TWI706041B

TWI706041B - 以雷射誘發加熱於微流道中的原位ｄｎａ複製及檢測方法

Info

Publication number: TWI706041B
Application number: TW107144248A
Authority: TW
Inventors: 洪敏勝; 陳志彬
Original assignee: 洪敏勝
Priority date: 2018-12-10
Filing date: 2018-12-10
Publication date: 2020-10-01
Also published as: TW202022122A

Abstract

本發明提出了一種以雷射誘發加熱及強抗生物素蛋白-生物素結合於長DNA鏈中的局部原位脫氧核糖核酸(DNA)複製及檢測方法。為了實現目標DNA複製，介電泳係產生用以在鋁電極板的兩端拉伸並固定DNA鏈。隨後，使用雷射誘發加熱產生的熱循環複製局部DNA序列。複製的雙股DNA產物係被原位捕捉於固體表面上，並使用量子點的螢光亮度(Qdots)進行檢測。結果顯示，利用雷射進行熱循環六次後，藉由分析複製前後量子點的螢光亮度，可以檢測複製局部DNA序列。期望此方法可提高生物樣品基因序列分析的效率。

Description

以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法

本發明係關於一種結合雷射誘發加熱及介電泳，用於目標DNA序列的原位複製及檢測的方法。

脫氧核糖核酸(DNA)包括一系列脫氧核糖核苷酸及關鍵的遺傳信息在臨床醫學中，識別特定的基因，疾病或病原體皆可藉由DNA檢測試驗來實現。由於基因工程的快速發展，人類DNA的定序也已被完成，接下來便是進行後基因體之工作，從這些已知的序列裡找出影響人類生理狀態、疾病等等的基因序列，才能開發針對這些特定序列進行修正或是修補的技術或是治療因為基因缺陷所造成的遺傳性疾病。然而DNA無法以肉眼直接觀察，且DNA為雙股纏繞的螺旋結構，因此要對DNA進行精準的操作相當不容易。而且，臨床樣品中靶核酸的濃度通常較低，因此，擴增過程是必要的。此外，在物理測序，基因鑑定及分子診斷中，從單一細胞中分離並檢測基因組DNA至關重要。因此，準確並快速地從單一細胞中複製並檢測DNA序列是一項在單細胞核酸擴增及基因資料庫製備中的關鍵技術挑戰。

聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction，PCR) 是一種常見的體外DNA複製技術，廣泛應用於醫學診斷，生物技術及分子生物學。PCR為一循環反應，每一循環係經三種不同溫度的三個步驟，週而復始循環操作而達到DNA的放大之目的，其三步驟為：(i)DNA變性，(ii)引子黏合，及(iii)延伸。兩條新的DNA鏈係由二個引子的末端延伸形成。傳統的PCR反應係利用反覆的熱循環步驟(通常需要25-30個循環)，使產物以2ⁿ進行擴增，進而將目標DNA片段大量複製，然後再藉由凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)進行分析PCR的產物。因此不但DNA複製效率不佳，而且整個分析過程必須等反應結束後再進行，於PCR反應過程中並沒有做任何分析、記錄(故一般PCR反應又可稱為End-point PCR)，因此其僅只能分析目標DNA擴增後的產物，而無法即時監測DNA擴增的過程。所以傳統DNA之複製及檢測方法的專一性、精確度及靈敏度皆較為不足。

有鑒於此，本發明人乃針對上述問題，而深入構思且積極研究、改良及試做，進而開發設計出本發明。

本發明之主要目的在於解決傳統DNA複製及檢測方法所存在之複製效率不佳及僅只能分析目標DNA擴增後的產物而無法即時監測DNA擴增的過程等之問題。

本發明所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，係包括：(A)備製一微流道，其中，將一製備塗抹抗生物素蛋白的蓋玻片置於含有二個鋁電極板的玻璃上，將一雙面膠帶黏接至該蓋玻片頂部及底部的邊緣，形成該微流道；(B)注入20μl Qdots(1nM)至該微流道中，以形成一樣品，其中，該樣品被靜置40分鐘，以便確認Qdots是否附著於該蓋玻片表面，利用一緩衝液清洗多餘的Qdots；(C)注入DNA溶液，並施加一電場藉以產生介電泳；(D)拉伸DNA並將其二端固定在該二個鋁電極板上，並使用緩衝液洗掉多餘的DNA；(E)注入DNA複製聚合酶及溶液；以及(F)使用紅外線雷射照射該固定的DNA的中間位置，並分別施加六、九、十二、十五及十八個的熱循環。

