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TWI779296B - 黑米萃取發酵物及其製備與應用 - Google Patents

黑米萃取發酵物及其製備與應用 Download PDF

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TWI779296B
TWI779296B TW109118692A TW109118692A TWI779296B TW I779296 B TWI779296 B TW I779296B TW 109118692 A TW109118692 A TW 109118692A TW 109118692 A TW109118692 A TW 109118692A TW I779296 B TWI779296 B TW I779296B
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黃琡涵
鍾鈺旻
林詠翔
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大江生醫股份有限公司
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Abstract

一種包含黑米萃取發酵物的組成物、該發酵物及其活性成分的應用、以及製備該發酵物的方法。其中，該黑米萃取發酵物係包含以下式（I）至式（V）化合物之至少一者：
Figure 109118692-A0101-11-0001-1
、
Figure 109118692-A0101-11-0001-2
、
Figure 109118692-A0101-11-0001-3
、
Figure 109118692-A0101-11-0001-4
、及

Description

黑米萃取發酵物及其製備與應用
本發明係關於一種包含一含有下述式（I）至式（V）化合物之至少一者之黑米萃取發酵物的組成物、以及製備該黑米萃取發酵物的方法：
Figure 02_image001
（I）、
Figure 02_image003
（II）、
Figure 02_image005
（III）、
Figure 02_image007
（IV）、及
Figure 02_image009
（V）。 本發明亦關於式（I）至式（V）化合物及黑米萃取發酵物之至少一者的應用，尤其是關於彼等於抗肌膚老化、保濕、抗皺、提升肌膚彈力、緊緻皮膚、抑制高度醣化終產物（advanced glycation end product，AGEs）生成、抗氧化、提升水通道蛋白表現、提升膠原蛋白分泌量、及提升彈力蛋白表現量的應用。
皮膚是人體最大的組織，也是抵抗外物侵入及外在環境刺激的第一道防線，具有保水、保暖及感覺等功能。當皮膚受到紫外線、輻射、環境中的微生物及懸浮粒子的影響，皆可能使皮膚的含水量降低並加速皮膚細胞老化，導致皮膚發生角質增厚、皮膚乾燥脫屑、產生細紋及斑點、皮膚鬆弛、以及蛋白質分解與流失等現象，甚至會損害皮膚細胞中DNA，而引發細胞毒性、造成皮膚細胞變異而導致皮膚病變。
已知水通道蛋白的表現提升係有助於提升皮膚的保濕能力，因此，若能提升水通道蛋白表現量，即可達到保濕的效果。此外，膠原蛋白亦為增加皮膚含水量的重要物質，除具有保水功能以外，還可賦予皮膚韌性及彈性；皮膚真皮層中的彈力蛋白則具有支撐皮膚細胞結構的功能。因此，若可提升膠原蛋白與彈力蛋白於皮膚中的含量，即可達到提升肌膚彈力、緊緻皮膚、以及抗皺的效果。
醣基化反應係指葡萄糖附著到蛋白質的化學反應過程，此反應會產生高度醣化終產物（advanced glycation end product，AGEs）。堆積於皮膚細胞中的高度醣化終產物不僅容易引起蛋白質變性、使蛋白質失去彈性，進而導致皮膚皺紋產生、皮膚老化，亦會造成皮膚細胞DNA損傷、影響皮膚細胞DNA正常功能，甚至導致皮膚病變。因此，若可抑制AGEs，亦可達到緊緻皮膚、提升肌膚彈力、抗皺、以及抗肌膚老化的效果。
近年來，人們越來越重視皮膚保養，且講究使用天然且安全的原料，因此，業界仍持續開發可透過天然且安全之原料的使用以有效保養皮膚的手段。本案發明人研究發現，透過萃取黑米、並進一步發酵所得到之萃取物而提供的黑米萃取發酵物，係可抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表現、提升膠原蛋白分泌量、及提升彈力蛋白表現量，故可應用於皮膚保養，以抗肌膚老化、保濕、抗皺、提升肌膚彈力、及／或緊緻皮膚。
因此，本發明之一目的，在於提供一種製備黑米萃取發酵物的方法，其係包含以下步驟：(a) 以一極性溶劑萃取黑米以提供一黑米萃取物；(b) 使用一釀酒酵母菌發酵該萃取物，以獲得一中間發酵物；以及(c) 使用一胚芽乳酸桿菌發酵該中間發酵物，以獲得一黑米萃取發酵物。較佳地，該方法更於步驟(a)使用一澱粉酶，且該釀酒酵母菌係釀酒酵母菌BCRC 20271，該胚芽乳酸桿菌係胚芽乳酸桿菌BCRC 910805。
本發明之另一目的，在於提供一種組成物，其係包含一由上述方法所提供之黑米萃取發酵物。較佳地，該黑米萃取發酵物係含有以下式（I）至式（V）化合物之至少一者：
Figure 02_image001
（I）、
Figure 02_image003
（II）、
Figure 02_image005
（III）、
Figure 02_image007
（IV）、及
Figure 02_image009
（V）。 較佳地，該組成物係一醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物。
本發明之再一目的，在於提供一種使用一活性成分於抗肌膚老化、保濕、抗皺、提升肌膚彈力、及／或緊緻皮膚的用途，其中該活性成分係上述之式（I）至式（V）化合物、以及由如上所述方法所提供的黑米萃取發酵物的至少一者。較佳地，該活性成分係以食品組成物或保養品組成物的形式使用。
本發明之又一目的，在於提供一種使用一活性成分於製備一用於抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表現、提升膠原蛋白分泌量、及提升彈力蛋白表現量之至少一者之醫藥組成物的用途，其中該活性成分係上述之式（I）至式（V）化合物、以及如上所述方法所提供的黑米萃取發酵物的至少一者。
本發明之又再一目的，在於提供一種用於抗肌膚老化、保濕、抗皺、提升肌膚彈力、緊緻皮膚、抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表現、提升膠原蛋白分泌量、及／或提升彈力蛋白表現量之組合物，其中，該組成物係包含一有效量之活性成分，該活性成分係如上述之式（I）至式（V）化合物、以及如上述方法所提供的黑米萃取發酵物的至少一者。較佳地，該組成物係一醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所具體陳述者或後附申請專利範圍所界定者。
除非文中有另外說明，於本說明書中（尤其是在後述專利申請範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；所謂「個體」係指人類或非人的哺乳動物（例如：狗、貓）。
黑米係在來米的一種，又稱黑秈糙米，其外觀呈黑紫色，富含花青素、鈣、磷、鐵、維生素B1等營養素，屬於低GI（Glycemic index，升糖指數）食物，適合糖尿病患者食用。
