TWI703215B

TWI703215B - 用於預測藥物功效之活體外診斷方法

Info

Publication number: TWI703215B
Application number: TW107147642A
Authority: TW
Inventors: 張嘉銘; 陳偉瑋; 孫維萱; 玄俊孔; 凱瑟琳米雪兒蘇利文
Original assignee: 財團法人生物技術開發中心; 美國伊利諾大學理事會
Priority date: 2017-12-28
Filing date: 2018-12-28
Publication date: 2020-09-01
Also published as: WO2019133767A1; TW201938789A

Abstract

本發明係揭示用於診斷或分析之3D類器官，其中該3D類器官係構築自腫瘤細胞。該3D類器官中之腫瘤細胞係來自細胞株、來自分離自患者之循環腫瘤細胞，或來自腫瘤組織。該3D類器官係使用水性凝膠材料及黏附分子構築。該水性凝膠材料係水凝膠。該黏附分子係ICAM-1或半乳糖凝集素-3。該3D類器官藉由形成具有水性凝膠材料之支架，接著添加該腫瘤細胞及黏附分子之混合物來構築。

Description

用於預測藥物功效之活體外診斷方法

本發明大體上關於用於預測藥物功效或作用之診斷或分析方法。

臨床前研究中之傳統2D細胞培養物可以提供許多重要的藥物功效預測。然而，在臨床中，患者對藥物之反應或基因之表現與臨床前環境中之彼等極為不同。因此，新的3D類器官系統可以提供改進的藥物測試環境並提供模擬臨床環境以便說明藥物作用之細胞模型。

3D類器官係以3D形式活體外生產的小型化器官之模擬物。3D類器官通常衍生自來自組織、胚胎幹細胞或誘導多能幹細胞中之一個或幾個細胞，其可以由於其自我更新及分化能力而在3D培養物中繁殖及自組織。

3D類器官模型可用於建立特定組織之結構及功能。由於其結構及模式與真實組織非常相似，因此3D類器官模型可以提供適當的細胞-細胞及細胞-細胞基質相互作用，藉此彌補了習知2D活體外細胞培養系統之缺點，該等系統缺乏在臨床患者中可見之腫瘤異質性及分子多樣性、細胞異質性、腫瘤微環境及組織特徵。基於3D類器官之活體外模型可用於抗癌藥物開發/測試，並且亦可提供用於篩檢針對復發性腫瘤之治療劑的及時分析資料。

本發明之實施例係關於用於診斷或分析藥物功效之3D類器官系統。本發明之一個態樣係關於用於診斷或分析之3D類器官。根據本發明之一個實施例之3D類器官可以由腫瘤細胞構築。3D類器官中之腫瘤細胞可以來自細胞株，來自分離自患者之循環腫瘤細胞，或來自腫瘤組織。3D類器官可以使用水性凝膠材料及黏附分子構築。水性凝膠材料可以係水凝膠。黏附分子可以係ICAM-1或半乳糖凝集素-3。3D類器官可以藉由用水性凝膠材料形成支架，接著添加腫瘤細胞及黏附分子之混合物來構築。

本發明之一個態樣係關於使用本發明之3D類器官的藥物功效或反應分析之方法。根據本發明之一個實施例的方法包含將藥物添加至3D類器官中並觀察藥物對3D類器官中之細胞的作用。藥物之作用使用成像系統分析以分析基因或蛋白質之表現量。藥物之作用使用螢光標記、發光或亮光分析。

藉由以下實施方式及附圖，本發明之其他態樣將變得顯而易見。

本發明之實施例係關於用於診斷或分析藥物功效之3D類器官系統。本發明之實施例亦關於用於建立3D類器官系統之方法及使用3D類器官來分析藥物治療作用之方法。

3D類器官腫瘤培養可用於建立組織之結構及功能。3D類器官之結構及功能與實際組織高度相似。其可以提供細胞-細胞相互作用以及細胞-基質相互作用。因此，3D類器官模型可以克服活體外2D細胞培養物之缺點，2D細胞培養物通常不能呈現臨床觀察到之腫瘤異質性及分子多樣性、細胞異質性、腫瘤環境及組織特徵。使用3D類器官模型，可以提供抗腫瘤藥物測試之及時資訊，並可以提供治療腫瘤復發之藥物篩檢資訊。

