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TWI707039B - 人類免疫缺陷病毒抗原、載體、組成物、及其使用方法 - Google Patents

人類免疫缺陷病毒抗原、載體、組成物、及其使用方法 Download PDF

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法蘭克 維格曼
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Abstract

本文描述了合成的HIV包膜蛋白、載體及其組成物，以及用於誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的保護性免疫之方法。編碼該合成的HIV包膜蛋白的病毒表現載體可用於疫苗中以提供針對HIV之改善保護性免疫。

Description

人類免疫缺陷病毒抗原、載體、組成物、及其使用方法
人類免疫缺陷病毒(HIV)影響全世界數百萬人，並且即使在廣泛的抗逆轉錄病毒治療的時代，藉由有效疫苗預防HIV仍然具有非常高的優先順序。HIV-1係該病毒中最常見的並且致病的菌株，其中超過90%的HIV/AIDS病例來源於HIV-1組M的感染。該M組進一步細分為分枝(clade)或亞型。有效疫苗理想地能夠引發強大的細胞應答和廣泛中和性抗體兩者，該等廣泛中和性抗體能夠中和來自不同分枝的HIV-1菌株。
HIV-1的高遺傳變異性使得HIV-1疫苗的開發成為前所未有的挑戰。為了改進潛在T-細胞表位的覆蓋並改善細胞應答，其他人描述並且開發了來源於HIV組抗原(Gag)、聚合酶(Pol)、和包膜蛋白(Env)蛋白的“花葉(mosaic)”HIV-1 Gag、Pol和Env抗原，試圖提供潛在T-細胞表位的最大覆蓋(例如，巴魯什(Barouch)等人，自然醫學(Nat Med)2010，16：319-323)。該等花葉抗原在長度和結構域結構上與野生型，即天然存在的HIV-1抗原相似。
例如，在疫苗中描述並且使用的花葉HIV抗原包括 巴魯什(Barouch)等人(同上)，以及WO 2010/059732中描述的那些，如：(a)Gag花葉抗原，該Gag花葉抗原包括：(a)(i)具有如在本文SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列的第一花葉Gag序列(“mos1Gag”)，以及(a)(ii)具有如在本文SEQ ID NO：2中所示的胺基酸序列的第二花葉Gag序列(“mos2Gag”)；(b)Pol花葉抗原，該Pol花葉抗原包括：(b)(i)具有如在本文SEQ ID NO：3中所示的胺基酸序列的第一花葉Pol序列(“mos1Pol”)，以及(b)(ii)具有如在本文SEQ ID NO：4中所示的胺基酸序列的第二花葉Pol序列(“mos2Pol”)；以及(c)Env花葉抗原，該Env花葉抗原包括：(c)(i)具有如在本文SEQ ID NO：5中所示的胺基酸序列的第一花葉Env序列(“mos1Env”)，以及(c)(ii)具有如在本文SEQ ID NO：6中所示的胺基酸序列的第二花葉Env序列(“mos2Env”)。
將編碼該等抗原的序列選殖在載體，例如，如重組腺病毒載體(例如重組腺病毒血清型26(rAd26))中，並且該等重組載體先前用作疫苗以產生對該等抗原的免疫應答(參見例如巴魯什等人，同上；以及WO 2010/059732)。例如，典型地將 mos1Gag和mos1Pol花葉抗原序列組合到Gag和Pol的融合蛋白(“mos1GagPol”)中，並且將其編碼序列選殖進入第一Ad26載體(“rAd26.mos1GagPol”)中；並且將mos2Gag和mos2Pol抗原序列組合到Gag和Pol的另一個融合蛋白(“mos2GagPol”)中，並且將其編碼序列選殖進入第二Ad26載體(“rAd26.mos2GagPol”)中。典型地將編碼mos1Env和mos2Env的構建體選殖進入分開的Ad26載體(分別為“rAd26.mos1Env”和“rAd26.mos2Env”)中。
一組如上所述的這樣的花葉抗原給出了M組HIV-1分離株的良好的全域覆蓋，其中編碼花葉1抗原序列的rAd26載體(例如，rAd26.mos1GagPol和rAd26.mos1Env)有利於分枝B和CRF01 HIV-1亞型，並且編碼花葉2抗原序列的rAd26載體(例如，rAd26.mos2GagPol和rAd26.mos2Env)有利於分枝C菌株。在rAd26載體中表現的花葉HIV-1 Gag、Pol和Env抗原可以用於提高獼猴中抗原特異性T淋巴細胞應答的寬度和深度，而與共有序列或天然序列HIV-1抗原相比不會損害細胞應答和體液應答的大小(巴魯什等人，同上；以及WO 2010/059732)。
然而，在對上述該等疫苗組分的進一步開發努力後，發現rAd26.mos2Env在非人類靈長動物中顯示出非最佳的細胞表面表現和免疫應答，但是此外與其他rAd26載體(如rAd26.mos1Env)相比，其在製造過程期間顯示出迄今未報告的、意想不到的和不可預測的非最佳遺傳穩定性。因此，包含rAd26.mos2Env的疫苗可以導致針對分枝C HIV-1亞型的非最佳免 疫應答，因為該mos2Env花葉抗原有利於分枝C HIV-1菌株。因此，對於抗HIV的疫苗中的mos2Env抗原的替代物存在需要，該替代物可用於誘導針對HIV-1分枝C的改善的免疫應答。
本發明涉及新穎的合成的人類免疫缺陷病毒(HIV)包膜蛋白，當與先前描述的mos2Env抗原相比時該等包膜蛋白具有改進的細胞表面表現和遺傳穩定性。本發明還涉及以下組成物及方法，該等組成物及方法使用此類新穎的合成的HIV包膜蛋白和/或其編碼序列以誘導抗HIV-1，特別是HIV-1分枝C的增加的免疫應答，較佳的是當該等組成物與其他HIV抗原組合使用時。
在一個概述方面中，本發明涉及一種核酸，該核酸編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的、或具有一個或多個選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)I529P(即，在SEQ ID NO：8的位置529處的Ile取代為Pro)，(ii)K480E(即，在SEQ ID NO：8的位置480處的Lys取代為Glu)，以及(iii)EK479-480RRRR(即，在SEQ ID NO：8的位置479-480處的Glu-Lys被四個連續Arg殘基替換)、I529P、A471C(即，在SEQ ID NO：8的位置471處的Ala取代為Cys)以及T575C(即，在SEQ ID NO：8的位置575處的Thr取代為Cys)的組合。在一個實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白進一步包含信號序列，例如具有選自下組的胺基酸序列的信號序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：9-12。在一個實施方式中，該信號序列具有SEQ ID NO：9的胺基酸序列。
在某些實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白進一步包括跨膜結構域，較佳的是具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的跨膜結構域。
在某些實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白進一步包括細胞質結構域的片段，較佳的是包括SEQ ID NO：14的胺基酸序列、或其胺基酸1-4(即，NRVR)的細胞質結構域的片段。在其中該合成的HIV包膜蛋白進一步包括跨膜結構域和細胞質結構域的片段的實施方式中，較佳的是該蛋白還包括被融合到SEQ ID NO：8的羧基-末端(C-末端)和該跨膜區域的胺基-末端(N-末端)的SEQ ID NO：37的胺基酸序列。
在另一個實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白包括三聚結構域，例如，包括SEQ ID NO：15(GCN4)或SEQ ID NO：16(foldon結構域)的胺基酸序列的三聚結構域。在一個較佳的實施方式中，該三聚結構域包括SEQ ID NO：15的胺基酸序列。具有三聚結構域的該等實施方式對於基於本文提供的胞外結構域序列(如包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的胞外結構域序列)的可溶性(即，非膜結合的)的合成的HIV包膜蛋白係有用的，其中該三聚結構域位於該合成的HIV包膜蛋白的C-末端。
在又其他的實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白包括具有以下突變：EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的SEQ ID NO：8。6個連續精胺酸殘基(SEQ ID NO：8的天然序列中的位置478和481已經是Arg殘基)的引入產生另外的優化的弗林蛋白酶(furin)切割位點，從而獲得改進的加工的(即切割的)胞外結 構域。I529P、A471C和T575C這三種突變被稱為SOSIP突變，其中最後兩個突變導致在新產生的半胱胺酸殘基之間引入可能的二硫鍵。總的來說，該等突變導致可溶性的、三聚的、合成的HIV包膜蛋白，而不需要三聚結構域。
在一個較佳的實施方式中，本發明涉及一種核酸，該核酸編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包括SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18的胺基酸序列，或SEQ ID NO：19的aa 1-686。最較佳的是，由該核酸編碼的該合成的HIV包膜蛋白包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列或由SEQ ID NO：18的胺基酸序列組成。
在另一概述方面中，本發明涉及一種載體，該載體包括編碼根據本發明的實施方式的合成的HIV包膜蛋白的核酸。在一個實施方式中，該載體係病毒載體。在一個較佳的實施方式中，該病毒載體係腺病毒載體。在一個較佳的實施方式中，該腺病毒載體係腺病毒26載體。
本發明的另一個概述方面涉及一種組成物，較佳的是疫苗組成物，所述組成物包含免疫原性(immunogenically)有效量的根據本發明的實施方式之載體(vector)、和運載體(carrier)，其中編碼該合成的HIV包膜蛋白的核酸可操作地連接至啟動子序列。在一個實施方式中，該組成物包含腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白。
在另一概述方面中，本發明涉及一種用於在對其有 需要的受試者體內誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之疫苗組合。該疫苗組合包括第一組成物，該第一組成物包括免疫原性有效量的載體，較佳的是腺病毒載體，更較佳的是腺病毒26載體，該載體編碼具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白；第二組成物，該第二組成物包括免疫原性有效量的第二載體，較佳的是第二腺病毒載體，更較佳的是第二腺病毒26載體，該第二腺病毒載體編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的HIV抗原性多肽；以及視情況至少一種另外的組成物，該另外的組成物包括免疫有效量的至少一種選自由以下各項組成的組：一種載體，該載體編碼具有選自由SEQ ID NO：1-4、28和29組成之群組的胺基酸序列的抗原性多肽，和包含免疫原性有效量的分離的HIV抗原性多肽的多肽，該分離的HIV抗原性多肽包括但不限於具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708的多肽或具有SEQ ID NO：36的殘基30-724的多肽，其中該第一組成物、第二組成物和視情況另外的組成物係存在於同一組成物或一種或多種不同組成物中。
本發明的又另一個概述方面涉及在對其有需要的受試者體內誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之方法，該等方法包括向該受試者給予根據本發明的實施方式之組成物或疫苗組合。本發明還涉及誘導針對HIV的免疫應答的多種方法，該等方法包括使用根據本發明的實施方式之組成物或疫苗組合來引發並增強該免疫應答。
本發明的又另外的方面涉及一種合成的HIV包膜蛋 白，該合成的HIV包膜蛋白包括SEQ ID NO：8的、或具有一個或多個選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)I529P，(ii)K480E，(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合。在一個實施方式中，該等合成的HIV包膜蛋白包括具有EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的突變的SEQ ID NO：8。在另一個實施方式中，該等合成的HIV包膜蛋白包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列的殘基30-704或30-711。在又另一個實施方式中，該等合成的HIV包膜蛋白包括SEQ ID NO：19的胺基酸序列的殘基30-686。
本發明的另一方面涉及一種細胞，較佳的是分離的細胞，該細胞包括根據本發明的實施方式之載體。
【發明詳述】
在背景和整個說明書中引用或描述了各種出版物、文章和專利；該等參考文獻中的每一篇均藉由引用以其整體結合在此。包括在本說明書中的文件、法案、材料、裝置、物品或類似物的討論用於提供本發明背景之目的。這種討論不承認任何或 所有該等事項形成關於所揭露或要求保護的任何發明的先前技術的一部分。
除非另外指明，本文所用的所有科學技術術語具有如熟習該項技術者通常理解的相同含義。否則，本文使用的某些術語具有如說明書中示出的含義。本文引用的所有專利、公開專利申請和出版物如同完全列出一樣藉由引用結合在此。必須注意，除非上下文另外明確指示，否則如在此和所附申請專利範圍中所使用，單數形式“一/一個/一種(a/an)”和“該”包括複數指示物。
如在此所使用，“受試者”係指將向其給予或已經給予根據本發明的實施方式的載體、組成物或組合疫苗的任何動物，較佳的是哺乳動物，最較佳的是人類。如在此所用的術語“哺乳動物”涵蓋任何哺乳動物。哺乳動物的實例包括但不限於牛、馬、羊、豬、貓、狗、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴、人等，更較佳的是人。
本發明總體上涉及合成的HIV包膜蛋白、編碼該等合成的HIV的包膜蛋白的核酸和載體、以及用編碼該等合成的HIV的包膜蛋白的載體或該等合成的HIV的包膜蛋白單獨地或與一種或多種另外的編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽的載體組合地，和/或與一種或多種另外的分離的HIV抗原性多肽組合地誘導針對HIV的免疫應答之方法。
人類免疫缺陷病毒(HIV)係慢病毒屬(Lentivirinae)之成員，其係逆轉錄病毒科(Retroviridae)的一部分。兩種HIV 感染人類：HIV-1和HIV-2。HIV-1係最常見的HIV病毒的菌株，並且已知比HIV-2更致病。如在此所使用，術語“人類免疫缺陷病毒”和“HIV”係指但不限於HIV-1和HIV-2。
HIV被分類為具有高度遺傳趨異的多個分枝。如在此所使用，術語“HIV分枝”或“HIV亞型”係指根據它們的遺傳相似性程度進行分類的相關人類免疫缺陷病毒。目前存在三組HIV-1分離株：M、N和O。M組(主要菌株)由至少從A至J的十個分枝組成。O組(外部菌株)可以由相似數目的分枝組成。N組係未分類於M或O組中的新HIV-1分離株。
如在此所使用，術語“HIV抗原性多肽”、“HIV抗原蛋白”、和“HIV免疫原”係指能夠在受試者中誘導針對HIV的免疫應答，例如體液和/或細胞介導的應答的多肽。該抗原性多肽可以是HIV的蛋白質、其片段或表位、或其多個HIV蛋白或部分的組合，其可以在受試者中誘導針對HIV的免疫應答或產生免疫，例如保護性免疫。
較佳的是，抗原性多肽能夠在宿主中產生保護性免疫應答，例如誘導針對病毒性疾病或感染的免疫應答，和/或在受試者中產生針對病毒性疾病或感染的免疫(即接種)，其保護受試者免受病毒性疾病或感染。例如，該抗原性多肽可以包含來自猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或HIV的蛋白或其片段，如HIV或SIV包膜gp160蛋白，HIV或SIV基質/衣殼蛋白，以及HIV或SIV gag、pol和env基因產物。
