TWI782232B - 基於硫酸化玻尿酸之水凝膠及含彼之藥學組成物 - Google Patents

Abstract

本發明關於一種基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，係藉由使交聯單體之-COOH基與交聯劑反應而形成的，該交聯單體包含選自由硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽所組成群組中之至少一者。

Description

基於硫酸化玻尿酸之水凝膠及含彼之藥學組成物

本發明關於一種基於硫酸化玻尿酸之水凝膠及含彼之藥學組成物。

玻尿酸是一種具有相當大的黏彈性質之多醣分子。玻尿酸係以滑液的基本成分存在於關節腔中，在關節腔中充當潤滑劑和減震劑，並防止軟骨細胞受到發炎性細胞介素的作用(Asari et al., Arch Histol Cytol, 1995, 58：65-76; Brun et al., Osteoarthr Cartil, 2003, 11：208-16; Stove et al., J Orthop Res, 2002, 20：551-5)。玻尿酸(就其本身或以衍生形式)長期以來一直作為“黏彈性補充劑(viscosupplement)”或潤滑劑用於治療退行性骨關節炎。

硫酸化玻尿酸及其衍生物以其抗發炎、抗-VEGF效用而聞名。然而，為了使硫酸化玻尿酸用作為具有實際效用的藥物，其應在體內具有高殘餘率及適合使用的物理性質。先前已知的硫酸化玻尿酸聚合物溶液有一缺點：其在體內迅速降解及其物理性質不易根據使用進行控制。

因此，需要開發基於硫酸化玻尿酸之材料，其呈現抗發炎和抗-VEGF效用且具有抗降解性，並因此其效用將在體內持續很長時間及可控制其各使用之物理性質。 [專利先前技術] WO2002-032407

[技術問題]

本發明提供一種新穎的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，其用於延長體內硫酸化玻尿酸的效用並控制其各使用所需的物理性質。

此外，本發明提供一種抗發炎或抗血管生成之藥學組成物，其含有作為活性成分的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠。 [技術解決方案]

本發明提供一種基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，係藉由使交聯單體之-COOH基與交聯劑反應而形成的，該交聯單體包括選自由硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽所組成群組中之至少一者。

此外，本發明提供一種抗發炎或抗血管生成之藥學組成物，其包括作為活性成分的該基於硫酸化玻尿酸之水凝膠。

此外，本發明提供一種用於預防或治療關節炎之藥學組成物、一種用於預防或治療眼疾之藥學組成物、一種抗癌藥學組成物，該藥學組成物包括作為活性成分的該基於硫酸化玻尿酸之水凝膠。 [有利效果]

根據本發明的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠具有抗發炎或抗血管生成之效用，及可抑制其在體內的降解，從而使抗發炎和抗血管生成效用持續很久，且可容易地控制凝膠關於其使用的物理性質。

根據本發明的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠可有效地用作為預防或治療關節炎、眼疾等等的藥劑及抗癌劑。

在下文中，將更詳細地描述本發明，以幫助理解本發明。基於發明人可適當定義術語的概念以最佳方式解釋自己的發明之原則，本說明書和申請專利範圍中所使用的術語或詞語不應解釋為限制於普通或詞典意義，且該等術語或詞語應解釋為與本發明的技術思想相一致的意義和概念。

本發明提供一種基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，其包括選自由硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽所組成群組中之至少一者。本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠係藉由使交聯單體之-COOH基與交聯劑反應而形成，該交聯單體包含選自由硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽所組成群組中之至少一者。

習知硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽已知彼等之抗發炎、抗VEGF效用，但是包括該等硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽的聚合物溶液等等具有弱點：其在體內迅速降解且其物理性質不易根據使用進行控制。因此，本發明提供基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，其包括選自由硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽所組成群組中之至少一者，從而抑制硫酸化玻尿酸在體內的降解以延長其在體內的效用及使凝膠關於其使用的物理性質易於控制。根據本發明的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠具有抗發炎或抗血管生成之效用，且可有效地用作為預防或治療關節炎、眼疾等等的藥劑及抗癌劑。