本發明所提供之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，主要係提供一種以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製方法，使其可以成功地高靈敏度的檢測出少量產物，並且能夠高效率地複製局部原位DNA序列。尤其是，其係可依據表面張力及靜電吸引的整合作用與長DNA奈米纖維晶片結合，以便在單次測量中提供基因組的DNA檢測，用於農業生物學中新植物品種的快速基因測序。

此外，在本研究中，並非僅在萃取的生物樣品中快速複製並檢測DNA，而是提出一種在單一細胞中精確複製並檢測來自單一細胞DNA鏈的目標位置之方法。我們研究的優勢在於使用單一平台來複製並檢測DNA。還顯示雷射誘發的加熱及螢光檢測方法易於與微電極陣列整合，以藉由單次測量進行準確的DNA檢測。

10‧‧‧微流道

11‧‧‧蓋玻片

12‧‧‧鋁電極板

13‧‧‧玻璃

14‧‧‧雙面膠帶

20‧‧‧抗生物素蛋白

21‧‧‧牛血清白蛋白

22‧‧‧Qdots

23‧‧‧生物素化引子

24‧‧‧生物素

30‧‧‧DNA

40‧‧‧紅外線雷射

41‧‧‧螢光顯微鏡

42‧‧‧電荷耦合器件相機

第1圖係本發明之流程方塊圖。

第2圖係本發明之DNA複製動作示意圖。

第3圖係本發明之微流道的立體示意圖。

第4圖(a)係本發明之鋁電極板的平面配置示意圖。

第4圖(b)係本發明之實驗系統設置示意圖。

第5圖係本發明使用以螢光為基礎的溫度測量中雷射功率及溫度之間的關係。

第6圖(a)係顯示微流道表面上無BSA的Qdots之螢光影像(照片係以人工方式增亮)。

第6圖(b)係顯示微流道表面上有BSA的Qdots之螢光影像(照片係以人工方式增亮)。

第7圖(a)係顯示施加電場後，電極上拉伸及固定DNA的螢光影像。

第7圖(b)係顯示注入螢光染料後，電極板上拉伸及固定DNA的螢光影像。

第8圖(a)係顯示雷射照射前，電極板上拉伸及固定DNA的螢光影像。

第8圖(b)係顯示雷射照射後，電極板上拉伸及固定DNA的螢光影像。

第9圖(a)係顯示藉由雷射誘發加熱的熱循環後，於拉伸DNA時，表面上Qdots的螢光圖像(照片係以人工方式增亮)。

第9圖(b)係顯示藉由雷射誘發加熱的六個熱循環後，表面上Qdots的螢光圖像(照片係以人工方式增亮)。

第9圖(c)係顯示藉由雷射誘發加熱的九個熱循環後，表面上Qdots的螢光圖像(照片係以人工方式增亮)。

第9圖(d)係顯示藉由雷射誘發加熱的十二個熱循環後，表面上Qdots的螢光圖像(照片係以人工方式增亮)。

第9圖(e)係顯示藉由雷射誘發加熱的十五個熱循環後，表面上Qdots的螢光圖像(照片係以人工方式增亮)。

第9圖(f)係顯示藉由雷射誘發加熱的十八個熱循環後，表面上Qdots的螢光圖像(照片係以人工方式增亮)。

第10圖係顯示藉由雷射誘發加熱，在各種熱循環下螢光強度的計算結果。

