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TWI798168B - 溶瘤病毒載體及其用途 - Google Patents

溶瘤病毒載體及其用途

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TWI798168B
TWI798168B TW106103584A TW106103584A TWI798168B TW I798168 B TWI798168 B TW I798168B TW 106103584 A TW106103584 A TW 106103584A TW 106103584 A TW106103584 A TW 106103584A TW I798168 B TWI798168 B TW I798168B
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oncolytic virus
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肯尼斯 P 格林伯格
米確爾 H 芬奈
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美商昂克諾斯公司
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Abstract

本發明係關於用於治療及預防癌症之重組體病毒載體。溶瘤病毒載體納入以下一或多種特徵：藉由將腫瘤抑制性微小RNA (miRNA)靶序列插入病毒基因體中限制病毒複製；破壞致癌miRNA功能；癌症微環境重塑；及藉由將蛋白酶活化之抗體納入病毒顆粒中以靶向癌細胞。

Description

溶瘤病毒載體及其用途
本發明係關於用於治療及預防癌症之重組體病毒載體。病毒載體利用以下態樣中之一或多者：藉由將腫瘤抑制性微小RNA(miRNA)靶序列插入病毒基因體中限制病毒複製；破壞致癌miRNA功能；癌症微環境重塑；及/或藉由將蛋白酶活化之抗體納入病毒顆粒中以靶向癌細胞。
由於腫瘤蛋白質表現特性之異質性，目前靶向之癌症治療劑僅在窄範圍之癌症中有效。此外，許多癌症治療(包括現存病毒載體、化學療法、放射及手術)缺乏在維持正常、非癌細胞之健康及存活的同時選擇性治療癌細胞之特異性，且可產生不期望脫靶效應。因此，業內需要在多種癌症中廣泛有效且能選擇性消除癌細胞之癌症療法。
溶瘤病毒係優先感染癌細胞之病毒且已用於癌症治療之多種臨床前及臨床研究中。使用溶瘤病毒帶有健康細胞之非特異性病毒感染之風險，從而導致非癌細胞及組織死亡。然而，遺傳操縱病毒以利用在正常對癌性組織中差異表現之路徑、蛋白質及基因可增加該等病毒之特異性並限制脫靶感染及細胞死亡。
微小RNA(miRNA或miR)係小的非編碼內源性RNA，其藉由引導其靶信使RNA進行降解或轉譯抑制調控基因表現。miRNA與正常細胞過程 緊密相關且因此，miRNA之失調促使多種疾病，包括癌症。許多miRNA基因位於癌症相關之基因體區或脆性位點中，此進一步強化miRNA在癌症中起重要作用之證據。miRNA在癌組織中之表現與正常組織相比不同且可對腫瘤形成具有因果關係。藉由利用不同腫瘤類型中之此差異miRNA表現，本文所述癌症治療劑具有光譜安全性及效能特性，其中基於特定miRNA或miRNA組之表現調控溶瘤病毒複製。此外，本文所述溶瘤病毒亦可表現促進貫穿腫瘤病毒擴散之蛋白質，例如改變調控細胞外基質之基因及蛋白質表現、藉此增加其治療效能之彼等。
本發明係關於用於治療及預防癌症之重組體病毒載體。溶瘤病毒載體包含個別或組合之以下態樣：藉由將腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列插入病毒基因體中將病毒載體複製限於癌症或腫瘤細胞；將一或多個基因納入產物破壞致癌miRNA及/或癌症細胞外基質之功能之病毒基因體中；及藉由將蛋白酶活化之抗體納入病毒顆粒中使載體高度選擇性靶向癌症/腫瘤細胞。
在一些實施例中，本發明提供包含一或多個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列之一或多個複本的重組體溶瘤病毒。在一些實施例中，病毒係單純皰疹病毒、腺病毒、脊髓灰質炎病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水皰性口炎病毒、正黏液病毒、小病毒、馬拉巴病毒(maraba virus)或柯薩奇病毒(coxsackievirus)。在一些實施例中，病毒係單純皰疹病毒且其中病毒複製所需之一或多個病毒基因係選自由以下組成之群：UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、 UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係選自表3之miR之靶序列。在一些實施例中，將一或多個腫瘤抑制性miR靶序列納入病毒複製所需之一或多個病毒基因之5’未轉譯區(UTR)或3’UTR中。
在一些實施例中，本發明提供包含一或多個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列之一或多個複本的重組體溶瘤病毒，其中與第二細胞中之病毒複製相比，第一細胞中之病毒複製減少或減弱。在一些實施例中，與第二細胞中能結合至一或多個腫瘤抑制性miR靶序列之腫瘤抑制性miR之表現相比，第一細胞具有腫瘤抑制性miR之增加表現。在一些實施例中，第一細胞中腫瘤抑制性miR之表現程度較第二細胞中腫瘤抑制性miR之表現程度大至少5%。在一些實施例中，與第一細胞中腫瘤抑制性miR之表現相比，第二細胞具有能結合至一或多個腫瘤抑制性miR靶序列之腫瘤抑制性miR之降低表現。在一些實施例中，第二細胞中腫瘤抑制性miR之表現程度較第一細胞中腫瘤抑制性miR之表現程度小至少5%。在一些實施例中，第二細胞係癌細胞。
在一些實施例中，本發明提供包含一或多個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列之一或多個複本的重組體溶瘤病毒，其中腫瘤抑制性miR靶序列係針對miR-124、miR-451a、miR-143-3p及miR-559之靶序列。在其他實施例中，溶瘤病 毒用於治療胰臟癌、肺癌及/或結腸癌。在一些實施例中，溶瘤病毒包含miR-124、miR-451、miR-143-3p、miR-1及miR-559之腫瘤抑制性miR靶序列。在一些實施例中，溶瘤病毒包含miR-124、miR-451、miR-145-5p及miR-559之腫瘤抑制性miR靶序列。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療源自任一類型之癌症之腫瘤。在一些實施例中，溶瘤病毒包含miR-205p、miR-141-5p、miR-31-5p及miR-124之腫瘤抑制性miR靶序列。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療神經鞘瘤。在其他實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列插入ICP4、ICP27、UL19及/或UL30基因座中。
在一些實施例中，本發明提供包含一或多個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列之一或多個複本的重組體溶瘤病毒，其中腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：miR-136-3p、miR-432-5p、miR-1-3p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-493-5p、miR-223-5p、miR-223-5p、miR-136-5p、miR-451a、miR-487b-3p、miR-370-3p、miR-410-3p、miR-431-3p、miR-4485-3p、miR-4485-5p、miR-127-5p、miR-409-3p、miR-338-3p、miR-559、miR-411-5p、miR-133a-5p、miR-143-3p、miR-376b-3p、miR-758-3p、miR-1、miR-101、miR-1180、miR-1236、miR-124-3p、miR-125b、miR-126、miR-1280、miR-133a、miR-133b、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-155、miR-16、miR-18a、miR-192、miR-195、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-214、miR-218、miR-23b、miR-26a、miR-29c、miR-320c、miR-34a、miR-370、miR-409-3p、miR-429、miR-451b、miR-490-5p、miR-493、miR-576-3p及/或miR-99a。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療膀 胱癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：miR-1251-5p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-124-3p、miR-448、miR-138-2-3p、miR-490-5p、miR-129-1-3p、miR-1264、miR-3943、miR-490-3p、miR-383-5p、miR-133b、miR-129-2-3p、miR-128-2-5p、miR-133a-3p、miR-129-5p、miR-1-3p、miR-885-3p、miR-124-5p、miR-759、miR-7158-3p、miR-770-5p、miR-135a-5p、miR-885-5p、let-7g-5p、miR-100、miR-101、miR-106a、miR-124、miR-124a、miR-125a、miR-125a-5p、miR-125b、miR-127-3p、miR-128、miR-129、miR-136、miR-137、miR-139-5p、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-146b-5p、miR-149、miR-152、miR-153、miR-195、miR-21、miR-212-3p、miR-219-5p、miR-222、miR-29b、miR-31、miR-3189-3p、miR-320、miR-320a、miR-326、miR-330、miR-331-3p、miR-340、miR-342、miR-34a、miR-376a、miR-449a、miR-483-5p、miR-503、miR-577、miR-663、miR-7、miR-7-5p、miR-873、let-7a、let-7f、miR-107、miR-122、miR-124-5p、miR-139、miR-146a、miR-146b、miR-15b、miR-16、miR-181a、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-185、miR-199a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-203、miR-204、miR-205、miR-218、miR-23b、miR-26b、miR-27a、miR-29c、miR-328、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-375、miR-383、miR-451、miR-452、miR-495、miR-584、miR-622、miR-656、miR-98、miR-124-3p、miR-181b-5p、miR-200b及/或miR-3189-3p。在其他實施例中，溶 瘤病毒用於治療腦癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：miR-10b-5p、miR-126-3p、miR-145-3p、miR-451a、miR-199b-5p、miR-5683、miR-3195、miR-3182、miR-1271-5p、miR-204-5p、miR-409-5p、miR-136-5p、miR-514a-5p、miR-559、miR-483-3p、miR-1-3p、miR-6080、miR-144-3p、miR-10b-3p、miR-6130、miR-6089、miR-203b-5p、miR-4266、miR-4327、miR-5694、miR-193b、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122、miR-124、miR-1258、miR-125a-5p、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-129、miR-130a、miR-132、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-149、miR-152、miR-153、miR-15a、miR-16、miR-17-5p、miR-181a、miR-1826、miR-183、miR-185、miR-191、miR-193a-3p、miR-195、miR-199b-5p、miR-19a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-205、miR-206、miR-211、miR-216b、miR-218、miR-22、miR-26a、miR-26b、miR-300、miR-30a、miR-31、miR-335、miR-339-5p、miR-33b、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374a、miR-379、miR-381、miR-383、miR-425、miR-429、miR-450b-3p、miR-494、miR-495、miR-497、miR-502-5p、miR-517a、miR-574-3p、miR-638、miR-7、miR-720、miR-873、miR-874、miR-92a、miR-98、miR-99a、mmu-miR-290-3p及/或mmu-miR-290-5p。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療乳癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：miR-143、miR-145、miR-17-5p、miR-203、miR-214、miR-218、miR-335、miR-342-3p、miR-372、miR-424、miR-491-5p、miR-497、miR-7、miR-99a、miR-99b、miR-100、miR-101、miR-15a、miR-16、miR-34a、miR-886-5p、miR-106a、miR-124、miR-148a、miR-29a及/或miR-375。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療子宮頸癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：miR-133a-5p、miR-490-5p、miR-124-3p、miR-137、miR-655-3p、miR-376c-3p、miR-369-5p、miR-490-3p、miR-432-5p、miR-487b-3p、miR-342-3p、miR-223-3p、miR-136-3p、miR-136-3p、miR-143-5p、miR-1-3p、miR-214-3p、miR-143-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-127-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-145-3p、miR-199a-5p、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-101、miR-126、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-192、miR-200c、miR-21、miR-214、miR-215、miR-22、miR-25、miR-302a、miR-320、miR-320a、miR-34a、miR-34c、miR-365、miR-373、miR-424、miR-429、miR-455、miR-484、miR-502、miR-503、miR-93、miR-98、miR-186、miR-30a-5p、miR-627、let-7a、miR-1、miR-124、miR-125a、miR-129、miR-1295b-3p、miR-1307、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150-5p、miR-154、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-18a、miR-191、miR-193a- 5p、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-198、miR-199a-5p、miR-203、miR-204-5p、miR-206、miR-212、miR-218、miR-224、miR-24-3p、miR-26b、miR-27a、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-29b、miR-30a-3p、miR-30b、miR-328、miR-338-3p、miR-342、miR-345、miR-34a-5p、miR-361-5p、miR-375、miR-378、miR-378a-3p、miR-378a-5p、miR-409-3p、miR-422a、miR-4487、miR-483、miR-497、miR-498、miR-518a-3p、miR-551a、miR-574-5p、miR-625、miR-638、miR-7、miR-96-5p、miR-202-3p、miR-30a及/或miR-451。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療結腸或結腸直腸癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之5’UTR或3’UTR中之miR-101、miR-130a、miR-130b、miR-134、miR-143、miR-145、miR-152、miR-205、miR-223、miR-301a、miR-301b、miR-30c、miR-34a、miR-34c、miR-424、miR-449a、miR-543及/或miR-34b。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療子宮內膜癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之5’UTR或3’UTR中之miR-125b、miR-138、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-16-1、miR-16-1-3p、miR-16-2、miR-181a、miR-181b、miR-195、miR-223、miR-29b、miR-34b、miR-34c、miR-424、miR-10a、miR-146a、miR-150、miR-151、miR-155、miR-2278、miR-26a、miR-30e、miR-31、miR-326、miR-564、miR-27a、let-7b、miR-124a、miR-142-3p、let-7c、miR-17、miR-20a、miR-29a、miR-30c、miR-720、miR-107、miR-342、 miR-34a、miR-202、miR-142-5p、miR-29c、miR-145、miR-193b、miR-199a、miR-214、miR-22、miR-137及/或miR-197。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療血液癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之5’UTR或3’UTR中之miR-1、miR-145、miR-1826、miR-199a、miR-199a-3p、miR-203、miR-205、miR-497、miR-508-3p、miR-509-3p、let-7a、let-7d、miR-106a*、miR-126、miR-1285、miR-129-3p、miR-1291、miR-133a、miR-135a、miR-138、miR-141、miR-143、miR-182-5p、miR-200a、miR-218、miR-28-5p、miR-30a、miR-30c、miR-30d、miR-34a、miR-378、miR-429、miR-509-5p、miR-646、miR-133b、let-7b、let-7c、miR-200c、miR-204、miR-335、miR-377及/或miR-506。