TWI763662B - 用於病毒性疾病的廣效型疫苗 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及用於誘導一種或多種免疫反應和/或用於增強宿主中疫苗接種的有效性的藥物組合，並能夠誘導針對病毒的多個毒株和/或血清型的交叉保護。在一個實施例中，藥物組合可以在可食用動物如牛、綿羊、山羊、豬和其他偶蹄動物中以較少疫苗接種活動產生保護作用。本發明的廣效型疫苗包含滅活病毒及以下一種或多種成分：在不同類型質粒內編碼病毒肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；病毒肽、多肽或蛋白質；病毒的人工肽或多肽；病毒的重組肽、多肽或蛋白質；病毒樣顆粒；衍生自其他病毒的病毒樣顆粒；蛋白質作為載體或分子佐劑，與衍生自一種或多種病毒的肽、多肽或蛋白質融合；佐劑；乳化劑，分子佐劑和載體體系。
Description
本專利申請以申請號為62/320852在2016年4月11日申請的美國專利申請作為優先權。上述專利申請的所有內容和公開都結合在本申請中。
在本專利申請中所引用的各參考文獻和公開都在此合併到本專利申請中從而更全面地描述本發明從屬的技術領域。
本發明廣泛地涉及疫苗組合物的領域。在一個實施例中，提供了使用一種或多種製劑的藥物組合進行病毒疫苗接種的平台，能夠誘導對一種或多種病毒的不同血清型和/或毒株的交叉保護。
隨著全球人口以目前的速度增長，確保安全和可持續的糧食供應至關重要。動物衛生行業的重要挑戰，是力求為安全、可靠和可持續的食品供應而開發先進的解決方案。動物保健品有助於改善和維護動物在疾病預防、
治療和管控方面的健康和福利。
動物生病的最重要原因之一是受病毒感染。其中一些病毒的傳染性非常高，可以造成毀滅性的經濟損失和對公共衛生造成影響。
口蹄疫(Foot and Mouth Disease,FMD)是一種嚴重且高度傳染性的疾病，可影響可食用動物包括：牛，豬，綿羊和山羊等內偶蹄類動物。儘管死亡率非常低，但口蹄疫的傳染性很強，所以生產力損失和經濟影響方面成為畜牧業最嚴重的疾病之一。
口蹄疫在全球多個地方流行。世界動物衛生組織(OIE)定期發布疾病分佈和爆發圖。由於世界動物衛生組織製定的市場限制，該組織所發布的衛生狀況對肉類貿易依賴型經濟的國家(特別是受口蹄疫影響的國家)產生了深遠的經濟影響。其他可對家畜生產力產生重大影響的病毒，包括但不限於，可導致新生牛犢腹瀉的牛輪狀病毒(Rotaviruses)；牛疱疹病毒-1型(Bovine Herpesviruses 1，BoHV-1或BHV-1，可導致傳染性牛鼻氣管炎)和牛疱疹病毒-5型(Bovine Herpesviruses 5，BoHV-5或BHV-5，可導致牛疱疹性腦炎)；與牛呼吸道疾病綜合症(Bovine respiratory disease complex，BRD)相關的牛副流感病毒-3型(Bovine Parainfluenza Virus 3，PI3或BPIV-3)及牛呼吸道合胞病毒(bovine respiratory syncytial virus，BRSV)；牛病毒性腹瀉病毒(Bovine Viral Diarrhoea Virus，BVDV，可導致腹瀉之外，可引起免疫抑制，流產，不孕和致命性併
發症，稱為粘膜病)；及可在動物和人類中引起致命的腦炎的狂犬病病毒(Rabies Virus)。
口蹄疫病毒(Foot and Mouth disease virus,FMDV)是一種無脂質包膜的呈二十面體對稱的病毒，直徑大小為25-30nm，含有由約8500個核苷酸組成的單鏈核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)分子。該核糖核酸分子包含編碼結構蛋白和非結構蛋白的單個開放閱讀框(open reading frame，ORF)。其蛋白質組分為結構蛋白和非結構蛋白。四種結構蛋白為：VP1，VP2，VP3和VP4。在這些蛋白質中，VP1是最廣泛被研究的蛋白質，原因是其在病毒附著、保護性免疫和血清型特異性中的重要作用(Sabbir Alam,et al.Antigenic heterogeneity of capsid protein VP1 in foot-and-mouth disease virus(FMDV)serotype Asia.Advances and applications in Bioinformatics and Chemistry.2013,6：37-46)。此外，VP1是用於開發新型肽疫苗的主要蛋白質(WO1999066954A1 and Peralta A.,et al.VP1 protein of Foot-and-mouth disease virus(FMDV)impairs baculovirus surface display.Virus Research.2013,175(1)：87-90)。非結構蛋白質組包括的蛋白質為：2A，2B，2C，3A，3B，3C和3D。這些蛋白質已被用於區分感染和接種疫苗的動物(Rodriguez A.,et al.Immunogenicity of non-structural proteins of foot-and-mouth disease virus：differences between infected and vaccinated swine.Archives of virology.1994,136(1)：123-131)。
不同血清型的FMDV已有描述，並且將每種血清型進一步分為多種毒株。這些血清型包括：O型、A型、C型、Asia型、和南非類型SAT-1型、2型和3型，其中最常見的是O型、A型及Asia型。
儘管現正不斷努力開發針對FMDV而不需要大規模擴散病原體的替代疫苗，目前的疫苗仍是基於滅活的全病毒，濃縮和純化至臨界質量的抗原以達到能夠產生保護性免疫反應。製造這些疫苗的廠房需符合OIE的生物安全等級4的要求。估計每年全球生產的口蹄疫疫苗數量為25至30億劑。
與傳統疫苗相比，肽疫苗是一種安全和經濟的技術。該技術的缺點是其免疫原性差。這類型的疫苗已經進行了實驗，以測試其保護動物的能力(Taboga O.,et al.A Large-Scale Evaluation of Peptide Vaccines against Foot-and-Mouth Disease：Lack of Solid Protection in Cattle and Isolation of Escape Mutants.Journal of Virology.1997,71(4)：2606-2614)。實驗結果顯示，肽疫苗的保護率均低於50%。相反，滅活的病毒疫苗(陽性對照)通常達到90%至100%保護。因此，作為常規方案以根除和處理緊急情況的疫苗通常以滅活病毒為基礎。
肽疫苗的另一個實施例涉及使用樹狀聚合肽。這些肽包含：賴氨酸殘基的核心、兩個或更多個氨基酸分支及其N-和C-末端的T和B表位。這些樹狀大分子肽先被用作抗微生物肽(Tam J.,et al.Antimicrobial dendrimeric
peptides.Eur.J.Biochem.2002,269：923-932)，但目前它們可用作動物疫苗接種的多抗原肽。在一個專利申請中(EP2647390A1)，開發出比線性肽引發更高同源免疫反應的樹狀大分子肽。這些樹狀聚合肽的缺點是需要用大量的肽配製疫苗以賦予針對口蹄疫病毒的實際保護。這是使用該肽疫苗的難題，因為大規模製造該疫苗的成本很高。