第11圖係顯示藉由PCR機器進行DNA複製(30個循環)的結果。

請參閱第1~4圖所示，係顯示本發明所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，包括：(A)備製一微流道10，其中係將100ng/ml抗生物素蛋白(Avidin)20塗抹在一蓋玻片11(18×18mm)的表面上，並在室溫下靜置40分鐘。然後用緩衝液(10mM Tris-HCl+50mM KCl，pH7.2)沖洗任何多餘的抗生物素蛋白20。在該蓋玻片11的表面上加入100mg/ml牛血清白蛋白(BSA)21，並在室溫下靜置30分鐘，用緩衝液沖洗多餘的牛血清白蛋白21。再將上述塗抹有抗生物素蛋白20及牛血清白蛋白21的蓋玻片11置於含有二個鋁電極板12的玻璃13上。將一製備塗抹抗生物素蛋白的蓋玻片11置於含有二個鋁電極板12的玻璃13上，將兩雙面膠帶14黏接至該蓋玻片11的頂部及底部的邊緣，以形成高度<30μm之一微流道10(如第3圖所示)。上述之緩衝液係為10mM Tris-HCl+50mM KCl，且其pH值為7.2。

(B)注入20μl Qdots22(1nM)至該微流道10中，以形成一樣品，其中Qdots為Quantum Dots(量子點)之縮寫，然後將該樣品靜置40分鐘以便確認Qdots22是否附著於該蓋玻片11的表面，之後再利用一緩衝液清洗多餘的Qdots22。

(C)注入DNA30溶液(1ng/μl λ DNA，2μM YO-PRO-1,1%(v/v)β-ME)，並施加10⁶V/m(1MHz)的電場藉以產生介電泳。

(D)拉伸DNA30並將其二端固定在該二個鋁電極板12上，並使用緩衝液洗掉多餘的DNA30。該二個鋁電極板12係誘導該DNA30的二端分佈正電荷及負電荷，因此會使該DNA30的二端固定在該二個鋁電極板12上，而將該DNA30拉伸成直線，其中作用於該DNA30的作用力係為介電泳力。

(E)注入DNA複製聚合酶及溶液(1×Taq緩衝液，0.02單位/μlTaq，0.2mM dNTP，1μM生物素化引子)。

(F)使用紅外線雷射照射該固定的DNA30的中間位置，並分別施加六、九、十二、十五及十八個熱循環，使DNA30 受熱變性(雙股變成單股)，以達複製局部DNA30序列之目的。

(G)複製完成後，將樣品在室溫下靜置40分鐘。

(H)用緩衝液洗滌樣品，注入20μl Qdots22(1nM)，並在室溫下靜置40分鐘。

(I)計算該蓋玻片11上Qdots22的螢光強度。

在上述(A)步驟中，該二個鋁電極板12之製作步驟為：(A1)將鋁金屬以氣相沉積至該玻璃13的表面，且每一鋁電極板12之厚度小於170nm；(A2)塗佈光阻劑(S1813)，軟烤，曝光，顯影，鋁蝕刻，以去除每一鋁電極板12之光阻；(A3)利用3%氟化銨蝕刻該二個鋁電極板12之間的玻璃13，產生每一高度約3μm的鋁電極板12，且該二個鋁電極板12之間的間距為12μm(如第3圖及第4圖(a)所示。