本文中所述的「澱粉酶」可為任何適用於本發明者，包括一般大眾可自商業獲得的澱粉酶。此外，本文中所述的「釀酒酵母菌」及「胚芽乳酸桿菌」亦可為任何適用於本發明者，包括一般大眾可自商業獲得之釀酒酵母菌、及胚芽乳酸桿菌（例如可購自國內或國外寄存機構者），以及利用本技術領域所慣用之微生物分離方法從天然來源分離所得的釀酒酵母菌及胚芽乳酸桿菌。
本案發明人研究發現，黑米萃取物在釀酒酵母菌、及胚芽乳酸桿菌存在下進行發酵所提供之發酵物，相較於未經發酵的黑米萃取物，係具有更佳之抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表現、及緊緻肌膚的能力，因此，根據本發明以黑米萃取物所提供的發酵物，即，黑米萃取發酵物可用於抗肌膚老化、保濕、抗皺、提升肌膚彈力、緊緻皮膚等效果。
本案發明人進一步由上述黑米萃取發酵物得到以下五個活性成分（即，式（I）至式（V）化合物），此等活性成分均具有提升膠原蛋白分泌量、及提升彈力蛋白表現量的能力：
Figure 02_image001
（I）、
Figure 02_image003
（II）、
Figure 02_image005
（III）、
Figure 02_image007
（IV）、及
Figure 02_image009
（V）。
因此，本發明係關於一種製備黑米萃取發酵物的方法、一種包含式（I）至式（V）化合物及由前述方法所提供之黑米萃取發酵物之至少一者的組合物、一種使用式（I）至式（V）化合物及由前述黑米萃取發酵物之至少一者於抗肌膚老化、保濕、抗皺、提升肌膚彈力、及／或緊緻皮膚的用途、以及一種使用式（I）至式（V）化合物及前述黑米萃取發酵物之至少一者於製備一醫藥組成物的用途，其中該醫藥組成物係用於抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表現、提升膠原蛋白分泌量、及提升彈力蛋白表現量之至少一者。
根據本發明之製備黑米萃取發酵物的方法係包含以下步驟：(a) 以一極性溶劑萃取黑米以提供一黑米萃取物；(b) 使用一釀酒酵母菌發酵該萃取物，以獲得一中間發酵物；以及(c) 使用一胚芽乳酸桿菌發酵該中間發酵物，以獲得一黑米萃取發酵物。
於步驟(a)中，可採用極性溶劑來進行萃取，較佳地，該極性溶劑係水、醇（例如C1-C4醇）、或前述之組合。於本發明部分具體實施態樣中，係採用水做為萃取溶劑。一般而言，萃取溶劑的用量可視需要進行調整，並無特殊限制，只要可使原料均勻分散即可。舉例言之，可於步驟(a)採用黑米與萃取溶劑之重量比為1：3至1：9的用量。此外，亦可視所採用之萃取溶劑來選用合宜的萃取時間、以及萃取溫度。以採用純水作為萃取溶劑且黑米：萃取溶劑之重量比為1：3至1：9為例，通常係於95℃下，萃取1.5小時即可。
於步驟(a)中，可視需要於進行萃取之前先添加一澱粉酶至萃取溶劑與黑米之混和物中。一般而言，澱粉酶的用量並無特殊限制，只要可將黑米中的澱粉分解為醣類即可。舉例言之，可於步驟(a)採用「澱粉酶」與「黑米及萃取溶劑混合物」之重量比為1：100至1：200的用量。
於步驟(b)中，係將釀酒酵母菌添加至步驟(a)所提供的萃取物中，以進行第一發酵反應。於本發明部分具體實施態樣中，係以釀酒酵母菌BCRC 20271對步驟(a)所提供的萃取物進行發酵。此外，可視所採用之釀酒酵母菌來選用合宜的發酵時間、以及發酵溫度。以採用釀酒酵母菌BCRC 20271為例，通常係於室溫發酵20小時至24小時。一般而言，釀酒酵母菌的添加量並無特殊限制。舉例言之，釀酒酵母菌之添加量可為每克萃取物添加8x105 至1.2x106 cfu。
於步驟(c)中，係將胚芽乳酸桿菌添加至步驟(b)所提供的中間發酵物中，以進行第二發酵反應。於本發明部分具體實施態樣中，係以胚芽乳酸桿菌BCRC 910805對步驟(b)所提供的中間發酵物進行發酵。此外，可視所採用之胚芽乳酸桿菌來選用合宜的發酵時間、以及發酵溫度。以採用胚芽乳酸桿菌BCRC 910805為例，通常係於室溫發酵1天至3天。一般而言，胚芽乳酸桿菌之添加量並無特殊限制。舉例言之，胚芽乳酸桿菌之添加量可為每克中間發酵物添加8x106 至5.0x107 cfu。
在不移除所添加之前述釀酒酵母菌及胚芽乳酸桿菌的情況下，步驟(c)所提供之黑米萃取發酵物通常可以符合糖度範圍＜4˚、pH值為2-4、酒精＞5%之規格。
於上述步驟完成之後，可視需要進行例如減壓濃縮、過濾、及滅菌操作，以提升黑米萃取發酵物之使用便利性。舉例言之，可於45˚C至70˚C下對黑米萃取發酵物進行減壓濃縮，以提供一濃縮發酵物；或者，可以200至400目（mesh）之網篩對黑米萃取發酵物或濃縮發酵物進行過濾，以移除殘餘固體物。另一方面，可於黑米萃取發酵物中添加40%至70%（重量／重量）之異麥芽寡糖、並於90˚C至120˚C下，滅菌70分鐘至90分鐘，以提供一飲品。
根據本發明所提供之醫藥組成物可用於全身性或局部性投藥，且可透過各種藥物傳遞系統（drug delivery system，DDS）進行傳遞，包括口服藥物傳遞系統（oral drug delivery system）、經皮藥物傳遞系統（transdermal drug delivery system）、注射藥物傳遞系統（injectable drug delivery system）等。舉例言之，但不以此為限，該根據本發明所提供之醫藥組成物可以藉由微脂體（liposome）、微膠囊（microcapsule）、奈米微粒（nanoparticle）、微針（microneedle）等系統進行傳遞，以達到提高生物利用率、控制藥物釋放速度、針對病灶精準投藥、減少藥物副作用等效果。
該根據本發明所提供之醫藥組成物係可呈任何合宜的型式，並無特殊限制，端視所欲之用途而呈對應之合宜劑型；舉例言之，但不以此為限，該醫藥組成物可以口服、靜脈注射（包含點滴輸注及快速注射）、肌肉注射、皮下注射、動脈注射、腹腔注射、經皮（例如貼片、軟膏等）之投藥方式施用至有需要之個體上。視使用形式及用途而定，可選用醫藥上可接受之載劑以提供該醫藥組成物，其中，該載劑為熟悉製藥技術者所熟知，包括賦形劑、稀釋劑、輔助劑、安定劑、吸收促進劑、崩散劑、增溶劑、乳化劑、抗氧化劑、黏合劑、結合劑、增黏劑、分散劑、懸浮化劑、潤滑劑、吸濕劑等。
以口服劑型為例，可利用任何合宜之方法，將該醫藥組成物以適於口服投藥的劑型提供，其中，適於口服之液態劑型包括糖漿劑、口服液、懸浮液、酏劑等，適於口服之固態劑型則包括粉劑、顆粒劑、口含錠、糖衣錠、腸溶錠、咀嚼錠、發泡錠、膜衣錠、膠囊劑、長效緩釋錠等。於根據本發明所提供之該醫藥組成物中可含有任何不會不利影響活性成分（即，式（I）至式（V）化合物及黑米萃取發酵物之至少一者）之所欲效益的醫藥上可接受之載劑。舉例言之，但不以此為限，前述液態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子包括：水、食鹽水、葡萄糖（dextrose）、甘油、乙醇或其類似物、油（例如橄欖油、蓖麻油、棉籽油、花生油、玉米油、及胚芽油）、甘油、聚乙二醇、及前述之組合；前述固態劑型之醫藥上可接受之載劑的例子則包括：纖維素、澱粉、高嶺土（kaolinite）、膨潤土（bentonite）、檸檬酸鈉、明膠、瓊脂、羧甲基纖維素、阿拉伯膠、海藻膠、單硬脂酸甘油酯（glyceryl monostearate）、硬脂酸鈣（calcium stearate）、及前述之組合。
亦可於適於經皮投藥之劑型中含有任何不會不利影響活性成分（即，式（I）至式（V）化合物及黑米萃取發酵物之至少一者）之所欲效益的醫藥上可接受之載劑，例如：水、礦物油、丙二醇、聚氧化乙烯、液體石蠟脂、去水山梨醇單硬脂酸酯、及聚山梨醇酯60。可利用任何合宜之方法，將該醫藥組成物以適於經皮投藥的劑型提供，例如以乳液、乳霜、油狀物、凝膠（例如水凝膠）、膏狀物（例如分散膏、軟膏）、洗劑、噴霧劑、及貼片（例如微針貼片）等形式提供，但不以此為限。