HIV抗原性多肽可以是任何HIV-1或HIV-2抗原或其 片段。HIV抗原的實例包括但不限於gag、pol、和env基因產物，該等基因產物編碼結構蛋白和必需酶。Gag、pol、和env基因產物被合成為多蛋白，該等多蛋白被進一步加工成多個其他蛋白產物。該gag基因的初級蛋白產物係病毒結構蛋白gag多蛋白，其被進一步加工成MA、CA、SP1、NC、SP2以及P6蛋白產物。該pol基因編碼病毒酶(Pol，聚合酶)，並且該初級蛋白產物被進一步加工成RT、RNA酶H、IN、以及PR蛋白產物。該env基因編碼結構蛋白，尤其病毒體包膜的糖蛋白。該env基因的初級蛋白產物係gp160，gp160被進一步加工成gp120和gp41。HIV抗原的其他實例包括基因調節蛋白Tat和Rev；輔助蛋白Nef、Vpr、Vif和Vpu；衣殼蛋白、核衣殼蛋白、以及p24病毒蛋白。
在某些實施方式中，該HIV抗原性多肽包括HIV Gag、Env、或Pol抗原、或任何抗原部分或其表位或組合，較佳的是HIV-1 Gag、Env、或Pol抗原或任何抗原部分或其表位或組合。
HIV抗原性多肽還可以是花葉HIV抗原。如在此所使用，“花葉抗原”係指自天然序列的片段組裝的重組蛋白。花葉抗原類似於天然抗原，但被優化以最大化在天然序列中發現的潛在T細胞表位的覆蓋，這提高了免疫應答的寬度和覆蓋。用於本發明的花葉HIV抗原較佳的是花葉Gag、Pol、和/或Env抗原，並且更較佳的是花葉HIV-1 Gag、Pol/和/或Env抗原。如在此所使用，“花葉HIV Gag、Pol、和/或Env抗原”尤其是指包含來源於HIV的一個或多個Gag、Pol和/或Env多蛋白序列的多個表位的花葉抗原。
在一個實施方式中，用於本發明的花葉HIV抗原係 具有來源於gag基因產物的序列的表位之花葉HIV Gag抗原(SEQ ID NO：1、2中提供了實例)；係具有來源於pol基因產物的序列的表位之花葉HIV Pol抗原(SEQ ID NO：3、4中提供了實例)；或係具有來源於env基因產物的序列的表位之花葉HIV Env抗原(SEQ ID NO：5、6中提供了實例；還有例如在SEQ ID N：8、17、18、19中的本發明的新穎抗原可以被認為是花葉HIV Env抗原)。在某些實施方式中，用於本發明的花葉HIV抗原可以包括來源於gag、pol、和/或env基因產物的表位的組合。說明性的和非限制的實例包括具有來源於env和pol基因產物的序列的表位的花葉Env-Pol抗原；具有來源於gag和pol基因產物的序列的表位的花葉Gag-Pol抗原；以及具有來源於gag和env基因產物的序列的表位的花葉Gag-Env抗原。gag、pol、和env基因產物的序列可以來源於一種或多種分枝。
可以用於本發明中的花葉HIV Gag、Pol和/或Env抗原的實例包括描述於例如US 20120076812；巴魯什等人，自然醫學(Nat Med)2010，16：319-323；以及巴魯什等人，細胞(Cell)155：1-9，2013中的那些，所有該等文獻都以其整體藉由引用結合在此。較佳的是，用於本發明的花葉HIV Gag、Pol、和/或Env抗原包括但不限於mos1Gag(SEQ ID NO：1)、mos2Gag(SEQ ID NO：2)、mos1Pol(SEQ ID NO：3)、mos2Pol(SEQ ID NO：4)、mos1Env(SEQ ID NO：5)、mos2Env(SEQ ID NO：6)、mos1GagPol(SEQ ID NO：28)、mos2GagPol(SEQ ID NO：29)、以及其組合。
如本文所使用，術語“HIV包膜蛋白”、“env蛋 白”、和“Env”各自係指在HIV病毒體的包膜上表現，並且使得HIV靶向並附著於HIV感染的細胞的質膜上的蛋白質或其片段或衍生物，該等蛋白質或片段或衍生物可以在對其有需要的受試者中誘導針對HIV的免疫應答或產生針對HIV的免疫。該HIV env基因編碼先質蛋白gp160，該先質蛋白gp160被蛋白質裂解地切割成兩種成熟的包膜糖蛋白，即gp120和gp41。該切割反應由宿主細胞蛋白酶(弗林蛋白酶)在逆轉錄病毒包膜糖蛋白先質中的高度保守的序列處介導。更具體地，gp160三聚化為(gp160)3，並且然後經歷切割成為兩個非共價締合的gp120和gp41。病毒進入隨後由gp120/gp41異源二聚體的三聚體介導。Gp120係受體結合片段，並且結合到靶細胞上的CD4受體上，該靶細胞具有這樣的受體如，例如T-輔助細胞。非共價結合至gp120的Gp41係融合片段並且提供HIV進入細胞的第二步驟。Gp41最初埋在該病毒包膜內，但當gp120與CD4受體結合時，gp120改變其構象，從而導致gp41暴露，其中它可以幫助與宿主細胞融合。Gp140係三聚gp160，即(gp160)3的未切除的胞外結構域，其被用作天然狀態的切割的病毒刺突的替代物。
根據本發明的實施方式，“HIV包膜蛋白”可以是gp160、gp140、gp120、gp41蛋白，其組合，融合物，截短物或衍生物。例如，“HIV包膜蛋白”可以包括與gp41蛋白非共價締合的gp120蛋白。它還可以包括穩定的三聚gp140蛋白，該三聚gp140蛋白可以具有或可以被修飾以包括三聚結構域，該三聚結構域穩定gp140的三聚體。三聚結構域的實例包括但不限於T4-fibritin“foldon”三聚結構域；來源於GCN4的捲曲螺旋三聚結構域；以 及作為三聚體標籤的大腸桿菌天冬胺酸轉胺甲醯酶的催化亞基。“HIV包膜蛋白”還可以是截短的HIV包膜蛋白，該截短的HIV包膜蛋白包括但不局限於包含在胞外結構域(即，延伸至細胞外空間的結構域)中的C-末端截短、在gp41中的截短物(如在gp41的跨膜結構域中的截短物，或在gp41的細胞質結構域中的截短物)的包膜蛋白。“HIV包膜蛋白”可以進一步係天然存在的HIV包膜蛋白的衍生物，該HIV包膜蛋白的衍生物具有例如在弗林蛋白酶切割位點中的序列突變、和/或所謂的SOSIP突變。
較佳的是，“HIV包膜蛋白”係“合成的HIV包膜蛋白。”如在此所使用，術語“合成的HIV包膜蛋白”係指非天然存在的HIV包膜蛋白，其在對其有需要的受試者中針對一種或多種天然存在的HIV菌株誘導免疫應答或產生免疫。花葉HIV Env蛋白係合成的HIV Env蛋白的實例，並且本發明提供了新穎的合成的HIV Env抗原，例如包含SEQ ID NO：8、17、18、或19的那些。
合成的HIV包膜蛋白及其編碼序列
本發明的實施方式涉及新穎的合成的HIV包膜蛋白和編碼該等的核酸分子。
在一個實施方式中，本發明涉及合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的、或具有一種或多種選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)I529P，(ii)K480E，以及(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合。SEQ ID NO：8包括合成的成熟gp120和合成的截短gp41，該合成的截短gp41不具有跨膜區域，也不具有細 胞質結構域。SEQ ID NO：8係非天然存在的序列，其包含來自該mos2Env花葉抗原(SEQ ID NO：6)的序列和其他HIV包膜蛋白序列的嵌合體。包含SEQ ID NO：8的新穎的合成的Env抗原的序列被優化以提供針對HIV分枝C的廣泛覆蓋和增強的T-細胞應答(當與該mos2Env抗原(SEQ ID NO：6)相比時)。在某些實施方式中，另外的胺基酸可以添加至SEQ ID NO：8中或本文所定義的它的變體之一中。
在某些實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白進一步包括信號序列。該合成的HIV包膜蛋白使用信號序列合成，所述信號序列在其轉運到內質網(ER)的腔內期間從新生多肽鏈切割。原則上，可以使用任何已知的信號序列。較佳的是使用HIV Env信號序列或其變體。本領域中已經使用針對HIV Env蛋白的不同信號序列(參見例如，WO 2014/107744)。在某些實施方式中，該信號序列包括SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12。在一個較佳的實施方式中，該信號序列包括SEQ ID NO：9。
在某些實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白進一步包括跨膜結構域。該跨膜結構域將合成的HIV包膜蛋白錨定到該ER膜上，並且有助於膜組裝和HIV包膜的功能。較佳的是，該跨膜結構域包括SEQ ID NO：13。
在另一個實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白包括具有截短的細胞質結構域的gp41。該gp41在其羧基末端具有異常長的細胞質結構域，通常約150個胺基酸(愛德華茲(Edwards) 等人，病毒學雜誌(J.Virology)，2002，76：2683-2691)。據報導該細胞質結構域的截短誘導HIV-1 Env蛋白的胞外結構域中的保守區域的暴露(Id.)。本發明的合成的HIV包膜中的截短的細胞質結構域可以在從一個至約140個胺基酸的範圍內，如全長細胞質結構域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、或140個胺基酸。在某些實施方式中，藉由給定的胺基酸直到C-末端之後的截短，該截短的細胞質結構域來源於SEQ ID NO：17的胺基酸704-862(即，來源於本發明的C4分子的細胞質結構域)。在一個較佳的實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白包括截短的細胞質結構域，該截短的細胞質結構域具有HIV gp41細胞質結構域的1至10個胺基酸殘基，更較佳的是4至8個胺基酸殘基，並且最較佳的是7個胺基酸殘基。合成的HIV包膜蛋白的細胞質結構域或其片段位於該細胞外結構域(細胞外結構域(ectodomain))的C-末端，並且當該合成的HIV包膜蛋白還包括跨膜結構域時，該細胞質結構域或其片段位於該跨膜結構域的C-末端。參見，例如，圖1A和1C。在一個特定實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白包括具有截短的細胞質結構域的gp41，該截短的細胞質結構域具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列或其片段，如其殘基1-4(即NRVR)。已經描述了並且可使用其他截短的細胞質結構域(例如Schiernle等人，美國科學院院刊(PNAS)，1997；亞伯拉罕(Abrahamyan)等人，病毒學雜誌(J Virol)2005)。
在其中該合成的HIV包膜蛋白進一步包括跨膜結構域和細胞質結構域的片段的實施方式中，較佳的是該蛋白還包括SEQ ID NO：37的胺基酸序列，該SEQ ID NO：37包含SEQ ID NO： 18的殘基655-682，其中SEQ ID NO：37的胺基酸序列被融合到SEQ ID NO：8的C-末端和該跨膜結構域的N-末端。
在本發明的一個特別較佳的實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白進一步包括跨膜結構域，例如具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的那些和截短的細胞質結構域或細胞質結構域的片段例如具有SEQ ID NO：14的胺基酸序列或SEQ ID NO：14的殘基1-4(即，NRVR)的那些。最較佳的是，該合成的HIV包膜蛋白包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列，具有或沒有信號序列(即，SEQ ID NO：18的胺基酸殘基1-29)或由其組成。
在另一個實施方式中，該合成的HIV包膜蛋白包括替代Env跨膜區域的三聚結構域。該三聚結構域增加了Env三聚結構的穩定性。較佳的是，該合成的HIV包膜蛋白包括gp140多肽，該gp140多肽被修飾以包括穩定gp140的三聚體的三聚結構域。三聚結構域的實例包括但不限於T4-fibritin“foldon”三聚結構域，如包含SEQ ID：16的胺基酸序列的那些；來源於GCN4的捲曲螺旋三聚結構域，如包含SEQ ID：15的胺基酸序列的那些；作為三聚體標籤的大腸桿菌天冬胺酸轉胺甲醯酶的催化亞基；或基於軟骨基質蛋白的三聚基序。如果存在時，該三聚結構域通常位於該細胞外結構域的C-末端(參見圖1B)。在某些較佳的實施方式中，其中該合成的HIV包膜蛋白包括三聚結構域，該合成的HIV包膜蛋白包括SEQ ID NO：19的胺基酸序列，具有或沒有信號序列(即，SEQ ID NO：19的胺基酸殘基1-29)。具有三聚結構域的該等實施方式主要用於該合成的HIV包膜蛋白的可溶性胞外結構域變體。在本發明的 此類可溶性變體的某些實施方式中，有可能對該弗林蛋白酶切割位點進行突變(例如在SEQ ID NO：8的位置480處的Lys突變為Glu)以使這個切割位點失活，從而使得該蛋白質將是一條單鏈；它與三聚結構域，尤其是與SEQ ID NO：19的GCN4三聚結構域良好地結合。
不使用三聚結構域的該合成的HIV包膜蛋白的此類可溶性細胞外結構域的可替代版本也是本發明的實施方式，並且可以藉由將優化該弗林蛋白酶切割位點的突變(在位置479-480處的Gly-Lys二肽被四個Arg殘基替換)以及所謂的SOSIP突變(在位置529處的I>P突變，並且在位置471和575之間藉由置換在SEQ ID NO：8中各自具有Cys殘基的那些位置上的相應Ala和Thr而引入二硫鍵)進行合併來從SEQ ID NO：8製備。這產生一種蛋白質，該蛋白質具有以下突變的組合的SEQ ID NO：8的胺基酸序列：EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C。
進一步增加本發明的合成的HIV包膜蛋白(包含SEQ ID NO：8)的三聚體含量的一可能的修飾係位置529處的Ile到Pro的修飾。這對於可溶性變體和膜結合變體兩者都可以是有效的。
載體
本發明的另一個概述方面涉及包含編碼合成的HIV包膜蛋白的核酸的載體。根據本發明的實施方式，該等載體可以包含本文所述的任何合成的HIV包膜蛋白。在本發明的一較佳的實施方式中，該載體包含編碼以下合成的HIV包膜蛋白的核酸，該HIV包膜蛋白包括SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、 或SEQ ID NO：19的胺基酸序列，並且更較佳的是SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
根據本發明的實施方式，編碼該合成的HIV包膜蛋白的核酸可操作地連接至啟動子，這意味著該核酸在啟動子的控制下。該啟動子可以是同源啟動子(即，來源於相同的作為載體的遺傳來源)或異源啟動子(即，來源於不同載體或遺傳來源)。適合的啟動子的實例包括巨細胞病毒(CMV)啟動子和勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子。較佳的是，該啟動子位於表現盒內的核酸的上游。可以可操作地連接至編碼該合成的HIV包膜蛋白的核酸的示例性CMV啟動子序列示於SEQ ID NO：24中。
根據本發明的實施方式，載體可以是表現載體。表現載體包括但不限於用於重組蛋白表現的載體和用於將核酸遞送至受試者中用於在該受試者的組織中表現的載體，例如病毒載體。適合用於本發明的病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、痘病毒載體、MVA載體、腸系病毒載體、委內瑞拉馬腦炎病毒載體、塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus vector)載體、菸草花葉病毒載體、慢病毒載體等。該載體還可以是非病毒載體。非病毒載體的實例包括但不限於質粒、細菌人工染色體、酵母人工染色體、噬菌體等。
在本發明的某些實施方式中，該載體係腺病毒載體。根據本發明的腺病毒屬於腺病毒科，並且較佳的是屬於哺乳動物腺病毒(Mastadenovirus)屬的一種。它可以是人類腺病毒，但還可以是感染其他物種的腺病毒，包括但不限於牛腺病毒(例 如牛腺病毒3、BAdV3)、犬腺病毒(例如CAdV2)、豬腺病毒(例如PAdV3或PAdV5)、或猿猴腺病毒(其包括猴腺病毒和猿腺病毒，如黑猩猩腺病毒或大猩猩腺病毒)。較佳的是，該腺病毒係人類腺病毒(HAdV、或AdHu)、或猿猴腺病毒如黑猩猩或大猩猩腺病毒(ChAd、AdCh、或SAdV)。在本發明中，人類腺病毒係指如果稱為Ad而不指明物種，例如該簡短符號“Ad26”表示與HadV26相同，該HadV26係人腺病毒血清型26。還如在此所使用的，符號“rAd”係指重組腺病毒，例如，“rAd26”係指重組人類腺病毒26。