根據本發明之一個實施例之3D類器官可以由腫瘤細胞構築。3D類器官中之腫瘤細胞可以來自細胞株，來自分離自患者之循環腫瘤細胞，或來自腫瘤組織。可以使用水性凝膠材料及黏附分子構築3D類器官。水性凝膠材料可以係水凝膠。本發明之3D類器官可以藉由用水性凝膠材料形成支架，接著添加腫瘤細胞及黏附分子之混合物來構築。

本發明之發明人發現，向培養物中添加黏附分子可以極大地改進3D類器官形成。黏附分子可以係此項技術中已知的任何合適的黏附分子，諸如ICAM-1及/或半乳糖凝集素-3。

本發明之3D類器官可用於分析藥物功效。根據本發明之一個實施例的藥物分析方法包含將藥物添加至3D類器官中並觀察藥物對3D類器官中之細胞之作用。可以使用任何合適的方法，例如使用成像系統分析藥物之作用，以分析基因或蛋白質之表現量。舉例而言，使用成像系統，可以使用顯微鏡及螢光標記、發光或白光來分析藥物之作用。

為了測試藥物功效，可以使用來自患者，例如來自腫瘤組織或來自分離自液體活體組織切片之循環腫瘤細胞(CTC)之腫瘤細胞建立3D類器官模型。替代地，可以使用與患者中關注腫瘤具有相同遺傳背景之細胞建立類器官系統。已經建立了若干3D類器官系統或腫瘤模型。

為了進行藥物功效分析，可以在24孔或96孔板中建立3D類器官。接著，可以將各種濃度的藥物添加至每個孔中。接著，將監測藥物對細胞之作用，例如藉由監測酶或標記物來進行。舉例而言，可以監測作為細胞活性之指示的ATP酶活性。

另外，可以使用光學方法對3D類器官細胞進行成像以理解藥物作用。舉例而言，可以使用單分子RNA FISH來監測已知受藥物影響之特定基因表現。可以使用生物成像系統來監測及量化基因之表現量。來自此類分析之定量資訊可用於獲得IC50值或自各種藥物獲得z得分。

根據本發明之實施例，3D類器官可用於建立藥物劑量關係。舉例而言，將癌細胞接種在24孔或96孔板中。一旦自癌細胞建立3D類器官模型。可以將待測試之藥物以不同濃度(例如，10 nM-1,000 nM)添加至3D類器官系統中。在與藥物一起培育後，可以提取細胞之總RNA以產生cDNA(例如，使用PCR)。接著，可以在qPCR中使用cDNA來監測藥物作用下的特異性標誌物表現。

舉例而言，已知3種基因與肺癌相關。基於此3種基因，可以找到相應的細胞株來產生3D類器官。在建立3D類器官後，可以使用該等3D類器官來評估靶向療法對此3種基因表現之作用。

將利用以下具體實例進一步說明本發明之實施例。熟習此項技術者將理解，此等實例僅用於說明而並非用於限制本發明之範疇。熟習此項技術者將理解，在不脫離本發明之範疇之情況下，可以對此等實例進行修改及變化。實例1：半乳糖凝集素-3改進3D腫瘤類器官形成

來自活體外培養物之兩種不同的肺癌細胞株(HCC-827及NCI-H727)分別用於建立2D細胞培養物及3D類器官細胞培養物。簡言之，將1×10⁵ 個細胞/毫升肺癌細胞添加至96孔低附著板之每個孔中，其中每個孔亦含有特定濃度之黏附分子(例如半乳糖凝集素-3)。細胞經培養以形成3D類器官。3D類器官之生長及大小尺寸變化可以使用顯微鏡進行監測。