至於適於注射之針劑或點滴劑，則可於根據本發明所提供之醫藥組成物中含有一或多種例如等張溶液、鹽類緩衝液（如磷酸鹽緩衝液或檸檬酸鹽緩衝液）、增溶劑、乳化劑、5%糖溶液、以及其他載劑等成分，以靜脈輸注液、乳劑靜脈輸注液、乾粉注射劑、懸液注射劑、或乾粉懸液注射劑等劑型提供該醫藥組成物。或者，可將該醫藥組成物製備成一注射前固體，並於投予至有需要之個體之前，將該注射前固體溶於其他溶液或懸浮液中或將其乳化，以提供所欲之注射劑。
根據本發明所提供之食品組成物可為飲品、固態食品、或半固態食品，且可以健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品或特殊營養食品的形式提供。舉例言之，但不以此為限，該食品組成物可為乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食品、餅乾、冰品、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、氣泡水、酒精飲料、運動飲料、營養飲料等產品。較佳地，該食品組成物係以健康食品或保健食品的形式提供。
此外，視使用形式及需求而定，可於根據本發明所提供之食品組成物中含有任何適宜之食品添加物。舉例言之，包括但不限於，防腐劑、殺菌劑、抗氧化劑、漂白劑、保色劑、膨脹劑、營養添加劑、著色劑、調味劑（例如：甜味劑）、黏稠劑、結著劑、食品工業用化學藥品、乳化劑、以及品質改良用、釀造用及食品製造用劑。
可於根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充食品或特殊營養食品的外包裝上標示建議使用量、特定族群（例如：孕婦、兒童等）的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員指導下自行服用而無安全疑慮。
可將根據本發明所提供之保養品組成物調配成任何合宜之產品形式。舉例言之，但不以此為限，該保養品組成物可為柔膚化妝水、收斂化妝水、營養化妝水、營養霜、按摩霜、精華液、眼霜、眼部精華液、面膜、貼片、噴霧、身體乳液、身體霜、身體油、及身體精華液等護理產品；妝前乳、粉底、蜜粉，腮紅、眼影、眉粉、睫毛膏、口紅等彩妝產品；或潔膚油、潔膚霜、潔膚水、眼唇卸妝液、香皂、沐浴露等清潔產品。此外，該保養品組成物還可以泡沫（foam）形態或進一步含有壓縮推進劑的氣霧（aerosol）形態來使用。
視產品的形式及需求而定，可於根據本發明所提供之保養品組成物中含有任何不會不利影響活性成分（即，式（I）至式（V）化合物及黑米萃取發酵物之至少一者）之所欲效益的化妝品學或皮膚科學上可接受的媒劑。舉例言之，但不以此為限，當該保養品組合物為一乳液狀、霜狀或凝膠狀產品時，可使用蠟、石蠟、澱粉、黃耆膠、纖維素衍生物、動物油、植物油、礦物油、聚乙二醇、膨潤土、氧化矽、滑石、氧化鋅等成分作為媒劑；當該保養品組成物為一粉狀或氣霧產品時，可使用例如乳糖、滑石、氧化矽、氫氧化鋁、矽酸鈣、聚醯胺等成分作為媒劑；當該保養品組成物為一溶液或乳濁液狀產品時，則可使用例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、聚乙二醇等成分作為媒劑。
當該保養品組成物以清潔產品的形式提供時，可進一步包含任何不會不利影響活性成分（即，式（I）至式（V）化合物及黑米萃取發酵物之至少一者）之所欲效益的界面活性劑作為媒劑。其中，該界面活性劑的例子包括，但不限於：脂肪酸鹽、烷基苯磺酸鹽（alkylbenzene sulfonate，ABS）、脂肪醇硫酸鹽（fatty alcohol sulfate，FAS）、脂肪醇聚氧乙烯硫酸鹽（alcohol ether sulfate，AES）、脂肪醇聚氧乙烯羧酸鹽（fatty alcohol polyoxyethylene ether carboxylate，AEC）、脂肪酸甲酯磺酸鹽（fatty acid methyl ester sulfonate，MES）、脂肪醇聚氧乙烯醚（fatty alcohol ethoxylates，AE）、烷基糖苷（alkyl polyglycoside，APG）、甜菜鹼型界面活性劑（Betaine type surfactant）、及前述之組合。
視需要地，亦可於根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物中進一步含有合宜用量之添加物，例如可提高該組成物於使用時感受之調色劑、著色劑等，以及可改善該組成物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。
根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物可視需要另含一或多種其他活性成分（例如：膠原蛋白、玻尿酸、胺基酸、維他命A、甘油、乳酸），以進一步加強該組成物之功效或增加製劑配方的運用靈活性與調配度，只要該其他活性成分對本發明活性成分（即，式（I）至式（V）化合物及黑米萃取發酵物之至少一者）之效益沒有不利的影響即可。
根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物中係含有以該組成物之總重量計，至少約0.0001、0.0002、0.0003、0.0004、0.0005、0.001、0.0015、0.002、0.0025、0.003、0.0035、0.004、0.0045、0.005、0.0055、0.006、0.0065、0.007、0.0075、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100重量%之活性成分（即，式（I）至式（V）化合物及黑米萃取發酵物之至少一者），且可自前述數值之任意二者選擇有用的範圍，例如：約0.0001重量%至約90重量%、約0.001重量%至約25重量%、約0.01重量%至約10重量%、約0.01重量%至約5重量%、約0.05重量%至約1重量%、及約0.05重量%至約0.5重量%。
根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物係可以一日一次、一日多次、或數日一次等不同頻率施用，端視投與個體之需求、年齡、體重、及健康況狀及施用目的而異。亦可視實際應用需求調整根據本發明所提供之醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物中黑米萃取發酵物、及式（I）至式（V）化合物之至少一者的含量，例如：調整至每日應服用或外用的量。一般而言，當以醫藥組成物之形式使用時，建議服用量為5至10克（或5至10毫升）之黑米萃取發酵物；或者，每日0.001毫克／公斤體重之本發明化合物（式（I）至式（V）化合物之至少一者）。當以食品組成物之形式使用時，建議服用量為每日5毫升之黑米萃取發酵物；或者，每日0.001毫克／公斤體重之本發明化合物。此外，當以保養品組成物之形式使用時，保養品中的黑米萃取發酵物建議含量為1%。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[ 製備 實施例 ]