已使用人腺病毒進行大多數高級研究，並且根據本發明的某些方面，人腺病毒係較佳的。在某些較佳的實施方式中，根據本發明的重組腺病毒係基於人腺病毒。在較佳的實施方式中，該重組腺病毒基於人腺病毒血清型5、11、26、34、35、48、49、50、52等。根據本發明的一特別較佳的實施方式，腺病毒係人腺病毒血清型26。這種血清型的優點係在人群體中的低血清陽性率和/或低預先存在的中和抗體效價，以及在臨床試驗中用於人類受試者的經驗。
猿猴腺病毒總體上也具有在人群體中的低血清陽性率和/或低預先存在的中和抗體效價，並且已經報導了大量使用黑猩猩腺病毒載體的工作(例如，US 6083716；WO 2005/071093；WO 2010/086189；WO 2010085984；法裡納(Farina)等人，2001，病毒學雜誌(J Virol)75：11603-13[13]；科恩(Cohen)等人，2002，普通病毒學雜誌(J Gen Virol)83：151-55[69]；科賓格(Kobinger) 等人，2006，病毒學(Virology)346：394-401[70]；Tatsis等人，2007，分子治療(Molecular Therapy)15：608-17[71]；還參見由Bangari和Mittal，2006，疫苗(Vaccine)24：849-62[72]的綜述；以及由拉莎諾(Lasaro)和埃特爾(Ertl)，2009，分子治療(Mol Ther)17：1333-39[73]的綜述)。因此，在其他的實施方式中，根據本發明的重組腺病毒係基於猿猴腺病毒，例如黑猩猩腺病毒。在某些實施方式中，該重組腺病毒係基於猿猴腺病毒類型1、7、8、21、22、23、24、25、26、27.1、28.1、29、30、31.1、32、33、34、35.1、36、37.2、39、40.1、41.1、42.1、43、44、45、46、48、49、50或SA7P。
較佳的是，該腺病毒載體係複製缺陷型重組病毒載體，如rAd26、rAd35、rAd48、rAd5HVR48等。
在本發明的一個較佳的實施方式中，該等腺病毒載體包括來自罕見血清型的衣殼蛋白，包括Ad26。在典型實施方式中，該載體係rAd26病毒。“腺病毒衣殼蛋白”係指在腺病毒(例如，Ad26、Ad35、rAd48、rAd5HVR48載體)的衣殼上的蛋白質，該腺病毒衣殼蛋白參與確定特定的腺病毒的血清型和/或趨向性。腺病毒衣殼蛋白典型地包括纖維、五鄰體蛋白和/或六鄰體蛋白。如在此所使用的用於特定腺病毒的“衣殼蛋白”(如“Ad26衣殼蛋白”)可以是例如包括至少一部分Ad26衣殼蛋白的嵌合的衣殼蛋白。在某些實施方式中，該衣殼蛋白係Ad26的整個衣殼蛋白。在某些實施方式中，該六鄰體、五鄰體和纖維都是Ad26的。
熟習該項技術者將認識到來源於多個血清型的元件 可以被組合在單一的重組腺病毒載體中。因此，可以產生組合了來自不同血清型的所希望性質的嵌合腺病毒。因此，在一些實施方式中，本發明的嵌合腺病毒可以將第一血清型的預先存在的免疫性的缺失與以下特徵相結合：如溫度穩定性、組裝、錨定、產量、重定向或改善的感染、靶細胞中DNA的穩定性等。
在某些實施方式中，本發明中有用的重組腺病毒載體主要或完全來源於Ad26(即，該載體係rAd26)。在某些實施方式中，該腺病毒係複製缺陷的，例如，因為它包含基因組的E1區域中的缺失。對於來源於非類群C的腺病毒(如Ad26或Ad35)的腺病毒，典型地是將腺病毒的E4-orf6編碼序列與人類亞群C(如Ad5)的腺病毒的E4-orf6交換。這允許在表現Ad5的E1基因的熟知的補充細胞系中此類腺病毒的繁殖，如例如293細胞或PER.C6細胞等(參見，例如哈文格(Havenga)等人，2006，普通病毒學雜誌(J Gen Virol)87：2135-43；WO 03/104467)。然而，這樣的腺病毒將不能在不表現Ad5的E1基因的非補充細胞中複製。
重組腺病毒載體的製備在本領域中是熟知的。例如在WO 2007/104792中和在阿賓克(Abbink)等人，(2007)病毒學(Virol)81(9)：4654-63中描述了rAd26載體的製備。Ad26的示例性基因組序列發現於GenBank登錄號EF 153474中和WO 2007/104792的SEQ ID NO：1中。用於本發明的載體的實例例如包括描述於WO 2012/082918中的那些，將其揭露內容以其整體藉由引用結合在此。
典型地，使用一核酸來產生本發明中有用的載體， 該核酸包括整個重組腺病毒基因組(例如，質粒、粘粒、或桿狀病毒載體)。因此，本發明還提供了分離的核酸分子，該等分離的核酸分子編碼本發明的該等腺病毒載體。本發明的該等核酸分子可以處於RNA形式或處於藉由選殖獲得或合成產生的DNA形式。該DNA可以是雙股或單股的。
本發明中有用的該等腺病毒載體典型地是複製缺陷的。在該等實施方式中，該病毒藉由使對病毒複製關鍵的區域(例如E1區域)缺失或失活而變得複製缺陷。可以藉由在所述區域內例如插入感興趣的基因，如編碼合成的HIV包膜蛋白的基因(通常連接至啟動子)，或編碼HIV抗原性多肽的基因(通常連接至啟動子)來使該等區域基本上缺失或失活。在一些實施方式中，本發明的該等載體可以包含其他區域如E2、E3或E4區域中的缺失，或該等區域中的一個或多個內的連接至啟動子的異源基因的插入。對於E2-和/或E4-突變的腺病毒，一般使用E2-和/或E4補充細胞系來產生重組腺病毒。該腺病毒的E3區域中的突變不需要被細胞系補充，因為對於複製E3係需要的。
通常使用包裝細胞系來生產足夠量的用於在本發明中使用的腺病毒載體。包裝細胞係包含在複製缺陷型載體中缺失或失活的那些基因的細胞，因此允許了該病毒在該細胞中複製。適合用於在該E1區域具有缺失的腺病毒的包裝細胞系包括，例如，PER.C6、911、293、以及E1 A549。
根據本發明的實施方式，並且如以上所指出的，本文所述的任何合成的HIV包膜蛋白可以在本發明的該等載體中表 現。鑒於遺傳密碼的簡並性，技術人員將充分意識到可以根據本領域中完全常規的方法來設計編碼相同蛋白質的若干種核酸序列。編碼該合成的HIV包膜蛋白的核酸可以視情況是密碼子優化的，以確保在所治療的宿主(例如，人類)中的適當的表現。密碼子優化係廣泛應用於本領域中的技術。SEQ ID NO：25、26和27中提供了一些編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的序列的非限制性實例。典型地，編碼該合成的HIV包膜蛋白的核酸被選殖入該腺病毒基因組的E1和/或E3區域。
在本發明的一個較佳的實施方式中，該載體係腺病毒載體，並且更較佳的是rAd26載體，最較佳的是在該腺病毒基因組的E1區域內具有至少一個缺失的rAd26載體，例如如在阿賓克(Abbink)，病毒學雜誌(J Virol)，2007.81(9)：第4654-63頁中描述的，將其藉由引用結合在此。
本發明還提供了細胞，較佳的是包含本文所述的任何載體的分離的細胞。該等細胞可以用於生產重組蛋白質，或用於生產病毒顆粒。
因此，本發明的實施方式還涉及製造合成的HIV抗原性多肽的方法。該方法包括用表現載體轉染宿主細胞，所述表現載體包含可操作地連接至啟動子的編碼該合成的HIV抗原性多肽的核酸；在適合於表現該合成的HIV抗原性多肽的條件下培養該轉染的細胞，並從該細胞分離該合成的HIV抗原性多肽。可以藉由本領域中已知的任何方法(包括親和層析等)從該細胞中分離或收集該合成的HIV抗原性多肽。鑒於本揭露，用於重組蛋白表現的 技術將是熟習該項技術者所熟知的。
本發明還包括用於生產編碼本發明的合成的HIV抗原性多肽的載體的方法，該方法包括培養包含該載體的細胞以在所述培養期間繁殖和增殖該載體，並從該細胞培養物(例如，從細胞、從培養基或兩者)中分離編碼本發明的合成的HIV抗原性多肽的載體。可以根據本領域已知的方法進一步純化該載體。
在某些實施方式中，本發明提供了根據本發明的實施方式的載體，該載體包含編碼合成的HIV抗原性多肽的核酸，並且在某些示例性實施方式中，該核酸具有選自下組的核苷酸序列，該組以下各項組成：SEQ ID NO：25、26和27。
組成物
在另一個概述方面中，本發明涉及包含一種載體和一種運載體的組成物，該載體包含編碼合成的HIV包膜蛋白的核酸。根據本發明的實施方式，本文所述的任何載體可以包括在該組成物中。較佳的是，該載體係病毒載體，更較佳的是腺病毒載體，並且甚至更較佳的是腺病毒26載體。在一較佳的實施方式中，組成物包含腺病毒載體，較佳的是編碼合成的HIV包膜蛋白的腺病毒26載體，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：18、或SEQ ID NO：19的胺基酸序列，並且更較佳的是SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
在一個方面，本發明提供了包含一種或多種載體的組合疫苗，該等載體一起包含編碼以下各項的核酸序列：(i)合成 的HIV包膜蛋白，其包含SEQ ID NO：8(例如SEQ ID NO：18或19)的胺基酸序列，和(ii)第二HIV包膜蛋白，其包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。該等載體可以各自在單獨的組成物中，或可被結合在單一的組成物中。旨在向一個受試者給予在一個或多個載體中的這兩種核酸，這將導致對HIV的免疫應答，其比給予任一單獨的載體時將獲得的免疫應答更廣泛。這兩種核酸序列還可以存在於一個單一的載體上。
根據本發明的實施方式，組成物包含免疫原性有效量的載體，如病毒載體。如在此所使用的，“免疫原性有效量”或“免疫有效量”係指足以在對其有需要的受試者中誘導所需免疫效應或免疫應答的組成物的量。在一個實施方式中，免疫原性有效量係指足以在對其有需要的受試者中誘導免疫應答的量。在另一個實施方式中，免疫原性有效量係指足以在對其有需要的受試者中產生免疫，例如，提供對抗疾病例如病毒感染的保護效應的量。免疫原性有效量可以根據多種因素而變化，諸如受試者的身體狀況、年齡、體重、健康等；具體應用，是否誘導免疫應答或提供保護性免疫；給予的特定重組載體；由所給予的重組載體編碼的免疫原或抗原性多肽；給予的特異性抗原性多肽；以及需要免疫的具體疾病，例如病毒感染。考慮到本揭露，藉由熟習該項技術者可以容易地確定免疫原性有效量。
作為一般指導，當參考重組病毒載體如腺病毒載體使用時，免疫原性有效量可以在從約108個病毒顆粒至約1012個病毒顆粒，例如108、109、1010、1011、或1012個病毒顆粒的範圍內。 免疫原性有效量可以以單一組成物或多個組成物，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個組成物(例如，片劑，膠囊或注射劑)給予，其中所述多個膠囊或注射劑的給予共同以免疫有效量提供給受試者。一般而言，當參考多肽(如分離的抗原性多肽)使用時，免疫原性有效量可以在從例如約0.3至約3000微克(μg)的範圍內，例如1-1000μg，例如10-500μg，例如約10、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500μg。作為非限制性實例，有可能將編碼本發明的合成的HIV Env抗原(具有SEQ ID NO：8)的載體的給予與Env多肽，例如250μg的具有SEQ ID NO：7的胺基酸30-708的HIV分枝C Env三聚體蛋白的給予進行合併。在所謂的初免-加強方案中，還有可能向受試者給予免疫原性有效量，並且隨後向同一受試者給予另一劑量的免疫原性有效量。初免-加強方案的一般概念係疫苗領域的技術人員熟知的。如果需要，可以視情況向該方案中加入另外的加強給予。
本發明的組成物進一步包括運載體。運載體可以包括一種或多種藥學上可接受的賦形劑，如粘合劑、崩散劑、蓬鬆劑、助懸劑、乳化劑、潤濕劑、潤滑劑、調味劑、甜味劑、防腐劑、染料、增溶劑以及塗層。該運載體或其他物質的確切性質可以取決於給藥途徑，例如肌內、皮下、口服、靜脈內、皮膚、粘膜內(例如，腸)、鼻內或腹膜內途徑。對於液體可注射製劑(例如，懸浮液和溶液)，適合的運載體和添加劑包括水、乙二醇、油、醇、防腐劑、著色劑等。對於固體口服製劑(例如散劑、膠囊、囊片、軟膠囊和片劑)，適合的運載體和添加劑包括澱粉、糖、稀釋劑、粒化劑、潤滑劑、粘合劑、崩散劑等。對於鼻噴霧劑/吸入 劑混合物，該水性溶液/懸浮液可以包括作為適合的運載體和添加劑的水、乙二醇、油、軟化劑、穩定劑、潤濕劑、防腐劑、芳香劑、調味劑等。
本發明的組成物可以配製成適合於給予受試者以便於給予並改善功效的任何物質，包括但不限於口服(腸內)給予和腸胃外注射。腸胃外注射包括靜脈內注射或輸注、動脈內注射、皮下注射、肌內注射以及關節內注射。還可以配製本發明的組成物用於其他給藥途徑，包括經粘膜、眼、直腸、長效植入、舌下給藥、舌下、從口腔粘膜繞過門脈循環、吸入或鼻內。
根據本發明的某些實施方式中，組成物包含免疫原性有效量的純化的或部分純化的腺病毒載體(如腺病毒26載體)，該腺病毒載體包含編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的核酸。所述組成物可以根據本領域熟知的方法被配製成疫苗(也稱為“免疫原性組成物”)。
本發明的組成物可以進一步視情況包括佐劑以增強免疫應答。術語“佐劑”和“免疫刺激劑”在此可互換地使用，並且被定義為引起免疫系統刺激的一種或多種物質。在本文中，佐劑用於增強對該等載體的免疫應答，該等載體編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白和/或與編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的載體組合使用的HIV抗原多肽。
適合用於本發明的佐劑應當係在人中潛在安全的、耐受性良好的並且有效的佐劑，如例如QS-21、Detox-PC、MPL-SE、MoGM-CSF、TiterMax-G、CRL-1005、GERBU、TER醯胺、PSC97B、 Adjumer、PG-026、GSK-I、GcMAF、B-alethine、MPC-026、Adjuvax、CpG ODN、Betafectin、鋁鹽(例如AdjuPhos)、Adjuplex、以及MF59。鑒於本揭露，可以藉由熟習該項技術者熟知的技術確定製劑中每種組分的最佳比例。
在一較佳的實施方式中，該佐劑係鋁鹽，如AdjuPhos。
免疫原性組成物的製備和使用係熟習該項技術者所熟知的。液體藥物組成物一般包括液體載體例如水、石油、動物或植物油、礦物油或合成油。還可以包括生理鹽水溶液、右旋糖或其他糖溶液或二醇，例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
例如，重組腺病毒載體可以儲存於緩衝液中，該緩衝液還可以用於腺病毒世界標準(Adenovirus World Standard)(霍根森(Hoganson)等人，2002，生物工藝雜誌(Bioprocessing J)1：43-8)：20mM Tris pH 8，25mM NaCl，2.5%甘油。適用於向人類給予的另一種有用的腺病毒配製物緩衝液係20mM Tris、2mM MgCl2、25mM NaCl、蔗糖10% w/v、聚山梨酯-80 0.02% w/v。適用於重組腺病毒的另一種配製物緩衝液包括10-25mM檸檬酸鹽緩衝劑pH 5.9-6.2，4%-6%(w/w)羥丙基-β-環糊精(HBCD)、70-100mM NaCl、0.018%-0.035%(w/w)聚山梨酯-80、以及視情況包括0.3%-0.45%(w/w)乙醇。顯而易見地，可以使用許多其他緩衝液，並且已知針對存儲和針對純化載體的藥用給藥的適合的配製物的若干實例。
根據本發明的實施方式，本發明的組成物可以與一 種或多種編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽的另外的載體，和/或一種或多種分離的HIV抗原性多肽一起使用。該等另外的載體和/或HIV抗原性多肽可以存在於包含本發明的合成的HIV Env蛋白的同一組成物中。它們還可以存在於一種或多種不同的組成物中，所述不同的組成物可以與包含本發明的合成的HIV包膜蛋白的組成物在疫苗組合中一起使用。較佳的是，該一種或多種另外的載體係病毒載體，如腺病毒載體，並且最較佳的是腺病毒26載體。鑒於本揭露，該一種或多種另外的載體可以編碼任何熟習該項技術者已知的HIV抗原性多肽。
在一個實施方式中，組成物或疫苗組合進一步包含第二腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該第二腺病毒載體編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的HIV抗原性多肽。此類實施方式的優點係增加免疫應答的寬度(覆蓋來自分枝B和C的菌株)。