該硫酸化玻尿酸意指玻尿酸的醇性羥基中之至少一者經硫酸基/根(sulfate)取代，及該硫酸化玻尿酸衍生物意指其他經化學改質之硫酸化玻尿酸或經取代之硫酸化玻尿酸。例如，硫酸化玻尿酸衍生物可由選自硫酸化玻尿酸-泊洛沙姆(poloxamer)衍生物、硫酸化玻尿酸-聚乙二醇衍生物、硫酸化玻尿酸-(CH₂ )_n -CH₃ 衍生物、硫酸化玻尿酸-苯甲酯衍生物、硫酸化玻尿酸-聚葡萄胺糖衍生物、硫酸化玻尿酸-PLGA衍生物、硫酸化玻尿酸-明膠或硫酸化玻尿酸-膠原衍生物中之一或多者組成。該硫酸化玻尿酸鹽可由選自硫酸化玻尿酸鈉、硫酸化玻尿酸鈣、硫酸化玻尿酸鎂、硫酸化玻尿酸鋅、硫酸化玻尿酸鈷或硫酸化玻尿酸四丁銨之一或多者組成。或者，該硫酸化玻尿酸可以例如下列通式表示：

[式]

其中，R₁ 和R₂ 可各自獨立為SO₃ H或H及n為1或更大的整數。

選自由該硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽所組成群組中之至少一者的重量平均分子量(Mw)可為從800至5,000 kDa。更佳地，其可為從1,000至4,000 kDa且甚至更佳地，從1,200至3,000 kDa。藉由使用在該重量平均分子量範圍內之硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽，可以提高其與交聯劑的反應性及製備水凝膠的容易性，且可改良所製備的水凝膠之物理性質。

在下文中，為方便起見，除非另有指示，術語“硫酸化玻尿酸”係指所有硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽。

在習知硫酸化玻尿酸中，一級-OH基，即玻尿酸的C6位置係經硫酸基/根取代，並因此其難以用使用該硫酸化玻尿酸作為交聯單體以便彼此與交聯劑交聯之習知方法來形成基於硫酸化的玻尿酸之水凝膠。

因此，本發明提供一種新的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，係藉由使交聯單體之-COOH基與交聯劑反應而形成的，該交聯單體包括選自由硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽所組成群組中之至少一者。

在本文中，該交聯單體可為選自由下列所組成群組中之至少一者：其中玻尿酸之一些或全部醇性羥基係經硫酸基/根取代的硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽。玻尿酸總共具有四個-OH基，除了一級-OH基外，包括三個二級-OH基。當進行硫酸基/根取代反應時，反應性較高的一級-OH基首先被硫酸基/根取代，且隨著反應的進行，二級-OH基可被硫酸基/根取代。當玻尿酸的所有-OH基被硫酸基/根取代時，總取代比可為400百分比。根據本發明之一個實施態樣，包括選自由該硫酸化玻尿酸、其衍生物及鹽所組成群組中之至少一者的交聯單體為一其中玻尿酸的30-400%醇性羥基係經硫酸基/根取代者。換句話說，像本發明一樣，使用硫酸化玻尿酸的-COOH交聯的基於玻尿酸之水凝膠，使用-COOH基而不是-OH基進行交聯，且因此，其中所有一級-OH基被硫酸鹽取代之硫酸化玻尿酸可用作為該交聯單體，及再者，可使用其中所有一級-OH基和二級-OH基都被硫酸基/根取代的硫酸化玻尿酸。此外，可使用其中只有一些玻尿酸之醇性羥基經硫酸基/根取代之硫酸化玻尿酸，且再者，也可使用其中只有一些一級-OH基經硫酸基/根取代之硫酸化玻尿酸。關於根據本發明之一個實施態樣的硫酸化玻尿酸，鑑於安全性、穩定性、抗發炎效用、抗血管生成效用、物理性質、等等，可藉由使用具有適合各種目的之取代比的硫酸化玻尿酸將效用和持續時間最大化。

關於本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，基於二胺之交聯劑可用作為交聯劑。關於本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，基於二胺之交聯劑係用作為交聯劑使得交聯單體之-COOH基與交聯劑反應而形成水凝膠。該基於二胺之交聯劑可為例如二胺基丁烷、二胺基己烷、二胺基辛烷、己二酸二醯肼(ADH)、聚乙二醇二胺(PEG-二胺)、胱胺、等等。最佳地，可使用二胺基己烷。於此，作為觸媒，可使用基於碳二亞胺之觸媒諸如1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺(EDC)、1-[3-(二甲胺基)丙基]-3-乙基碳二亞胺甲碘化物(1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylcarbodiimide methiodide))、二異丙基碳二亞胺(DIC)、N,N'-二環己基碳二亞胺(DCC)、等等。此外，為了幫助EDC的活性，可使用N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)、磺酸基-N-羥基琥珀醯亞胺(磺酸基-NHS)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、等等。彼等觸媒可用於使硫酸化玻尿酸的-COOH基與交聯劑的-NH₂ 反應。

