TWI774335B - 苦蕎麥種皮萃取物避免視網膜因藍光照射而受損傷之用途 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種苦蕎麥種皮萃取物用於製備促進抗老化基因表現之組合物之用途。該苦蕎麥種皮萃取物較佳為以水為溶劑對苦蕎麥種皮進行萃取而製得，其能促進CCT、PINK1、SIRT1、及FOXO3等多種抗老化基因之表現，因此預防個體機能衰退與維持健康。
Description
本發明係關於一種植物萃取物的保健用途，特別係關於一種苦蕎麥種皮萃取物用於製備促進抗老化基因表現之用途。
隨著人口平均年齡的延長，擁有健康而高品質的老年生活成為大眾關注的焦點之一，關於老化的科學研究也越發受重視。老化可大致定義為生理機能隨時間而衰退，其與許多流行疾病相關，例如心血管疾病、癌症、代謝疾病、神經退化疾病等。老化的過程複雜而受到諸多因素影響，包括飲食、運動、心理狀態、及遺傳因子。在分子或細胞層次，可能的內部機制包括染色體末端的端粒(telomere)縮短、基因突變、基因表現失調、蛋白質恆定喪失、粒線體功能下降等。此外，細胞周圍環境中由物理或化學因素產生的自由基(如活性氧物質)會損害細胞的染色體去氧核醣核酸(DNA)、蛋白質、及脂質生物膜，因而破壞細胞的機能。
鑒於上述造成老化的因素，抗老化可以從多方面著手，包括改變飲食與運動習慣、保持心情愉快、減少暴露於誘導自由基形成的環境因子(如紫外光)、及促進細胞保護機制的運作(例如促進長壽基因之表現)。其中，促進細胞保護機制的方法正處於發展階段，雖然初步研究成
果顯示其頗具抗老潛力，但其確切效力尚待進一步證實。因此，開發一種能促進細胞保護機制的新穎組合物，為減緩細胞機能衰退與維持細胞健康狀態提供新方向，實有其必要。
緣此，本發明之一目的在提供一種苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)種皮萃取物用於製備提升粒線體活性、促進抗老化基因表現、及抑制蛋白質醣化之組合物之用途，其中該苦蕎麥種皮萃取物係以一溶劑萃取一苦蕎麥種皮而獲得。
在本發明之一實施例中，該溶劑與該苦蕎麥種皮之重量比範圍為20：1至1：1，且該萃取係在50℃至100℃進行。
在本發明之一實施例中，該溶劑為水，且該苦蕎麥種皮萃取物之濃度為0.125mg/mL至0.25mg/mL，較佳為0.125mg/mL。
在本發明之一實施例中，該抗老化基因編碼一伴隨蛋白T複合體(chaperonin containing TCP1 complex，CCT)之蛋白次單元，其係選自於由CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及其任意組合所組成的群組。
在本發明之一實施例中，該抗老化基因編碼一磷酸酶及張力蛋白同源物誘導激酶1(phosphatase and tensin homolog(PTEN)-induced putative kinase 1，PINK1)。
在本發明之一實施例中，該抗老化基因編碼一受藍光照射細胞內之一沉默信息調節因子2同源蛋白1(silent mating type information
regulation 2 homolog 1或sirtuin 1，SIRT1)或一叉頭框蛋白O3(forkhead box class O 3，FOXO3)。
本發明苦蕎麥種皮萃取物能提升粒線體活性及促進數種人類細胞中與抗老化相關的多種基因表現，例如活化血管內皮細胞之粒腺體活性，及提升臍帶靜脈內皮細胞、人類視網膜細胞、人類纖維母細胞與人類週邊血液單核球之抗老化相關基因群之基因表現量，並且能減少醣化蛋白質生成，最終達到預防個體機能衰退與維持健康的功效。因此，本發明提供苦蕎麥種皮萃取物用於製備提升粒線體活性、促進抗老化基因表現、及抑制蛋白質醣化之組合物之用途。該組合物可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體，且可製成食品、飲品、醫藥品、或營養補充劑，藉由口服、皮膚塗抹等方式給予一個體。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1顯示人類臍帶靜脈內皮細胞在有或無苦蕎麥種皮萃取物處理24小時後，具有正常值粒線體膜電位的細胞百分比。
圖2顯示經藍光照射之人類視網膜色素上皮細胞在有或無苦蕎麥種皮萃取物處理48小時後，相對於控制組細胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、PINK1、ATG8、SIRT1及FOXO3基因之相對表現量。
圖3顯示人類皮膚纖維母細胞在有或無苦蕎麥種皮萃取物處理48小時後，相對於控制組細胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及PINK1基因之相對表現量。
