TWI763673B

TWI763673B - 新穎之基因重組牛痘病毒

Info

Publication number: TWI763673B
Application number: TW106117938A
Authority: TW
Inventors: 中尾慎典; 川瀬竜也; 中村貴史
Original assignee: 日商安斯泰來製藥股份有限公司; 國立大學法人鳥取大學
Priority date: 2016-05-30
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2022-05-11
Also published as: RU2757933C2; IL263373A; HUE054967T2; CN109477089A; LT3480307T; UA126380C2; ES2882538T3; SI3480307T1; JP6794442B2; MY191091A; RS62077B1; AU2017272721A1; EP3480307A4; CO2018013738A2; JPWO2017209053A1; CN109477089B; PL3480307T3; MX382907B; DK3480307T3; HRP20211145T1

Abstract

本發明的課題為提供有效於癌之預防或治療的基因重組牛痘病毒。

其解決手段，具體而言，本發明提供包含編碼IL-7之多核苷酸及編碼IL-12之多核苷酸的2種多核苷酸之牛痘病毒、含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒與包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒的2種牛痘病毒之組合套組，以及前述2種牛痘病毒的合併使用。

Description

新穎之基因重組牛痘病毒

本發明係關於新穎之基因重組牛痘病毒。

近年來，將病毒使用於癌治療的各種技術被開發，作為用於癌治療之病毒之一，係有牛痘病毒。牛痘病毒係作為將治療用基因送達癌細胞之載體、作為於癌細胞增殖並破壞癌細胞之腫瘤溶解性病毒，或作為表現癌抗原或免疫調節分子之癌疫苗，以癌治療為目的而受到研究(Expert Opinion on Biological Therapy、2011、Vol.11、p.595-608)。

以藉由插入編碼介白素-12(IL-12)或介白素-21(IL-21)之外來基因而使N1L基因不活化，且藉由插入LacZ報導基因及螢火蟲螢光酵素基因而使胸苷激酶(TK)基因缺損的方式操作之牛痘病毒，被報告於荷癌小鼠(tumor bearing mice)會造成腫瘤成長之抑制或生存率之改善(專利文獻1)。

關於使病毒蛋白質之牛痘病毒增殖因子(VGF)及O1L的功能缺損，於癌細胞內特異性增殖而破壞癌細胞之重組牛痘病毒，被報告有欲利用於癌治療之技術。其雖亦說明有對於該病毒，可將標記基因，或編碼具有細胞毒性或免疫賦活效果之產物的治療用基因等之外來基因導入於對於牛痘病毒之生命週期非必需的基因，然而於實施例中有具體驗證者，為導入標記基因之螢光酵素-綠色螢光蛋白質(GFP)融合基因或DsRed表現卡匣(cassette)。治療用基因的導入並未受到驗證。亦無關於組合複數個治療用基因的暗示(專利文獻2)。

另一方面，於使用重組蛋白質之探討中，作為對單離之CD8⁺T細胞的作用，有報告了雖單獨以人類之重組介白素-7(IL-7)蛋白質，並無誘發CD8⁺T細胞產生可檢測等級之干擾素-伽瑪(IFN-γ)，但人類之重組IL-7蛋白質與人類之重組IL-12蛋白質之組合會協同作用性地促進該IFN-γ產生(The Journal of Immunology、1995、Vol.154、p.5093-5102)。關於表現免疫刺激分子之腫瘤溶解性牛痘病毒，係報告了藉由強的免疫反應，而有早期清除病毒之可能性。其亦說明了強的免疫反應，對於牛痘病毒所媒介的癌治療法而言，可能為敵方亦可能為我方(Molecular Therapy、2005、Vol.11、No.2、p.180-195)。

〔先前技術文獻〕〔專利文獻〕

[專利文獻1]國際公開第2015/150809號

[專利文獻2]國際公開第2015/076422號

本發明之課題，為提供用以預防或治療癌之基因重組牛痘病毒(特別是腫瘤溶解性的牛痘病毒)、醫藥組成物及組合套組。

本發明者等人，於牛痘病毒之製作中，重複相當程度的創意研討，結果，製作出包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒或包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒、以及包含編碼IL-7之多核苷酸及編碼IL-12之多核苷酸的2種多核苷酸之牛痘病毒(實施例2)，且發現了1)包含編碼IL-7之多核苷酸及編碼IL-12之多核苷酸的2種多核苷酸之牛痘病毒、以及2)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒與包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之2種牛痘病毒之混合物，對各種人類癌細胞會顯示出細胞溶解作用(實施例3)，而完成了本發明。

1)包含編碼IL-7之多核苷酸及編碼IL-12之多核苷酸的2種多核苷酸之牛痘病毒，於荷癌人類化小鼠模式中顯示出腫瘤退縮作用(實施例6)，於同系荷癌小鼠模式中顯示出完全緩解(實施例7)，進一步地，可誘導獲得性免疫而持續抗腫瘤效果(實施例8)。又，2)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒與包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之2種牛痘病毒之混合物，於同系荷癌小鼠模式中顯示出完全緩解(實施例7)，進一步地，可誘導獲得性免疫而持續抗腫瘤效果(實施例8)。

亦即，本發明作為醫學上或產業上有用的物質或方法，可包含以下發明。

[1]一種牛痘病毒，其包含以下之(1)及(2)：(1)編碼介白素-7(IL-7)之多核苷酸；及(2)編碼介白素-12(IL-12)之多核苷酸。

[2]一種醫藥組成物，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)一種含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物，其係用以與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用；或(2)一種含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物，其係用以與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用。

[3]一種組合套組，其含有以下之(1)及(2)之牛痘病毒：(1)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒；及(2)包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒。

[4]如[1]之牛痘病毒，其係使牛痘病毒增殖因子(VGF)之功能缺損。

[5]如[1]之牛痘病毒，其係使O1L之功能缺損。

[6]如[1]之牛痘病毒，其係使VGF及O1L之功能缺損。

[7]如[1]之牛痘病毒，其係使B5R細胞外區域之SCR(short consensus repeat)結構域缺失。

[8]如[1]之牛痘病毒，其係使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失。

[9]如[1]及[4]~[8]中任一項之牛痘病毒，其係LC16mO株。

[10]一種醫藥組成物，其含有如[1]及[4]~[9]中任一項之牛痘病毒及藥學上容許之賦形劑。

[11]如[2]之醫藥組成物或[3]之套組，其中牛痘病毒係使VGF之功能缺損。

[12]如[2]之醫藥組成物或[3]之套組，其中牛痘病毒係使O1L之功能缺損。

[13]如[2]之醫藥組成物或[3]之套組，其中牛痘病毒係使VGF及O1L之功能缺損。

[14]如[2]之醫藥組成物或[3]之套組，其中牛痘病毒係使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失。

[15]如[2]之醫藥組成物或[3]之套組，其中牛痘病毒係使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失。

[16]如[2]及[11]~[15]中任一項之醫藥組成物或[3]及[11]~[15]中任一項之套組，其中牛痘病毒為LC16mO株。

[17]如[2]及[11]~[16]中任一項之醫藥組成物或[3]及[11]~[16]中任一項之套組，其含有藥學上容許之賦形劑。

[18]如[10]~[17]中任一項之醫藥組成物或套組，其係癌之預防或治療用。

[19]如[18]之醫藥組成物或套組，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。

[20]一種預防或治療癌之方法，其包含對必需進行癌之預防或治療的對象投與如[1]及[4]~[9]中任一項之牛痘病毒的步驟。

[21]如[20]之方法，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。

[22]如[1]及[4]~[9]中任一項之牛痘病毒，其係使用於癌之預防或治療。

[23]如[22]之牛痘病毒，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。

[24]一種如[1]及[4]~[9]中任一項之牛痘病毒之使用，其係用於製造癌之預防或治療用醫藥組成物。

[25]如[24]之使用，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。

[26]一種預防或治療癌之方法，其包含對必需進行癌之預防或治療的對象，投與(1)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒；及(2)包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之步驟。

[27]如[26]之方法，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。

[28]一種牛痘病毒，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用，而使用於癌之預防或治療的包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒；或(2)與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用，而使用於癌之預防或治療的包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒。

[29]如[28]之牛痘病毒，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。

[30]一種牛痘病毒之使用，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)用以製造與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的癌之預防或治療用醫藥組成物的包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之使用；或(2)用以製造與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的癌之預防或治療用醫藥組成物的包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之使用。

[31]如[30]之使用，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。

[32]一種(1)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒及(2)包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之使用，其係用於製造癌之預防或治療用之組合套組。

[33]如[32]之使用，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。

本發明之牛痘病毒、以及本發明之醫藥組成物及組合套組中所含有的牛痘病毒，係為顯示出腫瘤溶解作用，且於癌細胞中使病毒中搭載之多核苷酸所編碼的IL-12多肽及IL-7多肽表現，而達成完全緩解及獲得性免疫者，本發明之牛痘病毒、醫藥組成物及組合套組，可使用於癌之預防或治療。

[圖1]顯示本發明所使用之轉移載體質體(transfer vector plasmid)DNA的1例。圖1上部表示將連結於啟動子而能夠作動之BFP基因接入VGF基因內之例子。圖1下部表示將連結於啟動子而能夠作動之BFP基因接入O1L基因內之例子。

[圖2]表示各種重組牛痘病毒(LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-LacZ及該病毒載體製作過程中所構築之各種病毒)之基因體構造的示意圖。

