TWI769150B - 糖尿病之治療、類鐸受體第四型調節劑及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於治療糖尿病、類鐸受體第四型(toll-like receptor 4，TLR-4)調節劑及其使用方法。具體而言，本發明提供一種分離自肺炎球菌溶血素的胜肽(PLY peptide)，其能有效治療糖尿病。此外，本發明之PLY胜肽為TLR-4拮抗劑，因此可用於治療與TLR-4活化相關的疾病或病症。本發明亦提供以TLR-4拮抗劑對糖尿病之治療。

Description

糖尿病之治療、類鐸受體第四型調節劑及其使用方法

本申請案主張於2016年3月8日提交的美國臨時申請案號62/305,164的優先權，其全部內容透過引用併入本文。

本發明係關於使用類鐸受體第四型(toll-like receptor 4，TLR-4)調節劑治療糖尿病與其它疾病/病症。具體而言，本發明提供一種分離自肺炎球菌溶血素的胜肽(PLY peptide)，其係有效調節TLR-4活性與治療糖尿病，以及與TLR-4活化相關的其它疾病或病症。

糖尿病是由於胰腺產生之胰島素的缺乏或所產生之胰島素的無效所引起的糖代謝障礙。該疾病導致血液中葡萄糖含量增加，並導致身體的許多組織或器官(如血管及神經)的損傷。

糖尿病有第一型糖尿病和第二型糖尿病兩種形式。第一型糖尿病，亦稱為胰島素依賴性糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)，通常發生於兒童，且患者終生必須施打胰島素。第二型糖尿病，亦稱為非胰島素依賴性糖尿病(non-insulin-dependent diabetes mellitus，NIDDM)，與高脂肪飲食及肥胖症高度相關。有許多用於治療第二型糖尿病的藥物，包括透過排尿降低葡萄糖的藥物，如Invokana (canagliflozin)，為一種鈉-葡萄糖共轉運蛋白2 (sodium-glucose co-transporter 2，SGLT2)抑製劑，係透過排尿釋放身體中過量的葡萄糖；增加胰島素敏感性的藥物，如Glucophage (二甲雙胍)、Actos (吡格列酮)，以及Avandia (羅格列酮)；刺激胰腺產生胰島素的藥物，如磺醯脲與非磺醯脲促分泌素；以及緩慢消化碳水化合物的藥物，如α-葡萄糖苷酶抑製劑與澱粉素類似物和二肽基胜肽酶-4抑製劑(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)。Byetta (艾塞那肽)是一種新開發的可注射藥物，其為類升糖素胜肽-1 (glucagon-like-peptide-1，GLP-1)類似物，且透過增加胰島素從胰腺的釋放而降低血糖。然而，這些抗糖尿病藥物仍然存在一些局限性以及可能的副作用，例如低血糖、體重增加、心血管問題、噁心和腸胃氣脹。因此，仍然需要用於治療糖尿病的替代藥物。迄今為止，還沒有公開使用TLR-4拮抗劑治療糖尿病的報告。

TLR-4是類鐸受體(Toll-like receptor，TLR)家族的成員。它是一種細胞表面跨膜受體，其主要識別細菌脂多醣，並且在活化時在炎症途徑的誘導中具有重要作用。

有越來越多的證據顯示血管細胞中促發炎因子的產生和分泌在動脈粥狀硬化中具有重要作用。細胞間黏附分子1 (Intercellular adhesion molecule 1，ICAM-1)、血管黏附分子1 (vascular adhesion molecule 1，VCAM-1)，以及E-選擇蛋白是主要的生物標誌物，且內皮細胞(endothelial cell，EC)黏附分子，其調節白血球從血流到發炎部位的結合和外滲(Sato J. 等人，PLoS One 9:e107236)。當ECs對細胞激素反應而被活化時，細胞黏附分子在其表面上的表現顯著增加。循環中可溶性細胞黏附分子的出現被認為是從因為增加表現量而活化的ECs表面釋放所造成的結果(Tesfamariam B.等人，Vascul Pharmacol 46:229-237)。幾個報告已經證明可溶形式的黏附分子在第二型糖尿病患者中可能出現的微血管和大血管併發症中的重要性(Herder C.等人，PLoS One 6:e19852; Kalofoutis C.等人，Exp Clin Cardiol 12:17-28)。一些報告顯示，糖尿病(diabetes mellitus，DM)與動脈粥狀硬化和發炎性疾病有關(Kim JA等人，Circulation 113:1888-1904；Orasanu G.等人，J Am Coll Cardiol 53:S35-42)。在糖尿病文件記錄的心血管危險因子中，高血糖似乎是糖尿病血管併發症的獨立危險因子(Monnier L.等人，JAMA 295:1681-1687；Wright RJ等人，Diabetes Metab Res Rev 24:353-363)。

一些報告顯示TLR4功能的喪失部分保護了長期高脂肪飲食中末梢和心臟葡萄糖的代謝紊亂，且TLR4拮抗劑可防止醛固酮誘發的心臟和腎臟損傷(Jackson EE等人，PLoS One 10:e0142077；Zhang Y.等人，PLoS One 10:e0142456)。一些報告還顯示，TLR-4與直腸癌的進展和轉移、胃癌的進展、牙周病和尿道感染有關(Chen TC等人，Cell Microbiol 13：1703-1713；Chrzeszczyk D等人，Adv Clin Exp Med 24:1059-1070)。Lu等人公開了做為TLR4拮抗劑的Rs-LPS對高脂肪飲食所引起的葡萄糖和脂質變化沒有影響，顯示Rs-LPS透過獨立於代謝控制的機制來抑製糖尿病LDLR-/-小鼠的動脈粥狀硬化(Lu Z.等人，Immunobiology 220 (11): 1246-1254)。

肺炎球菌溶血素(Pneumolysin)，一種細胞內巰基活化的毒素，具有溶解細胞和活化補體的特性，是所有肺炎鏈球菌(Streptococcus. pneumoniae )中含有的主要毒力因子之一(Rabes A.等人，Curr Top Microbiol Immunol 397:215-227)。肺炎鏈球菌感染負責誘導由肺炎球菌溶血素造成的炎症，其損害肺部的血管並造成肺部氣腔出血。此外，最近的研究顯示，肺炎球菌溶血素可能是肺炎模型中嗜中性粒細胞跨內皮遷移的化學引誘物(Moreland JG等人，Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 290:L833-840)。

本發明基於不可預期的發現，即來自肺炎球菌溶血素 (pneumolysin，PLY)的截短胜肽移除對細胞的毒性並顯示抗糖尿病活性，包括降低血糖含量與增加胰島素含量。因此，本發明的PLY胜肽可用於治療糖尿病及其併發症。在本發明中進一步發現，截短的PLY胜肽做為類鐸受體第四型(TLR-4)拮抗劑，因此可用於治療與TLR-4活化相關的疾病或病症，例如由於TLR-4活化引起的發炎性疾病，例如動脈粥狀硬化。本發明還提供了以TLR-4拮抗劑治療糖尿病。

於一些方面，本文提供了一種分離的胜肽，包含：(i) 包含QDLTA (SEQ ID NO: 9)的胺基酸模體之第一片段；以及(ii) 包含與SEQ ID NO: 10至少85%相同的胺基酸序列之第二片段。該第一片段的C端連接至該第二片段的N端；且其中該分離的胜肽之長度最多達150個胺基酸。

於一些具體實施例中，該第二片段可包含與SEQ ID NO: 10至少90%相同的胺基酸序列，例如與SEQ ID NO: 10至少95%相同的胺基酸序列。於一些具體實施例中，該第二片段可包括在SEQ ID NO: 10中最多5個胺基酸殘基處的突變。例如，該第二片段可包括在SEQ ID NO: 10的位置19與20中的一個或多個處有一個或多個胺基酸取代。在一些特定實施例中，該第二片段如SEQ ID NO: 10、12、13或14所示。

於一些具體實施例中，該第一片段如SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 9所示。

於一些具體實施例中，本文所述之分離的胜肽包含選自由SEQ ID NOs: 3-7所組成之群組的胺基酸序列。

於另一方面，本案提供包含編碼本文所述之任何胜肽的核苷酸序列的重組核酸。這樣的核酸可以是包含本文所述之編碼序列的載體。在一些實施例中，載體為表現載體。

於另一方面，本文提供了包含本文所述之任何重組核酸的宿主細胞。

可以將任何胜肽或核酸配製成形成組合物，例如醫藥組合物，其進一步包含生理上可接受之載體。

本文還提供了在有需要的個體中治療糖尿病(例如第二型糖尿病)或糖尿病併發症的方法，包含向個體施用有效量的任何胜肽或任何編碼如本文所述之核酸，或包含這些的組合物。於一些情況下，胜肽或核酸的有效量足以降低個體的血糖含量或增加胰島素含量。於一些情況下，個體可能患有更多糖尿病的併發症之一，包括糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性腎病變、糖尿病性神經病變、糖尿病性心血管疾病(例如動脈粥狀硬化)，以及糖尿病性皮膚病。

此外，本文提供了一種用於抑制個體中TLR-4活性的方法，其包含向有需要的個體施用有效量的TLR-4拮抗劑，例如本文所述之任何胜肽。於一些情況下，TLR-4拮抗劑阻斷MD2蛋白與TLR-4的結合。於一些情況下，TLR-4拮抗劑為抗TLR-4抗體。於其他情況下，TLR-4拮抗劑為TLR-4目標的干擾核酸或抑制TLR-4的小分子。

待本文所述方法治療的個體可以是患有或疑似患有與TLR-4活化相關的疾病或病症的人類患者。這種疾病或病症可能是由於TLR4活化引起的發炎性疾病，具體而言是動脈粥狀硬化。於某些情況下，該個體患有糖尿病。於其他情況下，該個體不患有糖尿病。或者或此外，該個體可以是患有或疑似患有糖尿病(例如第二型糖尿病)或其併發症的人類患者。

TLR-4拮抗劑的有效量足以降低個體的血糖含量或增加胰島素含量。

也包含在本案之範圍內的還有，用於治療與TLR-4有關的疾病之醫藥組合物，該組合物包含如本文所述之任何胜肽或編碼該胜肽的核酸，以及醫藥上可接受之載體。這些疾病可能是第二型糖尿病或動脈粥狀硬化。此外，本文描述的是如本文所述之胜肽或編碼該胜肽的核酸用於製備用於治療與TLR-4相關的疾病之藥物的用途。

在下面的描述中闡述了本發明的一個或多個具體實施例的細節。 本發明的其它特徵或優點將從以下幾個具體實施例的詳細描述以及來自所附之申請專利範圍變得顯而易見。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的技術人員通常理解的相同的含義。

如本文所用，定冠詞「一(a)」與「一(an)」係指物品的語法對象中的一個或多於一個(即至少一個)。作為示例，「一元素」係指一個元素或多於一個元素。

「包含(comprise)」或「包含(comprising)」等詞通常被用在包括(include)/包括(including)的意義上，其係表示允許存在一個或多個特徵、成分或組分。「包含(comprise)」或「包含(comprising)」等詞包括「組成(consists)」或「由...組成(consisting of)」。

如本文所用，「多胜肽」乙詞係指由透過胜肽鍵連接的胺基酸殘基組成之聚合物。「胜肽」乙詞係指由連接的胺基酸組成的相對短的多胜肽，例如150個胺基酸或更少，例如，長度為140個或更少、130個或更少、120個或更少、110個或更少、100個或更少、90個或更少、80個或更少、70個或更少、60個或更少、50個或更少、40個或更少的胺基酸。

PLY 胜 肽和含有該胜肽之醫藥組合物

本文所述之PLY胜肽係指衍生自肺炎球菌溶血素的非天然存在的截短片段或其功能變體。這些胜肽與天然存在的全長PLY不同，至少在於這樣的胜肽與其全長對應物相比具有顯著降低的細胞毒性。此外，PLY胜肽顯示TLR-4拮抗的活性，其在全長天然配對物中未觀察到。因此，PLY胜肽是可用於抑制TLR-4調節的信號傳導途徑的TLR-4拮抗劑，因此有利於治療與異常TLR-4活化相關的疾病和病症。

細菌性肺炎球菌溶血素為具有471個胺基酸長度的多胜肽，其含有四個結構域。示例性的肺炎球菌溶血素的胺基酸序列提供於下表1中(SEQ ID NO: 1)。結構域1-3 (「肺炎球菌溶血素123;」 SEQ ID NO: 2)對應於SEQ ID NO: 1中的胺基酸殘基1-359。結構域4 (「Ply4；」 SEQ ID NO: 3)對應於SEQ ID NO: 1中的胺基酸殘基360-471。