還有其他基於肽的策略用於誘導針對不同疾病的實際免疫保護。其中一個策略是使用Brucella Lumazine Synthase(BLS)技術(見EP1776456B1)，其特徵在於來自布魯桿菌屬(Brucella spp.)的一種蛋白質，能夠形成十聚體並具有分子輔助性質：可以將有需要的抗原(例如肽)與其N-氨基末端融合，以促進針對靶抗原的免疫應答。因此，重組BLS蛋白的十聚體能夠同時融合十個肽。該技術與其它肽疫苗具有相同的缺點，即獲得免疫原性保護所需的抗原劑量較高。此外，大尺寸的BLS蛋白，含有表位的相對數量非常低。因此，為了克服上述問題，有需要配製大量BLS表位的疫苗以達到必需的表位質量以獲得實際保護。
不同血清型的口蹄疫病毒分佈在世界各地。一些地區有不止一種血清型和毒株會使衛生狀況複雜並阻礙根除該疾病(Paton D.,et al.Options for control of foot-and-mouth disease：knowledge,capability and policy.Philosophical Transactions of the Royal Society B.2009,364：2657-2667)。由於口蹄疫在經濟損失方面的重要影響，至關重要的是需要有一種疫苗可以為多種口蹄疫病毒血清型
和/或毒株提供交叉保護。因此，特定地區的動物可以通過較少的疫苗接種來進行廣泛的保護。
制定口蹄疫病毒疫苗的重大困難是該病毒呈現出顯著的抗原多樣性，特別是顯示高度遺傳變異的VP1蛋白(Haydon D.,et al.Characterizing sequence variation in the VP1 capsid proteins of foot and mouth disease virus(serotype 0)with respect to virion structure.Journal of Molecular Evolution.1998,46(4)：465-475)。高度的遺傳變異導致血清型之間缺乏交叉保護。當動物接種疫苗或從一種血清型病毒中康復，仍然易受其他六種血清型病毒的感染。此外，一種血清型高度的抗原變異可能引起對一種毒株具保護性的疫苗對同一血清型中的另一毒株無效。
有大量研究顯示，使用僅基於一種特異性毒株的疫苗，當針對另一種毒株時可引致缺乏保護性反應(Mattion N.,et al.Reintroduction of foot-and-mouth disease in Argentina：Characterization of the isolates and development of tools for the control and eradication of the disease.Vaccine.2004,22：4149-4162 and Maradei E.,et al.Characterization of foot-and-mouth disease virus from outbreaks in Ecuador during 2009-2010 and cross-protection studies with the vaccine strain in use in the region.Vaccine.2011,29：8230-8240)。Mattion N.等人於2004年比較了毒株A/Argentina/79和A/Argentina/87之間的交叉反應性結果顯示，一毒株與另一株的單克隆抗體沒有反應。Maradei E.
等人的保護數據顯示，接種一劑單價O1/Campos疫苗的牛對厄瓜多爾46-2010病毒O型的挑戰僅誘導6%的保護(一隻動物受保護，15隻動物未受保護)，以及對再次接種的動物誘導18%的保護(3隻動物受保護，13隻動物未受保護)。此外，有實驗顯示，使用O1 Manisa接種疫苗並受O1 Campos感染的動物，只有接種高載荷的O1 Manisa疫苗才能實現對O1 Campos的保護(Nagendrakumar S.B.,et al.Evaluation of cross-protection between O1 Manisa and O1 Campos in cattle vaccinated with foot-and-mouth disease virus vaccine incorporating different payloads of inactivated O1 Manisa antigen.Vaccine.2011,29(10)：1906-1912)。
為了克服缺乏交叉保護問題並考慮到目前存在的各種不同的肽，定制的肽疫苗可以幫助解決這個問題，因為定制的肽能夠易於改變疫苗靶向目標。雖然肽疫苗似乎是獲得交叉保護的好策略，該疫苗的免疫原性弱並在經濟上不可行。此外，肽疫苗不能引起強大的細胞介導的免疫應答，這是實現完全免疫原性保護的基石(Becker Y.,et al.Need for cellular and humoral immune responses in bovines to ensure protection from foot-and-mouth disease virus(FMDV)-a point of view.Virus Genes.1994,8：199-214)。口蹄疫病毒特異性細胞介導的免疫應答取決於病毒衣殼抗原的完整性和穩定性，因此，肽疫苗不能觸發實際的細胞介導的反應。此外，細胞介導的免疫應答對於針對異源毒株的交叉反應性保護是至關重要的(Bucafusco
D.,et al.Foot-and-mouth disease vaccination induces cross-reactive IFN-γ responses in cattle that are dependent on the integrity of the 140S particles.Virology.2015,476：11-18)。因此，強烈建議將滅活的FMDV添加到疫苗製劑中，以引發更強的體液和細胞介導的免疫應答。
基於上述原因，建議把滅活的口蹄疫全病毒抗原與其他疫苗技術組合，以利用滅活的抗原誘導強的細胞免疫應答的能力，並且使用新穎的疫苗技術，通過引發強而廣泛的抗體反應來實現廣泛的交叉保護和特異性。這種針對口蹄疫的新型及廣效型的疫苗可有效在全球範圍內應付口蹄疫病毒大流行並作為有用的工具，為所有血清型和不同品種的口蹄疫病毒提供全面的保護，並為未滿足的市場和技術需求提供解決方案。在新技術中，基於肽疫苗的多靶標能力，肽抗原可與滅活抗原組合使用。
如今，製備藥物和生物製藥產品的過程必須嚴格遵守生產質量管理規範(Good Manufacturing Practice,GMP)的標準。符合該要求可確保高標準的產品質量和可靠性。
本發明首次開發一個可符合GMP要求以製備各種疫苗的平台。在一個實施例中，提供了滅活病毒與至少一種以下成分的組合，包括：在不同類型質粒內編碼病毒肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；病毒的人工肽或多肽；病毒的重組肽、多肽或蛋白質；病毒樣顆粒；蛋白質作為載體或分子佐劑，與衍生自一種或多種病毒的肽、多肽或蛋
白質融合；佐劑；乳化劑，分子佐劑和載體體系。本發明可開發用於保護動物免受一種或多種病毒性疾病的廣效型疫苗。
在一個實施例中，本發明提供製備廣效型疫苗製劑的詳細程序，能夠誘導針對廣泛的血清型或病毒株的交叉保護(包括但不限於口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒)。