[圖3]表示各種重組牛痘病毒(LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-LacZ、LC16mO △SCR VGF-SP-IL7/O1L-SP-LacZ)之基因體構造的示意圖。

[圖4]表示重組牛痘病毒(LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-IL7)之基因體構造的示意圖。

[圖5-1]表示重組牛痘病毒(LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-IL7)之腫瘤溶解性。縱軸表示癌細胞生存率(%)。誤差槓表示標準差。

[圖5-2]表示重組牛痘病毒(LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-IL7)之腫瘤溶解性。縱軸表示癌細胞生存率(%)。誤差槓表示標準差。圖5-1與圖5-2，除了所測定之細胞種類不同以外，係為以相同實驗條件得到者。

[圖5-3]表示重組牛痘病毒2種類混合物(LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-LacZ與LC16mO △SCR VGF-SP-IL7/O1L-SP-LacZ之混合物)之腫瘤溶解性。縱軸表示癌細胞生存率(%)。誤差槓表示標準差。

[圖5-4]表示重組牛痘病毒2種類混合物(LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-LacZ與LC16mO △SCR VGF-SP-IL7/O1L-SP-LacZ之混合物)之腫瘤溶解性。縱軸表示癌細胞生存率(%)。誤差槓表示標準差。圖5-3與圖5-4，除了所測定之細胞種類不同以外，係為以相同實驗條件得到者。

以下詳述本發明。

<本發明之牛痘病毒、合併使用用之醫藥組成物及組合套組>

本發明提供一種牛痘病毒，其包含以下之(1)及(2)：(1)編碼IL-7之多核苷酸；及(2)編碼IL-12之多核苷酸。

(本說明書中，將該牛痘病毒亦稱為「本發明之牛痘病毒」)。

又，本發明提供一種醫藥組成物，其係由以下之(1)或(2)中選擇： (1)用以與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物；或 (2)用以與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物。

(本說明書中，將該醫藥組成物亦稱為「本發明之合併使用用之醫藥組成物」，將上述(1)或(2)記載的本發明之合併使用用之醫藥組成物中所分別含有的包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒或包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒，亦稱為「合併使用用之牛痘病毒」)。

又，本發明提供一種組合套組，其含有以下之(1)及(2)之牛痘病毒：(1)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒；及(2)包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒。

(本說明書中，將該組合套組亦稱為「本發明之組合套組」，將本發明之組合套組中所含有的各牛痘病毒，亦稱為「組合套組用之牛痘病毒」)。

本發明之組合套組，意指用於投與(1)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒及(2)包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之2種牛痘病毒的1或複數之醫藥組成物。兩種牛痘病毒同時投與時，組合套組可於如粉末劑之單一之醫藥組成物中一起含有或於複數之醫藥組成物中各別含有上述2種之組合套組用之牛痘病毒。因此，本發明之組合套組，包含：含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒及包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之2種牛痘病毒的醫藥組成物。未同時投與兩種組合套組用之牛痘病毒時，組合套組係分別於各別之醫藥組成物中含有上述2種之組合套組用之牛痘病毒。例如，組合套組係於單一包裝中的各別之醫藥組成物中，或於各別包裝中之各別之醫藥組成物中含有上述2種之組合套組用之牛痘病毒而成。本發明之組合套組，可含有藥學上容許之賦形劑。

本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒，及組合套組用之牛痘病毒中所使用的牛痘病毒，為屬於痘病毒科正痘病毒屬之病毒。本發明中所使用的牛痘病毒株並無限定，可列舉例如Lister株、New York City Board of Health(NYBH)株、Wyeth株、哥本哈根株、Western Reserve(WR)株、Modified Vaccinia Ankara(MVA)株、EM63株、池田株、大連株、Tian Tan株等，Lister株、MVA株，可由美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得(各為ATCC VR-1549及ATCC VR-1508)。進而，本發明中所使用的牛痘病毒，亦可使用以此等株為來源所確立之牛痘病毒株。例如本發明中所使用的牛痘病毒，亦可使用由Lister株所確立之LC16株、LC16m8株，及LC16mO株。LC16mO株係以Lister株為親株而低溫繼代，經LC16株所生產之株。LC16m8株係將LC16mO株進一步低溫繼代所生產，於編碼病毒膜蛋白質之基因即B5R基因上有讀框轉移變異，藉由使該蛋白質不會表現及發揮功能而弱毒化之株(蛋白質核酸酵素、2003、Vol.48、p.1693-1700)。Lister株、LC16m8株及LC16mO株之全部基因體序列，例如分別已知有Accession No.AY678276.1、Accession No.AY678275.1及Accession No.AY678277.1。因此，可自Lister株藉由公知之同源重組或部位特異性突變導入法，來製作LC16m8株，及LC16mO株。

於1個實施形態中，本發明中所使用的牛痘病毒為LC16mO株。

本發明中所使用的牛痘病毒，可使用弱毒化及/或腫瘤選擇性牛痘病毒。本說明書中，「弱毒化」意指對正常細胞(例如非腫瘤細胞)之毒性(例如細胞溶解性)低。本說明書中，「腫瘤選擇性」意指對腫瘤細胞之毒性(例如腫瘤溶解性)較正常細胞(例如非腫瘤細胞)更高。本發明中所使用的牛痘病毒，可使用實施了使特定蛋白質之功能缺損，或抑制特定基因或蛋白質之表現的基因改變之牛痘病毒(Expert Opinion on Biological Therapy、2011、Vol.11、p.595-608)。例如，為了提高牛痘病毒之腫瘤選擇性，可使用使TK之功能缺損的牛痘病毒(Cancer Gene Therapy、1999、Vol.6、p.409-422)、使VGF之功能缺損的牛痘病毒(Cancer Research、2001、Vol.61、p.8751- 8757)、包含修飾TK基因及修飾血球凝集素(HA)基因以及修飾F3基因或經中斷之F3基因座的牛痘病毒(國際公開第2005/047458號)、使VGF及O1L之功能缺損的牛痘病毒(國際公開第2015/076422號)、將於癌細胞表現降低之微型RNA(micro RNA)的標的序列插入B5R基因的3’非轉譯區域之牛痘病毒(國際公開第2011/125469號)、使VGF及TK之功能缺損的牛痘病毒(Cancer Research、2001、Vol.61、p.8751-8757)、使TK及HA以及F14.5L之功能缺損的牛痘病毒(Cancer Research、2007、Vol.67、p.10038-10046)、使TK及B18R之功能缺損的牛痘病毒(PLoS Medicine、2007、Vol.4、p.e353)、使TK及核糖核苷酸還原酵素之功能缺損的牛痘病毒(PLoS Pathogens、2010、Vol.6、p.e1000984)、使SPI-1及SPI-2之功能缺損的牛痘病毒(Cancer Research、2005、Vol.65、p.9991-9998)、使SPI-1、SPI-2及TK之功能缺損的牛痘病毒(Gene Therapy、2007、Vol.14、p.638-647)，或於E3L及K3L區域具有變異的牛痘病毒(國際公開第2005/007824號)。又，可使用使O1L之功能缺損的牛痘病毒(Journal of Virology、2012、Vol.86、p.2323-2336)。又，可期待於生體內減弱抗牛痘病毒抗體之中和效果所致的病毒排除，而使用使B5R之細胞外區域缺損的牛痘病毒(Virology、2004、Vol.325、p.425-431)或使A34R區域缺損的牛痘病毒(Molecular Therapy、2013、Vol.21、p.1024-1033)。又，可期待牛痘病毒所致之免疫細胞活化作用，而使用使介白素-1b(IL- 1b)受體缺損的牛痘病毒(國際公開第2005/030971號)。此等外來基因之插入或基因的缺失、變異，例如可藉由公知之同源重組或部位特異性突變導入法來進行。又，本發明中，牛痘病毒可使用具有此等基因改變之組合的牛痘病毒。本說明書中，「缺損」意指由該用語所界定之基因區域不具有功能，能夠以包含使由該用語所界定之基因區域缺失的意義使用。例如「缺損」可為於由特定基因區域所成的區域產生缺失、亦可為於包含特定基因區域之周邊的基因區域產生缺失。

於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係使VGF之功能缺損。於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係使O1L之功能缺損。於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係使VGF及O1L之功能缺損。可基於國際公開第2015/076422號所記載之方法，自牛痘病毒使VGF及/或O1L之功能缺損。

VGF為與上皮增殖因子(EGF)具有高的胺基酸序列相同性之蛋白質，其與EGF同樣地結合於上皮增殖因子受體，引起Ras、Raf、分裂促進因子活化蛋白質激酶(Mitogen-activated protein kinase、MAPK)/細胞外訊息調節激酶(the extracellular signal-regulated kinase、ERK)激酶(MAPK/ERK激酶、MEK)、以及ERK與隨後的訊息串列(signal cascade)之活化，促進細胞分裂。

O1L係維持ERK之活化，與VGF一起有助於細胞分裂。

牛痘病毒之VGF及/或O1L之功能缺損，係指編碼VGF的基因及/或編碼O1L的基因不表現，或即使表現，其表現蛋白質亦未保持VGF及/或O1L之正常功能。為了使牛痘病毒之VGF及/或O1L之功能缺損，只要使編碼VGF的基因及/或編碼O1L的基因之全部或一部分缺失即可。又，亦可藉由鹼基之取代、缺失、插入或附加，使基因變異，使正常的VGF及/或O1L無法表現。又，亦可於編碼VGF的基因及/或編碼O1L的基因中插入外來基因。本發明中，藉由基因之取代、缺失、插入或附加等之變異，而未表現正常基因產物時，稱為基因缺損。