本文所述之PLY胜肽可能缺少肺炎球菌溶血素分子的結構域1-3。於一些具體實施例中，如本文所述之PLY胜肽可以包含QDLTA (SEQ ID NO: 9)的胺基酸模體，其C端連接到包含與SEQ ID NO: 10序列至少有85% (例如，至少90%、95%或97%)相似的胺基酸序列的胜肽片段。於一些情況下，任何PLY胜肽可以具有最多150個胺基酸，例如含有35-150個胺基酸殘基、35 -120個胺基酸殘基、35-100個胺基酸殘基、35-80個胺基酸殘基或35-60個胺基酸殘基。

為了確定兩個胺基酸序列的相似度百分比，為了優化比較之目的進行序列比對(例如，可以在第一個胺基酸序列的序列中引入間隙以與第二個胺基酸序列進行最佳比對)。在計算相似度百分比時，通常會精確計算配對。可以使用本領域已知的數學演算法(例如BLAST和Gapped BLAST程序、NBLAST和XBLAST程序，或ALIGN程序)來確定兩個序列之間的同源性或相似度的百分比。

於一些具體實施例中，本文所述之PLY胜肽可以是天然存在的肺炎球菌溶血素的片段，例如細菌性肺炎球菌溶血素。這樣的PLY胜肽可以含有QDLTA (SEQ ID NO: 9)，接著SEQ ID NO: 10的片段。除了SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10的區段之外，PLY胜肽還可以含有在SEQ ID NO: 9的N端的親本肺炎球菌溶血素的區段、在SEQ ID NO: 10的C端的親本肺炎球菌溶血素的區段，或兩者皆有。PLY胜肽的長度可以在35-150個胺基酸的範圍內。衍生自天然存在的肺炎球菌溶血素的示例性PLY胜肽包括但不限於PLY4 (SEQ ID NO: 3)、C70PLY4 (SEQ ID NO: 4)，以及N35PLY4 (SEQ ID NO: 5)。見下表1。

在其它具體實施例中，本文所述之PLY胜肽可以是包含一個或多個突變的肺炎球菌溶血素片段的變體。可以理解的是，多胜肽可以具有有限數量的變化或修飾，其可以在與其活性或功能無關的多胜肽的某一部分內進行，且仍然導致具有可接受程度的等同或類似的生物活性或功能的變體。具體而言，本發明的PLY胜肽表現出減弱TLR-4活化的活性。因此，可以鑑定出對於本發明的PLY胜肽的減弱TLR- 4活化的活性必需或非必需的胺基酸位置，例如SEQ ID NO: 10的C端序列。TLR-4活化的分析通常透過在體內將LPS與嗜中性粒細胞結合，或透過體外蛋白競爭結合測定法來進行。將LPS與嗜中性粒細胞結合導致TLR-4活化，例如，其含量可以透過嗜中性粒細胞的遷移百分比來測量。與不具有測試胜肽者相比，如果該測試胜肽存在時TLR-4活化含量會降低的話，則該測試胜肽被確定為能有效減弱TLR-4活化。

在一些實施例中，PLY胜肽可以在對應於SEQ ID NO: 10的區域中在多達5個胺基酸位置(例如，1、2、3、4或5)處含有突變(例如，胺基酸殘基取代)。例如，PLY胜肽可以在SEQ ID NO: 10的位置19及/或位置20 (分別對應於SEQ ID NO: 5中的位置24和25)含有突變(例如，胺基酸殘基取代)。如本文所示，這兩個位置的突變不影響PLY胜肽的TLR-4抑制活性。實例包括但不限於N35PLY4m25K (SEQ ID NO: 6)以及N35PLY4m24L25K (SEQ ID NO: 7)。

於一些情況下，胺基酸殘基突變為保守胺基酸殘基取代，其如本領域已知的，不太可能影響所得胜肽的活性。如本文所用，「保守胺基酸取代」係指不改變其中進行胺基酸取代的蛋白質的相對電荷或大小特徵的胺基酸取代。可以根據改變本領域普通技術人員已知的多胜肽序列的方法來製備變體，例如在編譯這些方法的參考文獻中找到的，如Molecular Cloning: A Laboratory Manual，J.Sambrook等人編輯，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989年，或Current Protocols in Molecular Biology，F.M. Ausubel等人編輯，John Wiley & Sons公司，紐約。胺基酸的保守取代包括在以下組中的胺基酸之間進行的取代：(a) M、I、L、V；(b) F、Y、W；(c) K、R、H；(d) A、G；(e) S、T；(f) Q、N；以及(g) E、D。

表1顯示了本發明的一些具體實施例中全長肺炎球菌的肺炎球菌溶血素的胺基酸序列、其片段和具有突變的片段。

表 1

本發明的PLY胜肽可以透過使用蛋白質化學中熟知的技術，例如固相合成或在均勻溶液中合成以進行化學合成而製備。

或者，本發明的PLY胜肽可以使用重組技術製備。在這方面，提供了包含編碼本發明的胜肽的核苷酸序列的重組核酸，以及包含這種重組核酸的宿主細胞。可以在合適的條件下培養宿主細胞以表現目標多胜肽。多胜肽的表現可以是組成型的，使得它們連續產生或可誘導，需要刺激以啟動表現。在可誘導表現的情況下，當需要時可以透過於培養基中加入誘導劑物質，例如異丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)或甲醇，以開始產生蛋白質。多胜肽可以透過本領域已知的多種技術例如色層分析法，例如HPLC或親和管柱，以從宿主細胞中回收和純化。

「多核苷酸」或「核酸」等詞係指由核苷酸單元組成的聚合物。多核苷酸包括天然存在的核酸，例如去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，「DNA」)以及核糖核酸(ribonucleic acid，「RNA」)以及核酸類似物，包括具有非天然存在的核苷酸的核酸類似物。可以例如使用自動化DNA合成儀來合成多核苷酸。「核酸」乙詞通常係指大的多核苷酸。應當理解的是，當核苷酸序列由DNA序列(即A、T、G、C)表示時，這也包括其中由「U」代替「T」的RNA序列(即A、U、G、C)。「cDNA」乙詞係指與單鏈或雙鏈形式的mRNA互補或相同的DNA。

「互補」乙詞係指拓撲相容性或兩個多核苷酸的相互作用表面的配對。因此，這兩個分子可以被描述為互補的，此外，接觸表面特性彼此互補。如果第一多核苷酸的核苷酸序列與第二多核苷酸的多核苷酸結合配偶體的核苷酸序列相同，則第一多核苷酸與第二多核苷酸互補。因此，序列為5’-TATAC-3’的多核苷酸與序列為5’-GTATA-3’的多核苷酸互補。

「編碼」乙詞係指多核苷酸(例如，基因、cDNA或mRNA)中特定的核苷酸序列的固有性質，用於做為生物過程中合成其它聚合物和大分子的模板，其具有確定的核苷酸序列(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定的胺基酸序列以及由此產生的生物學特性。因此，如果由一基因產生的mRNA的轉錄和轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則該基因編碼該蛋白質。本領域技術人員可以理解，由於遺傳密碼的簡併性，許多不同的多核苷酸和核酸可編碼相同的多胜肽。還應當理解，技術人員可以使用常規技術進行核苷酸取代，該取代不影響其中所述之多核苷酸編碼的多胜肽序列，以反映任何特定宿主生物體的密碼子使用，其中該多胜肽將在該宿主生物體中被表現。因此，除非另有說明，否則「編碼胺基酸序列的核苷酸序列」包括彼此簡併形式並編碼相同胺基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質和RNA的核苷酸序列可能包括內含子。

「重組核酸」乙詞係指具有不是天然連接在一起的序列的多核苷酸或核酸。重組核酸可以以載體的形式存在。「載體」可以含有給定的目標核苷酸序列與調節序列。載體可以用於表現給定的核苷酸序列(表現載體)或維持給定的核苷酸序列，以用於複製、操縱，或在不同位置之間(例如在不同的生物體之間)轉移該核苷酸序列。為了上述目的，可將載體引入合適的宿主細胞。「重組細胞」係指已經在其中引入重組核酸的宿主細胞。

載體的實例包括但不限於質體、黏質體、噬菌體，YACs或PACs。通常，在載體中，給定的核苷酸序列可操作地與調節序列連接，使得當載體被引入宿主細胞時，給定的核苷酸序列可以在調節序列的控制下在宿主細胞中表現。調控序列可以包含，例如但不限於啟動子序列(例如，巨細胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子、猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、T7啟動子，以及醇氧化酶基因(AOX1 )啟動子)、起始密碼子、複製起點、增強子、操縱子序列、分泌信號序列(例如，α交配因子信號)以及其他控制序列(例如Shine-Dalgarno序列和終止序列)。優選地，載體可以進一步含有用於隨後篩選程序的標記序列(例如，抗生素抗性標記序列)。為了蛋白質生產的目的，在載體中，給定的目標核苷酸序列可以連接到除了上述調節序列之外的另一個核苷酸序列，而產生融合的多胜肽並有益於隨後的純化程序。所述融合多胜肽包括但不限於His標籤融合多胜肽和GST融合多胜肽。因此，於一些具體實施例中，如本文所述之本發明的胜肽可以是具有用於純化的標籤的融合多胜肽。

於一些具體實施例中，如果本發明的胜肽基本上不含可能參與胜肽製備過程的細胞材料或化學前驅物或其它化學物質，則本發明的胜肽可以說是「分離的」或「純化的」。應當理解的是，「分離的」或「純化的」等詞不一定反映胜肽被「絕對地」分離或純化的程度，例如，透過除去所有其它物質(例如雜質或細胞成分)。於一些情況下，例如，分離或純化的胜肽包括含有小於50%、40%、30%、20%或10%(重量)的其它蛋白質(例如細胞蛋白質)的胜肽的製劑，具有少於50%、40%、30%、20%或10% (體積)的培養基，或具有小於50%、40%、30%、20%或10% (重量)的化學前驅物或其他涉及合成程序的化學物質。「分離的」或「純化的」等詞也可以應用於本發明的核酸。

根據本發明，有效量的活性成分(PLY胜肽)可使用生理學上可接受的載體配製成用於遞送和吸收目的的合適形式的組合物。本發明的組合物特別包含約0.1% (重量百分比)至約100% (重量百分比)的活性成分，其中基於整個組合物的重量計算重量百分比。於一些具體實施例中，本發明的組合物可以是用於治療的醫藥組合物或藥物。於一些具體實施例中，本發明的組合物可以是食品或補充劑。

如本文所用，「生理上可接受的」係指載體與組合物中的活性成分相容，且優選地可穩定所述活性成分，並且對接受的個體是安全的。所述載體可以是活性成分的稀釋劑、載劑、賦形劑或基質。適當賦形劑的一些實例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖、甘露糖、澱粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、黃蓍膠、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、無菌水、糖漿和甲基纖維素。組合物還可以包含潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂和礦物油；潤濕劑；乳化劑和懸浮劑；防腐劑，如羥基苯甲酸甲酯和丙酯；甜味劑和調味劑。本發明的組合物可以在投與患者後提供活性成分快速、持續或延遲釋放的效果。

根據本發明，組合物的形式可以是片劑、丸劑、粉末、錠劑、包裝、口含錠、酏劑、懸浮液、洗液、溶液、糖漿、軟和硬明膠膠囊、栓劑、滅菌注射液，以及包裝粉末。

本發明的組合物可以透過任何生理上可接受的途徑遞送，例如口服、腸胃外(如肌肉內、靜脈內、皮下和腹膜內)、經皮、栓劑和鼻內方法。關於腸胃外給藥，優選以無菌水溶液的形式使用，其可以包含足以使溶液與血液等滲的其它物質，例如鹽或葡萄糖。可以根據需要適當地使該水溶液變為緩衝(例如pH值為3〜9)。在無菌條件下製備合適的腸胃外組合物可使用本領域技術人員熟知的標準藥理學技術來完成。

