4天，傳染期由發病前一天至發病後7天，兒童病例可傳染期通常較成人病例為長，也是造成流感傳播的主要來源。H1N1新型流感症狀與季節性流感類似，包括發燒、咳嗽、喉嚨痛、全身酸痛、頭痛、寒顫與疲勞，有些病例出現腹瀉、嘔吐症狀。截至目前為止，H1N1新型流感之流行病學顯示，其病程嚴重度仍屬溫和，與季節性流感相當，死亡率介於千分之一到四左右。在一些高危險族群，產生併發症或死亡的機率會比較高。高危險族群包括五歲以下的小朋友、孕婦、65歲以上老人、有潛在疾病者（如HIV、糖尿病、心血管疾病、慢性肺病）、免疫抑制患者、肥胖者等。目前主要防治手段為施打疫苗。但由於疫苗專一性較高，且H1N1新型流感變異度較大，每年施打的流感疫苗，有可能對當年度的H1N1無效。因此找尋有效藥物來預防/治療H1N1是必要的。

虎乳靈芝 （ Lignosus rhinocerus），又名老虎奶，屬擔子菌門 （Basidiomycota）多孔菌科（Polyporaceae）的植物。虎乳靈芝為馬來西亞傳統醫學用藥，傳統主要用於咳嗽、哮喘、支氣管炎、嘔吐、發燒、食物中毒等症狀。近代藥理研究分析，發現虎乳靈芝具有免疫調節、抗發炎、抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗凝血、抗乳癌的功效。然而，該些研究多專注在虎乳靈芝作為營養/保健食品，提升食用者自身免疫力來抵抗上述症狀；或者係將抗發炎引申為抗病毒性發炎，實際上無抗病毒效果。先前技術中並無證明病毒或細菌入侵體內時，虎乳靈芝作為藥物明確抵抗感染的效益。因此，本發明對虎乳靈芝菌絲體活性物質與腸病毒/流感病毒本身進行詳細研究，提供一種虎乳靈芝菌絲體活性物質的用途，證明其可有效抵抗腸病毒及/或流感病毒感染細胞。

根據本發明，提供一種虎乳靈芝菌絲體活性物質的用途 ，其係用於製備抗腸病毒及/或流感病毒之組合物。所述虎乳靈芝菌絲體活性物質之製備方法包括下列步驟：

（a）取一虎乳靈芝菌絲體（Lignosus rhinocerus mycelia）於平板培養基上，於15至30℃之溫度下培養1至2周；（b）將步驟（a）培養後之虎乳靈芝菌絲體接種至一燒瓶內，於15至30℃、pH 2至6之環境培養3至14天；（c）將步驟（b）培養後之虎乳靈芝菌絲體接種於一發酵槽內，於15至30℃、pH 2至6之環境下攪拌培養3至21天，形成一虎乳靈芝菌絲體發酵液；（d）將該虎乳靈芝菌絲體發酵液冷凍乾燥後磨粉，形成一虎乳靈芝菌絲體凍乾粉；（e）將該虎乳靈芝菌絲體凍乾粉以至少一溶劑萃取，形成一虎乳靈芝菌絲體萃取液；以及（f）將該虎乳靈芝菌絲體萃取液乾燥，以獲得該虎乳靈芝菌絲體活性物質。

一實施例中，此虎乳靈芝菌絲體活性物質係用於製備抗腸病毒為71型，或抗H1N1流感病毒之組合物。

一實施例中，上述虎乳靈芝菌絲體活性物質之製備方法的步驟（e）之溶劑係選自水、乙醇、乙酸乙酯或己烷。

一實施例中，上述虎乳靈芝菌絲體活性物質之製備方法的步驟（b）之燒瓶培養為震盪培養，且轉速為110至130 rpm。

一實施例中，上述虎乳靈芝菌絲體活性物質之製備方法的步驟（c）的發酵槽進一步通入一氣體，此氣體包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合，該發酵槽的槽壓為0.5至1.0 kg/cm2 且通氣速率為0.1至1.5 VVM。

