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TWI788781B - 新型改造t細胞受體及其免疫治療 - Google Patents

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TWI788781B
TWI788781B TW110104935A TW110104935A TWI788781B TW I788781 B TWI788781 B TW I788781B TW 110104935 A TW110104935 A TW 110104935A TW 110104935 A TW110104935 A TW 110104935A TW I788781 B TWI788781 B TW I788781B
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賽巴斯汀 邦克
馬丁 霍夫曼
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Abstract

本發明涉及針對COL6A3抗原的抗原識別構建體。本發明特別提出了對腫瘤表達抗原COL6A3具有選擇性和特異性的新型改造T細胞受體(TCR)分子。本發明的TCR及其衍生的COL6A3抗原結合片段可用於診斷、治療和預防表達COL6A3的癌性疾病。還提出了編碼本發明抗原識別構建體的核酸、包含這些核酸的載體、表達抗原識別構建體的重組細胞以及包含本發明化合物的藥物組合物。

Description

新型改造T細胞受體及其免疫治療
本發明涉及針對COL6A3抗原的抗原識別構建體。本發明特別提出了對腫瘤表達抗原COL6A3具有選擇性和特異性的新型改造T細胞受體(TCR)分子。本發明的TCR及其衍生的COL6A3抗原結合片段可用於診斷、治療和預防表達COL6A3的癌性疾病。還提出了編碼本發明抗原識別構建體的核酸、包含這些核酸的載體、表達抗原識別構建體的重組細胞以及包含本發明化合物的藥物組合物。
膠原蛋白是一種蛋白質超家族，在維持各種組織完整性方面發揮作用。膠原蛋白為細胞外基質蛋白，並具有三螺旋結構域作為其共同的結構元素。膠原蛋白VI是微纖維的主要結構成分。膠原蛋白VI的基本結構單元為α1 (VI)、α2 (VI)和α3 (VI) 膠原鏈的異源三聚體。α1 (VI)和α2 (VI)鏈分別由 COL6A1和COL6A2基因編碼。由COL6A3基因編碼的蛋白質為VI型膠原蛋白（α3 (VI) 膠原鏈）的α3亞基(Bertini et al., 2002 Eur. J. Paediatr. Neurol 6:193-8)。COL6A3基因表達之前被證明與乳腺癌進展相關，並在結腸癌中升高 (Smith MJ, et al.「Analysis of differential gene expression in colorectal cancer and stroma using fluorescence-activated cell sorting purification」 British journal of cancer.2009;100:1452–1464; Tilman G et al 「Human periostin gene expression in normal tissues, tumors and melanoma:evidences for periostin production by both stromal and melanoma cells」 Mol Cancer.2007;6:80)並作為結直腸癌的預後指標 (Qiao J et al.「Stroma derivedCOL6A3is a potential prognosis marker of colorectal carcinoma revealed by quantitative proteomics」 Oncotarget.2015 Oct 6; 6(30):29929–29946).COL6A3基因位於人基因組中2q37的位置，包含44個外顯子。COL6A3蛋白有3177個氨基酸，包含12個血管性假血友病因子A型(vWA)結構域，一個纖連蛋白3型結構域和一個BPTI/Kunitz 絲氨酸蛋白酶抑制劑家族(KU)結構域。
基於T細胞的免疫治療的靶標表示主要組織相容性複合體(MHC)分子呈遞的來源於腫瘤相關蛋白或腫瘤特異性蛋白的肽表位。這些腫瘤相關抗原(TAA)可以是源自所有蛋白類型的肽，如酶、受體、轉錄因子等，它們在相應腫瘤的細胞中被表達，並且與同源未變的細胞相比，其表達通常上調。
細胞免疫反應的特定元素能選擇性地識別和破壞腫瘤細胞。從腫瘤浸潤細胞群或外周血中分離出的腫瘤抗原特異性T細胞表明，這些細胞在癌症的天然免疫防禦中發揮了重要作用。特別是CD8陽性T細胞在這種反應中發揮重要作用，TCD8+ 能識別通常8至10個源自蛋白或位於細胞質的缺損核糖體產物(DRiP)的氨基酸殘基的主要組織相容性複合體(MHC) 所載的肽中所含的I類分子。人MHC分子也稱為人白細胞-抗原(HLA)。
TCR是免疫球蛋白超家族的異二聚體細胞表面蛋白，其與參與介導信號轉導的CD3複合體的不變蛋白質相關。TCR以αβ和γδ異源二聚體形式存在，其結構相似，但解剖位置非常不同，也可能功能也非常不同。天然異二聚體αβTCR的細胞外部分由兩個多肽鏈組成，每個多肽都有一個膜近端恒定結構域和一個膜遠端可變結構域。每個恒定和可變結構域都包括一個鏈內二硫鍵。可變結構域包含與抗體互補決定區(CDR)類似的高度多態性環。使用TCR基因療法可克服目前的一些障礙。它可讓患者自己的T細胞在短時間內具有所需的特異性並產生足夠數量的T細胞，從而避免其耗盡。TCR將被轉導至中央記憶T細胞或具有幹細胞特徵的T細胞中，這可確保轉移時產生更好的持久性和功能。TCR工程化T細胞將透過化學療法或照射被注入淋巴細胞減少的癌症患者，從而獲得有效的植入，但抑制免疫抑制。
雖然在開發用於癌症治療的分子靶向藥物方面取得了進展，但是，本領域仍然需要開發專門靶向作用於癌細胞高度特異性分子的抗癌新藥。本發明說明書透過提出新型改造COL6A3 TCR、各自的重組TCR構建體、核酸、載體和與COL6A3表位特異性結合的公開宿主細胞來滿足此需求；以及使用這些分子治療癌症的方法。
第一方面，本發明的目的透過抗原識別構建體來解決，所述抗原識別構建體包含由根據SEQ ID NO:5 (CDRa1)、6 (CDRa2)和7 (CDRa3)的三個互補決定區(CDR)組成的第一結構域和由根據SEQ ID NO:13 (CDRb1)、14 (CDRb2)和15 (CDRb3)的三個互補決定區(CDR)組成的第二結構域，其中至少一個所述互補決定區被選自以下組的至少一個序列取代：a)SEQ ID NO:26 (CDRa1-mut1)和SEQ ID NO:37至49（CDRb1-mut1至CDRb1-mut13），優選為SEQ ID NO:40，和b)SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:37至49，優選為SEQ ID NO:40的突變序列，其包含保守氨基酸交換。
另一方面，抗原識別構建體的CDRa1可能與根據SEQ ID NO: 5的氨基酸序列具有至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
另一方面，抗原識別構建體的CDRa2可能與根據SEQ ID NO: 6的氨基酸序列具有至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
另一方面，抗原識別構建體的CDRa3可能與根據SEQ ID NO: 7的氨基酸序列具有至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
另一方面，抗原識別構建體的CDRb1可能與根據SEQ ID NO: 13的氨基酸序列具有至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
另一方面，抗原識別構建體的CDRb2可能與根據SEQ ID NO:14的氨基酸序列具有至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
另一方面，抗原識別構建體的CDRb3可能與根據SEQ ID NO:15的氨基酸序列具有至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%的同一性。
在本發明的背景下，發明人已發現改良的COL6A3 TCR R4P3F9的改造形式，其包含改善親本R4P3F9穩定性、識別和選擇性的α和β鏈中的突變CDR1序列。在兩步法中選擇這些成熟的TCR變體，其中一步選擇變體的穩定性、第二步選擇變體的親和力（參見實施例）。雖然本發明的TCR包含突變的CDR1區域，但CDR2和/或CDR3也可能發生突變，以增加結合親和力/特異性和/或選擇性，在理想情況下，現有構建體中可能包括此類突變的CDR。
親和力成熟鑒定了對HLA-A*02/COL6A3-肽具有顯著更強結合活性的變體，同時保留或甚至改善特異性。與親本TCRC-1（包含野生型CDR的R4P3F9 TCR，參見表5）相比，本發明的所有變體改善了IFN-γ釋放，針對較低肽負載濃度已經達到了較高水準。
在可變結構域內，CDR1和CDR2位於多肽鏈的可變(V)區域，CDR3包括一部分V區域、全部多樣性(D)區域和連接(J)區域。假設CDR3是最可變的，是負責特異性和選擇性識別抗原的主要CDR。令人驚訝的是，對於一些TCR，CDR1似乎也與肽接觸，因此也負責選擇性識別。在本發明的情況下，若不受特定理論約束，突變的CDR1b似乎與COL6A3-肽的第8位相互作用。
天然α-β異二聚體TCR具有α鏈和β鏈。每個α鏈都包括可變、連接和恒定區域，β鏈通常還包括可變區和連接區之間的短多樣性區域，但是該多樣性區域常被視為連接區域的一部分。每個可變區都包括嵌入在框架序列中的三個CDR（互補決定區），其中一個是稱為CDR3的高度可變區。存在幾種類型的α鏈可變(Vα)區和幾種類型的β鏈可變(Vβ)區，由其框架、CDR1和CDR2序列及部分定義的CDR3序列區分。Vα類型透過唯一的TRAV 號在IMGT命名中提及，Vβ類型透過唯一的TRBV 號被提及。
優選情況是，本發明的抗原識別構建體包含本文公開的本發明的單個改造TCR可變區的各CDR1至CDR3。優選的是本發明的抗原識別構建體(如，αβ和γδ TCR)包含至少一個，優選的兩個成熟的(maturated) CDR1序列。
如果沒有其他說明，文中公開的CDR變體，特別是CDR1變體，可以透過在肽鏈內的不同位點（可能是選擇性位點）替換一個或多個殘基來進行修飾。此取代是保守性的，其中一個氨基酸被具有類似結構和特點的另一個氨基酸所取代，比如其中一個疏水性氨基酸被另一個疏水性氨基酸取代。更保守的取代是具有相同或類似的大小和化學性質的氨基酸間的取代，例如，亮氨酸被異亮氨酸取代。在天然同源蛋白質家族序列變異的研究中，某些氨基酸的取代往往比其他氨基酸更具有耐受性，這些氨基酸往往表現出與原氨基酸的大小、電荷、極性和疏水性之間的相似性相關，這是確定「保守取代」的基礎。在本文中，優選保守取代定義為在以下五種基團之一的內部進行交換：基團1 — 小脂肪族、非極性或略具極性的殘基(Ala, Ser, Thr, Pro, Gly)；基團2 — 極性、帶負電荷的殘基及其醯胺 (Asp, Asn, Glu, Gln)；基團3 — 極性、帶正電荷的殘基(His, Arg, Lys)；基團4 — 大脂肪族非極性殘基(Met, Leu, Ile, Val, Cys)以及基團5 — 大芳香殘基(Phe, Tyr, Trp)。