用於治療與 TLR-4 相關的疾病的 PLY 胜 肽的治療用途

TLR-4是負責活化先天免疫系統的類鐸受體。TLR-4可以識別並被脂多醣(lipopolysaccharide，LPS)活化，脂多醣(LPS)是細菌病原體中常見的成分。其他分子，如病毒蛋白與多醣，也被發現作為TLR-4的配體。意料不到地，本文所述之PLY胜肽被發現能夠抑制TLR-4活化。因此，本文所述之任何對TLR-4具有抑制活性的PLY胜肽可用於在需要這種治療的個體中抑制TLR-4活性，從而有益於治療與異常活化的TLR-4有關的疾病或病症。

為了實施本文公開的方法，一有效量的本文所述之組合物，例如本文所述之醫藥組合物，包含本文所述之一種或多種PLY4胜肽，可以被施用於需要治療的個體(例如，人類)，經由一適當的方法進行治療，例如靜脈內給藥，例如作為推注或透過連續輸注一段時間，透過肌肉內、腹膜內、腦脊髓內、皮下、關節內、滑膜內，鞘內腔、口服，吸入或局部途徑。用於液體製劑的市售噴霧器，包括噴射式噴霧器和超音波霧化器有助於給藥。液體製劑可以直接霧化，而凍乾粉末可以在重建後霧化。或者，包含如本文所述之PLY4胜肽的組合物可以使用氟碳製劑和計量劑量吸入器霧化，或作為凍乾和研磨的粉末吸入。

本文使用之「有效量」乙詞係指在接受治療的個體或細胞中賦予預期生物學效應的活性成分的量。有效量可以根據各種原因改變，例如給藥途徑和頻率、體重和接受該藥物的個體的物種，以及給藥之目的。基於本文的公開內容、已建立的方法及其經驗，本領域技術人員可以在每種情況下確定劑量。

透過本文所述方法治療的個體可以是哺乳動物，更優選人類。哺乳動物包括但不限於農場動物、運動動物、寵物、靈長類動物、馬、狗、貓、小鼠和大鼠。需要治療的人類個體可能是患有、有風險、疑似患有目標疾病/障礙，例如糖尿病，其併發症或動脈粥狀硬化。可以透過常規醫療檢驗，例如實驗室檢查、器官功能測試、CT掃描或超音波來確認具有目標疾病或病症的個體。懷疑有任何此類目標疾病/病症的個體可能顯示該疾病/病症的一種或多種症狀。具有患有該疾病/障礙風險的個體可以是帶有該疾病/病症的一種或多種危險因素的個體。

TLR-4活化異常與不同的疾病和病症有關。在本發明中首先公開了TLR-4信號傳導涉及糖尿病的發展和進展，故可以透過抑制TLR-4活化來治療糖尿病。因此，於一實施例中，透過抑制TLR-4活化來治療的目標疾病為糖尿病或其併發症。糖尿病併發症的實例包括糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性腎病變、糖尿病性神經病變、糖尿病性心血管疾病，以及糖尿病性皮膚病，但不限於此，只要該併發症可由糖尿病引起即可。為了治療糖尿病或其併發症，可以將PLY胜肽以有效降低個體血糖含量及/或增加胰島素含量的量給予需要治療的個體。

於具體實施例中，與TLR-4活化相關的疾病或病症是由於TLR4活化引起的發炎性疾病。於某個實施例中，與TLR-4活化相關的疾病或病症為動脈粥狀硬化。在具體實施例中，該個體患有糖尿病或不患有糖尿病。

與異常TLR-4活化相關的其它疾病/病症包括但不限於動脈粥狀硬化、心血管疾病、視網膜病變、腎肥大和功能障礙、直腸癌進展和轉移、胃癌進展、動脈粥狀硬化、牙周病、尿道感染等發炎性疾病。

於一些具體實施例中，個體或受試者可以為患有動脈粥狀硬化或具有患有動脈粥狀硬化風險的哺乳動物，例如，超重或肥胖者、具有高血壓或高血膽固醇者，攝取高脂肪飲食者，具有心臟病家族史者，患有糖尿病或吸煙者。

本文所用之「治療」乙詞係指將包括一種或多種活性劑的組合物施用或施用於受到疾病(例如糖尿病、動脈粥狀硬化和其它發炎性疾病)、該疾病的症狀或病症，或該疾病的進展或傾向所苦的個體，其目的為治癒、癒合、舒緩、緩解、改變、補救、改善，增進，或影響該疾病、該疾病的症狀或病症、由該疾病誘導的殘疾，或該疾病的進展或傾向。因此，「治療」乙詞還可以包括，取決於待治療對象的狀況、預防疾病，包括預防該疾症發作或與之相關的任何症狀，以及降低或減輕該疾病的嚴重性，或發病前的任何症狀。

以 TLR-4 拮抗劑 治療糖尿病

本揭露至少部分地基於TLR-4信號傳導涉及糖尿病發展和進展的發現。據此，本文還提供了以TLR-4拮抗劑透過例如抑制TLR-4途徑，以治療糖尿病及/或緩解至少一種糖尿病的症狀的方法，從而降低血糖含量及/或增加胰島素含量。本文描述的方法將不會引起某些副作用，例如體重增加與心血管問題。

如本文所用，「TLR-4拮抗劑」乙詞係指一種物質或藥劑，該物質或藥劑可以顯著降低、抑制、阻斷及/或減輕TLR-4活化，包括但不限於嗜中性粒細胞的活化、促發炎性物質(如ICAM-1、VCAM-1與E-選擇蛋白)的產生，以及嗜中性粒細胞跨內皮遷移。TLR4是一種被詳細描述特徵的細胞表面受體。TLR4是LRR (富含白胺酸重複)家族的非典型成員，由N端、中心和C端結構域所組成。中心結構域的β折疊表現出非常小的半徑和大扭轉角度。MD-2是一種細胞外蛋白，與該N端和中心結構域的凹槽表面結合，形成用於LPS識別的TLR-4/MD2二聚體(Ohto U等人，Science (2007) 316: 1632-4；KIM HM等人，Cell (2007) 130:906；Park BS等人，Nat (2009) 458: 1191)。於一些具體實施例中，如本文所用的TLR-4拮抗劑能夠抑制MD2蛋白與TLR-4之間的相互作用，例如透過競爭TLR4中MD2的結合位點，從而顯著降低、抑制、阻斷及/或減輕TLR-4的活化。

除了本文所述之PLY胜肽之外，用於本文所述之用於糖尿病治療方法的TLR-4拮抗劑可以包括抗TLR-4抗體、針對TLR-4基因的反義核酸分子、針對TLR-4核酸的小干擾RNA(siRNA)，或小分子TLR-4抑制化合物。

抗體(可與複數形式互換使用)是一種透過位於免疫球蛋白分子的可變區中的至少一個抗原識別位點，而能夠特異性結合一目標的免疫球蛋白分子，該目標例如為一碳水化合物、多核苷酸、脂質、多胜肽等。如本文所用，「抗體」乙詞不僅涵蓋完整(即，全長)多株或單株抗體，而且還包括其抗原結合片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)₂ 、Fv)、單鏈(scFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、雙抗體、線性抗體、單鏈抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，以及免疫球蛋白分子的任何其它修飾構型，其包含具有所需特異性的抗原識別位點，包括抗體的糖基化變體、抗體的胺基酸序列變體，以及共價修飾的抗體。抗體包括任何類別的抗體，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM (或其亞類)，且抗體不需要具有任何特定的類別。取決於其重鏈恆定結構域的抗體胺基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同的類別。存在五種主要類型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG，以及IgM，其中幾種可進一步分為亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。對應於不同類別的免疫球蛋白的重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ，以及μ。不同類別的免疫球蛋白的次單位結構及三維構型是眾所周知的。

用於本文所述方法的抗體可以是小鼠、大鼠、人類或任何其它來源(包括嵌合或人源化抗體)。於一些實施例中，抗體包含修飾的恆定區，例如免疫惰性的恆定區，例如不引發補體調節的裂解，或不刺激抗體依賴性細胞調節的細胞毒性(ADCC)。ADCC活性可以使用美國專利號5,500,362中所公開的方法來分析。於其它的具體實施例中，恆定區的修飾如Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624、PCT申請號PCT/GB99/01441，及/或英國專利申請號9809951.8所述。

本文所述之任何抗體可以是單株或多株的。「單株抗體」係指同源的抗體群體，「多株抗體」係指異源的抗體群體。這兩個術語並不限制抗體的來源或其製備方式。

在一個實施例中，本文所述方法中使用的抗體為人源化抗體。人源化抗體係指非人類(例如小鼠)抗體的形式，其為含有源自於非人類免疫球蛋白的最小序列的特異性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈，或其抗原結合片段。在大多數情況下，人源化抗體為人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體的互補決定區(complementary determining region，CDR)的殘基被來自非人類的物種(供體抗體)的CDR的殘基替代，例如具有所需特異性、親和力和容量的小鼠、大鼠，或兔。於一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架區(FR)殘基被相應的非人類殘基代替。此外，人源化抗體可以包含未在受體抗體中也未在引進的CDR或框架序列中發現的殘基，而是包括進一步改進和優化的抗體性能。通常，人源化抗體將包含基本上全部至少一個，通常為兩個可變結構域，其中對應於非人類免疫球蛋白的所有或基本上所有的CDR區域，以及所有的或基本上所有的FR區域為人類免疫球蛋白共有序列的那些區域。人源化抗體最優還將包含免疫球蛋白恆定區或結構域(Fc)的至少一部分，通常為人類免疫球蛋白的恆定區或結構域(Fc)。抗體可以具有如WO 99/58572中所述修飾的Fc區。其他形式的人源化抗體具有相對於原始抗體改變的一個或多個CDR (一個、兩個、三個、四個、五個、六個)，其也被稱為一個或多個「源自」一個或多個來自原抗體的CDR。人源化抗體也可能涉及親和力成熟。

於另一實施例中，本文所述之抗體為嵌合抗體，其可以包括來自人類抗體的重恆定區和輕恆定區。嵌合抗體係指具有來自第一物種的可變區或可變區的一部分，以及來自第二物種的恆定區的抗體。通常，在這些嵌合抗體中，輕鏈和重鏈的可變區模擬來自一種哺乳動物(例如，非人類哺乳動物，如小鼠、兔和大鼠)的抗體的可變區，而恆定部分與源自另一哺乳動物如人類的抗體中的序列同源。於一些具體實施例中，可以在可變區及/或恆定區中進行胺基酸修飾。

於一些實施例中，本文揭露的抗體特異性結合目標抗原，例如人類TLR-4。「特異性結合」(本文可互換使用)到一目標或一抗原決定位的抗體是本領域中眾所周知的術語，且確定此類特異性結合的方法也是本領域熟知的。如果分子與其它目標相比更頻繁地、更快速地以更長的時間及/或具有比特定目標抗原更高的親和力反應或相關聯，則表示為「特異性結合」。如果比起抗體與其他物質的結合，該抗體以更高的親和力、結合力，更容易及/或更長的持續時間與目標抗原結合，則其「特異性結合」目標抗原。例如，特異性(或優先)結合一TLR-4抗原決定位的抗體，是以比結合其他TLR-4抗原決定位或非TLR-4抗原決定位，具有更高的親和力、結合力、更容易及/或更長時間結合該TLR-4抗原決定位的抗體。透過閱讀本定義也可以理解，例如，特異性結合第一目標抗原的抗體可以或可不特異性地或優先地結合第二目標抗原。因此，「特定結合」或「優先結合」不一定需要(儘管它可以包括)排他性結合。通常，但不一定是，提及結合代表優先結合。

抗TLR-4抗體為一種能夠與TLR-4結合並抑制由TLR-4信號傳導調節的TLR-4生物活性及/或下游途徑的抗體。於一些實施例中，本文所述方法中使用的抗TLR-4抗體抑制該TLR-4信號傳導途徑至少20%、至少40%、至少50%、至少75%、至少90%、至少100%，或至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍，或至少1000倍。

抗TLR-4抗體對TLR-4 (例如人類TLR-4)的結合親和力可以小於約100 nM、約50 nM、約10 nM、約1 nM、約500 pM、約100 pM，或約50 pM至約2 pM中的任一種。結合親和力可以表現為K_D 或解離常數，且增加的結合親和力對應於降低的K_D 。確定抗體對TLR-4的結合親和力的一種方法是透過測量抗體的單功能Fab片段的結合親和力。為了獲得單功能Fab片段，可以木瓜蛋白酶切割抗體(例如，IgG)或重組表現。可以透過表面等離振子共振(BIAcore3000™表面等離子體共振(surface plasmon resonance，SPR)系統，BIAcore公司，Piscaway，紐澤西州)測定抗體的抗TLR-4 Fab片段的親和力。獲得動力學關聯速率(k_on )和解離速率(k_off )(通常在25ºC測量)；且平衡解離常數(K_D )值被計算為k_off /k_on 。