為了消除於介電泳期間由直流電場產生的電泳效應，通常會施加交流(AC)電場，亦可應用交流(AC)電場。因此，於實際操作時，通常採用高頻交流電場。

在第4圖(b)中係指出，本發明係採用紅外線雷射(IR laser)40(1455nm，CW，拉曼光纖雷射器；IPG Laser GmbH，USA)作為誘發熱循環的加熱源。在過程中，係將雷射照射到螢光顯微鏡41(BX-51；Olympus，Japan)中，通過物鏡(100×NA=1.4；奧林巴斯，日本)，並聚焦到拉伸及固定的λ DNA上。使用電子轟擊電荷耦合器件相機42(C7190-23；Hamamatsu,，Japan)記錄實驗圖像。因鋁對紅外線雷射具有高吸收係數，藉由在該玻璃13的表面上氣相沉積的鋁電極板12來校準雷射光點的直徑。本發明中採用的雷射光點直徑約為8μm(數據未顯示)。使用螢光染料即羅丹明B，校準雷射功率及溫度之間的關係；螢光強度係依據溫度變化而變化。我們已經依據羅丹明B的螢光強度，證明了紅外線雷射光點的溫度校準。使用功率計在物鏡下測量雷射功率，並利用熱電偶測量該微流道10中的溫度。首先，應用雷射照射及溫度控制的加熱板，來加熱該微流道10中的羅丹明B溶液。記錄螢光強度的加熱前及加熱後圖像。Image J商業軟體用於計算該微流道10中的螢光強度。通過選擇並平均10×10像素(表示8μm×8μm的面積)中的螢光強度值來分析每個圖像。在室溫(22℃)下拍攝的螢光強度圖像用於在加熱後標準化相同區域的螢光強度圖像。第5圖顯示了15個實驗的校準結果。而表1則列出了雷射加熱用於熱循環的操作條件。

本發明採用λ DNA(48,502bp，~16μm)作為實驗樣品。核酸螢光染料(YO-PRO-1，Ex 491nm/Em 509nm；Invitrogen Co.,USA)用於染色樣品。複製位置位於DNA的中間位置，範圍為24,808至25,237bp(第2圖中的中心位置；複製長度：429bp)。設計具有位於5'末端的生物素24的生物素化引子(Biotinylated primers)23[熔解溫度(Tm)：60℃；Mission Biotech Co.，Taiwan]，包含正向引子，5'-GTCTTCCTGCCTCCAGTTC-3'和反向引子，5'-TTACCTACGACAGGACACAC-3'。在DNA複製後，產物的末端含有生物素化引子23。產物的一端與該蓋玻片11表面上的抗生物素蛋白結合，而另一端用Qdots22(Em：655nm；Qdot 655鏈黴抗生物素蛋白綴合物；Life Technologies Co.，Taiwan)結合。通過Qdots22的光強度檢測複製的產物。此外，設計其他引子(不含生物素)以複製44,956及5,435bp之間的序列(如第2圖中的右端；複製長度：480bp，Tm：60℃，未修飾生物素；Mission Biotech Co.,Taiwan)，包含正向引子5'-AGCAACAGCACAACCCAAAC-3'及反向引子5'-CAATCGAGTCAGTACCGATG-3'。為了證實本研究中應用的DNA複製方法的效率，回收通過雷射誘發加熱複製的產物並與右端引子混合，以便用PCR機進行擴增。瓊脂糖凝膠電泳用於產物檢測。如果藉由雷射誘發加熱，成功複製λ DNA的中間序列，則在電泳結果中僅能檢測到中心複製的產物(429bp)。

當蓋玻片未用牛血清白蛋白(BSA)21塗佈時，在該蓋玻片11上觀察到顯著的Qdots22螢光，如第6圖(a)所示。當該蓋玻片11塗佈有牛血清白蛋白(BSA)21時，該蓋玻片上的Qdots22螢光基本上較低，即只有一個螢光點，如第6圖(b)中的白色箭頭所示。該發現與我們之前的研究相對應，其中牛血清白蛋白(BSA)21阻止Qdots22吸附至玻璃表面上。

藉由介電泳係可使λ DNA拉伸及固定，即施加電場後可觀察到許多DNA鏈結二個相鄰的電極，表明DNA的二端都固定在該二個鋁電極板上，如第7圖(a)所示。當注射1nM YO-PRO-1溶液時，DNA鏈保持固定在該二個鋁電極板上，且DNA的螢光強度隨著嵌入螢光染料的濃度而增加，如第7圖(b)。

隨後，為了確定是否藉由雷射照射會切割固定的DNA鏈，藉由80mW雷射照射DNA鏈1分鐘(在本研究中，熱循環的最高雷射功率為72mW)，其結果如第8圖所示。第8圖(a)顯示雷射光照射前DNA(用嵌入螢光染料染色)的螢光圖。照射後之DNA鏈的螢光強度立即降低(數據未顯示)。然而，在雷射照射後，DNA的螢光強度開始逐漸恢復，如第8圖(b)所示。因此，第8圖所示的結果證實，即使施加相對高的雷射能量，也不能切割固定的DNA。該結果與我們之前的研究結果一致。