在一個實施例中，本發明提供一種或多種包含一種或多種滅活病毒的製劑，包括但不限於口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒，並含有不同劑量的不同組分。該製劑由全滅活的病毒及以下一種或多種成分組成：在不同類型質粒內編碼病毒肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；病毒的人工肽或多肽；病毒的重組肽、多肽或蛋白質；病毒樣顆粒；蛋白質作為載體或分子佐劑，與衍生自一種或多種病毒的肽、多肽或蛋白質融合；佐劑；乳化劑，分子佐劑和載體體系。
在一個實施例中，本發明公開披露一種能夠誘導針對不同血清型或病毒株的交叉保護的疫苗製劑，其中
該疫苗製劑包含全滅活病毒和至少一種以下成分：(a)編碼該病毒的肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；(b)該病毒的人工肽或多肽；(c)該病毒的重組肽、多肽或蛋白質；(d)該病毒的病毒樣顆粒；(e)粒衍生自其他病毒的病毒樣顆粒，所述病毒樣顆粒展示該病毒的重組肽、多肽或蛋白質；及(f)肽、多肽或蛋白質作為載體或分子佐劑，其中該肽、多肽或蛋白質會或不會與任何(b)至(e)的成分融合。在一個實施例中，該病毒包括但不限於口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒。
在一個實施例中，本發明提供包含不同劑量的各種組分及具有全滅活口蹄疫病毒的不同製劑。其中該製劑包含全滅活口蹄疫病毒和至少一種以下成分：在不同類型質粒中編碼口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；口蹄疫病毒的人工肽或多肽；口蹄疫病毒的重組肽、多肽或蛋白質；口蹄疫病毒樣顆粒；衍生自其他病毒的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒展示口蹄疫病毒的重組肽、多肽或蛋白質；蛋白質作為載體或分子佐劑與衍生自口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白質融合；佐劑；乳化劑、分子佐劑和載體體系。
本發明提供的藥物組合，用於誘導針對宿主中的一種或多種病毒性疾病的一種或多種免疫反應和/或用於增強宿主中疫苗接種的有效性，該藥物組合包含：(a)本
發明所述的一種或多種能夠在宿主中引發免疫應答的疫苗製劑；及(b)一種或多種增強宿主免疫應答的分子佐劑，可增強宿主的免疫反應，其中病毒疫苗和分子佐劑可以單獨或同時施用。
本發明提供一種對易受口蹄疫病毒感染的宿主接種疫苗的方法，包含向宿主施用一種或多種如本發明所述的之疫苗製劑以誘導免疫反應，其中該疫苗製劑及分子佐劑可以同時或不同時施用。
在一個實施例中，包含本發明的一種或多種疫苗製劑的藥物組合能夠通過誘導細胞介導和體液成分的免疫反應確保對一種或多種病毒提高保護性，其中該病毒例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等。
在一個實施例中，包含本發明的一種或多種疫苗製劑的藥物組合能夠通過誘導細胞介導和體液成分的免疫反應確保提高對口蹄疫病毒保護性。
在一個實施例中，本發明的藥物組合可以在偶蹄動物如牛、綿羊、山羊或豬誘導針對一種或多種病毒感染的免疫應答，該病毒例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等。
在一個實施例中，本發明包含一種或多種疫苗製劑的藥物組合可以使用較少疫苗接種活動產生免疫原性交叉保護作用。
在一個實施例中，本發明提供一種包含廣效型疫苗的藥物組合並能符合GMP標準。
圖1及圖2所示的是牛的臨床試驗中獲得的血清學結果，基於與不同口蹄疫病毒肽表位融合的BLS載體蛋白比較不同藥物組合的疫苗製劑。測試中的不同疫苗製劑是重組BLS蛋白與口蹄疫病毒肽表位或編碼不同BLS-FMDV表位的裸質粒DNA融合。實驗疫苗在研究的第0天和第30天使用初次/加強方案進行。在接種疫苗後不同時間檢測血清反應(DPV：Day Post Vaccination，接種疫苗後天數)：30DPV、60DPV、90DPV和105DPV。序列BLS-I(DNA)(SEQ ID NO.56)、BLS-D(SEQ ID NO.58)、BLS-A1(SEQ ID NO.59)、and BLS-I(SEQ ID NO.57)如表2所示。BLS-I(DNA)/BLS-I：含多核苷酸“BLS-I(DNA)”(SEQ ID NO.56)及融合蛋白BLS-I(SEQ ID NO.57)的疫苗製劑的藥物組合；BLS-I(DNA)/BLS-D+BLS-A1+BLS-I：含多核苷酸BLS-I(DNA)(SEQ ID NO.56)及融合蛋白BLS-D(SEQ ID NO.58)、BLS-A1(SEQ ID NO.59)及BLS-I(SEQ ID NO.57)的疫苗製劑的藥物組合；BLS-I/BLS-I：只含融合蛋白BLS-I(SEQ ID NO.57)的疫苗製劑的藥物組合；BLS-D+BLS-A1+BLS-I/BLS-D+BLS-A1+BLS-I：含融合蛋
白BLS-D(SEQ ID NO.58)、BLS-A1(SEQ ID NO.59)及BLS-I(SEQ ID NO.57)的疫苗製劑的藥物組合。疫苗製劑D、E、F及G如表3所示，動物的疫苗接種方案如表4所示。滅活的四價病毒疫苗(O1 Campos,A2001,C3 Indaial and A24 Cruzeiro)作陽性對照(+)。進行競爭性酶聯免疫吸附測定(ELISA)來測量所獲得的血清學反應中存在的O1 Campos抗體滴度。抗體滴度表示為血清稀釋度的倒數log10，給予對照(沒有血清的病毒)孔中記錄的吸光度的50%。
圖3所示的是針對不同疫苗和免疫策略中獲得的攻毒測試的結果。感染結果分析在7 DPI(Day Post Infection、DPI、感染後天數)進行。疫苗製劑和免疫策略的不同藥物組合與圖1所述的相同。滅活的四價病毒疫苗(O1 Campos,A2001,C3 Indaial and A24 Cruzeiro)作陽性對照(+)。T：舌；RFM：右前方位置；LFM：左前方位置；RHM：右後方位置；LHM：左後方位置。符號“+”是指動物的該位置受FMDV感染後出現症狀。符號“-”是指動物的該位置受FMDV感染後沒有出現症狀。因為舌頭是接種部位，所以不考慮對該部位進行分析。當該位置(RFM、LFM、RHM和LHM)沒有顯示任何症狀時，動物被定義為“受保護”。
圖4及圖5所示的是O1 Campos毒株特異性血清學檢測結果，在交叉保護的臨床檢測中使用不同疫苗製劑的藥物組合進行比較。實驗疫苗均在第0天施用。測試中
使用的疫苗製劑的不同藥物組合是：(1)BLS-I(SEQ ID NO.57)應用於動物的左側和應用於動物的右側的滅活的口蹄疫病毒血清型A2001型全病毒(疫苗製劑A和B)；(2)滅活的FMDV血清型A2001型全病毒：陰性對照(-)(疫苗製劑B)；(3)滅活的口蹄疫病毒血清型O1 Campos型全病毒：陽性對照(+)(疫苗製劑C)；(4)動物未接種疫苗。進行競爭性酶聯免疫吸附測定(ELISA)來測量所獲得的血清學反應中存在的O1 Campos抗體滴度。y軸上的抗體滴度表示為在對照孔(無血清病毒)中記錄的50%吸光度的血清稀釋度的倒數log10。在接種後29和58天測量血清學反應。
圖6及圖7所示的是在牛的臨床試驗中獲得的A2001毒株特異性血清學檢測結果，對疫苗製劑的不同藥物組合進行比較。在不同時間測定血清學反應：63DPV和98DPV。O1 Campos滅活病毒疫苗：O1 Campos全滅活病毒顆粒(陰性對照)。A2001滅活病毒疫苗：A2001全滅活病毒顆粒(陽性對照)。BLS-I_A2001(SEQ ID NO.60)的序列如表2所示。第1組：(BLS-I_A2001+O1 Campos滅活病毒疫苗)：包含兩種不同的疫苗配方，第一種含有融合蛋白BLS-I_A2001(SEQ ID NO.60)及第二種含有O1 Campos全滅活病毒顆粒，應用於動物兩側。疫苗製劑H、I和J如表7所示。陰性對照(-)：O1 Campos全滅活病毒顆粒。陽性對照(+)：A2001全滅活病毒顆粒。抗體滴度表示為血清稀釋度的倒數log10，給予對照(沒有血清的病毒)孔中記錄的吸光度的50%。