於一些具體實施例中，該抗體與人類TLR-4結合，且不顯著結合來自另一種哺乳動物物種的TLR-4。於一些具體實施例中，該抗體與人類TLR-4結合，也與來自另一種哺乳動物物種的一種或多種TLR-4結合。

能夠干擾本文所述之TLR-4信號傳導途徑的抗體可以透過本領域已知的任何方法製備。參見例如Harlow和Lane，(1988年) Antibodies: A Laboratory Manual，冷泉港實驗室，紐約。

於一些具體實施例中，可以透過常規融合瘤技術製備對目標抗原(例如，人類TLR-4)特異性的抗體。任選與載體蛋白如KLH偶聯的全長目標抗原或其片段可用於免疫宿主動物以產生結合該抗原的抗體。如本文進一步所述，宿主動物的免疫途徑和時間表通常與用於已建立的抗體刺激和產生的常規技術保持一致。用於生產小鼠、人源化和人類抗體的一般技術是本領域已知的，並且在本文中進行描述。預期包括人類的任何哺乳動物個體或其產生抗體的細胞可以被操縱，以用於生產哺乳動物，包括人類融合瘤細胞株，之基礎。通常，使用一定量的免疫原，包括本文所述者，以腹膜內、肌肉內、口服、皮下、眼內及/或皮內途徑接種宿主動物。

融合瘤可由淋巴細胞及永生化的骨髓瘤細胞所製備，藉由使用Kohler, B.與Milstein, C. (1975年) Nature 256: 495-497所述的一般體細胞雜交技術，或由Buck, D.W.等人，In Vitro, 18:377-381 (1982年)修改的方法進行。可得之骨髓瘤細胞，包括但不限於X63-Ag8.653以及來自美國加州聖地牙哥細胞分佈中心的Salk研究所的那些骨髓瘤細胞，係可用於雜交。通常，該技術涉及使用例如聚乙二醇的融合劑來融合骨髓瘤細胞與類淋巴細胞，或透過本領域技術人員熟知的電子方式進行。融合後，將細胞與融合培養基分離，並在選擇性生長培養基，例如次黃嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine，HAT)培養基中生長，以除去未雜交的親本細胞。補充含有或不含血清的本文所述之任何培養基可用於培養分泌單株抗體的融合瘤。作為細胞融合技術的另一替代方案，EBV永生化B細胞可用於產生本發明的抗TLR-4單株抗體。如果需要，將融合瘤擴增並進行次選殖，並透過常規免疫測定方法(例如，放射免疫測定、酵素免疫測定，或螢光免疫測定)測定上清液的免疫原活性。

可以作為抗體來源的融合瘤包括產生能夠干擾TLR-4信號傳導途徑的單株抗體的所有衍生物、母本融合瘤的後代細胞。產生這種抗體的融合瘤可以使用已知的方法在體外或體內生長。如果需要，可以透過常規的免疫球蛋白純化方法，如硫酸銨沉澱、凝膠電泳、透析、色層分析和超過濾，從培養基或體液中分離出單株抗體。如果存在不想要的活性，可以透過，例如，在附著於固相的免疫原所製成的吸附劑上運行該製劑，並從該免疫原中洗脫或釋放所需之抗體，以除去不想要的活性。以目標抗原或含有與待免疫之物種中具免疫原性的蛋白質(例如，匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白，或大豆胰蛋白酶抑制劑)綴合的目標胺基酸序列的片段，使用雙功能或衍生的藥劑(例如，馬來醯亞胺基苯甲醯基磺基琥珀醯亞胺酯(透過半胱胺酸殘基綴合)、N-羥基琥珀醯亞胺(透過離胺酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐，SOCl或R1N=C=NR，其中R與R1是不同的烷基)，免疫宿主動物，可產生一群抗體(如，單株抗體)。

如果需要，可以對目標(例如，由融合瘤產生)抗體(單株或多株)進行定序，然後將多核苷酸序列選殖到用於表現或繁殖的載體中。編碼目標抗體的序列可以在宿主細胞內的載體中被維持，然後可以擴增及冷凍宿主細胞以備將來使用。或者，多核苷酸序列可用於遺傳操作以使抗體「人源化」或提高抗體的親和力(親和力成熟)或其他特徵。例如，如果該抗體用於人類的臨床試驗和治療，則恆定區域可被設計為更類似於人類的恆定區域以避免免疫反應。可能需要遺傳操縱抗體序列以獲得對目標抗原的更大親和力，並且在抑制由TLR-4調節的信號傳導途徑方面具有更大的功效。對於本領域技術人員顯而易見的是，可以對抗體進行一種或多種多核苷酸改變，並且仍然保持其與目標抗原的結合特異性。

於其他具體實施例中，可以透過使用經遺傳工程化以表現特定人類免疫球蛋白質的市售小鼠來獲得完全人類抗體。設計用於產生更理想(例如完全人類抗體)或更強健的免疫反應的基因轉殖動物也可用於產生人源化或人類抗體。這種技術的例子是來自Amgen公司(Fremont，加州)的Xenomouse^RTM ，以及來自Medarex公司(Princeton，紐澤西州)的HuMAb-Mouse^RTM 與TC Mouse^TM 。於另一個替代方案中，抗體可以透過噬菌體展示技術重組製備。參見，例如，美國專利第5,565,332號；5,580,717；5,733,743；以及6,265,150；以及Winter等人(1994年) Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455。或者，噬菌體展示技術(McCafferty等人，(1990年) Nature 348：552-553)可用於從來自未免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)結構域基因庫中，在體外產生人類抗體和抗體片段。

可以透過常規方法製備完整抗體(全長抗體)的抗原結合片段。例如，F(ab’)2片段可以透過胃蛋白酶消化抗體分子來產生，且Fab片段可以透過還原F(ab’)2片段的二硫鍵來產生。

遺傳工程改造的抗體，如人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體，以及雙特異性抗體，可以透過例如常規重組技術產生。於一實施例中，可以使用常規方法(例如透過使用能夠特異性結合編碼單株抗體的重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地分離並定序編碼針對目標抗原特異性的單株抗體的DNA。融合瘤細胞作為這種DNA的優選來源。一旦分離，可將DNA置於一個或多個表現載體中，然後將其轉染至宿主細胞，如大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，或不另外產生免疫球蛋白的骨髓瘤細胞蛋白質，以獲得在重組宿主細胞中單株抗體的合成。參見，例如，PCT公開號WO 87/04462。然後，該DNA可以被修飾，例如，透過以編碼人類重鏈和輕鏈恆定結構域的序列來取代同源的小鼠序列，Morrison等人(1984年)Proc. Nat. Acad. Sci . 81:6851，或透過共價連接到免疫球蛋白編碼序列全部或部分非免疫球蛋白多胜肽的編碼序列。以這種方式，遺傳工程化抗體，例如「嵌合」或「雜合」抗體，可以製備具有目標抗原的結合特異性。

為生產「嵌合抗體」開發的技術為本領域公知的。參見，例如，Morrison等人(1984年)Proc. Nat. Acad. Sci .USA 81:6851；Neuberger等人(1984年) Nature 312, 604；以及Takeda等人(1984年) Nature 314:452。

構建人源化抗體的方法也是本領域熟知的。參見，例如，Queen等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 86:10029-10033 (1989年)。於一實施例中，使用本領域已知的方法對親本非人類抗體的V_H 和V_L 的可變區進行三維分子模型分析。接著，使用相同的分子模型分析來確定預測對於形成正確CDR結構重要的框架胺基酸殘基。並行地，使用母體V_H 和V_L 序列作為搜詢條件，從任何抗體基因數據庫找出具有與該親本非人類抗體同源的胺基酸序列的人類V_H 和V_L 鏈。然後選擇人類V_H 和V_L 受體基因。

選擇的人類受體基因內的CDR區可用於取代來自親本非人類抗體或其功能變體的CDR區。必要時，預測在與該CDR區相互作用中重要的親本鏈的框架區域中的殘基(見上文描述)可用於取代人類受體基因中相應的殘基。

可以透過重組技術藉由連接編碼重鏈可變區的核苷酸序列和編碼輕鏈可變區的核苷酸序列來製備單鏈抗體。優選地，在兩個可變區之間併入柔性接頭。或者，描述用於生產單鏈抗體的技術(美國專利第4,946,778號和第4,704,692號)可被改用以產生噬菌體scFv文庫，且可以從常規程序中從文庫鑑定出對TLR-4特異性的scFv選殖株。可以對陽性選殖株進行進一步篩選以鑑定出抑制TLR-4活性的那些選殖株。

可以使用本領域已知的方法來描述依照本領域已知並在本文中描述的方法所獲得的抗體的特徵。例如，一種方法是用來鑑定抗原結合的抗原決定位，或「繪製抗原決定位地圖」。有許多本領域已知的方法可用於對蛋白質上的抗原決定位的位置繪製地圖及描述特徵，包括解析抗體–抗原複合物的結晶結構、競爭分析、基因片段表現分析，以及基於合成的胜肽的分析，例如在Harlow和Lane所著之Using Antibodies, a Laboratory Manual，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1999年，一書的第11章。於另一實施例中，繪製抗原決定位地圖可被用於確定抗體結合的序列。抗原決定位可以是線性抗原決定位，即包含在胺基酸的單段中，或由不一定包含在單段(一級結構線性序列)中的胺基酸的三維相互作用形成的構象抗原決定位。不同長度的胜肽(例如，至少4-6個胺基酸長)可以被分離或合成(例如，重組)，並用於與抗體的結合分析。於另一實施例中，抗體結合的抗原決定位可以透過使用衍生自目標抗原序列的重疊胜肽並確定抗體的結合而在系統篩選中確定。根據基因片段表現分析法，編碼目標抗原的開放閱讀框架隨機地或透過特異性遺傳構建進行片段化，並確定抗原的表現片段與待測抗體的反應性。例如，可以透過PCR產生基因片段，然後在放射性胺基酸的存在下，在體外轉錄並轉譯為蛋白質。然後透過免疫沉澱和凝膠電泳測定抗體與放射性標記的抗原片段的結合。也可以透過使用顯示在噬菌體顆粒表面上的大量隨機胜肽序列庫(噬菌體文庫)來鑑定某些抗原決定位。或者，可以在簡單結合測定中測試明確的重疊胜肽片段文庫與測試抗體的結合。於另一實施例中，可以進行抗原結合結構域的突變分析、結構域交換實驗分析，以及丙胺酸掃描式突變分析，以鑑定抗原決定位結合所需的、足夠的及/或必需的殘基。例如，可以使用目標抗原的突變進行結構域交換實驗分析，其中該TLR-4多胜肽的各種片段已由來自密切相關但抗原性不同的蛋白質(例如，神經營養蛋白家族的另一成員)的序列所替換(交換)。透過評估抗體與突變體TLR-4的結合，可以評估特定抗原片段對抗體結合的重要性。

或者，競爭分析可以使用已知結合相同抗原的其它抗體來進行，以確定抗體是否結合與其它抗體相同的抗原決定位。競爭分析是本領域技術人員所公知的。

除了能夠干擾如上所述之TLR-4信號傳導途徑的抗體之外的TLR-4拮抗劑可用於本文所述之方法中。

於本發明的一些具體實施例中，TLR-4拮抗劑包含至少一種能夠阻斷或降低功能性TLR-4 (例如人類TLR-4)的表現的反義核酸分子。TLR-4基因的核苷酸序列是已知的，並且可從公眾可獲得的資料庫中輕易地獲得。參見上述揭露。製備不與其他多核苷酸交叉反應而特異性結合一目標mRNA的反義寡核苷酸分子是慣常的程序。目標的示例性位點包括但不限於起始密碼子、5’調節區、編碼序列，以及3’非轉譯區。於一些具體實施例中，寡核苷酸長度為約10至100個核苷酸，長度為約15至50個核苷酸，長度為約18至25個核苷酸或更長。寡核苷酸可以包含骨架修飾，例如硫代磷酸酯鍵，以及本領域熟知的2’-0糖修飾。