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療腎癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-105、miR-122、miR-122a、miR-1236、miR-124、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-1271、miR-128-3p、miR-129-5p、miR-130a、miR-130b、miR-133a、miR-134、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-141、miR-142-3p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150-5p、miR-15b、miR-16、miR-181a-5p、miR-185、miR-188-5p、miR-193b、miR-195、miR-195- 5p、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a-5p、miR-199b、miR-199b-5p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-203、miR-204-3p、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-21、miR-21-3p、miR-211、miR-212、miR-214、miR-217、miR-218、miR-219-5p、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2、miR-29c、miR-302b、miR-302c、miR-30a、miR-30a-3p、miR-335、miR-338-3p、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-365、miR-370、miR-372、miR-375、miR-376a、miR-377、miR-422a、miR-424、miR-424-5p、miR-433、miR-4458、miR-448、miR-450a、miR-451、miR-485-5p、miR-486-5p、miR-497、miR-503、miR-506、miR-519d、miR-520a、miR-520b、miR-520c-3p、miR-582-5p、miR-590-5p、miR-610、miR-612、miR-625、miR-637、miR-675、miR-7、miR-877、miR-940、miR-941、miR-98、miR-99a、miR-132及/或miR-31。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療肝癌。在其他實施例中，肝癌係肝細胞癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-143-3p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1266-3p、miR-6130、miR-6080、miR-511-5p、miR-143-5p、miR-223-5p、miR-199b-5p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-142-5p、miR-144、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-199a-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-1297、miR-141、miR-145、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-29b、miR-381、miR-409-3p、miR-429、 miR-451、miR-511、miR-99a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-101、miR-133b、miR-138、miR-142-5p、miR-144、miR-1469、miR-146a、miR-153、miR-15a、miR-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-182、miR-192、miR-193a-3p、miR-194、miR-195、miR-198、miR-203、miR-217、miR-218、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29c、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-365、miR-449a、miR-449b、miR-486-5p、miR-545、miR-610、miR-614、miR-630、miR-660、miR-7515、miR-9500、miR-98、miR-99b、miR-133a、let-7a、miR-100、miR-106a、miR-107、miR-124、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-126、miR-126*、miR-129、miR-137、miR-140、miR-143、miR-146b、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-152、miR-154、miR-155、miR-17-5p、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-186、miR-193b、miR-199a、miR-204、miR-212、miR-221、miR-224、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-32、miR-335、miR-338-3p、miR-340、miR-342-3p、miR-361-3p、miR-373、miR-375、miR-4500、miR-4782-3p、miR-497、miR-503、miR-512-3p、miR-520a-3p、miR-526b、miR-625*及/或miR-96。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療肺癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7b、 miR-101、miR-125b、miR-1280、miR-143、miR-146a、miR-146b、miR-155、miR-17、miR-184、miR-185、miR-18b、miR-193b、miR-200c、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-211、miR-218、miR-26a、miR-31、miR-33a、miR-34a、miR-34c、miR-376a、miR-376c、miR-573、miR-7-5p、miR-9及/或miR-98。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療黑色素瘤。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7d、miR-218、miR-34a、miR-375、miR-494、miR-100、miR-124、miR-1250、miR-125b、miR-126、miR-1271、miR-136、miR-138、miR-145、miR-147、miR-148a、miR-181a、miR-206、miR-220a、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-32、miR-323-5p、miR-329、miR-338、miR-370、miR-410、miR-429、miR-433、miR-499a-5p、miR-503、miR-506、miR-632、miR-646、miR-668、miR-877及/或miR-9。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療口腔癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7i、miR-100、miR-124、miR-125b、miR-129-5p、miR-130b、miR-133a、miR-137、miR-138、miR-141、miR-145、miR-148a、miR-152、miR-153、miR-155、miR-199a、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-212、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-409-3p、miR-411、miR-429、miR-432、miR-449a、miR-494、miR-497、miR-498、miR-519d、miR-655、miR-9、miR-98、miR-101、miR-532-5p、miR- 124a、miR-192、miR-193a及/或miR-7。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療卵巢癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-216a-5p、miR-802、miR-217、miR-145-3p、miR-143-3p、miR-451a、miR-375、miR-214-3p、miR-216b-3p、miR-432-5p、miR-216a-3p、miR-199b-5p、miR-199a-5p、miR-136-3p、miR-216b-5p、miR-136-5p、miR-145-5p、miR-127-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-559、miR-129-2-3p、miR-4507、miR-1-3p、miR-148a-3p、miR-101、miR-1181、miR-124、miR-1247、miR-133a、miR-141、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150*、miR-150-5p、miR-152、miR-15a、miR-198、miR-203、miR-214、miR-216a、miR-29c、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-373、miR-375、miR-410、miR-497、miR-615-5p、miR-630、miR-96、miR-132、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-126、miR-135a、miR-143、miR-144、miR-150、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-217、miR-218、miR-337、miR-494及/或miR-98。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療胰臟癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7a-3p、let-7c、miR-100、miR-101、miR-105、miR-124、miR-128、miR-1296、miR-130b、miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b、miR-135a、 miR-143、miR-145、miR-146a、miR-154、miR-15a、miR-187、miR-188-5p、miR-199b、miR-200b、miR-203、miR-205、miR-212、miR-218、miR-221、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-29b、miR-302a、miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d、miR-30e、miR-31、miR-330、miR-331-3p、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374b、miR-449a、miR-4723-5p、miR-497、miR-628-5p、miR-642a-5p、miR-765及/或miR-940。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療前列腺癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-101、miR-183、miR-204、miR-34a、miR-365b-3p、miR-486-3p及/或miR-532-5p。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療視網膜母細胞瘤。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：miR-143-3p、miR-133b、miR-1264、miR-448、miR-1298-5p、miR-490-5p、miR-138-2-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR-150-5p、miR-129-1-3p、miR-559、miR-1-3-p、miR-143-5p、miR-223-3p、miR-3943、miR-338-3p、miR-124-3p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-451a、miR-142-5p、miR-133a-3p、miR-145-5p及/或miR-145-3p。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療神經膠母細胞瘤。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：miR-143-3p、miR-223-3p、miR-6080、miR-208b-3p、miR-206、miR-133a-5p、miR-133b、miR-199a-5p、miR-199b-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-144-3p、miR-144-5p、miR- 338-3p、miR-214-3p、miR-559、miR-133a-3p、miR-1-3p、miR-126-3p、miR-142-5p、miR-451a、miR-199a-3p及/或miR-199b-3p。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療頭頸癌。
在一些實施例中，腫瘤抑制性miR靶序列係針對以下之靶序列：miR-133b、miR-208b-3p、miR-6130、miR-141-5p、miR-31-3p、miR-1293、miR-129-2-3p、miR-129-5p、miR-124-3p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-490-3p、miR-488-3p、miR-935、miR-124-5p、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-1-3p、miR-133a-3p、miR-375、miR-141-3p、miR-31-5p、miR-205-5p、miR-200c-3p及/或miR-203a-3p。在其他實施例中，溶瘤病毒用於治療神經鞘瘤。
在一些實施例中，本發明提供包含以下中之一或多者之重組體溶瘤病毒：(a)一或多個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列；(b)一或多個編碼一或多種蛋白質或寡核苷酸之聚核苷酸，其中蛋白質或寡核苷酸降低miR、基因或TIMP之表現或抑制其功能；(c)至少一種蛋白酶活化之抗體；及/或(d)編碼至少一種蛋白酶活化之抗體之聚核苷酸。在一些實施例中，miR係致癌miR或微環境重塑miR。在一些實施例中，致癌miR選自表4中所列舉之miR。在一些實施例中，基因係致癌基因。在一些實施例中，致癌基因選自表7中所列舉之基因。在一些實施例中，微環境重塑miR選自表5中所列舉之miR。在一些實施例中，TIMP選自TIMP1、TIMP2、TIMP3及TIMP4。在一些實施例中，(b)之寡核苷酸係shRNA或誘餌寡核苷酸。
在一些實施例中，本發明提供包含以下中之一或多者之重組體溶瘤 病毒：(a)一或多個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列；(b)一或多個編碼一或多種蛋白質或寡核苷酸之聚核苷酸，其中蛋白質或寡核苷酸降低miR、基因或TIMP之表現或抑制其功能；(c)至少一種蛋白酶活化之抗體；及/或(d)編碼至少一種蛋白酶活化之抗體之聚核苷酸，其中蛋白質係核酸酶、雙特異性T細胞接合器(BiTE)、抗免疫抑制蛋白或免疫原性抗原。在一些實施例中，核酸酶選自成簇規律間隔之短回文重複序列(CRISPR)相關之內核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)或轉錄活化劑樣效應物核酸酶(TALEN)。在一些實施例中，CRISPR相關之內核酸酶選自SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9、C2C1、C2C3、Cpf1、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3及Csf4。在其他實施例中，溶瘤病毒進一步包含編碼tracr-RNA(trRNA)及crispr-RNA(crRNA)之異源聚核苷酸，其中將crRNA靶向編碼miR或TIMP之基因體DNA序列且其中trRNA促進CRISPR相關之內核酸酶之結合及活化。
在一些實施例中，抗免疫抑制蛋白係抗調節性T細胞(Treg)蛋白或抗骨髓樣源抑制細胞(MDSC)蛋白。在一些實施例中，抗免疫抑制蛋白係VHH源阻斷劑或VHH源BiTE。
在一些實施例中，蛋白質包括抗腫瘤免疫反應。在其他實施例中， 蛋白質選自EpCAM、葉酸鹽、IFNβ、抗CTLA-4、抗PD1、A2A、抗FGF2、抗FGFR/FGFR2b、抗SEMA4D、CCL5、CD137、CD200、CD38、CD44、CSF-1R、CXCL10、CXCL13、內皮素B受體、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-35、ISRE7、LFA-1、NG2(亦稱為SPEG4)、SMAD蛋白、STING、TGFβ及VCAM1。
在一些實施例中，本發明提供包含以下中之一或多者之重組體溶瘤病毒：(a)一或多個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列；(b)一或多個編碼一或多種蛋白質或寡核苷酸之聚核苷酸，其中蛋白質或寡核苷酸降低miR、基因或TIMP之表現或抑制其功能；(c)至少一種蛋白酶活化之抗體；及/或(d)編碼至少一種蛋白酶活化之抗體之聚核苷酸，其中將至少一種蛋白酶活化之抗體納入病毒醣蛋白包膜中。在一些實施例中，蛋白酶活化之抗體係由選自以下之蛋白酶活化：半胱胺酸細胞自溶酶、天冬胺酸細胞自溶酶、激肽釋放酶(hK)、絲胺酸蛋白酶、半胱天冬酶、基質金屬蛋白酶(MMP)及解聚素金屬蛋白酶(ADAM)。在一些實施例中，蛋白酶選自細胞自溶酶K、細胞自溶酶B、細胞自溶酶L、細胞自溶酶E、細胞自溶酶D、hK1、PSA(hK3)、hK10、hK15、uPA、uPAR、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-23A、MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27、MMP-28或表6中所列舉之蛋白酶。
在一些實施例中，蛋白酶活化之抗體結合至癌細胞或在癌症微環境中較非癌細胞或在非癌症微環境中表現更多之蛋白質。在一些實施例中， 蛋白酶活化之抗體結合NKG2D、c-met、HGFR、CD8、硫酸乙醯肝素、VSPG4(亦稱為NG2)、EGFR、EGFRvIII、CD133、CXCR4、癌胚抗原(CEA)、CLC-3、膜聯蛋白II、人類運鐵蛋白受體或EpCAM。
在一些實施例中，將miR靶序列及/或一或多個聚核苷酸插入病毒基因體之基因座中。在一些實施例中，病毒係單純皰疹病毒且其中在一或多個選自由以下組成之群之病毒基因座中或之間插入至少一個聚核苷酸：內部重複接頭區(包含二倍體基因ICP0、ICP34.5、LAT、ICP4及ICP47啟動子中之每一者之一個複本)、ICP0、LAT、UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。
在一些實施例中，本發明提供編碼本文所述溶瘤病毒之核酸分子。在一些實施例中，本發明提供本文所述溶瘤病毒之病毒原液。在一些實施例中，本發明提供包含本文所述溶瘤病毒及醫藥上可接受之載劑之組合物。
在一些實施例中，本發明提供殺死癌細胞之方法，其包含在足以溶瘤病毒在癌細胞內感染及複製之條件下將該癌細胞暴露於本文所述溶瘤病毒或其組合物，且其中溶瘤病毒在癌細胞內複製引起細胞死亡。在一些實施例中，與非癌細胞中腫瘤抑制性miR之表現相比，癌細胞具有能結合至一或多個腫瘤抑制性miR-靶序列之腫瘤抑制性miR之降低表現。在一些實 施例中，癌細胞中腫瘤抑制性miR之表現程度較非癌細胞中腫瘤抑制性miR之表現程度小至少5%。在一些實施例中，在能結合至一或多個腫瘤抑制性miR-靶序列之腫瘤抑制性miR表現降低之癌細胞中，溶瘤病毒之複製增加或維持。在一些實施例中，與非癌細胞中之病毒複製相比，癌細胞中之病毒複製大至少5%。在一些實施例中，細胞係在活體內。在一些實施例中，細胞係在腫瘤內。
在一些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之癌症之方法，其包含向個體投與本文所述溶瘤病毒或其組合物。在一些實施例中，個體係小鼠、大鼠、兔、貓、狗、馬、非人類靈長類動物或人類。在一些實施例中，溶瘤病毒或其組合物係經靜脈內、皮下、腫瘤內、肌內或鼻內投與。在一些實施例中，癌症選自肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、睪丸癌、結腸直腸癌、結腸癌、胰臟癌、肝癌、胃癌、頭頸癌、甲狀腺癌、惡性膠質瘤、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)及邊緣區淋巴瘤(MZL)。在一些實施例中，肺癌係小細胞肺癌或非小細胞肺癌。在一些實施例中，肝癌係肝細胞癌(HCC)。