如圖1所示，在第4天，3D類器官在含有濃度為0.3 μg/mL、0.6 μg/mL、1.25 μg/mL及2.5 μg/mL之黏附分子(半乳糖凝集素-3，Gal-3)的孔中經建立成熟。在存在黏附分子之情況下，3D類器官之尺寸約大50%。此外，NCI-H727細胞在黏附分子存在下會形成帶狀結構。此等結果表明黏附分子可以支持較大之3D類器官的形成。實例2：水凝膠及半乳糖凝集素-3可以刺激血管3D類器官之形成

水凝膠可以用不同比率的膠原及PEG製備，諸如1:2、1:4、1:6及1:8(膠原:PEG)。舉例而言，將3 mg/ml I型膠原及300 mg/ml PEG(例如7500 MW)添加至細胞培養基(含有10%牛血清或5%人血清)中。將此溶液與由乙酸及10X MEM細胞培養基組成之重建溶液充分混合，接著使其在細胞培養箱中靜置20分鐘或更長時間以形成水凝膠。

製備1×10⁵ 個細胞/毫升腫瘤細胞、2×10⁴ 個細胞/毫升血管內皮細胞(腫瘤細胞:血管內皮細胞=5:1)及1 μg/mL半乳糖凝集素-3之均質混合物。將此均質混合物注入前述所製備之水凝膠中。將水凝膠置於細胞培養箱(37℃，5% CO₂ )中進行培育。用自動多功能光學成像系統(Cytation 5，Bio-Tek, USA)監測生長進程。圖2顯示具有及不具有Gal-3以及具有或不具有EC(內皮細胞)之3D類器官形成隨時間之進展。

如圖2所示，用1:4、1:6及1:8之膠原:PEG比率製備之水凝膠可以更好地支持細胞團(類器官)形成。隨著Gal-3(黏附分子)之添加，3D類器官之形成得以進一步增強。藉由添加內皮細胞(EC)，可觀察到血管之形成。實例3-1：與3D類器官系統相比，基因在2D細胞培養系統中表現不同

在此實例中，來自活體外培養物之4種不同的肺癌細胞株(HCC-827、NCI-H727、A549及H1975)用於建立2D細胞及3D類器官培養系統。程序如下。

在96孔低附著板中接種1×10⁵ 個細胞/毫升肺癌細胞與特定濃度的黏附分子以培養3D類器官。在顯微鏡下觀察並記錄3D類器官的尺寸(參見圖1)。

為了建立2D細胞培養模型，程序如下：在24孔板中分別接種4種人肺癌細胞株(1×10⁵ 個細胞/毫升)。將板在5% CO₂ 、37℃條件下培育隔夜。在顯微鏡下確認細胞完全覆蓋了孔，接著收集細胞。

為了建立3D類器官模型，程序如下：在低附著24孔板中分別接種4種人肺癌細胞株(6×10⁵ 個細胞/毫升)。在5% CO₂ 、37℃之條件下培育板直至第7天。在第7天，收集3D類器官細胞群。

自2D細胞培養物及3D類器官收集細胞後，分別自此等細胞中進行總RNA提取。接著，自總RNA合成cDNA以構築cDNA形式。

使用即時定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析來自2D細胞培養物及3D類器官之cDNA中之PIK3CA、EGFR及KRAS的基因表現量。

來自此等分析之PIK3CA、EGFR及KRAS之表現量顯示在圖3中。如圖3所示，在大多數肺癌細胞株中，與2D培養系統中之彼等相比，3D類器官培養物中EGFR、PIK3CA及KRAS之表現量相對較低。實例3-2：PLX3397(CSF1R抑制劑)治療作用

測試方法：

2D細胞培養：在24孔板中分別接種4種人肺癌細胞株(1×10⁵ 個細胞/毫升)。將板在5% CO₂ 、37℃之條件下培育隔夜。

在顯微鏡下確認細胞完全覆蓋了孔，接著將10、100及1,000 nM的PLX3397的預製溶液分別添加至孔中。接著，在5% CO₂ 、37℃之條件下培育板24小時。