圖8及圖9所示的是接種不同藥物組合的疫苗製劑後使用高病原性A2001口蹄疫病毒攻毒檢測的測試結果。感染結果分析在7DPI進行。陰性對照(-)：O1 Campos全滅活病毒顆粒。陽性對照(+)：A2001全滅活病毒顆粒。T：舌；RFM：右前方位置；LFM：左前方位置；RHM：右後方位置；LHM：左後方位置。符號“+”是指動物的該位置受口蹄疫病毒感染後出現症狀。符號“-”是指動物的該位置受口蹄疫病毒感染後沒有出現症狀。因為舌頭是接種部位，所以不考慮對該部位進行分析。當該位置(RFM、LFM、RHM和LHM)沒有顯示任何症狀時，動物被定義為“受保護”。在y軸上的值表示為在針對口蹄疫病毒O1 Campos型攻毒的總動物數量中受保護動物數量的百分比。
圖10及圖11所示的是A2001毒株特異性血清學在牛臨床試驗中獲得的結果，並比較不同藥物組合的疫苗製劑和免疫方案。實驗疫苗均在第0天施用。在疫苗接種後不同時間測定血清學反應：31DPV和63DPV。O1 Campos滅活病毒疫苗：O1 Campos全滅活病毒顆粒(陰性對照)。A2001滅活病毒疫苗：A2001全滅活病毒顆粒(陽性對照)。序列BLS-I_A2001(SEQ ID NO.60)如表2所示。BLS-I_A2001+O1 Campos滅活病毒疫苗：含O1 Campos全滅活病毒顆粒及融合蛋白BLS-I_A2001(SEQ ID NO.60)的疫苗製劑。疫苗製劑K、L和M如表10所示。陰性對照(-)：O1 Campos全滅活病毒顆粒。陽性對照(+)：A2001全
滅活病毒顆粒。抗體滴度表示為血清稀釋度的倒數log10，給予對照(沒有血清的病毒)孔中記錄的吸光度的50%。
本發明的方法涉及製備一種或多種高質量的病毒疫苗的過程，該病毒例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1)、牛疱疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine Respiratory Syncytial Virus，BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及狂犬病病毒等。
在一個實施例中，本發明的方法制定針對一種或多種病毒的血清型和/或毒株的廣效型疫苗，例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等，以僅一次疫苗接種獲得交叉保護。
在一個實施例中，本發明提供了免疫原性組分以配製不同的疫苗，以確保針對所有或不同的病毒血清型或毒株的交叉保護，例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等。
在一個實施例中，本發明提供了免疫原性組分以配製不同的疫苗，以確保針對不同口蹄疫病毒血清型和
/或毒株的總體或交叉保護。結合使用全滅活的口蹄疫病毒與一種或多種免疫原性組分可以確保了細胞和體液成分的免疫應答的高度保護。
在一個實施例中，本發明的廣效型疫苗可以特異性誘導針對存在於特定地區的病毒的全部或不同血清型和/或毒株的一種或多種靶向免疫應答(該病毒如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等)。
在一個實施例中，本發明的製劑由滅活的病毒及以下一種或多種成分組成：在不同類型質粒中編碼病毒肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；病毒的人工肽或多肽；病毒的重組肽、多肽或蛋白質；病毒樣顆粒；衍生自其他病毒的病毒樣顆粒；蛋白質作為載體或分子佐劑，與衍生自一種或多種病毒的肽、多肽或蛋白質融合；佐劑；乳化劑、分子佐劑和載體體系。該病毒包括但不限於口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒。
在一個實施例中，本發明的製劑包含全滅活口蹄疫病毒和至少一種以下成分：在不同類型質粒中編碼一個或多個口蹄疫病毒的多核苷酸序列；口蹄疫病毒的人工
肽或多肽；口蹄疫病毒的重組肽、多肽或蛋白質；口蹄疫病毒樣顆粒；衍生自其他病毒的病毒樣顆粒展示口蹄疫病毒的重組肽、多肽或蛋白質；蛋白質作為載體或分子佐劑，與衍生自口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白質融合；佐劑；乳化劑、分子佐劑和載體體系。
本領域普通技術人員將容易理解到，本發明可以使用來自各種病毒(例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等)的多核苷酸的組合。
本發明也可以組合使用口蹄疫病毒不同的多核苷酸。在一個實施例中，廣效型疫苗包含一個或多個多核苷酸，用以編碼全部、部分或變異的口蹄疫病毒蛋白質，例如衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；或非結構蛋白例如2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或編碼一個或多個氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)的多核苷酸序列，或其部分、變異、同源或功能類似物的肽的多核苷酸序列。上述多核苷酸序列可以克隆在本領域已知的能夠在真核細胞環境中表達上述序列的任何表達載體中。合適的表達載體也可以通過本領域通常已知的重組技術的技術構建。具有編碼口蹄疫病毒表位的序列的表達載體的實例包括但不限於：pcDNA3.1/P1-2A3C3D、含編碼病毒結構蛋白前體
序列的質粒P1-2A(VP0、VP1或VP3)及非結構蛋白3C和3D(Cedillo-Barron L.,et al.Induction of a protective response in swine vaccinated with DNA encoding foot-and-mouth disease virus empty capsid proteins and the 3D polymerase.Journal of General Virology.2001,82：1713-1724)；和由於在小鼠和豬克隆VP1的DNA序列而賦予口蹄疫病毒保護作用的質粒pCEIM和pCEIS(Wong HT.,et al.Plasmids Encoding Foot-and-Mouth Disease Virus VP1 Epitopes Elicited Immune Responses in Mice and Swine and Protected Swine against Viral Infection.Virology.2000,278：27-35)。
本領域普通技術人員將容易理解到，本發明可以組合使用衍生自病毒(例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等)不同的重組或合成肽、多肽和/或蛋白質。
在一個實施例中，本發明的組合物包含不同的衍生自口蹄疫病毒的氨基酸序列的組合。例如，一個或多個衍生自口蹄疫病毒的氨基酸序列，可以編碼全部、部分或變異的口蹄疫病毒衣殼蛋白序列例如VP1、VP2、VP3和VP4；或非結構蛋白例如2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D。在另一個實施例中，氨基酸序列可以選自SEQ ID