較不保守的取代可能涉及一個氨基酸被另一個具有類似特點但在大小上有所不同的氨基酸所取代，如：丙氨酸被異亮氨酸殘基取代。
本文所用術語「特異性」或「抗原特異性」或「特異性針對」給定抗原系指當所述抗原為HLA，優選為HLA A2呈遞時，抗原識別構建體可與所述抗原特異性結合，優選為COL6A3抗原，更優選為具有高親合力的抗原。例如，作為抗原識別構建體的TCR可視為對COL6A3抗原具有「抗原特異性」，條件是在與使用低濃度COL6A3抗原，例如下文提出的COL6A3表位（例如，約 10-11 mol/l、10-10 mol/l、10-9 mol/l、10-8 mol/l、10-7 mol/l、10-6 mol/l、10-5 mol/l）脈衝處理的HLA A2 靶細胞共培養時，表達TCR對呈遞HLA的COL6A3作出反應的T細胞分泌至少約 200pg/ml或以上（例如，250pg/ml或以上、300pg/ml或以上、400pg/ml或以上、500pg/ml或以上、600pg/ml或以上、700pg/ml或以上、1000pg/ml或以上、2,000 pg/ml或以上、2,500 pg/ml或以上、5,000 pg/ml或以上）的干擾素γ (IFN-γ)。替代或附加情況是，如果表達TCR的T細胞在與低濃度COL6A3抗原脈衝的靶細胞共培養時分泌至少兩倍於IFN-γ 未轉染背景水準的IFN-γ，則認為TCR對COL6A3具有「抗原特異性」。如上所述的這種「特異性」可用ELISA 進行分析。
在本發明的一個替代或附加實施方案中，抗原識別構建體穩定並可特異性地和/或選擇性地與COL6A3抗原結合；優選其中COL6A3抗原為具有SEQ ID NO: 1 所示氨基酸序列的蛋白質表位或肽或其變體，其中所述變體氨基酸缺失、添加、插入或取代不超過三個、優選為兩個、最優選為不超過一個氨基酸位置。
術語「選擇性」或「選擇性識別/結合」被理解為是指抗原識別構建體（如TCR或抗體）的性質，選擇性地識別或結合至優選僅一個特異性表位，優選為與另一個表位沒有或基本上沒有交叉反應。優選情況為，術語「選擇性」或「選擇性識別/結合」是指抗原識別構建體（例如TCR）選擇性地識別或結合優選僅一個特異性表位，且優選為與另一個表位沒有或基本上沒有交叉反應，其中所述表位對於一種蛋白質是獨特的，使得抗原識別構建體對另一種表位和另一種蛋白質沒有或基本上沒有交叉反應性。
根據本發明的抗原識別構建體優選為選自抗體或其衍生物或片段、雙特異性分子或T細胞受體(TCR)或其衍生物或片段。本發明的抗體或TCR的衍生物或片段應優選為可保留母體分子的抗原結合/識別能力，特別是其如上所述的特異性和/或選擇性。
在本發明的一實施方案中，本發明改造的TCR能夠以主要組織相容性複合體(MHC) I類依賴性方式識別COL6A3抗原。本文使用的「MHC I類依賴性方式」系指在MHC I類分子的背景中在結合COL6A3肽抗原時TCR引起免疫應答。MHC I類分子可以是本領域已知的任何 MHC I類分子，例如HLA-A分子。在本發明的一項優先實施方案中，MHC I類分子為HLA-A2分子。
本發明提供單鏈抗原識別構建體和雙鏈識別構建體以及其他變異分子。本發明特別提出一種作為抗原識別構建體或其片段或衍生物的改造 TCR。改造TCR優選為來源於人，其被理解為由人TCR基因座產生，因此包含人TCR序列。此外，本發明TCR的特徵在於親和力成熟的TCR，其能夠特異性地和選擇性地識別COL6A3肽抗原。
本發明的另一項實施方案另外提供上述抗原識別構建體，其誘導免疫應答，優選為其中免疫應答的特徵在於干擾素(IFN) γ水準增加。
本發明的TCR可以為單鏈α或β，或γ和δ分子，或為由 α和β鏈或γ和δ鏈兩者組成的雙鏈構建體。
最優選地，在一些附加的實施方案中，其中本披露是指包含本文公開的改造TCR鏈的任何一個、兩個或全部 CDR1至CDR3區的抗原識別構建體（參見表1）。抗原識別構建體可能為優選，其包含天然或改造的CDR序列，其具有三個、兩個、優選為僅一個修飾的氨基酸殘基。修飾的氨基酸殘基可能選自氨基酸插入、缺失或取代基。最為優先的情況是三個、兩個、優選為一個修飾的氨基酸殘基為相應CDR序列的第一個或最後一個氨基酸殘基。如果修飾是取代，則在一些實施方案中優選取代為保守的氨基酸取代。
本發明的TCR可以進一步包含源自任何合適物種的恒定區，如任何哺乳動物，例如：人、大鼠、猴、兔、驢或小鼠。在本發明的一項實施方案中，本發明的TCR進一步包含人恒定區。在一些優選實施方案中，本發明TCR的恒定區可例如透過引入異源序列、優選為小鼠序列來稍加修飾，這可能增加TCR的表達和穩定性。此外，可以引入現有技術中已知的進一步穩定化突變（例如DE 10 2016 123 893.7），例如，替換 V區中的不利氨基酸和/或在TCRC結構域之間引入二硫鍵以及去除不配對的半胱氨酸。
本文所用的術語「鼠」或「人」在提及抗原識別構建體或TCR時，或本文所述的TCR的任何組分（例如，互補性決定區(CDR)、可變區、恒定區，α鏈和/或β鏈）是指分別源自小鼠或人未經排列的TCR基因座的TCR（或其組分）。
在本發明的一項實施方案中，提供了嵌合TCR，其中所述TCR鏈包含來自多物種的序列。優選情況為，本發明的TCR可包含α鏈，其包含α鏈的人可變區和例如鼠 TCRα鏈的鼠恒定區。
在一項實施方案中，本發明的TCR是由根據上述實施方案的人可變區和人恒定區組成的人TCR。
本發明的TCR可能為單鏈TCR(scTCR)。scTCR可包含第一TCR鏈（例如，α鏈）的可變區的多肽和整個（全長）第二TCR鏈（例如，β鏈）的多肽，反之亦然。此外，scTCR可以任選地包含一個或多個將兩個或多個多肽連接在一起的接頭。例如，接頭可以是肽，其將兩個單鏈連接在一起，如本文所述。還提供了本發明的scTCR，其與人細胞因子如IL-2、IL-7或IL-15融合。
本發明的抗原識別構建體還可能以包含至少兩個scTCR分子的多聚複合體形式提供，其中所述scTCR分子各自與至少一種生物素部分融合，並且其中所述scTCR 透過生物素-鏈黴親和素相互作用相互連接，以形成所述多聚體複合體。用於產生多聚體TCR的類似方法也是可能的並且包括在本披露資料中。還提出了更高級的多聚體複合體，其包含本發明兩種以上的scTCR。
為了本發明的目的，TCR是具有至少一個TCRα或γ和/或TCRβ或δ可變結構域的部分。通常他們包括TCRα可變結構域和TCRβ可變結構域。他們可能為αβ異源二聚體，也可能為單鏈形式。為了用於過繼療法，αβ異二聚體TCR可能例如被轉染為具有細胞質和跨膜結構域的全長鏈。如果需要，相應恒定結構域殘基之間可能存在引入的二硫鍵。
在一項優選的實施方案中，抗原識別構建體為人TCR或其片段或衍生物。人TCR或其片段或衍生物是一種 TCR，其包含超過50%的相應人TCR序列。優選情況為，只有少部分TCR序列為人工來源或源自其他物種。然而，眾所周知，例如，人源的嵌合TCR在恒定結構域含有鼠源序列是有利的。因此，特別優選的是根據本發明的TCR，其在其恒定結構域的細胞外部分含有鼠序列。
因此，又為優選的是本發明的抗原識別構建體能夠以人白細胞抗原(HLA)依賴性方式、優選以HLA-A02依賴性方式識別其肽抗原。在本發明的上下文中，術語「HLA依賴性方式」系指抗原識別構建體僅在抗原肽由所述HLA呈遞的情況下才與抗原結合。
在一項實施方案中，根據本發明的抗原識別構建體優選為誘導免疫應答，優選為其中免疫應答的特徵在於干擾素(IFN) γ水準增加。
如本文所用的術語「多肽」包括寡肽，系指透過一個或多個肽鍵連接的單鏈氨基酸。關於本發明的多肽，功能部分可以是包含TCR（或其功能變體）連續氨基酸的任何部分，其中部分條件是功能部分與COL6A3抗原特異性結合，優選為如表1中所公開的。當使用與TCR（或其功能變體）相關時，術語「功能部分」系指本發明TCR（或其功能變體）的任何部分或片段，其中該部分或片段保留 TCR（或其功能變體）的生物活性，其為母體TCR或其親代功能變體的一部分。功能部分包括，例如，保留與COL6A3抗原特異性結合的能力（以HLA依賴性方式）或以與母體TCR（或其功能變體）相似程度、相同程度或更高程度檢測、治療或預防癌症的TCR（或其功能變體）的那些部分。
功能部分可以在該部分的氨基或羧基末端或兩個末端包含額外的氨基酸，其中在母體TCR或其功能變體的氨基酸序列中未發現額外的氨基酸。理想的情況是，額外的氨基酸不干擾功能部分的生物學功能，例如，特異性結合COL6A3抗原；和/或具有檢測癌症、治療或預防癌症等能力。更理想的是，與母體TCR或其功能變體的生物學活性相比，額外的氨基酸增強了生物學活性。
如上所述，本發明TCR的結合功能可能在抗體框架中提供。本文中使用了各種語法形式的術語「抗體」，系指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有抗原結合位點或互補位的分子。此類分子也被稱為免疫球蛋白分子的「抗原結合片段」。本發明還提出了與本文所述的抗原特異性結合的抗體或其抗原結合部分。抗體可以是本領域已知的任何類型的免疫球蛋白。例如，抗體可以是任何同種型免疫球蛋白，例如IgA、IgD、IgE、IgG、IgM等。抗體可以是單克隆或多克隆抗體。抗體可以是天然存在的抗體，例如從哺乳動物（例如，小鼠、兔、山羊、馬、雞、倉鼠、人等）中分離和/或純化的抗體。或者，抗體可以是基因工程化抗體，例如人源化抗體或嵌合抗體。抗體可以是單體或聚合體形式。
本發明還提出了本文所述任何抗體的抗原結合部分。抗原結合部分可以是具有至少一個抗原結合位元點的任何部分，例如Fab、F(ab')2、dsFv、scFv、雙抗體和三抗體。由包含透過合成肽連接到輕鏈抗體的可變(V)結構域的抗體重鏈的V結構域的截短 Fab片段所組成的單鏈可變區片段 (scFv) 抗體片段可使用常規重組 DNA 技術方法產生。類似地，二硫鍵穩定的可變區片段 (dsFv)可以透過重組 DNA 技術製備，但本發明的抗體片段不限於這些示例性類型的抗體片段。此外，抗體或其抗原結合部分可以被修飾為包括可檢測的標記，例如放射性同位素、螢光團（例如，異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)）、酶（例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶）和元素顆粒（例如，金顆粒）。