或者，可以使用本領域所周知的基因剔除、嗎啉代寡核苷酸、小干擾RNA (siRNA或RNAi)、微RNA或核酶等方法降低TLR-4表現及/或釋放。 RNA干擾(RNAi)是dsRNA引導信使RNA的同源序列特異性降解的過程。在哺乳動物細胞中，RNAi可以透過小干擾RNA (siRNA)的21-核苷酸雙鏈體觸發而不會活化宿主干擾素反應。本文公開的方法中使用的dsRNA可以是siRNA (含有兩個單獨且互補的RNA鏈)或短髮夾RNA (即，形成緊髮夾結構的RNA鏈)，這兩者都可以基於目標基因而被設計。或者，其可以是微小RNA。

可視需要地，如上所述之用於本文所述方法的核酸分子(例如，反義核酸、小干擾RNA，或微小RNA)包含非天然存在的核鹼基、糖或共價核苷酸間鍵合(骨幹)。這樣的修飾的寡核苷酸賦予所需的性質，例如增強細胞吸收、改善對目標核酸的親和力，以及增加體內穩定性。

於一實施例中，該核酸具有修飾的骨架，包括保留磷原子的骨架(參見，例如，美國專利號3,687,808; 4,469,863; 5,321,131; 5,399,676；以及5,625,050)與不具有磷原子的骨架(參見，例如，美國專利號5,034,506; 5,166,315；以及5,792,608)。含磷修飾的骨架的實例包括，但不限於，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基-磷酸三酯、甲基，以及其它烷基膦酸酯，包括3’-亞烷基膦酸酯、5’-亞烷基膦酸酯，以及手性膦酸酯、次膦酸酯，包括3’-胺基胺基磷酸酯以及胺基烷基磷醯胺化物的胺基磷酸酯、具有3’-5’鍵或2’-5’鍵的硫代磷醯胺化物、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒磷酸酯，以及硼烷化磷酸酯。這樣的骨架還包括具有反轉極性的那些骨架，即3’至3’、5’至5’，或2’至2’鍵。不包括磷原子的修飾骨架由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵形成，混合雜原子和烷基或環烷基核苷間鍵，或一個或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵。這些骨架包括那些具有嗎啉鍵(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；矽氧烷骨架；硫化物、亞碸和碸骨架；甲醯乙醯和硫代乙醯基骨架；亞甲基甲醯基和硫代甲醯乙醯骨架；核糖核心骨架；含烯烴的骨架；胺基磺酸鹽骨架；亞甲基亞胺基和亞甲基肼基骨架；磺酸鹽和磺醯胺骨架；醯胺骨架；和其他具有混合的N、O、S和CH₂ 組分的部分。

於另一實施例中，在所公開的方法中使用的核酸包括一個或多個取代的糖部分體。這種取代的糖部分體可以在其2’位置包括以下基團之一：OH、F、O-烷基、S-烷基、N-烷基、O-烯基、S-烯基、N-烯基、O-炔基、S-炔基、N-炔基，以及O-烷基-O-烷基。在這些基團中，烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C₁ 至C₁₀ 烷基或C₂ 至C₁₀ 烯基和炔基。它們還可以包括在其2’位置的雜環烷基、雜環烷基芳基、胺基烷基胺基、多烷基胺基、取代的甲矽烷基、RNA裂解基團、報導子基團、嵌入劑、用於改善寡核苷酸的藥代動力學性質的基團，或用於改善寡核苷酸的藥效學性質的基團。優選的取代糖部分體包括具有2’-甲氧基乙氧基、2’-二甲基胺基氧乙氧基，以及2’-二甲基胺基乙氧基乙氧基的糖部分體。參見Martin等人，Helv. Chim. Acta，1995年，78, 486-504。

於另一實施例中，核酸包括一個或多個修飾的天然核鹼基(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)。修飾的核鹼基包括在美國專利號3,687,808、The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering，第858-859頁，Kroschwitz, J. I.編輯，John Wiley & Sons出版社，1990年、Englisch等人，Angewandte Chemie，國際版，1991年, 30, 613，以及Sanghvi, Y. S.，第15章，Antisense Research and Applications，第289-302頁，CRC出版社，1993年。核鹼基特別可用於增加反義寡核苷酸與其目標核酸的結合親和力。這些包括5-取代的嘧啶、6-氮雜嘧啶，以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤(例如2-胺基丙基-腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶，以及5-丙炔基胞嘧啶)。參見Sanghvi等人編輯，Antisense Research and Applications，CRC出版社，Boca Raton，1993年，第276-278頁)。

任何核酸可以透過本領域已知的方法合成。參見例如Caruthers等人，1992年，Methods in Enzymology 211, 3-19、Wincott等人，1995年，Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684、Wincott等人，1997年，Methods Mol. Bio. 74, 59、Brennan等人，1998年，Biotechnol Bioeng., 61, 33-45，以及Brennan，美國專利號6,001,311。其亦可以從表現載體轉錄並使用標準技術分離。

在其它具體實施例中，TLR-4拮抗劑包含至少一種TLR-4抑制化合物。如本文所用，「TLR-4抑制化合物」係指直接或間接減少、抑制、中和或消除TLR-4生物活性的抗TLR-4抗體以外的化合物。TLR-4抑制性化合物應顯示以下特徵中的一種或多種：(a)與TLR-4結合並抑制其生物活性及/或由TLR-4訊息傳遞功能調節的下游途徑；(b)降低個體的血糖含量，(c)增加個體的胰島素含量，及/或(e)減輕與糖尿病相關的一種或多種併發症。本領域技術人員可以鑑定和製備這樣的抑制性化合物。

於其它具體實施例中，本文所述之TLR-4抑制性化合物為小分子，其可以具有約100至20,000道爾頓、500至15,000道爾頓，或1000至10,000道爾頓中的任何一種的分子量。小分子的文庫為市售可得。可以使用本領域已知的任何方法，包括吸入、腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、鞘內腔、心室內、口服、腸內、腸胃外、鼻內或皮膚中的方式施用該小分子。通常，當根據本發明的TLR-4拮抗劑為小分子時，其將以0.1至300 mg/kg患者體重的劑量施用，分配為一至三次或更多的劑量。對於正常體重的成年患者，可以施用的劑量範圍為每劑量1 mg至5 g。

上述小分子可以從化合物文庫獲得。文庫可為空間上可確定位置的平行固相文庫或液相文庫。參見，例如Zuckermann等人，J. Med. Chem. 37, 2678-2685，1994年；以及Lam Anticancer Drug Des. 12:145, 1997年。化合物文庫的合成方法是本領域熟知的，例如DeWitt等人PNAS USA 90:6909, 1993年；Erb等人PNAS USA 91:11422, 1994年；Zuckermann 等人，J. Med. Chem. 37:2678, 1994年；Cho等人，Science 261:1303, 1993年；Carrell等人Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994年；Carell等人Angew Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061, 1994年；以及Gallop等人J. Med. Chem. 37:1233, 1994年。化合物的文庫可以存在於溶液中(例如，Houghten Biotechniques 13:412-421, 1992年)或珠子上(Lam Nature 354:82-84, 1991年)、芯片(Fodor Nature 364:555-556, 1993年)、細菌(美國專利號5,223,409)、孢子(美國專利號5,223,409)、質粒(Cull等人，PNAS USA 89:1865-1869, 1992年)或噬菌體(Scott和Smith Science 249:386-390, 1990年；Devlin Science 249:404-406, 1990年；Cwirla等人，PNAS USA 87:6378-6382, 1990年；Felici J. Mol. Biol. 222:301-310, 1991；以及美國專利號5,223,409)。

示例性TLR-4抑制性化合物包括，但不限於，(1) TLR4-IN-C34，其係為透過與MD2的疏水口袋對接抑制TLR4信號傳導的胺基單醣(Matthew D等人，PLoS One (2013年) 8:e65779)，(2) NBP2-26244，其係為透過阻斷TLR4與其細胞內銜接蛋白(Mal/TIRAP和TRAM)之間的相互作用來抑制TLR4信號傳導的胜肽(Lysakova-Devine T等人，J Immunol. (2010) 185:4261)，以及(3) CLI-095，其是為透過阻斷TLR4的細胞內結構域而不是細胞外結構域來抑制TLR4信號傳導的環己烯衍生物(Li M等人，Mol. Pharmacol (2006年) 69:1288-95)。

透過以下實施例進一步說明本發明，這些實施例是為了演示而不是為了限制目的而提供的。鑑於本案，本領域技術人員應該理解，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，可以在所公開的具體實施例中進行許多改變，並且仍然獲得類似或相似的結果。

實施例

在本發明中，我們發現一來自肺炎鏈球菌的缺失結構域1-3的截短形式(合成胜肽)在高脂肪飲食模型中有效控制第二型糖尿病及其與動脈粥狀硬化和肥胖相關的後果。本發明的PLY胜肽作為類鐸受體第四型(TLR4)拮抗劑，而沒有如全長Ply的溶血作用。沒有觀察到細胞凋亡和細胞毒性的觸發。本發明的PLY胜肽在高飲食誘導大鼠模型和糖尿病基因剔除(db/db^-/- )小鼠模型中顯示出對血糖控制的有效性和胰島素的增加。在動物模型中觀察到對照組和處理組之間ICAM-1、VCAM-1以及E-選擇蛋白表現的顯著變化。本發明的PLY胜肽顯示在HUVAC中LPS活化的嗜中性粒細胞遷移的抑制作用，在層流低剪切應力下的細胞保護作用，並減少鼠動脈粥狀硬化性炎症。

1. 材料和方法

1.1 肺炎球菌溶血素 (PLY) 、全長及其片段

全長肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(PLY，1-471個胺基酸殘基)及其片段，包括結構域4的片段(PLY4，360-471個胺基酸殘基)、C-末端70個胺基酸片段(C70PLY4，402-471個胺基酸殘基)、C70PLY4的N端35個胺基酸片段(N35PLY4，402-436個胺基酸殘基)、具有一個突變(N35PLY4m25K)的C70PLY4的N端35個胺基酸片段、具有兩個突變(N35PLY4m24L25K)的C70PLY4的N端35個胺基酸片段，以及具有前5個胺基酸殘基缺失(M50PLY4)的C70PLY4的N端50個胺基酸片段(M50PLY4)，如下表1所示，產生這些片段後並隨後進行測定。

1.2 肺炎球菌溶血素的重組結構域 4 (rPly4) 之選殖株、表現和產生

使用含有Nde I限制酶切位的正向引子5’- GGAATTCCATATGAACGGAGATTTACTGCTG -3’ (SEQ ID NO: 15)，以及與編碼序列互補並含有Xho I限制酶切位的反向引子5’- CCGCTCGAGGTCATTTTCTACCTTATCTTCTAC -3’ (SEQ ID NO: 16)進行Ply4基因的擴增。結果，重組蛋白的C端含有另外的組胺酸標籤LEHHHHHH (SEQ ID NO: 17)。使用Nde I和Xho I切位將PCR產物選殖到表現載體pET-22b (+) (Novagen公司，Madison，懷俄明州，美國)中，得到質體pPly4。

在來自Novagen公司(Madison，懷俄明州，美國)的BL21 (DE3) Star中表現Ply4基因。在37°C下整夜培養以1 mM IPTG誘導重組Ply4 (rPly4)的表現，並離心收穫細胞。

誘導rPly4後，將3.6公升的細胞培養物離心(6400×g，15分鐘)，並將沉澱物重新懸浮於含有10 mM咪唑，pH7.6的360 mL磷酸鹽緩衝液(phosphate-buffered saline，PBS)中。在法式細胞破碎機(Constant Systems，Daventry，英國)中以27 Kpsi破壞細胞後，透過超高速離心(10,000×g，60分鐘)澄清細胞裂解物。將上清液加載到9 mL Ni-NTA樹脂(Qiagen公司，San Diego，加州，美國)上。首先用均質緩衝液洗滌管柱(1.1 cm i.d. × 9.5 cm)，然後以含有40 mM咪唑的相同緩衝液洗滌。再以含有500 mM咪唑的勻質緩衝液洗脫rPly4。多黏菌素B瓊脂糖管柱(Pierce公司，Rockfold，伊利諾州，美國)用於去除脂多醣(lipopplysaccharide，LPS)。透過鱟變形細胞裂解物(Limulus amebocyte lysate，LAL)測定法(Cape Cod公司，Cape Cod，麻州，美國)測定每種目標蛋白中殘留LPS的量。發現LPS含量低於3 EU/mg。