NO.1-55(表1)的肽，或其部分、變異、同源或功能類似物的肽。衍生自口蹄疫病毒的合適多肽的實例包括但不限於，一種或多種構建自口蹄疫病毒VP1的G-H環和來自麻疹病毒(UBITh1)並混雜人造Th位點的全部、部分或變異的天然、合成或重組的肽、多肽或蛋白質，可以於保護豬隻不受O1台灣型口蹄疫病毒感染。(Wang CY.,et al.Effective synthetic peptide vaccine for foot-and-mouth disease in swine.Vaccine.2002,20：2603-2610)；天然、合成或重組的肽、多肽和蛋白質衍生自全部、部分或變異的口蹄疫病毒毒株A/HuBWH/CHA/2009的免疫原性表位VP1(129-169)、3A(21-35)和3D(346-370)蛋白質，可有效地在牛和豚鼠中引發產生針對血清型A的病毒中和抗體(Zhang Z.,et al.Efficacy of synthetic peptide candidate vaccines against serotype-A foot-and-mouth disease virus in cattle.Applied Microbiology and Biotechnology.2015,99(3)：1389-1398)。在一個實施例中，多肽選自天然、合成或重組的肽或多肽衍生自全部、部分或變異的G-H環的高可變區域，其長度可以根據毒株變化，但通常包含口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的氨基酸135至160。VP1蛋白的G-H環的高可變區域包含主要表位，並且是口蹄疫病毒毒株之間的系統多樣性的主要位點之一，因為其代表了在免疫系統的壓力下口蹄疫病毒分歧毒株的逃避機制。事實上，由宿主針對一個毒株的高可變區域產生的抗體是針對該特異毒株的中和抗體，但不會中和另一種口蹄疫病毒分歧毒株。因此，不同序列的
同源性百分比是高度可變的。因此，本領域技術人員可以容易地理解，衍生自G-H環並且被認為可用於本發明的肽和多肽是功能類似物，並且與G-H環肽的氨基酸序列SEQ ID NO.9-18(表1)的同源性可低至10%。在另一個實施例中，多肽包含(i)衍生自口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的全部、部分或變異的G-H環高可變區域(氨基酸135-160)的天然、合成或重組肽或多肽，和(ii)包含RGD基序(3個氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列(Berinstein A.,et al.Antibodies to the vitronectin receptor(integrin alpha V beta 3)inhibit binding and infection of foot-and-mouth disease virus to cultured cells..Journal of Virology.1995,69(4)：2664-2666)。
本領域普通技術人員將容易理解到，本發明使用的一種或多種病毒樣顆粒源自病毒，例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等。
在一個實施例中，本發明使用口蹄疫病毒樣顆粒。構建、克隆和表達口蹄疫病毒樣顆粒可以通過本領域通常已知的重組技術完成。在一個實施例中，病毒樣顆粒完全由口蹄疫病毒衣殼蛋白VP0、VP1和VP3組成，其通過重組技術表達並自發組裝成不摻入病毒基因組的顆粒。在
另一個實施例中，口蹄疫病毒衣殼蛋白是變異的。上述病毒樣顆粒是非複制型和非傳染性疫苗，能夠模擬天然病毒的表位呈現。病毒樣顆粒技術作為口蹄疫病毒疫苗已進行測試，在豚鼠、豬和牛中獲得了有效的保護性免疫應答。(Guo H-C.,et al.Foot-and-mouth disease virus-like particles produced by a SUMO fusion protein system in Escherichia coli induce potent protective immune responses in guinea pigs,swine and cattle.Veterinary Research.2013,44：48；and Terhuja M.,et al.Comparative efficacy of virus like particle (VLP)vaccine of foot-and-mouth-disease virus(FMDV)type O adjuvanted with poly I：C or CpG in guinea pigs.Biologicals.2015,43(6)：437-443)。此外，通過將突變的3C蛋白酶和多肽(P1-2A)拼接在一起，可提高結構蛋白的產量，而所獲得的病毒樣顆粒能夠引發體液和細胞介導的免疫應答(Bhat S.,et al.Novel immunogenic baculovirus expressed virus-like particles of foot-and-mouth disease(FMD)virus protect guinea pigs against challenge.Research in Veterinary Science.2013,95(3)：1217-1223)。
在另一個實施例中，本發明包括使用具有非口蹄疫病毒骨架的病毒樣顆粒，但能夠在其表面上呈現口蹄疫病毒重組抗原。這項技術的一個例子是“Metavax”技術，被描述為重組免疫原性肽或大型蛋白質的載體(US 7678374)。由於其形成融合蛋白的病毒樣顆粒的工程具有靈活性和多功能性，Metavax技術是表達口蹄疫病毒肽、
多肽或蛋白質的合適方案。
在一個實施例中，本發明的肽、多肽或蛋白質可以作為載體與具有病毒表位的肽、多肽或蛋白質融合，該病毒如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等。
在一個實施例中，本發明的肽、多肽或蛋白質可以作為載體與具有口蹄疫病毒表位的肽、多肽或蛋白質融合。現有的技術公開了口蹄疫病毒表位可以是VP1蛋白的全部、部分或變異的序列：血清型O1 Kaufbeuren(O1K)的氨基酸殘基144-159(Pfaff E.,et al.Antibodies against a preselected peptide recognize and neutralize foot and mouth disease virus.The EMBO Journal.1982,1(7)：869-874)；血清型O1K的氨基酸殘基25-41和200-213(Bittle J.,et al.Protection against foot-and-mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence.Nature.1982,298：30-33)；O/UKG/35/2001的氨基酸殘基66-80(Gerner W.,et al.Identification of a novel foot-and-mouth disease virus specific T-cell epitope with immunodominant characteristics in cattle with MHC serotype A31.2007.Vet.Res.38：