在另一個實施方式中，本發明的組成物或疫苗組合進一步包含編碼HIV抗原性多肽的腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：28(mos1 GagPol)的胺基酸序列。
在另一個實施方式中，本發明的組成物或疫苗組合進一步包含編碼HIV抗原性多肽的腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：29(mos2 GagPol)的胺基酸序列。
在一個具體實施方式中，本發明的組成物或疫苗組合進一步包含第二腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該第二 腺病毒載體編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的HIV抗原性多肽；以及一種或多種另外的腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該一種或多種另外的載體編碼一種或多種包含選自由SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29組成之群組的胺基酸序列的HIV抗原性多肽。例如，根據本發明的實施方式的組成物或疫苗組合可以包含四種腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，其中第一載體編碼包含SEQ ID NO：8(例如SEQ ID NO：18)的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白；第二載體編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的HIV抗原性多肽；第三載體編碼包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白；並且第四載體編碼包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白。
在一些實施方式中，該組成物或疫苗組合進一步包含一種或多種分離的HIV抗原性多肽。鑒於本揭露，熟習該項技術者已知的任何HIV抗原性多肽可以被進一步包括在本發明的組成物或疫苗組合中，包括但不限於HIV包膜蛋白(例如，gp160、gp140、gp120、或gp41)，較佳的是穩定化的三聚gp140蛋白，如穩定化的分枝C或分枝A gp140蛋白。在一個較佳的實施方式中，該分離的HIV抗原性多肽係一穩定化的HIV分枝C三聚gp140蛋白，如包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708的蛋白(SEQ ID NO：7的殘基1-29在該信號序列中)。可以使用的替代的或另外的HIV Env多肽(除了分枝C gp140蛋白或單獨的)係花葉Env三聚體蛋白，該葉Env三聚體蛋白例如具有如SEQ ID NO：36的胺基酸30-724中所揭露的胺基酸序列(對應於WO 2014/107744的SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：36的殘基1-29在該信號序列中)。
根據本發明的一個具體實施方式，HIV抗原性蛋白質可以是本發明的合成的HIV包膜蛋白。因此，本發明的合成的包膜蛋白可以以分離的和/或純化的形式在對其有需要的受試者中使用從而例如針對HIV誘導免疫應答或提供保護性免疫。任何本文所述的包含SEQ ID N：8的胺基酸序列的合成的包膜蛋白可以用作處於分離和/或純化形式的HIV抗原性蛋白。在一個較佳的實施方式中，當以分離的形式作為HIV抗原性蛋白使用時，該合成的包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的殘基30-711或SEQ ID NO：19的胺基酸序列的殘基30-686，並且更較佳的是包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的殘基30-704。該分離的HIV抗原性多肽還可以包含具有以下突變：EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的SEQ ID NO：8。
本發明的實施方式還涉及組成物或疫苗組合，該等組成物或疫苗組合包含分離的合成的HIV包膜蛋白，該分離的合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列。可以使用任何本文所述的合成的HIV包膜蛋白。在本發明的具體實施方式中，該分離的合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的殘基30-704或30-711，SEQ ID NO：19的胺基酸序列的殘基30-686，或具有以下突變：EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的SEQ ID NO：8的胺基酸序列。此類組成物或疫苗組合可以進一步包含一種或多種表現載體，例如，腺病毒載體，如腺病毒26載體，該等載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，如本發明的合成的HIV包膜蛋白，或其他HIV抗原性蛋白如列於SEQ ID NO：4、5、7、28或29中的那些或其片段。
本發明還涉及生產本發明的組成物或疫苗組合之方法。根據本發明的實施方式，生產組成物或組合的方法包括將包含編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的核酸的載體與運載體、以及視情況編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽的一種或多種另外的載體和/或一種或多種分離的HIV抗原性多肽進行組合。熟習該項技術者將熟悉用於製備這樣的組成物的常規技術。
疫苗和疫苗組合
根據本發明之實施方式，組成物可以是疫苗。如在此所使用的，術語“疫苗”係指組成物，該組成物包含編碼本發明的能夠對受試者或接種疫苗的受試者提供保護性免疫或保護性免疫應答的合成的HIV包膜蛋白的表現載體，較佳的是病毒載體。根據本發明的實施方式，當向受試者給予該組成物時，該表現載體表現該編碼的合成的HIV包膜蛋白，並且將該表現的合成的HIV包膜蛋白提供給受試者的免疫系統，從而誘導所需的應答以產生免疫，或誘導免疫應答。
因此，在另一概述方面中，本發明提供了用於在受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之疫苗。根據本發明的實施方式，該疫苗包含組成物，該組成物包含免疫原性有效量的表現載體，該表現載體編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列，並且較佳的是SEQ ID NO：18的胺基酸序列。較佳的是，該表現載體係病毒載體，更較佳的是腺病毒載體，並且最較佳的是腺病毒26載體。
根據本發明的實施方式，當參考本文所述的該等方 法和組成物使用時，“誘導免疫應答”涵蓋用於預防目的針對感染(如HIV感染)提供保護性免疫和/或接種受試者，以及用於治療目的在對其有需要的受試者中引起針對感染(如HIV感染)的所希望的免疫應答或效應。較佳的是，本發明的該等方法係用於預防目的，如用於提供保護性免疫。該免疫應答可以是細胞免疫應答和/或體液免疫應答。
如在此所使用的，術語“保護性免疫”或“保護性免疫應答”係指該接種的受試者能夠控制對其進行疫苗接種的致病因數的感染。通常，已經發展了“保護性免疫應答”的受試者僅發展輕度至中度的臨床症狀或根本沒有症狀。通常，對某種試劑具有“保護性免疫應答”或“保護性免疫”的受試者不會由於所述試劑的感染而死亡。
根據本發明的實施方式，疫苗組成物可以進一步包含編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽的一種或多種另外的載體，例如病毒載體，如腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，和/或一種或多種分離的HIV抗原性多肽。該合成的HIV包膜蛋白、另外的載體和/或一種或多種分離的HIV抗原性多肽可以被配製在該疫苗中的同一組成物或一種或多種不同組成物中。
本發明還涉及用於在對其有需要的受試者中使用一種或多種載體與分離的抗原性多肽組合來引發和加強對一種或多種HIV分枝的免疫應答之疫苗組合。因此，在另一概述方面中，本發明提供了用於在受試者中誘導針對HIV的免疫應答的疫苗組合。根據本發明的實施方式，該疫苗組合包含： (i)第一組成物，該第一組成物包含免疫原性有效量的表現載體、和運載體，該表現載體編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的、或具有一種或多種選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(a)I529P，(b)K480E，以及(c)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合；和(ii)第二組成物，該第二組成物包含免疫原性有效量的分離的HIV抗原性多肽和運載體，其中該第一和第二組成物之一用於引發免疫並且另一種組成物用於加強免疫。
根據本發明的實施方式，該疫苗組合視情況進一步包含免疫原性有效量的一種或多種另外的表現載體，該一種或多種另外的表現載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽。該一種或多種另外的表現載體可以包括在該第一組成物或該第二組成物中，或該一種或多種另外的表現載體可以包括在有待與該第一和/或第二組成物一起給予的一種或多種另外的組成物中。
如在此所使用的，術語“共遞送”、“共給予”或“與......一起給予”係指同時給予兩種或更多種組分，如病毒表現載體和分離的抗原性多肽，或多種病毒表現載體。“同時給予”可以是至少在同一天給予兩種或更多種組分。當兩種組分“一起給予”時，它們可以在短時間段內(例如24、20、16、12、8或4小時，或1小時或更短時間內)順序地在分開的組成物中給予，或者它們可以同時在單一組成物中給予。
在本發明的疫苗組合的具體實施方式中，該第一組成物包含腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；並且該分離的HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708或SEQ ID NO：36的殘基30-724。在一個具體實施方式中，該第一組成物進一步包含腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的HIV抗原性多肽。在另一個具體實施方式中，該第一組成物進一步包含一種或多種另外的腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，該HIV抗原性多肽包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：28和29。
本發明的另一個概述方面涉及試劑盒(kit)，該試劑盒包含根據本發明的實施方式之疫苗組合。
在上文和下面的說明性實施方式中詳細討論了可以在本發明的疫苗組合中使用的合成的HIV包膜蛋白、表現載體、另外的表現載體、由表現載體編碼的HIV抗原性多肽、以及分離的HIV抗原性多肽等的其他實施方式。
用於誘導針對HIV感染的保護性免疫之方法
本發明還涉及在對其有需要的受試者中誘導針對一種或多種HIV分枝的免疫應答之方法。本文所述的方法包括將一種或多種表現載體與一種或多種分離的抗原性多肽組合使用來引發和加強免疫應答之方法。
在一個概述方面中，在受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答的方法包括向受試者給予包含免疫有效量的表現載體的組成物，該表現載體包含編碼合成的HIV包膜蛋白的核酸，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列。本文所述的任何組成物可以用於在受試者中誘導針對HIV的免疫應答的方法。較佳的是，該組成物包括腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體包含編碼合成的HIV包膜蛋白的核酸，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。該組成物可以進一步包含編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽的一種或多種另外的載體和/或一種或多種另外的分離的HIV抗原性多肽。
在另一概述方面中，在受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之方法包括：(i)向該受試者給予第一組成物，該第一組成物包含免疫原性有效量的表現載體、和運載體，該表現載體編碼花葉HIV包膜蛋白，該花葉HIV包膜蛋白具有SEQ ID NO：8的、或具有一種或多種選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(a)I529P，(b)K480E，以及(c)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合；(ii)向該受試者給予第二組成物，該第二組成物包含免疫原性有效量的分離的HIV抗原性多肽、和運載體；並且(iii)視情況，向該受試者給予免疫原性有效量的一種或多種另外的表現載體，該另外的表現載體編碼一種或多種另外的HIV 抗原性多肽，其中步驟(i)和(ii)以任一順序進行，其中步驟之一用於引發免疫並且另一步驟用於加強免疫。根據本發明的實施方式，該視情況、有效量的一種或多種另外的表現載體與該第一組成物或該第二組成物一起給予。在一個較佳的實施方式中，該視情況有效量的一種或多種另外的表現載體與該第一組成物一起給予。
在誘導免疫應答的方法的一具體實施方式中，該第一組成物包含一種腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白；和第二腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該第二腺病毒載體編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的HIV抗原性多肽；該第二組成物包含分離的HIV抗原性多肽，該分離的HIV抗原性多肽具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708或SEQ ID NO：36的殘基30-724；並且該一種或多種另外的表現載體係腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，該HIV抗原性多肽包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：28和29；其中向該受試者一起給予該第一組成物與該一種或多種另外的表現載體一次或多次以用於引發免疫，並且向該受試者給予該第二組成物一次或多次以用於加強免疫。
通常肌內、皮內或皮下給予包含該等表現載體和/或抗原性多肽的免疫原性組成物。然而，也可以設想其他給藥模式，如靜脈內、直腸、皮膚、口服、鼻內等。免疫原性組成物的肌內 給予可以藉由使用針頭注射該等表現載體(例如，腺病毒載體)和/或抗原性多肽的懸浮液來實現。一替代方案係使用無針注射裝置來給予該組成物(使用例如BiojectorTM)或含有該疫苗的冷凍乾燥粉末。
對於肌內、靜脈內、皮膚或皮下注射，或病痛部位的注射，該載體將處於腸胃外可接受的水性溶液形式，該水性溶液為無熱原的並且具有適當的pH、等滲性以及穩定性。同樣地，該分離的抗原性多肽將處於腸胃外可接受的溶液形式，該溶液具有適當的pH、等滲性以及穩定性。熟習該項技術者完全能夠使用例如等滲媒介物，如氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringer's Injection)、乳酸鹽林格氏注射液來製備適合的溶液。根據需要，可以包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑和/或其他添加劑。還可以使用緩釋配製物。
通常，根據本發明的實施方式的疫苗組成物的給予將具有預防目的，以在感染或症狀發展之前產生針對HIV抗原的免疫應答。在其他實施方式中，該等表現載體(例如，腺病毒載體)、和/或HIV抗原性多肽可以被給予用於曝露後的預防用品。