製備抗體的合適方法是本領域已知的。例如，標準雜交瘤方法描述於例如，Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol, 5, 51 1-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies:A Laboratory Manual, CSH Press (1988), and C.A. Janeway et al.(eds.), Immunobiology, 8 Ed., Garland Publishing, New York, NY (201 1) 一文中。或者，其他方法，例如EBV 雜交瘤方法（Haskard and Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361-67 (1984),和Roder et al, Methods Enzymol, 121, 140-67 (1986)）和噬菌體載體表達系統（參見例如，Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)）都是本領域已知的。此外，在非人動物中產生抗體的方法描述於例如美國專利 5,545,806、5,569,825和5,714,352以及美國專利申請公開號 2002/0197266中。
本發明的一些實施方案也涉及作為可溶性TCR的TCR或其功能片段和多肽。用於本文時，術語可溶性「T細胞受體」系指天然TCR的單鏈或異二聚體截短變體，其至少包含由多肽接頭連接的TCRα鏈和β鏈的可變結構域（SEQ ID NO: 22、24、25和27）。TCR的可溶性變體通常至少缺乏天然蛋白質的跨膜和胞質結構域；有時優選地，此類可溶性構建體不包含任何恒定的結構域序列。在優選的實施方案中，本發明的可溶性T細胞受體構建體包含由本文提供的α和β鏈可變結構域序列組成的構建體，其透過合適的接頭序列連接。可溶性TCRα鏈和β鏈的可變結構域序列（氨基酸或核酸）可以與天然TCR中的相應序列相同，或者與相應的天然TCR序列相比，可以包含可溶性TCRα鏈和β鏈可變結構域序列的變體。本文所用的術語可溶性「T細胞受體」包括具有變體或非變體可溶性TCRα鏈和β鏈可變結構域序列的可溶性 TCR。這些變異可以在可溶性TCRα鏈和β鏈可變結構域序列的框架和/或CDR區中，並且可以包括但不限於氨基酸缺失、插入、取代突變以及不改變氨基酸序列的核酸序列改變。在任何情況下，本發明的可溶性TCR都保留或優先改善其親本TCR分子的結合功能。
上述問題透過編碼本發明抗原識別構建體的核酸或任何上述蛋白質或多肽構建體得以進一步解決。核酸優選為(a)具有編碼根據本發明的抗原識別構建體的鏈；(b)具有與(a)中的鏈互補的鏈；或(c)具有在嚴格條件下與如(a)或(b) 所述的分子雜交的鏈。嚴格條件是本領域技術人員已知的，具體來自 Sambrook等人的「Molecular Cloning」一文。除此之外，核酸任選具有進一步的序列，其是表達對應於蛋白質的核酸序列所必需的，特別是用於在哺乳動物/人細胞中表達。使用的核酸可包含於適於允許在細胞中表達對應於該多肽的核酸序列的載體中。然而，核酸也可用於轉化抗原呈遞細胞，其可能不限於經典的抗原呈遞細胞，例如樹突狀細胞，這樣，使得他們本身在其細胞表面上產生相應的蛋白質。
本文所用的「核酸」包括「多核苷酸」、「寡核苷酸」和「核酸分子」，通常是指可以為單鏈或雙鏈、合成或從自然資源中獲得（例如，分離和/或純化）的DNA或RNA 聚合物，其可含有天然、非天然的或改變的核苷酸，並且可含有天然、非天然的或改變的核苷酸間連接子，例如氨基磷酸酯連接子或磷硫代磷酸酯連接子，而非未修飾寡核苷酸的核苷酸之間的磷酸二酯。
優選地，本發明的核酸為重組核酸。本文所用的術語「重組」系指 (i) 透過將天然或合成核酸區段連接到可在活細胞中複製的核酸分子而構建在活細胞外部的分子，或(ii) 從複製上述(i)中所述內容而產生的分子。為了本文的目的，複製可以是體外複製，也可以是體內複製。核酸可包含編碼本文所述的任何 TCR、多肽或蛋白質或功能部分或其功能變體的任何核苷酸序列。
此外，本發明提出了包含如上所述的本發明核酸的載體。理想情況是，載體為表達載體或重組表達載體。術語「重組表達載體」在本發明背景下系指允許在合適宿主細胞中表達mRNA、蛋白質或多肽的核酸構建體。本發明的重組表達載體可以是任何合適的重組表達載體，並可用於轉化或轉染任何合適的宿主。合適的載體包括設計用於繁殖和擴增或用於表達或兩者兼有的載體，例如質粒和病毒。動物表達載體的實例包括 pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo。優選地，重組表達載體為病毒載體，例如，逆轉錄病毒載體。重組表達載體包括調節序列，例如轉錄和翻譯起始和終止密碼子，其特異於宿主細胞（例如，細菌、真菌、植物或動物）的類型，其中載體將被引入其中並且在其中可以進行本發明核酸的表達。此外，本發明的載體可能包括一個或多個標誌物基因，其允許選擇轉化或轉染的宿主。重組表達載體可包含與編碼本發明構建體的核苷酸序列或者與編碼本發明構建體的核苷酸序列互補或雜交的核苷酸序列在操作上可連接的天然或規範性啟動子。啟動子的選擇包括例如強、弱、誘導型、組織特異性和開發特異性啟動子。啟動子可以是非病毒啟動子，也可以是病毒啟動子。本發明的重組表達載體可以被設計用於暫態表達、穩定表達或兩者的表達。此外，重組表達載體可以用於組成型表達或誘導型表達。
本發明還涉及包含根據本發明的抗原識別構建體的宿主細胞。具體地，本發明的宿主細胞包含如上所述的核酸或載體。宿主細胞可以是真核細胞，例如植物、動物、真菌或藻類，也可以是原核細胞，例如細菌或原生動物。宿主細胞可以是培養細胞或原代細胞，即直接從生物體（例如人）分離。宿主細胞可以是貼壁細胞或懸浮細胞（即，在懸浮液中生長的細胞）。為了產生重組TCR、多肽或蛋白質的目的，宿主細胞優選為哺乳動物細胞，例如中國倉鼠卵巢 (CHO)細胞。最優選地，宿主細胞為人細胞。雖然宿主細胞可以是任何細胞類型，可以來自任何類型的組織，可以是任何發育階段的細胞，但是宿主細胞優選為外周血白細胞 (PBL)或外周血單核細胞 (PBMC)。更優選地，宿主細胞為T細胞。T細胞可以是任何T細胞，諸如培養的T細胞，例如，原代T細胞或來自培養T細胞系的T細胞，例如Jurkat、SupT1等，或獲得自哺乳動物的T細胞，優選為來自人類患者的T細胞或T細胞前體。如果獲得自哺乳動物，T細胞可從許多來源獲得，包括但不限於血液、骨髓、淋巴結、胸腺或其他組織或液體。T細胞還可以是富集或純化的。優選地，T細胞為人T細胞。更優選地，T細胞是分離自人的T細胞。T細胞可以是任何類型的T細胞並且可以是任何發育階段的，包括但不限於CD4陽性和/或CD8陽性、CD4陽性輔助T細胞，例如，Th1和Th2細胞、CD8-陽性T細胞（例如，細胞毒性T細胞）、腫瘤浸潤細胞 (TIL)、記憶T細胞、幼稚T細胞等。優選地，T細胞為CD8陽性T細胞或CD4陽性T細胞。
優選地，本發明的宿主細胞為淋巴細胞，優選為T 淋巴細胞，例如CD4陽性或CD8陽性T細胞。宿主細胞更優選為對表達COL6A3的腫瘤細胞特異性的腫瘤反應性T細胞。
本發明的另一方面涉及本文公開的用於藥物中的抗原識別構建體、核酸、載體、藥物組合物和/或宿主細胞。在一項優選實施方案中在藥物中的用途包括在診斷、預防和/或治療諸如惡性或良性腫瘤疾病等腫瘤疾病中的用途。腫瘤疾病為，例如，在所述腫瘤疾病的癌細胞或腫瘤細胞中以表達COL6A3為特徵的腫瘤疾病。
關於抗原識別構建體及其衍生其他材料的上述醫療用途，待治療和/或診斷的癌症可以為任何癌症，包括以下癌症中任一種：急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡狀橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞癌、結腸癌、食管癌、宮頸癌、胃腸類癌、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、下嚥癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、腹膜癌、網膜癌、腸系膜癌、咽癌、攝護腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌和膀胱癌。優選的癌症為宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、肛門直腸癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。特別優選的癌症為COL6A3陽性癌症，包括胃腸癌和胃癌。
本發明的構建體、蛋白質、TCR、抗體、多肽和核酸特別用於免疫治療，優選用於過繼性T細胞治療。本發明化合物的給藥可以，例如，涉及將本發明的T細胞輸注入所述患者體內。優選地，此類T細胞為患者的自體T細胞，並且用本發明的核酸或抗原識別構建體在體外轉導。
WO 2016/011210 公開了用於過繼療法的工程細胞，包括 NK細胞和T細胞以及含有所述細胞的組合物及其受試者給藥方法。所述細胞可以含有特異性結合抗原的基因工程化抗原受體，例如，嵌合抗原受體(CAR)和共刺激受體。
本發明的目的還透過製備表達細胞系的COL6A3特異性抗原識別構建體的方法來解決，包括 a. 提出合適的宿主細胞， b. 提出一種基因構建體，其包含編碼根據請求項 1至4中任一項所述的抗原識別構建體的編碼序列， c. 將所述基因構建體引入所述合適的宿主細胞，和 d. 由所述合適的宿主細胞表達所述基因構建體。
所述方法可能進一步包括在所述合適宿主細胞上進行細胞表面呈遞所述抗原識別構建體的步驟。
在其他優選的實施方案中，所述基因構建體是包含與所述編碼序列可操作地連接的啟動子序列的表達構建體。
優選地，所述抗原識別構建體來源於哺乳動物，優選來源於人。用於本發明方法的優選合適宿主細胞為哺乳動物細胞，諸如人細胞，特別是人T 淋巴細胞。用於本發明的T細胞在上文中進行了詳細描述。
本發明還包括實施方案，其中所述抗原識別構建體為修飾的TCR，其中所述修飾是加入功能結構域，諸如標記物或治療活性物質。此外，包括具有可選結構域的TCR，諸如可選膜錨定結構域而不是內源性跨膜區。
理想情況是，用於將基因構建體引入所述合適宿主細胞的轉染系統為逆轉錄病毒載體系統。此類系統是本領域技術人員所熟知的。
本發明還包括在一項實施方案中，從細胞中分離和純化抗原識別構建體的另外的方法步驟，以及任選地在T細胞中重構經翻譯的抗原識別構建體片段。
本發明的另一方面提出了透過產生T細胞受體(TCR)的方法獲得的或可獲得的T細胞，其中T細胞受體(TCR) 對於腫瘤細胞具有特異性並且具有如上所述的高親合力。此類T細胞取決於本發明方法中使用的宿主細胞，例如人或非人T細胞，優選為人TCR。
本發明的TCR、多肽、蛋白質（包括其功能變體）、核酸、重組表達載體、宿主細胞（包括其群體）和抗體（包括其抗原結合部分）可以進行分離和/或純化。本文所用的術語「分離」系指已經從其自然環境中去除。本文所用的術語「純化」系指純度增加，其中「純度」為一個相對術語，並不一定要解釋為絕對純度。例如，純度可以為至少約 50%，可以大於60%、70%、80%、90%、95%，也可以為100%。