本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒是否使VGF及/或O1L之功能缺損，可使用公知之方法判斷。例如可藉由進行VGF及/或O1L之功能評估、以使用抗VGF之抗體或抗O1L之抗體的免疫化學方法來確認VGF或O1L的存在，或以聚合酶連鎖反應(PCR)來決定編碼VGF的基因或編碼O1L的基因之存在，以進行判斷。

B5R(Accession No.AAA48316.1)為存在於牛痘病毒之外套膜(envelope)的第1型跨膜蛋白質，其於病毒感染及傳播於鄰接之細胞或宿主體內的其他部位時，具有提高感染效率的作用。B5R之細胞外區域係存在有4個稱為SCR結構域的構造(Journal of Virology、1998、Vol.72、 p.294-302)。於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係使B5R之細胞外區域的SCR結構域缺失。

牛痘病毒之B5R細胞外區域的SCR結構域之缺失，係指包含B5R細胞外區域之4個SCR結構域的一部分或全體之缺失，且編碼B5R細胞外區域內之4個SCR結構域的一部分或全體之基因區域不表現，或所表現之B5R蛋白質未保持細胞外區域之4個SCR結構域的一部分或全體者。於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒中，B5R係使4個SCR結構域全部缺失。於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒中所缺失之4個SCR結構域，為對應於上述Accession No.AAA48316.1之胺基酸序列中第22號之胺基酸至第237號之胺基酸的區域。

本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒是否使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失，可使用公知之方法來判斷。例如可藉由以使用抗SCR結構域之抗體的免疫化學方法來確認SCR結構域之存在，或以PCR決定編碼SCR結構域的基因之存在或大小，以進行判斷。

於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失之牛痘病毒。

於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失之LC16mO株牛痘病毒。

於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒，係包含編碼IL-7之多核苷酸及編碼IL-12之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損之牛痘病毒。

於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒，係包含編碼IL-7之多核苷酸及編碼IL-12之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損之LC16mO株牛痘病毒。

於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒，係包含編碼IL-7之多核苷酸及編碼IL-12之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失之牛痘病毒。

於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒，係包含編碼IL-7之多核苷酸及編碼IL-12之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失之LC16mO株牛痘病毒。

於1個實施形態中，合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係包含編碼IL-7之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損之牛痘病毒，或包含編碼IL-12之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損之牛痘病毒。

於1個實施形態中，合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係包含編碼IL-7之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損之LC16mO株牛痘病毒，或包含編碼IL-12之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損之LC16mO株牛痘病毒。

於1個實施形態中，合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係包含編碼IL-7之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失之牛痘病毒，或包含編碼IL-12之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失之牛痘病毒。

於1個實施形態中，合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，係包含編碼IL-7之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失之LC16mO株牛痘病毒，或包含編碼IL-12之多核苷酸，且使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失之LC16mO株牛痘病毒。

IL-7為對IL-7受體作為促效劑而發揮功能的分泌性蛋白質。IL-7被報告有助於T細胞或B細胞等之生存、增殖及分化(Current Drug Targets、2006、Vol.7、p.1571-1582)。本發明中，IL-7，包含天然存在之IL-7及具有其功能之修飾體。於1個實施形態中，IL-7為人類IL-7。本發明中，人類IL-7，包含天然存在之人類IL-7及具有其功能之修飾體。於1個實施形態中，人類IL-7，係選自由以下之(1)~(3)所成群組： (1)包含Accession No.NP_000871.1所示之胺基酸序列，且具有人類IL-7之功能的多肽；(2)由於Accession No.NP_000871.1所示之胺基酸序列中，1~10個之胺基酸經缺失、取代、插入，及/或附加之胺基酸序列所構成，且具有人類IL-7之功能的多肽；以及(3)包含與Accession No.NP_000871.1所示之胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列，且具有人類IL-7之功能的多肽。

此處，人類IL-7之功能，係指對各種人類免疫細胞之生存、增殖及分化作用。

較佳為，本發明中所使用的人類IL-7，為由Accession No.NP_000871.1所示之胺基酸序列所構成的多肽。

IL-12，為IL-12次單元p40與IL-12次單元α之異二聚體(heterodimer)。IL-12被報告具有活化及分化誘導T細胞及NK細胞的功能(Cancer Immunology Immunotherapy、2014、Vol.63、p.419-435)。本發明中，IL-12包含天然存在之IL-12及具有其功能之修飾體。於1個實施形態中，IL-12為人類IL-12。本發明中，人類IL-12，包含天然存在之人類IL-12及具有其功能之修飾體。於1個實施形態中，人類IL-12，作為人類IL-12次單元p40與人類IL-12次單元α之組合，係選自由以下之(1)~(3)所成群組：(1)(1-a)包含Accession No.NP_002178.2所示之胺基酸序列的多肽、(1-b)由Accession No.NP_002178.2所示之胺基酸序列中1~10個之胺基酸經缺失、取代、插入，及/或附加之胺基酸序列所構成的多肽，或(1-c)包含與Accession No.NP_002178.2所示之胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列之多肽，以及(2-a)包含Accession No.NP_000873.2所示之胺基酸序列的多肽、(2-b)由Accession No.NP_000873.2所示之胺基酸序列中1~10個之胺基酸經缺失、取代、插入，及/或附加之胺基酸序列所構成的多肽，或(2-c)包含含有與Accession No.NP_000873.2所示之胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列之多肽，且具有人類IL-12功能之多肽；(2)(1-a)由Accession No.NP_002178.2所示之胺基酸序列所構成的多肽，以及(2-a)包含Accession No.NP_000873.2所示之胺基酸序列的多肽、(2-b)由Accession No.NP_000873.2所示之胺基酸序列中1~10個之胺基酸經缺失、取代、插入，及/或附加之胺基酸序列所構成的多肽，或(2-c)包含含有與Accession No.NP_000873.2所示之胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列之多肽，且具有人類IL-12功能之多肽；以及(3)(1-a)包含Accession No.NP_002178.2所示之胺基酸序列的多肽、(1-b)由Accession No.NP_002178.2所示之胺基酸序列中1~10個之胺基酸經缺失、取代、插入，及/或附加之胺基酸序列所構成的多肽，或(1-c)包含與 Accession No.NP_002178.2所示之胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列之多肽，以及(2-a)包含由Accession No.NP_000873.2所示之胺基酸序列所構成的多肽，且具有人類IL-12功能之多肽。

此處，人類IL-12之功能，係指T細胞或NK細胞之活化作用，及/或分化誘導作用。IL-12次單元p40及IL-12次單元α可藉由直接鍵結，形成IL-12。又，IL-12次單元p40及IL-12次單元α可透過連接子鍵結。

較佳為，本發明中所使用的人類IL-12，為包含由Accession No.NP_002178.2所示之胺基酸序列所構成的多肽及由Accession No.NP_000873.2所示之胺基酸序列所構成的多肽之多肽。

本說明書中，「同一性」意指藉由NEEDLE program(Journal of Molecular Biology、1970、Vol.48、p.443-453)檢索，使用準備為預設值之參數所得到的值Identity。前述參數如以下所示。

Gap penalty=10

Extend penalty=0.5

Matrix=EBLOSUM62

本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，具有腫瘤溶解活性。評估被驗病毒是否具有腫瘤溶解活性之方法，可列舉評估病毒添加所致之癌細胞的生存率降低之方法。評估所使用的癌細胞，可列舉例如惡性黑色素瘤細胞RPMI-7951(例如ATCC HTB-66)、肺腺癌細胞HCC4006(例如ATCC CRL-2871)、肺癌細胞A549(例如ATCC CCL-185)、小細胞肺癌細胞DMS 53(例如ATCC CRL-2062)、肺扁平上皮癌細胞NCI-H226(例如ATCC CRL-5826)、腎癌細胞Caki-1(例如ATCC HTB-46)、膀胱癌細胞647-V(例如DSMZ ACC 414)、頭頸部癌細胞Detroit 562(例如ATCC CCL-138)、乳癌細胞JIMT-1(例如DSMZ ACC 589)、乳癌細胞MDA-MB-231(例如ATCC HTB-26)、食道癌細胞OE33(例如ECACC 96070808)、神經膠母細胞瘤U-87MG(例如ECACC 89081402)、神經母細胞瘤GOTO(例如JCRB JCRB0612)、骨髓瘤RPMI 8226(例如ATCC CCL-155)、卵巢癌細胞SK-OV-3(例如ATCC HTB-77)、卵巢癌細胞OVMANA(例如JCRB JCRB1045)、大腸癌細胞RKO(例如ATCC CRL-2577)、大腸癌細胞HCT 116(例如ATCC CCL-247)、胰臟癌細胞BxPC-3(例如ATCC CRL-1687)、攝護腺癌細胞LNCaP clone FGC(例如ATCC CRL-1740)、肝癌細胞JHH-4(例如JCRB JCRB0435)、中皮瘤NCI-H28(例如ATCC CRL-5820)、子宮頸癌細胞SiHa(例如ATCC HTB-35)，及胃癌細胞Kato III(例如RIKEN BRC RCB2088)。具體的評估方法，可使用如例如後述實施例3所記載的方法。