圖4顯示人類外周血單核細胞在有或無苦蕎麥種皮萃取物處理48小時後，相對於控制組細胞的CCT2及CCT5基因之相對表現量。
圖5顯示人類臍帶靜脈內皮細胞在有或無苦蕎麥種皮萃取物處理48小時後，相對於控制組細胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及PINK1基因之相對表現量。
圖6顯示不同濃度苦蕎麥種皮萃取物對膠原蛋白醣化的抑制作用。
本發明提供一種苦蕎麥種皮萃取物用於製備提升粒線體活性、促進抗老化基因表現、及抑制蛋白質醣化之組合物之用途。本發明之苦蕎麥種皮萃取物係以一溶劑萃取一苦蕎麥種皮而獲得，其中，該溶劑較佳為水，該溶劑與該苦蕎麥種皮之重量比為20：1至1：1，且該萃取係在50℃至100℃進行。該苦蕎麥種皮萃取物處理經下列實施例證實能提升人類細胞之粒線體活性及減少膠原蛋白醣化終產物生成。此外，基於基因表現定量分析結果，該苦蕎麥種皮萃取物促進臍帶靜脈內皮細胞、人類視網膜細胞、人類纖維母細胞與人類週邊血液單核球之抗老化相關基因群之基因表現量。該些抗老化基因編碼之蛋白質包括伴隨蛋白T複合體(CCT)之
蛋白次單元、磷酸酶及張力蛋白同源物誘導激酶1(PINK1)、沉默信息調節因子2同源蛋白1(SIRT1)及叉頭框蛋白O3(FOXO3)。
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本文中所謂「抗老化基因」泛指其存在與生物體長壽相關或其蛋白質產物之作用可維持細胞正常功能的基因。該抗老化基因所編碼蛋白質之作用包括協助其他蛋白質摺疊，使粒線體正常運作，及調控參與養分代謝或細胞壓力反應之蛋白的基因表現等。
以下實施例使用購自美國典型培養物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)或食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center，BCRC)之人類臍帶靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC，BCRC H-UV001或ATCC CRL-1730)、人類視網膜色素上皮細胞ARPE-19(ATCC CRL-2302)、及人類皮膚纖維母細胞(human skin fibroblast)CCD-966SK(BCRC 60153)。人類外周血單核細胞(peripheral mononuclear mononuclear cell，PBMC)係分離自捐贈者血液。所有細胞皆培養於37℃、5%二氧化碳的條件。HUVEC細胞培養於添加10%低血清生長添加劑(low serum growth supplement，LSGS；Thermo Fischer Scientific)之M200培養基(Medium 200；Thermo Fischer Scientific)，以
下稱M200細胞培養基。ARPE-19細胞培養於DMEM培養基(Dulbecco's modified Eagle’s medium；Thermo Fischer Scientific)與漢氏F12培養基(Ham’s F12 medium；Thermo Fischer Scientific)依1：1體積比混和之DMEM/F12培養基，其中添加0.5mM丙酮酸鈉、15mMHEPES緩衝溶液、及10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，以下稱DMEM/F12細胞培養基。CCD-966SK細胞培養於添加10% FBS及1%青黴素-鏈黴素之最低基礎培養基(Minimum Essential Medium(MEM)；Thermo Fischer Scientific)，以下稱MEM細胞培養基。PBMC細胞培養於添加10% FBS及1%青黴素-鏈黴素之RPMI培養基(RPMI medium 1640；Thermo Fischer Scientific)，以下稱RPMI細胞培養基。
為評估細胞的粒線體活性，利用流式細胞儀(flow cytometer；BD Accuri)及粒線體膜電位檢測套組(BDTMMitoScreen)測定粒線體膜電位改變之細胞群體占比，其步驟簡述如下。依據廠商使用說明，以磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS；Thermo Fischer Scientific)潤洗待測細胞，再將細胞收集至1.5mL微量離心管及進行離心(400xg，5分鐘)。經移除上清液，以PBS溶液再懸浮細胞並且再次離心(400xg，5分鐘)。將沉澱之細胞與100μLJC-1操作溶液在暗處均勻混合15分鐘以進行螢光標記，再以清洗溶液及離心步驟(400xg，5分鐘)清洗細胞2次。最終，將細胞再懸浮於含2% FBS之PBS溶液，使用流式細胞儀計數粒線體膜電位為正常值的細胞百分比。