565-572)；血清型Asia-1的氨基酸殘基1-12、17-29及194-211(Zhang Z-W.,et al.Screening and identification of B cell epitopes of structural proteins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1.Veterinary Microbiology.2010,140(1-2)：25-33)；毒株AF/72的氨基酸殘基106-115和4-13(Liu X-S.,et al.Identification of H-2d Restricted T Cell Epitope of Foot-and-mouth Disease Virus Structural Protein VP1.Virology Journal.2011,8：426)。在一個實施例中，該肽或多肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的全部、部分或變異的天然、合成或重組的肽或多肽。例如，該肽是表1所示的SEQ ID NO.1-21序列衍生自口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白，及其變異或功能類似物。VP1蛋白的高可變區域(氨基酸135-160)是口蹄疫病毒毒株間產生多樣性的主要位點之一。VP1蛋白的G-H環高可變區域的同源性百分比高度可變。在另一個實施例中，該多肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的G-H環高可變區域(氨基酸135-160)的天然、合成或重組肽或多肽和包含RGD基序(3個氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列。此外，源自口蹄疫病毒表位的肽可以是其它衣殼蛋白的全部、部分或變異的序列，例如血清型Asia-1的VP2(氨基酸殘基40-50)、VP3(氨基酸殘基26-39)和VP4(氨基酸殘基30-41)(Zhang Z-W.,et al.Screening and identification of B cell epitopes of structural proteins of foot-and-mouth disease virus serotype Asia1.Veterinary Microbiology.2010,140(1-2)：25-33)。此外，源
自口蹄疫病毒表位的肽可以是非結構蛋白的全部、部分或變異的序列，例如來自血清型O1K的2B(PFFFSDVRSNSFKLV(SEQ ID NO.28)、FFRSTPEDLERAEK(SEQ ID NO.29))、2C(LKARDINDIFAILKN(SEQ ID NO.30)、SEEKFVTMTDLVPG(SEQ ID NO.31))、3B(ERTLPGQKACDDVN(SEQ ID NO.35)、GPYAGPLETQKPLK(SEQ ID NO.36)、PLERQKPLKVRAKL(SEQ ID NO.37)、GPYAGPMERQKPLK(SEQ ID NO.38)、PMERQKPLKVKAKA(SEQ ID NO.39)、QKPLKVKAKAPVVK(SEQ ID NO.40))(Höhlich B-J.,et al.Identification of Foot-and-Mouth Disease Virus-Specific Linear B-Cell Epitopes To Differentiate between Infected and Vaccinated Cattle.Journal of Virology.2003,Aug.：8633-8639)；毒株O1K的蛋白3A(氨基酸殘基11-25和21-35)、3C(氨基酸殘基121-135和166-180)(Blanco E.et al.Identification of T-Cell Epitopes in Nonstructural Proteins of Foot-and-Mouth Disease Virus.Journal of Virology.2001.April：3164-3174)；及毒株C-S8的蛋白3D(氨基酸殘基301-315、326-340、346-360、351-365、356-370和406-420)(Gerner W.,et al.Identification of novel foot-and-mouth disease virus specific T-cell epitopes in c/c and d/d haplotype miniature swine.Virus Research.2006,121(2)：223-228)。
在另一個實施例中，具有口蹄疫病毒表位的肽的實例如表1所示(SEQ ID NO.1-55)。本發明還包括表1的肽的同源序列或功能類似物的肽。在另一個實施例中，
該口蹄疫病毒表位的肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的G-H環高可變區域(氨基酸135-160)的天然、合成或重組肽或多肽，和包含RGD基序(3個氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列。
本發明的肽、多肽或蛋白載體能夠呈現口蹄疫病毒的免疫原性表位。在一個實施例中，該載體可以增強免疫原性應答。在一個實施例中，該載體可以是豬免疫球蛋白G重鏈恆定區，與重複多表位基因融合，其包含三個部分對應於口蹄疫病毒毒株O/China/99的VP1蛋白氨基酸殘基141-160和200-213的免疫原中(Shao J-J.,et al.Promising Multiple-Epitope Recombinant Vaccine against Foot-and-Mouth Disease Virus Type O in Swine.Clinical and Vaccine Immunology.2011,18(1)：143-149)。另一個實例中，可以使用VP1和牛IFN-γ的序列設計的融合蛋白，被證明是體液和細胞介導反應的誘導物(Shi X-J.,et al.Expressions of Bovine IFN-γ and Foot-and-Mouth Disease VP1 antigen in P.pastoris and their effects on mouse immune response to FMD antigens.Vaccine.2006,82-89)。本領域普通技術人員將容易理解和/或構建適用於本發明的肽或多肽載體。
本發明可以使用滅活病毒的任何毒株和/或血清型，該病毒例如口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或
BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等。