圖1圖解說明對應於25個選擇miRNA之癌及非癌腦組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖2圖解說明對應於25個選擇miRNA之癌及非癌膀胱組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖3圖解說明對應於25個選擇miRNA之癌及非癌乳房組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖4圖解說明對應於25個選擇miRNA之癌及非癌結腸組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖5圖解說明對應於25個選擇miRNA之神經膠母細胞瘤及非癌腦組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖6圖解說明對應於25個選擇miRNA之癌及非癌頭頸組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖7圖解說明對應於25個選擇miRNA之癌及非癌肺組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖8圖解說明對應於25個選擇miRNA之癌及非癌胰臟組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖9圖解說明對應於25個選擇miRNA之神經鞘瘤及非神經鞘瘤組織中miRNA表現特性之熱圖。
圖10圖解說明與非癌組織(Norm)相比所有腫瘤類型(CA)中miR-451a表現之下調。
圖11圖解說明所有腫瘤類型(CA)中miR-1表現之下調、非癌組織(Norm)中miR-1之中等表現及非癌頭頸組織(H&N)中miR-1之高表現。
圖12圖解說明所有腫瘤類型(CA)中miR-559表現之下調、非癌組織(Norm)中miR-559之低表現及非癌肺組織中miR-559之高表現。
圖13圖解說明所有腫瘤類型(CA)中miR-145-5p表現之下調及大多數非癌組織(Norm)中miR-145-5p之高表現。
圖14圖解說明結腸、肺及胰臟腫瘤類型(CA)中miR-143-3p表現之下調及大多數非癌組織(Norm)中miR-143-3p之高表現。
圖15A-圖15C圖解說明實例2中所述之miRNA表現及減毒報導基因系 統。圖15A顯示誘導miRNA表現質體之表現之pTetR tet阻遏劑質體的示意圖。圖15B顯示含有tet可誘導mCherry及miRNA表現盒之pTF-002 miRNA表現質體的示意圖。圖15C顯示使得能夠讀出非穩定GFP(dsGFP)之pTF-004 miRNA減毒報導基因之示意圖。
圖16圖解說明使用圖15中所示及實例2中所述之報導基因系統之miR-122表現及減毒。
圖17圖解說明使用圖15中所示及實例2中所述之報導基因系統之miR-122、miR-184、miR-34a及Let7a介導之GFP減毒。加圓圈之孔指示降低之GFP表現程度。
圖18圖解說明使用圖15中所示及實例2中所述之報導基因系統之miR-122、miR-184、miR-34a及Let7a之表現，由mCherry表現所指示。
圖19圖解說明使用圖15中所示及實例2中所述之報導基因系統之miR-122、miR-124、miR-145、miR-199及miR-451介導之GFP減毒。加圓圈之孔指示降低之GFP表現程度。
圖20圖解說明使用圖15中所示及實例2中所述之報導基因系統之miR-122、miR-124、miR-145、miR-199及miR-451之表現，由mCherry表現所指示。
圖21顯示miR-122及miR-184減毒之GFP螢光之量化。
圖22顯示miR-34a及miR-184減毒之GFP螢光之量化。
圖23顯示Let7a及miR-184減毒之GFP螢光之量化。
圖24顯示miR-124及miR-184減毒之GFP螢光之量化。
圖25顯示miR-145及miR-184減毒之GFP螢光之量化。
圖26顯示miR-199及miR-451減毒之GFP螢光之量化。
圖27顯示miR-125及miR-451減毒之GFP螢光之量化。
圖28顯示miR-126及miR-451減毒之GFP螢光之量化。
圖29顯示miR-127及miR-451減毒之GFP螢光之量化。
圖30顯示miR-133及miR-451減毒之GFP螢光之量化。
圖31顯示miR-223及miR-451減毒之GFP螢光之量化。
圖32顯示具有插入ICP27及ICP4基因之各種miRNA之靶序列之miR減毒之HSV構築體。
圖33圖解說明非癌(有絲分裂後肺)及癌(A253)細胞中藉由miR-125之HSV減毒。
圖34顯示非癌(PM肺)及癌(A253)肺細胞中藉由miR-125之HSV減毒之基於qPCR的量化。
圖35圖解說明HCC1395對A253細胞中藉由miR-145之HSV減毒之基於螢光的量化。
圖36顯示HCC1395對A253細胞中藉由miR-145之HSV減毒之基於qPCR的量化。
圖37圖解說明正常肺細胞中藉由miR-199a-5p對miR-143-3p之HSV減毒之基於螢光的量化。
圖38顯示正常肺細胞中藉由miR-199a-5p對miR-143-3p之HSV減毒之基於qPCR的量化。
圖39圖解說明用於治療癌症或良性過度增殖性病症之ICP4-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
圖40顯示用於治療癌症或良性過度增殖性病症之ICP27-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
圖41顯示用於治療癌症或良性過度增殖性病症之UL19-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
圖42顯示用於治療癌症或良性過度增殖性病症之UL19-TmiRNA及ICP27-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
圖43顯示用於治療癌症或良性過度增殖性病症之UL19-TmiRNA及ICP4-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
圖44顯示用於治療癌症或良性過度增殖性病症之UL19-TmiRNA、ICP27-TmiRNA及ICP4-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
圖45顯示用於治療癌症之ICP4-TmiRNA減毒、基因體編輯之HSV載體的示意圖。
圖46顯示用於治療癌症之ICP4-TmiRNA減毒、基因體編輯、微環境重塑之HSV載體的示意圖。
圖47顯示用於治療胰臟癌、肺癌及結腸癌之ICP4-TmiRNA及ICP27-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
圖48顯示用於治療多種癌症類型之ICP4-TmiRNA及ICP27-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
圖49顯示用於治療神經鞘瘤之ICP4-TmiRNA及ICP27-TmiRNA減毒之HSV載體的示意圖。
相關申請案交叉參考
本申請案主張於2016年1月27日提出申請之美國臨時申請案第62/287,619號之優先權，其全部揭示內容以引用方式併入本文中。
關於序列表之說明
與本申請案相關之序列表係以文本格式代替紙質複本提供，且以引用方式併入本申請案中。含有序列表之文本之名稱係ONCR_001_01WO_ST2.txt。文本文件係7KB，創建於2017年1月26日，且經由EFS-Web以電子方式提交。
在一些態樣中，本發明利用差異miRNA表現特性以將病毒載體複製有效限於腫瘤細胞。在一些實施例中，本文所述病毒載體亦破壞特異性miRNA之表現用於降低之腫瘤增殖、轉移及/或腫瘤微環境重塑以使得能夠增強病毒擴散。在一些實施例中，本文所述病毒載體涵蓋病毒載體上表面分子之使用以有利於靶向腫瘤細胞。該等態樣可個別或組合應用以研發潛在地能夠利用單一病毒載體治療多種癌症類型之病毒載體。因此，本發明進一步涵蓋重組體溶瘤病毒載體，其用於治療及預防疾病及病症(例如，癌症)。在一些實施例中，本發明利用內源性微小RNA(miRNA)以使得安全且有效之重組體病毒載體能夠適於治療多種癌症。
本文所用之標題部分僅出於組織目的，且不應理解為限制所述標的物。本文引用之所有文件或文件之部分(包括但不限於專利、專利申請案、文章、書及論文之全文出於任何目的以引用方式併入本文中。倘若併入之文件或文件之部分中之一或多者定義之術語與申請案中術語之定義有矛盾，則以本申請案中出現之定義為準。然而，在提及本文引用之任何參考文獻、文章、出版物、專利、專利公開案及專利申請案時並不且不應視為承認或任何形式之表明其構成有效先前技術或形成世界上任何國家中常見一般知識之部分。
如本文所闡述，除非另外指示，否則任一濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括在所列舉範圍內之任一整數值及(在適 當時)其分數(例如整數之十分之一及百分之一)。應理解，除非另外指示，否則如本文所用術語「一」(「a」及「an」)係指所列舉組份中之「一或多者」。替代形式(例如，「或」)之使用應理解為意指替代形式之一者、二者或其任一組合。如本文所用術語「包括」及「包含」係同義使用。如本文所用，「複數」可指一或多個組份(例如，一或多個miRNA靶序列)。
溶瘤病毒
在一些實施例中，本發明提供重組體溶瘤病毒，其中一或多個腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列之一或多個複本插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中。如本文所用術語「溶瘤病毒」係指經修飾或天然優先感染癌細胞之病毒。溶瘤病毒之實例為業內已知，包括但不限於單純皰疹病毒、腺病毒、脊髓灰質炎病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水皰性口炎病毒、正黏液病毒、小病毒、馬拉巴病毒或柯薩奇病毒。在一些實施例中，將本文所述溶瘤病毒納入病毒載體中。術語「載體」在本文中用於指能轉移或傳輸核酸分子之核酸分子。經轉移核酸通常連接至、例如插入載體核酸分子中。載體可包括引導細胞中自主複製之序列，或可包括足以容許整合至宿主細胞DNA中之序列。病毒載體有時可稱作「重組體病毒」或「病毒」。術語「溶瘤病毒」及「溶瘤載體」在本文中互換使用。在特定實施例中，重組體病毒載體係能腫瘤選擇性載體複製之單純皰疹病毒，如國際PCT公開案第WO 2015/066042號中所述，其全文以引用方式併入本文中。
術語「微小RNA」、「miRNA」及「miR」在本文中互換使用且係指藉由引導其靶信使RNA(mRNA)用於降解或轉譯抑制來調控基因表現的 小的非編碼內源性RNA。miR在多種疾病狀態(包括多種類型之癌症)中差異表現。在一些態樣中，給定癌症類型或組織之癌細胞展現與非癌對照細胞相比不同之miR表現。如本文所用術語「oncomiR」係指與誘癌作用、惡性轉變或轉移相關(正性或負性)之miR。在一些態樣中，特定oncomiR之表現程度與特定癌症之發生或維持相關。該等miR在本文中稱作「致癌miR」。
在一些實施例中，與非癌對照相比，癌細胞或組織中致癌miR之表現增加。舉例而言，與非癌細胞或組織中致癌miR之表現相比，癌細胞中致癌miR之表現可增加至少5%。在一些實施例中，與非癌細胞或組織中致癌miR之表現相比，致癌miR之表現增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、1000%或更多。在一些態樣中，癌細胞或組織可表現在非癌對照細胞或組織中不表現之致癌miR。在一些實施例中，與源自不同癌症類型之癌細胞相比，癌細胞或組織中致癌miR之表現增加。舉例而言，與源自不同癌症類型之癌細胞相比，癌細胞中致癌miR之表現增加至少5%。在一些實施例中，與源自不同癌症類型之癌細胞相比，致癌miR之表現增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、1000%或更多。在癌症組織中通常過表現之致癌miRNA之實例包括(但不限於)miR-21、miR-155及miR-17-92。致癌miR之其他實例列舉於表4中。
在一些實施例中，特定oncomiR之表現與誘癌作用及/或轉移之預防及/或延遲相關。該等oncomiR在本文中稱作「腫瘤-抑制劑miR」或「腫 瘤抑制性miR」，此乃因其表現預防或抑制癌症發生。在一些實施例中，腫瘤抑制性miR之不足表現可導致癌症。因此，在一些態樣中，腫瘤抑制性miR在健康細胞中表現且在癌細胞中不表現。在一些態樣中，與癌細胞相比，健康細胞中特定腫瘤抑制性miR之表現增加。舉例而言，與癌細胞中腫瘤抑制性miR之表現相比，健康(例如，非癌)細胞中腫瘤抑制性miR之表現增加至少5%。在一些實施例中，與癌細胞中腫瘤抑制性miR之表現相比，腫瘤抑制性miR之表現增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、1000%或更多。在一些實施例中，與源自體內之不同組織類型或位置之正常細胞相比，正常細胞或組織中腫瘤抑制性miR之表現增加。舉例而言，與源自體內之不同組織類型或位置之正常細胞相比，正常細胞中腫瘤抑制性miR之表現增加至少5%。在一些實施例中，與源自體內之不同組織類型或位置之正常細胞相比，正常細胞中腫瘤抑制性miR之表現增加至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、200%、300%、400%、500%、1000%或更多。腫瘤抑制性miRNA之實例包括(但不限於)miR-15a、miR-16-1、miR-34以及let-7家族之miRNA。腫瘤抑制性miR之其他實例列舉於表3及表8中。
癌症致病性係異質且多基因過程。因此，特定路徑之活化及特定基因之表現在一種情況下可導致癌症發生，且在不同情況下活化或表現時引起不同或相反結果。因此，將特定基因或miR表徵為「致癌基因」或「致癌miR」或「腫瘤抑制劑」或「腫瘤抑制性miR」並非二元區分法且經常依賴於情況。舉例而言，miR-152b在絕大多數血液惡性病中用作致癌 miR，但在許多實體腫瘤中用作腫瘤抑制性miR。此外，特定miR可在癌細胞及非癌細胞中高度表現。舉例而言，miR-155在正常細胞中高度表現，從而在巨噬細胞極化中起重要作用，且亦在癌細胞中高度表現。因此，本文所述miR減毒、基因體編輯及微環境重塑之溶瘤病毒係基於一個細胞群體中與另一細胞群體或組織相比之特定miR或miR組之差異表現。熟習此項技術者應理解，術語腫瘤抑制性miR通常係指與癌細胞或組織相比在非癌細胞或組織中更高度表現之miR，且術語致癌miR通常係指與非癌細胞或組織相比在癌細胞或組織中更高度表現之miR。熟習此項技術者應進一步理解，在一種類型之癌症中特徵為腫瘤抑制性miR之miR在不同類型之癌症中可用作或另外可不用作腫瘤抑制性miR，且一種類型之癌症中特徵為致癌miR之miR在不同類型之癌症中可用作或更可不用作致癌miR。
表1顯示12個選擇oncomiR(9個腫瘤抑制劑及3個致癌miRNA)與不同癌症之間之關係。3,410個oncomiR-癌症關係之列表顯示於表2中。miRNA調控參與控制細胞增殖及細胞凋亡之蛋白質之許多轉錄物。調控之蛋白質包括習用原癌蛋白及腫瘤抑制劑，例如Ras、Myc、Bcl2、PTEN及p53。因此，miRNA之異常表現通常參與癌症之發生且可藉由抑制致癌miRNA或置換耗盡腫瘤抑制miRNA在治療上得以校正。此外，癌細胞對非癌細胞中特定oncomiR之差異表現可用作將癌症治療劑特異性靶向癌細胞之方式。因此，在一些實施例中，本文所述溶瘤病毒載體可包含個別或組合之以下性質：將腫瘤抑制性miRNA靶序列插入病毒基因體中，藉此將病毒載體複製限於癌症或腫瘤細胞；一或多個納入病毒基因體中之聚核苷酸，該病毒基因體之產物破壞致癌miRNA及/或癌症細胞外基 質之功能；及/或納入病毒顆粒中以使載體高度選擇性靶向癌症及/或腫瘤細胞之蛋白酶活化之抗體。
本發明之一個態樣包含重組體溶瘤病毒(或病毒載體)，其包含一或多個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性miRNA靶序列(例如，選自表3或表8中所列舉之miRNA之miRNA)之複數個複本。在某些實施例中，重組體溶瘤病毒可包含插入病毒複製所需之至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個病毒基因之基因座中的腫瘤抑制性miRNA靶序列。在正常(非癌)細胞中表現之腫瘤抑制miRNA可結合至該等靶序列且抑制含有miRNA靶序列之病毒基因之表現，藉此限制健康、非癌細胞中之病毒複製。該等重組體溶瘤病毒及/或載體在本文中稱作「miR減毒」或「複製限制的」，此乃因與不表現腫瘤抑制性miR或表現降低之細胞相比，其在表現能結合至納入之腫瘤抑制性miR靶序列之腫瘤抑制性miR的細胞中引起降低或減弱之病毒複製。藉由將腫瘤抑制性miRNA納入病毒複製所需之關鍵基因中，病毒複製可在表現腫瘤抑制性miRNA之正常二倍體細胞中有條件地受抑制且通常可在不表現腫瘤抑制性miRNA之細胞中進行。在該等實施例中，健康、非癌細胞保護正常細胞免於由重組體病毒載體感染之溶解效應。
在某些實施例中，將一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列納入病毒複製所需之一或多個病毒基因之5’未轉譯區(UTR)及/或3’UTR中。在正常二倍體細胞中，腫瘤抑制性miRNA可結合至包含腫瘤抑制性miRNA靶序列之經改造之3’或5’非編碼序列，但該等腫瘤抑制性miRNA在轉變或惡性細胞中缺乏。因此，病毒複製可在缺乏腫瘤抑制性miRNA表現或表現降 低之細胞中進行。在一些實施例中，將至少一個腫瘤抑制性miR靶序列納入複製所需之一或多個病毒基因中。在一些實施例中，溶瘤病毒載體可包含納入複製所需之一個病毒基因中之相同腫瘤抑制性miR靶序列的多個複本。舉例而言，可向複製所需之病毒基因中納入腫瘤抑制性miR靶序列之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個複本。在特定實施例中，向複製所需之病毒基因之3’或5’UTR中納入腫瘤抑制性miR靶序列之2至6個複本。在其他實施例中，向複製所需之病毒基因之3’或5’UTR中納入腫瘤抑制性miR靶序列之4個複本。在一些實施例中，溶瘤病毒載體可包含納入複製所需之複數個病毒基因中之相同腫瘤抑制性miR靶序列之多個複本。舉例而言，可向病毒複製所需之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個基因中納入腫瘤抑制性miR靶序列之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個複本。在特定實施例中，向複製所需之兩個或更多個病毒基因之3’或5’UTR中納入腫瘤抑制性miR靶序列之2至6個複本。在其他實施例中，向複製所需之兩個或更多個病毒基因之3’或5’UTR中納入腫瘤抑制性miR靶序列之至少4個複本。
在一些實施例中，溶瘤病毒載體可包含納入複製所需之一個病毒基因中之一個以上腫瘤抑制性miR的靶序列。舉例而言，可向病毒複製所需之單一基因中納入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同腫瘤抑制性miR之靶序列。在一些實施例中，溶瘤病毒載體可包含納入複製所需之複數個病毒基因中之一個以上腫瘤抑制性miR的靶序列。舉例而言，可向病毒複製所需之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多基因中納入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多不同腫瘤抑制性miR之靶序列。在一些實施例中，溶瘤病毒載體可包含至少兩個不同腫瘤抑制性miR(例 如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個不同腫瘤抑制性miR)之多個靶序列(例如，一個靶序列之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個複本)。在該等實施例中，第一腫瘤抑制性miR之多個靶序列可納入複製所需之第一基因中，第二腫瘤抑制性miR之多個靶序列可納入複製所需之第二基因中，第三腫瘤抑制性miR之多個靶序列可納入複製所需之第三基因中，等。在特定實施例中，本文所述溶瘤病毒載體包含納入複製所需之第一基因之3’或5’UTR中之第一腫瘤抑制性miR靶序列的至少2個至至少8個複本、納入複製所需之第二基因之3’或5’UTR中之第二腫瘤抑制性miR靶序列的至少2個至至少8個複本及納入複製所需之第三基因之3’或5’UTR中之第三腫瘤抑制性miR靶序列的至少2個至至少8個複本。
在一些實施例中，本文所述miR減毒之溶瘤病毒在表現能結合至一或多個納入之miR-靶序列之腫瘤抑制性miR之細胞中產生降低之病毒複製。「病毒複製」係指在給定量之時間期間在特定細胞或細胞群體中發生之病毒複製循環之總數。在一些實施例中，病毒複製可藉由評價在給定量之時間過程中存在之總病毒效價或藉由評價存在之病毒基因體複本之數目(例如，藉由測序)直接量測。在一些實施例中，病毒載體可另外包含可檢測標記，例如螢光報導基因。在該等實施例中，病毒複製可藉由量測報導基因之螢光強度或表現報導基因之細胞之數目來評價。在一些實施例中，病毒複製可藉由評價在給定量之時間過程中活細胞之數目間接量測。舉例而言，可預計病毒複製程度與隨時間活細胞之數目逆相關。
如本文所用「降低之病毒複製」係指第一細胞或第一細胞群體中病毒複製程度低於第二細胞或第二細胞群體。在一些實施例中，與第二細胞或細胞群體中病毒複製程度相比，第一細胞或第一細胞群體中病毒複製程 度降低至少5%。在一些實施例中，與第二細胞或細胞群體中病毒複製程度相比，第一細胞或第一細胞群體中病毒複製程度降低至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，與第二細胞或細胞群體中病毒複製相比，第一細胞或第一細胞群體中病毒複製完全受抑制。
在一些實施例中，第一細胞或第一細胞群體中降低之病毒複製與能結合至納入複製所需之一或多個病毒基因中之一或多個miR-靶序列的腫瘤抑制性miR之表現相關。在一些實施例中，因此，對應於納入之miR-靶序列之腫瘤抑制性miR之表現抑制或降低複製基因之表現，藉此抑制或降低病毒複製。在一些實施例中，第二細胞或第二細胞群體不表現腫瘤抑制性miR或其表現程度降低。在一些實施例中，對應於納入之miR-靶序列之腫瘤抑制性miR之不存在或降低之表現(例如，在癌細胞中)容許進行病毒複製。在一些實施例中，第二細胞或細胞群體中腫瘤抑制性miR之表現程度較第一細胞或群體中腫瘤抑制性miR之表現程度低至少5%。在一些實施例中，與第一細胞或群體中腫瘤抑制性miR之表現程度相比，第二細胞或細胞群體中腫瘤抑制性miR之表現程度降低至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，第二細胞不表現腫瘤抑制性miR。在特定實施例中，第一細胞係非癌細胞且第二細胞係癌細胞。