基於定量聚合酶鏈鎖反應(quantitative polymerase chain reaction，簡稱qPCR)測定細胞中抗老化基因的表現量，其步驟簡述如下。依據廠商使用說明，利用RNA萃取套組(RNA Extraction Kit；Geneaid)自細胞分離出RNA，於37℃下以反轉錄酶SuperScript® III Reverse Transcriptase(Invitrogen)將2000ng RNA反轉錄為cDNA。其後，藉由目標基因與作為內部對照之甘油醛3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因之引子對(表1)，利用qPCR套組(KAPA CYBR FASTqPCR Kit(2X)；KAPA Biosystems)在PCR反應儀(StepOnePlus Real-Time PCR system；Applied Biosystems)對前述cDNA進行qPCR，以取得解鏈曲線(melting curve)。
最終，使用2-△△CT方法測定目標基因的相對表現量。該方法以GAPDH基因的循環閾值(CT)作為內部對照之參考基因的循環閾值，按照以下公式計算相對倍數變化：△CT=實驗組或控制組的目標基因的CT-內部對照的CT △△CT=實驗組的△CT-控制組的△CT倍數變化=2-△△Ct平均值
統計分析係使用Excel軟體中的STDEV函數計算各基因相對表現量的標準差，並以單尾學生T檢驗(TTEST)計算統計上差異。
首先，洗淨及乾燥苦蕎麥全穀的外殼，即苦蕎麥種皮，及使用粉碎機將其粉碎。苦蕎麥種皮粉碎物可選擇性以10目(mesh)篩網過濾。其次，以水為溶劑對苦蕎麥種皮粉碎物進行萃取。該溶劑與該苦蕎麥種皮粉碎物混合之重量比範圍為20：1至1：1。萃取溫度為介於50℃至100℃，較佳為80℃至90℃。以下實施例2-4中苦蕎麥種皮萃取物皆為以水萃取，萃取時間為0.5至3小時。
經上述萃取步驟所得苦蕎麥種皮萃取物冷卻至室溫後，可於5000rpm之轉速離心10分鐘，再以400目之濾網過濾，以移除殘餘固體
物。該過濾後的苦蕎麥種皮萃取物可進一步在45℃至70℃進行減壓濃縮而獲得一濃縮產物。為獲得固態的苦蕎麥種皮萃取物，可將前述經濃縮的苦蕎麥種皮萃取物以例如冷凍乾燥、噴霧乾燥之乾燥方式去除溶劑，因此獲得苦蕎麥種皮萃取物之乾燥產物。
粒線體是供給細胞能量的胞器，其正常運作對維持細胞的活力與增殖能力至關重要。為探討苦蕎麥種皮萃取物對粒線體功能的影響，本實施例以流式細胞儀評估人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)經苦蕎麥種皮萃取物處理後，其粒線體活性的變化。首先，將HUVEC細胞依1×105個細胞/孔接種於含有2mLM200細胞培養基的6孔盤的各孔，在37℃下培養24小時。其後，以1mL含0.25mg/mL或0.125mg/mL苦蕎麥種皮萃取物之M200培養基處理細胞(實驗組)，或者僅用M200培養基處理細胞以作為控制組。各組細胞於37℃培養24小時後用於粒線體活性分析。
圖1顯示前述各組HUVEC細胞中粒線體膜電位為正常值者的百分比，其值越高表示具有正常功能粒線體的細胞數目越多；*表示相比控制組為p<0.05，***表示相比控制組為p<0.001。依據圖1，相比控制組細胞，施予0.125mg/mL苦蕎麥種皮萃取物使具有正常功能粒線體的細胞顯著增加，施予0.25mg/mL苦蕎麥種皮萃取物則造成較小幅細胞數增加，此結果說明苦蕎麥種皮萃取物能提高細胞的平均能量產生，使細胞有能力執行特定生理功能或增殖以汰換老舊細胞，因此有益於維持動物或人類個體的健康狀況。
3.1 視網膜色素上皮細胞
為探討苦蕎麥種皮萃取物對抗老化相關基因表現的影響，以qPCR測定人類視網膜色素上皮細胞ARPE-19經苦蕎麥種皮萃取物處理後，其伴隨蛋白T複合體(CCT)次單元、磷酸酶及張力蛋白同源物誘導激酶1(PINK1)、自嗜相關蛋白8(autophagy-related protein 8，ATG8)、沉默信息調節因子2同源蛋白1(SIRT1)及叉頭框蛋白O3(FOXO3)之基因表現變化。簡言之，將細胞依1×105個細胞/孔接種於含有2mL細胞培養基的6孔盤的各孔，在37℃下培養24小時後，移除該細胞培養基並以PBS溶液清洗細胞。其後，以1mL含0.5%(w/v)苦蕎麥種皮萃取物之DMEM/F12細胞培養基處理細胞48小時，再將6孔培養盤置於藍光箱中，於室溫下接受藍光(波長約為425-475nm)照射15分鐘。作為藍光照射組的細胞係以不含苦蕎麥種皮萃取物之DMEM/F12培養基處理並且經藍光照射15分鐘；作為控制組的細胞係以不含苦蕎麥種皮萃取物之DMEM/F12培養基處理但未經藍光照射。最終，收集各組細胞用於qPCR分析。