向受試者給予包含該等表現載體(例如，腺病毒載體)和/或抗原性多肽的該等免疫原性組成物，在受試者中產生抗HIV免疫應答。足以誘導可檢測的免疫應答的組成物的量被定義為“免疫原性有效劑量”或“免疫原性有效量。”在本發明的一典型實施方式中，該免疫應答係保護性免疫應答。
給予的實際量以及給予的速率和時程將取決於正治 療的疾病的性質和嚴重度。治療處方(例如劑量等的決定)係在全科醫生和其他醫師、或在獸醫環境中是獸醫的職責範圍內的，並且典型地考慮了有待治療的失調、個體患者的狀況、遞送部位、給藥方法以及醫師已知的其他因素。以上提及的該等技術和方案的實例可以在雷明頓藥學大全(Remington’s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol,A.編著，1980中找到。
在產生腺病毒載體和任選將這種顆粒配製成組成物後，可以將該等載體給予個體，特別是人或其他靈長類動物。對非人哺乳動物的遞送不需要用於治療目的，而是可以用於在實驗背景中使用，例如在對由本發明的該等腺病毒載體表現的合成的HIV包膜蛋白的免疫應答的機制的研究中使用。
在揭露的方法的一個實施方式中，使用編碼一種或多種HIV抗原性多肽的一種或多種腺病毒載體來引發免疫應答。一種或多種分離的HIV抗原性多肽可以與一種或多種腺病毒載體一起用於引發免疫。引發免疫可以僅施用一次，但也可以視情況施用多次，例如，在時間0初次引發施用，隨後是在約第4-14週，例如，第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14週，或在初始引發施用之間、之後的任何時間另一次引發施用。可以將一種或多種分離的HIV抗原性多肽視情況與一種或多種另外的腺病毒或編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽的其他載體一起使用以增強免疫應答。加強免疫也可以施用一次或多次，例如，首先在約第18-36週，例如，第18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36週，或在初始引發施用 之間、之後的任何時間，隨後在約第36-52週，例如，第36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60週，或在初始引發施用之間、之後的任何時間另一次加強施用。監測由免疫誘導的免疫應答。
該等揭露的方法的實施方式還考慮更短的初免-加強方案，意味著在初始引發施用之後的約22-26週施用該最終加強免疫。可以在第0週給予該引發免疫。該加強免疫可以施用多次，例如，首先在約第7-9週或第11-13週，或在約第4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、或14週，或在初始引發施用之間、之後的任何時間，隨後在約第22-26週、或在約第16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、或28週，或在初始引發施用之間、之後的任何時間另一次加強施用。在某些實施方式中，將一種或多種分離的HIV抗原性多肽與一種或多種腺病毒載體一起給予用於引發和/或加強免疫。
熟習該項技術者容易理解，可以基於施用後測量的免疫應答來調整用於引發和加強施用的方案。例如，通常在給予引發組成物後數週或數月，例如，約2-3週或4週、或8週、或16週、或20週、或24週、或28週、或30週、或32週，或給予引發組成物後一至兩年給予該等加強組成物。
根據本發明的實施方式，佐劑可以與該分離的HIV抗原性多肽一起作為引發和/或加強免疫的一部分來給予。鑒於本揭露，可以使用任何佐劑，並且在某些實施方式中，該佐劑係鋁 鹽，如AdjuPhos。
在本發明的一較佳的實施方式中，在本文揭露的該等方法中使用的該等腺病毒載體包括rAd26載體。較佳的是，編碼合成的HIV包膜蛋白(包含SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的，最較佳的是SEQ ID NO：18的胺基酸序列)的rAd26載體，單獨地或與一種或多種另外的rAd26載體(編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，如具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的mos1Env)組合用於引發免疫應答，並且分離的HIV抗原性多肽(如包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708或SEQ ID NO：36的殘基30-724的那些)被用於加強免疫應答，或者反之亦然。
在一個示例性實施方式中，編碼包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白的rAd26載體與編碼具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的HIV抗原性多肽的rAd26載體組合用於引發免疫應答。一種或多種另外的rAd26載體還可以與其他rAd26載體一起給予以引發免疫應答，該一種或多種另外的rAd26載體編碼一種或多種另外的具有選自由SEQ ID NOs：1-4、28和29組成之群組的胺基酸序列的HIV抗原性多肽。在某些實施方式中，在給予任何加強免疫之前給予該引發施用兩次。然後給予分離的HIV抗原性多肽，如包含SEQ ID NO：7(較佳的是)的胺基酸序列的殘基30-708的那些，或包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的殘基30-724的那些，或這樣的分離的HIV抗原性多肽的至少兩種的組合，以加強免疫應答，並且較佳的是給予超過一次。較佳的是，在加強免疫中，進一步給予佐劑與該分離的HIV抗原性多肽。
在一具體實施方式中，藉由給予在腺病毒載體(較佳的是rAd26載體)上編碼的四種HIV抗原來引發免疫應答，編碼的這四種抗原為：(i)包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白，(ii)具有SEQ ID NO：5的胺基酸序列的多肽，(iii)具有SEQ ID NO：28的胺基酸序列的多肽，以及(iv)具有SEQ ID NO：29的胺基酸序列的多肽。這四種抗原各自可以在單獨的腺病毒載體(較佳的是rAd26載體)上編碼，以約1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10 x 1010個病毒顆粒(vp)，例如約5 x 1010vp(對於所有載體一起)的總劑量給予。該等載體可以例如以1：1：1：1比率預先混合，。可以在初始引發施用後，例如，在初始引發施用後第8、9、10、11、12、13、14、15或16週時重複該引發施用。在此實施方式中，藉由將用於該引發施用的同一腺病毒載體疫苗與分離的HIV Env gp140蛋白(例如分枝C gp140蛋白(包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708)或花葉gp140蛋白(包含SEQ ID NO：36的胺基酸序列的殘基30-724)，或者分枝C gp140蛋白和花葉gp140蛋白)一起，以約50-300μg蛋白的總劑量，例如分枝C gp140蛋白的50、100、150、200、250、或300微克或之間的任何量，或例如花葉gp140蛋白的50、100、150、200、250、或300微克或之間的任何量，或例如分枝C gp140蛋白和花葉gp140蛋白的組合(例如以1：1比率，混合在一起活單獨地給予)的50、100、150、200、250、或300微克或之間的任何量給予來加強免疫應答。較佳的是，該gp140蛋白與佐劑，例如磷酸鋁一起給予。可以在約第18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30週，或在該初始引發施用之間、之後的任何時間進行該腺病毒加上gp140蛋白給予 以加強免疫應答。可以例如在約第42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53或54週，或在該初始引發施用之間、之後的任何時間重複該加強施用。藉由肌內途徑較佳的是進行根據這個實施方式的所有給予。
當連同附圖一起閱讀時，會更好地理解先前概述以及以下本發明的詳述。應理解的是本發明不限於附圖中示出的準確實施方式。
在該等附圖中：圖1A-1C係HIV包膜蛋白結構的示意性表示；圖1A示出了全長HIV包膜蛋白；圖1B示出根據本發明的實施方式的可溶性單鏈HIV包膜蛋白結構，其中該跨膜結構域(TM)被GCN4三聚結構域替換，並且該弗林蛋白酶切割位點係突變的(sC4)；圖1C示出根據本發明的實施方式的膜結合HIV包膜蛋白之結構，該結構包括跨膜結構域和細胞質結構域的片段(C4D7)； 圖2示出了可溶性sC1包膜蛋白的表現水平，該sC1包膜蛋白基於具有另外的C-末端三聚結構域的mos2Env花葉抗原序列、和根據本發明的實施方式的可溶性合成的HIV包膜蛋白(sC4)；表現藉由使用針對gp120的多株抗體的定量西方墨點法測量；將編碼sC1或sC4的質粒暫態表現兩次，並且每次轉染藉由光密度測定法定量兩次；相比於顯示出相對高的表現水平的sC4合成的HIV包膜蛋白，該sC1蛋白顯示出非常低的表現水平；圖3A和3B示出在如藉由ELISA測定而確定的可溶性CD4存在(淺灰色)和不存在(深灰色)的情況下，合成的HIV包膜蛋白與單株抗體17b(mAb17b)之結合；圖3A示出sC1的結合；圖3B示出sC4的結合；圖4係來自sC1蛋白和sC4合成的HIV包膜蛋白的天然聚丙烯醯胺凝膠電泳之西方墨點之圖像；圖5示出了使用抗gp120多株抗體(GP120)藉由表現該等蛋白質的細胞的FACS分析，並且藉由結合至廣泛中和性抗體PG9(PG9)和PG16(PG16)的膜結合的C1、C1D7、C4和C4D7合成的HIV包膜蛋白的相對細胞表面表現水平，該廣泛中和性抗體PG9和PG16係四級結構依賴性的並且優先結合正確折疊的Env三聚體；圖6係在多次病毒傳代後腺病毒載體的穩定性之圖示，該等腺病毒載體含有編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白之序列，該等序列包括全長C4(FLC4)、C4D7和sC4；在PER.C6細胞中產生重組腺病毒26載體；在用於轉染和斑塊純化的最初3次傳代 後，選擇5個斑塊並以T25形式擴增10代，導致總病毒傳代數(vpn)為13；示出了如藉由E1轉基因盒聚合酶鏈式反應(PCR)測定的vpn 3、5、10和13之後的穩定性；例如，3/5係指在5個測試的斑塊中的3個斑塊係穩定的，並且5/5係指在5個測試的斑塊中的5個斑塊是穩定的；並且圖7A和7B示出了在兔子中的基於TZM-bl細胞的中和測定中針對HIV-1包膜假型病毒顆粒(EVP)之病毒中和效價；在第1週、第8週、第14週和第20週，針對EVP VSV-G(陰性對照)和MW965.26(Tier 1A分枝C)測量高腺病毒載體給藥組的log10-轉化的IC50值；每個點表示單獨的兔的log10-轉化的IC50值，組平均值由水平線表示；HD：測試的最高稀釋度(上部實線)；LD：測試的最低稀釋度(下部實線)；LOB：背景的限值，編譯的陰性樣品的95百分位值(虛線)；在相應的線處設置超過LD或HD閾值的Log10 IC50值；對每個時間點使用聯合分級的Dunn方法與對照進行單向非參數比較；該等圖中示出了以下統計顯著差異：*=P<0.05，**=P<0.01，以及***=P<0.001；圖7A示出了VSV-G(陰性對照)的結果；並且圖7B示出了MW965.26(Tier 1A分枝C)的結果。
實施方式1係編碼合成的HIV包膜蛋白的核酸，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的、或具有一種或多種選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)I529P，(ii)K480E，以及(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合。
實施方式2係根據實施方式1所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白進一步包含信號序列，例如包含選自下組的胺基酸序列的信號序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：9至12，較佳的是SEQ ID NO：9。
實施方式3係根據實施方式1或2所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白進一步包含跨膜結構域，例如具有SEQ ID NO：13的胺基酸序列的跨膜結構域，較佳的是該合成的HIV包膜蛋白進一步包含融合到SEQ ID NO：8的C-末端和該跨膜結構域的N-末端的SEQ ID NO：37。
實施方式4係根據實施方式3所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白進一步包含一個細胞質結構域的片段，較佳的是包含SEQ ID NO：14的胺基酸序列或其胺基酸殘基1-4(即，NRVR) 的細胞質結構域的片段。
實施方式5係如以上實施方式1-4中任一項所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
實施方式6係根據實施方式1或2所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白(a)進一步包含選自下組的三聚結構域，該組由以下各項組成：GCN4、fibritin(foldon結構域)，例如具有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16的，較佳的是SEQ ID NO：15的胺基酸序列的三聚結構域，或(b)包含具有以下突變：EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合的SEQ ID NO：8。
實施方式7係根據實施方式6所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：19的胺基酸序列。
實施方式8係根據實施方式5所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白由SEQ ID NO：18的胺基酸序列組成。
實施方式9係根據實施方式7所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白由SEQ ID NO：19的胺基酸序列組成。
實施方式10係一種載體，該載體包含實施方式1-9中任一項所述之核酸，其中所述核酸可操作地連接至啟動子序列。
實施方式11係根據實施方式10所述之載體，係病毒載體，較佳的是腺病毒載體，並且更較佳的是腺病毒26載體。
實施方式12係分離的細胞，該分離的細胞包含實施方式10或實施方式11所述的載體。
實施方式13係一種組成物，該組成物包含免疫原性有效量的實施方式10或申請專利範圍11所述的載體、和運載體。
實施方式14係一種疫苗組合，該疫苗組合包括第一組成物，該第一組成物包括免疫原性有效量的腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該載體編碼具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白；第二組成物，該第二組成物包括免疫原性有效量的第二腺病毒載體，較佳的是第二腺病毒26載體，該第二腺病毒載體編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的HIV抗原性多肽；以及視情況至少一種另外的組成物，該另外的組成物包括免疫有效量的選自由以下各項組成之群組的至少一種：載體，該載體編碼具有選自由SEQ ID NO：1-4、28和29組成之群組的胺基酸序列的抗原性多肽，和分離的HIV抗原性多肽，該分離的HIV抗原性多肽具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708或具有SEQ ID NO：36的殘基30-724，其中該第一組成物、第二組成物和另外的組成物係存在於同一組成物或一種或多種不同組成物中。
實施方式15係一種在對其有需要的受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之方法，該方法包括向該受試者給予實施方式13所述的組成物或實施方式14所述的疫苗組合。