一實施例中，所述虎乳靈芝菌絲體活性物質包含該虎乳靈芝菌絲體的水萃物、乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、己烷萃取物或其混合。

一實施例中，所述組合物進一步包含藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。

一實施例中，所述組合物包含一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。

一實施例中，所述組合物的型態包含粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。

一實施例中，所述虎乳靈芝菌絲體選自寄存於生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 930202的虎乳靈芝菌絲體。

為使本發明之上述及其它方面更為清楚易懂，下文特舉實施例，並配合所附圖式詳細說明。

實施例一　虎乳靈芝菌絲體培養

本實施例使用之虎乳靈芝菌絲體，係購自馬來西亞野生虎乳靈芝子實體。子實體外表經表面消毒後切一小口以撕裂方式取得無雜菌區，以鑷子夾取一小塊子實體置於平板培養基PDA中進行培養。以此方式進行菌種分離並在菌絲生長於PDA後，將不同型態的菌絲進行純化，經確認菌絲型態皆為一致後進行菌種鑑定。

將菌種液態培養收集菌絲體後以液態氮研磨破菌方式進行DNA萃取，並以ITS-1及ITS-4引子（ITS-1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG/ ITS-4: TCCTCCGCTTATTGATATGC）進行ITS基因片段增幅放大。

PCR放大條件為95℃反應5分鐘後，再進行95℃反應30秒、52℃反應30秒、72℃反應1分鐘10秒的 35 個循環，最後以72℃反應5min的條件，進行聚合酶鏈反應。將增幅後產物進行序列定序分析，並利用NCBI網站資源進行BLAST search 進行序列片對比對。序列相似度與虎乳靈芝序列（ Lignosus rhinoceros）達 99%。上述虎乳靈芝菌絲體寄存於財團法人食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 930202。

然而，可用於本發明的虎乳靈芝品種並不限定於此單獨一種，亦可使用其他來源的虎乳靈芝，本發明並不對其限制。以下說明本發明之虎乳靈芝培養步驟：

（1）平板培養：將虎乳靈芝菌絲體接種於平板上，於15至30℃下培養1至2周（本實施例中，係於25℃下培養7天）。平板培養基的成份可包含馬鈴薯糊精培養基（Potato Dextrose Agar, PDA）、碳源及氮源，並無特別限制。

（2）燒瓶培養：刮取（1）平板上之菌絲體接種於燒瓶中，並以15至30℃、pH 2至6及轉速110至130 rpm的條件震盪培養3至14天（本實施例中，於25℃、pH 5、轉速120 rpm之下震盪培養7天）。此震盪培養係以下表1所示之培養基進行培養。

表1  培養基配方

成分	本實施例使用含量 (重量%)	較佳含量範圍(重量%)
綜合性碳氮源	1	1-3
醣類	2	1-4
酵母抽出物	0.6	0.5-1
蛋白腖	0.6	0.5-1
無機鹽類	0.05	0.01-0.05

上述培養基配方中，綜合性碳氮源可選自穀類（如：麥粉）或豆類（如：黃豆粉、綠豆粉、大豆粉、肉桂粉等）；醣類可為葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖等；無機鹽類可為硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸鐵等。特別說明的是，表1培養基配方僅為其中一種範例，使用時成份可依需求調整，或搭配市售培養基使用，並無特別限制。

（3）發酵槽培養：將（2）中燒瓶培養的菌絲體接種於發酵槽內，以15至30 ℃、槽壓0.5至1.0 kg/cm ²、pH 2至6及攪拌速度50至150 rpm條件下，以0.1至1.5 VVM的通氣速率培養3至21天，形成一虎乳靈芝菌絲體發酵液，該通入之氣體種類可包含：空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合（本實施例中，係在25℃、槽壓0.5 kg/cm ²、pH 5，攪拌速度80 rpm及1.0 VVM（空氣）的條件下，培養14天），即得虎乳靈芝菌絲體發酵液。發酵槽培養使用之培養基可與步驟（2）燒瓶培養使用之培養基相同（本實施例之作法），亦可另外配置適當培養基。虎乳靈芝菌絲體發酵液可進一步藉由冷凍乾燥步驟製備為虎乳靈芝菌絲體發酵液凍乾粉。冷凍乾燥作法為：（a）將樣品冷凍至-20至-40℃約4小時 ；（b）將樣品抽真空，使水分直接昇華；以及（c）加熱到20至40℃4-8小時即完成。於本實施例中，100 L的虎乳靈芝菌絲體發酵液可製得約2 kg凍乾粉。