本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，會產生IL-7及/或IL-12多肽。若使用本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒時，藉由產生IL-7及IL-12多肽，抗腫瘤效果會顯著提高。IL-7及IL-12之產生，可使用於該領域公知之方法確認。例如可藉由將導入有編碼IL-7及IL-12之各多肽的多核苷酸之牛痘病毒與癌細胞培養之後，測定培養上清液中之IL-7及IL-12濃度，或藉由細胞之免疫染色或細胞溶解物之西方點墨解析或測定細胞溶解物中之IL-7及IL-12濃度來確認。IL-7及IL-12之各濃度，例如可分別使用Human IL-7 ELISA kit(RayBiotech公司)、Human IL-12 p70 DuoSet ELISA(R&D Systems公司)來測定。作為具體評估培養上清液中或細胞溶解物中之各種多肽濃度的方法，可使用如後述實施例4記載之方法。細胞之免疫染色或細胞溶解物之西方點墨解析，可分別使用市售之抗IL-7抗體、抗IL-12抗體來進行。

各編碼IL-7及IL-12之多核苷酸，可基於可公開利用之序列資訊，利用於該領域公知之多核苷酸合成方法來合成。又，若一旦取得各個多核苷酸，則亦可使用部位特異性變異誘發法(Current Protocols in Molecular Biology edition、1987、John Wiley & Sons Section 8.1-8.5)等之所屬技術領域中具有通常知識者所公知之方法，藉由於特定部位導入變異，來製作具有各多肽之功能的修飾體。

各編碼IL-7及IL-12之多核苷酸，可藉由公知之同源重組或部位特異性突變導入法，對牛痘病毒導入。例如可製作於欲導入之部位的鹼基序列中導入有該多核苷酸的質體(亦稱為轉移載體質體DNA)，並導入於感染了牛痘病毒之細胞中。較佳為，編碼各個外來基因IL-7及IL-12之多核苷酸的導入區域，為對牛痘病毒之生命週期而言非必需的基因區域。例如其一態樣中，IL-7及/或IL-12之導入區域，於VGF功能缺損牛痘病毒中，可為該VGF基因之內部，於O1L功能缺損牛痘病毒中，可為該O1L基因之內部，於具有VGF功能缺損與O1L功能缺損兩方的牛痘病毒中，可為該VGF基因及該O1L基因之任一方或兩方之內部。上述中，外來基因可為以與VGF及O1L基因之轉錄方向相同方向或相反方向轉錄的方式導入。

轉移載體質體DNA對細胞之導入方法並無特殊限定，例如可使用磷酸鈣法、電穿孔法等。

導入各編碼外來基因IL-7及IL-12之多核苷酸時，可於外來基因之上游以可作動的方式連結適當的啟動子。藉此，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒中，外來基因可連結於可在腫瘤細胞表現之啟動子。此等啟動子可列舉例如PSFJ1-10、PSFJ2-16、p7.5K啟動子、p11K啟動子、T7.10啟動子、CPX啟動子、HF啟動子、H6啟動子，及T7雜交型啟動子(T7 hybrid promoter)等。

於1個實施形態中，本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒，不具有藥劑選擇標記基因。

本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒之表現及/或增殖，可藉由使牛痘病毒感染宿主細胞，且培養經感染之宿主細胞來進行。牛痘病毒之表現及/或增殖，可藉由於該領域公知之方法進行。用以使本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒表現或增殖的宿主細胞，只要為可使本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒表現、增殖者，則無特殊限制。如此之宿主細胞，可列舉例如BS-C-1、A549、RK13、HTK-143、Hep-2、MDCK、Vero、HeLa、CV-1、COS、BHK-21，及初代兔子腎臟細胞等之動物細胞，較佳可使用BS-C-1(ATCC CCL-26)、A549(ATCC CCL-185)、CV-1(ATCC CCL-70)或RK13(ATCC CCL-37)。宿主細胞之培養條件，例如溫度、培養基之pH，及培養時間，係適當選擇。

生產本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒的方法，除了使本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒感染宿主細胞，並培養經感染之宿主細胞，使本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒表現的步驟以外，可進一步包含將本發明之牛痘病毒、合併使用用之牛痘病毒或組合套組用之牛痘病毒回收，較佳為純化之步驟。純化方法，可使用利用了Benzonase之DNA消化、蔗糖梯度離心分離法、Iodixanol密度梯度離心分離法、超微過濾法，及濾洗(diafiltration)法等。

<本發明之醫藥組成物>

本發明之醫藥組成物，包含含有本發明之牛痘病毒及藥學上容許之賦形劑的醫藥組成物。本發明之醫藥組成物，亦包含本發明之合併使用用之醫藥組成物。於1個實施形態中，本發明之合併使用用之醫藥組成物，含有藥學上容許之賦形劑。

本發明之醫藥組成物，可使用於該領域中通常使用之賦形劑，亦即藥劑用賦形劑或藥劑用載體等，藉由通常使用之方法來配製。此等醫藥組成物之劑型的例子，可列舉例如注射劑，及點滴用劑等之非經口劑，可藉由靜脈內投與、皮下投與，或腫瘤內投與等進行投與。於製劑化時，可於藥學上容許之範圍，使用因應此等劑型之賦形劑、藥用載體，或添加劑等。

有效投與量係依患者之症狀的程度或年齡、所使用之製劑的劑型，或病毒的力價等而異，例如就單獨病毒之有效投與量而言、就組合套組中之2種類病毒的合計有效投與量而言，或就合併使用投與時之2種類病毒的合計有效投與量而言，可使用10²~10¹⁰溶菌斑形成單位(PFU)左右。組合套組中之2種類之病毒投與量的比率，例如能夠以1比10~10比1左右、1比5~5比1左右、1比3~3比1左右、1比2~2比1左右，或約1比1來使用。

<癌之預防或治療用途>

本發明之醫藥組成物，可使用作為選自由癌、例如惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之預防或治療劑。

本發明包含含有本發明之牛痘病毒或合併使用用之牛痘病毒的癌之預防或治療用醫藥組成物，例如選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之預防或治療用醫藥組成物。

本發明包含含有各組合套組用之牛痘病毒的癌之預防或治療用組合套組，例如選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之預防或治療用組合套組。

又，本發明包含：包含對必需進行癌之預防或治療的對象(例如患者)投與本發明之牛痘病毒之步驟的癌之預防或治療方法，例如預防或治療選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之方法。

又，本發明包含：包含對必需進行癌之預防或治療的對象(例如患者)投與以下之(1)及(2)之步驟的癌之預防或治療方法，例如預防或治療選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之方法。

(1)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒；及(2)包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒。

該2種牛痘病毒，可同時地、分別地、連續地，或間隔地投與至對象。

又，本發明包含用於預防或治療癌，例如選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之本發明之牛痘病毒。

又，本發明包含用於預防或治療癌，例如選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之由以下之(1)或(2)中選擇的牛痘病毒。

(1)與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用，而使用於癌之預防或治療、包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒；或(2)與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用，而使用於癌之預防或治療、包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒。

進一步地，本發明包含用於製造癌，例如選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之預防或治療用之醫藥組成物的本發明之牛痘病毒之使用。

進一步地，本發明包含用於製造癌，例如選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之預防或治療用之醫藥組成物的由以下之(1)或(2)中選擇的牛痘病毒之使用： (1)用以製造與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的癌之預防或治療用醫藥組成物的包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之使用；或(2)用以製造與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的癌之預防或治療用醫藥組成物的包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之使用。

進一步地，本發明包含用於製造癌，例如選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌之預防或治療用之組合套組的包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒及包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之使用。

本說明書中，「預防用」係以與「用以預防之」相同意義地使用，「治療用」係以與「用以治療之」相同意義地使用。

本發明之醫藥組成物或組合套組，能夠與對癌，例如選自由惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌，及胃癌等所成群組的癌顯示出有效性之各種治療劑合併使用。該合併使用，可同時投與，或各別地連續，或隔著所期望之時間間隔來進行投與。本發明之醫藥組成物，於同時投與的情況時，可為摻合劑亦可各別地經製劑化。

本發明之牛痘病毒、本發明之醫藥組成物、本發明之組合套組、本發明之預防或治療癌之方法，或本發明之使用所適用的癌，亦包含對原發病灶以外之臟器，例如對淋巴節或肝臟等之轉移性癌等。

關於本發明雖經全面性記載，但於此提供為了進一步得到理解所參照之特定實施例，然而此等係以例示為目的者，並非限定本發明者。

〔實施例〕

關於使用市售之套組或試藥等的部分，只要無特別指明，係遵照所添附之實驗指南(protocol)進行實驗。

(實施例1：轉移載體質體DNA之構築)

藉由同源重組法，如以下方式製作用以製作重組牛痘病毒之轉移載體質體DNA。

(1)pTN-VGF-P-DsRed轉移載體質體DNA之構築

基於國際公開第2015/076422號製作pUC19-VGF載體。更具體而言，為了製作pUC19-VGF載體，使用LC16mO株之基因體DNA(Accession No.AY678277.1)作為模板，使用Invitrogen公司之pUC19載體(產品編碼：54357)。將所製作之pUC19-VGF載體以限制酵素AccI切斷後，使末端鈍化(blunting)。藉由於該切斷部位插入包含p7.5k啟動子與DsRed片段之DNA片段(序列編號22)，構築轉移載體質體DNA。將所構築之質體DNA稱為pTN-VGF-P-DsRed。