於以下實施例中，所使用的物料及器材如下： 1.   核磁共振光譜儀（Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer，NMR）：1D與2D光譜使用400MHz Varian 400 FT-NMR；以δ表示化學位移（chemical shift），單位為ppm。 2.   質譜儀（Mass Spectrometer，MS）：串聯質譜-二維離子阱串聯傅立葉轉換質譜，使用Bruker amaZon SL system測定，單位為 m/z。 3    中壓液相層析儀（Medium pressure liquid chromatography，MPLC）：CombiFlash® Rf+, Teledyne ISCO, Lincoln, NE。 4.   高效能液相層析儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）： (1)     幫浦系統：Hitachi L-2310 series pump； (2)     偵測器：Hitachi L-2420 UV-VIS detector，偵測波長為 200至380 nm； (3)     資料處理軟體：D-2000 Elite 軟體； (4)     分析管柱：Discovery® HS C18（SUPELCO, 250 x 4.6 mm，5μm）； (5)     分析管柱：Mightysil RP-18 GP 250（Kanto, 250 x 4.6 mm，5μm）； (6)     半製備管柱：Discovery® HS C18（SUPELCO, 250 x 10.0 mm，5μm）；以及 (7)     製備級管柱: Discovery® HS C18（SUPELCO, 250 x 21.0 mm，5μm）。 5.   管柱層析（Column Chromatography）填充材料： (1)     Sephadex LH-20（Amersham Biosciences）； (2)     Diaion HP-20（Mitsubishi Chemical）； (3)     Merck Kieselgel 60（40-63μm，Art. 9385）；以及 (4)     Merck LiChroprep® RP-18（40-63μm，Art. 0250）。 6.   薄層色層分析（Thin-Layer Chromatography，TLC）：TLC aluminium sheets（silica gel 60 F254，0.25 mm，購自Merck, Germany）。 7.   紫外光燈（UV Lamp）：UVP UVGL-25，波長為 254 nm及365 nm。 8.   溶劑（購自默克台灣）：正己烷（n-hexane）、乙酸乙酯（ethyl acetate）、丙酮（acetone）、甲醇（methanol）、乙醇（ethanol）、正丁醇（n-butanol）、乙腈（acetonitrile）、氯仿-d1（deuteration degree 99.5%）、甲醇-d6（deuteration degree 99.5%）、重水（deuterium oxide，deuteration degree ＞ 99.8%）、二甲基亞碸-d6 （Dimethyl sulfoxide-d6，deuteration degree ＞ 99.9%）。
A. 黑米萃取發酵物的製備
A-1. 取黑米（購自：僑聯食品），並以1：6（黑米：水）之重量比將黑米與水混合，以提供一混合物。接著於該混合物中添加1%（重量／重量）之澱粉酶，並置於95˚C下萃取1.5小時，以提供一黑米萃取物。將該黑米萃取物冷卻至室溫，待後續之發酵步驟使用。
A-2. 取A-1所提供之黑米萃取物，於其中添加釀酒酵母菌BCRC 20271（添加量：每克萃取物添加1x106 cfu之釀酒酵母菌BCRC 20271），並置於室溫下發酵24小時，以提供一中間發酵物。
A-3. 取A-2所提供之中間發酵物，於其中添加乳酸桿菌BCRC910805（添加量：每克中間發酵物添加5x107 cfu之乳酸桿菌BCRC910805），並於室溫下發酵1.5天，以提供一黑米萃取發酵物。
A-4. 取A-3所提供之黑米萃取發酵物，在不移除所添加之前述釀酒酵母菌及胚芽乳酸桿菌的情況下，檢驗該發酵物是否符合糖度範圍＜4˚、pH值為2-4、酒精＞5%之規格，若符合即表示發酵完成。確認符合前述規格後，將該發酵物置於60˚C下進行減壓濃縮，以提供一濃縮發酵物。接著，將該濃縮發酵物以200目之網篩過濾，以移除殘餘固體物。最後，置於95˚C下加熱90分鐘進行滅菌。
B. 白米萃取發酵物的製備
本製備實施例係比照[製備實施例A]之方法步驟進行，其中，僅以白米（購自：僑聯食品）取代黑米，以提供一白米萃取發酵物。
C. 式（ I ）至式（ V ）化合物的製備
C-1. 取10公升A-4所提供之黑米萃取發酵物，使用等比例（1:1）之正丁醇（n-BuOH）與水對該發酵物液相分配萃取（重複三次），分別合併三次萃取所獲得之正丁醇層萃取液、以及水層萃取液，並進行減壓濃縮乾燥，以提供正丁醇層萃取物（共10.4 g）及水層萃取物（共1053.5 g）。
C-2. 取C-1所提供之正丁醇層萃取物（共10.4 g），以Diaion HP-20為層析材料進行層析（其中，起始沖提液為純水，並逐漸增加沖提液中的甲醇比例以漸減極性），得到第一劃分層（F1）、第二劃分層（F2）、及第三劃分層（F3）。
C-3. 取C-2所提供之第二劃分層（F2），以中壓管柱層析儀（MPLC）進行層析（以水與甲醇之混合溶劑作為沖提液，水：甲醇=9：1）後，以TLC點片（TLC aluminium sheets；silica gel 60 F254，0.25 mm）合併，得到F2-1至F2-5五個次劃分層。取次劃分層F2-3，以矽膠管柱層析法進行層析（以二氯甲烷與甲醇之混合溶劑作為沖提液，二氯甲烷：甲醇=9:1）後，以TLC點片（TLC aluminium sheets；silica gel 60 F254，0.25 mm）合併，得到F2-3-1至F2-3-5五個次劃分層，其中，F2-3-2為式（II）化合物（15.2 mg）。另一方面，取次劃分層F2-2，以矽膠管柱層析法進行層析（以二氯甲烷與甲醇之混合溶劑作為沖提液，二氯甲烷：甲醇=12:1），分離得到化合物式（III）化合物（10.3 mg）。
C-4. 取C-2所提供之第三劃分層（F3），以矽膠管柱層析法進行層析（以二氯甲烷與甲醇之混合溶劑作為沖提液，二氯甲烷：甲醇=12:1），得到F3-1至F3-6六個次劃分層。取次劃分層F3-1，以矽膠管柱層析法進行層析（以正己烷與乙酸乙酯之混合溶劑作為沖提液，正己烷：乙酸乙酯=2:1）後，以TLC點片（TLC aluminium sheets； silica gel 60 F254，0.25 mm）合併，得到式（V）化合物（5.2 mg）。另一方面，取次劃分層F3-2，以矽膠管柱層析進行層析（以正己烷與乙酸乙酯之混合溶劑作為沖提液，正己烷：乙酸乙酯=2:1），得到式（I）化合物（3.5 mg）與式（IV）化合物（6.8 mg）。
C-5. 以核磁共振光譜儀與質譜儀分析式（I）至式（V）化合物，並經文獻比對確定其化學構造係如下表1所示，其NMR圖譜分別示於圖1A至圖1E。其中，式（I）至式（V）化合物之化學名稱分別為香草酸、酪醇、鄰苯二酚、苯甲酸和對羥基苯甲醛。 表1
化合物 化學結構式 化學名稱
I
Figure 02_image001
 香草酸（Vanillic acid）
II
Figure 02_image003
 酪醇（Tyrosol）
III
Figure 02_image005
 鄰苯二酚（Catechol）
IV
Figure 02_image007
 苯甲酸（Banzoic acid）
V
Figure 02_image009
 對羥基苯甲醛 （4-hydroxybenzaldehyde）