隨後，藉由雷射誘發加熱複製DNA。雷射熱循環的條件如第5圖的表1所示。第9圖顯示了藉由雷射誘發加熱的局部DNA序列複製的結果，以及使用Qdots的原位產物檢測結果(參見第2圖)。當確認DNA鏈固定在該二個鋁電極板上時，用雷射照射DNA的中心位置，如第9圖(a)中的白色箭頭所示。第9圖(b)顯示了在進行六次熱循環後，蓋玻片上的Qdot螢光強度。六次熱循環後Qdot螢光強度(如第9圖(b)中的白點)大於複製前的Qdot螢光強度。第9圖(c)-第9圖(f)則分別表示9、12、15及18個熱循環後，蓋玻片上的Qdot螢光強度，表明螢光強度隨著複製產物數量的增加而增加。

為了計算蓋玻片上的Qdot螢光強度，應用以下等式：R=(I_t-I_bla)/(I_pro-I_bla)。在該等式中，I_pro及I_t分別是複製前後Qdots的螢光強度；和I_bla代表蓋玻片表面的背景值。當R>1 時，結果與背景值不同。根據第9圖(b)-第9圖(f)中的Qdot螢光強度計算。6、9、12、15及18個熱循環的平均計算R值分別為5.9、9.0、9.6、14.5及19.8，即使僅進行6次熱循環，R也超過1。此外，R隨著所施加的熱循環次數而增加。結果證明，藉由雷射誘發的加熱，目標DNA的擴增隨著熱循環次數的增加而增加。另外，發現複製產物的數量受到該二鋁電極板上拉伸及固定的DNA量的影響，特別是對於更高次數的熱循環。因此，在雷射誘發加熱18個熱循環的Qdots的螢光強度誤差範圍比小於18個熱循環時的結果較高(如第10圖所示)。

為了確定凝膠電泳是否可用於通過雷射誘發加熱產生的複製產物之檢測，回收所有在各種熱循環中產生的產物，並藉由瓊脂糖凝膠電泳檢測該產物。結果證明，在經受雷射誘發加熱的樣品中未檢測到產物(數據未顯示)。根據我們以前的結果，如果產品數量充足，凝膠電泳可以檢測使用在先前研究中以相同應用方法產生的複製產物。因此，不能觀察到明亮產物帶的原因，可能是藉由雷射誘發的加熱產生的複製產物量不足。在藉由雷射誘發的加熱產生的複製產物被回收後，使用PCR機器加熱30個熱循環(用中心引子及右端引子)；其加熱條件如第5圖之表1所示。隨後，應用瓊脂糖凝膠電泳來檢測產物。第11圖顯示了結果。在藉由雷射誘發加熱產生的複製產物中，使用生物素化引子(中心位置：429bp)的複製序列被認為是唯一可觀察的序列。然而，如第11圖所示(第1行係為標準樣品；第2行係為雷射加熱6個循環後的回收樣品；第3行係為雷射加熱9個循環後的回收樣品；第4行係為雷射加熱12個循環後的回收樣品；第5行係為雷射加熱15個循環後的回收樣品；第6行係為雷射加熱18個循環後的回收樣品；第M行係為標記)，由雷射誘發加熱及PCR機產生的複製產物都含有由生物素化引子(429bp)及右端引子(480bp)所複製的序列。其結果可歸因於鋁電極固定λ DNA時，多餘的λ DNA附著於微流道表面。但在回收複製產物過程，多餘的λ DNA與雷射誘發的加熱複製產物一起被回收。此外，所提出的檢測方法比凝膠電泳更靈敏。再者，該檢測方法與微流道中局部DNA序列的複製相結合，進而簡化了操作過程。