(2)pTN-VGF-SP-IL12及pTN-VGF-SP-IL7轉移載體質體DNA之構築

以pTagBFP-N vector(FP172、Evrogen公司)之DNA為模板，藉由2個引子(序列編號1及序列編號2)放大BFP基因區域。將該PCR產物以限制酵素SfiI及EcoRI切斷，選殖於pTK-SP-LG載體(國際公開第2015/076422號。惟，使用LC16mO株之基因體DNA(Accession No.AY678277.1)作為模板，且使用Invitrogen公司之pUC19載體(產品編碼：54357)。又，pVNC110-Luc/IRES/EGFP質體係使用國際公開第2011/125469號記載之pVNC110-Luc/IRES/EGFP)之相同限制酵素部位，構築於合成牛痘病毒啟動子(Journal of Virological Methods、1997、Vol.66、p.135-138)下連結有BFP的pTK-SP-BFP。接著，將pTK-SP-BFP以限制酵素SphI及EcoRI切斷，使末端鈍化。將如此所得之DNA片段，選殖入將pUC19-VGF載體以限制酵素AccI切斷且使末端鈍化之部位，藉以構築pTN-VGF-SP-BFP(圖1)。接著，將編碼人類IL-12的多核苷酸(包含人類IL-12次單元p40、內部微脂體導入部位及人類IL-12次單元α之多核苷酸。序列編號7)，及編碼人類IL-7的多核苷酸(序列編號8)(各多核苷酸，分別於5’側包含限制酵素位點accggtcgccacc(序列編號16)及於3’側包含限制酵素位點gctagcgaattc(序列編號17))以限制酵素AgeI與NheI切斷。藉由將各多核苷酸片段選殖於pTN-VGF-SP-BFP之相同限制酵素部位，構築轉移載體質體DNA。將所構築之質體DNA分別稱為pTN-VGF-SP-IL12及pTN-VGF-SP-IL7。

(3)pTN-O1L-SP-BFP、pTN-O1L-SP-LacZ、pTN-O1L-SP-IL12，及pTN-O1L-SP-IL7轉移載體質體DNA之構築

將以與上述(2)相同之方法將pTK-SP-BFP以限制酵素SphI及EcoRI切斷，且使末端鈍化所得之DNA片段，選殖入將pUC19-O1L載體(國際公開第2015/076422號。惟，與pUC19-VGF載體製作相同地，使用LC16mO株之基因體DNA(Accession No.AY678277.1)作為模板，且使用Invitrogen公司之pUC19載體(產品編碼：54357)。O1L基因區域係插入pUC19載體之XbaI位點)以限制酵素XbaI切斷且使末端鈍化之部位，藉以製作轉移載體質體DNA(圖1)。將所製作之質體DNA稱為pTN-O1L-SP-BFP。接著，將含有對於人類使密碼子最佳化過的大腸菌LacZ基因之多核苷酸(序列編號9)、編碼人類IL-12之多核苷酸(序列編號7)，及編碼人類IL-7之多核苷酸(序列編號8)，以限制酵素AgeI與NheI切斷。將編碼LacZ、IL-12，或IL-7之各多核苷酸片段，選殖於pTN-O1L-SP-BFP載體之相同限制酵素部位(AgeI部位及NheI部位)，藉以構築轉移載體質體DNA。所構築之質體DNA分別稱為pTN-O1L-SP-LacZ、pTN-O1L-SP-IL12，及pTN-O1L-SP-IL7。

(4)pTN-DsRed(B5R-)及pTN-B5R△I-4轉移載體質體DNA之構築

以pB5R(國際公開第2011/125469號。惟，使用LC16mO株之基因體DNA(Accession No.AY678277.1)作為模板)之DNA為模板，藉由2個引子(序列編號3及序列編號4)放大B4R基因區域。又，以pDsRed-Express-N1(Clontech公司)之DNA為模板，藉由2個引子(序列編號5及序列編號6)放大DsRed基因區域。將前者之PCR產物以限制酵素NotI及FspI、後者之PCR產物以限制酵素FspI及MfeI切斷。藉由將該2種DNA片段，選殖入經限制酵素NotI及MfeI切斷之pB5R，製作轉移載體質體DNA。將所製作之質體DNA稱為pTN-DsRed(B5R-)。另一方面，將pB5R以限制酵素NotI及NspI，或以限制酵素NspI及SacI切斷。藉由將該2種DNA片段，選殖入經限制酵素NotI與SacI切斷之pB5R，構築轉移載體質體DNA。將所製作之質體DNA稱為pTN-B5R△1-4。pTN-B5R△1-4係編碼4個SCR結構域缺失之B5R蛋白質。該胺基酸序列係為以序列編號18所示之序列。

(實施例2：基因重組牛痘病毒之構築)

由牛痘病毒LC16mO株製作使VGF與O1L之功能缺損的重組牛痘病毒(稱為LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed)。對其使用次世代定序儀PacBio RSII(Pacific Bioscience公司)進行定序，由所得之序列資訊，利用Sprai[BMC GENOMICS.2014 AUG 21；15：699.]軟體進行病毒基因體之再構成以決定鹼基序列，結果具有序列編號21表示之鹼基序列。又，該鹼基序列之兩末端係附加有環狀域(loop)序列，兩末端環狀域序列為序列編號19或20表示之鹼基序列。

(1)回收具備圖2所示之病毒基因體的重組牛痘病毒。以下具體說明回收順序。使LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed以MOI(Multiplicity of infection)=0.02~0.1來感染於6孔盤中培養至80%匯合(confluent)的CV1細胞(ATCC CCL-70)或RK13細胞(ATCC CCL-37)，於室溫吸附1小時。將實施例1(3)中構築之pTN-O1L-SP-BFP與FuGENE(註冊商標)HD Transfection Reagent(Roche)混合，遵照手冊添加於細胞使其攝入，於5%CO₂存在下於37℃培養2~5日。將細胞冷凍融解後，進行超音波震盪處理，藉由下述操作以Opti-MEM(Invitrogen)稀釋為可取得單一溶菌斑的程度。將所得之稀釋液100μL於6孔盤中添加於成為次匯合(subconfluent)的BS-C-1細胞(ATCC CCL-26)或RK13細胞以進行接種。添加含有0.8%甲基織維素(和光純藥、136- 02155)、5%胎牛血清、0.225%碳酸氫鈉(和光純藥、195-16411)及GlutaMAX(TM)Supplement I(GIBCO、35050-061)之Eagle’s MEM培養基(Nissui、05900)2mL，於5%CO₂存在下於37℃培養2~5日。去除培養基，以BFP表現為指標，以尖錐的前端刮取溶菌斑，使其浮游於Opti-MEM。於BS-C-1細胞或RK13細胞進一步重複該操作3次以上，純化溶菌斑，回收病毒溶菌斑(本實施例中，以下將至此為止的程序稱為「回收」)。使回收之溶菌斑浮游於Opti-MEM，進行超音波震盪。使用High Pure Viral Nucleic Acid Kit(Roche)，遵照手冊，由前述超音波震盪溶液200μL中抽出基因體DNA，供PCR篩選。關於VGF，係藉由2個引子(序列編號10及序列編號11)、關於O1L，係藉由2個引子(序列編號12及序列編號13)、關於B5R，係藉由2個引子(序列編號14及序列編號15)進行PCR。於檢測出特定大小的PCR產物之殖株當中，選擇藉由直接定序確認PCR產物之鹼基序列為正確之病毒殖株(稱為LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP。圖2)，於A549細胞(ATCC CCL-185)或RK13細胞增殖後，於RK13細胞測定病毒力價。使用LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP及實施例1(4)中製作之pTN-DsRed(B5R-)，以DsRed表現為指標，來替代BFP表現，以與上述相同之方法回收重組病毒。將回收之病毒稱為LC16mO △-DsRed VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP(圖2)。

(2)回收使B5R蛋白質之4個SCR結構域的重組病毒。具體而言，係使用實施例2(1)中製作之LC16mO △-DsRed VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP及實施例1(4)中構築之pTN-B5R△1-4，以DsRed表現消失為指標，來替代BFP表現，以與實施例2(1)相同之方法回收重組病毒。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP(圖2)。又，使用所製作之LC16mO △SCR VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP及實施例1(1)中構築之pTN-VGF-P-DsRed，以DsRed表現為指標，來替代BFP表現，以與實施例2(1)相同之方法回收重組病毒。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP(圖2)。接著，使用所製作之LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP及實施例1(3)中構築之pTN-O1L-SP-LacZ，以BFP表現消失為指標，來替代BFP表現，以與實施例2(1)相同之方法回收重組病毒。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-LacZ(圖2)。

(3)回收會表現具備圖3所示之病毒基因體的治療基因及標記基因之SCR區域缺失重組牛痘病毒。具體而言，分別使用實施例2(2)中製作之LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-LacZ以及實施例1(2)中構築之轉移載體質體DNA(pTN-VGF-SP-IL12，及pTN-VGF-SP-IL7)，以DsRed表現消失為指標，來替代BFP表現，以與實施例2(1)相同之方法回收各重組病毒。將回收之各病毒稱為LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-LacZ(以下稱為「hIL12搭載牛痘病毒」)、LC16mO △SCR VGF-SP- IL7/O1L-SP-LacZ(以下稱為「hIL7搭載牛痘病毒」)(圖3)。為了純化，使各重組病毒感染A549細胞或RK13細胞。於5%CO₂存在下於37℃培養2~5日後，回收感染細胞。將細胞冷凍融解，進行超音波震盪處理。使用OptiPrep(Axis Shield公司)藉由密度梯度離心分離法純化。之後，於RK13細胞測定各病毒之病毒力價。