實施例 1 ：黑米萃取發酵物之 SOD 活性
研究已知，SOD 的活性提升係有助於提升細胞抗氧化能力，因此，若能提升SOD 的活性，即可達到抗肌膚老化的效果。為了解為本發明黑米萃取發酵物之SOD活性，係進行以下測試。
實驗組：包括「黑米萃取物組」、「黑米發酵物組」及「白米發酵物組」，分別取20 μL[製備實施例A-1]所提供之黑米萃取物、[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物、以及[製備實施例B]所提供之白米萃取發酵物作為待測樣品，接著，分別於各組待測樣品依序添加2.35 mL之A液（0.1M Tris-HCl與1mM EDTA）、1.8 mL之H2 O、及0.15 mL之B液（4.5mM磷苯三酚鹽酸溶液）。
空白組：將2.35 mL之A液、1.8 mL之H2 O及0.15 mL之B液依序混合。
添加完B液後，以紫外光-可見光光譜儀（UV/VIS Spectrophotometer）測試各組在第0秒、以及反應1分鐘後的A325 吸光值。
以下式（I）進行「黑米萃取物組」、「黑米發酵物組」及「白米發酵物組」之SOD活性的計算，結果示於圖2及圖3： 公式（I）：
Figure 02_image033
其中，△A325 係「空白組在第0秒的A325 吸光值」與「空白組在反應1分鐘後的A325 吸光值」的差值；△A’325 係「實驗組（即，「黑米萃取物組」、「黑米發酵物組」或「白米發酵物組」）在第0秒的A325 吸光值」與「實驗組在反應1分鐘後的A325 吸光值」的差值；V係待測樣品的體積，單位為毫升（mL）；D係待測樣品的稀釋倍數。
由圖2及圖3可知，無論是相較於「黑米萃取物組」或「白米發酵物組」，「黑米發酵物組」的SOD活性皆明顯較高。前述結果顯示，透過使用本發明發酵方法對黑米萃取物進行發酵，可有效提升SOD活性，另一方面，相較於以白米作為材料所提供之萃取發酵物，以黑米作為材料所提供者確實具有較佳之SOD活性。此說明，本發明黑米萃取發酵物係有助於提升細胞抗氧化能力，可抗肌膚老化，且效果優於白米萃取發酵物。
實施例 2 ： 黑米萃取發酵物於抑制 AGEs 生成效果
於以下實施例中，所使用的物料及器材如下： 1.     200 mM磷酸鹽緩衝液（Sodium phosphate buffer，pH 7.4） 2.     以200 mM磷酸鹽緩衝液配置含有0.06% NaN3 之60毫克／毫升之膠原蛋白 3.     以200 mM磷酸鹽緩衝液配置1.5 M D-果糖 4.     ELISA讀盤機
實驗組： I.         對[製備實施例A-1]所提供之黑米萃取物、[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物、以及[製備實施例B]所提供之白米萃取發酵物各取0.4毫升，分別作為「黑米萃取物組」、「黑米發酵物組」及「白米發酵物組」的待測樣品，並分別與膠原蛋白溶液（0.4毫升）、及果糖溶液（0.4毫升）均勻混合，以提供三種混合溶液； II.      取0.1毫升步驟I 提供之的混合溶液，並偵測其於激發光波長360 nm及放射光波長460 nm之螢光強度，各組皆重複進行三次前述螢光偵測步驟，並將所獲得之螢光強度分別進行平均，以獲得平均螢光值（此稱為「實驗組0小時之螢光值」）； III.   將步驟I 提供之混合溶液置於50°C下反應24小時，使溶液中的膠原蛋白發生醣化反應，以提供三種醣化反應溶液；以及 IV.  取0.1毫升步驟III 提供之的醣化反應溶液，並偵測其於激發光波長360 nm及放射光波長460 nm之螢光強度，各組皆重複進行三次前述螢光偵測步驟，並將所獲得之螢光強度分別進行平均，以獲得平均螢光值（此稱為「實驗組24小時之螢光值」）。
B. 控制組： i.          取0.4毫升的水，與膠原蛋白溶液（0.4毫升）及果糖溶液（0.4毫升）均勻混合，以提供一混合溶液； ii.          取0.1毫升步驟i 提供之混合溶液，並偵測其於激發光波長360 nm及放射光波長460 nm之螢光強度，重複進行三次前述螢光偵測步驟，並將所獲得之螢光強度分別進行平均，以獲得平均螢光值（此稱為「控制組0小時之螢光值」）； iii.      將步驟i 提供之混合溶液置於50°C下反應24小時，使溶液中的膠原蛋白發生醣化反應，以提供一醣化反應溶液；以及 iv.   取0.1毫升步驟iii 提供之醣化反應溶液，並偵測其於激發光波長360 nm及放射光波長460 nm之螢光強度，重複進行三次前述螢光偵測步驟，並將所獲得之螢光強度分別進行平均，以獲得平均螢光值（此稱為「控制組24小時之螢光值」）。
其後，經由下式（II）計算各實驗組之抗醣化活性（%），結果示於圖4及圖5。
Figure 02_image035
由圖4及圖5可知，無論是相較於「黑米萃取物組」或「白米發酵物組」，「黑米發酵物組」的抗醣化效果皆顯著較佳。前述結果顯示，透過使用本發明發酵方法對黑米萃取物進行發酵，可有效提升其於抗醣化（抑制AGEs生成）的效果，另一方面，相較於以白米作為材料所提供之萃取發酵物，以黑米作為材料所提供者確實具有較佳之抗醣化（抑制AGEs生成）效果。此說明，本發明黑米萃取發酵物可透過抑制AGEs生成，達到緊緻皮膚、提升肌膚彈力、抗皺、抗肌膚老化的效果，且效果優於白米萃取發酵物。
實施例 3 ：黑米萃取發酵物之保濕多糖含量
已知保濕多糖具有保持肌膚水分的效果，為了解本發明黑米萃取發酵物是否具有較高之保濕多糖含量，係進行以下保濕多糖含量測試。
標準曲線繪製： I.                   取10毫克葡萄糖置於10毫升之容器中，並以ddH2 O將其配置為1毫克／毫升葡萄糖溶液； II.                以ddH2 O將步驟I提供之葡萄糖溶液系列稀釋為0、20、50、100、150、200微克／毫升之葡萄糖溶液； III.             取步驟II所提供之葡萄糖溶液（各濃度取100微升），分別置於玻璃試管中； IV.            於各玻璃試管中加入500微升之5%苯酚溶液、以及2.5毫升硫酸溶液（95.5%），漩渦混合後靜置20分鐘，以提供六組混合溶液； V.               取步驟IV所提供之各組混合溶液（各組取200微升），置於96孔盤中，測量在490nm下的吸光值，並繪製標準曲線。
實驗組： i.              對[製備實施例A-1]所提供之黑米萃取物、[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物、以及[製備實施例B]所提供之白米萃取發酵物各取100微升，分別作為「黑米萃取物組」、「黑米發酵物組」及「白米發酵物組」的待測樣品，並分別置於玻璃試管中； ii.              於各玻璃試管中分別加入500微升之5%苯酚溶液、以及2.5毫升硫酸溶液（95.5%），漩渦混合後靜置20分鐘，以提供三組混合溶液； iii.              取步驟ii所提供之各組混合溶液（各取200微升），置於96孔盤中，以ELISA讀盤機測量在490nm下的吸光值，並經由內差法計算[製備實施例A-1]所提供之黑米萃取物、[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物、以及[製備實施例B]所提供之白米萃取發酵物的保濕多糖含量，結果示於圖6及圖7。
由圖6及圖7可知，無論相較於「黑米萃取物組」或「白米發酵物組」，「黑米發酵物組」的保濕多糖含量皆明顯較高。前述結果顯示，透過使用本發明發酵方法對黑米萃取物進行發酵，可有效提升保濕多糖含量，另一方面，相較於以白米作為材料所提供之萃取發酵物，以黑米作為材料所提供者確實具有較高之保濕多糖含量、有助於提升皮膚的保濕能力。此說明，本發明黑米萃取發酵物可用於保濕，且效果優於白米萃取發酵物。