圖2顯示前述三組ARPE-19細胞相對於控制組細胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、PINK1、ATG8、SIRT1、及FOXO3基因之相對表現量；*及**分別表示相比藍光照射組為p<0.05及p<0.01。依據圖2，相比控制組，藍光照射會降低多數抗老化基因的表現。然而，相比藍光照射組，苦蕎麥種皮萃取物之處理顯著提升ARPE-19細胞中協助蛋白質摺疊之伴隨蛋白T複合體之CCT2、CCT5、及CCT6A次單元
之基因表現，同時顯著增加與長壽相關之SIRT1及FOXO3的基因表現，以及略為增加與粒線體活性相關之PINK與ATG8的基因表現。此結果說明苦蕎麥種皮萃取物能促進多種抗老化基因於藍光照射下之視網膜細胞內合成，因此具有減少該細胞因藍光照射而損傷或死亡的潛力。
3.2 皮膚纖維母細胞
利用qPCR測定人類皮膚纖維母細胞CCD-966SK經苦蕎麥種皮萃取物處理後，其CCT之蛋白次單元及PINK1之基因表現變化。簡言之，將細胞依1×105個細胞/孔接種於含有2mL細胞培養基的6孔盤的各孔，在37℃下培養24小時後，移除該細胞培養基並以PBS溶液清洗細胞。其後，以1mL含0.125mg/mL苦蕎麥種皮萃取物之MEM培養基處理細胞(實驗組)，或者僅以MEM培養基處理細胞以作為控制組。前述二組細胞於37℃培養48小時後用於qPCR分析。
圖3顯示前述二組CCD-966SK細胞相對於控制組細胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及PINK1基因之相對表現量；***表示相比控制組為p<0.001。依據圖3，苦蕎麥種皮萃取物之處理顯著提升CCD-966SK細胞中伴隨蛋白T複合體之CCT2、CCT6A、CCT7、及CCT8次單元之基因表現，同時略為增加CCT5與PINK1基因的表現。此結果說明苦蕎麥種皮萃取物有益於維持皮膚細胞的活力，因此具有延緩肌膚老化的潛力。
3.3 外周血單核細胞
利用qPCR測定人類外周血單核細胞(PBMC)經苦蕎麥種皮萃取物處理後，其CCT之蛋白次單元之基因表現變化。簡言之，將細胞依
1×105個細胞/孔接種於含有2mL細胞培養基的6孔盤的各孔，在37℃下培養24小時後，移除該細胞培養基並以PBS溶液清洗細胞。其後，以1mL含0.125mg/mL苦蕎麥種皮萃取物之RPMI培養基處理細胞(實驗組)，或者僅以RPMI培養基處理細胞以作為控制組。前述二組細胞於37℃培養48小時後用於qPCR分析。
圖4顯示前述二組PBMC細胞相對於控制組細胞的CCT2及CCT5基因之相對表現量；*及***分別表示相比控制組為p<0.05及p<0.001。依據圖4，苦蕎麥種皮萃取物之處理顯著提升CCD-966SK細胞中伴隨蛋白T複合體之CCT2與CCT5次單元之基因表現。此結果指示蕎麥種皮萃取物有助於血液中單核細胞(例如T細胞、B細胞、及單核球)的正常功能。
3.4 血管內皮細胞
利用qPCR測定人類臍帶靜脈內皮細胞(HUVEC)經苦蕎麥種皮萃取物處理後，其CCT之蛋白次單元及PINK1之基因表現變化。簡言之，將細胞依1×105個細胞/孔接種於含有2mL細胞培養基的6孔盤的各孔，在37℃下培養24小時後，移除該細胞培養基並以PBS溶液清洗細胞。其後，以1mL含0.125mg/mL苦蕎麥種皮萃取物之M200培養基處理細胞(實驗組)，或者僅以M200培養基處理細胞以作為控制組。前述二組細胞於37℃培養48小時後用於qPCR分析。
圖5顯示前述二組HUVEC細胞相對於控制組細胞的CCT2、CCT5、CCT6A、CCT7、CCT8、及PINK1基因之相對表現量；*及**分別表示相比控制組為p<0.05及p<0.01。依據圖5，苦蕎麥種皮萃
取物之處理顯著提升HUVEC細胞中伴隨蛋白T複合體之CCT2與CCT5次單元之基因表現，亦顯著增加PINK1基因的表現。此結果說明苦蕎麥種皮萃取物有益於維持血管內皮細胞的活力，因此具有降低血管相關疾病發生率的潛力。