(4)回收會表現具備圖4所示之病毒基因體之編碼人類IL-7的多核苷酸及編碼人類IL-12的多核苷酸之SCR結構域缺失重組牛痘病毒。

(4-1)具體而言，使用實施例2(2)中製作之LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP及實施例1(2)中構築之轉移載體質體DNA pTN-VGF-SP-IL12，以DsRed表現消失為指標，來替代BFP表現，以與實施例2(1)相同之方法回收各重組病毒。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-BFP。

(4-2)接著，使用實施例2(4-1)中製作之LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-BFP及實施例1(3)中構築之轉移載體質體DNA pTN-O1L-SP-IL7，以BFP表現消失為指標，來替代BFP表現，以與實施例2(1)相同之方法回收各重組病毒。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-IL7(以下，於後述實施例中，亦稱為「hIL12及hIL7搭載牛痘病毒」)(圖4)。將各重組病毒以實施例2(3)之方法純化後，於RK13細胞測定各病毒之病毒力價。

(實施例3：基因重組牛痘病毒之腫瘤溶解性)

對於實施例2中製作之hIL12及hIL7搭載牛痘病毒，評估於各種人類癌細胞之溶解能力(細胞殺死能力)。又，對於實施例2中製作之hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒的2種之組合混合物，亦同樣地評估於各種人類癌細胞之溶解能力。

具體而言，首先，於96孔盤(AGC TECHNO GLASS公司)中各添加100μL之以培養基(含有10%胎牛血清(GE Healthcare公司)及1%盤尼西林鏈黴素(Life Technologies公司)的下述記載之培養基)懸浮為1×10⁴個/mL之各細胞。培養一夜後，將1)hIL12及hIL7搭載牛痘病毒，及2)將hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒以1比1濃度組合而得的混合物(以下稱為「hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物」)，使用Opti-MEM(Life Technologies公司)，分別稀釋為5×10⁴PFU/mL、5×10⁵PFU/mL，及5×10⁶PFU/mL。於各孔中各添加20μL之各病毒溶液，以MOI=1.0、10、100的方式進行感染。製作未添加細胞之孔，及添加Opti-MEM以替代病毒之孔(MOI=0)，作為控制組。之後，於CO₂濃度5%、設定於37℃之CO₂培養箱中培養5日。使用CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay(Promega公司)測定5日後之細胞生存率。具體而言，係遵照上述分析套組之實驗指南，於各孔中各添加100μL的CellTiter-Glo Reagent，靜置 30分後，將全部之量移至96孔黑盤(康寧公司)，使用EnSpire(PerkinElmer公司)測定各孔之發光強度。於算出在各孔的細胞生存率時，係以未播種細胞之孔的值為0%生存、播種細胞且未添加病毒之孔為100%生存。

所評估之細胞，為惡性黑色素瘤細胞RPMI-7951(ATCC HTB-66)、肺腺癌細胞HCC4006(ATCC CRL-2871)、肺癌細胞A549(ATCC CCL-185)、小細胞肺癌細胞DMS 53、肺扁平上皮癌細胞NCI-H226(ATCC CRL-5826)、腎癌細胞Caki-1(ATCC HTB-46)、膀胱癌細胞647-V(DSMZ ACC 414)、頭頸部癌細胞Detroit 562(ATCC CCL-138)、乳癌細胞JIMT-1(DSMZ ACC 589)、乳癌細胞MDA-MB-231(ATCC HTB-26)、食道癌細胞OE33(ECACC 96070808)、神經膠母細胞瘤U-87MG(ECACC 89081402)、神經母細胞瘤GOTO(JCRB JCRB0612)、骨髓瘤RPMI 8226(ATCC CCL-155)、卵巢癌細胞SK-OV-3(ATCC HTB-77)、卵巢癌細胞OVMANA(JCRB JCRB1045)、大腸癌細胞RKO(ATCC CRL-2577)、大腸癌細胞HCT 116、胰臟癌細胞BxPC-3(ATCC CRL-1687)、攝護腺癌細胞LNCaP clone FGC(ATCC CRL-1740)、肝細胞癌JHH-4(JCRB JCRB0435)、中皮瘤NCI-H28(ATCC CRL-5820)、子宮頸癌細胞SiHa(ATCC HTB-35)，及胃癌細胞Kato III(RIKEN BRC RCB2088)。

作為培養基，係分別使用RPMI-7951、HCC4006、DMS 53、NCI-H226、Caki-1、647-V、Detroit 562、JIMT-1、OE33、U-87MG、GOTO、RPMI8226、SK-OV-3、OVMANA、RKO、HCT 116、BxPC-3、LNCaP clone FGC、JHH-4、NCI-H28，及，Kato III係使用RPMI1640培養基(Sigma-Aldrich公司、R8758)，A549及MDA-MB-231係使用DMEM培養基(Sigma-Aldrich公司、D6429)，SiHa係使用EMEM培養基(ATCC 30-2003)。結果如圖5-1~5-4所示。此處，hIL12及hIL7搭載牛痘病毒之效果，係分為圖5-1及5-2記載，hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物之效果，係分為圖5-3及5-4記載。

其結果，明顯可知hIL12及hIL7搭載牛痘病毒，於所試驗之全部的人類癌細胞中，具有殺死細胞之能力(圖5-1及5-2)。又，明顯可知就hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物而言，亦於所試驗之全部的人類癌細胞中，具有殺死細胞之能力(圖5-3及5-4)。再者，圖5-1至圖5-4中，自左起依序顯示每個細胞株於MOI=0、1、10、100之腫瘤溶解性。

(實施例4：自基因重組牛痘病毒所感染之癌細胞中產生蛋白質)

測定使hIL12及hIL7搭載牛痘病毒感染癌細胞時，自癌細胞所產生之人類IL-7蛋白質及人類IL-12蛋白質的濃度。進一步地，對於hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物亦同樣地測定感染癌細胞時自癌細胞所產生之人類IL-7蛋白質及人類IL-12蛋白質的濃度。

於人類IL-7蛋白質之測定中，具體而言，首先，將經含有10%胎牛血清及1%盤尼西林鏈黴素之RPMI1640培養基懸浮為1×10⁴個/mL的SK-OV-3卵巢癌細胞，於96孔盤中播種100μL。培養一夜後，以Opti-MEM配製1)hIL12及hIL7搭載牛痘病毒，或2)hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物，以MOI=1.0的方式各添加20μL使其感染。之後，於CO₂濃度5%、設定為37℃之CO₂培養箱中培養24小時，回收培養上清液。使用表1所列之ELISA套組及EnSpire測定培養上清液中所含有的蛋白質濃度。

人類IL-12蛋白質之測定中，將以含有10%胎牛血清及1%盤尼西林鏈黴素之RPMI1640培養基懸浮為1×10⁵個/mL之SK-OV-3卵巢癌細胞，於96孔盤中播種100μL。培養一夜後，以Opti-MEM配製1)hIL12及hIL7搭載牛痘病毒，或2)hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物，以MOI=1.0的方式各添加20μL使其感染。之後，於CO₂濃度5%、設定為37℃之CO₂培養箱中培養48小時，回收培養上清液。使用表1所列之ELISA套組及EnSpire測定培養上清液中所含有的蛋白質濃度。

其結果，明顯可知由添加了hIL12及hIL7搭載牛痘病毒之細胞，及由添加了hIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物的細胞中，產生了人類IL-12蛋白質及人類IL-7蛋白質(表2-1及2-2)。

(實施例5：搭載編碼小鼠IL-12之多核苷酸的轉移載體質體DNA之構築及搭載編碼小鼠IL-12之多核苷酸的基因重組牛痘病毒之構築)

(1)遵照實施例1(2)記載之方法，構築轉移載體質體DNA pTN-VGF-SP-mIL12。實施例1(2)記載之方法中，使用編碼小鼠IL-12之多核苷酸(包含小鼠IL-12次單元p40、內部微脂體導入部位及小鼠IL-12次單元α之多核苷酸。序列編號23)，以替代編碼人類IL-12之多核苷酸(序列編號7)，將該多核苷酸片段選殖於pTN-VGF-SP-BFP。

(2)遵照實施例1(3)記載之方法，構築轉移載體質體 DNA pTN-O1L-SP-Luc2。實施例1(3)記載之方法中，使用編碼螢光酵素Luc2基因之多核苷酸(Accession No.DQ188840之第100號至第1752號)，以替代包含大腸菌LacZ基因之多核苷酸(序列編號9)，將該多核苷酸片段選殖於pTN-O1L-SP-BFP。

(3)遵照實施例2(2)之方法，回收重組病毒。實施例2(2)之方法中，使用LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP與實施例5(2)中製作之pTN-O1L-SP-Luc2，以替代pTN-O1L-SP-LacZ。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-Luc2(以下，將本病毒亦稱為「對照牛痘病毒」)。

(4)遵照實施例2(3)之方法，回收重組病毒。實施例2(3)之方法中，使用實施例5(3)中製作之LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-Luc2以替代LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-LacZ，且使用實施例5(1)中製作之pTN-VGF-SP-mIL12以替代pTN-VGF-SP-IL12。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-SP-mIL12/O1L-SP-Luc2(以下亦稱為「mIL12搭載牛痘病毒」)。