本發明的抗原識別構建體、TCR、多肽、蛋白質（包括其功能變體）、核酸、重組表達載體、宿主細胞（包括其群體）和抗體（包括其抗原結合部分）以下統稱為「本發明的TCR材料」，可以配製成組合物，諸如藥物組合物。就此而言，本發明提出了一種藥物組合物，其包含本文所述的任意抗原識別構建體、TCR、多肽、蛋白質、功能部分、功能變體、核酸、表達載體、宿主細胞（包括其群體）和抗體（包括其抗原結合部分）以及藥用載體、賦形劑和/或穩定劑。含有任何本發明TCR材料的本發明藥物組合物可包含多於一種本發明的TCR材料，例如，多肽和核酸，或兩種或更多種不同的TCR（包括功能部分及其功能變體）。或者，藥物組合物可包含與另一種藥物活性劑或藥物組合的本發明TCR材料，諸如，化學治療劑，例如，天冬醯胺酶、白消安、卡鉑、順鉑、柔紅黴素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔單抗、長春花堿、長春新堿等。優選地，載體為藥用載體。關於藥物組合物，載體可以是常規用於所考慮的本發明的特定TCR材料的任意載體。這些藥用載體是本領域技術人員所熟知的，並且是公眾容易獲得的。優選情況是，藥用載體是在使用條件下無有害副作用或毒性的一種載體。
因此，本還提出了一種藥物組合物，其包含本文所述的本發明的任何產品和本發明的任何TCR材料，特別是任何蛋白質、核酸或宿主細胞。在一項優選的實施方案中，藥物組合物用於免疫治療，優選為繼代細胞治療。
優選地，本發明的TCR材料透過注射施用，如，靜脈內施用。當本發明的TCR材料為表達本發明TCR（或其功能變體）的宿主細胞時，用於注射的細胞藥用載體可能包括任何等滲載體，例如，生理鹽水（水中含有約 0.90%w/v的NaCl、水中含有約 300mOsm/L NaCl、或每升水中含有約 9.0g NaCl）、NORMOSOL R 電解質溶液 (Abbott, Chicago, IL)、PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL)、水中含約 5% 葡萄糖或林格氏乳酸鹽。在一項實施方案中，藥用載體用人血清白蛋白補充。
為了本發明的目的，施用本發明TCR材料的數量或劑量（例如，當本發明TCR材料為一個或多個細胞時的細胞數量）可能在合理時間框架內在受試者或動物中足以影響治療或預防反應。例如，本發明TCR材料的劑量應該自施用起約 2個小時或更長時間（例如，12至24 小時）或更多小時的期間內與癌症抗原結合或檢測、治療或預防癌症。在某些實施方案中，時間可能更長。劑量將由本發明特定TCR材料的療效和動物（例如，人）的狀況以及待治療動物（例如，人）的體重決定。
預期本發明的藥物組合物、TCR（包括其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞或細胞群可用於癌症或COL6A3陽性癌前病變的治療或預防方法。本發明的TCR（及其功能變體）被認為可與COL6A3抗原特異性結合，使得 TCR（或本發明相關多肽或蛋白質及其功能變體）由細胞表達時能夠介導針對表達本發明COL6A3抗原的靶細胞。就此而言，本發明提出了哺乳動物中病症（特別是癌症）的治療或預防方法，包括向哺乳動物施用任何藥物組合物、抗原識別構建體，特別是TCR（及其功能變體）、多肽或本文所述的蛋白質、任何核酸或重組表達載體，其包含編碼本文所述的任何 TCR（及其功能變體）、多肽、蛋白質的核苷酸序列或包含重組載體的任何宿主細胞或細胞群，該重組載體編碼本文所述的本發明的任何構建體（及其功能變體）、多肽或蛋白質，用量為有效治療或預防哺乳動物中病症的量，其中所述病症為癌症，優選為COL6A3陽性癌症。
可用於本發明的藥用載體或稀釋劑的實例包括諸如SPGA、碳水化合物（例如，山梨糖醇、甘露糖醇、澱粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）等穩定劑，諸如白蛋白或酪蛋白等蛋白質，諸如牛血清或脫脂牛奶和緩衝液（例如，磷酸鹽緩衝液）等含蛋白製劑。
本文中所用的術語「治療」和「預防」以及源自這些術語的詞語並不一定意味著 100%或完全治療或預防。相反，存在不同程度的治療或預防，而本領域普通技術人員認識到具有潛在的益處或治療效果。就此而言，本發明的方法可為哺乳動物的病症提供任何治療或預防水準的任意量。此外，本發明方法提出的治療或預防可包括待治療或預防病症（例如，癌症）的一種或多種病症或症狀的治療或預防。例如，治療或預防可以包括促進腫瘤消退。此外，為了本文之目的，「預防」可以包括推遲疾病或其症狀或病症的發作。
本發明還涉及一種治療癌症的方法，其包括與至少一種化學治療劑和/或放射治療組合施用本說明書的TCR、核酸或宿主細胞。
還提出了一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括： a)       從所述受試者中分離細胞； b)       用編碼本發明的抗原識別構建體的至少一種載體轉化細胞以產生轉化的細胞； c)       擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和 d)       將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。
還提出了一種在有需要的受試者中治療癌症的方法，包括： a)       從健康供體中分離細胞； b)       用編碼本發明的抗原識別構建體的一種載體轉化細胞以產生轉化的細胞； c)       擴增轉化細胞以產生多個轉化細胞；和 d)       將所述多個轉化細胞施用於所述受試者。
還提出了一種檢測生物樣本中癌症的方法，包括： a)       使生物樣本與本說明書的抗原識別構建體接觸； b)       檢測抗原識別構建體與生物樣本的結合情況。
在一些實施方案中，檢測癌症的方法在體外、體內或原位進行。
還提出了檢測哺乳動物中有無病症的方法。該方法包括 (i)將包含哺乳動物一種或多種細胞的樣本接觸本發明的任何 TCR（及其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群、抗體或其抗原結合部分或本文所述的藥物組合物，從而形成複合體，並 (ii)包括檢測複合體，其中所述複合體的檢測提示哺乳動物中是否存在病症，其中所述病症為癌症，諸如COL6A3陽性惡性疾病。
關於檢測哺乳動物疾病的本發明方法，細胞樣本可以是包含全細胞、其裂解物或全部細胞裂解物的一部分的樣本，例如核或細胞質級分、全蛋白質級分或核酸級分。
為了本發明的檢測方法之目的，所述接觸可以在哺乳動物體外或體內進行。優選情況是，接觸在體外進行。
此外，複合體的檢測可以透過本領域已知的任何方式進行。例如，本文所述的本發明抗原識別構建體（及其功能變體）、多肽、蛋白質、核酸、重組表達載體、宿主細胞、細胞群或抗體或TCR或其抗原結合部分可以用檢測到的標記（諸如，放射性同位素、螢光團（例如，異硫氰酸螢光素(FITC)、藻紅蛋白(PE)）、酶（例如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶）和元素顆粒（例如，金顆粒）進行標記。
為了本發明方法之目的，其中施用宿主細胞或細胞群，所述細胞可以是與哺乳動物同種異體或自體的細胞。優選情況是，細胞為哺乳動物自體細胞。
關於本發明TCR材料的上述醫療用途，待治療和/或診斷的癌症可以為任何癌症，包括以下癌症中任一種：急性淋巴細胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡狀橫紋肌肉瘤、骨癌、腦癌、乳腺癌、肛門癌、肛管癌或肛門直腸癌、眼癌、肝內膽管癌、關節癌、頸癌、膽囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、口腔癌、陰道癌、外陰癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞癌、結腸癌、食管癌、宮頸癌、胃腸類癌、神經膠質瘤、霍奇金淋巴瘤、下嚥癌、腎癌、喉癌、肝癌、肺癌、惡性間皮瘤、黑色素瘤、多發性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、口咽癌、卵巢癌、陰莖癌、胰腺癌、腹膜癌、網膜癌、腸系膜癌、咽癌、攝護腺癌、直腸癌、腎癌、皮膚癌、小腸癌、軟組織癌、胃癌、睾丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、輸尿管癌和膀胱癌。優選的癌症為宮頸癌、口咽癌、肛門癌、肛管癌、肛門直腸癌、陰道癌、外陰癌或陰莖癌。特別優選的癌症為COL6A3陽性癌症，例如，胃腸癌或胃癌。
總體上，本發明提出了患有腫瘤或腫瘤疾病的受試者的治療方法，其包括施用本發明公開的抗原識別構建體、核酸、載體、藥物組合物和/或宿主細胞。優選地，所述受試者為需要這種治療的受試者。優選實施方案中的受試者為患有COL6A3陽性的腫瘤或腫瘤疾病的哺乳動物受試者，優選為人類患者。
表1：本發明的肽序列（位置根據IMGT編號： （François Ehrenmann、Patrice Duroux、Chantal Ginestoux；蛋白展示：人（智人）TRAV；IMGT 庫。IMGT®，國際 ImMunoGenetics 資訊系統® http://www.imgt.org.；創建時間：2011 年 3 月 16 日。版本：2016 年 6月 3 日；François Ehrenmann、Patrice Duroux、Chantal Ginestoux；蛋白展示：人（智人）TRBV；IMGT 庫。IMGT®，國際 ImMunoGenetics 資訊系統® http://www.imgt.org.；創建時間： 2011 年 3 月 16 日。版本： 2016 年 6月 3 日。）
SEQ ID NO: 名稱 描述 序列
1 COL6A3-002   FLLDGSANV
2 R4P3F9 α R4P3F9TCRα鏈– 全長 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
3 R4P3F9 α 前導 R4P3F9TCRα鏈– 前導肽 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQ
4 R4P3F9 α可變 R4P3F9TCRα鏈–可變結構域 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIP
5 R4P3F9 CDRa1 R4P3F9TCRα鏈– CDR1 DRGSQS
6 R4P3F9 CDRa2 R4P3F9TCRα鏈– CDR2 IYSNGD
7 R4P3F9 CDRa3 R4P3F9TCRα鏈– CDR3 CAAYSGAGSYQLT
8 R4P3F9 – α 恒定 R4P3F9TCRα鏈– 恒定結構域 NIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
9 R4P3F9 – α 恒定開始 R4P3F9TCRα鏈– 恒定結構域開始 NIQN
10 R4P3F9 β R4P3F9TCRβ鏈– 全長 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
11 R4P3F9 β 前導 R4P3F9TCRβ鏈– 前導肽 MGFRLLCCVAFCLLGAGPV
12 R4P3F9 β可變 R4P3F9TCRβ鏈–可變結構域 DSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVV
13 R4P3F9 CDRb1 R4P3F9TCRβ鏈– CDR1 RSGDLS
14 R4P3F9 CDRb2 R4P3F9TCRβ鏈– CDR2 YYNGEE
15 R4P3F9 CDRb3 R4P3F9TCRβ鏈– CDR3 CASSVESSYGYT