如此，根據本發明的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠具有抗發炎或抗血管生成之效用。此外，根據本發明的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠可藉由減緩體內的降解率來延長抗發炎或抗血管生成之效用。因此，根據本發明的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠可有效地用作為預防或治療關節炎、眼疾的藥劑及抗癌劑等等。

此外，本發明提供一種抗發炎或抗血管生成之藥學組成物，其包括作為活性成分之該基於硫酸化玻尿酸之水凝膠。根據本發明的藥學組成物可用於預防或治療關節炎、眼疾、及用於抗癌治療。

該“藥學組成物”可包括本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠和其他化學成分，諸如稀釋劑、載體、等等。因此，該藥物組成物可根據需要包括藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或其組合。藥學組成物促進化合物投予至生物體中。存在用於投予化合物之各種方法，包括但不限於口服、注射、氣霧劑、腸胃外和局部投予。

此外，本發明提供一種藉由投予作為活性成分的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠預防或治療哺乳動物的關節炎之方法。在本文中，基於硫酸化玻尿酸之水凝膠較佳可以注射用製劑投予。關於代表例，本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠可用於治療骨關節炎或類風濕性關節炎，或其他發炎性關節炎諸如痛風或焦磷酸鈣二水合物沉積性疾病，或其可用於減少或防止在外科手術後可能形成的黏連。本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠特別可用於治療慢性或急性發炎。

在本文中，術語“治療”意指停止、延遲或改善表現出疾病症狀的個體(subject)之疾病的進展。術語“預防”意指停止、延遲或改善處於表現出疾病症狀之風險的個體之疾病的徵兆，即使他或她沒有表現出症狀。

提出下列實施例以提供一般技藝人士關於如何製造和評估本文所提供的化合物、組成物和方法之完整揭示和說明，且意為純粹是示例性的。因此，該等實施例決不意欲限制發明人所認為之其發明的範圍。有多種變化和組合之反應條件，例如組分濃度、所需溶劑、溶劑混合物、溫度、壓力和其他反應參數及可用於優化產品特性(例如純度、產率、等等)之條件。該等也被認為在本申請的範圍內。除非本文另外指出或與上下文明顯矛盾，否則本發明涵蓋上述要素的所有可能變型的任何組合。

[製備例1] - 硫酸化玻尿酸(硫酸化HA)的合成

將玻尿酸(HA)-四丁基銨鹽(TBA)衍生物以3 mg/mL的濃度溶解於二甲基甲醯胺(DMF)(其為有機溶劑)中，其中TBA與離子交換樹脂一起引入HA中。將HA-TBA衍生物的15莫耳倍之三氧化硫吡啶錯合物加至其中。在氮氣下於5℃反應2小時後，進行乙醇沉澱，以產生經純化的硫酸化玻尿酸衍生物。

實施例1

將製備例1中所製備的硫酸化玻尿酸(SHA)溶解於水中至為6 wt%。接著，相對於100莫耳份的硫酸化玻尿酸單體，添加100莫耳份的EDC、100莫耳份的NHS、和20莫耳份的二胺基辛烷，使其在40℃下反應過夜以製備水凝膠。

[實驗例1：SHA和基於硫酸化玻尿酸之水凝膠的鑑定]

以1H NMR分析和元素分析測定製備例1中所製備的硫酸化玻尿酸(SHA)的硫酸基/根取代度。以1H NMR分析鑑定實施例1中所製備的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠。結果係顯示於圖1和圖2中。

參照圖1的NMR數據，從於3.4 ppm處的峰自圖1的數據中完全消失之事實，發現製備例1中所製備的硫酸化玻尿酸(SHA)為其中所有一級-OH基(即玻尿酸的C6位置)均被硫酸基/根取代的硫酸化玻尿酸(硫酸化HA)。在實施例1中所製備的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠中，從圖2中的數據發現交聯劑的峰出現在1.0至1.6 ppm之間。因此，證實製得基於硫酸化玻尿酸之水凝膠。