本發明所提供之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，係一種與微電極製造、光學雷射及圖像處理系統整合的微流體平台，用於複製局部的原位DNA序列，並通過使用螢光強度進行原位產物檢測。在本發明中，產品一端的生物素與蓋玻片表面的抗生物素蛋白鏈合，而另一端的生物素與Qdots結合；通過使用Qdot螢光強度可以直接原位檢測產物。即使僅有6個熱循環，Q點螢光強度(R)的比率也超過1。R值隨著熱循環次數的增加而增加，表明複製產品的數量在增加。因此，本研究開發的方法可以成功地高靈敏度的檢測出少量產物，並且能夠高效率地複製局部原位DNA序列。該技術可以直接與依據表面張力及靜電吸引的整合作用與長DNA奈米纖維晶片結合提供最新發展，以便在單次測量中提供基因組的DNA檢測。將來，該方法可用於農業生物學中新植物品種的快速基因測序。

以上所述之實施例僅係為說明本發明之技術思想及特徵，其目的在使熟習此項技藝之人士均能了解本發明之內容並據以實施，當不能以此限定本發明之專利範圍，凡依本發明之精神及說明書內容所作之均等變化或修飾，皆應涵蓋於本發明專利範圍內。

綜上所述，由於本發明具有上述優點及實用價值，而且在同類產品中均未見有類似之產品發表，故已符合發明專利之申請要件，乃爰依法提出申請。

Claims

一種以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，包括：(A)備製一微流道，其中，將一製備塗抹抗生物素蛋白的蓋玻片置於含有二個鋁電極板的玻璃上，將一雙面膠帶黏接至該蓋玻片頂部及底部的邊緣，形成該微流道；(B)注入20μl Qdots(1nM)至該微流道中，以形成一樣品，其中，該樣品被靜置40分鐘，以便確認Qdots是否附著於該蓋玻片表面，利用一緩衝液清洗多餘的Qdots；(C)注入DNA溶液，並施加一電場藉以產生介電泳；(D)拉伸DNA並將其二端固定在該二個鋁電極板上，並使用緩衝液洗掉多餘的DNA；(E)注入DNA複製聚合酶及溶液；(F)使用紅外線雷射照射該固定的DNA的中間位置，並分別施加六、九、十二、十五及十八個的熱循環；(G)複製完成後，將樣品在室溫下靜置40分鐘；(H)用緩衝液洗滌樣品，注入20μl Qdots(1nM)，並在室溫下靜置40分鐘；以及(I)計算該蓋玻片上Qdots22的螢光強度。
如請求項1所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，其中該(A)步驟中，係將100ng/ml抗生物素蛋白塗抹於該蓋玻片的表面上，並在室溫下靜置40分鐘，然後利用緩衝液沖洗任何多餘的抗生物素蛋白，然後再該蓋玻片表面上，加入100mg/ml牛血清白蛋白(BSA)，並在室溫下靜置 30分鐘，該緩衝液係用於沖洗多餘的BSA。
如請求項1所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，其中該微流道之高度<30μm。
如請求項1所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，其中該(A)步驟中的緩衝液係為10mMTris-HCl+50mM KCl，且其pH值為7.2。
如請求項1所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，其中該(C)步驟中，該DNA溶液係為1ng/μl λ DNA，2μM YO-PRO-1,1%(v/v)β-ME，該電場係為10⁶V/m(1MHz)。
如請求項1所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，其中該(D)步驟中，該二鋁電極板係誘導該DNA的二端分佈正電荷及負電荷，並拉伸該DNA成直線，使其二端固定在該二鋁電極板上，其中，作用於該DNA的作用力係為介電泳力。
如請求項1所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，其中該(E)步驟中所注入之溶液係為1×Taq緩衝液，0.02單位/μl Taq，0.2mM dNTP，1μM生物素化引子。
如請求項1所述之以雷射誘發加熱於微流道中的原位DNA複製及檢測方法，其中該(A)步驟中，該二個鋁電極板12之製作步驟為：(A1)將鋁金屬氣相沉積至該玻璃表面，且每一鋁電極板之厚度小於170nm；(A2)塗佈光阻劑，軟烤，曝光，顯影，鋁蝕刻，以去除每一鋁電極板之光阻；(A3)利用3%氟化銨蝕刻該二鋁電極板之間的玻璃，產生每一高度約3μm的鋁電極板，且該二鋁電極板之間的間距為12μm。