(5)遵照實施例2(4-1)之方法，回收重組病毒。實施例2(4-1)之方法中，使用LC16mO △SCR VGF-p7.5-DsRed/O1L-SP-BFP與實施例5(1)中製作之pTN-VGF-SP-mIL12，以替代pTN-VGF-SP-IL12。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-SP-mIL12/O1L-SP-BFP。

進一步地，遵照實施例2(4-2)之方法，回收重組病毒。實施例2(4-2)之方法中，使用上述所製作之LC16mO △SCR VGF-SP-mIL12/O1L-SP-BFP與pTN-O1L-SP-IL7，以替代LC16mO △SCR VGF-SP-IL12/O1L-SP-BFP。將回收之病毒稱為LC16mO △SCR VGF-SP-mIL12/O1L-SP-IL7(以下亦稱為「mIL12及hIL7搭載牛痘病毒」)。

(實施例6：荷癌人類化小鼠中基因重組牛痘病毒的抗腫瘤效果)

對於hIL12及hIL7搭載牛痘病毒，使用經移植人類癌細胞之人類化小鼠(藉由於重度免疫不全小鼠中移入人類造血幹細胞而將免疫系統置換為人類免疫細胞之小鼠)，來評估生體內之抗腫瘤效果。

具體而言，首先，為了製作人類化小鼠，係對於使用X射線照射裝置以2.0戈雷之強度照射過X射線的NOG小鼠(NOD/Shi-scidIL-2RγKO Jic、雌、6週齡、日本CLEA股份有限公司)由尾靜脈注射而移入3×10⁴個來自人類臍帶血的造血幹細胞(Lonza公司)。移入13週後，對小鼠之右背側皮下注射而移植100μL的經PBS懸浮為3×10⁷個/mL之人類肺癌細胞NCI-H1373(ATCC CRL-5866)。癌細胞移植後以游標卡尺測定腫瘤直徑，以各群之腫瘤體積(短徑mm×短徑mm×長徑mm×0.52)的平均值成為37mm³至47mm³的方式進行分群。於同日，將經PBS稀釋為1.0×10⁸PFU/mL之濃度的hIL12及hIL7搭載牛痘病毒，注射20μL於腫瘤內(表中，稱為「hIL12及hIL7搭載VV投與群」)。以將PBS投與20μL於腫瘤內之群為溶劑(PBS)投與群。對各小鼠每2~4日以游標卡尺測定腫瘤直徑，基於上述式算出腫瘤體積，藉由下式對每個個體算出病毒投與後14日之腫瘤體積變化率(%)(n=7~8)：病毒投與後14日之腫瘤體積變化率(%)=100(%)×病毒投與後14日之腫瘤體積(mm³)/病毒投與日之腫瘤體積(mm³)。

當病毒投與後14日之腫瘤體積變化率(%)的各群平均值低於100，且各群之病毒投與後14日之腫瘤體積與病毒投與日之腫瘤體積以Paired t-test檢定而觀察到顯著差(p值<0.05定為具有顯著差)時，判定為具有腫瘤退縮效果。

再者本實施例中，作為相對於hIL12及hIL7搭載牛痘病毒(2×10⁶PFU/個體)的比較病毒，係以相同注射量(20μL)及稀釋溶液(PBS)，使用對照牛痘病毒(2×10⁶PFU/個體)、hIL12搭載牛痘病毒(2×10⁶PFU/個體)，或hIL7搭載牛痘病毒(2×10⁶PFU/個體)(表中分別稱為「對照VV投與群」、「hIL12搭載VV投與群」、「hIL7搭載VV投與群」)。

其結果，於投與hIL12及hIL7搭載牛痘病毒之群中，於病毒投與後14日之腫瘤體積變化率的平均值顯示未達100%。進一步地，將於病毒投與後14日之腫瘤體積與病毒投與日之腫瘤體積以Paired t-test檢定後，觀察到顯著差，故判定具有腫瘤退縮效果(表3)。因此明顯可知hIL12及hIL7搭載牛痘病毒之投與，具有腫瘤退縮效果。另一方面，投與hIL12搭載牛痘病毒或hIL7搭載牛痘病毒之任一方的群中，未確認到腫瘤退縮效果(表3)。

表3：hIL12及hIL7搭載牛痘病毒於荷癌人類化小鼠中的腫瘤體積變化率(%)

(實施例7：同系荷癌小鼠模式中之基因重組牛痘病毒的完全緩解導入效果) (1)關於mIL12及hIL7搭載牛痘病毒

關於mIL12及hIL7搭載牛痘病毒，係使用經同系之小鼠癌細胞株皮下移植之小鼠(同系荷癌小鼠)來評估於生體之完全緩解導入效果。再者，已知人類IL-12對小鼠之免疫細胞不反應，因此使用搭載編碼小鼠IL-12之多核苷酸的基因重組牛痘病毒(實施例5中製作)，以替代編碼人類IL-12之多核苷酸。

具體而言，首先，於C57BL/6J小鼠(雄、5-7週齡、日本Charles River公司)之右腹側，皮下移植50μL的經PBS配製為4×10⁶個/mL之小鼠肺癌細胞 LL/2(LLC1)(ATCC CRL-1642)(以下稱為LLC1)。以與實施例6相同之方法算出腫瘤體積，以各群之腫瘤體積的平均值成為50mm³至60mm³的方式進行分群。翌日將經PBS稀釋為6.7×10⁸PFU/mL之濃度的mIL12及hIL7搭載牛痘病毒對12隻小鼠進行腫瘤內注射30μL(2×10⁷PFU，表中稱為「mIL12及hIL7搭載VV投與群」)。於初次投與之2日後，及4日後亦實施同樣的病毒之腫瘤內注射。以腫瘤內投與30μL之PBS來代替病毒的群作為溶劑(PBS)投與群。

每週2次以游標卡尺測定腫瘤直徑算出腫瘤體積。將最終於病毒初次投與之27日後的觀察中，以觸診觀察不到腫瘤的情況定義為完全緩解，計測顯示出完全緩解之個體數。關於試驗期間中，群的平均腫瘤體積超過1700mm³之群，由動物倫理上之觀點使其安樂死。再者，本實施例中，作為相對於mIL12及hIL7搭載牛痘病毒(2×10⁷PFU/次、3次投與)之比較病毒，係以相同之注射量(30μL/1次投與)及稀釋溶液(PBS)，使用對照牛痘病毒、mIL12搭載牛痘病毒，或hIL7搭載牛痘病毒(各為2×10⁷PFU/次、3次投與)(表中各稱為「對照VV投與群」、「mIL12搭載VV投與群」、「hIL7搭載VV投與群」)。

其結果，於投與mIL12及hIL7搭載牛痘病毒之群中，最終有3例的個體達到完全緩解。另一方面，於投與比較病毒之群中，得不到完全緩解之個體(表4-1)。因此，明顯可知mIL12及hIL7搭載牛痘病毒之投與，於同系荷癌小鼠模式中，相較於hIL7搭載牛痘病毒或mIL12搭載牛痘病毒而言，具有更高的完全緩解導入效果。

(2)關於mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物

關於mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之1比1混合物(以下稱為「mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物」)，係使用同系荷癌小鼠評估於生體中之完全緩解導入效果。

與(1)相同地實施。惟，係移植懸浮為8×10⁶個/mL之小鼠肺癌細胞LLC1。進一步地，係使用mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物(於PBS中，將各病毒稀釋為6.7×10⁸PFU/mL)30μL(各自地2×10⁷PFU/次、3次投與)，以替代稀釋為6.7×10⁸PFU/mL之濃度的mIL12及hIL7搭載牛痘病毒30μL(2×10⁷PFU)(表中稱為「mIL12搭載VV與hIL7搭載VV之混合物之投與群」)。小鼠之個體數係使用7隻。作為比較病毒，係分別以30μL之注射量來使用對照牛痘病毒(4×10⁷PFU/次、3次投與)、mIL12搭載牛痘病毒與對照牛痘病毒之1比1混合物(各自地2×10⁷PFU/次、3次投與)，或hIL7搭載牛痘病毒與對照牛痘病毒之1比1混合物(各自地2×10⁷PFU/次、3次投與)(表中分別稱為「對照VV投與群」、「mIL12搭載VV與對照VV之混合物之投與群」、「hIL7搭載VV與對照VV之混合物之投與群」)。

其結果，於投與mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物的群中，4例的個體達到完全緩解。於投與mIL12搭載牛痘病毒與對照牛痘病毒之混合物的群中，僅1例完全緩解，於投與其他比較病毒的群中，並無完全緩解的例子(表4-2)。因此，明顯可知mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物，於同系荷癌小鼠模式中，相較於含有hIL7搭載牛痘病毒或mIL12搭載牛痘病毒之任一方的混合物而言，具有更高的完全緩解導入效果。

(實施例8：於同系荷癌小鼠模式中，基因重組牛痘病毒的獲得性免疫效果(獲得性免疫所致之腫瘤的排斥效果))

(1)關於mIL12及hIL7搭載牛痘病毒：對於經mIL12及hIL7搭載牛痘病毒處置且結果完全緩解之小鼠，進行相同癌細胞之再移植實驗，評估病毒所致之獲得性免疫效果。