實施例 4 ：黑米萃取發酵物於提升皮膚水通道蛋白表現的效果
水通道蛋白為皮膚細胞之細胞膜上負責主動運輸水分的通道，相較於一般的水分擴散作用，水通道蛋白可以更快速的補充皮膚細胞的水分。為了解本發明黑米萃取發酵物是否可提升皮膚細胞中水通道蛋白的表現，係進行以下之水通道蛋白螢光染色實驗。
於以下實施例中，所使用的物料及器材如下： 1.     細胞株：人類初代皮膚角質形成細胞（human primary epidermal keratinocytes HPEK-50，購自CELLnTEC）。 2.     培養基：Keratinocyte-SFM (1X)，購自Thermo。 3.     一級抗體：Polyclonal anti-AQP3 antibody，購自Boster immunoleader。 4.     二級抗體：Anti-mouse-alexa 488 antibody，購自Thermo。 5.     赫斯特（Hoechst）染劑：Hoechst 33342，購自Thermo。 6.     Triton X-100：購自Sigma。 7.     BSA：購自Bio Basic Inc.。 8.     10%甲醛：購自ECHO。
將HPEK-50細胞株分為三組（每組2x103 個細胞），分別植入不同之細胞培養玻片（Chamber Slide）中，並分別以如下培養基培養過夜： 1.     控制組：培養基。 2.     黑米萃取物組：含有4%[製備實施例A-1]所提供之黑米萃取物的培養基。 3.     黑米發酵物組：含有4%[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物的培養基。
對上述各組所提供之細胞進行以下處理：在室溫下，以4%三聚甲醛固定細胞15分鐘；以1xPBS潤洗細胞三次後，再添加0.5%之Triton X-100以滲透細胞，並於室溫下培養10分鐘；添加1%BSA，並於室溫下反應1小時以封閉（blocking）反應；以1xPBS潤洗細胞三次後，再添加經1%BSA稀釋之一級抗體，並於37°C下培養2小時；以1xPBS潤洗細胞三次後，再添加經1%BSA稀釋之二級抗體，並於37°C下培養1小時；以1xPBS潤洗細胞三次後，再添加赫斯特（Hoechst）染劑，並於室溫下培養3至5分鐘；以1xPBS潤洗細胞三次後，以封片膠封片，並於螢光顯微鏡下觀察玻片及拍照。結果示於圖8（藍色螢光部分為細胞核；綠色螢光部分為水通道蛋白）。
由圖8可知，無論是相較於「控制組」或「黑米萃取物組」，「黑米發酵物組」之細胞的水通道蛋白表現量皆明顯較高。前述結果顯示，本發明黑米萃取發酵物確實具有提升水通道蛋白表現量的效果、有助於提升皮膚的保濕能力。此再次說明，本發明黑米萃取發酵物可用於保濕。
實施例 5 ：黑米萃取發酵物於緊緻皮膚的效果
本實施例係以細胞實驗模擬皮膚組織生長的狀況，其中，若一待測物可使皮膚組織生長得越緊密（即，使組織形成的面積變小、膠原蛋白密度提升），代表該待測物具有越高的緊緻皮膚效果。
於以下實施例中，所使用的物料及器材如下： 1.       細胞株：人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966sk（BCRC No. 60153）。 2.       培養基：90%Earle's平衡鹽溶液中的MEM培養基（Minimum essential medium (Eagle) in Earle's BSS），含0.1 mM非必要胺基酸（non-essential amino acids）、1.5克／升碳酸氫鈉及1 mM丙酮酸鈉、以及10%胎牛血清；購自Gibco。 3.       PBS：購自Gibco。 4.       第一型膠原蛋白（Collagen I）：購自Gibco。 5.       NaOH。
將CCD-966sk細胞株分為三組（每組2x105 個細胞），分別添加至不同的滅菌管中，並於各管添加濃度為3毫克／毫升之膠原蛋白溶液，以提供三組混合溶液（其中，各組之細胞懸浮液與膠原蛋白溶液的體積百分比為0.66：0.33（細胞懸浮液：膠原蛋白溶液））。接著，快速於各組混合溶液中添加少量1莫耳濃度之NaOH（可將酚紅培養基指示劑（phenol red media indicator）轉變為淡粉紅色的量），並上下吸取混合。其後，取前述混和均勻的溶液（各組取500微升）置於24孔盤（每孔1.9平方公分）中，將孔覆蓋後置於室溫下20分鐘，以獲得膠原蛋白膠。
於前述孔中，分別加入500微升以下培養基： 1.         控制組：培養基。 2.         黑米萃取物組：含有4%[製備實施例A-1]所提供之黑米萃取物的培養基。 3.         黑米發酵物組：含有4%[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物的培養基。
然後，以200微升移液管的尖端輕輕將膠原蛋白膠自孔中分離、並重新懸浮。將24孔盤置於37°C、加濕的5% CO2 下培養48小時。最後，將24孔盤置於光箱上，並以數位相機於該24孔盤的上方進行拍照。以ImageJ軟體追蹤各膠原蛋白膠的輪廓，並計算各膠原蛋白膠的表面積，照片圖示於圖9（其中，黃色線為「控制組」膠原蛋白膠的輪廓、藍色線為「黑米萃取物組」膠原蛋白膠的輪廓、紅色線則為「黑米發酵物組」膠原蛋白膠的輪廓）。最後，以「控制組」的結果為基準（即，將控制組的膠原蛋白密度設定為100%），計算其他各組的相對膠原蛋白密度。數據使用Excel軟體進行統計分析，以學生t（student’s t-test）檢驗是否達到統計學上的顯著性。結果示於圖10。
由圖9及圖10可知，無論是相較於「控制組」或「黑米萃取物組」，「黑米發酵物組」細胞之膠原蛋白膠表面積皆明顯較小、膠原蛋白密度較高。前述結果顯示，本發明黑米萃取發酵物確實具有緊緻皮膚的效果。
實施例 6 ：人體實驗
（ 6-1 ）使用黑米萃取發酵物面膜之短期試驗
本實驗採自身對照方式進行，招集五位受試者（25至55歲之健康男性／女性），將每位受試者之手臂內側分成二區，分別貼敷黑米萃取發酵物面膜（以面膜中精華液之總重計，係含有1%[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物）、及安慰劑面膜（與黑米萃取發酵物面膜之差異僅在於，不含本發明黑米萃取發酵物）。貼敷20分鐘後，將面膜取下、以指腹稍加按摩促進吸收，並於第0分鐘（使用前）及第20分鐘（使用後），以DermaLab® Combo Skin Analyzer肌膚分析儀進行肌膚含水量、肌膚鬆弛度、及肌膚彈力測定並記錄。接著，以第0分鐘之結果作為基準（即，將第0分鐘設定為100%）計算20分鐘後的肌膚含水量、肌膚鬆弛度、及肌膚彈力。結果示於圖11至圖13。
由圖11至圖13可知，相較於使用安慰劑面膜，在使用黑米萃取發酵物面膜20分鐘後，受試者的肌膚含水量、及肌膚彈力明顯提升，且肌膚鬆弛度明顯降低。前述結果顯示，本發明之黑米萃取發酵物具有在短時間內達到提升肌膚含水量、提升肌膚彈性、及緊緻肌膚的效果。
（ 6-2 ）食用黑米萃取發酵物之長期試驗