透過重組技術以相似的方式製備全長PLY。

1.3 胜 肽的合成

使用芴基-甲氧基羰基(Fmoc)基團進行α-胺基保護的自動化胜肽合成儀(來自Protein Technologies公司的PS-3型)，透過固相方法合成各種PLY片段。使用的樹脂衍生自具有改質的Rink連接子(Merck公司，Darmstadt，德國)的NovaSyn TGR樹脂。用叔丁氧基羰基(tBoc)保護色胺酸和離胺酸殘基，以2,2,4,6,7-五甲基二氫苯並呋喃-5-磺醯基(Pbf)組保護精胺酸殘基。最後的去阻隔步驟以TFA/三異丙基矽烷/水(94:3:3)的混合物進行。透過使用乙醚作為非溶劑來沉澱回收粗胜肽，並透過分析型反相HPLC進行特徵分析。在Agilent 1100系列LC/MSD高性能離子阱質譜儀上進行質譜分析，以確保獲得目標胜肽。C70PLY4由英國Almac Sciences公司合成。並以這種方式合成其他PLY胜肽。

1.4 高脂肪飲食 (HFD) 誘導的第二型糖尿病大鼠

將Sprague-Dawley大鼠分配到兩種飲食方案，最初2週進行自由餵食正常飲食或高脂肪飲食(HFD)。經過2週的飲食操作後，以低劑量的STZ (35 mg/kg體重)對餵食HFD的大鼠組進行腹膜內注射(i.p.)，同時以相應的劑量腹膜內注射給予對照大鼠體積為1 mL/kg的檸檬酸鹽緩衝液(pH 4.5)載劑。STZ注射後7天，篩選大鼠的血糖含量。整夜禁食(10-12小時)的動物透過胃插管給予葡萄糖(3 g/kg體重)。口服給予葡萄糖2小時後，從側尾靜脈採取血液樣品，靜置凝固離心；然後測量血清葡萄糖濃度。在葡萄糖攝入2小時後，血清葡萄糖 ≥ 200 mg/dL的大鼠被認為是糖尿病患者，並進一步進行藥物研究。允許大鼠繼續餵養各自的飲食直到研究結束(16)。

將實驗動物分為三組，每組包含六隻大鼠，分組如下：(1)第1組作為對照組大鼠(非DM對照組)；(2)第2組作為糖尿病對照組大鼠(STZ +載劑組)；以及(3)第3組作為糖尿病治療大鼠，以腹腔注射施用在水性懸浮液中的C70PLY4 (2 mg/kg/3天) 共30天(STZ + C70PLY4組)。在實驗結束時，犧牲動物，取得血液樣品、肌肉及肝臟。

1.5 糖尿病基因剔除小鼠 (C57BL/KsJ-db /db )

將新到的5週齡(23g)的雄性C57BL/KsJ-db/db 小鼠(糖尿病缺乏型剔除小鼠)以顆粒狀的市售飼料餵食，使其適應2週。將所有小鼠保持在受控制的明暗週期(12:12小時，上午8:00亮燈)及恆溫(25°C)。這些小鼠可自由攝取食物及蒸餾水，且分別於每日及每週測量食物的攝取及體重的增加。將動物隨機分為兩組，每組包含6隻小鼠，分組如下：(1)第1組作為對照組小鼠(載劑組)；以及(2)第2組作為糖尿病小鼠，以腹腔注射存在於水性懸浮液中的C70PLY4 (2 mg/kg/3天)共30天(C70PLY4組)。在實驗結束時，所有小鼠在禁食12小時後以氯胺酮麻醉，並自下腔靜脈採集血液樣品到塗布有肝素的試管中。血液在4°C下以1000 g離心15分鐘，以分離血漿及紅血球。移除肝臟及脂肪組織、洗滌、稱重，並冷凍於-70°C直到分析。

1.6 葡萄糖含量的測量

使用血糖測試紙及血糖監測系統測定在上午10點及中午之間收集的尾巴上的一滴血液的全血糖值。使用葡萄糖氧化酶/過氧化物酶試劑套組比色測定葡萄糖濃度。將樣品與100 μl測定試劑在37°C下作用30分鐘，並在波長540 nm下測量。數值以mg/dL表示。

1.7 ELISA 分析

血清中胰島素、sICAM-1、sVCAM-1，以及E-選擇素的含量透過使用三明治ELISA (R&D)根據製造商的實驗方法來測定。

1.8 以蘇木精和伊紅 (HE) 染色進行小鼠主動脈的病理學分析

主動脈的上升部分取自小鼠，包括對照組健康小鼠以及有和沒有C70PLY4治療的HFD誘導的糖尿病小鼠，並將樣本保持在10%甲醛中緩衝24小時。將樣品以常規方式包埋在石蠟塊中並以橫切面(3 μm)切割。載玻片以蘇木精和伊紅染色。用光學顯微鏡分析樣品。

1.9 TLR4 缺陷型 [TLR4(-/-)] C3H/HeJ 小鼠及野生型 C3H/HeN 小鼠

為了從TLR4缺陷型[TLR4(-/-)] C3H/HeJ小鼠和野生型C3H/HeN小鼠獲得小鼠嗜中性粒細胞，將0.1 ml尿酸溶液注射到小鼠的腹膜腔中以誘導發炎反應。透過與鹽水(10% [wt/vol])混合並以超音波處理10分鐘製備尿酸溶液(非結晶形式)。在接種之前，將乳白色沉澱的尿酸溶液劇烈搖動。在以5 ml冷磷酸鹽緩衝鹽水(PBS；總體積為10ml)注射灌洗腹腔二次後，於4、18或24小時時收集腹膜滲出液細胞。透過在4°C下以200 ×g離心10分鐘洗滌尿酸誘導的腹膜細胞(Uric acid-induced peritoneal cells，UAPMN)。隨後進行低滲裂解以消除紅血球，進行離心及額外的洗滌。然後將細胞重新懸浮於Krebs-Ringer磷酸鹽緩衝液(KRG; pH7.3)中。分別以Türk試劑染色細胞核，並透過細胞離心，然後以May-Grünwald-Giemsa染色，來測定腹膜滲出液細胞的數量及族群。根據作用時間(4小時)，腹腔注射尿酸產生1至2×10⁷ 個細胞/小鼠的產量。在注射後4小時，尿酸誘導的PMN的純度含量為95%。以台盼藍排除法確定存活率超過95%的分離的嗜中性粒細胞。然後將TLR4 (-/-) C3H/HeJ小鼠和野生型C3H/HeN小鼠的PMN用於PMN轉移分析。

1.10 人類臍靜脈內皮細胞 ( Human umbilical vein endothelial cell ， HUVEC) 培養

HUVEC購自ScienCell Research Laboratories公司(加州，美國)。將沉澱物重新懸浮於補充有青黴素/鏈黴素以及20%胎牛血清(FBS)的M199培養基中，然後將細胞鋪在細胞培養皿上。ECs在培養皿中培養3天，然後接種到預先塗有鼠尾第1型膠原蛋白的載玻片上。二次培養物在達到細胞長滿後的兩天內(約1-2×10⁵ 個細胞/cm² )用於實驗。¹²

1.11 人類及小鼠多形核白血球 ( polymorphonuclear leukocyte ， PMN) 的分離

來自人類的中性粒細胞是以含有無防腐劑的肝素(最終濃度20 U/ml)的注射器抽取而分離的血液，並與等體積的含有3%葡聚醣的PBS混合，然後在室溫下作用20分鐘。收集富含白血球的血漿(上層)，透過離心從血漿中獲得沉澱的細胞，並重新懸浮於0.9 % NaCl。將10 ml Ficoll-Hypaque溶液分層於該細胞懸浮液下方。離心1500 ×g 20分鐘後，吸出Ficoll-Hypaque層，留下嗜中性粒細胞/RBC顆粒。透過將每個嗜中性粒細胞/RBC沉澱物重新懸浮於冷的0.2 % NaCl中30秒，對細胞進行低滲裂解。在此期間，透過加入冰冷的1.6 % NaCl還原等滲透性。離心後，將細胞重新懸浮於冰冷的PBS/葡萄糖緩衝液中。如前所述，從腹膜中分離出來自小鼠的嗜中性粒細胞。參見，例如Rabes等人，Curr Top Microbiol Immunol 397: 215-227 (2016年)。將細胞濃度調整至16,107個細胞/mL。分離的嗜中性粒細胞的活力超過95%，以台盼藍排除法所確定。

1.12 PMNs 經內皮遷移

透過使用Transwell系統進行經內皮遷移。將Transwell過濾器以HUVEC單層預接種24小時，並轉移至乾淨的24孔盤。將HUVEC以DPBS洗滌兩次，將500 μl ECM加到Transwell過濾室中，然後在上腔室中加入10⁶ 個嗜中性粒細胞。透過向下腔室加入LPS至1 μg/ml的終濃度來刺激經內皮遷移。將細胞與內皮細胞在37°C作用1小時。在作用結束時，從下腔室收集遷移的細胞，並以血球計數器計數，進行三重複。透過將從下腔室回收的PMN的數量除以最初添加的PMN的數量來計算PMN遷移百分比。

1.13 MD2 和類鐸受體 (TLR) 第四型的體外蛋白結合分析

將重組TLR4蛋白質在磷酸鹽緩衝溶液(PBS)(2 μg/mL)中稀釋，並透過在37°C下培養以固定在96孔(100ng/孔)酵素聯結免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)盤上2小時。孔盤以PBS洗滌三次，然後加入含有300 μL 5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS於環境溫度下整夜作用以進行阻隔作用。然後，在加入各種濃度(從133.3至0.065nM的2倍連續稀釋液)的重組MD2蛋白溶液之前，孔盤以PBST (含有0.05% Tween 20溶液的PBS)清洗3次。將配體(MD2)和TLR4蛋白在37°C下培養2小時，然後孔盤以PBST洗滌3次，再加入100 μL以1% BSA稀釋(1:1000)的抗MD2抗體。在環境溫度下作用1小時後，將孔盤以PBST洗滌3次，然後加入100 μL以1% BSA稀釋(1:2000)的抗小鼠IgG-HRP抗體。在環境溫度下作用1小時後，將孔盤以 PBST洗滌3次，然後在每個孔中加入100 μL的HRP基質(即3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺，TMB)。在環境溫度下作用5分鐘後，透過在每個孔中加入50 μL終止液(2N H₂ SO₄ )終止反應。使用ELISA盤讀取器測定每個孔中的光密度(OD₄₅₀ )。使用GraphPad Prism軟體(GraphPad Software公司，San Diego，加州)透過非線性回歸分析計算以nM為單位的結合親和力。

1.14 體外蛋白競爭結合分析 (C70PLY4 、 N35PLY4 和 M50PLY4 用於 MD2/TLR4 交互作用 )

將重組TLR4蛋白質在PBS (2 μg/mL)中稀釋，並透過在37°C下作用2小時以將其固定在96孔(100 ng/孔) ELISA盤上。將孔盤以PBS洗滌三次，然後在環境溫度下加入300 μL 5% BSA的PBS溶液阻隔整夜。然後，以PBST將孔盤重新洗滌三次，然後進行競爭結合分析。透過加入各種量的(50 μM至3.05 nM的2倍連續稀釋液) C70PLY4、N35PLY4或M50PLY4胜肽來競爭MD2 (50 nM)與TLR4的結合，而使用以1% BSA稀釋的如本文所述之抗-MD2抗體以及抗-小鼠-IgG-HRP抗體來檢驗殘留的結合。

1.15 西方墨點分析

保持細胞作為對照組，以LPS (1 μg/mL)處理或以LPS (1 μg/mL)與C70PLY4 (100、300以及500 nM)共同處理24小時，並以西方墨點分析法檢測ERK1/2與NFκB-p65次單位的磷酸化。透過刮取方式收集細胞，並以含有1% NP-40，0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS，以及蛋白酶抑製劑混合物(PMSF、抑胜肽酶，以及原釩酸鈉)的RIPA緩衝液裂解。透過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)(10%跑膠用，4%堆疊用)分離總細胞裂解物(50 μg蛋白質)並轉移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon P，孔徑0.45 μm)上。然後將膜與指定的抗體一起作用。使用Western-Light化學發光檢測系統(Applied Biosystems公司，Foster City，加州)進行免疫檢測。