在一些態樣中，將腫瘤抑制性miRNA靶序列之多個複本(例如，至少2、至少3、至少4、至少5、至少6或更多個複本)串聯插入病毒基因體中之基因座中。在該等實施例中，靶序列之多個複本可由連接體序列或間隔序列分開。在一些實施例中，連接體及/或間隔體序列包含4個或更聚核苷 酸。舉例而言，間隔或連接體序列可包含4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更聚核苷酸。在一些實施例中，連接體序列或間隔體序列包含約5至約20個核苷酸。在其他實施例中，連接體序列或間隔體序列包含約8至約16個核苷酸。作為闡釋性實施例且並不意欲以任何方式限制本發明，溶瘤病毒可包含串聯插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之以下亞單位中之一或多者中之至少一個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個：(a)第一腫瘤抑制性miRNA之靶序列-連接體或間隔體序列-第一腫瘤抑制性miRNA之靶序列；或(b)第一腫瘤抑制性miRNA之靶序列-連接體或間隔體序列-第二腫瘤抑制性miRNA之靶序列。在一些實施例中，miRNA靶序列係miRNA之反向補體。
在一些實施例中，溶瘤病毒係單純皰疹病毒(HSV)，且病毒複製所需之病毒基因係UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及/或US12。在一些實施例中，溶瘤病毒係單純皰疹病毒(HSV)，且向ICP0、ICP4、UL19及ICP27基因中之一或多者中納入一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列。在某些實施例中，溶瘤病毒載體係包含納入病毒複製所需之一或多個基因(例如，UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、 UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11或US12)之5’或3’UTR中之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列(例如，表3中所列舉之腫瘤抑制性miR中之任一者)的HSV(例如，圖39-49)。
在一些實施例中，限制複製之病毒載體(例如，miR減毒之病毒載體)包含至少一個let-7靶序列且用於治療肺癌。在一些實施例中，限制複製之病毒載體包含至少一個miR-15a及/或至少一個miR-16A靶序列且用於治療B細胞慢性淋巴球性白血病。在一些實施例中，限制複製之病毒載體包含至少一個miR-125b、至少一個miR-145、至少一個miR-21及/或至少一個miR-155靶序列且用於治療乳癌。在其他實施例中，限制複製之病毒載體包含至少一個miR-143及/或至少一個miR-145靶序列且用於治療結腸直腸癌。在某些實施例中，限制複製之病毒載體包含至少一個miR-181a、至少一個miR-181b及/或至少一個miR-181c靶序列且用於治療神經膠母細胞瘤。在一些實施例中，限制複製之病毒載體包含至少一個miR-199a*、至少一個miR-195、至少一個miR-199a、至少一個miR-200a及/或至少一個miR-125a靶序列且用於治療肝癌(例如，肝細胞癌)。
在特定實施例中，限制複製之病毒載體包含至少一個miR-451a靶序列、至少一個miR-143-3p靶序列、至少一個miR-559靶序列及至少一個miR-124靶序列且用於治療胰臟癌、肺癌及/或結腸癌。在該等實施例中，向病毒複製所需之兩個或更多個基因(例如，ICP4及ICP27)中納入miR-451a、miR-143-3p、miR-559及miR-124之靶序列。在其他特定實施例 中，限制複製之病毒載體包含至少一個miR-451a靶序列、至少一個miR-145-5p靶序列、至少一個miR-559靶序列及至少一個miR-124靶序列且用於治療本文所述任何類型之癌症。在該等實施例中，向病毒複製所需之兩個或更多個基因(例如，ICP4及ICP27)中納入miR-451a、miR-145-5p、miR-559及miR-124之靶序列。在其他特定實施例中，限制複製之病毒載體包含至少一個miR-205p靶序列、至少一個miR-141-5p靶序列、至少一個miR-31-5p靶序列及至少一個miR-124靶序列且用於治療神經鞘瘤。在該等實施例中，向病毒複製所需之兩個或更多個基因(例如，ICP4及ICP27)中納入miR-205p、miR-141-5p、miR-31-5p及miR-124之靶序列。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-136-3p、miR-432-5p、miR-1-3p、miR-127-3p、miR-379-5p、miR-493-5p、miR-223-5p、miR-223-5p、miR-136-5p、miR-451a、miR-487b-3p、miR-370-3p、miR-410-3p、miR-431-3p、miR-4485-3p、miR-4485-5p、miR-127-5p、miR-409-3p、miR-338-3p、miR-559、miR-411-5p、miR-133a-5p、miR-143-3p、miR-376b-3p、miR-758-3p、miR-1、miR-101、miR-1180、miR-1236、miR-124-3p、miR-125b、miR-126、miR-1280、miR-133a、miR-133b、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-155、miR-16、miR-18a、miR-192、miR-195、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-203、miR-205、miR-214、miR-218、miR-23b、miR-26a、miR-29c、miR-320c、miR-34a、miR-370、miR-409-3p、miR-429、miR-451、miR-490-5p、miR-493、miR-576-3p及/或miR-99a。此溶瘤病 毒可用於治療膀胱癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-1251-5p、miR-219a-5p、miR-219a-2-3p、miR-124-3p、miR-448、miR-138-2-3p、miR-490-5p、miR-129-1-3p、miR-1264、miR-3943、miR-490-3p、miR-383-5p、miR-133b、miR-129-2-3p、miR-128-2-5p、miR-133a-3p、miR-129-5p、miR-1-3p、miR-885-3p、miR-124-5p、miR-759、miR-7158-3p、miR-770-5p、miR-135a-5p、miR-885-5p、let-7g-5p、miR-100、miR-101、miR-106a、miR-124、miR-124a、miR-125a、miR-125a-5p、miR-125b、miR-127-3p、miR-128、miR-129、miR-136、miR-137、miR-139-5p、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-146b-5p、miR-149、miR-152、miR-153、miR-195、miR-21、miR-212-3p、miR-219-5p、miR-222、miR-29b、miR-31、miR-3189-3p、miR-320、miR-320a、miR-326、miR-330、miR-331-3p、miR-340、miR-342、miR-34a、miR-376a、miR-449a、miR-483-5p、miR-503、miR-577、miR-663、miR-7、miR-7-5p、miR-873、let-7a、let-7f、miR-107、miR-122、miR-124-5p、miR-139、miR-146a、miR-146b、miR-15b、miR-16、miR-181a、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-185、miR-199a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-203、miR-204、miR-205、miR-218、miR-23b、miR-26b、miR-27a、miR-29c、miR-328、miR-34c-3p、miR-34c-5p、miR-375、miR-383、miR-451、miR-452、miR-495、miR-584、 miR-622、miR-656、miR-98、miR-124-3p、miR-181b-5p、miR-200b及/或miR-3189-3p。此溶瘤病毒可用於治療腦癌之方法及組合物中。在某些實施例中，腦癌係星細胞瘤、神經膠母細胞瘤或膠質瘤。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-10b-5p、miR-126-3p、miR-145-3p、miR-451a、miR-199b-5p、miR-5683、miR-3195、miR-3182、miR-1271-5p、miR-204-5p、miR-409-5p、miR-136-5p、miR-514a-5p、miR-559、miR-483-3p、miR-1-3p、miR-6080、miR-144-3p、miR-10b-3p、miR-6130、miR-6089、miR-203b-5p、miR-4266、miR-4327、miR-5694、miR-193b、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-107、miR-10a、miR-10b、miR-122、miR-124、miR-1258、miR-125a-5p、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-129、miR-130a、miR-132、miR-133a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-146b、miR-147、miR-148a、miR-149、miR-152、miR-153、miR-15a、miR-16、miR-17-5p、miR-181a、miR-1826、miR-183、miR-185、miR-191、miR-193a-3p、miR-195、miR-199b-5p、miR-19a-3p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-205、miR-206、miR-211、miR-216b、miR-218、miR-22、miR-26a、miR-26b、miR-300、miR-30a、miR-31、miR-335、miR-339-5p、miR-33b、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374a、miR-379、miR-381、miR-383、miR-425、miR-429、miR-450b-3p、miR-494、miR-495、miR-497、miR-502-5p、miR-517a、 miR-574-3p、miR-638、miR-7、miR-720、miR-873、miR-874、miR-92a、miR-98、miR-99a、mmu-miR-290-3p及/或mmu-miR-290-5p。此溶瘤病毒可用於治療乳癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-143、miR-145、miR-17-5p、miR-203、miR-214、miR-218、miR-335、miR-342-3p、miR-372、miR-424、miR-491-5p、miR-497、miR-7、miR-99a、miR-99b、miR-100、miR-101、miR-15a、miR-16、miR-34a、miR-886-5p、miR-106a、miR-124、miR-148a、miR-29a及/或miR-375。此溶瘤病毒可用於治療子宮頸癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-133a-5p、miR-490-5p、miR-124-3p、miR-137、miR-655-3p、miR-376c-3p、miR-369-5p、miR-490-3p、miR-432-5p、miR-487b-3p、miR-342-3p、miR-223-3p、miR-136-3p、miR-136-3p、miR-143-5p、miR-1-3p、miR-214-3p、miR-143-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-127-3p、miR-133a-3p、miR-145-5p、miR-145-3p、miR-199a-5p、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-100、miR-101、miR-126、miR-142-3p、miR-143、miR-145、miR-192、miR-200c、miR-21、miR-214、miR-215、miR-22、miR-25、miR-302a、miR-320、miR-320a、miR-34a、miR-34c、miR-365、 miR-373、miR-424、miR-429、miR-455、miR-484、miR-502、miR-503、miR-93、miR-98、miR-186、miR-30a-5p、miR-627、let-7a、miR-1、miR-124、miR-125a、miR-129、miR-1295b-3p、miR-1307、miR-130b、miR-132、miR-133a、miR-133b、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-150-5p、miR-154、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-18a、miR-191、miR-193a-5p、miR-194、miR-195、miR-196a、miR-198、miR-199a-5p、miR-203、miR-204-5p、miR-206、miR-212、miR-218、miR-224、miR-24-3p、miR-26b、miR-27a、miR-28-3p、miR-28-5p、miR-29b、miR-30a-3p、miR-30b、miR-328、miR-338-3p、miR-342、miR-345、miR-34a-5p、miR-361-5p、miR-375、miR-378、miR-378a-3p、miR-378a-5p、miR-409-3p、miR-422a、miR-4487、miR-483、miR-497、miR-498、miR-518a-3p、miR-551a、miR-574-5p、miR-625、miR-638、miR-7、miR-96-5p、miR-202-3p、miR-30a及/或miR-451。此溶瘤病毒可用於治療結腸或結腸直腸癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-101、miR-130a、miR-130b、miR-134、miR-143、miR-145、miR-152、miR-205、miR-223、miR-301a、miR-301b、miR-30c、miR-34a、miR-34c、miR-424、miR-449a、miR-543及/或miR-34b。此溶瘤病毒可用於治療子宮內膜癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑 制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-125b、miR-138、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-16-1、miR-16-1-3p、miR-16-2、miR-181a、miR-181b、miR-195、miR-223、miR-29b、miR-34b、miR-34c、miR-424、miR-10a、miR-146a、miR-150、miR-151、miR-155、miR-2278、miR-26a、miR-30e、miR-31、miR-326、miR-564、miR-27a、let-7b、miR-124a、miR-142-3p、let-7c、miR-17、miR-20a、miR-29a、miR-30c、miR-720、miR-107、miR-342、miR-34a、miR-202、miR-142-5p、miR-29c、miR-145、miR-193b、miR-199a、miR-214、miR-22、miR-137及/或miR-197。此溶瘤病毒可用於治療血液癌之方法及組合物中。在一些實施例中，血液癌係白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-1、miR-145、miR-1826、miR-199a、miR-199a-3p、miR-203、miR-205、miR-497、miR-508-3p、miR-509-3p、let-7a、let-7d、miR-106a*、miR-126、miR-1285、miR-129-3p、miR-1291、miR-133a、miR-135a、miR-138、miR-141、miR-143、miR-182-5p、miR-200a、miR-218、miR-28-5p、miR-30a、miR-30c、miR-30d、miR-34a、miR-378、miR-429、miR-509-5p、miR-646、miR-133b、let-7b、let-7c、miR-200c、miR-204、miR-335、miR-377及/或miR-506。此溶瘤病毒可用於治療腎癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基 因中之5’UTR或3’UTR中之let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-100、miR-101、miR-105、miR-122、miR-122a、miR-1236、miR-124、miR-125b、miR-126、miR-127、miR-1271、miR-128-3p、miR-129-5p、miR-130a、miR-130b、miR-133a、miR-134、miR-137、miR-138、miR-139、miR-139-5p、miR-140-5p、miR-141、miR-142-3p、miR-143、miR-144、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150-5p、miR-15b、miR-16、miR-181a-5p、miR-185、miR-188-5p、miR-193b、miR-195、miR-195-5p、miR-197、miR-198、miR-199a、miR-199a-5p、miR-199b、miR-199b-5p、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-202、miR-203、miR-204-3p、miR-205、miR-206、miR-20a1、miR-21、miR-21-3p、miR-211、miR-212、miR-214、miR-217、miR-218、miR-219-5p、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-29b-1、miR-29b-2、miR-29c、miR-302b、miR-302c、miR-30a、miR-30a-3p、miR-335、miR-338-3p、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-365、miR-370、miR-372、miR-375、miR-376a、miR-377、miR-422a、miR-424、miR-424-5p、miR-433、miR-4458、miR-448、miR-450a、miR-451、miR-485-5p、miR-486-5p、miR-497、miR-503、miR-506、miR-519d、miR-520a、miR-520b、miR-520c-3p、miR-582-5p、miR-590-5p、miR-610、miR-612、miR-625、miR-637、miR-675、miR-7、miR-877、miR-940、miR-941、miR-98、miR-99a、miR-132及/或miR-31。此溶瘤病毒可用於治療肝癌之方法及組合物中。在一些實施例中，肝癌係肝細胞癌。