實施方式16係實施方式13所述的組成物或實施方式14所述之疫苗組合，該組成物或疫苗組合包含一種腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體載體編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；第 二腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該第二腺病毒載體編碼HIV抗原性多肽，該HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；一種或多種另外的腺病毒載體，該一種或多種另外的腺病毒載體編碼一種或多種另外的抗原性多肽，該抗原性多肽包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：1-4、28和29；以及分離的HIV抗原性多肽，該分離的HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708或SEQ ID NO：36的殘基30-724，用於誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答。
實施方式17係合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的、或具有一種或多種選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)I529P，(ii)K480E，以及(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合。
實施方式18係實施方式17所述的合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含具有突變EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，或SEQ ID NO：18的胺基酸序列的殘基30-704或SEQ ID NO：19的殘基30-686。
實施方式19係實施方式13所述之組成物，該組成物進一步包含編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽的一種或多種另外的表現載體(該表現載體)和/或一種或多種分離的HIV抗原性多肽。
實施方式20係實施方式13所述之組成物，該組成物包含腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼由 SEQ ID NO：18的胺基酸序列組成的合成的HIV包膜蛋白。
實施方式21係根據實施方式20所述之組成物，該組成物進一步包含第二腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該第二腺病毒載體編碼HIV抗原性多肽，該HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；以及視情況一種或多種另外的腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該一種或多種另外的腺病毒載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，該HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：1-4、28和29的胺基酸序列。
實施方式22係在對其有需要的受試者中產生針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之方法，該方法包括向該受試者給予根據實施方式19、20、或21中任一項所述的組成物。
實施方式23係生產組成物或疫苗組合之方法，該方法包括將實施方式10或實施方式11所述的載體與運載體、以及視情況編碼一個或多個另外的HIV抗原性多肽的一種或多種另外的載體和/或一種或多種分離的HIV抗原性多肽連同運載體一起進行組合。
實施方式24係用於在受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之疫苗組合，該疫苗組合包含：(i)第一組成物，該第一組成物包含免疫原性有效量的表現載體、和運載體，該表現載體編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的、或具有一種或多種選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i) I529P，(ii)K480E，以及(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合；和(ii)第二組成物，該第二組成物包含免疫原性有效量的分離的HIV抗原性多肽、和運載體，其中該第一和第二組成物之一用於引發免疫並且另一種組成物用於加強免疫，並且其中該疫苗組合視情況進一步包含免疫原性有效量的一種或多種另外的表現載體，該一種或多種另外的表現載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，並且該一種或多種另外的表現載體包括在該第一或該第二組成物中，或一種或多種要與該第一或該第二組成物一起使用的另外的組成物中。
實施方式25係根據實施方式24所述的疫苗組合，其中該第一組成物包含腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列；該分離的HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708，或SEQ ID NO：36的殘基30-724；並且該一種或多種另外的表現載體係腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該一種或多種另外的載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，該另外的HIV抗原性多肽包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：1-5、28和29。
實施方式26係用於在對其有需要的受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之方法，該方法包括： (i)向該受試者給予第一組成物，該第一組成物包含免疫原性有效量的表現載體、和運載體，該表現載體編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8的、或具有一種或多種選自下組的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列，該組由以下各項組成：(i)I529P，(ii)K480E，以及(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合；(ii)向該受試者給予第二組成物，該第二組成物包含免疫原性有效量的分離的HIV抗原性多肽、和運載體；並且(iii)視情況，向該受試者給予免疫原性有效量的一種或多種另外的表現載體，該一種或多種另外的表現載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，其中步驟(i)和(ii)係以任一順序進行，該等步驟之一用於引發免疫並且另一步驟用於加強免疫，並且較佳的是，該視情況、有效量的一種或多種另外的表現載體與該第一組成物一起給予。
實施方式27係根據實施方式26所述之方法，其中該第一組成物包含一種腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該腺病毒載體編碼合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白具有SEQ ID NO：18的胺基酸序列；和第二腺病毒載體，較佳的是腺病毒26載體，該第二腺病毒載體編碼HIV抗原性多肽，該HIV抗原性多肽包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列；該第二組成物包含分離的HIV抗原性多肽，該分離的HIV抗原性多肽具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708、或SEQ ID NO：36的殘基30-724；並且該視情況一種或多種另外的表現載體係腺病毒載體，較佳的是腺病 毒26載體，該一種或多種另外的表現載體編碼一種或多種另外的HIV抗原性多肽，該另外的HIV抗原性多肽包含選自下組的胺基酸序列，該組由以下各項組成：SEQ ID NO：28和29；其中向該受試者給予該第一組成物，視情況連同該一種或多種另外的表現載體一次或多次以用於引發免疫，並且向該受試者給予該第二組成物一次或多次以用於加強免疫。
實施方式28係合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白由SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19的胺基酸序列(具有或沒有該信號序列)組成。
實施方式29係一種疫苗組合，該疫苗組合包含一種或多種載體，該等載體一起包含編碼以下各項的核酸序列：(i)包含SEQ ID NO：8的胺基酸序列的第一合成的HIV包膜蛋白和(ii)包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的第二HIV包膜蛋白。
實施方式30係根據實施方式29所述之疫苗組合，其中該第一合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
實施方式31係一種疫苗組合，該疫苗組合包含以下組分：(i)編碼由SEQ ID NO：18的胺基酸序列組成的合成的HIV包膜蛋白的Ad26載體；和(ii)編碼由SEQ ID NO：5的胺基酸序列組成的HIV包膜蛋白的Ad26載體。
實施方式32係根據實施方式31所述之疫苗組合，該 疫苗組合進一步包含以下組分：(iii)編碼由SEQ ID NO：28的胺基酸序列組成的HIV抗原的Ad26載體。
實施方式33係根據實施方式31或32所述之疫苗組合，該疫苗組合進一步包含以下組分：(iv)編碼由SEQ ID NO：29的胺基酸序列組成的HIV抗原的Ad26載體。
實施方式34係根據實施方式31-33中任一項所述之疫苗組合，該疫苗組合進一步包含以下組分：(v)分離的HIV抗原性多肽，該分離的HIV抗原性多肽具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708、或SEQ ID NO：36的胺基酸序列的殘基30-724，視情況進一步包含佐劑。
實施方式35係一種在對其有需要的受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之方法，該方法包括：(a)向該受試者給予：(i)編碼包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白的rAd26載體；(ii)編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；(iii)編碼包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；以及(iv)編碼包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；較佳的是，其中以約1：1：1：1的比率，以約1-10 x 1010病毒顆粒(vp)(例如5 x 1010vp)的總劑量給予該等rAd26載體；(b)在步驟(a)之後的約第10-14週，例如在第12週重複步驟 (a)；(c)向該受試者給予：(i)編碼包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白的rAd26載體；(ii)編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；(iii)編碼包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；(iv)編碼包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；(v)具有SEQ ID NO：7的胺基酸30-708的序列的分離的HIV gp140蛋白；以及(vi)磷酸鋁佐劑；較佳的是，其中以約1：1：1：1的比率、以約1-10 x 1010病毒顆粒(vp)(例如5 x 1010vp)的總劑量給予該等rAd26載體，並且其中以約50-300微克(例如250微克)的劑量給予該分離的HIV gp140蛋白；在步驟(a)之後的約第20-28週，例如在第24週；以及(d)在步驟(a)之後的約第42-54週，例如在第48週重複步驟(c)。
實施方式36係一種在對其有需要的受試者中誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)的免疫應答之方法，該方法包括：(a)向該受試者給予：(i)編碼包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白的rAd26載體；(ii)編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；(iii)編碼包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；以及(iv)編碼包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；較佳的是，其中以約1：1：1：1的比率，以約1-10 x 1010病毒顆粒(vp)(例如5 x 1010vp)的總劑量給予該等rAd26載體；(b)在步驟(a)之後的約第10-14週，例如在第12週重複步驟(a)； (c)向該受試者給予：(i)編碼包含SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白的rAd26載體；(ii)編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；(iii)編碼包含SEQ ID NO：28的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；(iv)編碼包含SEQ ID NO：29的胺基酸序列的抗原的rAd26載體；(v)具有SEQ ID NO：7的胺基酸30-708的序列的分離的HIV gp140蛋白；(vi)具有SEQ ID NO：36的胺基酸30-724的序列的分離的HIV gp140蛋白；以及(vii)磷酸鋁佐劑；較佳的是，其中以約1：1：1：1的比率、以約1-10 x 1010病毒顆粒(vp)(例如5 x 1010vp)的總劑量給予該等rAd26載體，並且其中以約1：1的比率、以約50-300微克(例如250微克)的總劑量給予該等分離的HIV gp140蛋白；在步驟(a)之後的約第20-28週，例如在第24週；以及(d)在步驟(a)之後的約第42-54週，例如在第48週重複步驟(c)。
【實例】 實例1：HIV包膜抗原序列之設計
設計了幾個HIV包膜抗原序列，其與花葉HIV抗原mos2Env(SEQ ID NO：6；先前也描述於WO 2010/059732中)具有序列相似性。該等新設計的膜結合的序列基於來自HIV包膜蛋白的完全天然野生型序列、或mos2Env序列和野生型HIV包膜蛋白序列的嵌合體(的組合)。除了全長包膜蛋白序列(參見圖1A)，還設計了具有細胞質結構域的C-末端截短的序列(參見例如，圖1C)。還參見例如，Schiernle等人，美國科學院院刊(PNAS)1997；亞伯拉罕(Abrahamyan)等人，病毒學雜誌(J Virol)2005；愛德 華茲(Edwards)等人，病毒學雜誌(J.Virology)，2002，76：2683-2691。在跨膜(TM)區域之前，還藉由C-末端截短來製備可溶性變體，該跨膜區域被三聚結構域(如GCN4三聚結構域)替換(參見例如，圖1B)。該等可溶性變體藉由弗林蛋白酶切割位點的突變進一步轉化為單鏈變體，從而抑制該包膜蛋白的細胞外結構域加工成gp120和gp41亞基。