1.16 剪切應力 實驗

將HUVEC安裝在平行板流動室中的載玻片上，其連接到灌注環系統(15)。將系統保持在恆定溫度，透過用5% CO₂ 放氣保持在pH 7.4。在灌注期間，培養基的滲透濃度保持在285-295 mOsm/kg的範圍內。流道寬度(w)為1 cm，通道高度(h)為0.025cm。透過使用公式τ=6μQ/wh₂ 估計對HUVECs進行的流體剪切應力(τ)，其中μ為介質的黏度，Q為流量。在本研究中施加的流體剪切應力為4 dynes/cm² 。將細胞安裝在載玻片上，在存在或不存在100 mM各種PLY胜肽的情況下，在37°C，5% CO₂ 下，以M199培養基作用1小時，然後暴露於4 dyn/cm² 的剪切應力6小時。對照組細胞與靜態培養基同時作用。

1.17 免疫螢光顯微鏡

在暴露於具有或不具有胜肽處理的剪切應力之後，洗滌HUVEC，以4%甲醛固定，並以含有1% Triton X-100的PBS在37°C下透化30分鐘。然後以含有0.1% Triton X-100以及10%牛血清白蛋白(BSA)的PBS將細胞阻隔1小時。透過以鬼筆環胜肽-螢光素異硫氰酸酯(FITC)(1:1000 eBioscience)在室溫下染色1小時，檢測細胞質內F-肌動蛋白免疫螢光，並以4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在室溫下進行細胞核染色10分鐘。以具有CCD的螢光顯微鏡(OLYMPUS公司)拍攝螢光細胞。

1.18 細胞存活力測定

透過甲磺酸鹽(MTS)分析法檢測細胞存活力。簡而言之，將2×10⁴ 個HUVEC接種到一個48孔盤中，每孔含有100μl的內皮細胞培養基(ECM，ScienCell Research Laboratory公司，型號1001，美國)並作用24小時。去除培養基，然後將細胞與具有2%胎牛血清(FBS)的培養基一起培養，該培養基分別具有或不具有濃度為1、10，或100 nM的各種胜肽，例如PLY、PLY123、PLY4、C70PLY4或N35PLY4。培養18小時後，除去培養基，將最終體積為100 μl的20 μl MTS試劑(20%)加入各孔中，置於培養箱中1小時。以培養盤讀取器在波長490 nm下測量光密度。

1.19 細胞凋亡

透過使用市售末端去氧核苷酸轉移酶-dUTP切口末端標記(transferase-dUTP nick end labeling，TUNEL)與半胱天冬酶-3活性套組，即Apo-BrdU原位DNA片段化分析套組(BioVision公司)與NucView™ 488半胱天冬酶-3酵素基質(Biotium公司)檢測細胞凋亡。簡言之，在存在或不存在100 mM各種PLY胜肽的M199培養基中，於37°C，5% CO₂ 下培養1小時，以PBS洗滌HUVEC並以固定緩衝液在冰上固定20分鐘。然後將細胞在70%乙醇中浸泡1小時。經洗滌緩衝液清洗2次後，細胞於37°C在DNA標記溶液中作用60分鐘。然後用漂洗緩衝液處理細胞，並在室溫下與抗體緩衝液作用30分鐘。細胞核以碘化丙啶染色30分鐘。透過螢光顯微鏡及攝影電荷耦合裝置(CCD)照相機觀察樣品。活細胞呈紅色螢光，而凋亡細胞為綠色螢光。

關於半胱天冬酶-3活性測定，在變體胜肽處理之後，以PBS洗滌HUVEC。然後將細胞與半胱天冬酶-3基質1 mM在室溫下反應30分鐘。然後透過螢光顯微鏡和CCD照相機觀察細胞。具有半胱天冬酶-3活性的細胞將呈現綠色螢光。

1.20 統計學分析

結果表示為平均值±標準誤差(SEM)。透過使用獨立的學生氏t檢驗對兩組數據進行分析，並以方差分析(ANOVA)進行統計分析，接著以Scheffe檢驗進行多次比較。P 值小於0.05者被認為是顯著的。

2. 結果

2.1 高脂飲食 (HFD) 誘導的第二型糖尿病大鼠模型中的血糖和胰島素含量

在STZ誘導的DM大鼠中評估C70PLY4對血糖和血液胰島素含量的影響。

給予STZ+載體的大鼠與非糖尿病(DM)對照組相比，顯示血糖含量升高且血液中胰島素含量降低。然而，與施用載體的STZ注射的大鼠相比，施用C70PLY4的STZ注射的大鼠顯示出降低的血糖及增加的血液胰島素含量(圖3與圖4)。這些結果表明，C70PLY4在治療第二型糖尿病方面具有潛在的作用。

2.2 C57BL/KsJ-db/db 糖尿病缺陷小鼠的血糖及體重

C57BL/KsJ-db/db 小鼠已廣泛用為第二型糖尿病的自發性糖尿病模型，以研究糖尿病的發病機制。C57BL/KsJ-db/db 小鼠在瘦素受體基因(肥胖調節基因)中帶有突變，是肥胖誘導的第二型糖尿病小鼠的良好模型(22)。在本研究中，實驗開始時，所有C57BL/KsJ-db/db 小鼠均為患有糖尿病，如血糖含量所示。在db/db 小鼠中評估C70PLY4對血糖含量及體重的影響。結果顯示，在為期二週的實驗期之後，C70PLY4與對照組相比，血糖含量(圖5)及體重(圖6)顯著降低。這些結果表明，C70PLY4有效改善了糖尿病進展。

2.3 HFD 誘導的第二型糖尿病大鼠模型中 sICAM-1 、 sVCAM-1 以及 sE- 選擇蛋白的血清含量

ICAM-1、VCAM-1和E-選擇蛋白的血清含量是白血球與內皮黏附的重要介質，而且與糖尿病和相關併發症的風險，特別是動脈粥狀硬化，顯著相關。我們進一步評估了C70PLY4對STZ誘導的糖尿病大鼠體內sICAM-1、sVCAM-1和sE-選擇蛋白的血清含量的影響。給予STZ和載劑的大鼠與非糖尿病的對照組相比，顯示出sICAM-1、sVCAM-1和sE-選擇蛋白含量的增加。然而，與施用載劑的STZ注射的大鼠相比，在STZ注射的大鼠中施用C70PLY4的大鼠顯示出降低的sICAM-1(圖7A)、sVCAM-1(圖7B)和sE-選擇蛋白(圖7C)。這些結果表明，C70PLY4有效抑制血管細胞中促發炎性因子的產生和分泌，而且可能在治療第二型糖尿病的動脈粥狀硬化中具有重要的作用。

2.4 STZ 大鼠模型 中的抗動脈粥狀硬化

本研究確定C70PLY4是否減弱HFD餵養的大鼠動脈粥狀硬化的狀態。將大鼠分為四組：(1)對照組(非糖尿病組)，(2)糖尿病大鼠(STZ組，STZ為能夠破壞哺乳動物胰臟中胰島素生成β細胞並導致糖尿病的化學物質)，(3)糖尿病治療對照大鼠(STZ + N-乙醯胞嘧啶(NAC)組，NAC為可用於改善動脈粥狀硬化狀態的還原型硫醇)(20)，(4)糖尿病治療大鼠(STZ + C70PLY4組)。

透過HE染色，顯示STZ促進主動脈的新內膜形成並導致STZ治療的大鼠中的動脈粥狀硬化的發展。在STZ + NAC組，NAC治療可以部分改善STZ對新內膜形成的影響。令人驚訝的是，在STZ + C70PLY4組中，C70PLY4顯著減弱STZ引起的新內膜形成狀態(圖8)。

2.5 PLY 胜 肽在低剪切應力實驗下表現出抗動脈粥狀硬化的活性

比較HUVEC處於在靜態下、低剪切應力下，以及低剪切應力但預處理C70PLY1小時的情況下。細胞處於6小時低剪切應力下表現出聚集排列(圖9A)以及F-肌動蛋白的重構(圖9B)。然而，C70PLY4的治療幾乎阻止了低剪切應力引起的形態變化(圖9A)以及細胞骨架重塑(圖9B)。C70PLY4的這種作用可以在低剪切應力下保持完整的內皮。

2.6 本發明的 PLY 胜 肽作為 TLR4 拮抗劑

PMN跨內皮遷移在動脈粥狀硬化形成的早期階段具有重要作用。已知LPS為一種透過活化TLR4蛋白而造成血管內皮細胞發炎的發炎性刺激劑(18)。為了評估本發明的PLY胜肽是否透過抑制TLR4活化而提供抗動脈粥狀硬化的活性，在從不同組小鼠分離的PMN中進行PMN遷移測定，包括(1)沒有LPS誘導的C3H/HeN [野生型(WT)]小鼠，(2)以1 μg LPS誘導的野生型小鼠，以及(3)有或沒有LPS誘導的TLR4(-/-)小鼠C3H/HeJ。

在比較沒有LPS誘導的C3H/HeN [野生型(WT)]小鼠分離的PMN中獲得的結果時，從以1 μg LPS誘導的野生型小鼠分離的PMN顯示出顯著增加的跨內皮細胞遷移，但從不論有無LPS誘導的TLR4(-/-)小鼠C3H/HeJ分離的PMNs則無此現象(圖10)。該結果表明，增加的細胞遷移是經由TLR4途徑，且增加的細胞遷移是由LPS所刺激，而LPS是一種TLR4配體。

全長PLY的添加不影響野生型及TLR4(-/-)小鼠模型中的PMNs遷移。然而，在野生型小鼠模型中觀察到附加的PLY4及C70PLY4對PMNs細胞遷移的顯著抑制，而TLR4(-/-)小鼠模型中沒有發生這種現象(圖10)。該結果表明PLY4及C70PLY4作為TLR4拮抗劑。

進一步研究本案的各種PLY胜肽的動脈粥狀硬化活性。圖11-12顯示，全長PLY增強LPS引起的PMN遷移；相較之下，PLY4、C70PLY4、N35PLY4，以及突變胜肽(N35PLY4m25K與N35PLY4m24L25K)在LPS誘導的PMN遷移中具有抑制作用，其可以抑制PMN滲入血管壁。具有沉默突變的35個胺基酸片段(例如，N35PLY4m25K以及N35PLY4m24L25K)的功能變體也具有抗動脈粥狀硬化的活性。結果顯示N35PLY4 (SEQ ID NO: 5)足以具有TLR4拮抗劑的作用，且顯示出抑制TLR-4配體誘導的PMNs細胞遷移的抗動脈粥狀硬化活性。

2.7 本發明的 PLY 胜 肽的 N 端模體 「QDLTA」 對於作為 TLR4 拮抗劑的功能是極為重要的

MD2是與TLR4蛋白的細胞外結構域相關的細胞外蛋白質。已經證明MD2蛋白對於LPS與TLR4蛋白的交互作用是不可缺的。 Kobayashi等人，J. Immunol. 176：6211-6218 (2006年)。因此，為了確定C70PLY4在TLR4蛋白誘導功能中的作用，本研究透過體外結合分析及競爭結合分析法檢測C70PLY4、MD2和TLR4蛋白之間的結合能力。將TLR4蛋白(2 μg/mL)包覆在96孔盤上，將MD2蛋白以不同濃度(從133.3至0.065 nM的2倍連續稀釋液)加入到各孔中。顯示出MD2蛋白對TLR4蛋白具有高結合親和力，其K_d 值為18.4±3.9 nM (K_d 值為解離常數，表示一半的蛋白質結合配體時的濃度)(圖13A)。在競爭結合分析中，我們確定了C70PLY4、N35PLY4或M50PLY4胜肽與MD2及TLR4蛋白相互作用的阻斷能力。N35PLY4與M50PLY4胜肽分別衍生自C70PLY4胜肽的第1至第35個胺基酸以及第6至第55個胺基酸；亦即M50PLY4覆蓋除了前5個胺基酸(QDLTA，SEQ ID NO: 9)以外的N35PLY4的所有胺基酸。在加入包覆有TLR4蛋白(2 μg/mL)的孔之前，將MD2蛋白(50 nM)與各種濃度(50 μM至3.05 nM的2倍連續稀釋液)的C70PLY4、N35PLY4或M50PLY4胜肽混合。C70PLY4在MD2和TLR4蛋白之間的交互作用中顯示出劑量依賴性的阻斷能力，K_i 為74.8 nM (圖13B)。N35PLY4顯示出對MD2和TLR4蛋白交互作用的部分阻隔能力，K_i 為11224.0 nM。然而，M50PLY4未顯示出競爭能力。此外，透過6.25 μM C70PLY4以及50 μM N35PLY4可以完全將MD2蛋白競爭掉。因此，這表明C70PLY4在TLR4誘導功能中的調節作用是透過競爭TLR4蛋白中MD2蛋白的結合位點。此外，N35PLY4和M50PLY4胜肽的競爭結果顯示，C70PLY4的第1至第5個胺基酸(QDLTA)在C70PLY4和TLR4的交互作用中具有關鍵作用。C70PLY4若不具有胺基酸QDLTA，則將失去與TLR4交互作用的功能。