（4）萃取物製備：將虎乳靈芝菌絲體發酵液凍乾粉分為4等份，分別加入20倍重量之蒸餾水/乙醇/乙酸乙酯/己烷進行萃取。以水為溶劑的樣品以溫度100℃加熱30分鐘，待冷卻後離心取上清液，經冷凍乾燥法（步驟可與上段相同）進行乾燥得虎乳靈芝菌絲體水萃物。以乙醇/乙酸乙酯/己烷為溶劑萃取的樣品，以超音波震盪1小時，離心後取上清液，將上清液經減壓濃縮後分別得到虎乳靈芝菌絲體乙醇萃取物/乙酸乙酯萃取物/己烷萃取物。

經由萃取步驟，可取得含較高濃度之虎乳靈芝菌絲體活性物質的水萃物及乙醇萃取物/乙酸乙酯萃取物/己烷萃取物。虎乳靈芝菌絲體活性物質的態樣包含虎乳靈芝菌絲體發酵液（菌絲體與澄清液）、發酵液凍乾粉、水萃物、乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、己烷萃取物及其混合物或其他劑型。以下實施例二跟實施例三中，係以水萃物及乙醇萃取物/乙酸乙酯萃取物/己烷萃取物作為虎乳靈芝菌絲體活性物質態樣進行對於腸病毒71型及流感病毒H1N1的實驗。 實施例二 虎乳靈芝菌絲體活性物質對於腸病毒 71 型感染之影響

病毒培養及增幅（Virus amplify）

將病毒液接種於含2% FBS RPMI-1640培養液之Vero細胞（vero cell）中，以倒立式顯微鏡觀察細胞型態，當出現80%以上細胞病變現象 （cytopathic effect, CPE）時，收集含病毒之培養液，以病毒斑分析（plaque assay）來定量病毒力價（titer），並儲存於 -80℃ 冰箱備用。

細胞來源與培養

Vero細胞（ATCC CCL-81, African green monkey kidney cells）：綠猿猴腎臟細胞，原購於American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, USA）。

當細胞長到八分滿時進行繼代培養，首先吸除舊有細胞培養液，用磷酸緩衝生理食鹽水PBS洗去殘留的血清及代謝物，加入1 mL胰蛋白酶 typsin-EDTA後，置於37℃下作用3-5分鐘，輕拍細胞盤側促使貼附於盤底之細胞脫落，鏡檢確認細胞被切下後，以0.5 mL胎牛血清FBS中止胰蛋白酶的作用，以RPMI-1640培養基沖下細胞並收集於50 mL離心管中進行離心（條件設定為500 xg，5 分鐘，4℃），而後吸除上清液，再以RPMI-1640培養基回溶沉澱之細胞並進行計數，將細胞濃度調整為3 × 10 ⁵細胞/盤，最後種於細胞培養皿，並加入含有10 %FBS之RPMI-1640培養基共10 mL，培養於37℃及5% CO ₂之培養箱。

虎乳靈芝菌絲體活性物質對於腸病毒71型感染之影響

先將虎乳靈芝菌絲體萃取物以DMSO溶解至適當濃度，將VERO細胞培養至 96 孔盤內，隔夜培養待細胞貼附後，以MTS assay測定各種虎乳靈芝菌絲體萃取物於不同EV71感染時間點之VERO細胞存活率。