具體而言，首先遵照實施例7製作LLC1荷癌小鼠，對其腫瘤內投與mIL12及hIL7搭載牛痘病毒(惟，病毒之腫瘤內注射，於初次投與之2日後，及4日後以外，於1日後、3日後亦實施(共5次)，表中稱為「mIL12及hIL7搭載VV投與群」)。對於病毒最終投與之23日後確認到完全緩解，且於最終投與之51日後仍維持完全緩解狀態之個體，與配合此等個體之週齡的非病毒接種小鼠(控制群)，皮下移植50μL之經PBS懸浮為8×10⁶個/mL之LLC1癌細胞。遵照實施例6算出腫瘤體積，計測最終於LLC1移植後第14日的觀察中，藉由目視及觸診觀察到腫瘤形成之個體數，求出腫瘤生長的小鼠個體數/接種癌細胞的小鼠個體數之比例。本實施例中，於控制群與病毒投與群進行Fisher之直接機率檢定，具有顯著差(未達5%)的情況評估為具有獲得性免疫效果。

其結果，於控制群中，共10例中，10例全部形成了皮下腫瘤，但於mIL12及hIL7搭載病毒投與群中，共10例中的6例，不管目視或觸診均觀察不到經再移植之LLC1癌細胞形成腫瘤(表5-1)(P<0.05、Fisher之直接機率檢定)。因此，藉由本實施例，確認到mIL12及hIL7搭載牛痘病毒之投與所致之獲得性免疫效果。

(2)關於mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物：對經mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物處置，結果完全緩解之小鼠，進行相同癌細胞之再移植實驗，評估獲得性免疫效果。

具體而言，係與(1)同樣地實施。惟，係使用遵照實施例7(2)投與mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物(分群之1日後、3日後、5日後，共3次)且完全緩解之小鼠，以替代經投與mIL12及hIL7搭載牛痘病毒而完全緩解的小鼠(表中稱為「mIL12搭載VV與hIL7搭載VV之混合物之投與群」)。癌細胞之再移植，係於病毒最終投與後74日後(完全緩解係於最終投與之24日後判定)進行。

其結果，於癌細胞再移植14日後，控制群中8例中全部形成了皮下腫瘤，但於mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物投與群中，於10例中的8例，不管目視或觸診均觀察不到經再移植之LLC1癌細胞形成腫瘤(表5-2)(P<0.05、Fisher之直接機率檢定)。

因此，藉由本實施例，確認到mIL12搭載牛痘病毒與hIL7搭載牛痘病毒之混合物的投與所致之獲得性免疫效果。

〔產業上之可利用性〕

本發明之牛痘病毒、醫藥組成物及組合套組，有用於各種癌的預防或治療。

〔序列表非關鍵詞文字〕

序列表之數字標題<223>，記載「Artificial Sequence」之說明。

序列編號1~6及10~15表示之核苷酸序列為引子。

序列編號7、8及9表示之鹼基序列，分別為包含人類IL-12基因之多核苷酸、包含人類IL-7基因之多核苷酸及包含大腸菌LacZ基因之多核苷酸。序列編號7中，第14號~第1000號之鹼基序列對應於編碼IL-12之p40次單元的區域、第1606號~第2367號之鹼基序列對應於編碼IL-12之次單元α的區域。

序列編號16及17表示之核苷酸序列，為連結於序列編號7~9之各基因編碼區域的限制酵素位點。

序列編號18表示之胺基酸序列，為4個SCR結構域缺失的B5R蛋白質。

序列編號19、20表示之鹼基序列，為LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed之兩末端環狀域序列之序列。

序列編號21表示之鹼基序列，為LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed之兩末端環狀域序列以外的序列。

序列編號22表示之鹼基序列，為包含p7.5k啟動子與DsRed片段之DNA片段。

序列編號23表示之鹼基序列，為包含小鼠IL-12基因之多核苷酸。

<110> Astellas Pharma裕Inc.

NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOTTORI UNIVERSITY

<120> Novel genetically engineered vaccinia viruses

<130> A17006A00

<150> JP 2016-107481

<151> 2016-05-30

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pTagBFP-N vector forward primer

<400> 1

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pTagBFP-N vector reverse primer

<400> 2

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B4R forward primer

<400> 3

<210> 4

<211> 73

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B4R reverse primer

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DsRed forward primer

<400> 5

<210> 6

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DsRed reverse primer

<400> 6

<210> 7

<211> 2379

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polynucleotide comprising human IL-12

<400> 7

<210> 8

<211> 559

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polynucleotide comprising human IL-7

<400> 8

<210> 9

<211> 3082

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Codon optimized LacZ

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VGF forward primer

<400> 10

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> VGF reverse primer

<400> 11

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> O1L forward primer

<400> 12

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> O1L reverse primer

<400> 13

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B5R forward primer-for PCR

<400> 14

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> B5R reverse primer-for PCR

<400> 15

<210> 16

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5' restriction enzyme site in SEQ ID NOS：7 to 9

<400> 16

<210> 17

<211> 12

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 3' restriction enzyme site in SEQ ID NOS：7 to 9

<400> 17

<210> 18

<211> 101

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 4 SCR domains deleted B5R protein

<400> 18

<210> 19

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Partial genome sequence of Vaccinia virus

<400> 19

<210> 20

<211> 104

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Partial genome sequence of Vaccinia virus

<400> 20

<210> 21

<211> 202489

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Partial genome sequence of modified vaccinia virus

<400> 21

<210> 22

<211> 908

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polynucleotide comprising p7.5k promoter-DsReD

<400> 22

<210> 23

<211> 2349

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polynucleotide comprising mouse IL-12

<400> 23

Claims

一種牛痘病毒，其包含以下之(1)及(2)：(1)編碼介白素-7(IL-7)之多核苷酸；及(2)編碼介白素-12(IL-12)之多核苷酸。
一種醫藥組成物，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)用以與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物；或(2)用以與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物。
一種組合套組，其含有以下之(1)及(2)之牛痘病毒：(1)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒；及(2)包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒。
如請求項1之牛痘病毒，其中使牛痘病毒增殖因子(VGF)之功能缺損。
如請求項1之牛痘病毒，其中使O1L之功能缺損。
如請求項1之牛痘病毒，其中使VGF及O1L之功能缺損。
如請求項1之牛痘病毒，其中使B5R細胞外區域之SCR(short consensus repeat)結構域缺失。
如請求項1之牛痘病毒，其中使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失。
如請求項1及4~8中任一項之牛痘病毒，其係LC16mO株。
一種醫藥組成物，其含有如請求項1及4~9中任一項之牛痘病毒及藥學上容許之賦形劑。
如請求項2之醫藥組成物或請求項3之套組，其中牛痘病毒係使VGF之功能缺損。
如請求項2之醫藥組成物或請求項3之套組，其中牛痘病毒係使O1L之功能缺損。
如請求項2之醫藥組成物或請求項3之套組，其中牛痘病毒係使VGF及O1L之功能缺損。
如請求項2之醫藥組成物或請求項3之套組，其中牛痘病毒係使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失。
如請求項2之醫藥組成物或請求項3之套組，其中牛痘病毒係使VGF及O1L之功能缺損，且使B5R細胞外區域之SCR結構域缺失。
如請求項2及11~15中任一項之醫藥組成物或請求項3及11~15中任一項之套組，其中牛痘病毒為LC16mO株。
如請求項2及11~15中任一項之醫藥組成物或請求項3及11~15中任一項之套組，其含有藥學上容許之賦形劑。
如請求項16之醫藥組成物或套組，其含有藥學上容許之賦形劑。
如請求項10~15中任一項之醫藥組成物或套組，其係癌之預防或治療用。
如請求項16之醫藥組成物或套組，其係癌之預防或治療用。
如請求項17之醫藥組成物或套組，其係癌之預防或治療用。
如請求項18之醫藥組成物或套組，其係癌之預防或治療用。
如請求項19之醫藥組成物或套組，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
如請求項20之醫藥組成物或套組，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
如請求項21之醫藥組成物或套組，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
如請求項22之醫藥組成物或套組，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
如請求項1及4~8中任一項之牛痘病毒，其係使用於癌之預防或治療。
如請求項9之牛痘病毒，其係使用於癌之預防或治療。
如請求項27之牛痘病毒，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
如請求項28之牛痘病毒，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
一種如請求項1及4~8中任一項之牛痘病毒之使用，其係用於製造癌之預防或治療用醫藥組成物。
一種如請求項9之牛痘病毒之使用，其係用於製造癌之預防或治療用醫藥組成物。
如請求項31之使用，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
如請求項32之使用，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
一種牛痘病毒，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用，而使用於癌之預防或治療的包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒；或(2)與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用，而使用於癌之預防或治療的包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒。
如請求項35之牛痘病毒，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
一種牛痘病毒之使用，其係由以下之(1)或(2)中選擇：(1)用以製造與含有包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的癌之預防或治療用醫藥組成物的包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之使用；或(2)用以製造與含有包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒之醫藥組成物合併使用的癌之預防或治療用醫藥組成物的包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之使用。
如請求項37之使用，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。
一種(1)包含編碼IL-7之多核苷酸的牛痘病毒及(2)包含編碼IL-12之多核苷酸的牛痘病毒之使用，其係用於製造癌之預防或治療用之組合套組。
如請求項39之使用，其中癌為惡性黑色素瘤、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、神經膠母細胞瘤、神經母細胞瘤、骨髓瘤、卵巢癌、大腸癌、胰臟癌、攝護腺癌、肝細胞癌、中皮瘤、子宮頸癌或胃癌。