16 R4P3F9 β 恒定 R4P3F9TCRβ鏈– 恒定結構域 EDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
17 R4P3F9 – β 恒定開始 1 R4P3F9TCRβ鏈– 恒定結構域開始 1 EDLNK
18 R4P3F9 – β 恒定開始 2 R4P3F9TCRβ鏈– 恒定結構域開始 2 EDLKN
19 Aga2p – R4P3F9 Aga2p融合蛋白與scTv R4P3F9和標籤 MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVFGGGGSDYKDDDDKGGGASQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKAAAGGSGGEQKLISEEDL
20 Aga2p 前導序列和Aga2p MQLLRCFSIFSVIASVLAQELTTICEQIPSPTLESTPYSLSTTTILANGKAMQGVFEYYKSVTFVSNCGSHPSTTSKGSPINTQYVF
21 FLAG標記 FLAG標記加接頭 GGGGSDYKDDDDKGGGAS
22 scTv R4P3F9 帶有接頭的R4P3F9的單鏈可變結構域；α可變結構域中的aF55S QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNK
23 Myc標籤 接頭和Myc標籤 AAAGGSGGEQKLISEEDL
24 scTv R4P3F9 – bQ43K 在β可變結構域中具有穩定突變bQ43K的scTv R4P3F9 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNK
25 scTv R4P3F9 – bL72S 在β可變結構域中具有穩定突變bL72S的scTv R4P3F9 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNK
26 CDRa1 突變體1 aG29R 突變 DRRSQS
27 scTv R4P3F9S 穩定形式的scTv R4P3F9 QKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVV
28 AGRN-001 相似肽 ALLDGRVQL
29 CLASP1-001 相似肽 RLLDGAFKL
30 COL6A1-001 相似肽 ILLDGSASV
31 COL6A2-001 相似肽 FLLDGSERL
32 COL6A3-006 相似肽 FLFDGSANLV
33 COL6A3-008 相似肽 FLFDGSANL
34 COL6A3-014 相似肽 FLLDGSEGV
35 VWA2-001 相似肽 FLLDGSNSV
36 VWF-001 相似肽 FLLDGSSRL
37 CDRb1 突變體1 β鏈– CDR1變體1 ARWHNN
38 CDRb1 突變體2 β鏈– CDR1變體2 AKDHLN
39 CDRb1 突變體3 β鏈– CDR1變體3 ARWHRN
40 CDRb1 突變體4 β鏈– CDR1變體4 AMDHPY
41 CDRb1 突變體5 β鏈– CDR1變體5 ATDHYN
42 CDRb1 突變體6 β鏈– CDR1變體6 ARYHTN
43 CDRb1 突變體7 β鏈– CDR1變體7 APYHLN
44 CDRb1 突變體8 β鏈– CDR1變體8 AKDHTN
45 CDRb1 突變體9 β鏈– CDR1變體9 ARYHRN
46 CDRb1 突變體10 β鏈– CDR1變體10 ARWHSN
47 CDRb1 突變體11 β鏈– CDR1變體11 ATDHYN
48 CDRb1 突變體12 β鏈– CDR1變體12 RWGDLN
49 CDRb1 突變體13 β鏈– CDR1變體13 ARDHLN
50 75-1 含有穩定scTv R4P3F9S的Fab 重鏈 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLKN
51 75- Fab 重鏈 Fab 重鏈 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAG
52 75- Fab 輕 鏈 Fab 輕鏈 MKWVTFISLLFLFSSAYSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRLESGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
53 1G4 α 1G4TCRα鏈– 全長 METLLGLLILWLQLQWVSSKQEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHPYIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
54 1G4 α 前導 1G4TCRα鏈– 前導肽 METLLGLLILWLQLQWVSSK
55 1G4 α可變 1G4TCRα鏈–可變結構域 QEVTQIPAALSVPEGENLVLNCSFTDSAIYNLQWFRQDPGKGLTSLLLIQSSQREQTSGRLNASLDKSSGRSTLYIAASQPGDSATYLCAVRPTSGGSYIPTFGRGTSLIVHP
56 1G4 α 恒定 1G4TCRα鏈– 恒定結構域 YIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
57 1G4 β 1G4TCRβ鏈– 全長 MSIGLLCCAALSLLWAGPVNAGVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVLEDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
58 1G4 β 前導 1G4TCRβ鏈– 前導肽 MSIGLLCCAALSLLWAGPVNA
59 1G4 β可變 1G4TCRβ鏈–可變結構域 GVTQTPKFQVLKTGQSMTLQCAQDMNHEYMSWYRQDPGMGLRLIHYSVGAGITDQGEVPNGYNVSRSTTEDFPLRLLSAAPSQTSVYFCASSYVGNTGELFFGEGSRLTVL
60 1G4 β 恒定 β鏈– 恒定結構域 EDLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
61 NYESO1-001 對照肽 SLLMWITQV
62 C-14 β；C-5 β C-14；含有CDRb1 突變體4的C-5TCR全長 β鏈 MGFRLLCCVAFCLLGAGPVDSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPAMDHPYVYWYQQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNILERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
63 C-14 α 含有CDRa1 突變體1的C-14TCR全長 α鏈 MKSLRVLLVILWLQLSWVWSQQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMFIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
64 75-5 含有穩定scTv R4P3F9S和CDRb1 突變體4的Fab 重鏈 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRGSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPAMDHPYVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLKN
65 75-14 含有穩定scTv R4P3F9S、CDRa1 突變體1和CDRb1 突變體4的Fab 重鏈 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPAMDHPYVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLKN
66 75-25 在β/α方向含有穩定scTv R4P3F9S 並含有CDRa1 突變體1的Fab 重鏈 MKWVTFISLLFLFSSAYSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYTMNWVRQAPGKGLEWVALINPYKGVSTYNQKFKDRFTISVDKSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTSPPSPAPPVAGGVTQTPKHLITATGQRVTLRCSPRSGDLSVYWYKQSLDQGLQFLIQYYNGEERAKGNISERFSAQQFPDLHSELNLSSLELGDSALYFCASSVESSYGYTFGSGTRLTVVEDLKNGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQKEVEQNSGPLSVPEGAIASLNCTYSDRRSQSFFWYRQYSGKSPELIMSIYSNGDKEDGRFTAQLNKASQYVSLLIRDSQPSDSATYLCAAYSGAGSYQLTFGKGTKLSVIPNIQN
實施例
與靶向作用於病毒抗原的TCR相比，抗癌抗原的天然T細胞受體(TCR) 通常親和力較低，這可能是腫瘤免疫逃逸的一種可能解釋 (Aleksic et al. 2012)。因此，希望具有更高親和力的TCR變體，其設計用作過繼細胞療法中的抗原識別構建體，或者作為可溶性方法的識別模組，即，使用雙特異性分子(Hickman et al. 2016)。因此，本發明涉及天然存在的T細胞受體R4P3F9（SEQ ID NO: 2和10）的修飾和優化，其靶向作用於親和力為約 60 μM的腫瘤相關肽 COL6A3-002 (SEQ ID NO:1) (DE102016115246)。實施例1 ：穩定scTv 的產生
對於本發明，先前研究的TCR R4P3F9（SEQ ID NO: 2和10）被轉化為單鏈TCR構建體（scTv，SEQ ID NO: 22），透過酵母表面展示以含有各自恒定結構域（SEQ ID NO: 9和17）的附加物和適當的甘氨酸-絲氨酸接頭序列的可變α (SEQ ID NO:4)和β (SEQ ID NO:12)結構域的組合進行成熟。合成相應序列的DNA 並轉化為釀酒酵母 EBY100 (MATa AGA1::GAL1­AGA1::URA3 ura3­52 trp1 leu2­delta200 his3­delta200 pep4::HIS3 prbd1.6R can1 GAL) (ATCC® MYA­ 4941™)與基於pCT302的含有前導序列和Aga2p 酵母交配蛋白(SEQ ID NO:20)的酵母展示載體(Boder et al.2000)。在酵母中同源重組後得到的融合蛋白(SEQ ID NO: 19) 在Aga2p蛋白的N 末端含有前導肽（負責顯示目的蛋白）(Boder et al.1997)、短肽標籤，包括用於表達對照和目的蛋白質的接頭序列（SEQ ID NO: 21和23），即 scTv R4P3F9 (SEQ ID NO: 22)或其變體。如DE102016121899中所述進行轉化，每個文庫產生多達109 個酵母克隆。透過跨越 scTv R4P3F9的完整基因序列的隨機突變PCR方法產生文庫。