預防試驗（Pre-treatment）

在病毒吸附階段前，於細胞中加入不同態樣（分別為水萃物、乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物及己烷萃取物）、不同濃度虎乳靈芝菌絲體活性物質（每種態樣之活性物質分別為1000、500、250 μg/mL）於培養箱中作用 1 小時，吸除培養液後再加入m.o.i. = 0.25（病毒感染劑量 Multiplicity of infection, MOI）之EV71溶液，與細胞於培養箱作用 1 小時。移除培養液並加入含2% FBS之新鮮RPMI-1640培養液，於37℃、5% CO ₂培養箱培養48小時，最後以MTS assay測其細胞存活率，結果如第1圖所示。

第1圖中EV71欄位的+/-值表示該樣品是否有添加腸病毒EV71。DMSO為未加入虎乳靈芝菌絲體的對照/控制組，Lr H ₂O、Lr EtOH、Lr EA及Lr Hex為加入虎乳靈芝菌絲體活性物質（分別以水萃物、乙醇/乙酸乙酯/己烷萃取物態樣加入）的實驗組。1000、500、250為添加虎乳靈芝菌絲體活性物質之濃度（μg/mL）。縱軸為細胞存活率（以未添加腸病毒EV71之對造組為100%）。星號*表示該組數值與病毒對照組相比為顯著差異（*=p ＜ 0.05，**=p ＜ 0.01，***=p ＜ 0.001）。預防試驗主要係測試虎乳靈芝菌絲體活性物質是否能抑制病毒吸附至細胞，與僅添加腸病毒之EV71對造組相比，以濃度1000μg/ml的水萃物、乙酸乙酯萃取物及己烷萃取物進行預防處理的組別，細胞存活率分別提升達26.370% （p＜0.001）、12.7%（p＜0.001）及13.9 % （p＜0.001），且於250μg/mL濃度下細胞存活率仍具顯著提昇。

共培養試驗（Co-treatment）

將不同態樣、不同濃度之虎乳靈芝菌絲體活性物質與m.o.i. = 0.25之EV71共培養1小時，之後將各濃度、態樣的虎乳靈芝菌絲體的活性物質分別加入細胞中於培養箱作用1小時，移除原培養液並加入含2% FBS之新鮮RPMI-1640培養液，於37℃、5% CO ₂培養箱培養48 小時，最後以MTS assay測其細胞存活率。結果如第2圖所示，圖式橫/縱軸的說明與第1圖相同。共培養試驗亦是測試虎乳靈芝菌絲體活性物質是否能抑制病毒吸附至細胞，或者活性物時能否優先結合病毒使其失活。共培養處理條件時，1000μg/mL的虎乳靈芝水萃物之細胞存活率增加51.67%（p＜0.001），且於250μg/mL濃度下仍具有顯著差異；而1000μg/mL的虎乳靈芝乙酸乙酯萃取物及虎乳靈芝己烷萃取物之細胞存活率分別增加35.53%（p＜0.001）及28.64%（p＜0.001）；且水萃物、乙酸乙酯萃取物及己烷萃取物於250μg/mL濃度下仍具有顯著差異。

治療試驗（Post-treatment）

於細胞中加入m.o.i. = 0.25之EV71並放入培養箱中作用 1 小時，吸除培養液後分別加入不同濃度之虎乳靈芝菌絲體活性物質再於培養箱中作用1小時，移除原培養液並加入含2 %FBS之新鮮RPMI-1640培養液，於37℃、5 % CO ₂培養箱培養 48 小時，最後以MTS assay測其細胞存活率，結果如第3圖所示。治療試驗主要測試虎乳靈芝菌絲體活性物質是否可提升細胞殺掉胞內病毒能力。治療處理條件下，1000μg/mL的虎乳靈芝水萃物之細胞存活率增加47.37%（p＜0.001），且於250μg/mL 濃度下仍具有顯著差異；而1000μg/mL 的虎乳靈芝乙醇萃取物、虎乳靈芝乙酸乙酯萃取物及虎乳靈芝己烷萃取物之細胞存活率分別升高7.86%（p＜0.001）、40.84%（p＜0.001）以及30.56%（p＜0.001），且於250μg/mL濃度下仍然具有顯著差異。