本實驗採自身對照方式進行，招集九位受試者（25至60歲之肌膚鬆弛的男性／女性），每日飲用一瓶（5毫升）黑米萃取發酵物飲料（以飲料之總重計，係含有10%[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物），持續4週。分別於第0週（飲用含有本發明黑米萃取發酵物的飲料前）及第4週（飲用含有本發明黑米萃取發酵物的飲料後），以DermaLab® Combo Skin Analyzer肌膚分析儀、及VISIA® Skin Analysis System全臉儀進行測定並記錄。接著，以學生t檢驗（Student t-test）進行統計分析，並以第0週之結果作為基準（即，將第0週設定為100%）計算飲用含有本發明黑米萃取發酵物的飲料4週後的肌膚含水量、肌膚彈力、肌膚鬆弛度、及肌膚皺紋，結果示於圖14至圖17。圖18所顯示者為其中二個受試者的肌膚皺紋照片圖。
由圖14至圖18可知，在連續飲用含有本發明黑米萃取發酵物的飲料4週後，受試者的肌膚含水量、及肌膚彈力明顯提升，且肌膚鬆弛度、及肌膚皺紋明顯降低。前述結果顯示，本發明之黑米萃取發酵物確實具有保濕、提升肌膚彈力、緊緻肌膚、及抗皺的效果。
實施例 7 ：本發明化合物於促進膠原蛋白分泌的效果
於以下實施例中，所使用的物料及器材如下： 1.         細胞株：人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966Sk，購自ATCC®，型號CRL-1881。 2.         培養基：含有10%FBS、1%青黴素／鏈黴素、及1 mM丙酮酸鈉之MEM培養基，購自Gibco。 3.         PBS：購自Gibco。 4.         可溶性膠原蛋白檢測套組（Sircol™ Soluble Collagen Assay kit）：購自Biocolor。 5.         ELISA讀盤機：購自BioTek。
將CCD-966Sk細胞株分成六組（每組2x104 個細胞），並分別植入24孔盤中（每孔中含有500微升之培養基）。於37°C下培養24小時後，以PBS清洗細胞，接著，將各組細胞分別於以下培養基中48小時： 1.         控制組：培養基（共500微升）。 2.         第I組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（I）化合物的培養基（共500微升）。 3.         第II組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（II）化合物的培養基（共500微升）。 4.         第III組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（III）化合物的培養基（共500微升）。 5.         第IV組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（IV）化合物的培養基（共500微升）。 6.         第V組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（V）化合物的培養基（共500微升）。
接著，對上述各組所提供之細胞進行以下處理：分別將各組之培養基移至1.5毫升之微離心管中；於各管中添加200微升之膠原蛋白分離及濃縮試劑（Collagen Isolation & Concentration Reagent），並倒置該等離心管6-8次，然後將該等離心管置於4°C下過夜；之後，以12000rmp離心10分鐘，並移除上清液；添加1000微升之Sircol染劑後，輕輕搖晃30分鐘；再次以12000rmp離心10分鐘，並移除上清液；然後，添加750微升之酸鹼清洗劑（acid-salt washing reagent），並以12000rmp離心10分鐘；移除上清液後，將離心管倒置以排空液體，並以棉花棒移除剩餘之液體；最後，添加250微升之鹼劑（Alkali reagent），並混和均勻，再以ELISA讀盤機讀取555nm之吸光值；以學生t檢驗（Student t-test）進行統計分析，並以「控制組」作為基準（即，將控制組的膠原蛋白分泌量設定為100%）計算「第I組」至「第V組」的相對膠原蛋白分泌量。結果示於第19圖。
由圖19可知，相較於「控制組」，「第I組」至「第III組」、及「第V組」細胞的膠原蛋白分泌量皆明顯提升。前述結果顯示，式（I）至式（III）及式（V）化合物確實具有提升肌膚彈力、緊緻皮膚、以及抗皺的效果。
實施例 8 ：本發明化合物於促進彈力蛋白表現的效果
於以下實施例中，所使用的物料及器材如下： 1.         細胞株：人類皮膚纖維母細胞（Human skin fibroblast）CCD-966Sk，購自ATCC®，型號CRL-1881。 2.         培養基：含有10%FBS、1%青黴素／鏈黴素、及1 mM丙酮酸鈉之MEM培養基，購自Gibco。 3.         PBS：購自Gibco。 4.         彈力蛋白檢測套組（Fastin™ Elastin Assay kit）：購自Biocolor。 5.         ELISA讀盤機：購自BioTek。
將CCD-966Sk細胞株分成六組（每組1x105 個細胞），分別植入6孔盤中後，於37°C下培養24小時。接著，將各組細胞分別於以下培養基中48小時： 1.       控制組：培養基（共2毫升）。 2.       第I組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（I）化合物的培養基（共2毫升）。 3.       第II組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（II）化合物的培養基（共2毫升）。 4.       第III組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（III）化合物的培養基（共2毫升）。 5.       第IV組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（IV）化合物的培養基（共2毫升）。 6.       第V組：含有20微克／毫升[製備實施例C]所提供之式（V）化合物的培養基（共2毫升）。
接著，對上述各組所提供之細胞進行以下處理：移除培養基，並以1xPBS清洗細胞一次；以胰蛋白酶處理細胞3分鐘；接著，以培養基停止胰蛋白酶之活性；將經胰蛋白酶處理之細胞轉移至1.5毫升之微離心管中，以300xg離心5分鐘；以PBS潤洗細胞後，再以300xg離心5分鐘；之後，將細胞顆粒（pellet）保留在300微升之PBS中，並於其中添加100微升之1.0M 草酸（oxalic acid），再於100°C下培養1小時；添加等量彈性蛋白沉澱劑（Elastin Precipitating Reagent）至各管，均勻混和後靜置15分鐘；以10,000xg離心10分鐘，並將管中的液體排空；接著，添加1毫升染劑，混和均勻後於震盪器上培養90分鐘；將未結合的染劑排空後，可見到彈性蛋白係成紅棕色，並沉澱於管底；於各管加入250微升之染劑解離劑（Dye Dissociation Reagent），並藉由漩渦混合器將染劑釋放至溶液中；將溶液移至96孔盤中，並以ELISA讀盤機讀取513nm之吸光值；最後，以學生t檢驗（Student t-test）進行統計分析，並以「控制組」作為基準（即，將控制組的彈力蛋白表現量設定為100%）計算「第I組」至「第V組」的相對彈力蛋白表現量。結果示於第20圖。
由圖20可知，相較於「控制組」，「第I組」至「第V組」細胞的彈力蛋白表現量皆明顯提升。前述結果顯示，式（I）至式（V）化合物確實具有提升肌膚彈力、緊緻皮膚、以及抗皺的效果。