實施例2

除了使用二胺基己烷代替二胺基辛烷作為基於二胺基之交聯劑之外，以與實施例1相同的方式製備基於硫酸化玻尿酸之水凝膠。

比較例1

將製備例1中所製備的硫酸化玻尿酸(SHA)溶解在NaOH中至為20重量%，及接著對其添加相對於硫酸化玻尿酸單體為5莫耳%的作為交聯劑之1,4-丁二醇二環氧丙基醚(BDDE)，並使在30℃下反應過夜。然而，使用其中所有C6位置均被硫酸基/根取代的硫酸化玻尿酸(硫酸化HA)作為交聯單體且使用BDDE作為交聯劑的比較例1沒有引起水凝膠的形成，且甚至在反應完成後，仍導致溶液形式，並因此無法進行分析。

[實驗例2：水凝膠的黏彈性測量]

以配備25 mm鋼板的MCR 302流變計在25℃、4%應變和2.5 Hz下測量實施例1至2中所製備的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠的黏彈性。此外，將實施例1至2中所製備的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠在高壓釜中於121℃下進行高壓蒸汽滅菌10分鐘，並接著測量黏彈性的改變。結果顯示於表1中。

表1

	滅菌前	滅菌後
G'(Pa)	G''(Pa)	G'(Pa)	G''(Pa)
實施例1	551	132	221	47
實施例2	679	197	240	63

參照上表1，發現根據應用目的，可製備實施例1至2中所製備的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，使其具有範圍從硬到軟的物理性質之寬範圍的黏彈性。此外，發現必要時，實施例1至2中所製備的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠即使在以高壓釜最終滅菌之後也可具有所需的黏彈性範圍。

[實驗例3：酶抗性的評估]

比較實施例2之SHA-COOH(SCO)凝膠與玻尿酸-COOH水凝膠(HA-COOH凝膠)的酶抗性且顯示於圖3中。

將1 g的各水凝膠與10 ul的500單位/g的玻尿酸酶溶液混合，該溶液是玻尿酸降解酶。接著，以配備有25mm鋼板的MCR 302流變計在37℃、4%應變和2.5Hz下測量黏彈性。結果係顯示於圖3中。

參照圖3，在相同條件下製備的玻尿酸-COOH水凝膠(HA-COOH凝膠)隨著時間的推移會迅速降解。同時，在實施例2的SHA-COOH凝膠中，發現由於降解酶引起的物理性質之劣化得到顯著改善。

[實驗例4：細胞毒性評估]

使用實施例1之SHA-COOH(SCO)凝膠、玻尿酸(HA)和硫酸化玻尿酸(SHA)評估兩種類型的細胞FLS和軟骨細胞的細胞毒性。

將兩種類型的細胞FLS和軟骨細胞分別以8.0x10³ 和3.4x10⁴ 個細胞/孔的濃度接種於96孔中，及接著生長過夜，並用1 mg/ml的各樣品處理。在樣品處理及培養另外24小時後，藉由刃天青素(resazaurin)分析測量細胞的活力。結果係顯示於圖4中。

參照圖4，相較於未用任何樣品處理的對照組，實施例1的SHA-COOH (SCO)凝膠、玻尿酸(HA)和硫酸化玻尿酸(SHA)的所有樣品均導致兩種細胞FLS和軟骨細胞的80%或更大之活力。因此，發現所有樣品均無細胞毒性。

[實驗例5：HUVEC抗血管生成效用的測定]

從使用經VEGF處理的HUVEC細胞樣品組和未經VEGF處理的HUVEC細胞樣品組的基質膠(Matrigel)之3D培養產生的血管生成(管形成)係顯示於圖5中。

在經VEGF處理組/未經VEGF處理的組中，將HUVEC細胞接種在用基質膠塗布的96孔中，且在培養16小時之後，以光學顯微鏡確定血管(管)的形成。此外，為了評估各樣品的抑制血管生成(管形成)之效用，將HUVEC細胞接種在用基質膠塗布的96孔中，及接著用某濃度的VEGF處理HUVEC細胞，接著用實施例1的硫酸化玻尿酸水凝膠(SCO凝膠)處理。培養16小時之後以光學顯微鏡觀察血管(管)的形成。結果係顯示於圖5中。