根據上述實驗，可知虎乳靈芝菌絲體之水萃物、乙醇/乙酸乙酯/己烷萃取物對EV71病毒有預防、抑制吸附、消滅及/或治療等抗病毒效果，可提昇細胞存活率。 實施例三 虎乳靈芝菌絲體活性物質對於流感病毒 H1N1 感染之影響

病毒培養及增幅（Virus amplify）

將 A 型流感病毒（H1N1）液注射100 μL（約100 TCID50）入 SPF（Specific pathogen free）雞胚蛋的尿囊膜後，以蠟封住洞口進行繁殖，放在培養箱中培養1至2天，再放入4℃等待凝結，最後再將尿囊膜中液體抽出，置入-80℃保存。

細胞株來源與培養

MDCK細胞（Madin-Darby Canine Kidney cells）：犬腎上皮細胞，購自台灣財團法人食品工業研究所之生物資源中心（Bioresource Collection and Research Center, BCRC），細胞株編號為BCRC 60004。當細胞長到八分滿的時進行繼代培養，首先吸除舊有細胞培養液，用磷酸緩衝生理食鹽水PBS洗去殘留的血清及代謝物，加入 1 mL 胰蛋白酶typsin-EDTA後，置於37℃下作用3-5分鐘，輕拍細胞盤側促使貼附於盤底之細胞脫落，鏡檢確認細胞被切下後，以0.5 mL胎牛血清FBS中止胰蛋白酶的作用，以DMEM培養基沖下細胞並收集於50 mL離心管中進行離心（條件設定為 500 xg，5 分鐘，4℃），而後吸除上清液，再以 DMEM培養基回溶沉澱之細胞並進行計數，將細胞濃度調整為3 × 10 ⁵細胞/盤，最後種於細胞培養皿，並加入含有10 % FBS之DMEM培養基共10 mL，培養於37℃及5% CO ₂之培養箱。

虎乳靈芝菌絲體萃取物對於H1N1病毒感染之影響

先將虎乳靈芝菌絲體萃取物分別以 PBS以及DMSO溶解至適當濃度（水萃取物使用PBS溶解，其他萃取物使用DMSO溶解），將MDCK培養至96孔盤內，隔夜培養待細胞貼附後，以MTS assay測定虎乳靈芝菌絲體萃取物於不同H1N1感染時間點之MDCK細胞存活率。

預防試驗（Pre-treatment）

在病毒吸附階段前，於細胞中加入不同態樣（分別為水萃物、乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物及己烷萃取物）、不同濃度虎乳靈芝菌絲體活性物質（分別為1000、500、250 μg/mL）於培養箱中作用1小時，吸除培養液後再加入m.o.i. = 0.05（病毒感染劑量Multiplicity of infection, MOI）之H1N1溶液，與細胞於培養箱作用 1 小時，移除培養液並加入含2% FBS之新鮮DMEM培養液，於37℃、5% CO ₂培養箱培養 48 小時，最後以MTS assay測其細胞存活率，結果如第4圖所示。除病毒種類從EV71改為H1N1外，第4圖圖式橫/縱軸的說明與第1圖相同。與H1N1病毒對照組相比之結果顯示，以濃度1000μg/ml的乙酸乙酯萃物、己烷萃取物進行預防處理的組別，細胞存活率分別提升6.35 % （p＜0.05）以及24.7% （p＜0.01），且己烷萃取物於250μg/mL濃度下仍具有顯著差異；以濃度500μg/ml的水萃物、乙醇萃取物進行預防處理的組別，細胞存活率分別提升5.14 %（p＜0.05）以及7.47 %（p＜0.05），且乙醇萃取物於250μg/mL濃度下仍具有顯著差異。