在產生的和測試的所有構建體中，基於C4的構建體具有最佳性質，例如良好的可製造性、折疊、免疫原性等，並且選擇該等基於C4的構建體用於進一步研究。在進一步研究中還產生並測試了具有代替跨膜結構域的GCN4三聚結構域的C4構建體的可溶性變體(sC4，圖1B)和包含細胞質結構域的7個胺基酸片段的變體(C4D7，圖1C)。C4、sC4、以及C4D7的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：17、19、和18中。編碼該等的序列分別示於SEQ ID NO：25、27、和26中。構建體C1具有基於mos2Env序列(SEQ ID NO：6)的細胞外結構域序列。還分別產生了具有代替跨膜結構域的GCN4三聚結構域的構建體C1的可溶性變體(sC1)和包含細胞質結構域的7個胺基酸片段的變體(C1D7)，它們類似於如圖1B和1C中示出的sC4和C4D7。出於比較目的，將構建體C1及其變體用於進一步研究中，因為它們基本上基於先前技術的mos2Env序列。C1、sC1以及C1D7的胺基酸序列分別示於SEQ ID NO：31、30、和32中。編碼該等的核酸序列分別示於SEQ ID NO：34、33、和35中。測試的其他構建體不如基於構建體C4的那些最優，並且沒有進入進一步發展。
實例2：合成的HIV包膜蛋白之表現和折疊
測量合成的HIV包膜蛋白的表現水平、折疊、和細胞表面表現。
表現水平
用編碼如實例1所述的可溶性合成的HIV包膜蛋白sC1和sC4的質粒暫態轉染HEK293F細胞。使用定量西方墨點法(QWB)在上清液中測量該可溶性蛋白的表現水平。結果示於圖2中。sC1的低表現水平(其基本上對應於具有添加的跨膜結構域的mos2Env)與我們最近對mos2Env的見解一致。如藉由該等結果所證明的，本發明的sC4變體顯示比該sC1變體(對照)顯著更高的表現水平。
蛋白質折疊
藉由測量可溶性合成的HIV包膜蛋白與已知結合該HIV包膜蛋白的共受體結合位點的抗體(MAb 17b)的結合來測試蛋白質折疊，該HIV包膜蛋白僅在結合CD4後藉由酶聯免疫吸附測定(ELISA)而暴露。具體地，在存在預先的sC4與CD4的結合以及不存在預先的sC4與CD4的結合的情況下，測試了純化的sC4與MAb17b的結合。使用純化的sC1作為對照。在沒有預先的CD4結合到該包膜蛋白的情況下，MAb 17b與sC4的結合係部分解折疊的或預先觸發的包膜蛋白(即，在不存在CD4結合時採取“開放”構象的不穩定Env)的指示。該ELISA測定的結果示於圖3A和3B中。
如圖3B中所示，在存在預先與CD4結合的情況下， sC4顯示了與MAb 17b的強結合，但在不存在預先與CD4結合的情況下，sC4顯示沒有與MAb 17b的可檢測的結合。相比之下，如在圖3A中所示，在存在與不存在預先與CD4結合的情況下，sC1顯示與MAb 17b的低得多的結合。結果表明，在不暴露預先與CD4結合的共受體結合位點的情況下，sC4具有正確的折疊模式。
還藉由sC1和sC4的天然聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)來分析蛋白質折疊，以評價可溶性蛋白質變體的四級結構，以及原聚體之間可能的不正確的二硫鍵形成。在非變性凝膠上電泳後，藉由西方墨點分析來檢測凝膠中的蛋白質。如圖4中的結果所示，大部分sC4以三聚體狀態存在，這係正確的四級結構。
總之，蛋白質折疊實驗的結果表明該sC4可溶性合成的HIV包膜蛋白具有希望的折疊特性(folding profile)，這與現有的mos2Env抗原(由sC1表示)的折疊特性相比係被改進的。
細胞表面表現
還研究了HIV包膜蛋白C1(全長)、C4(全長，參見圖1A)、C1D7和C4D7的膜結合變體的細胞表面表現。僅用編碼eGFP的質粒(陰性對照，NC)，或用編碼eGFP的質粒連同編碼HIV包膜蛋白變體的表現構建體暫態轉染HEK293T細胞。轉染後兩天，在暴露於針對gp120的多種多株和單株抗體、以及二級抗體後，對細胞進行螢光啟動細胞分選(FACS)分析，並且然後檢查包膜蛋白細胞表面表現水平。藉由使用抗gp120多株抗體測定總表現水平，並藉由評估廣泛中和性抗體PG9和PG16(它們係四級結構依賴性的，並優先結合正確折疊的包膜三聚體)的相對結合， 來評估該等包膜變體的質量。
細胞表面表現實驗的結果示於圖5中。如使用抗gp120抗體測量的截短變體C1D7和C4D7的表面表現水平分別遠高於其全長對應物C1和C4的表面表現水平。這證實了來自Env的羧基-末端的144個殘基的缺失增加了包膜表面表現水平。與全長C1相比，本發明的全長C4構建體還顯示出提高的PG9和PG16結合，這表明該C4包膜序列在細胞表面上被適當地折疊(即，三聚體)。
結果還表明，C1D7變體，其基本上是具有添加的跨膜結構域和細胞質結構域的7個胺基酸的Mos2Env，可以在HEK293T細胞上進行表面表現。這與當轉染至A549細胞時不能在表面上以可檢測的水平表現的Ad26.mos2Env中的可溶性構建體形成對比。然而，與PG9和PG16的相對結合在背景之上幾乎檢測不到，這表明該C1D7包膜序列折疊不良，並且可能不作為細胞表面上的完整三聚體存在。
總的來說，與C1和C1D7相比，該C4D7包膜變體具有最佳的抗體結合特性，具有比其全長對應物C4更高的gp120表現，和大於15倍的增加的PG9和PG16結合(圖5)。
實例3：編碼HIV包膜序列的載體之穩定性
我們實驗室中的先前工作(未公開)表明編碼該mos2Env抗原序列的腺病毒26(Ad26)載體顯示具有相對高的VP/IU比率(表明腺病毒產物批次的較低質量)，並且此外這樣的載體顯示穩定性問題。因此，重要的是在腺病毒背景下測試本發 明的合成的HIV包膜蛋白構建體的穩定性。
在PER.C6細胞中產生編碼如以上實例1中所述的本發明的HIV抗原序列C4、C4D7和sC4的重組Ad26(rAd26)載體(分別稱為“rAd26.C4”、“rAd26.C4D7”、和“rAd26.sC4”)。挑選載體殖株(斑塊)並按比例放大以產生研究批次。將最多5個病毒殖株(斑塊)按比例擴大至T25形式，並以T25形式連續傳代10代(傳代1-3係轉染和斑塊純化步驟，隨後以T25形式傳代10次，得到總共13次傳代)。藉由E1轉基因盒PCR分析在病毒傳代數(vpn)3、5、10和13時評估遺傳穩定性，隨後在vpn 13時測序。結果示於圖6中。
編碼全長C4(rAd26.C4)的rAd26載體顯示差的生長特徵，如藉由在2-3天中沒有完全細胞病變效應(CPE)；遺傳不穩定性，如藉由E1轉基因盒區域的缺失所確定的；或其組合所確定的(圖6)。由於差的生長特徵和觀察到的遺傳不穩定性，不進一步追蹤該編碼全長C4的載體。
相比之下，對於編碼C4D7(rAd26.C4D7)和sC4(rAd26.sC4)的該等rAd26載體，所有繁殖的斑塊在實驗過程中保持遺傳穩定(圖6)。因此，就腺病毒載體背景中的穩定性而言，該等新穎的sC4和C4D7構建體勝過原始mos2Env構建體。直到vpn 13的遺傳穩定性試驗代表了在載體的工業規模製備中使用的幾個傳代之外的繁殖。
實例4：腺病毒載體中的HIV包膜序列的表現和體內抗原性
在體內在載體轉導的A549細胞(人細胞系)中單獨地或與編碼mos1Env(SEQ ID NO：5)的重組Ad26載體(下文稱為“rAd26.mos1Env”)組合來評估rAd26.C4D7和rAd26.sC4的表現和抗原性(數據未顯示)。流式細胞術分析證明所有抗原在用作為對照的該等單一包膜抗原的2 x 104個病毒顆粒(vp)，或用藉由腺病毒轉導的2種組合的Env抗原的1 x 104vp轉導的細胞培養物中表現。所有轉導物另外含有編碼mos1GagPol(“rAd26.mos1GagPol”)和mos2GagPol(“rAd26.mos2GagPol”)的單劑量(1 x 104vp)的腺病毒載體(巴魯什等人，自然醫學(Nat Med)2010,16：319-323)，使得所評估的載體組合顯示與用於臨床前和臨床用途的不同腺病毒載體相同的相對比例。較佳的是，將編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的該等載體與編碼用於臨床用途的mos1GagPol和mos2GagPol抗原的載體進行組合。
rAd26.mos1Env和rAd26.C4D7的組合產生如藉由單株抗體結合測定的評估表位的最大覆蓋。特別地，藉由用Ad26.C4D7轉化而貢獻的PG16表位的暴露有希望用於疫苗使用，因為PG16代表識別HIV-1 Env的V1/V2環區域的廣泛中和性單株抗體(沃克(Walker)等人，科學(Science)，2009)。因此，與僅由mos1Env產生的免疫應答相比，來源於C4序列的本發明的合成的HIV包膜蛋白增加了針對該HIV包膜蛋白的免疫應答的寬度。在RV144研究中，針對包膜蛋白區域的疫苗誘導的抗體應答已經顯示與來自HIV-1感染的保護相關(海恩斯(Haynes)等人，新英格蘭醫學雜誌(N Engl J Med.)2012)，因此本發明的合成的HIV包膜 蛋白係包括在HIV疫苗方案中的物有希望的候選。
實例5：編碼合成的HIV包膜蛋白的載體之免疫原性
在兔中測試Ad26載體背景下的本發明的合成的HIV包膜蛋白序列，以確定該等構建體是否是rAd26.mos2Env構建體的免疫原性替代物。
單獨地，並與編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的腺病毒載體(rAd26.C4D7和rAd26.sC4；包含SEQ ID NO：8，具體地分別是SEQ ID NO：18和19)組合地測試編碼mos1Env的腺病毒載體(rAd26.mos1Env；SEQ ID NO：5)的免疫原性。在所有情況下，還給予編碼mos1GagPol和mos2GagPol抗原的腺病毒26載體(分別是rAd26.mos1GagPol[SEQ ID NO：28]和rAd26.mos2GagPol[SEQ ID NO：29])。更確切地說，將rAd26.mos1Env單獨的免疫原性(三價疫苗：rAd26.mos1GagPol、rAd26.mos2GagPol和rAd26.mos1Env)與rAd26.mos1Env和rAd26.C4D7或rAd26.sC4之一的組合的免疫原性進行比較(四價疫苗：給予任何rAd26.mos1GagPol、rAd26.mos2GagPol、rAd26.mos1Env和rAd26.C4D7；或給予rAd26.mos1GagPol、rAd26.mos2GagPol、rAd26.mos1Env和rAd26.sC4)。該三價疫苗(缺少編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的任何載體)與該四價疫苗(包含編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的載體)的比較允許確定本發明的HIV包膜蛋白是否有助於保護的寬度。
在疫苗方案中進行給予，其中該等Ad26載體在第0和6週作為雙重引發來給予，並且分枝C gp140蛋白(三價Env gp140 蛋白，其具有不帶有殘基1-29的信號肽序列的SEQ ID NO：7，還參見WO 2010/042942)在第12和18週作為雙重加強來給予(參見例如，巴魯什等人，2015，科學(Science)349：320-324)。表1描述了用於本研究的疫苗方案。空rAd26係指缺少編碼HIV抗原蛋白的序列的任何基因的對照載體。每個組包括六隻兔子。
Figure 105141650-A0202-12-0064-1
該三價Ad26疫苗(缺乏本發明的新穎Env抗原)與該四價Ad26疫苗(其包含新型sC4或C4D7 Env抗原)的比較允許測試新穎抗原是否有助於保護的寬度。使用建立的基於TZM-bl細 胞的中和測定[Montefiori DC.分子生物學方法(Methods Mol Biol)2009,485：395-405；Sarzotti-Kelsoe M等人，免疫學方法(J Immunol Methods)2014,409：131-146]來測量候選疫苗的中和活性。
結果示於圖7中，並且藉由使用該三價疫苗(表1中的組1)作為對照組並與每種新穎四價疫苗(表1中的組2和組3)進行比較來統計分析該等結果。
總的來說，在兔中進行兩次同源肌內免疫後，新穎C4-衍生的(即，編碼包含SEQ ID NO：8的Env蛋白，係mos2Env的替代物)腺病毒構建體係免疫原性的。
兔免疫血清針對Tier 1B假病毒的中和能力不存在(數據未顯示)，這係不出乎意料的，因為已知此類病毒更難以中和。
兔免疫血清針對分枝B Tier 1A病毒的假病毒中和能力不受添加新組分的影響(數據未顯示)。這證明新抗原不會不利地幹擾該疫苗中存在的現有分枝B抗原的免疫原性(儘管該等新組分針對分枝C，但是這種不期望的幹擾在其被測試前不能被先驗排除)。
與三價(僅具有mos1Env)單獨的免疫(組1)相比，在含有腺病毒的該四價新穎C4D7(四價，組2)中兔免疫血清針對分枝C Tier 1A病毒的假病毒中和能力顯著增強(圖7，B圖)。此外，與三價(僅具有mos1Env)單獨的免疫(組1)相比，在含有腺病毒的該四價新穎sC4(四價，組3)中兔免疫血清針對分枝C Tier 1A 病毒的假病毒中和能力在第8週顯著增強(圖7，B圖)。
總之，Ad26中編碼的C4D7和sC4構建體係免疫原性的並且其添加擴大了疫苗的結合能力和中和能力，該疫苗具有mos1Env(主要是分枝B)作為唯一的朝向分枝C菌株的Ad26編碼的Env組分(圖7B)。
實例6：包括編碼本發明的合成的HIV包膜蛋白的載體的疫苗方案之免疫原性
一種另外的兔研究評估了該四價載體組合Ad26.Mos4.HIV(由四種腺病毒載體：Ad26.Mos1GagPol[編碼SEQ ID NO：28]、Ad26.Mos2GagPol[編碼SEQ ID NO：29]、Ad26.Mos1Env[編碼SEQ ID NO：5]和Ad26.Mos2SEnv[如以上使用的名稱“C4D7”還被稱為“Mos2S”；該載體以1：1：1：1混合，以5 x 109vp的總劑量編碼根據本發明的新穎SEQ ID NO：18]組成)，在第0週和第6週肌內給予該四價載體組合作為雙重引發免疫，在第13週和第19週與重組的HIV-1 Env蛋白加強進行組合，使用分枝C gp140[具有SEQ ID NO：7的胺基酸殘基30-708的序列]、花葉gp140[具有SEQ ID NO：36的胺基酸殘基30-724的序列]、或分枝C gp140和花葉gp140的組合。以10或50微克蛋白質組合免疫當天配製的250mcg磷酸鋁佐劑的總劑量肌內施用該等蛋白質加強。
結果表明，所有測試的方案在所有動物中是免疫原性的，這誘導高抗體滴度和針對Tier 1 Env假型病毒的中等中和活性。如果將花葉gp140單獨地或與分枝C gp140組合用作疫苗抗 原，則與單獨用分枝C gp140加強的參照組相比，花葉gp140特異性ELISA滴度和分枝B假病毒識別在第15週顯著增加。改善的總體效應大小係中度的，並且與單獨的花葉gp140相比，用二價分枝C gp140-花葉gp140組合而增強的組更大。在研究的第21週，失去該等差異，並且針對接受二價分枝C gp140-花葉gp140加強或單價分枝C gp140加強的群體而測量的免疫應答在統計學上不可區分。
該二價蛋白質方案顯示分枝C ELISA滴度和假病毒識別與分枝C gp140單獨加強方案的可比較的誘導，這表明分枝B相關的免疫原花葉gp140的包含對分枝C抗原覆蓋沒有不利影響，同時在本研究的第15週顯著增強了分枝B覆蓋。
數據證實，編碼根據本發明的合成的Env抗原的Ad26.Mos2SEnv載體可成功地用於疫苗方案中。
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Figure 105141650-A0202-12-0074-8
Figure 105141650-A0202-12-0075-9
Figure 105141650-A0202-12-0076-10
Figure 105141650-A0202-12-0077-11
<210> 4
<211> 850
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mos2Pol花葉抗原序列
<400> 4
Figure 105141650-A0202-12-0077-12
Figure 105141650-A0202-12-0078-13
Figure 105141650-A0202-12-0079-14
<210> 5
<211> 685
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mos1Env花葉抗原序列
<400> 5
Figure 105141650-A0202-12-0079-15
Figure 105141650-A0202-12-0080-16
Figure 105141650-A0202-12-0081-17
<210> 6
<211> 684
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mos2Env花葉抗原序列
<400> 6
Figure 105141650-A0202-12-0082-19
Figure 105141650-A0202-12-0083-20
Figure 105141650-A0202-12-0084-21
<210> 7
<211> 708