參照圖5，可發現用實施例1的SCO凝膠之處理幾乎不導致血管生成。

[實驗例6：抗發炎效用評估]

使用實施例1之基於硫酸化玻尿酸之水凝膠(SCO凝膠)、玻尿酸(HA)和硫酸化玻尿酸(SHA)在兩種類型的細胞軟骨細胞和FLS中進行抗發炎效用評估。

將兩種類型的細胞軟骨細胞和FLS分別以3.4x10⁴ 和8.0x10³ 個細胞/孔接種於96孔中，及用10 ng/ml和1 ng/ml的TNF-α處理以激活細胞過夜，並接著用5 mg/ml和1 mg/ml的各樣品處理細胞。在樣品處理後培養24小時後，藉由使用ELISA測量培養基中細胞的細胞介素分泌。結果係顯示於圖6中。

參照圖6，相較於未用任何樣品處理的對照組，實施例1的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠(SCO凝膠)將軟骨細胞的IL-6和IL-8分泌降低至60%或更少，且將FLS細胞的IL-6和IL-8分泌降低至30%或更少。因此，可確認抗發炎效用。

[實驗例7：抗凝血反應評估]

藉由使用實施例1的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠(SCO凝膠)、肝素、和硫酸化玻尿酸(SHA)之顯色分析測量因子IIa和因子Xa之活性抑制。結果顯示於表2中。

表2

	抗-IIa活性 [單位/mg]	抗-Xa活性 [IU/mg]
肝素	209	209
SHA	0.13	0.17
實施例1	0.05	0.12

參照上表2，硫酸化玻尿酸(SHA)的所有樣品之抑制因子IIa和因子Xa的活性均比肝素低1200倍或更高。特別是，實施例1的基於硫酸化玻尿酸之水凝膠(SCO凝膠)的活性均比肝素低1500倍或更大。因此，證實幾乎沒有抗凝血反應發生。

[圖1]為鑑定硫酸化玻尿酸(SHA)之硫酸化取代的1H NMR結果。

[圖2]為鑑定本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠的1H NMR結果。

[圖3]為說明本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠的酶抗性之評估的圖。

[圖4]為說明本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠的細胞毒性之評估的圖。

[圖5]顯示觀察在經VEGF處理的HUVEC細胞樣品和未經VEGF處理的HUVEC細胞樣品中之管形成，以及基於硫酸化玻尿酸之水凝膠(SCO凝膠)對經VEGF處理的HUVEC細胞樣品中的管形成之抑制效用的光學顯微照片。

[圖6]顯示說明本發明基於硫酸化玻尿酸之水凝膠的抗發炎效用之評估的圖。

Claims (8)

1. 一種基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，係藉由使交聯單體之-COOH基與交聯劑反應而形成的，該交聯單體包含選自由硫酸化玻尿酸及其鹽所組成群組中之至少一者，其中該硫酸化玻尿酸係以下式表示：

   

   其中R₁和R₂各自獨立為SO₃H或H且n為1或更大的整數前提是R¹和R²並非同時為H；其中玻尿酸的30-400%之醇性羥基係經硫酸基/根取代；該選自由硫酸化玻尿酸及其鹽所組成群組中之至少一者的重量平均分子量(Mw)範圍從800至5,000kDa；且該交聯劑為基於二胺之交聯劑，其中該基於二胺之交聯劑為選自由下列所組成群組中之至少一者：二胺基丁烷、二胺基己烷、二胺基辛烷、聚乙二醇二胺(PEG-二胺)、和胱胺。
2. 如請求項1之基於硫酸化玻尿酸之水凝膠，其用於抗發炎或抗血管生成。
3. 一種藥學組成物，其包含作為活性成分之根據請求項1之基於硫酸化玻尿酸之水凝膠。
4. 如請求項3之藥學組成物，係用於治療關節炎。
5. 如請求項3之藥學組成物，係用於治療眼疾，其中該眼疾係與血管生成相關。
6. 如請求項3之藥學組成物，係用於抗癌，其中該癌係與血管生成相關。
7. 一種如請求項1之基於硫酸化玻尿酸之水凝膠的用途，係用於製造供治療哺乳動物關節炎之醫藥。
8. 如請求項3之藥學組成物，係用於抗發炎或抗血管生成。

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