3D類器官培養：在低附著24孔板中分別接種4種人肺癌細胞株(6×10⁵ 個細胞/毫升)。在5% CO₂ 、37℃之條件下培育板直至第7天。在第7天，將10、100及1,000 nM的PLX3397的預製溶液分別添加至孔中。接著，在5% CO₂ 、37℃之條件下培育板24小時。

使用即時定量聚合酶鏈反應(qPCR)分析來自2D細胞培養物及3D類器官之cDNA中PIK3CA、EGFR及KRAS之基因表現量。藥物處理後PIK3CA、EGFR及KRAS之表現量如圖4所示。

如圖4所示，使用2D細胞培養系統，因應HCC-827及NCI-H727細胞中經培昔達尼(Pexidartinib，PLX3397；CSF1R抑制劑)處理，PIK3CA、EGFR及KRAS之基因表現量會增加，但在A549及H1975細胞中卻沒有增加。此等結果在KAS野生型及突變型兩者中均有發現。然而，使用3D類器官系統，經以PLX3397處理僅有PIK3CA會增加，而EGFR及KRAS不會增加。

此等結果清楚地表明2D細胞培養系統及3D類器官系統產生不一致之結果。如後文章節討論，該等3D類器官系統之結果可利用活體內動物異種移植物測試得以驗證，然而該等來自2D細胞培養系統之結果無法以活體內動物模型得到支持。實例4：使用3D類器官腫瘤培養系統評估藥物之治療作用

為了進行此等測試，使用若干種活體外培養的肺癌細胞株(例如，HCC-827、NCI-H460、NCI-H727及NCI-H1975)及結腸直腸癌細胞(例如，HCT-116及HT-29)建立2D細胞培養物及3D類器官類腫瘤系統。簡言之，將1×10⁴ 個細胞/毫升腫瘤細胞置於96孔低附著板之每個孔中，以培養2D細胞培養物及3D類器官腫瘤系統。

作為藥物功效測試之一實例，11種不同的化學治療劑、靶向治療劑及免疫調節劑(0、0.01、0.1、1及10 nM)以及半胱天冬酶3/7螢光偵測套組試劑個別地在2D細胞培養物及3天齡3D類器官腫瘤系統中進行測試。使反應進行24小時。

24小時後，2D細胞培養物及3D類器官中之半胱天冬酶3/7螢光產率用自動多功能光學成像系統(Cytation 5，Bio-Tek, USA)定量。結果如圖5所示。

如圖5所示，不同的治療劑對不同的腫瘤細胞具有不同的作用。此係眾所周知的。值得注意的是，2D細胞培養系統與3D類器官系統之間的不一致。舉例而言，紫杉醇(Pacitaxel)、吉非替尼(Gefitinib)及厄洛替尼(Erlotinib)在2D細胞培養系統中顯示出對HCC-827肺癌細胞有效，而此等相同的藥物在3D類器官系統中無效。相反，3D類器官系統顯示僅阿法替尼(Afatinib)對HCC-827有效。顯示出此種不一致係由於2D細胞培養系統之不準確結果，因為在活體內動物異種移植模型中驗證了3D類器官系統之結果，但未驗證2D細胞培養系統之結果(參見後面的部分及圖6)。實例5：使用動物異種移植模型驗證2D細胞培養系統及3D類器官系統

皮下注射HCC-827肺癌細胞以建立異種移植模型，用於驗證來自2D細胞培養系統及3D類器官系統之藥物功效測試結果。簡言之，將0.1 ml HCC-827肺癌細胞(2×10⁶ 個細胞/毫升)皮下注射至小鼠的背部中。1週後，用數位測徑規測定腫瘤尺寸。當腫瘤生長至100-150 mm³ 之尺寸時，可以開始藥物測試。

經由經口飼管每週給予阿法替尼5次，且每週給予紫杉醇一次，持續4週。每週量測腫瘤尺寸及動物體重兩次，持續4週。動物測試結果如圖6所示。

如圖6所示，5 mpk或20 mpk的紫杉醇對抑制腫瘤生長無效。相反，5 mpk或20 mpk(mg/kg)阿法替尼在抑制腫瘤生長方面非常有效。此等結果與使用本發明之3D類器官觀察到之結果一致，藉此驗證了本發明之3D類器官用於藥物功效測試。