共培養試驗 （Co-treatment）

將不同態樣、不同濃度之虎乳靈芝菌絲體萃取物與m.o.i. = 0.05之H1N1共培養1小時，之後將各濃度、態樣的虎乳靈芝菌絲體的活性物質分別加入細胞中於培養箱作用1小時，移除原培養液並加入含2% FBS之新鮮DMEM培養液，於37℃、5% CO ₂培養箱培養48小時，最後以MTS assay測其細胞存活率，結果如第5圖所示。共培養處理條件時，高濃度1000μg/mL的水萃物、乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物及己烷萃取物之細胞存活率分別提升25.5 %（p＜0.01）、12.1%（p＜0.01）、18.3 %（p＜0.05）以及15.5%（p＜0.001），且乙醇萃取物於250μg/mL濃度下仍具有顯著差異。

治療試驗 （Post-treatment）

於細胞中加入m.o.i. = 0.05之H1N1並放入培養箱中作用1小時，吸除培養液後分別加入不同濃度、不同態樣之虎乳靈芝菌絲體萃取物再於培養箱中作用1小時，移除原培養液並加入含2 % FBS之新鮮DMEM培養液，於37℃、5 %　CO ₂培養箱培養48小時，最後以MTS assay測其細胞存活率。結果如第6圖所示，治療處理條件下，高濃度1000μg/mL的水萃物、乙醇萃取物及己烷萃取物細胞存活率分別提升22.1 %（p＜0.01）、11.3%（p＜0.001）以及23.9%（p＜0.01），且乙醇萃取物跟己烷萃取物於250μg/mL濃度下仍具有顯著差異。

根據上述實驗，可知虎乳靈芝菌絲體之水萃物、乙醇萃取物及己烷萃取物對H1N1病毒有預防、抑制吸附、消滅及/或治療等抗病毒效果，可提昇細胞存活率。 實施例四 組合物製備

本發明之虎乳靈芝菌絲體活性物質可進一步製備為食品或醫藥組合物。此組合物進一步包含添加劑。在一較佳的實施態樣中，該添加劑可為賦型劑、防腐劑、稀釋劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑、或其組合。該賦型劑可選自檸檬酸鈉、碳酸鈣、磷酸鈣、蔗糖或其組合。該防腐劑可延長醫藥組合物的儲藏期限，例如苯甲醇、對羥基苯甲酸（parabens）。稀釋劑可選自水、乙醇、丙二醇、甘油或其組合。填充劑可選自乳糖、牛乳糖、高分子量舉乙二醇或其組合。吸收促進劑可選自二甲基亞碸（DMSO）、月桂氮卓酮、丙二醇、甘油、聚乙二醇或其組合。甜味劑可選自安塞甜（Acesulfame K）、阿斯巴甜（aspartame）、糖精（saccharin）、三氯蔗糖／蔗糖素（sucralose）、紐甜（neotame）或其組合。除上述所列舉的添加劑以外，在不影響虎乳靈芝菌絲體活性物質的醫藥效果前提下，可依需求選用適合的其他添加劑。

該組合物於醫藥領域中可開發為不同商品。在一較佳實施態樣中，該組合物為一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。

該組合物可根據受施予者之需要，而採用不同形態。在一較佳實施態樣中，該組合物的形態為粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶（ampoule/ampule）、液劑噴劑或塞劑。

若應用於食品用途，則以組合物1之態樣作為例示性實例。

組合物1：取虎乳靈芝菌絲體活性物質（以水萃物、乙醇/乙酸乙酯/己烷萃取物或其組合之形式，20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）充分混合，並溶於純水（65 wt%）中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。

本發明之虎乳靈芝菌絲體活性物質若以液體劑型應用於醫藥用途，則以組合物2之態樣作為例示性實例。

組合物2：取取虎乳靈芝菌絲體活性物質（以水萃物、乙醇/乙酸乙酯/己烷萃取物或其組合之形式，20 wt%），與作為防腐劑之苯甲醇（8wt%）、作為稀釋劑之甘油（7 wt%）、作為稀釋劑之蔗糖（10 wt%）充分混合，並溶於純水（55 wt%）中，存放於4℃備用。前述wt%係指各成分佔組合物總重之比例。

綜上，藉由上述各項實驗可證，本發明揭露之虎乳靈芝菌絲體活性物質具有可預防、消滅及/或治療等抵抗效果，特別是指其在預防、消滅及/或治療等抵抗效果腸病毒及/或流感病毒的用途，更佳為抵抗腸病毒71型及/或流感H1N1病毒的用途。