2.8 本發明的 PLY 胜 肽的 TLR4 拮抗活性涉及 ERK1/2 以及 NFκB-p65 信號傳導途徑

本研究透過使用西方墨點分析法確定C70PLY4是否抑制人類臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中LPS誘導的信號傳導，包括蛋白質ERK1/2以及NFκB-p65次單位(圖14A)。將細胞保持作為對照組、僅以LPS (1 μg/mL)處理24小時，或以LPS (1 μg/mL)以及C70PLY4 (100、300，以及500 nM)共處理24小時，並檢測ERK1/2與NFκB-p65次單位的蛋白質磷酸化。顯示LPS誘導在HUVEC中ERK1/2與NFκB-p65次單位皆有蛋白質磷酸化(圖14A)。然而，以C70PLY4與LPS共處理細胞，則以劑量依賴性方式顯著抑制LPS對ERK1/2與NFκB-p65次單位磷酸化的影響(圖14B)。這些結果進一步表明本發明的PLY胜肽具有作為LPS/TLR4信號傳導的潛在拮抗劑的功能，並透過ERK1/2與NFκB-p65信號傳導途徑。

2.9 細胞毒性

透過使用MTS分析法檢測每種胜肽對HUVECs的毒性(圖15)。結果顯示肺炎球菌溶血素(全長)在濃度為100 nM時對細胞具有毒性，只有30%細胞存活；當PLY4濃度高時，PLY4顯示出輕微的毒性；相比之下，相同濃度的C70PLY4與N35PLY4對HUVECs不具有毒性作用(圖15)。在以下試驗中使用的濃度(100 nM)是基於MTS測定的結果，其對細胞是安全的。

顯微鏡分析顯示，C70PLY4不影響HUVEC的細胞形態(圖16)。MTS分析亦顯示，C70PLY4與PLY4在濃度為100 nM或更低時，對HUVECs不具有毒性作用(如上述結果2.9所示，數據未顯示)。此外，使用TUNEL和半胱天冬酶-3活性分析法檢測細胞凋亡。結果顯示，與對照組細胞相比，C70PLY4不具有細胞凋亡的潛能，不論是以TUNEL法(圖17A)或半胱天冬酶-3活性分析法(圖17B)測試的凋亡模式皆無差異，而陽性對照組(以喜樹鹼，已知的細胞毒性植物生物鹼)則具有約60%凋亡細胞。

無

當結合圖式閱讀時，將更好地理解上述概述以及本發明的以下詳細描述。為了說明本發明之目的，在附圖中示出了目前較佳的具體實施例。然而，應當理解的是，本發明不限於所示的精確排列與手段。

在圖式中：

圖1顯示了(1) 全長肺炎球菌的肺炎球菌溶血素(PLY，1-471個胺基酸殘基)，(2) 結構域1-3的片段(PLY123，1-359個胺基酸殘基)，(3) 結構域4的片段(PLY4，360-471個胺基酸殘基)，(4) C端70個胺基酸片段(C70PLY4，402-471個胺基酸殘基)，(5) C70PLY4的N端35個胺基酸片段(N35PLY4，402-436個胺基酸殘基)，(6) 在胺基酸位置25處具有一個點突變的N35PLY4，其參考SEQ ID NO: 5，自精胺酸(R)變為離胺酸(K) (N35PLY4m25K)，(7) N35PLY4具有雙重突變，參考SEQ ID NO: 5在胺基酸位置24處有一個突變，從異白胺酸(I)變為白胺酸(L)，另一個突變參考SEQ ID NO: 5在胺基酸位置25處，從精胺酸(R)變為離胺酸(K) (N35PLY4m24L25K)，以及(8) M50PLY4 (407-456個胺基酸殘基)，為C70PLY4的第6至第55個胺基酸殘基的胜肽(SEQ ID NO: 9)，缺乏QDLTA的N端模體的圖解。

圖2顯示PLY4、C70PLY4、N35PLY4、N35PLY4m25K、N35PLY4m24L25K以及M50PLY4的胺基酸序列。

圖3顯示透過以C70PLY4處理的STZ注射的HFD餵養的大鼠中血糖含量降低。

圖4顯示透過以C70PLY4處理的STZ注射的HFD餵養的大鼠中胰島素含量升高。

圖5顯示以C70PLY4處理的C57BL/KsJ-db/db 小鼠中血糖含量降低。

圖6顯示以C70PLY4處理的C57BL/KsJ-db/db 小鼠體重降低。

圖7包括透過以C70PLY4處理的STZ注射的HFD餵養的大鼠中血清可溶性ICAM-1含量降低的圖表(圖(A))；透過以C70PLY4處理的STZ注射的HFD餵養的大鼠中血清可溶性VCAM-1含量降低(圖(B))；以及以C70PLY4處理的STZ注射的HFD餵養的大鼠中血清可溶性E-選擇蛋白含量降低(圖(C))。

圖8顯示C70PLY4對HFD餵養的大鼠以STZ誘導的新內膜形成和動脈粥狀硬化狀態的減弱作用。

圖9表明C70PLY4可以阻斷低剪切應力引起的形態變化(A)以及細胞骨架重塑(B)。細胞(a)在沒有PLY胜肽的靜態培養基中培養，(b)在沒有PLY胜肽的靜態培養基中培養，然後暴露於剪切應力6小時，或(c)在C70PLY4存在下在靜態培養基中培養1小時，然後暴露於剪切應力6小時。

圖10顯示脂多醣刺激後野生型(WT)小鼠C3H/HeN與類鐸受體第四型(TLR4)缺陷小鼠C3H/HeJ的多形核白細胞(polymorphonuclear leukocyte，PMNs)的遷移差異。

圖11顯示以PLY、PLY4、C70PLY4或N35PLY4處理的野生型(WT)小鼠模型對PMNs遷移的抑制。

圖12顯示以N35PLY4、N35PLY4m25K，或N35PLY4m24L25K處理對PMNs遷移的抑制。

圖13包括在體外蛋白結合測定(圖(A))中顯示MD2與TLR4的高結合親和力(K_d 值)，以及透過C70PLY4與TLR4的MD2結合模體有效競爭的圖表(圖(B))。

圖14包括顯示西方墨點分析結果的照片(圖(A))，表明LPS誘導的ERK1/2與NFκB-p65次單位活化中C70PLY4的劑量依賴性抑制，以及圖表(圖(B))顯示基於上圖所示結果的磷酸化含量(對照組的百分比)，表明C70PLY4在LPS誘導的ERK1/2與NFκB-p65次單位活化中的劑量依賴性抑制。

圖15顯示全長PLY對細胞具有毒性，而高濃度的PLY4對細胞具有輕微毒性。透過以C70PLY4和N35PLY4處理則未發現細胞毒性。

圖16顯示C70PLY4不影響HUVEC的細胞形態，(a)以C70PLY4處理1小時的細胞，(b)以C70PLY4處理4小時的細胞，以及(c)以C70PLY4處理7小時的細胞。

圖17包括顯示C70PLY4在TUNEL測定中沒有細胞凋亡潛力(圖(A))，且C70PLY4在半胱天冬酶-3活性測定中沒有細胞凋亡潛力(圖(B))的照片。(a)對照組細胞，(b)以C70PLY4處理的細胞，以及(c)以喜樹鹼(已知的細胞毒性植物生物鹼)處理的細胞。

無

Claims (29)

1. 一種分離的肺炎球菌溶血素(pneumolysin，PLY)截短胜肽用於製備治療個體的糖尿病或糖尿病併發症之藥物的用途，其中該PLY截短胜肽包含：(i)第一片段，其包含QDLTA(SEQ ID NO：9)的胺基酸模體；以及(ii)第二片段，其包含與SEQ ID NO：10至少85%相同的胺基酸序列；其中該第一片段的C端連接至該第二片段的N端；且其中該PLY截短胜肽具有100個或更少的胺基酸，且係藉由阻斷MD2蛋白與類鐸受體第四型(TLR-4)之結合而抑制TLR-4活性。
2. 如請求項1之用途，其中該第二片段包含與SEQ ID NO：10至少90%相同的胺基酸序列。
3. 如請求項2之用途，其中該第二片段包含與SEQ ID NO：10至少95%相同的胺基酸序列。
4. 如請求項1之用途，其中該PLY截短胜肽具有90個或80個或更少的胺基酸。
5. 如請求項1之用途，其中該第二片段包括在SEQ ID NO：10的位置19及/或20中的胺基酸取代，其中位置19的胺基酸取代係從異白胺酸(I)變為白胺酸(L)，以及位置19的胺基酸取代係從精胺酸(R)變為離胺酸(K)。
6. 如請求項1之用途，其中該PLY截短胜肽具有70個或更少的胺基酸。
7. 如請求項1之用途，其中該第一片段如SEQ ID NO：9所示。
8. 如請求項1之用途，其中該第二片段如SEQ ID NO：10、12、13或14所示。
9. 如請求項1之用途，其中該PLY截短胜肽包含選自由SEQ ID NOs：4-7所組成之群組的胺基酸序列。
10. 如請求項1-9中任一項之用途，其中該PLY截短胜肽的有效量係足以降低該個體的血糖含量或增加胰島素含量。
11. 如請求項1-9中任一項之用途，其中該糖尿病為第二型糖尿病。
12. 如請求項1-9中任一項之用途，其中該糖尿病併發症係選自於由下列所組成之群組：糖尿病性視網膜病變、糖尿病性白內障、糖尿病性腎病變、糖尿病性神經病變、糖尿病性心血管疾病，以及糖尿病性皮膚病。
13. 如請求項12之用途，其中該糖尿病性心血管疾病為動脈粥狀硬化。
14. 一種分離的肺炎球菌溶血素(pneumolysin，PLY)截短胜肽用於製備抑制個體體內類鐸受體第四型(TLR-4)活性之藥物的用途，其中該PLY截短胜肽包含：(i)第一片段，其包含QDLTA(SEQ ID NO：9)的胺基酸模體；以及(ii)第二片段，其包含與SEQ ID NO：10至少85%相同的胺基酸序列；其中該第一片段的C端連接至該第二片段的N端；且其中該PLY截短胜肽具有100個或更少的胺基酸，且係藉由阻斷MD2蛋白與類鐸受體第四型(TLR-4)之結合而抑制TLR-4活性。
15. 如請求項14之用途，其中該第二片段包含與SEQ ID NO：10至少90%相同的胺基酸序列。
16. 如請求項15之用途，其中該第二片段包含與SEQ ID NO：10至少95%相同的胺基酸序列。
17. 如請求項14之用途，其中該PLY截短胜肽具有90個或80個或更少的胺基酸。
18. 如請求項14之用途，其中該第二片段包括在SEQ ID NO：10的位置19及/或20中的胺基酸取代，其中位置19的胺基酸取代係從異白胺酸(I)變為白胺酸(L)，以及位置19的胺基酸取代係從精胺酸(R)變為離胺酸(K)。
19. 如請求項14之用途，其中該PLY截短胜肽具有70個或更少的胺基酸。
20. 如請求項14之用途，其中該第一片段如SEQ ID NO：9所示。
21. 如請求項14之用途，其中該第二片段如SEQ ID NO：10、12、13或14所示。
22. 如請求項14之用途，其中該PLY截短胜肽包含選自由SEQ ID NOs：4-7所組成之群組的胺基酸序列。
23. 如請求項14之用途，其中該個體為患有或疑似患有與TLR-4活化相關之疾病或病症的人類患者。
24. 如請求項23之用途，其中該與TLR-4活化相關之疾病或病症為由於TLR4活化所引起之發炎性疾病。
25. 如請求項24之用途，其中該發炎性疾病是動脈粥狀硬化。
26. 如請求項24之用途，其中該個體患有糖尿病或不患有糖尿病。
27. 如請求項26之用途，其中該個體為患有或疑似患有糖尿病或其併發症之人類患者。
28. 如請求項27之用途，其中該PLY截短胜肽的有效量係足以降低該個體的血糖含量或增加胰島素含量。
29. 如請求項27之用途，其中該糖尿病為第二型糖尿病。

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