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-143-3p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-1266-3p、miR-6130、miR-6080、miR-511-5p、miR-143-5p、miR-223-5p、miR-199b-5p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-451a、miR-142-5p、miR-144、miR-150-5p、miR-142-3p、miR-214-3p、miR-214-5p、miR-199a-5p、miR-145-3p、miR-145-5p、miR-1297、miR-141、miR-145、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-29b、miR-381、miR-409-3p、miR-429、miR-451、miR-511、miR-99a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-1、miR-101、miR-133b、miR-138、miR-142-5p、miR-144、miR-1469、miR-146a、miR-153、miR-15a、miR-15b、miR-16-1、miR-16-2、miR-182、miR-192、miR-193a-3p、miR-194、miR-195、miR-198、miR-203、miR-217、miR-218、miR-22、miR-223、miR-26a、miR-26b、miR-29c、miR-33a、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-365、miR-449a、miR-449b、miR-486-5p、miR-545、miR-610、miR-614、miR-630、miR-660、miR-7515、miR-9500、miR-98、miR-99b、miR-133a、let-7a、miR-100、miR-106a、miR-107、miR-124、miR-125a-3p、miR-125a-5p、miR-126、miR-126*、miR-129、miR-137、miR-140、miR-143、miR-146b、miR-148a、miR-148b、miR-149、miR-152、miR-154、miR-155、miR-17-5p、miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b、miR-181b-1、miR-181b-2、miR-181c、miR-181d、miR-184、miR-186、miR-193b、miR-199a、miR- 204、miR-212、miR-221、miR-224、miR-27a、miR-27b、miR-29a、miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30d-5p、miR-30e-5p、miR-32、miR-335、miR-338-3p、miR-340、miR-342-3p、miR-361-3p、miR-373、miR-375、miR-4500、miR-4782-3p、miR-497、miR-503、miR-512-3p、miR-520a-3p、miR-526b、miR-625*及/或miR-96。此溶瘤病毒可用於治療肺癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7b、miR-101、miR-125b、miR-1280、miR-143、miR-146a、miR-146b、miR-155、miR-17、miR-184、miR-185、miR-18b、miR-193b、miR-200c、miR-203、miR-204、miR-205、miR-206、miR-20a、miR-211、miR-218、miR-26a、miR-31、miR-33a、miR-34a、miR-34c、miR-376a、miR-376c、miR-573、miR-7-5p、miR-9及/或miR-98。此溶瘤病毒可用於治療黑色素瘤之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7d、miR-218、miR-34a、miR-375、miR-494、miR-100、miR-124、miR-1250、miR-125b、miR-126、miR-1271、miR-136、miR-138、miR-145、miR-147、miR-148a、miR-181a、miR-206、miR-220a、miR-26a、miR-26b、miR-29a、miR-32、miR-323-5p、miR-329、miR-338、miR-370、miR-410、miR-429、miR-433、miR-499a-5p、miR-503、miR-506、miR-632、miR-646、 miR-668、miR-877及/或miR-9。此溶瘤病毒可用於治療口腔癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7i、miR-100、miR-124、miR-125b、miR-129-5p、miR-130b、miR-133a、miR-137、miR-138、miR-141、miR-145、miR-148a、miR-152、miR-153、miR-155、miR-199a、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-212、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-409-3p、miR-411、miR-429、miR-432、miR-449a、miR-494、miR-497、miR-498、miR-519d、miR-655、miR-9、miR-98、miR-101、miR-532-5p、miR-124a、miR-192、miR-193a及/或miR-7。此溶瘤病毒可用於治療卵巢癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-216a-5p、miR-802、miR-217、miR-145-3p、miR-143-3p、miR-451a、miR-375、miR-214-3p、miR-216b-3p、miR-432-5p、miR-216a-3p、miR-199b-5p、miR-199a-5p、miR-136-3p、miR-216b-5p、miR-136-5p、miR-145-5p、miR-127-3p、miR-199a-3p、miR-199b-3p、miR-559、miR-129-2-3p、miR-4507、miR-1-3p、miR-148a-3p、miR-101、miR-1181、miR-124、miR-1247、miR-133a、miR-141、miR-145、miR-146a、miR-148a、miR-148b、miR-150*、miR-150-5p、miR-152、miR-15a、miR-198、miR-203、miR-214、miR-216a、miR-29c、miR-335、miR-34a、miR-34b、miR-34c、 miR-373、miR-375、miR-410、miR-497、miR-615-5p、miR-630、miR-96、miR-132、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-126、miR-135a、miR-143、miR-144、miR-150、miR-16、miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-217、miR-218、miR-337、miR-494及/或miR-98。此溶瘤病毒可用於治療胰臟癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之let-7a-3p、let-7c、miR-100、miR-101、miR-105、miR-124、miR-128、miR-1296、miR-130b、miR-133a-1、miR-133a-2、miR-133b、miR-135a、miR-143、miR-145、miR-146a、miR-154、miR-15a、miR-187、miR-188-5p、miR-199b、miR-200b、miR-203、miR-205、miR-212、miR-218、miR-221、miR-224、miR-23a、miR-23b、miR-25、miR-26a、miR-26b、miR-29b、miR-302a、miR-30a、miR-30b、miR-30c-1、miR-30c-2、miR-30d、miR-30e、miR-31、miR-330、miR-331-3p、miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-374b、miR-449a、miR-4723-5p、miR-497、miR-628-5p、miR-642a-5p、miR-765及/或miR-940。此溶瘤病毒可用於治療前列腺癌之方法及組合物中。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含針對以下之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本：插入病毒複製所需之一或多個病毒基因中之5’UTR或3’UTR中之miR-101、miR-183、miR-204、miR-34a、miR-365b-3p、miR-486-3p及/或miR-532-5p。此溶瘤病毒可用於治療視 網膜母細胞瘤之方法及組合物中。在一些實施例中，本文所述溶瘤病毒係單純皰疹病毒且其中病毒複製所需之一或多個病毒基因選自由以下組成之群：UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。
在一些情形下，本發明之重組體病毒載體係單純皰疹病毒(HSV)且進一步包含包含二倍體基因ICP0、ICP34.5、LAT及ICP4以及ICP47基因之啟動子之每一者之一個複本之內部重複(接頭)區的缺失。
在某些實施例中，本發明之重組體病毒載體係展現經由直接感染及/或側向擴展增強進入細胞中之HSV。在一態樣中，本發明之HSV載體可經由與不為HSV感染之典型介體(例如，不為連接素-1、HVEM或硫酸乙醯肝素/硫酸軟骨素蛋白多醣)之細胞蛋白質相互作用直接感染細胞。在某些實施例中，本發明之重組體病毒載體係HSV且進一步包含有利於經由非典型受體之載體進入之gB或gH基因的突變。在另一態樣中，本發明提供HSV載體，其進一步包含在通常對HSV側向擴展具有抗性之細胞、例如缺乏gD受體之細胞中展現側向擴展的突變體gH醣蛋白。在一些實施例中，本發明之HSV載體包含突變體gB或gH蛋白質中之一或多者，如美國專利公開案第2013/0096186號中所述，其以引用方式併入本文中。在某些態樣中，HSV載體內之突變體進入蛋白係涉及病毒進入之醣蛋白，例如gB、gH，且突變體HSV載體可包含二者之突變形式。然而，突變體進入蛋白可為實現HSV載體進入細胞中之任何蛋白質。在某些實施例中，突變 體進入蛋白不為gD，但HSV載體可另外包含例如含有配體或其他期望突變之突變體gD。用於本發明HSV載體中之gB或gH醣蛋白之非限制性突變出現在以下殘基中之一或多者：gB：D285、gB：A549、gB：S668、gH：N753及gH：A778。在一些實施例中，本發明HSV載體包含gB：D285及gB：A549二者、gH：N753及gH：A778二者、及/或gB：S668、gH：N753及gH：A778中之每一者之突變。在某些實施例中，HSV載體含有該等突變中之兩者或更多者(例如、3或更多者、4或更多者)，且HSV載體可包含所有五個該等殘基中之突變。在一個實施例中，HSV載體具有gB：285、gB；549、gH：753及gH：778之突變。突變在本文中係相對於HSV-1菌株KOS衍生物K26GFP之gD、gB及gH基因之密碼子(胺基酸)編號來提及。K26GFP之gB及gH之序列不同於如GenBank(編號AF311740(以引用方式併入本文中))中所揭示之gB之序列及如下表中所反映之gH(GenBank編號X03896(以引用方式併入本文中))之序列。
Figure 106103584-A0305-02-0048-1
然而，K26GFP可含有對應於GenBank X03896之核苷酸2,079-2,102 之基因之區之額外差異。因此，應理解，KOS衍生物K26GFP或GenBank登錄號AF311740之序列可用作本文論述之gB突變之參照序列。KOS衍生物K26GFP或GenBank登錄號X03896亦可用作本文論述之gH突變之參照序列。然而，本發明之HSV載體可包括任何HSV菌株之gB及gH中之同源突變。
在一些態樣中，用於納入HSV載體中之進入蛋白之突變係取代突變；然而，突變並不限於取代突變體。在某些實施例中，用於HSV載體中之突變體gB或gH醣蛋白選自由以下組成之取代突變之群：gB：D285N、gB：A549T、gB：S668N、gH：N753K、gH：A778V。在某些態樣中，HSV載體包括該等取代之組合(例如該等取代中之兩者或更多者(例如，3者或更多、4者或更多或全部))，其中gB：D285N/gB：A549T雙重突變體、gH：N753K/gH：A778V雙重突變體及gB：S668N/gH：N753K/gH：A778V三重突變體係實施例之實例。在一個實施例中，HSV載體包含gB：D285N/gB：A549T/gH：N753K/gH：A778V。
在某些態樣中，HSV載體包含突變體gB及/或突變體gH醣蛋白，其中醣蛋白中之突變係至少2個殘基中之取代突變，其中在載體係HSV-1K26GFP時，至少2個殘基選自由gB：D285、gB：A549、gB：S668、gH：N753及gH：A778組成之群，或其中在載體係同源HSV時，至少2個殘基選自與gB：D285、gB：A549、gB：S668、gH：N753及gH：A778相關之胺基酸，其中gB：D285殘基與VYPYXEFVL(SEQ ID NO：1)中之X相關，gB：A549殘基與KLNPNXIAS(SEQ ID NO：2)中之X相關，gB：S668殘基與ITTVXTFID(SEQ ID NO：3)中之X相關，gH：N753殘基與VDTDXTQQQ(SEQ ID NO：4)中之X相關，且gH：A778殘基與 VPSTXLLLF(SEQ ID NO：5)中之X相關；且其中HSV載體係HSV-1或HSV-2載體。
在一態樣中，本發明涵蓋重組體溶瘤病毒，其包含至少一個編碼蛋白質或寡核苷酸(例如，shRNA、誘餌寡核苷酸或安塔夠妙(antagomir))之聚核苷酸，該蛋白質或寡核苷酸降低miRNA、基因或金屬蛋白酶之組織抑制劑(TIMP)之表現或抑制其功能。該等重組體溶瘤病毒在本文中稱作「基因體-編輯」或「微環境-重塑」病毒或載體。經編碼之蛋白質或寡核苷酸可以任何數目之方式降低miRNA、基因或TIMP之表現或抑制其功能，該等方式包括靶向蛋白質(例如，TIMP)用於降解(例如，藉由泛蛋白化及蛋白酶體降解或靶向溶酶體降解)、阻斷與同源受體之相互作用(例如，阻斷抗體或其抗原結合片段或肽抑制劑)、降解信使RNA轉錄物(例如，短干擾RNA或短髮夾RNA)、及/或改變編碼特異性miR、基因或蛋白質之基因體DNA序列(例如，藉由內核酸酶)。
在特定實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低參與誘癌作用或轉移之miR或基因(例如，致癌miR或致癌基因)之表現。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含至少一個編碼蛋白質或寡核苷酸之聚核苷酸，該蛋白質或寡核苷酸降低作為致癌miRNA(例如，表4中所列舉之miRNA中之一或多者)之miRNA之表現或功能。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個編碼降低致癌miRNA之表現或功能之蛋白質或寡核苷酸之聚核苷酸。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多個編碼降低複數種致癌miRNA之表現或功能之複數種蛋白質或寡核苷酸的聚核苷酸。在一些實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低miR-17-92之表現且用於治療肺癌(例 如，小細胞肺癌)。在其他實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低miR-221及/或miR-21之表現且用於治療神經膠母細胞瘤。在某些實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低miR-155及/或miR-17-92之表現且用於治療淋巴瘤(例如，柏基特淋巴瘤、瀰漫性大B細胞淋巴瘤、邊緣區淋巴瘤或慢性淋巴球性白血病)。在一些實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低miR-221、miR-222及/或miR-146之表現且用於治療甲狀腺癌。在一些實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低miR-372及/或miR-373之表現且用於治療睪丸癌(例如，睪丸生殖細胞瘤)。在一些實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低miR-18及/或miR-224之表現且用於治療肝癌(例如，肝細胞癌)。
在一些實施例中，本文所述重組體病毒載體可用於降解腫瘤細胞外基質(ECM)，在一些態樣中，其導致增強之病毒擴散。基質金屬蛋白酶(MMP)係基於其活性分類成膠原酶、明膠酶、基質降解酶及基質溶解因子之鋅依賴性蛋白酶。該等蛋白酶通常分泌為前酶(酶原)且藉由前肽前結構域之蛋白水解移除被活化。MMP在癌症中所起之主要作用在於降解ECM，其有利於腫瘤侵襲及轉移。MMP亦參與腫瘤進展、上皮至間質過渡(EMT)及血管生成。MMP係藉由miRNA以及TIMP(其包含四種蛋白酶抑制劑(TIMP1、TIMP2、TIMP3及TIMP4)之家族)調控。多種腫瘤微環境藉由利用本發明之重組體病毒載體破壞負性調控MMP家族之miRNA或TIMP來降解。miRNA/MMP相互作用之實例示於表5中。該等相互作用中之許多顯示，多種MMP係由單一miRNA調控：例如let-7調控MMP-2、MMP-9及MMP-14；miR-143調控MMP-2、MMP-9及MMP-13；miR-218調控MMP-2、MMP-7及MMP-9。此外，絕大多數MMP可由單一TIMP主開關調控：例如，已知TIMP1可抑制幾乎所有已知MMP且亦促進多種細 胞類型中之細胞增殖；TIMP2與MMP-14及MMP-2相互作用。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含至少一個編碼蛋白質或寡核苷酸之聚核苷酸，該蛋白質或寡核苷酸降低作為微環境重塑miRNA(例如，表5中所列舉之miRNA中之一或多者)之miRNA之表現或功能。在一些實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低一種微環境重塑miRNA之表現或功能。在一些實施例中，蛋白質或寡核苷酸降低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10種或更多微環境重塑miRNA之表現或功能。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含編碼降低複數種微環境重塑miRNA之表現或功能之複數種蛋白質或寡核苷酸的複數種聚核苷酸。在一些實施例中，本文所述策略可藉由本發明之重組體病毒載體用於敲低或破壞負性調控MMP之miRNA或TIMP之表現或功能。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒降低選自TIMP1、TIMP2、TIMP3及TIMP4之TIMP之表現。
在一些實施例中，本文所述重組體溶瘤病毒包含至少一個編碼降低基因之表現或功能之蛋白質或寡核苷酸的聚核苷酸。在一些態樣中，基因係致癌基因(例如，選自表7中所列舉之基因之基因)。在一些態樣中，基因編碼致癌miR(例如，表4中所列舉之miRNA)、微環境重塑miR(例如，表5中所列舉之miRNA)或ECM降解之負調節劑(例如，TIMP)。基因表現及/或功能之降低可藉由轉錄程度(例如，使基因體DNA序列突變、缺失或沉默)或轉移程度(例如，藉由經由mRNA降解抑制基因產物之產生)。在一些實施例中，本文所述重組體溶瘤病毒包含一或多個編碼核酸酶之聚核苷酸，該核酸酶藉由使得基因序列能夠突變、缺失或抑制轉錄來降低基因之表現或功能。在具體實施例中，核酸酶選自成簇規律間隔之短回文重複序列(CRISPR)相關內核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)或轉錄活化劑樣效應物 核酸酶(TALEN)。在非限制性實例中，CRISPR相關之內核酸酶選自SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9、C2C1、C2C3、Cpf1、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(亦稱為Csnl及Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csx17、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csx15、Csfl、Csf2、Csf3及Csf4。
本發明之重組體病毒載體可利用CRISPR(成簇規律間隔之短回文重複序列)/Cas(CRISPR相關)核酸酶系統，其係基於可用於哺乳動物基因體改造之細菌系統的經改造之核酸酶系統。通常，系統包含Cas核酸酶及嚮導RNA(gRNA)。gRNA包括兩個部分；對靶基因體DNA序列具有特異性之crispr-RNA(crRNA)及有利於Cas結合之tracr RNA(trRNA)。crRNA及trRNA可以單獨RNA寡核苷酸形式存在，或可存於同一RNA寡核苷酸中，稱作單一嚮導-RNA(sgRNA)。如本文所用術語「嚮導RNA」或「gRNA」係指個別trRNA及個別crRNA或sgRNA之組合。例如，參見Jinek等人(2012)Science 337：816-821：Cong等人(2013)Science 339：819-823；Mali等人(2013)Science 339：823-826；Qi等人(2013)Cell 152：1173-1183；Jinek等人(2013),eLife 2：e00471；David Segal(2013)eLife 2：e00563；Ran等人(2013)Nature Protocols 8(11)：2281-2308；Zetsche等人(2015)Cell 163(3)：759-771：PCT公開案第WO 2007/025097號、第WO 2008/021207號、第WO 2010/011961號、第WO 2010/054108號、第WO 2010/054154號、第WO 2012/054726號、第WO 2012/149470號、第WO 2012/164565號、第WO 2013/098244號、第WO 2013/126794號、第WO 2013/141680號及第WO 2013/142578號；美國專利公開案第2010-0093617號、第2013-0011828號、第2010-0257638號、第2010-0076057號、第2011-0217739號、第2011-0300538號、第2013-0288251及第2012-0277120號；及美國專利第8,546,553號，其各自之全文以引用方式併入本文中。