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 穩定化的進化枝C gp140三聚體：具有切割突變的C97ZA012-gp140-foldon
<400> 7
Figure 105141650-A0202-12-0084-22
Figure 105141650-A0202-12-0085-23
Figure 105141650-A0202-12-0086-24
<210> 8
<211> 625
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C4片段：沒有信號肽和跨膜結構域的gp120-截短的gp41
<400> 8
Figure 105141650-A0202-12-0086-25
Figure 105141650-A0202-12-0087-26
Figure 105141650-A0202-12-0088-27
<210> 9
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 9
Figure 105141650-A0202-12-0088-28
<210> 10
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 10
Figure 105141650-A0202-12-0088-29
<210> 11
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 11
Figure 105141650-A0202-12-0088-30
<210> 12
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 信號序列
<400> 12
Figure 105141650-A0202-12-0089-31
<210> 13
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 跨膜結構域
<400> 13
Figure 105141650-A0202-12-0089-32
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的細胞質區域
<400> 14
Figure 105141650-A0202-12-0089-34
<210> 15
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GCN4三聚結構域
<400> 15
Figure 105141650-A0202-12-0089-33
<210> 16
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> foldon三聚結構域
<400> 16
Figure 105141650-A0202-12-0089-35
Figure 105141650-A0202-12-0090-36
<210> 17
<211> 862
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C4序列
<400> 17
Figure 105141650-A0202-12-0090-37
Figure 105141650-A0202-12-0091-38
Figure 105141650-A0202-12-0092-39
<210> 18
<211> 711
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C4D7序列
<400> 18
Figure 105141650-A0202-12-0092-40
Figure 105141650-A0202-12-0093-41
Figure 105141650-A0202-12-0094-42
<210> 19
<211> 704
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sC4序列
<400> 19
Figure 105141650-A0202-12-0095-43
Figure 105141650-A0202-12-0096-44
Figure 105141650-A0202-12-0097-45
<210> 20
<211> 4050
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼mos1GagPol的核苷酸序列
<400> 20
Figure 105141650-A0202-12-0097-46
Figure 105141650-A0202-12-0098-47
<210> 21
<211> 4023
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼mos2GagPol的核苷酸序列
<400> 21
Figure 105141650-A0202-12-0099-48
Figure 105141650-A0202-12-0100-49
<210> 22
<211> 2055
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼mos1Env的核苷酸序列
<400> 22
Figure 105141650-A0202-12-0100-50
Figure 105141650-A0202-12-0101-51
<210> 23
<211> 2052
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼mos2Env的核苷酸序列
<400> 23
Figure 105141650-A0202-12-0101-52
Figure 105141650-A0202-12-0102-53
<210> 24
<211> 829
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於表現Ad26載體中的抗原的CMV啟動子
<400> 24
Figure 105141650-A0202-12-0102-54
Figure 105141650-A0202-12-0103-55
<210> 25
<211> 2586
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼C4的核苷酸序列
<400> 25
Figure 105141650-A0202-12-0103-56
Figure 105141650-A0202-12-0104-57
<210> 26
<211> 2133
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼C4D7的核苷酸序列
<400> 26
Figure 105141650-A0202-12-0104-58
Figure 105141650-A0202-12-0105-59
<210> 27
<211> 2112
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼sC4的核苷酸序列
<400> 27
Figure 105141650-A0202-12-0105-60
Figure 105141650-A0202-12-0106-61
<210> 28
<211> 1350
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mos1GagPol花葉抗原序列
<400> 28
Figure 105141650-A0202-12-0106-62
Figure 105141650-A0202-12-0107-63
Figure 105141650-A0202-12-0108-64
Figure 105141650-A0202-12-0109-65
Figure 105141650-A0202-12-0110-66
<210> 29
<211> 1341
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mos2GagPol花葉抗原序列
<400> 29
Figure 105141650-A0202-12-0110-67
Figure 105141650-A0202-12-0111-68
Figure 105141650-A0202-12-0112-69
Figure 105141650-A0202-12-0113-70
Figure 105141650-A0202-12-0114-71
<210> 30
<211> 709
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> sC1序列
<400> 30
Figure 105141650-A0202-12-0114-72
Figure 105141650-A0202-12-0115-73
Figure 105141650-A0202-12-0116-74
<210> 31
<211> 867
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> C1序列
<400> 31
Figure 105141650-A0202-12-0116-75
Figure 105141650-A0202-12-0117-76
Figure 105141650-A0202-12-0118-77
Figure 105141650-A0202-12-0119-78
<210> 33
<211> 2127
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼sC1的核苷酸序列
<400> 33
Figure 105141650-A0202-12-0119-79
Figure 105141650-A0202-12-0120-80
<210> 34
<211> 2601
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼C1的核苷酸序列
<400> 34
Figure 105141650-A0202-12-0120-81
Figure 105141650-A0202-12-0121-82
<210> 35
<211> 2148
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼C1D7的核苷酸序列
<400> 35
Figure 105141650-A0202-12-0122-83
<210> 36
<211> 724
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 花葉Env三聚體序列
<400> 36
Figure 105141650-A0202-12-0123-84
Figure 105141650-A0202-12-0124-85
Figure 105141650-A0202-12-0125-86
<210> 37
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ ID NO：18的殘基655-682
<400> 37
Figure 105141650-A0202-12-0125-87

Claims (22)

  1. 一種編碼合成的HIV包膜蛋白之核酸，其包含SEQ ID NO：8，或具有一或多種選自以下組成之群的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列：(i)I529P，(ii)K480E，以及(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白進一步包含一信號序列。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白進一步包含一跨膜結構域。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白進一步包含一細胞質結構域之片段。
  5. 如申請專利範圍第4項所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白包含該SEQ ID NO：18的胺基酸序列。
  6. 如申請專利範圍第1或2項所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白：(a)進一步包含一個三聚結構域，亦或(b)包含具有突變EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合的SEQ ID NO：8。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之核酸，其中該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：19的殘基1-686之胺基酸序列。
  8. 一種包含如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之核酸之載體，其中該核酸可操作地連接至一啟動子序列。
  9. 如申請專利範圍第8項所述之載體，其係一病毒載體。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之載體，其係腺病毒載體。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之載體，其中該腺病毒載體係人類腺病毒血清型26(Ad26)載體。
  12. 一種分離的細胞，其包含如申請專利範圍第8至11項中任一項所述之載體。
  13. 一種組成物，其包含免疫原性有效量的如申請專利範圍第8至11項中任一項所述之載體、以及運載體(carrier)。
  14. 一種疫苗組合，其包含：(i)第一組成物，其包含免疫原性有效量的腺病毒載體，該腺病毒載體編碼具有SEQ ID NO：8之胺基酸序列之合成的HIV包膜蛋白；(ii)第二組成物，其包含免疫原性有效量的第二腺病毒載體，該第二腺病毒載體編碼包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列之HIV抗原性多肽；以及視情況(iii)至少一種另外的組成物，其包含免疫有效量的選自由以下各項組成之群組的至少一種：(iiia)載體，其編碼具有選自由SEQ ID NO：1-4、28和29組成之群組的胺基酸序列之抗原性多肽，以及(iiib)包含免疫原性有效量的分離的HIV抗原性多肽之多肽，該分離的HIV抗原性多肽具有SEQ ID NO：7的胺基酸序列的殘基30-708或SEQ ID NO：36的殘基30-724，其中該第一組成物、第二組成物和另外的組成物存在於同一組成物或一種或多種不同組成物中。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之疫苗組合，其中該腺病毒載體為腺病毒26 載體，且該第二腺病毒載體為第二腺病毒26載體。
  16. 如申請專利範圍第15項所述之疫苗組合，其中該(i)中的合成的HIV包膜蛋白具有SEQ ID NO：18之胺基酸序列。
  17. 一種如申請專利範圍第13項所述之組成物或如申請專利範圍第14至16項中任一項所述之疫苗組合的用途，其係用於製備誘導針對人類免疫缺陷病毒(HIV)之免疫反應的藥物。
  18. 一種合成的HIV包膜蛋白，該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：8或具有一種或多種選自以下組成之群的突變的SEQ ID NO：8的胺基酸序列：(i)I529P，(ii)K480E，以及(iii)EK479-480RRRR、I529P、A471C和T575C的組合。
  19. 如申請專利範圍第18項所述之合成的HIV包膜蛋白，其中該合成的HIV包膜蛋白包含SEQ ID NO：18的胺基酸殘基30-704，或SEQ ID NO：19的胺基酸殘基30-686。
  20. 一種腺病毒26載體，其編碼包括SEQ ID NO：18或由SEQ ID NO：18組成的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白。
  21. 一種組合物，其包含腺病毒26載體，該腺病毒26載體編碼包括SEQ ID NO：18的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白。
  22. 一種MVA載體，其編碼包括SEQ ID NO：18或由SEQ ID NO：18組成的胺基酸序列的合成的HIV包膜蛋白。
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