雖然本發明已用實施例揭露如上，然其並非用以限制本發明。本領域之通常知識者，於參酌以上教示後，當能對上述實施例的內容進行適當修改，而仍然能達到本案所主張之功效。因此，本發明的保護範圍應以其後所附之申請專利範圍為準。

第1圖繪示不同濃度/萃取溶液之虎乳靈芝菌絲體活性物質先處理Vero細胞後，再加入EV71病毒的Vero細胞存活率測試結果。

第2圖繪示不同濃度/萃取溶液之虎乳靈芝菌絲體活性物質跟EV71病毒一起處理Vero細胞後，Vero的細胞存活率測試結果。

第3圖繪示EV71病毒先處理Vero細胞後，再加入不同濃度/萃取溶液之虎乳靈芝菌絲體活性物質，Vero的細胞存活率測試結果。

第4圖繪示不同濃度/萃取溶液之虎乳靈芝菌絲體活性物質先處理MDCK細胞後，再加入H1N1病毒的MDCK細胞存活率測試結果。

第5圖繪示不同濃度/萃取溶液之虎乳靈芝菌絲體活性物質跟H1N1病毒一起處理MDCK細胞後，MDCK的細胞存活率測試結果。

第6圖繪示H1N1病毒先處理MDCK細胞後，再加入不同濃度/萃取溶液之虎乳靈芝菌絲體活性物質，MDCK的細胞存活率測試結果。

TW中華民國       食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心  2018/12/24     930202

Claims (10)

1. 一種虎乳靈芝菌絲體活性物質的用途，其係用於製備抗腸病毒及/或流感病毒之組合物，該虎乳靈芝菌絲體活性物質之製備方法包括下列步驟： （a）取一虎乳靈芝菌絲體（ Lignosus rhinocerusmycelia）於平板培養基上，於15至30℃之溫度下培養1至2周； （b）將步驟（a）培養後之虎乳靈芝菌絲體接種至一燒瓶內，於15至30℃、pH 2至6之環境培養3至14天； （c）將步驟（b）培養後之虎乳靈芝菌絲體接種於一發酵槽內，於15至30℃、pH 2至6之環境下攪拌培養3至21天，形成一虎乳靈芝菌絲體發酵液； （d）將該虎乳靈芝菌絲體發酵液冷凍乾燥後磨粉，形成一虎乳靈芝菌絲體凍乾粉； （e）將該虎乳靈芝菌絲體凍乾粉以至少一溶劑萃取，形成一虎乳靈芝菌絲體萃取液；以及 （f）將該虎乳靈芝菌絲體萃取液乾燥，以獲得該虎乳靈芝菌絲體活性物質。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該腸病毒為71型，或該流感病毒為H1N1型。
3. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中在步驟（e）中，該溶劑係選自水、乙醇、乙酸乙酯或己烷。
4. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中步驟（b）之燒瓶培養為震盪培養，且轉速為110至130 rpm。
5. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中步驟（c）中該發酵槽進一步通入一氣體，該氣體包括空氣、氧氣、二氧化碳、氦氣或其組合，該發酵槽的槽壓為0.5至1.0 kg/cm ²且通氣速率為0.1至1.5 VVM。
6. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該虎乳靈芝菌絲體活性物質包含該虎乳靈芝菌絲體的水萃物、乙醇萃取物、乙酸乙酯萃取物、己烷萃取物或其混合。
7. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物進一步包含藥學上可接受之載劑、賦形劑、稀釋劑、輔劑、填充劑、吸收促進劑、甜味劑或其組合。
8. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物包含一藥品、飼料、飲料、營養補充品、乳製品、食品或保健食品。
9. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該組合物的型態包含粉劑、錠劑、造粒、栓劑、微膠囊、安瓶、液劑噴劑或塞劑。
10. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該虎乳靈芝菌絲體選自寄存於生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 930202的虎乳靈芝菌絲體。

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