已鑑別並在功能上詳細表徵多種1類CRISPR-Cas系統(包括I型及III型系統)，其揭示效應物複合物之複雜架構及動力學(Brouns等人，2008,Marraffini及Sontheimer,2008,Hale等人，2009,Sinkunas等人，2013,Jackson等人，2014,Mulepati等人，2014)。另外，亦已鑑別並以實驗方式表徵利用Cas9家族之同源RNA導向內核酸酶作為效應物之若干2類-II型CRISPR-Cas系統(Barrangou等人，2007,Garneau等人，2010,Deltcheva等人，2011,Sapranauskas等人，2011,Jinek等人，2012,Gasiunas等人，2012)。其次，最近在若干細菌基因體中鑑別出推定2類-V型CRISPR-Cas系統。推定V型CRISPR-Cas系統含有大的、約1,300個胺基酸蛋白，稱作Cpf1(來自普氏菌(Prevotella)及弗朗西斯氏菌屬1(Francisella 1))之CRISPR)。
在一些實施例中，本文所述溶瘤病毒進一步包含至少一個編碼靶向miRNA或TIMP之trRNA及crRNA之聚核苷酸。在一些情形下，至少一個編碼trRNA及crRNA之聚核苷酸插入病毒基因體上之基因座中。在一些實施例中，聚核苷酸係包含合成隔離物或天然病毒(例如，HSV)隔離物之隔離序列。在某些實施例中，溶瘤病毒係單純皰疹病毒且至少一個編碼 RNA結合位點之聚核苷酸插入一或多個基因組中或其之間，該等基因組包括內部重複接頭區(包含二倍體基因ICP0、ICP34.5、LAT、ICP4及ICP47啟動子中之每一者之一個複本)、ICP0、LAT、UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。在一個實施例中，溶瘤病毒係單純皰疹病毒(HSV)且至少一個編碼RNA結合位點之聚核苷酸插入UL3與UL4開放閱讀框之間之基因座中(例如，圖45及圖46)。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含至少一個編碼蛋白質之聚核苷酸，該蛋白質係雙特異性T細胞接合器(BiTE)、抗免疫抑制蛋白或免疫原性抗原。如本文所用之「抗免疫抑制蛋白」係抑制免疫抑制路徑之蛋白質。本發明涵蓋表現抗免疫抑制蛋白之溶瘤病毒，該抗免疫抑制蛋白係抗調節T細胞(Treg)蛋白或抗骨髓源抑制劑細胞(MDSC)蛋白。在一些實施例中，抗免疫抑制蛋白係VHH源阻斷劑或VHH源BiTE。如本文所用，「免疫原性抗原」係指增加發炎或免疫原性免疫反應之蛋白質。在特定實施例中，抗免疫抑制及免疫原性抗原誘導抗腫瘤免疫反應。該等蛋白質之實例包括結合並抑制免疫檢查點受體(例如CTLA4、LAG3、PD1、PDL1及其他)之抗體或其抗原結合片段、促發炎細胞介素(例如、IFNγ、IFNα、IFNβ、TNFα、IL-12、IL-2、IL-6、IL-8、GM-CSF及其他)或結合並活化活化受體(例如，FcγRI、FcγIIa、FcγIIIa、共刺激受體及其他)之蛋白 質。在特定實施例中，蛋白質選自EpCAM、葉酸鹽、IFNβ、抗CTLA-4、抗PD1、A2A、抗FGF2、抗FGFR/FGFR2b、抗SEMA4D、CCL5、CD137、CD200、CD38、CD44、CSF-1R、CXCL10、CXCL13、內皮素B受體、IL-12、IL-15、IL-2、IL-21、IL-35、ISRE7、LFA-1、NG2(亦稱為SPEG4)、SMAD、STING、TGFβ及VCAM1。
在某些實施例中，編碼經靶向以降低miRNA、基因或TIMP之表現之蛋白質或寡核苷酸的聚核苷酸插入重組體溶瘤病毒之病毒基因體的基因座中。在一些實施例中，聚核苷酸係包含合成隔離物或天然病毒(例如，HSV)隔離物之隔離序列。在某些實施例中，溶瘤病毒係單純皰疹病毒且至少一個編碼RNA結合位點之聚核苷酸插入一或多個基因組中或其之間，該等基因組包括內部重複接頭區(包含二倍體基因ICP0、ICP34.5、LAT、ICP4及ICP47啟動子中之每一者之一個複本)、ICP0、LAT、UL1、UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。在一個實施例中，病毒係單純皰疹病毒(HSV)且至少一個聚核苷酸插入UL3與UL4開放閱讀框之間之基因座中(例如，參見圖45及圖46)。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含至少一種蛋白酶活化之抗體。蛋白酶活化之抗體(例如由Metz等人(Protein Eng Des Sel,25(10)：571-80,2012)所述之彼等)經活化且在保護性蓋之蛋白酶裂解後僅 結合至靶標。在一些情況下，腫瘤微環境具有與周圍健康組織充分區分開之蛋白酶之陣列。舉例而言，蛋白酶細胞自溶酶B在多種癌症中過表現，該等癌症包括乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、頭頸癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰臟癌、前列腺癌及甲狀腺癌。包括由人類細胞合成之蛋白酶之完全清單之人類降解體由至少569種蛋白酶構成，該等蛋白酶分成五個寬類別(以自最大至最少數目之次序)：金屬蛋白酶(MMP)、絲胺酸、半胱胺酸、蘇胺酸及天冬胺酸蛋白酶(Lopez-Otin等人，Nat Rev Cancer,7(10)：800-8,2007)。具體而言，由MMP特異性裂解之蛋白酶抗體可用作將本文所述重組體病毒載體靶向腫瘤微環境之優良方式，此乃因在細胞之細胞外及細胞周圍區域中發現MMP。表6概述在癌症中過表現之蛋白酶，其可用於使得能夠特異性結合經蛋白酶活化之抗體假型重組體病毒載體。
在某些實施例中，蛋白酶活化之抗體納入病毒醣蛋白包膜中。蛋白酶活化之抗體可納入本發明之重組體病毒載體(例如，HSV載體)之醣蛋白包膜中以增加治療指數並減少脫靶感染。在HSV載體之情形下，在一些實施例中，醣蛋白可為gC或gD。在一些實施例中，本文所述重組體溶瘤病毒包含至少一個編碼蛋白酶活化之抗體之聚核苷酸。在某些實施例中，蛋白酶活化之抗體係由選自以下之蛋白酶活化：半胱胺酸細胞自溶酶、天冬胺酸細胞自溶酶、激肽釋放酶(hK)、絲胺酸蛋白酶、半胱天冬酶、基質金屬蛋白酶(MMP)及解聚素及金屬蛋白酶(ADAM)。在一些實施例中，蛋白酶選自細胞自溶酶K、細胞自溶酶B、細胞自溶酶L、細胞自溶酶E、細胞自溶酶D、hK1、PSA(hK3)、hK10、hK15、uPA、uPAR、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、 MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-18、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-23A、MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27、MMP-28或表6中所列舉之蛋白酶。
在一些實施例中，蛋白酶活化之抗體結合癌細胞或在癌症微環境中較非癌細胞或在非癌症微環境中表現更多之蛋白質。在某些態樣中，蛋白酶活化之抗體結合NKG2D、c-met、HGFR、CD8、硫酸乙醯肝素、VSPG4(亦稱為NG2)、EGFR、EGFRVIII、CD133、CXCR4、癌胚抗原(CEA)、CLC-3、膜聯蛋白II、人類運鐵蛋白受體或EpCAM。在某些情況下，多種蛋白酶活化之抗體可納入單一病毒載體粒子中以確保靶向不同腫瘤組織型。舉例而言，至少1、2、3、4、6、7、8、9、10或更多種蛋白酶活化之抗體可納入病毒醣蛋白包膜中。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個編碼至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多種蛋白酶活化之抗體的聚核苷酸。在一些實施例中，溶瘤病毒包含結合癌細胞或在癌症微環境中較非癌細胞或在非癌症微環境中表現更多之第一蛋白質的第一蛋白酶活化之抗體以及結合癌細胞或在癌症微環境中較非癌細胞或在非癌症微環境中表現更多之第二蛋白質的第二蛋白酶活化之抗體。在其他實施例中，溶瘤病毒包含結合癌細胞或在癌症微環境中較非癌細胞或在非癌症微環境中表現更多之複數種蛋白質的複數種蛋白酶活化之抗體。溶瘤病毒包含(例如)係人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體之蛋白酶活化之抗體。在一些實施例中，溶瘤病毒包含係全長免疫球蛋白、scFv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、雙價抗體、三價抗體、微小抗體、單一結構域抗體或多特異性抗體的抗體。
在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含以下中之一或多者：一或多 個插入病毒複製所需之一或多個病毒基因之基因座中之腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列；一或多個編碼一或多種蛋白質或寡核苷酸之聚核苷酸，其中蛋白質或寡核苷酸降低miR、基因或TIMP之表現或抑制其功能；至少一種蛋白酶活化之抗體；及/或編碼至少一種蛋白酶活化之抗體之聚核苷酸。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含：插入非癌細胞中病毒複製所需之病毒基因之基因座中之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本；及/或編碼經靶向以降低致癌miRNA或致癌基因之表現之蛋白質或寡核苷酸的第一聚核苷酸；及/或編碼經靶向以降低微環境重塑miRNA或TIMP之表現之蛋白質或寡核苷酸的第二聚核苷酸。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含：插入非癌細胞中病毒複製所需之病毒基因之基因座中之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本；及/或編碼經靶向以降低致癌miRNA或致癌基因之表現之蛋白質或寡核苷酸的聚核苷酸；及/或至少一種蛋白酶活化之抗體。在其他實施例中，重組體溶瘤病毒包含插入非癌細胞中病毒複製所需之病毒基因之基因座中之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本；及/或編碼經靶向以降低微環境重塑miRNA或TIMP之表現之蛋白質或寡核苷酸的聚核苷酸；及/或至少一種蛋白酶活化之抗體。在一個實施例中，重組體溶瘤病毒包含插入非癌細胞中病毒複製所需之病毒基因之基因座中之一或多個腫瘤抑制性miRNA靶序列的複數個複本；及/或編碼經靶向以降低致癌miRNA或致癌基因之表現之蛋白質或寡核苷酸的第一聚核苷酸；及/或編碼經靶向以降低微環境重塑miRNA或TIMP之表現之蛋白質或寡核苷酸的第二聚核苷酸；及/或至少一種蛋白酶活化之抗體。在一些具體實施例中，此段落中所述之溶瘤病毒係單純皰疹病毒且非癌細胞中病毒複製所需之病毒基因係UL1、 UL5、UL6、UL7、UL8、UL9、UL11、UL12、UL14、UL15、UL17、UL18、UL19、UL20、UL22、UL25、UL26、UL26.5、UL27、UL28、UL29、UL30、UL31、UL32、UL33、UL34、UL35、UL36、UL37、UL38、UL39、UL40、UL42、UL48、UL49、UL52、UL53、UL54、ICP0、ICP4、ICP22、ICP27、ICP47、γ-34.5、US3、US4、US5、US6、US7、US8、US9、US10、US11及US12。
在某些態樣中，本發明係關於重組體溶瘤病毒，其包含編碼經靶向以降低致癌miRNA或致癌基因之表現之蛋白質或寡核苷酸的第一聚核苷酸；及編碼經靶向以降低微環境重塑miRNA或TIMP之表現之蛋白質或寡核苷酸的第二聚核苷酸。在其他實施例中，重組體溶瘤病毒包含編碼經靶向以降低致癌miRNA或致癌基因之表現之蛋白質或寡核苷酸的聚核苷酸；及至少一種蛋白酶活化之抗體。在一些實施例中，重組體溶瘤病毒包含編碼經靶向以降低微環境重塑miRNA或TIMP之表現之蛋白質或寡核苷酸的聚核苷酸；及至少一種蛋白酶活化之抗體。在一個實施例中，重組體溶瘤病毒包含編碼經靶向以降低致癌miRNA或致癌基因之表現之蛋白質或寡核苷酸的第一聚核苷酸；及/或編碼經靶向以降低微環境重塑miRNA或TIMP之表現之蛋白質或寡核苷酸的第二聚核苷酸；及/或至少一種蛋白酶活化之抗體。
在某些實施例中，本文所述溶瘤病毒係皰疹病毒(例如，單純皰疹病毒(例如，HSV-1或HSV-2))、腺病毒、脊髓灰質炎病毒、牛痘病毒、麻疹病毒、水皰性口炎病毒、正黏液病毒、小病毒、馬拉巴病毒或柯薩奇病毒。基於HSV之載體及其構築方法闡述於以下中：例如，美國專利第7,078,029號、第6,261,552號、第5,998,174號、第5,879,934號、第 5,849,572號、第5,849,571號、第5,837,532號、第5,804,413號及第5,658,724號及國際專利申請案WO 91/02788、WO 96/04394、WO 98/15637及WO 99/06583，其全文以引用方式併入本文中。已公開HSV之序列(NCBI登錄號NC_001806；亦參見McGoech等人，J.Gen.Virol,69(PT 7),1531-1574(1988))，其可有利於設計本發明之基於HSV之載體。
本發明亦涵蓋編碼本文所述溶瘤病毒之核酸分子。
組合物及使用方法
本發明之某些態樣係關於包含本文所述溶瘤病毒之原液及組合物。在一些態樣中，本發明係關於包含本文所述溶瘤病毒之病毒原液。在一些實施例中，病毒原液係均相原液。病毒原液之製備及分析為業內熟知。舉例而言，病毒原液可在含有經病毒載體轉導之細胞之滾瓶中製造。隨後可將病毒原液以連續nycodenze梯度純化，並分成等份並儲存直至需要。病毒原液之效價變化相當大，此大大取決於用於製備其之病毒基因型及方案及細胞系。
在特定實施例中，本文涵蓋之病毒原液(例如，基於HSV之載體病毒原液)之效價係至少約105個噬菌斑形成單元(pfu)，例如至少約106pfu或甚至更佳至少約107pfu。在某些實施例中，效價可為至少約108pfu或至少約109pfu，且至少約1010pfu或至少約1011pfu之高效價原液最佳。
本發明進一步涵蓋包含本文所述溶瘤病毒或核酸分子及醫藥上可接受之載劑的組合物。片語「醫藥上可接受的」係指在投與個體(例如，人類)時不產生過敏或類似不利反應之分子實體及組合物。如本文所用術語「組合物」係指一或多種本文所述能投與或遞送至個體及/或細胞之溶瘤病毒或核酸分子的調配物。通常，調配物包括所有生理上可接受之組合 物，包括其衍生物及/或前藥、溶劑合物、立體異構物、外消旋物或互變異構物與任何生理上可接受之載劑、稀釋劑及/或賦形劑。「治療組合物」或「醫藥組合物」(在本文中可互換使用)係一或多種能投與或遞送至患者及/或個體及/或細胞之試劑的組合物，其用於治療特定疾病或病症。
本文揭示之組合物可以中性或鹽形式調配。「醫藥上可接受之鹽」包括酸及鹼加成鹽二者。醫藥上可接受之鹽包括酸加成鹽(與蛋白質之游離胺基形成)，且其係與以下酸形成：無機酸，例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及諸如此類；及有機酸，例如但不限於乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、海藻酸、抗壞血酸、天冬胺酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙醯胺基苯甲酸、樟腦酸、樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、檸檬酸、環拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羥基乙磺酸、甲酸、富馬酸、半乳糖二酸、龍膽酸、葡庚糖酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、麩胺酸、戊二酸、2-側氧基-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、馬尿酸、異丁酸、乳酸、乳糖醛酸、月桂酸、馬來酸、蘋果酸、丙二酸、苦杏仁酸、甲磺酸、黏酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羥基-2-萘甲酸、菸鹼酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、撲酸、丙酸、焦麩胺酸、丙酮酸、柳酸、4-胺基柳酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、對甲苯磺酸、三氟乙酸、十一烯酸及諸如此類。與游離羧基形成之鹽亦可源自無機鹼，例如鈉、鉀、鋰、銨、鈣、鎂、鐵、鋅、銅、錳、鋁鹽及諸如此類。源自有機鹼之鹽包括(但不限於)以下之鹽：一級胺、二級胺及三級胺、包括天然存在之經取代胺在內的經取代胺、環狀胺及鹼離子交換樹脂(例如，氨、異丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、地阿諾(deanol)、2-二甲基胺基乙醇、2-二乙基胺基乙醇、二環己胺、離胺酸、 精胺酸、組胺酸、咖啡因(caffeine)、普魯卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、膽鹼、甜菜鹼、苯乙苄胺、苄星青黴素、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可鹼、三乙醇胺、胺丁三醇、嘌呤、六氫吡嗪、六氫吡啶、N-乙基六氫吡啶、聚胺樹脂及諸如此類。尤佳之有機鹼係異丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二環己胺、膽鹼及咖啡因。在調配時，溶液將以與劑量調配物相容之方式及以治療有效之量投與。調配物易於以多種劑型(例如可注射溶液、藥物釋放膠囊及諸如此類)投與。
如本文所用，「載劑」包括任何及所有溶劑、分散介質、媒劑、包衣、稀釋劑、抗細菌及抗真菌劑劑、等滲及吸收延遲劑、緩衝液、載劑溶液、懸浮液、膠體及諸如此類。業內熟知用於醫藥活性物質之該等介質及試劑之使用。除任何與活性成份不相容之習用介質或試劑外，亦涵蓋其於治療組合物中之使用。亦可將補充活性成分納入組合物中。
如本文所用「醫藥上可接受之載劑」包括(但不限於)生理上相容之任何佐劑、載劑、賦形劑、助流劑、甜味劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、風味增強劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、穩定劑、等滲劑、溶劑、表面活性劑、分散介質、包衣、抗細菌及抗真菌劑、等滲及吸收延遲劑及諸如此類，包括已由美國食品藥品管理局(United States Food and Drug Administration)批准為可接受用於人類及/或家畜中之醫藥上可接受之細胞培養介質及/或乳化劑。實例係醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)糖，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；澱粉，例如玉米澱粉及馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素及乙酸纖維素；黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石；可可脂、蠟、動物及植物脂肪、石蠟、聚矽氧、膨潤土、矽酸、氧化鋅；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝 麻油、橄欖油、玉米油及大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，例如氫氧化鎂及氫氧化鋁；海藻酸；無熱源水；等滲鹽水；林格氏溶液(Ringer's solution)；乙醇；磷酸鹽緩衝溶液；及用於醫藥調配物中之任何其他可相容物質。除非任何習用介質及/或試劑與本發明之試劑皆不相容，否則本發明涵蓋其於治療組合物中之使用。亦可將補充活性成分納入組合物中。
潤濕劑、乳化劑及潤滑劑(例如月桂基硫酸鈉及硬脂酸鎂)以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、矯味劑及加香劑、防腐劑及抗氧化劑亦可存在於組合物中。
醫藥上可接受之抗氧化劑的實例包括：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、氫氯酸半胱胺酸、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉及諸如此類；(2)油溶性抗氧化劑，例如棕櫚酸抗壞血酸酯、丁基化羥基苯甲醚(BHA)、丁基化羥基甲苯(BHT)、卵磷脂、沒食子酸丙酯、α-生育酚及諸如此類；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸及諸如此類。
在一個實施例中，包含載劑之組合物適於非經腸投與，例如血管內(靜脈內或動脈內)、腹膜內或肌內投與。醫藥上可接受之載劑包括無菌水溶液或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉劑。業內熟知用於醫藥活性物質之該等介質及試劑之使用。除任何與病毒載體或核酸分子不相容之習用介質或試劑外，亦涵蓋其於本發明之醫藥組合物中之使用。
本發明之組合物可包含一或多種多肽、聚核苷酸、包含其之載體、 經感染細胞等，如本文所述，其調配於醫藥上可接受或生理上可接受之溶液中用於單獨或與一或多種其他治療模式組合投與細胞或動物。亦應理解，若期望，本發明之組合物亦可與其他試劑(例如細胞介素、生長因子、激素、小分子或各種醫藥活性劑)組合投與。對亦可包括於組合物中之其他組份實質上無限制，條件係其他試劑不會不利地影響組合物遞送預期療法之能力。