實施例 9 ：黑米萃取物發酵前後，本發明化合物的含量變化
取[製備實施例A-1]所提供之黑米萃取物、以及[製備實施例A-4]所提供之黑米萃取發酵物，分別配置成濃度為20毫克／毫升之樣品溶液。接著，各取10微升之樣品溶液，並以HPLC對其成分進行分析。其中，HPLC所使用的分析管柱為Octadecylsilyl, Mightysil RP-18 GP 250（250 x 10毫米，5微米），偵測波長為280 nm，以1.0毫升／分鐘之流速沖提，沖提液之組成係如下表1所示： 表1：
時間（分鐘） 流動相A（%） 流動相B（%）
0 98 2
10 98 2
40 30 70
50 0 100
60 0 100
62 98 2
70 98 2
*A：水+0.1%甲酸；B：甲醇+0.1%甲酸。
經上述步驟分析所得之HPLC指紋圖譜示於圖21，其中，上方圖係顯示黑米萃取發酵物的HPLC指紋圖譜、下方圖係顯示黑米萃取物的HPLC指紋圖譜。由圖21可知，相較於黑米萃取物，以本發明發酵方法製得之黑米萃取發酵物具有黑米萃取物所沒有的式（I）至式（III）化合物、且具有較高的式（IV）及式（V）化合物含量。前述結果顯示，本發明製備黑米萃取發酵物的方法確實可以有效提升黑米萃取物中活性成分的含量。
如上述實施例所示，本發明黑米萃取發酵物、以及式（I）至式（V）化合物確實可有效抑制AGEs生成、抗氧化、提升水通道蛋白表現、緊緻肌膚、提升膠原蛋白分泌量、及提升彈力蛋白表現量，故可用於抗肌膚老化、保濕、抗皺、提升肌膚彈力、及緊緻皮膚。此外，本發明製備黑米萃取發酵物的方法確實可以有效提升黑米萃取物中活性成分的含量。
圖1A至圖1E所示分別為式（I）至式（V）化合物之NMR圖譜；
圖2所示為「黑米萃取物組」及「黑米發酵物組」之SOD活性，其中「黑米萃取物組」之反應溶液含有黑米萃取物，「黑米發酵物組」之反應溶液則含有黑米萃取發酵物；
圖3所示為「白米發酵物組」及「黑米發酵物組」之SOD活性，其中「白米發酵物組」之反應溶液含有白米萃取發酵物，「黑米發酵物組」之反應溶液則含有黑米萃取發酵物；
圖4所示為「黑米萃取物組」及「黑米發酵物組」之抗醣化活性，其中「黑米萃取物組」之反應溶液含有黑米萃取物，「黑米發酵物組」之反應溶液則含有黑米萃取發酵物；
圖5所示為「白米發酵物組」及「黑米發酵物組」之抗醣化活性，其中「白米發酵物組」之反應溶液含有白米萃取發酵物，「黑米發酵物組」之反應溶液則含有黑米萃取發酵物；
圖6所示為「黑米萃取物組」及「黑米發酵物組」之保濕多糖含量，其中「黑米萃取物組」之反應溶液含有黑米萃取物，「黑米發酵物組」之反應溶液則含有黑米萃取發酵物；
圖7所示為「白米發酵物組」及「黑米發酵物組」之保濕多糖含量，其中「白米發酵物組」之反應溶液含有白米萃取發酵物，「黑米發酵物組」之反應溶液則含有黑米萃取發酵物；
圖8所示為於顯微鏡下所拍攝之經染色的人類初代皮膚角質形成細胞（藍色螢光部分為細胞核；綠色螢光部分為水通道蛋白；比例尺為100微米），包括「控制組」、「黑米萃取物組」及「黑米發酵物組」的結果，其中「控制組」之人類初代皮膚角質形成細胞係培養於不含黑米萃取物及黑米萃取發酵物之培養基，「黑米萃取物組」之人類初代皮膚角質形成細胞係培養於含有黑米萃取物之培養基，「黑米發酵物組」之人類初代皮膚角質形成細胞則培養於含有黑米萃取發酵物之培養基；
圖9所示為以相機拍攝之膠原蛋白膠，包括「控制組」、「黑米萃取物組」及「黑米發酵物組」的結果（黃色線為「控制組」膠原蛋白膠的輪廓、藍色線為「黑米萃取物組」膠原蛋白膠的輪廓、紅色線為「黑米發酵物組」膠原蛋白膠的輪廓），其中「控制組」之膠原蛋白膠係經不含黑米萃取物及黑米萃取發酵物之培養基處理，「黑米萃取物組」之膠原蛋白膠係經含有黑米萃取物之培養基處理，「黑米發酵物組」之膠原蛋白膠則係經含有黑米萃取發酵物之培養基處理；
圖10所示為以上述「控制組」膠原蛋白膠的結果為基準，「黑米萃取物組」及「黑米發酵物組」之膠原蛋白膠的相對膠原蛋白密度（**係表示相較於控制組的p值＜0.01）；
圖11至圖13係分別顯示以貼敷方式使用本發明黑米萃取發酵物於提升肌膚含水量、降低肌膚鬆弛度、及提升肌膚彈力的效果，包括「安慰劑（不含黑米萃取發酵物之面膜）」、及「黑米發酵物（含黑米萃取發酵物之面膜）」的結果；
圖14至圖17係分別顯示以口服方式使用本發明黑米萃取發酵物於提升肌膚含水量、提升肌膚彈力、降低肌膚鬆弛度、及降低肌膚皺紋的效果，包括「第0週（飲用含有本發明黑米萃取發酵物的飲料前）」及「第4週（飲用含有本發明黑米萃取發酵物的飲料後）」的結果（*係表示相較於第0週的p值＜0.05）；
圖18所示為以相機拍攝之二受試者的肌膚皺紋照片圖，包括「第0週（飲用含有本發明黑米萃取發酵物的飲料前））」及「第4週（飲用含有本發明黑米萃取發酵物的飲料後）」的結果；
圖19所示為「控制組」、「第I組」、「第II組」、「第III組」、「第IV組」、及「第V組」之人類皮膚纖維母細胞的相對膠原蛋白分泌量，其中「控制組」細胞係培養於不含本發明化合物之培養基，「第I組」至「第V組」之細胞則係分別培養於含有式（I）化合物、式（II）化合物、式（III）化合物、式（IV）化合物、式（V）化合物之培養基（*係表示相較於控制組的p值＜0.05；**係表示相較於控制組的p值＜0.01）；
圖20所示為「控制組」、「第I組」、「第II組」、「第III組」、「第IV組」、及「第V組」之人類皮膚纖維母的相對彈力蛋白表現量，其中「控制組」細胞係培養於不含本發明化合物之培養基，「第I組」至「第V組」之細胞係分別培養於含有式（I）化合物、式（II）化合物、式（III）化合物、式（IV）化合物、式（V）化合物之培養基（*係表示相較於控制組的p值＜0.05；**係表示相較於控制組的p值＜0.01）；
圖21所示為「黑米萃取發酵物」及「黑米萃取物」的HPLC指紋圖譜，其中，上方圖係顯示黑米萃取發酵物的結果、下方圖係顯示黑米萃取物的結果。
Figure 109118692-A0101-11-0002-11

Claims (8)

  1. 一種製備黑米萃取發酵物的方法，其係包含以下步驟：(a)以一極性溶劑萃取黑米以提供一黑米萃取物；(b)使用一釀酒酵母菌BCRC 20271發酵該萃取物，以獲得一中間發酵物；(c)使用一胚芽乳酸桿菌BCRC 910805發酵該中間發酵物，以獲得一黑米萃取發酵物；以及(d)對該黑米萃取發酵物進行過濾及滅菌其中，在不移除所添加之釀酒酵母菌及胚芽乳酸桿菌的情況下，步驟(c)所提供之黑米萃取發酵物係符合糖度範圍<4°、pH值為2-4、酒精>5%之規格。
  2. 如請求項1之方法，其中更於步驟(a)使用一澱粉酶。
  3. 一種組成物，其係包含一黑米萃取發酵物，該黑米萃取發酵物係由如請求項1或2之方法所提供者。
  4. 如請求項3之組成物，其中該黑米萃取發酵物係含有以下式(I)至式(V)化合物之至少一者：
    Figure 109118692-A0305-02-0035-1
  5. 如請求項3之組成物，其係一醫藥組成物、食品組成物或保養品組成物。
  6. 一種使用一活性成分於保濕、抗皺、提升肌膚彈力、及/或緊緻皮膚的用途，其中該活性成分係由如請求項1或2之方法所提供的黑米萃取發酵物。
  7. 如請求項6之用途，其中該活性成分係以食品組成物或保養品組成物的形式使用。
  8. 一種使用一活性成分於製備一用於抑制AGEs生成、提升水通道蛋白表現、提升膠原蛋白分泌量、及提升彈力蛋白表現量之至少一者之醫藥組成物的用途，其中該活性成分係由如請求項1或2之方法所提供的黑米萃取發酵物。
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