具有在HLA-A*02背景下選擇性結合COL6A3-002的最佳表達scTv的酵母克隆的選擇過程基本上如Smith et al 2015中所述進行。為了確定在酵母表面上顯示的scTv R4P3F9變體的高表達和正確構象，抗-Vβ1（Beckman Coulter，克隆BL37.2）抗體與HLA-A*02/COL6A3‑002四聚體一起使用（圖1）。透過酵母表面展示的scTv 轉化揭示了框架區中兩個關鍵穩定突變以及用於在細胞表面上正確呈遞scTv的原始 CDR序列，即 bQ43K (SEQ ID NO: 24)和bL72S (SEQ ID NO:25)，均位於β鏈上。此外，在穩定性成熟期間，α鏈的CDR1中的第29位置 (SEQ ID NO: 5) 從甘氨酸轉化為精氨酸（CDRa1 突變體1，SEQ ID NO: 26），這導致四聚體結合改善。實施例2 ：穩定scTv 的親和力成熟
為了產生對HLA-A*02/COL6A3‑002具有更高結合親和力的scTv分子，使用先前鑒定的表達穩定突變aG29R、bQ43K和bL72S的穩定化scTv R4P3F9S 支架 (SEQ ID NO: 27) 對CDRb1 (SEQ ID NO: 13) 進行簡並。透過使用基本上如前所述的簡並 DNA 寡聚引物隨機化處理 CDRb1 殘基(Smith et al. 2015)。如實施例1中所述轉化所得到的DNA文庫。為了保持scTv結合選擇性，對包含衍生自正常組織的肽（SEQ ID NO: 28至36）的HLA‑A*02四聚體進行陰性選擇，其顯示出與COL6A3-002 肽的高度序列相似性。
為了選擇親和力增強的和選擇性的scTv R4P3F9S變體，每個分選回合使用降低濃度的HLA‑A*02/COL6A3‑002四聚體。在三輪選擇後，分離單個scTv克隆並測序，產生多種親和力成熟的CDRb1序列（SEQ ID NO: 37至49）。對於具有成熟CDRb1序列的scTv，可以證明COL6A3-002結合的強烈改善，同時保留 COL6A3-002結合的選擇性，因為未觀察到 9種類似肽的結合（圖2）。實施例3 ： 雙特異性抗體-scTv 融合蛋白的產生
針對HLA‑A*02/COL6A3‑002的穩定和親和力成熟的scTv可以與針對CD3的抗體部分融合表達，從而允許腫瘤特異性重新靶向作用於和活化T細胞，而與其天然特異性無關。本發明人產生了雙特異性抗體-TCR融合蛋白，其包含與scTv R4P3F9S變體（SEQ ID NO: 50、64、65和66）融合的抗CD3 Fab (UCHT1) 重鏈(SEQ ID NO: 51)和抗CD3 Fab (UCHT1) 輕鏈(SEQ ID NO: 52)。得到的Fab-scTv融合蛋白的分子量約為75 kDa。基於scTvR4P3F9S α（SEQ ID NO: 5和26）和β鏈（SEQ ID NO: 13和37至49）的不同 CDR1序列，不同的Fab-scTv融合變體（75-1至75-25，表2）按照製造商的建議在暫態轉染的ExpiCHO細胞中表達。透過蛋白L和尺寸排阻色譜法純化蛋白質。所有融合變體均可產生，產量範圍為80 μg至 1 mg（表2）並且均勻形成的異二聚體預期大小如透過尺寸排阻色譜法分析的大小（圖3）。
表2：雙特異性 Fab-scTv融合蛋白的命名和產量。分子基於SEQ ID NO 50和52以及指示的CDRa1和CDRb1變體。
變體 CDRa1/SEQ CDRb1/SEQ 產量 [µg]
75-1 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 267.9
75-2 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHNN (SEQ ID NO. 37) 78.4
75-3 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHLN (SEQ ID NO. 38) 646.7
75-4 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHRN (SEQ ID NO. 39) 704.3
75-5 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AMDHPY (SEQ ID NO. 40) 397.2
75-6 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ATDHYN (SEQ ID NO. 41) 268.1
75-7 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARYHTN (SEQ ID NO. 42) 83.2
75-8 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) APYHLN (SEQ ID NO. 43) 765.7
75-9 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHTN (SEQ ID NO. 44) 1067.2
75-10 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 389.6
75-11 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHNN (SEQ ID NO. 37) 270.4
75-12 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHLN (SEQ ID NO. 38) 943.6
75-13 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHRN (SEQ ID NO. 39) 560.3
75-14 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AMDHPY (SEQ ID NO. 40) 360.7
75-15 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 41) 541.5
75-16 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHTN (SEQ ID NO. 42) 403.6
75-17 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) APYHLN (SEQ ID NO. 43) 195.5
75-18 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHTN (SEQ ID NO. 44) 731.3
75-19 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHRN (SEQ ID NO. 45) 794
75-20 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHSN (SEQ ID NO. 46) 85.5
75-21 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 47) 276
75-22 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RWGDLN (SEQ ID NO. 48) 255
75-23 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARDHLN (SEQ ID NO. 49) 217
75-24a DRGSQS (SEQ ID NO: 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 166.6
75-25a DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ ID NO. 13) 267
a scTv的β-α方向實施例4 ：Fab-scTv 融合蛋白與COL6A3-002 和類似肽的結合
透過生物層干涉測量法測量抗CD3-scTv R4P3F9S融合蛋白對具有COL6A3-002或不同類似肽的HLA-A*02 單體的結合親和力。使用製造商推薦的設置在Octet RED384 系統上進行測量。簡而言之，在分析 HLA-A*02/COL6A3-002的系列稀釋液之前，將純化的Fab-scTv分子上樣到生物感測器 (FAB2G) 上。與包含野生型CDRa1和野生型CDRb1的變體75-1和75-24 相比，具有成熟CDRa1和/或CDRb1序列的Fab-scTv變體觀察到結合親和力增加高達40 倍（表3、圖4）。為了評估與HLA-A*02/COL6A3-002結合的選擇性，篩選載入到 FAB2G 生物感測器上的純化Fab-scTv分子與1 μM 相似肽（SEQ ID NO: 28至36）結合，每個都與HLA-A*02複合。除了與大多數含有成熟CDRa1 (SEQ ID NO:26)的Fab-scTv變體結合的HLA-A*02/COL6A1-001 (SEQ ID NO: 30) 外，Fab-scTv變體顯示不與相似肽結合（圖5），支持高結合選擇性。對於一些Fab-scTv變體，透過將生物素化肽-HLA複合體載入到生物感測器 (SA) 上並分析 Fab-scTv變體的稀釋系列來研究 HLA-A*02/COL6A3-002與HLA-A*02/COL6A1-001結合之間的治療視窗。雖然包含成熟CDRa1 (SEQ ID NO: 26)和野生型CDRb1 (SEQ ID NO: 13)序列的變體75-10顯示出對HLA-A*02/COL6A3-002的結合親和力比對HLA-A*02/COL6A1-001 增加 8 倍，但是對於包含成熟CDRb1 (SEQ ID NO: 39)的Fab-scTv變體75-13的結合親和力檢測到增加高達57 倍，從而支援治療視窗有所改善（表4、圖6）。
表3：Fab-scTv融合蛋白與HLA-A*02/COL6A3-002的結合親和力。
變體 KD (M) kon (1/Ms) koff (1/s)
75-1 8.06E-06 1.01E+05 8.17E-01
75-2 3.69E-06 1.59E+05 5.86E-01
75-3 4.92E-06 9.71E+04 4.78E-01