在本發明之醫藥組合物中，醫藥上可接受之賦形劑及載劑溶液之調配物為熟習此項技術者熟知，研發適宜投藥及治療方案以供在各種治療方案中使用本文所述特定組合物亦如此。在調配時，溶液係以與劑量調配相容之方式且以治療有效產生症狀之改良或補救的量投與。調配物易於以多種劑型(例如可攝取溶液、藥物釋放膠囊及諸如此類)投與。端視所治療個體之病況而定，可發生一些劑量變化。在任何事件中，負責投與之人員可測定個別個體之適當劑量。此外，對於人類投與而言，製劑滿足如由FDA生物製品評估及研究中心(FDA Center for Biologics Evaluation and Research)標準需要之無菌性、一般安全性及純度標準。投與途徑天然地將隨所治療疾病之位置及性質變化，且可包括(例如)真皮內、經皮、真皮下、非經腸、經鼻、靜脈內、肌內、鼻內、皮下、經皮、氣管內、腹膜內、腫瘤內、灌注、灌洗、直接注射及經口投與。
在某些情況下，應期望非經腸、靜脈內、肌內或甚至腹膜內遞送本文揭示之組合物、重組體病毒載體及核酸分子，如(例如)美國專利第5,543,158號、美國專利第5,641,515號及美國專利第5,399,363號(其各自全文以引用方式明確併入本文中)中所述。呈游離鹼或藥理學上可接受之鹽形式之活性化合物之溶液可在與表面活性劑(例如羥丙基纖維素)適宜地 混合之水中製備。分散液亦可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中及在油中製備。在普通儲存及使用條件下，該等製劑含有防腐劑以防止微生物生長。
適合於注射使用之醫藥形式包括無菌水溶液或分散液及用於即時製備無菌注射溶液或分散液之無菌粉劑(美國專利第5,466,468號，其全文以引用方式明確併入本文中)。在所有情況下，該形式應係無菌的且其流動性程度應使其具有易注射性。其應在製造及儲存條件下保持穩定且應針對諸如細菌及真菌等微生物之污染作用進行防腐。載劑可為溶劑或分散介質，其含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇及液體聚乙二醇及諸如此類)、其適宜混合物及/或植物油。可藉由(例如)使用諸如卵磷脂等包衣、藉由維持所需粒徑(在分散液之情形下)及藉由使用表面活性劑維持適當流動性。可藉由各種抗細菌及抗真菌劑(例如，對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞及諸如此類)來促進防止微生物作用。在許多情形中，將較佳包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可注射組合物之延長吸收可藉由在組合物中使用吸收延遲劑(例如，單硬脂酸鋁及明膠)來實現。含有蛋白質作為活性成份之水性組合物之製備為業內充分瞭解。通常，該等組合物係製備為可注射劑，呈液體溶液或懸浮液形式；亦可製備適於在注射之前溶解或懸浮於液體中之固體形式。製劑亦可經乳化。
對於水溶液中之非經腸投與而言，例如，溶液應適宜地經緩衝(若需要)且液體稀釋劑首先使得與足夠鹽水或葡萄糖等滲。該等特定水溶液尤其適於靜脈內、肌內、皮下及腹膜內投與。就此而言，鑒於本發明，熟習此項技術者已知可採用之無菌水性介質。舉例而言，可將一個劑量溶解於1ml等滲NaCl溶液中且添加至1000ml皮下灌注流體或在所提出輸注位點 注射(例如，參見Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版Baltimore,MD：Lippincott Williams & Wilkins,2000)。端視所治療個體之病況而定，必需發生一些劑量變化。在任何事件中，負責投與之人員將測定個別個體之適當劑量。此外，對於人類投與而言，製劑應滿足如由FDA生物製品辦公室(FDA Office of Biologics)標準需要之無菌性、致熱原性及一般安全性及純度標準。
無菌可注射溶液可藉由以下方式來製備：將活性化合物以所需量納入視需要具有上文所列舉多種其他成份之適當溶劑中，隨後進行過濾滅菌。通常，分散液係藉由將各種經滅菌活性成份納入含有鹼性分散介質及所需的來自上文所列舉成份之其他成份的無菌媒劑中來製備。在用於製備無菌可注射溶液之無菌粉劑之情形下，較佳製備方法係真空乾燥及冷凍-乾燥技術，其可自其預先經無菌過濾之溶液產生活性成份加上任一所期望額外成份之粉劑。
在某些實施例中，組合物可藉由鼻內噴霧、吸入及/或其他氣溶膠遞送媒劑遞送。經由經鼻氣溶膠噴霧將聚核苷酸及肽組合物直接遞送至肺的方法已闡述於(例如)美國專利第5,756,353號及美國專利第5,804,212號(其各自之全文以引用方式明確併入本文中)中。同樣，使用鼻內微粒樹脂(Takenaga等人，1998)及溶血磷脂醯基-甘油化合(美國專利第5,725,871號，其全文以引用方式明確併入本文中)之藥物之遞送亦為醫藥技術所熟知。同樣，呈聚四氟乙烯載體基質形式之經黏膜藥物遞送闡述於美國專利第5,780,045號(其全文以引用方式明確併入本文中)中。
在某些實施例中，遞送可藉由使用脂質體、奈米膠囊、微粒、微球體、脂質粒子、囊泡(視情況與CPP多肽混合)及諸如此類進行以供將本發 明組合物引入適宜宿主細胞中。特定而言，本發明組合物可經調配用於遞送，囊封於脂質粒子、脂質體、囊泡、奈米球、奈米粒子或諸如此類中。該等遞送媒劑之調配及使用可使用已知之習用技術來實施。本發明之調配物及組合物可包含一或多種多肽、聚核苷酸及小分子，如本文所述，其調配於醫藥上可接受或生理上可接受之溶液(例如培養基)中用於單獨或與一或多種其他治療模式組合投與細胞或動物。亦應理解，若期望，本發明之組合物亦可與其他試劑(例如細胞、其他蛋白質或多肽或各種醫藥活性劑)組合投與。
在特定實施例中，本發明之調配物或組合物包含與任一數目之如本文涵蓋之聚核苷酸或病毒載體之組合接觸之細胞。
在某些態樣中，本發明提供適於遞送病毒載體系統之調配物或組合物。
用於離體遞送之實例性調配物亦可包括使用業內已知之各種轉染試劑(例如磷酸鈣)、電穿孔、熱激及各種脂質體調配物(即，脂質介導之轉染)。脂質體係誘捕一部分水性流體之脂質雙層。DNA與陽離子脂質體(由於其電荷)之外表面自發締合且該等脂質體將與細胞膜相互作用。
本發明之特定實施例可包含其他調配物，例如醫藥技術中熟知且闡述於以下中之彼等：例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版。Baltimore,MD：Lippincott Williams & Wilkins,2000。
在某些態樣中，本發明提供醫藥上可接受之組合物，其包含治療有效量之一或多種如本文所述與一或多種醫藥上可接受之載劑(添加劑)及/或稀釋劑(例如，醫藥上可接受之細胞培養介質)調配在一起之病毒載體或聚 核苷酸。如本文所用「治療有效量」係指達成期望生理及/或生物結果所需之本文所述組合物或重組體病毒的量。病毒、病毒原液或組合物之「治療有效量」可根據以下因素變化：例如疾病狀態、個體年齡、性別及體重以及幹細胞及祖細胞在個體內引發期望反應之能力。治療有效量亦係其中治療有益效應勝過病毒或經轉導治療細胞之任何毒性或有害效應的量。術語「治療有效量」包括有效「治療」個體(例如，患者)之量。治療有效量可藉由噬菌斑形成單位(pfu)(例如至少1e1至至少1e20、特定而言約1e4至約1e15、更特定而言約1e6至約1e12pfu)之總數、或病毒基因體之數目(例如至少1e1至至少1e20、特定而言約1e4至約1e15、更特定而言約1e6至約1e12個病毒基因體)來量化。熟習此項技術者應瞭解，治療有效量將基於所投與病毒之類型、調配物之性質、投與途徑、欲治療之疾病之性質及/或嚴重程度、及/或個體之一般健康及身體狀況而變化。
本發明之一些態樣涵蓋殺死癌細胞之方法，其包含在足以使溶瘤病毒在該癌細胞內感染及複製之條件下將癌細胞暴露於本文所述溶瘤病毒或其組合物，且其中癌細胞內溶瘤病毒之複製引起細胞死亡。在某些實施例中，與非癌細胞相比，癌細胞具有降低之腫瘤抑制性miR之表現。在一些實施例中，藉由此方法殺死之癌細胞係在活體內。在某些實施例中，藉由此方法殺死之癌細胞係在腫瘤內。
本發明係關於治療有需要之個體之癌症之方法，其包含向個體投與預防有效量或治療有效量之如本文所述溶瘤病毒、病毒原液或組合物。如本文所用「個體」包括展現可利用本文揭示之重組體病毒載體、組合物及方法治療之疾病、病症或病況之症狀的任何動物。適宜個體(例如，患者)包括實驗室動物(例如小鼠、大鼠、兔或天竺鼠)、農場動物(例如馬或牛) 及家畜或寵物(例如貓或狗)。包括非人類靈長類動物且較佳人類患者。
「投與」在本文中係指向個體中引入溶瘤病毒、病毒原液或其組合物或使溶瘤病毒、病毒原液或其組合物與細胞及/或組織接觸。投與可藉由注射、灌溉、吸入、消耗、電滲透、血液透析、離子電滲及業內已知之其他方法進行。投與途徑天然地將隨所治療疾病之位置及性質變化，且可包括(例如)經耳、經頰、結膜、經皮、經牙、子宮頸內、竇內(endosinusial)、氣管內、經腸、硬膜外、間質、關節內、動脈內、腹內、耳內、膽道內、支氣管內、黏液囊內、海綿竇內、大腦內、腦池內、角膜內、冠內、冠狀動脈內、顱內、真皮內、盤內、導管內、十二指腸內、十二指腸內、硬膜內、心外膜內、表皮內、食管內、胃內、齒齦內、肝內、回腸內、病灶內、舌內、管腔內、淋巴內、乳房內、髓內、腦膜內、肌內、鼻內、結內、眼內、網膜內、卵巢內、腹膜內、心包內、胸膜內、前列腺內、肺內、瘤胃內、竇內(intrasinal)、脊椎內、滑膜內、腱內、睪丸內、氣管內、鞘內、胸廓內、小管內、腫瘤內、鼓室內、子宮內、腹膜內、血管內、室內、膀胱內、前庭內、靜脈內、玻璃體內、喉內、經鼻、鼻胃、經口、經眼、口咽、非經腸、經皮、關節周、硬膜外、神經周、牙周、呼吸、眼球後(retrotubular)、直腸、脊椎、蛛網膜下、結膜下、皮下、真皮下、齦下、舌下、黏膜下、視網膜下、局部、經皮、心內膜內、經黏膜、經胎盤、經氣管、經鼓膜、輸尿管、尿道及/或陰道灌注、灌洗、直接注射及經口投與。
如本文所用術語「治療」(「treating」及「treatment」)係指向個體投與治療有效量之如本文所述重組體病毒或其組合物，以使該個體之疾病或病況或疾病或病況之症狀有改良。改良係疾病或病況或疾病或病況之症 狀之任何改良或補救。改良係可觀察或可量測之改良，或可為個體之健康狀況之一般感覺。因此，熟習此項技術者認識到，治療可改良疾病狀況，但可不為疾病之完全治癒。「預防有效量」係指有效達成期望預防結果之病毒、病毒原液或組合物的量。如本文所用「預防」可意指疾病症狀之完全預防、疾病症狀之發作之延遲、或減輕隨後發生之疾病症狀之嚴重程度。通常但未必，因預防劑量係在患病之前或患病早期用於個體中，故預防有效量小於治療有效量。
本文之「癌症」係指或闡述哺乳動物中之通常特徵在於細胞生長失調之生理學病況。癌症之實例包括(但不限於)癌、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤、骨原性肉瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、平滑肌肉瘤、脊索瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、黏液肉瘤、軟骨肉瘤)、神經內分泌腫瘤、間皮瘤、滑膜瘤、神經鞘瘤、腦脊髓膜瘤、腺癌、黑色素瘤及白血病或淋巴性惡性病。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌(例如上皮鱗狀細胞癌)、肺癌(包括小細胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小細胞肺癌、肺之腺癌及肺之鱗狀癌、小細胞肺癌(small cell lung癌))、腹膜癌、肝細胞癌、胃癌(gastric或stomach cancer，包括胃腸癌)、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌(kidney或renal cancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌、肛門癌、陰莖癌、睪丸癌、食管癌、膽道腫瘤、尤恩氏腫瘤(Ewing's tumor)、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝細胞瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、威爾姆氏瘤(Wilms' tumor)、睪丸腫瘤、肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質瘤、星細胞瘤、髓母細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、寡樹突神經膠細胞瘤、腦脊髓膜瘤、黑色素瘤、神經胚細胞瘤、視網膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、瓦登斯特隆巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、脊髓發育不良疾病、重鏈病、神經內分泌腫瘤、神經鞘瘤及其他癌、以及頭頸癌。
在某些實施例中，如本文所述溶瘤病毒(例如，HSV)、病毒原液或組合物用於治療選自以下之癌症：肺癌(例如，小細胞肺癌或非小細胞肺癌)、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、睪丸癌、結腸直腸癌、結腸癌、胰臟癌、肝癌(例如，肝細胞癌(HCC))、胃癌、頭頸癌、甲狀腺癌、惡性膠質瘤、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)及邊緣區淋巴瘤(MZL)。
在某些態樣中，本發明係關於如本文揭示之圖或實施例中之任一者所示之溶瘤病毒載體。
實例
以下實例係出於闡釋本發明之各個實施例之目的且並不意欲以任何型式限制本發明。本發明實例以及本文所述方法具有實例性，且並不意欲限制本發明之範疇。明確涵蓋本發明之精神內涵蓋之所述實施例之變化、修改及其他改變。
實例1-正常及惡性細胞之miR序列分析
差異miR表現係許多癌症之標誌(Lu等人，Nature,2005)。實施實驗以測定主要在八種不同癌細胞系中高度差異表現之miR。差異表現係藉由與非癌對照組織比較來測定。對總共108個試樣進行測序。試樣詳情提供 於下表中。
Figure 106103584-A0305-02-0073-2
為有利於選擇細胞類型中適於HSV減毒之適當miRNA靶序列的鑑別，實施癌系及非癌對照組織之miRNA序列剖析。針對癌及非癌細胞產生dicer處理之RNA之測序文庫，包括膀胱、結腸、乳房、胰臟、肺、頭頸、神經鞘瘤、神經膠母細胞瘤、腦、肝及骨髓。將該等miRNA測序文庫正規化至總RNA，且使用用於高達3e8個讀數/輪之測序讀數之HiSeq 2500超高通量測序系統及HiSeq V4化學試劑進行測序(Illumina)。使用Basespace中之miRNA分析工具(Illumina)分析來自測序輪之FASTQ文件。藉由計算正常之平均值、癌症之平均值並自高至低分選正常/癌症之比率進行分級。利用具有零及轉化為零之負值之天然對數值生成熱圖(量度：黑色係高表現，白色係低表現)。橫跨試樣之正規化數據表示為給定試樣中之正規化miRNA讀數計數。正規化與給定試樣中相對於其他試樣比較之讀數之總數有關。
圖1例示非癌及癌性腦組織中25個miRNA之miRNA表現特性熱圖。針對以下顯示miRNA表現特性熱圖之其他實例：對應於每一實例中25個miRNA之非癌及癌性膀胱(圖2)、乳房(圖3)、結腸(圖4)、腦(圖5)、頭頸(圖6)、肺(圖7)、胰臟(圖8)及神經鞘瘤(圖9)組織。圖10顯示與代表泛-腫瘤抑制miRNA之非癌組織相比，所有腫瘤類型中miR-451a含量經下調。圖11顯示在所測試之所有腫瘤類型中miR-1經下調，以中等含量存於非癌組織中，且以高含量存於頭頸組織中。圖12顯示在所測試之所有腫瘤類型中miR-559經下調，通常以低含量存於非癌組織中，且以高含量存於非癌肺組織中。圖13顯示在所測試之所有腫瘤類型中miR-145-5p經下調且通常以高含量存於大多數所測試非癌組織類型中。圖14顯示在結腸、肺及胰臟腫瘤中miR-143-3p經下調，且以高含量存於所有正常組織類型及一些乳房腫瘤系中。miRNA數據分析揭示代表文獻先前未鑑別之新穎及意外miRNA表現特性的至少11個miRNA。
該等所鑑別miRNA中之許多係泛-或多-腫瘤特異性。舉例而言，miR-451a、miR-559、miR-1、miR-145-3p及miR143-3p之表現通常橫跨所測試之所有癌細胞系與對照組織相比經下調。此對於miR-451a尤其值得注意，其在所有正常組織類型中高度表現且在所有癌症類型中實質上下調，由此代表泛特異性腫瘤抑制性miRNA。miR-559之表現在正常組織類型中較低，正常肺組織除外，且正常組織中miR-1及mir-145-3p之表現係可變的。儘管差異及絕對表現程度之量級之可變性，但與相應正常組織中之含量相比，癌細胞系中每一miR之平均表現實質上較低。該等miRNA係產生能廣泛治療各種癌症類型之泛-腫瘤HSV病毒粒子的候選者。
儘管與對照相比，癌細胞系中miR-451a、miR-559、miR-1、miR- 145-3p及miR143-3p之平均表現較低，但降低之表現並非在所有癌細胞系中完全一致。舉例而言，所測試之正常膀胱試樣之2/3顯示miR-145-3p之增加表現，而其餘試樣中之表現實質上類似於癌細胞系中觀察之平均值。在乳癌細胞系中觀察到類似結果。儘管所有乳癌試樣之平均讀數計數係106，但5/12試樣具有>1000個計數之正規化讀數計數，其中之2個係>40,000個計數。
該等數據指示產生能靶向多種腫瘤類型之單一miR減毒之溶瘤病毒的潛能。舉例而言，包含miR-124、miR-451a、miR-559、miR-1及miR-145-3p之靶序列之構築體可用於治療所測試之所有腫瘤類型(例如，膀胱、結腸、乳房、胰臟、肺、頭頸、神經鞘瘤及神經膠母細胞瘤)。不同癌症類型中miR之表現程度之可變性指示需要藉由miR表現或經由使用其他生物標記對患者進行分層之潛能。
實例2-用以快速分析基於miRNA之基因減毒之報導基因系統的構築及使用
研發報導基因系統以評價使用實質上任何miRNA靶序列及同源miRNA之基於miRNA之基因減毒。在此系統(示於圖15中)中，由miRNA識別之靶序列(即hsa-miR-122)插入去穩定綠色螢光蛋白(dsGFP)之3’UTR中。隨後使用mCherry作為對照用於miRNA表現經由四環素(tet)誘導型啟動子使同源miRNA表現。將所有表現載體選殖至亦表現mCherry(pTF002)之tet抑制型載體pcDNA5 Frt/To中。用於表現之所有miRNA係藉由自人類基因體DNA基因合成來產生且將其選殖至pTF002中。為產生減毒報導基因載體，將dsGFP選殖至cDNA3.1+中，從而產生載體pTF004。減毒載體含有目標miRNA序列之反向補體之四個串聯重複，其 由8-16個核苷酸隔開。藉由使用標準分子生物技術將以合成方式產生之寡核苷酸插入pTF004之dsGFP基因之3 'UTR中構築質體。在第一天，根據製造商方案使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將HEK293TetR細胞用miRNA減毒及報導基因表現質體(各自0.15μg，總共0.3μg含有CMV啟動子之質體)轉染。在第二天，用四環素以5ng/ml處理細胞並將其培育高達72小時。培育後，使用SpectraMax® i3x Minimax多模式微板讀數儀(Molecular Devices)每日檢測GFP及mCherry螢光信號並使用Softmax Pro或Metamorph成像軟體(Molecular Devices)進行分析。利用5-6ms之曝光獲得相位影像。利用GFP(541nm頻道)曝光10ms及mCherry(713nm頻道)200-1500ms獲得螢光影像。
圖16例示在經由tet誘導miR-122表現後在24小時時miR-122介導之GFP表現減弱。對照構築體miR-184、miR-34a及Let7a不減弱GFP含量，在tet不存在下亦未觀察到GFP減毒。圖17顯示使用個別地及以miR-122/Let7a、miR-122/Let7a/miR-34a或miR-122/Let7a/miR-184之盒組合之每一miR靶序列的miR-122、miR-184、miR-34a及Let7a表現及GFP減毒。僅在適當miR及同源靶序列一起存在時觀察到降低之GFP(加圓圈之孔)。圖18用作非減毒對照且顯示miR-122、miR-184、miR-34a及Let7a表現及mCherry表現。
圖19顯示個別使用每一靶序列之miR-122、miR-124、miR-145、miR-199及miR-451表現及GFP減毒(加圓圈之孔)。圖20用作上述實例之非減毒對照且顯示個別使用每一靶序列之miR-122,miR-124,miR-145,miR-199及miR-451表現及mCherry表現。圖21顯示在同源miR-122或miR-184靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-122及miR-184減弱GFP 螢光。圖22顯示在同源miR-34a或miR-184靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-34a及miR-184減弱GFP螢光。圖23顯示在同源Let-7a或miR-184靶序列存在時，在轉染後72小時，Let-7a及miR-184減弱GFP螢光。圖24顯示在同源miR-124或miR-184靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-124及miR-184減弱GFP螢光。圖25顯示在同源miR-145或miR-184靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-145及miR-184減弱GFP螢光。圖26顯示在同源miR-199或miR-451靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-199及miR-451減弱GFP螢光。圖27顯示在同源miR-125或miR-451靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-125及miR-451減弱GFP螢光。圖28顯示在同源miR-126或miR-451靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-126及miR-451減弱GFP螢光。圖29顯示在同源miR-127或miR-451靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-127及miR-451減弱GFP螢光。圖30顯示在同源miR-133或miR-451靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-133及miR-451減弱GFP螢光。圖31顯示在同源miR-223或miR-451靶序列存在時，在轉染後72小時，miR-223及miR-451減弱GFP螢光。