本發明可以使用任何類型的滅活口蹄疫病毒，包括但不僅限於，毒株O1 Campos、C3 Indaial、A24 Cruzeiro和A2001，或口蹄疫病毒的血清型如O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3或ASIA1。本發明的疫苗可以包括一種或多種不同毒株和/或不同血清型的病毒。可用於本發明製劑中的毒株將取決於預期疫苗接種區域中的主要毒株。在一個實施例中，在疫苗中配製的毒株可以是PanAisa毒株血清型O型，其與亞洲爆發性的流行病有關，並從1998年至2001年延伸至非洲和歐洲地區(Knowles N.,et al.Pandemic Strain of Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype O.Emerging Infectious Diseases.2005,11(12)：1887-1893)。其它毒株包括但不限於，O-Manisa、O-PanAsia-2(或等同物)、O-BFS或Campos、A24 Cruzeiro、Asia 1 Shamir、A Iran-05(或A TUR 06)、A22 Iraq、SAT 2 Saudi Arabia(或等同物，即SAT 2 Eritrea)、A Eritrea、SAT 2 Zimbabwe、SAT 1 South Africa、A Malaysia 97(或等同物，即A/NPT/TAI/86)、A Argentina 2001(A2001)、O Taiwan 97(豬適應毒株或菲律賓等同物)、A Iran’96、A Iran’99、A Iran 87或A Saudi Arabia 23/86(或等同物)、A15 Bangkok related strain、A87 Argentina相關毒株、C Noville、SAT 2 Kenya、SAT 1 Kenya、SAT 3 Zimbabwe以及將來根據糧農組織世界口蹄疫參考實驗室可
能出現的其他毒株。滅活過程可以使用本領域中已知的技術，例如加入氯仿和二元乙烯亞胺(BEI)兩次。此外，可以使用溶劑和/或洗滌劑和/或其它蛋白質變性劑滅活病毒顆粒。在另一個實施例中，可以通過其基因組中的遺傳變化滅活病毒顆粒或減毒。(Rieder E.,et al.Vaccines Prepared from Chimeras of Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV)Induce Neutralizing Antibodies and Protective Immunity to Multiple Serotypes of FMDV.Journal of Virology.1994,68(11)：7092-7098)。
本發明可以使用不同類型的佐劑、乳化劑、分子佐劑和載體體系。在一個實施例中，本發明的製劑包括但不限於，鋁鹽、氫氧化鋁凝膠、皂苷或衍生物如QS21、淋巴細胞因子、CpG、聚肌胞(poly I：C)、Toll樣受體激動劑、免疫刺激複合物(ISCOMs)、脂質體、不完全弗氏佐劑、脂質體、硬脂酸酪氨酸酯、角鯊烯、L121、Emulsigen、單磷醯脂質A、Montanide ISA佐劑(ISA 15 VG、ISA 25 VG、ISA 28 VG、ISA 35 VG、ISA 201 VG、ISA 206 VG、ISA 207 VG、ISA 50 V2、ISA 50 V4、ISA 61 VG、ISA 70、ISA 71 VG、ISA 71 R VG、ISA 720、ISA 760、ISA 761 VG、ISA 763 A VG、ISA 775、ISA 780)、Montanide IMS佐劑(IMS 251 C、IMS 1312 VG、IMS 1313 VG N、IMS 2215、IMS 3012)、Montanide GEL 01、Montanide GEL 02、輕質礦物油、代謝油、聚山梨醇酯
20、聚山梨醇酯40聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、聚山梨醇酯120、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、脫水山梨醇三硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨醇單油酸酯、脫水山梨醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯和其他有效的佐劑和乳化劑。在另一個實施例中，疫苗製劑是乳液，如油包水(W/O)乳液或水包油(O/W)乳液或水包油包水(W/O/W)乳液或油包水包油(O/W/O)乳液。在另一個實施例中，疫苗製劑包含乳液和一種或多種其他佐劑的混合物。可用於該疫苗製劑中的載體體系的其它實例，例如本領域中已知的可導致TH1或TH2應答的脂質體(Badiee A.,et al.The role of liposome size on the type of immune response induced in BALB/c mice against leishmaniasis：rgp63 as a model antigen.Experimental Parasitology.2011,132(4)：403-409)、微/納米球、納米顆粒如聚乳酸-乙醇酸(PLGA)和多醣(Akagi T.,et al.Biodegradable Nanoparticles as Vaccine Adjuvants and Delivery Systems：Regulation of Immune Responses by Nanoparticle-Based Vaccine.Adv.Polym.Sci.2012,247：31-64)、樹狀聚合物(Sheng K-C.,et al.Delivery of antigen using a novel mannosylated dendrimer potentiates immunogenicity in vitro and in vivo.European Journal of Immunology.2008,38(2)：424-436)、膠束體系、金納米粒子(Dykman L.,et al.Use of a synthetic foot-and-mouth disease virus peptide conjugated to gold nanoparticles for enhancing immunological response.Gold Bull.2015,48：93-101)和免疫刺激複合物(ISCOMs)。
在一個實施例中，本發明的廣效型疫苗可以通過注射器注射、無針注射、微針補片和遞送來施用。藥物組合可以通過不同途徑施用，例如口服、肌內、皮下、皮內、鼻內噴霧。
在一個實施例中，本發明的藥物組合含有衍生自口蹄疫病毒衣殼蛋白的抗原表位。該抗原表位可以衍生自，例如，A型、O型和C型的血清型；African SAT1、SAT2和SAT3血清型；和Asia-1血清型。在一個實施例中，抗原表位衍生自口蹄疫病毒的VP1蛋白。
在一個實施例中，本發明的疫苗製劑可以使用蛋白質或樹狀聚合肽作為外來肽、多肽和/或蛋白質的載體。在一個實施例中，可以使用BLS蛋白作載體或分子佐劑，把免疫應答重定向至特定毒株或血清型。在另一個實施例中，BLS蛋白的N-氨基末端與外來肽、多肽和/或蛋白質融合。
在一個實施例中，外來肽、多肽和/或蛋白質包含病毒的表位，該病毒包括但不限於口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒。在一個實施例中，該BLS蛋白與來自衣殼蛋白VP1、
VP2、VP3和VP4，或病毒的非結構蛋白質的全部、部分或變異的病毒肽、多肽或蛋白質融合，包括但不限於口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒等。在一個實施例中，該融合蛋白可誘導宿主中一種或多種病毒的免疫應答。