75-4 5.76E-06 9.78E+04 5.63E-01
75-5 4.32E-04 2.21E+03 9.55E-01
75-6 1.13E-06 2.06E+05 2.32E-01
75-7 1.79E-06 1.93E+05 3.44E-01
75-8 3.45E-06 1.36E+05 4.69E-01
75-9 1.41E-05 6.02E+04 8.51E-01
75-10 1.78E-06 1.69E+05 3.01E-01
75-11 2.82E-07 4.16E+05 1.18E-01
75-12 3.74E-07 2.67E+05 1.00E-01
75-13 4.05E-07 3.28E+05 1.33E-01
75-14 3.10E-06 8.41E+04 2.61E-01
75-15 7.78E-07 2.33E+05 1.81E-01
75-16 5.87E-07 3.37E+05 1.98E-01
75-17 2.27E-07 3.62E+05 8.20E-02
75-18 1.93E-06 1.51E+05 2.91E-01
75-19 6.00E-07 2.96E+05 1.78E-01
75-20 5.31E-07 6.08E+05 3.23E-01
75-21 5.52E-07 2.72E+05 1.50E-01
75-22 8.22E-07 2.48E+05 2.04E-01
75-23 3.24E-07 3.18E+05 1.03E-01
75-24 5.20E-06 1.08E+05 5.62E-01
75-25 8.33E-06 6.23E+04 5.19E-01
表4：Fab-scTv融合蛋白與HLA-A*02/COL6A3-002和HLA-A*02/COL6A1-001的結合親和力比較。
變體 pHLA-A*02 KD (M) KDCOL6A1-001 /KDCOL6A3-002
75-10 COL6A3-002 1.37E-05 8
  COL6A1-001 1.08E-04
75-11 COL6A3-002 8.50E-07 8
  COL6A1-001 6.46E-06
75-12 COL6A3-002 7.24E-07 12
  COL6A1-001 8.98E-06
75-13 COL6A3-002 7.39E-07 57
  COL6A1-001 4.23E-05
75-17 COL6A3-002 8.25E-07 9
  COL6A1-001 7.10E-06
75-23 COL6A3-002 1.15E-06 22
  COL6A1-001 2.55E-05
實施例5 ：親和力成熟TCR 對於細胞表達的用途
修飾T細胞以表達識別腫瘤特異性肽-HLA的TCR是將T細胞重定向至癌細胞的有前景的替代方案。由於使用成熟的CDR1序列可以改善針對HLA-A*02/COL6A3-002的細胞結合TCR，因此將鑒定的CDRa1和CDRb1 突變體序列移植到親本TCRR4P3F9（SEQ ID NO: 2和10）上。在電穿孔透過PCR 擴增 DNA 構建體的體外轉錄產生的相應mRNA 後，在人CD8+ T細胞中表達所得的突變TCR變體（C-1至C-18、表5）。出於對照目的，表達針對NYESO1-001 肽 (SEQ ID NO:61)的1G4 TCR（SEQ ID NO: 53和57）。在RNA 電穿孔的CD8+ T細胞過夜孵育後，透過用PE標記的HLA-A*02/COL6A3-002四聚體或HLA-A*02/NYESO1-001四聚體染色來分析引入TCR變體的表達。雖然親本TCRR4P3F9變體C-1 僅顯示出對HLA-A*02/COL6A3-002四聚體的最少染色，但具有成熟CDRa1和/或CDRb1的R4P3F9TCR變體C-2至C-18顯示四聚體染色增加（圖7）。表達不同成熟R4P3F9TCR變體的CD8+ T細胞（20,000個細胞/孔）的功能性活化透過測定與T2細胞（20,000個細胞/孔）共同培養後釋放的IFN-γ水準來研究，所述T2細胞載入有稀釋系列的COL6A3-002 (SEQ ID NO:1)或10 μM COL6A3-002和類似肽（SEQ ID NO: 28至36）。與親本R4P3F9TCR變體C-1 相比，成熟的TCR變體C-2至C-18顯示出 IFN-γ釋放增加，在較低的肽濃度下已達到最高水準（圖8）。如所預期的，對於不表達TCR的T細胞或對NYESO1-001特異的1G4 對照 TCR未觀察到 IFN-γ釋放。為了分析 COL6A3-002 對成熟R4P3F9TCR變體的識別選擇性，分析了負載不同相似肽（SEQ ID NO: 28至36 ）的T2細胞的IFN-γ釋放，並顯示了成熟R4P3F9TCR變體的不同選擇性特徵。最有趣的是，包含相同成熟CDRb1 (SEQ ID NO: 40)的TCR變體C-5（SEQ ID No 62和2）和C-14（SEQ ID NO: 62和63）未對COL6A1-001或其他類似肽（圖9）顯示出任何交叉反應性，這使親和力成熟R4P3F9TCR變體C-5和C14 成為最有希望用於基於細胞TCR腫瘤靶向作用的候選變體。
表5：細胞TCR變體的命名。分子基於SEQ ID NO 2和10以及指示的CDRa1和CDRb1變體。
變體 CDRa1 CDRb1
C-1 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) RSGDLS (SEQ ID NO. 13)
C-2 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHNN (SEQ ID NO. 37)
C-3 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHLN (SEQ ID NO. 38)
C-4 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARWHRN (SEQ ID NO. 39)
C-5 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AMDHPY (SEQ ID NO. 40)
C-6 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ATDHYN (SEQ ID NO. 41)
C-7 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) ARYHTN (SEQ ID NO. 42)
C-8 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) APYHLN (SEQ ID NO. 43)
C-9 DRGSQS (SEQ ID NO. 5) AKDHTN (SEQ ID NO. 44)
C-10 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) RSGDLS (SEQ ID NO. 13)
C-11 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHNN (SEQ ID NO. 37)
C-12 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHLN (SEQ ID NO. 38)
C-13 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARWHRN (SEQ ID NO. 39)
C-14 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AMDHPY (SEQ ID NO. 40)
C-15 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ATDHYN (SEQ ID NO. 41)
C-16 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) ARYHTN (SEQ ID NO. 42)
C-17 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) APYHLN (SEQ ID NO. 43)
C-18 DRRSQS (SEQ ID NO. 26) AKDHTN (SEQ ID NO. 44)
實施例6 ：COL6A3-002 和COL6A1-001 識別細胞TCR 變體的視窗
如上所述進行 R4P3F9變體的細胞表達和分析。根據先前的實驗（圖7），與親本TCRC-1 相比，用PE標記的HLA-A*02/COL6A3-002四聚體對表達R4P3F9TCR變體C-2至C-18的T細胞染色增加。另外，TCR變體C-12和C-17顯示與HLA-A*02/COL6A1-001結合（圖10）。所有成熟R4P3F9變體的表達改善了CD8+ T細胞的功能性活化，以應答載入有COL6A3-002 稀釋系列(SEQ ID NO:1)的T2細胞，與親本TCRC-1 相比，EC50 值降低 5至90 倍（圖11、表6）。發現了變體C-14的最低 EC50 值。同樣，包含相同成熟CDRb1 (SEQ ID NO: 40)的TCR變體C-5（SEQ ID No 62和2）和C-14（SEQ ID NO: 62和63）未對COL6A1-001顯示出任何交叉反應性，但是，其他變體顯示出強識別能力，EC50 視窗（COL6A3-002與COL6A1-001）低至因子5。
表6：與載有COL6A3-002或COL6A1-001的T2細胞共培養後表達R4P3F9變體的T細胞的IFN-γ釋放 EC50 值 [nM]。
變體 EC50 COL6A3-002 [nM] EC50 COL6A1-001 [nM]
C-1 2.51 -
C-2 0.16 -
C-3 0.14 871a
C-4 0.13 -
C-5 0.15 -
C-6 0.48 -
C-7 0.29 -
C-8 0.20 350
C-9 0.55 -
C-10 0.32 1.5
C-11 0.32 8.2
C-12 0.20 1.9
C-13 0.23 9.7
C-14 0.03 -
C-15 0.31 69
C-16 0.34 78
C-17 0.33 4.1
C-18 0.14 280089 a
a 未達到穩定狀態實施例7 ：成熟R4P3F9 變體C-5 和C-14 對腫瘤細胞系的療效
如上所述進行 R4P3F9變體的細胞表達和分析。
與親本TCRC-1 相比，成熟R4P3F9變體C-5（SEQ ID NO 62和2）和C-14（SEQ ID NO: 62和63）的表達改善了CD8+ T細胞的功能性活化，以應答呈遞COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1)的腫瘤細胞系（圖12）。該研究期間使用的腫瘤細胞系呈遞不同量的靶肽。SF539細胞每個細胞攜帶 ~4000個拷貝的HLA-A*02/COL6A3-002，SW982細胞每個細胞攜帶~460個拷貝。儘管親本TCRC-1在與靶陽性細胞系共培養後不介導強的T細胞活化，但TCR變體C-14顯示出比TCR變體C-5 更強的功能性活化改善。這些資料符合從TCRC-1到C-5和至C-14的EC50 改善（表6）。靶陰性腫瘤細胞系MCF-7未被任何這些TCR識別。