身體內蛋白質的醣化反應會導致蛋白質功能缺失，進而促進老化與相關疾病發生。為探討苦蕎麥種皮萃取物是否能抑制蛋白質醣化，以抗醣化分析測定0.1、0.5、1、或5mg/mL苦蕎麥種皮萃取物對豬膠原蛋白醣化反應的抑制作用。簡言之，利用200mM磷酸鹽緩衝溶液(pH 7.4)配製60mg/mL膠原蛋白溶液(含0.06%疊氮化鈉)及1.5M果糖溶液。為進行膠原蛋白醣化反應，將0.2mL膠原蛋白溶液與0.2mL果糖溶液之混合物與0.2mL各濃度之苦蕎麥種皮萃取物樣品或去離子水(控制組)均勻混合，於50℃反應24小時，再添加胺基胍(aminoguanidine，AG，購自Sigma)以中止醣化反應。使用分光螢光計(spectrofluorometer，FLx 800，BioTek)測量前述反應液(0.1mL)在0小時與24小時的螢光強度(激發波長360nm，放射波長460nm)，並依下列公式計算蛋白質醣化終產物生成率：[(樣品螢光強度24小時-樣品螢光強度0小時)/(控制組螢光強度24小時-控制組螢光強度0小時)]×100%。
圖6顯示不同濃度苦蕎麥種皮萃取物對膠原蛋白醣化的抑制作用。依據圖6，0.1、0.5、1、及5mg/mL苦蕎麥種皮萃取物分別減少
膠原蛋白醣化終產物生成達約8%、52%、69%、81%，顯示苦蕎麥種皮萃取物可降低體內蛋白質的醣化反應，進而延緩老化的進展，例如肌膚老化。
綜上所述，苦蕎麥種皮萃取物能提升粒線體活性及促進數種人類細胞中與抗老化相關的多種基因表現，例如活化血管內皮細胞之粒腺體活性，及提升臍帶靜脈內皮細胞、人類視網膜細胞、人類纖維母細胞與人類週邊血液單核球之抗老化相關基因群之基因表現量，並且能減少醣化蛋白質生成，最終達到預防個體機能衰退與維持健康的功效。因此，本發明提供苦蕎麥種皮萃取物用於製備提升粒線體活性、促進抗老化基因表現、及抑制蛋白質醣化之組合物之用途。該組合物可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體，且可製成食品、飲品、醫藥品、或營養補充劑，藉由口服、皮膚塗抹等方式給予一個體。
<110> 大江生醫股份有限公司
<120> 苦蕎麥種皮萃取物避免視網膜因藍光照射而受損傷之用途
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Claims (4)
- 一種苦蕎麥種皮萃取物用於製備避免視網膜色素上皮細胞因藍光照射而受損傷之組合物之用途，其中該苦蕎麥種皮萃取物可以促進藍光照射下視網膜色素上皮細胞中一基因群表現，該苦蕎麥種皮萃取物係以水萃取一苦蕎麥種皮而獲得；及其中該基因群為編碼伴隨蛋白T複合體(CCT)之CCT2、CCT5、及CCT6A次單元，以及SIRT1基因、FOXO3基因、PINK基因與ATG8的基因其中至少一。
- 如請求項1所述之用途，其中該組合物具有粉末、顆粒、溶液、膠體、或膏體之劑型。
- 如請求項1所述之用途，其中該水與該苦蕎麥種皮之重量比範圍為20：1至1：1。
- 如請求項1所述之用途，其中該萃取係在50℃至100℃進行。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201862696870P | 2018-07-12 | 2018-07-12 | |
| US62/696,870 | 2018-07-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW202130357A TW202130357A (zh) | 2021-08-16 |
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ID=70412738
Family Applications (3)
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| TW110114819A TWI777518B (zh) | 2018-07-12 | 2018-09-26 | 苦蕎麥種皮萃取物延緩肌膚老化之用途 |
Family Applications Before (1)
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Family Applications After (1)
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2018
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 期刊 .... J. Food Sci. Technol Vol.52,no.2 .. February 2015 p.1110-1116; * |
| 期刊 .... 山西師範大學學報(自然科學版) 第23卷第4期 .. 2009 年12月 .. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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