參考圖5，2D細胞培養系統亦顯示紫杉醇係有效的。此並非係用活體內異種移植模型驗證的。此結果證明習知2D細胞培養系統不如本發明之3D類器官系統可靠。實例6：3D類器官系統中之源自患者的腫瘤重建

將患者之結腸直腸癌細胞接種至小鼠中以建立異種移植物。自異種移植物中取出一塊300 mm³ 的結腸直腸癌組織，且用膠原酶NB4G(0.5 PZU/mL)消化組織40分鐘以分離細胞。

用HBSS緩衝液洗滌細胞。離心並取細胞懸浮液進行實驗。將約5×10⁴ 個細胞添加至96孔之各孔中的含水凝膠之細胞培養基中，並向各孔中添加半乳糖凝集素-3(Gal-3，1 μg/mL)。使用自動多功能光學成像系統(Cytation 5，Bio-Tek, USA)在接下來的幾天內分析孔中腫瘤塊之尺寸。結果如圖7所示。

如圖7所示，在添加或不添加黏附分子(Gal-3)之情況下，腫瘤塊基本上經4天生長。然而，與沒有添加黏附分子之孔相比，具有Gal-3之孔產生更好的有組織腫瘤塊。實例7：含有血管細胞之3D類器官模型

將由膠原及PEG(MW=7500；比率為1:2)製備之水凝膠置於96孔板之孔中。簡言之，將細胞培養基(含有10%牛血清或5%人血清)、3 mg/ml I型膠原、300 mg/ml PEG(7500 MW)及由乙酸及10X MEM細胞培養基組成之重建溶液充分混合，接著使混合物在細胞培養箱中靜置20分鐘或更長時間以形成水凝膠。

混合1×10⁵ 個細胞/毫升腫瘤細胞、2×10⁴ 個細胞/毫升血管內皮細胞(腫瘤細胞:血管內皮細胞=5:1)及1 μg/ml Gal-3。將混合物注入水凝膠中並將板在細胞培養箱(37℃，5% CO₂ )中培育以培育2天，從而允許形成含有血管之腫瘤塊。

將2 μl抗CD31抗體[JC/70A](Alexa Flour^® 647) ab215912添加至來自上述培育之板之每個孔中以染色血管內皮細胞標記物，並使反應在培養箱中進行60分鐘(確保阻擋燈光)。

添加0.05% Triton X100透化細胞，且使反應在冰上進行15分鐘。接著，添加450 nM DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽，D1306，Invitrogen™)染色劑以染色細胞。使染色在黑暗中進行1小時，接著將容器置於細胞培養箱中12-16小時。

使用自動多功能光學成像系統(Cytation 5，Bio-Tek, USA)量測抗CD31及DAPI染色之螢光強度。結果如圖8所示。

如圖8所示，3D類器官之程序已經作為測試1、測試2及測試3重複。影像顯示類器官中血管之形成。所有三個實驗產生了一致的結果。

上述實例清楚地表明，藉助於黏附分子(例如，半乳糖凝集素-3、ICAM-1或類似的黏附分子)可以有效地構築3D類器官。在代表活體內微環境方面，3D類器官比2D細胞培養物更準確，且因此，3D類器官可用於準確評估藥物之治療作用。此外，可以建立包括血管形成之3D類器官，以更準確地代表活體內腫瘤微環境。

已經用有限數目之實例說明了本發明之實施例。然而，熟習此項技術者將理解，此等具體程序僅用於說明，且在不脫離本發明範疇之情況下可以進行其他變化及修改。因此，本發明之範疇應由所附申請專利範圍確定。

圖1顯示藉由添加黏附分子改進3D類器官培養物。黏附分子(半乳糖凝集素-3，Gal-3)濃度為0.3 μg/mL、0.6 μg/mL、1.25 μg/mL及2.5 μg/mL。在存在黏附分子之情況下，3D類器官之尺寸約50%更大。此外，NCI-H727細胞在黏附分子存在下形成帶狀結構。此等結果表明黏附分子可以支持更大之3D類器官之形成。