參考文獻： Aleksic et al. 2012: Different affinity windows for virus and cancer-specific T-cell receptors – implications for therapeutic strategies, Eur J Immunol. 2012 Dec;42(12):3174-9; Hickman et al. 2016: Antigen Selection for Enhanced Affinity T-Cell Receptor–Based Cancer Therapies, J Biomol Screen. 2016 Sep;21(8):769-85; Boder and Wittrup 2000: Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability, Methods Enzymol. 2000;328:430-44; Boder and Wittrup 1997: Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries, Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7; Smith et al. 2015: T Cell Receptor Engineering and Analysis Using the Yeast Display Platform, Methods Mol Biol. 2015;1319:95-141; DE102016121899.5 DE102016115246
無
在以下實施例中將對本發明進一步進行說明，參照隨附圖表和序列，但是不僅限於此。為了本發明之目的，所有參考文獻均以完整引用的形式併入本文。在圖和序列中：
圖1顯示了透過酵母表面展示技術將TCR轉化為穩定的Vα/Vβ 單鏈TCR(scTv)。顯示於轉化釀酒酵母 EBY100 表面上的ScTv分子用FITC標記的抗Vbeta1 抗體和PE標記的HLA-A*02/COL6A3‑002四聚體染色。將未修飾的scTv R4P3F9（左圖，SEQ ID NO: 22）與帶有單點突變的scTv克隆進行比較，以穩定scTv 支架（右圖），其源自隨機突變scTv文庫的選擇。
圖2顯示了透過酵母表面展示的scTv 親和力成熟。將具有和不具有親和力成熟CDR1 β的穩定scTv分子用含有COL6A3-002 (SEQ ID NO: 1)的HLA-A*02四聚體進行染色，並用含有與COL6A3-002具有高度序列相似性的9種肽（SEQ ID NO: 28至36）的HLA-A*02四聚體混合物進行複染。將具有非成熟β鏈CDR1序列RSGDLS (SEQ ID NO: 13)的穩定scTv (SEQ ID NO: 27)與攜帶親和力成熟β鏈CDR1序列(SEQ ID NO: 40)和ARWHRN (SEQ ID NO: 39)的scTv克隆進行比較。
圖3顯示了抗CD3 Fab-scTv R4P3F9S融合變體75-1至75-25的尺寸排阻色譜洗脫曲線。
圖4顯示了透過生物層干涉測量法測量的抗CD3 Fab-scTv R4P3F9S融合變體75-1至75-25的HLA-A*02/COL6A3-002結合動力學。顯示了HLA-A*02/COL6A3-002的分析濃度。
圖5顯示了透過生物層干涉測量法 (BLI) 測量的抗CD3 Fab-scTv R4P3F9S融合變體75-1至75-25的結合分析。分析了與指定的相似肽複合的1 μM HLA-A*02。
圖6顯示了不同抗CD3 Fab-scTv R4P3F9S融合變體的HLA-A*02/COL6A3-002和HLA-A*02/COL6A1-001 (SEQ ID NO: 30)結合動力學的比較。顯示了Fab-scTv分子的分析濃度。
圖7顯示了用PE標記的HLA-A*02/COL6A3-002四聚體染色表達人CD8+ T細胞的成熟R4P3F9TCR變體。出於對照目的，沒有表達對NYESO1-001特異的TCR（空白對照）或1G4 TCR，並且使用PE標記的HLA-A*02/NYESO1-001四聚體進行染色。
圖8顯示了應答 COL6A3-002的表達人CD8+ T細胞的成熟R4P3F9TCR變體的IFN-γ釋放。出於對照目的，沒有表達對NYESO1-001特異的TCR（空白對照）或1G4 TCR。在電穿孔的CD8+ T細胞與載有連續稀釋的COL6A3-002的T2細胞共培養後，透過ELISA法測定IFN-γ釋放。
圖9顯示了應答 COL6A3-002和不同相似肽的表達人CD8+ T細胞的成熟R4P3F9TCR變體的IFN-γ釋放。出於對照目的，沒有表達對NYESO1-001特異的TCR（空白對照）或1G4 TCR。在電穿孔的CD8+ T細胞與載有10 µM COL6A3-002或相似肽的T2細胞共培養後，透過ELISA法測定IFN-γ釋放。
圖10顯示了用PE標記的肽-HLA-A*02四聚體染色表達人CD8+ T細胞的成熟R4P3F9TCR變體。出於對照目的，沒有表達對NYESO1-001特異的TCR（空白對照）或1G4 TCR，並且使用PE標記的HLA-A*02/NYESO1-001四聚體進行染色。
圖11顯示了應答 COL6A3-002或COL6A1-001的表達人CD8+ T細胞的成熟R4P3F9TCR變體的IFN-γ釋放。出於對照目的，沒有表達對NYESO1-001特異的TCR（空白對照）或1G4 TCR。在電穿孔的CD8+ T細胞與載有連續稀釋的COL6A3-002或COL6A1-001的T2細胞共培養後，透過ELISA法測定IFN-γ釋放。
圖12顯示了與不同腫瘤細胞系共培養後表達R4P3F9TCR變體的原代人CD8+ T細胞的IFN-γ釋放。SF539、SW982和Hs840.T細胞以不同水準呈遞靶肽。MCF-7細胞不呈遞靶肽。作為對照，無外源性TCR的效應細胞與具有目標TCR的細胞一起分析。透過ELISA法測定IFN-γ釋放。*標記超出範圍的資料點。
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Claims (20)

  1. 一種抗原識別構建體，其包含一第一結構域及一第二結構域，該第一結構域及該第二結構域各包含三個互補決定區(CDR)，其中該第一結構域包含根據SEQ ID NO：6(CDRa2)和7(CDRa3)的氨基酸序列，以及該第二結構域包含根據SEQ ID NO：14(CDRb2)和15(CDRb3)的氨基酸序列，其中(a)該第一結構域的CDRa1為SEQ ID NO：26和該第二結構域的CDRb1為SEQ ID NO：40，及其中該抗原識別構建體包含SEQ ID NO：65的序列，或包含SEQ ID NO：62和63的序列；或(b)該第一結構域的CDRa1為SEQ ID NO：5和該第二結構域的CDRb1為SEQ ID NO：40，及其中該抗原識別構建體包含SEQ ID NO：64的序列，或包含SEQ ID NO：62和2的序列。
  2. 如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該抗原識別構建體為穩定的，並且在MHC的背景下能夠特異性地和/或選擇性地(selectively)與包含根據SEQ ID NO：1的氨基酸序列的一COL6A3抗原肽結合。
  3. 如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該抗原識別構建體為一T細胞受體(TCR)或其衍生物或片段，其中該衍生物或片段維持異性地和/或選擇性地與COL6A3抗原多肽結合之分子的抗原結合和/或識別能 力。
  4. 如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該抗原識別構建體為一抗體或其衍生物或片段，其中該衍生物或片段維持異性地和/或選擇性地與COL6A3抗原多肽結合之分子的抗原結合和/或識別能力。
  5. 如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該第一結構域是一TCR α或γ鏈的一部分；和/或其中該第二結構域是一TCR β或δ鏈的一部分。
  6. 如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該抗原識別構建體為一單鏈抗原識別構建體。
  7. 如請求項1所述的抗原識別構建體，其中該抗原識別構建體為一可溶性TCR。
  8. 如請求項7所述的抗原識別構建體，其中該可溶性TCR為一異二聚體截短TCR變體，其至少包含由一多肽接頭連接之(a)SEQ ID NO：62的TCR α鏈和SEQ ID NO：63的TCRβ鏈的可變結構域；或(b)SEQ ID NO：62的TCR α鏈和SEQ ID NO：2的TCR β鏈的可變結構域，該多肽接頭連具有選自由SEQ ID NO：22、24、25及27組成之群組之一序列。
  9. 一種核酸，其編碼如請求項1所述的抗原識別構建體。
  10. 一種核酸載體，其包含如請求項9所述的核 酸。
  11. 一種重組宿主細胞，其包含如請求項9所述的核酸或如請求項10所述的核酸載體。
  12. 如請求項11所述的重組宿主細胞，其中該重組宿主細胞為一淋巴細胞。
  13. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至8中任一項所述的抗原識別構建體、如請求項9所述的核酸，如請求項10所述的核酸載體，或如請求項11或12所述的重組宿主細胞，以及一藥用載體、稀釋穩定劑和/或賦形劑。
  14. 一種製造如請求項1所述的COL6A3特異性抗原識別構建體的方法，包括以下步驟：a.提供一合適的宿主細胞，b.提供一基因構建體，其包含編碼如請求項1所述的抗原識別構建體的一編碼序列，c.將該基因構建體引入該合適的宿主細胞，和d.由該合適的宿主細胞表達該基因構建體。
  15. 如請求項14所述的方法，進一步包括從該合適的宿主細胞分離和純化該抗原識別構建體，以及在一T細胞中重構該抗原識別構建體。
  16. 一種如請求項1所述的抗原識別構建體、如請求項9所述的核酸、如請求項10所述的核酸載體，或如請求項11所述的重組宿主細胞於製備一藥物上的用途。
  17. 一種如請求項1所述的抗原識別構建體、如請求項9所述的核酸、如請求項10所述的核酸載體，或如請求項11所述的重組宿主細胞於製備用於診斷、預防和/或治療癌症之一藥物上的用途。
  18. 如請求項17所述的用途，其中該癌症選自COL6A3過度表達、突變和/或呈現一COL6A3衍生腫瘤相關抗原的癌症。
  19. 如請求項18所述的用途，其中該癌症為結直腸癌、結腸癌、肝癌、卵巢癌或胃癌。
  20. 一種於體外在一生物樣本中檢測癌症的方法，包含以下步驟：a)使該生物樣本與如請求項1所述的抗原識別構建體接觸；以及b)檢測該抗原識別構建體與該生物樣本的結合情況。
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