因此，該等資料指示，miR表現可引起表現同源miR靶序列之基因之特異性減毒。
實例3-miRNA減毒之HSV之生成
在miRNA靶序列及同源miRNA對之基於報導基因之驗證後，生成含有miRNA減毒盒之基於HSV之病毒。可對細菌人工染色體(BAC)上之KOS-37 BAC(HSV-1之KOS菌株之全長基因體純系)進行一系列修飾，如(Mazzacurati等人，Mol Ther.,2015)所述。對於含有二倍體基因ICP0、ICP34.5、LAT及ICP4以及ICP47基因之啟動子之每一者之一個複本的內 部重複(接頭)區，缺失產物KGBAC。此缺失有利於操縱4個缺失基因之其餘複本，提供為增強病毒之溶瘤活性之轉基因的潛在納入提供充足空間，並藉由降低神經毒力因子ICP34.5之表現增加腫瘤特異性；ICP47表現之消除有益於經感染癌細胞由病毒特異性T細胞之免疫識別。KGBAC亦含有經由2A肽序列與醣蛋白C(gC)ORF稠合之GFP開放閱讀框(ORF)以容許監測晚(複製後)病毒基因表現。最後，KGBAC含有所示gB基因之突變對以增強經由非典型受體之HSV進入。將miRNA靶序列盒重組至2A5B-MMP9之ICP4及/或ICP27基因之3' UTR中以產生如圖32中所示之ONCR-003、ONCR-010、ONCR-011、ONCR-012、ONCR-013、ONCR-014、ONCR-015、ONCR-016、ONCR-017、ONCR-018、ONCR-019、ONCR-020、ONCR-021及ONCR-022。所有BAC構築體皆轉化成病毒粒子，同時藉由Vero-Cre細胞之轉染移除位於loxP位點之間之BAC序列。在噬菌斑純化後，製備病毒原液並在Vero細胞上進行滴定。
實例4-使用miRNA減毒之HSV之病毒感染性分析
為分析正常及癌細胞中之病毒感染性及複製，在以下活體外分析中測試miRNA減毒之HSV粒子。在第一天，對於感染之每一細胞類型，引入HSV粒子以達成0.01之感染複數(moi)。在第2至5天，藉由使用SpectraMax® i3x Minimax多模式微板讀數儀(Molecular Devices)之GFP檢測分析病毒感染性並使用Softmax Pro或Metamorph成像軟體(Molecular Devices)進行分析。利用5-6ms之曝光獲得相位影像。螢光影像係使用GFP(541nm頻道)曝光10ms及mCherry(713nm頻道)曝光200-1500ms獲得，評估任何潛在非特異性自體螢光信號。
由於ICP27基因中miR-125盒之存在及該等細胞中高含量之miR-125a (>3000個計數)，ONCR-011複製在有絲分裂後肺組織中顯著減弱，如圖33(藉由GFP陽性細胞量化讀出)及圖34(藉由量化PCR讀出)中所示。儘管ONCR-011及對照病毒ONCR-003含有ICP4基因中之miR-124靶序列，但miR-124係以不足以減弱病毒複製之低含量(<100個計數)存在。ONCR-011及ONCR-003二者在頭頸癌細胞(A253)中皆自由複製，此乃因該等細胞含有低含量之miR-125a及miR-124二者(<100個計數)。ONCR-013複製在HCC1395細胞中顯著減弱、但在A253細胞中不顯著減弱，如圖35(藉由GFP陽性細胞量化讀出)及圖36(藉由量化PCR讀出)中所示。ONCR-014複製在非癌肺組織中顯著減弱，如圖37(藉由GFP陽性細胞量化讀出)及圖38(藉由量化PCR讀出)中所示。
實例5-患有胰臟癌、肺癌或結腸癌之患者之治療
使用本文揭示之組合物及方法治療患有胰臟癌、肺癌或結腸癌之患者。可藉由向UL19、ICP4、ICP27(或其他病毒基因)中納入一或多個miRNA靶序列產生減毒之基於HSV之病毒原液，如圖39-44中所示。在一些情形下，除了miRNA靶序列以外，亦將用於腫瘤破壞及/或微環境重塑之基因體編輯能力經工程改造至病毒中，如圖45-46中所示。在具體實例中，根據實例3中所述之方法產生基於HSV之原液，其中含有已納入ICP4及ICP27中之miR-124、miR-451a、miR-143-3p及miR-559減毒盒。將miRNA靶序列盒引入ICP4(miR-124)及ICP27(miR-451a、miR-143-3p、miR-559)基因之3' UTR中，如圖47中所示。BAC構築體轉化成病毒粒子，同時藉由Vero-Cre細胞之轉染，移除位於loxP位點之間之BAC序列。在噬菌斑純化後，將病毒原液進一步純化，更換緩衝液，並在Vero細胞上進行滴定。當向患有胰臟癌、肺癌或結腸癌之患者活體內投藥時，在 磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，使用醫藥上可接受之穩定劑一起製備HSV粒子。在治療當天，經由腫瘤內輸注投與含在1.0mL體積之醫藥上可接受之載劑中之109個載體基因體。使用標準護理程序，依據患者之特定預後，按適當時間間隔監測患者之腫瘤消退。
實例6-患有腦癌、膀胱癌、乳癌或頭頸癌之患者之治療
使用本文揭示之組合物及方法治療患有腦癌、膀胱癌、乳癌或頭頸癌之患者。根據實例3中所述之方法，產生基於HSV之原液，其中含有miR-124、miR-451a、miR-145-3p及miR-559減毒盒。將miRNA靶序列盒引入ICP4(miR-124)及ICP27(miR-451a、miR-145-3p、miR-559)基因之3' UTR中，如圖48中所示。BAC構築體轉化成病毒粒子，同時藉由Vero-Cre細胞之轉染，移除位於loxP位點之間之BAC序列。在噬菌斑純化後，將病毒原液進一步純化，更換緩衝液，並在Vero細胞上進行滴定。當向患有腦癌、膀胱癌、乳癌或頭頸癌之患者活體內投藥時，在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，使用醫藥上可接受之穩定劑一起製備HSV粒子。在治療當天，經由腫瘤內輸注投與含在1.0mL體積之醫藥上可接受之載劑中之109個載體基因體。使用標準護理程序，依據患者之特定預後，按適當時間間隔監測患者之腫瘤消退。
實例7-患有神經鞘瘤之患者之治療
使用本文揭示之組合物及方法治療患有神經鞘瘤之患者。根據實例3中所述之方法，產生基於HSV之原液，其中含有miR-124-3p、miR-205-5p、miR-141-5p及miR-31-5p減毒盒。將miRNA靶序列盒重組至ICP4(miR-124)及ICP27(miR-205-5p、miR-141-5p、miR-31-5p)基因之3' UTR中，如圖49中所示。BAC構築體轉化成病毒粒子，同時藉由Vero- Cre細胞之轉染移除位於loxP位點之間之BAC序列。在噬菌斑純化後，將病毒原液進一步純化，更換緩衝液並在Vero細胞上進行滴定。對於向患有神經鞘瘤之患者之活體內投與，在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，使用醫藥上可接受之穩定劑一起製備HSV粒子。在治療當天，經由腫瘤內輸注投與在1.0mL體積之醫藥上可接受之載劑中之109個載體基因體。使用標準護理程序，依據患者之特定預後，按適當時間間隔監測患者之腫瘤消退。
儘管在本文中顯示並闡述了本發明之較佳實施例，但熟習此項技術者將顯而易見，該等實施例僅作為實例來提供。熟習此項技術者可在不背離本發明之情況下構想出許多變化、改變及替代。應瞭解，可在實踐本發明中採用本文所述之本發明實施例之各種替代。以下申請專利範圍意欲界定本發明範圍並由此覆蓋該等申請專利範圍及其等效形式範圍內之方法及結構。
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Figure 106103584-A0305-02-0883-811
<110> 美商昂克諾斯公司(ONCORUS,INC.)
<120> 溶瘤病毒載體及其用途
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<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變gB醣蛋白
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> gB取代突變D至N之位置
<400> 1
Figure 106103584-A0305-02-0884-812
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變gB醣蛋白
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> gB取代突變A至T之位置
<400> 2
Figure 106103584-A0305-02-0884-813
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 突變gB醣蛋白
<220>

Claims (30)

  1. 一種重組體溶瘤病毒，其包含二或多個腫瘤抑制性微小RNA(miR)靶序列的一或多個複本，其中該病毒係單純皰疹病毒(HSV)，其中該重組體HSV基因體之ICP4基因座包含至少一個miR-124靶序列，且其中該重組體HSV基因體之ICP27基因座包含至少一個針對選自由以下組成之群的miR之腫瘤抑制性miR靶序列：mir-193b、let-7a、let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7a-3p、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7g-5p、let-7i、mir-1、mir-100、mir-101、mir-103a、mir-105、mir-106a、mir-106a-5p、mir-107、mir-10a、mir-10b、mir-1180、mir-1181、mir-1207-5p、mir-122、mir-1228、mir-122a、mir-1236、mir-1247、mir-1250、mir-1258、mir-125a、mir-125a-3p、mir-125a-5p、mir-125b、mir-126、mir-1266、mir-127、mir-127-3p、mir-1271、mir-128、mir-128-3p、mir-1280、mir-1285、mir-128a、mir-129、mir-129-1-3p、mir-129-2-3p、mir-129-3p、mir-129-5p、mir-1291、mir-1294、mir-1295b-3p、mir-1296、mir-1297、mir-1307、mir-130a、mir-130b、mir-132、mir-133a、mir-133a-1、mir-133a-2、mir-133b、mir-134、mir-135a、mir-135a-5p、mir-136、mir-137、mir-138、mir-139、mir-139-5p、mir-140、mir-140-5p、mir-141、mir-142-3p、mir-142-5p、mir-143、mir-144、mir-145、mir-1469、mir-146a、mir-146a-5p、mir-146b、mir-146b-5p、mir-147、mir-148a、mir-148b、mir-149、mir-150、mir-150-5p、mir-151、mir-152、mir-153、mir-154、mir-155、mir-155-5p、mir-15a、mir-15b、 mir-16、mir-16-1、mir-16-1-3p、mir-16-2、mir-17、mir-17-5p、mir-181a、mir-181a-1、mir-181a-2、mir-181a-5p、mir-181b、mir-181b-1、mir-181b-2、mir-181b-5p、mir-181c、mir-181d、mir-182、mir-182-5p、mir-1826、mir-183、mir-184、mir-185、mir-186、mir-187、mir-188-5p、mir-18a、mir-18b、mir-191、mir-192、mir-193a、mir-193a-3p、mir-193a-5p、mir-194、mir-195、mir-195-5p、mir-196a、mir-197、mir-1974、mir-198、mir-199a、mir-199a-3p、mir-199a-5p、mir-199b、mir-199b-5p、mir-19a-3p、mir-200a、mir-200b、mir-200c、mir-202、mir-202-3p、mir-203、mir-204、mir-204-3p、mir-204-5p、mir-205、mir-206、mir-20a、mir-21、mir-21-3p、mir-210、mir-211、mir-212、mir-212-3p、mir-214、mir-215、mir-216a、mir-216b、mir-217、mir-218、mir-219-5p、mir-22、mir-220a、mir-221、mir-222、mir-223、mir-224、mir-2278、mir-23a、mir-23b、mir-24、mir-24-3p、mir-25、mir-26a、mir-26b、mir-27a、mir-27b、mir-28-3p、mir-28-5p、mir-29a、mir-29a-3p、mir-29b、mir-29b-1、mir-29b-1-5p、mir-29b-2、mir-29c、mir-300、mir-301a、mir-301b、mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-30a、mir-30a-3p、mir-30a-5p、mir-30b、mir-30c、mir-30c-1、mir-30c-2、mir-30d、mir-30d-5p、mir-30e、mir-30e-5p、mir-31、mir-3189-3p、mir-32、mir-320、mir-320a、mir-320c、mir-323-5p、mir-324-3p、mir-326、mir-328、mir-329、mir-330、mir-331-3p、mir-335、mir-335-5p、mir-337、mir-338、mir-338-3p、mir-339-5p、mir-33a、mir-33b、mir-340、mir-342、mir-342-3p、mir-345、mir-34a、mir-34a-5p、mir-34b、mir-34c、mir-34c-3p、mir-34c- 5p、mir-361-3p、mir-361-5p、mir-363、mir-365、mir-365b-3p、mir-367、mir-370、mir-372、mir-373、mir-374a、mir-374b、mir-375、mir-376a、mir-376c、mir-377、mir-378、mir-378a-3p、mir-378a-5p、mir-379、mir-381、mir-382、mir-383、mir-3928、mir-409-3p、mir-410、mir-411、mir-422a、mir-424、mir-424-5p、mir-425、mir-429、mir-432、mir-433、mir-4458、mir-448、mir-4487、mir-449、mir-449a、mir-449b、mir-4500、mir-450a、mir-450b-3p、mir-451、mir-451a、mir-452、mir-454、mir-455、mir-4723-5p、mir-4782-3p、mir-483、mir-483-5p、mir-484、mir-485-5p、mir-486、mir-486-3p、mir-486-5p、mir-490-3p、mir-490-5p、mir-491-5p、mir-493、mir-494、mir-495、mir-497、mir-498、mir-499a-5p、mir-502、mir-502-5p、mir-503、mir-504、mir-506、mir-508-3p、mir-509-3p、mir-509-5p、mir-511、mir-512-3p、mir-513b、mir-517a、mir-518a-3p、mir-518b、mir-519d、mir-520a、mir-520a-3p、mir-520b、mir-520c-3p、mir-520d-3p、mir-526b、mir-532-5p、mir-542-3p、mir-543、mir-545、mir-551a、mir-564、mir-573、mir-574-3p、mir-574-5p、mir-576-3p、mir-577、mir-582-5p、mir-584、mir-590-5p、mir-608、mir-610、mir-612、mir-613、mir-614、mir-615-5p、mir-622、mir-625、mir-627、mir-628-5p、mir-630、mir-632、mir-637、mir-638、mir-642a-5p、mir-646、mir-655、mir-656、mir-660、mir-663、mir-668、mir-675、mir-7、mir-7-5p、mir-720、mir-7515、mir-765、mir-873、mir-874、mir-877、mir-885-5p、mir-886-3p、mir-886-5p、mir-9、mir-92a、mir-93、mir-940、mir-941、mir-9500、mir-96、mir-96-5p、mir-98、mir-99a、 mir-99b、mmu-mir-290-3p及mmu-mir-290-5p。
  2. 如請求項1之溶瘤病毒，其中該miR-124靶序列之二或多個副本插入該ICP4基因座中。
  3. 如請求項1之溶瘤病毒，其中將至少一個額外之miR靶序列納入該ICP4基因座中，其中該額外之miR靶序列不同於該miR-124靶序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之溶瘤病毒，其包含插入該ICP27基因座之該miR-122靶序列的至少一個複本。
  5. 如請求項1至3中任一項之溶瘤病毒，其中將該腫瘤抑制性miR靶序列納入該ICP4基因座及該ICP27基因座之5’未轉譯區(UTR)或3’UTR中。
  6. 如請求項1之溶瘤病毒，其中該病毒於第一細胞中之複製比該病毒於第二細胞中之複製降低或減弱，其中該第一細胞為非癌細胞，以及其中該第二細胞為癌細胞。
  7. 如請求項6之溶瘤病毒，其中該第一細胞中可以結合至該二或多個腫瘤抑制性miR靶序列之腫瘤抑制性miR之表現比該第二細胞中該腫瘤抑制性miR之表現提高。
  8. 如請求項7之溶瘤病毒，其中該第一細胞中該腫瘤抑制性miR之表現 程度比該第二細胞中該腫瘤抑制性miR之表現程度大至少5%。
  9. 如請求項6之溶瘤病毒，其中該第二細胞中可以結合至該二或多個腫瘤抑制性miR靶序列之腫瘤抑制性miR之表現比該第一細胞中該腫瘤抑制性miR之表現降低。
  10. 如請求項10之溶瘤病毒，其中該第二細胞中該腫瘤抑制性miR之表現程度比該第一細胞中該腫瘤抑制性miR之表現程度小至少5%。
  11. 如請求項1至3及6至10中任一項之溶瘤病毒，其進一步包含編碼選自細胞介素及抗免疫抑制蛋白之異源聚核苷酸。
  12. 如請求項11之溶瘤病毒，其中該細胞介素為IL-12，以及其中該抗免疫抑制蛋白係選自抗PD1蛋白及抗CTLA4蛋白。
  13. 如請求項11之溶瘤病毒，其中該異源聚核苷酸於UL3與UL4開放閱讀框之間插入該重組體HSV基因體。
  14. 如請求項1至3及6至10中任一項之溶瘤病毒，其進一步包含內部接頭區中ICP0、ICP34.5、LAT及ICP4基因之每一者之一個複本的缺失。
  15. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至14中任一項之溶瘤病毒。
  16. 一種病毒液(viral stock)，其包含如請求項1至14中任一項之溶瘤病毒。
  17. 一種組合物，其包含如請求項1至14中任一項之溶瘤病毒及醫藥上可接受之載劑。
  18. 一種如請求項1至14中任一項之溶瘤病毒或其組合物之用途，其用於製造用於殺死癌細胞之藥劑，其中在足以讓該溶瘤病毒在該癌細胞內感染及複製之條件下，將該癌細胞暴露於該溶瘤病毒或其組合物，且其中該溶瘤病毒在該癌細胞內之複製引起細胞死亡。
  19. 如請求項18之用途，其中癌細胞中可以結合至一或多個腫瘤抑制性miR-靶序列之腫瘤抑制性miR之表現比非癌細胞中該腫瘤抑制性miR之表現降低。
  20. 如請求項19之用途，其中該癌細胞中該腫瘤抑制性miR之表現程度比該非癌細胞中該腫瘤抑制性miR之表現程度小至少5%。
  21. 如請求項18至20中任一項之用途，其中在可以結合至該一或多個腫瘤抑制性miR-靶序列之該腫瘤抑制性miR之表現降低之癌細胞中，該溶瘤病毒之複製增加或維持。
  22. 如請求項21之用途，其中癌細胞中之病毒複製比非癌細胞中之病毒 複製大至少5%。
  23. 如請求項18至20中任一項之用途，其中該細胞係在活體內。
  24. 如請求項23之用途，其中該細胞係在腫瘤內。
  25. 一種如請求項1至14中任一項之溶瘤病毒或其組合物之用途，其用於製造用於治療有需要之個體之癌症的藥劑。
  26. 如請求項25之用途，其中該個體係小鼠、大鼠、兔、貓、狗、馬、非人類靈長類動物或人類。
  27. 如請求項25或26之用途，其中該溶瘤病毒或其組合物係經靜脈內、皮下、腫瘤內、肌內或鼻內投與。
  28. 如請求項25之用途，其中該癌症選自肺癌、乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、前列腺癌、睪丸癌、結腸直腸癌、結腸癌、胰臟癌、肝癌、胃癌、頭頸癌、甲狀腺癌、惡性膠質瘤、神經膠母細胞瘤、黑色素瘤、B細胞慢性淋巴球性白血病、瀰漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)及邊緣區淋巴瘤(MZL)。
  29. 如請求項28之用途，其中該肺癌係小細胞肺癌或非小細胞肺癌。
  30. 如請求項28之用途，其中該肝癌係肝細胞癌(HCC)。
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