圖2顯示用不同膠原/PEG比率製備之不同水凝膠對類器官形成之影響。膠原:PEG比率為1:4、1:6及1:8可以更好地支持細胞團(類器官)形成。隨著Gal-3(黏附分子)之添加，3D類器官之形成得以進一步增強。藉由添加內皮細胞(EC)，可觀察到血管之形成。

圖3顯示2D細胞培養物相比於3D類器官中之差異基因表現。舉例而言，在大多數肺癌細胞株中，與2D培養系統中之彼等相比，3D類器官培養物中EGFR、PIK3CA及KRAS之表現量相對較低。

圖4顯示2D細胞培養物相比於3D類器官中藥物處理之不同作用。因應HCC827及NCI-H727細胞中經培昔達尼(PLX3397；CSF1R抑制劑)處理後，PIK3CA、EGFR及KRAS之基因表現量會增加。與2D培養物中之彼等相比，在3D類器官培養物中觀察到較低表現量。PLX3397處理在A549及H1975細胞中未顯示劑量依賴性作用。

圖5顯示各種治療劑在2D細胞培養物或3D類器官中之作用。不同的治療劑對不同的腫瘤細胞有不同之作用。然而，2D細胞培養系統及3D類器官系統顯示出不同之結果。舉例而言，紫杉醇、吉非替尼及厄洛替尼在2D細胞培養系統中顯示出對HCC-827肺癌細胞有效，而此等相同的藥物在3D類器官系統中無效。相反，3D類器官系統顯示僅阿法替尼對HCC-827有效。顯示出此種不一致係由於2D細胞培養系統之不準確結果。

圖6顯示使用活體內動物模型驗證3D類器官系統之結果。5 mpk或20 mpk之紫杉醇在抑制腫瘤生長方面無效。相反，5 mpk或20 mpk(mg/kg)阿法替尼在抑制腫瘤生長方面非常有效。此等結果與使用本發明之3D類器官觀察到之結果一致，藉此驗證了本發明之3D類器官用於藥物功效測試。

圖7顯示用源自患者之異種移植物建立之3D類器官之結果。與沒有添加黏附分子之彼等相比，Gal-3之添加產生更好的有組織腫瘤塊。

圖8顯示含有血管細胞之3D類器官模型。

Claims

一種用於診斷或分析之3D類器官，其中該3D類器官係由腫瘤細胞及黏附分子構築，其中該腫瘤細胞為肺癌或結腸直腸癌細胞，且其中該黏附分子為半乳糖凝集素-3。
如請求項1之3D類器官，其中該3D類器官中之腫瘤細胞來自細胞株、來自分離自患者之循環腫瘤細胞，或來自腫瘤組織。
如請求項2之3D類器官，其中該3D類器官係使用水凝膠材料及黏附分子構築的。
如請求項3之3D類器官，其中該水凝膠用PEG及膠原以PEG：膠原=1至25：1之比率製備。
如請求項1之3D類器官，其中該黏附分子之濃度為0.3μg/mL至2.5μg/mL。
如請求項1之3D類器官，其中該3D類器官藉由形成具有水凝膠材料之支架，接著添加該腫瘤細胞及黏附分子之混合物來構築。
如請求項6之3D類器官，其中該水性凝膠材料包含PEG及膠原，其中PEG：膠原之比率為1至25：1。
如請求項6之3D類器官，其中該黏附分子之濃度為0.3μg/mL至2.5μg/mL。
如請求項1之3D類器官，其進一步包含自該3D類器官中之內皮細胞所形成之血管。
一種使用如請求項1之3D類器官的藥物功效或反應分析之方法，其包含將藥物添加至該3D類器官中並觀察該藥物對該3D類器官中細胞的作用。
如請求項10之方法，其中該藥物之作用係使用成像系統進行分析，以分析基因或蛋白質之生物化學活性及/或表現量。
如請求項11之方法，其中該藥物之作用係使用螢光標記、發光或白光分析。