在另一個實施例中，外來肽、多肽和/或蛋白質包含口蹄疫病毒表位。在一個實施例中，外源肽、多肽和/或蛋白質與蛋白質載體和BLS佐劑融合以引發更強的免疫應答。在一個實施例中，BLS或其變異的BLS與來自衣殼蛋白的VP1、VP2、VP3和VP4，或非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的全部、部分或變異的口蹄疫病毒肽，多肽或蛋白質融合。在一個實施例中，BLS或其變異的BLS與一種或多種口蹄疫病毒肽或其變異或同源物如表1所示的序列(SEQ ID NO.1-55)融合。在另一個實施例中，BLS或其變異的BLS與一種或多種如表1所示的肽的同源或功能類似物的肽序列融合。在一個實施例中，BLS或其變異的BLS與衍生自口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的全部、部分或變異的G-H環高可變區域(氨基酸135-160)的天然、合成或重組肽或多肽，和包含RGD基序(3個氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列融合。在另一個實施例中，BLS或其變異的蛋白質與蛋白質、多肽和肽融合，並以肽或多肽作為接頭。在一個實施例中，本發明的融合蛋白可誘導
宿主中口蹄疫病毒的免疫反應。在一個實施例中，本發明的疫苗製劑還包含一種或多種滅活的口蹄疫病毒。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑還包含一種或多種質粒DNA。在一個實施例中，本發明的質粒DNA可以編碼BLS與源自口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白質融合的蛋白。在一個實施例中，BLS或其變異的BLS可以用作分子佐劑而沒有與任何口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白質融合。
在一個實施例中，本發明的廣效型疫苗可以使用線性肽表位串聯配製。在另一個實施例中，可以結合使用T表位和B表位的組合(Blanco E.et al.Identification of T-Cell Epitopes in Nonstructural Proteins of Foot-and-Mouth Disease Virus.Journal of Virology.2001.April：3164-3174)。
在一個實施例中，在廣效型疫苗的製劑中，用於呈現免疫原性抗原的多肽可以採用不同配置的樹狀聚合肽。例如，樹狀聚合肽可以配置成含有一種或多種衍生自口蹄疫病毒表位的肽(Blanco E.,et al.B Epitope Multiplicity and B/T Epitope Orientation Influence Immunogenicity of Foot-and-Mouth Disease Peptide Vaccines.Clinical and Developmental Inmunology.2013,Article ID 475960 and Cubillos C.Enhanced Mucosal Immunoglobulin A Response and Solid Protection against Foot-and-Mouth Disease Virus Challenge Induced by a Novel Dendrimeric Peptide.Journal of Virology.2008,July：7223-7230)。有其他實例描述了樹
狀聚合肽(Monsó M.,et al.Influence of configuration chemistry and B Epitope Orientation on the Immune Response of Branched Peptide Antigens.Bioconjugate Chemistry：24(4),578-585,2013)。呈現在樹狀聚合肽上的口蹄疫病毒表位可以是相同表位或不同表位，以針對口蹄疫病毒的不同毒株和/或血清型提供保護。
在另一個實施例中，可以通過僅融合口蹄疫病毒免疫原性肽來構建樹狀聚合肽。
在一個實施例中，廣效型疫苗製劑包含一種或多種BLS嵌合蛋白，攜帶來自不同類型的口蹄疫病毒不同的肽、多肽和/或蛋白質，以便對不同類型的口蹄疫病毒提供保護。
在另一個實施例中，源自口蹄疫病毒不同的肽、多肽和/或蛋白質可以與BLS蛋白質融合，以便對不同類型的口蹄疫病毒提供保護。
在一個實施例中，與BLS蛋白質融合的一種或多種源自口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白質可以衍生自口蹄疫病毒的B表位和/或T表位。
在一個實施例中，選擇與BLS蛋白質融合的源自口蹄疫病毒不同的肽、多肽和/或蛋白質的標準取決於需要保護的口蹄疫病毒的類型。本發明能夠針對一種特定毒株、針對相同血清型的不同毒株或針對不同的血清型設計疫苗。為了針對一種特定的毒株提供保護，建議可以組合使用衍生自該毒株的B表位和T表位的肽，以提高保護效
果(Blanco E.,et al.B Epitope Multiplicity and B/T Epitope Orientation Influence Immunogenicity of Foot-and-Mouth Disease Peptide Vaccines.Clinical and Developmental Inmunology：Article ID 475960,2013)。為了對多於一種毒株提供保護，建議可以組合使用衍生自不同毒株的表位的肽(Cao Y.,et al.Evaluation of cross-protection against three topotypes of serotype O foot-and-mouth disease virus in pigs vaccinated with multi-epitope protein vaccine incorporated with poly(I：C).Veterinary Microbiology.2014,168(2-4)：294-301)，並建議同時選擇衍生自口蹄疫病毒的B表位和T表位的肽。為了對多於一種血清型提供保護，建議可以組合使用衍生自不同血清型的表位的肽，並建議同時選擇衍生自口蹄疫病毒的B表位和T表位的肽。
在一個實施例中，具有口蹄疫病毒表位的肽的實施例，包括但不限於，表1所示的肽。本領域普通技術人員將容易理解到，本發明不限於表1所述的肽；本發明包括表1所述的肽以及其變異、同源序列和/或功能類似物。
在一個實施例中，本發明的廣效型疫苗可以在沒有多核苷酸序列的情況下使用。
在一個實施例中，本發明的方法根據GMP標准開發，以確保疫苗的質量和純度。在許多情況下，符合GMP標準是輸出產品的必要條件。
在一個實施例中，本發明適用於OIE協議緊急疫苗方案，以對抗口蹄疫病毒的新毒株的爆發。實現上述方案的準則是該疫苗需在單次給藥後能夠為動物提供足夠的保護，以防止動物受口蹄疫病毒感染。
在一個實施例中，本發明適用於產生抗原庫，可以在緊急情況下使用，以製備FMDV口蹄疫病毒的廣效型疫苗。
在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑可以多次給藥。
在一個實施例中，本發明提供一種能夠誘導針對口蹄疫病毒不同血清型或病毒株的交叉保護的疫苗製劑，其中該疫苗製劑包含全滅活口蹄疫病毒和至少一種以下成分：(a)在不同類型質粒中編碼口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；(b)口蹄疫病毒的人工肽或多肽；(c)口蹄疫病毒的重組肽、多肽或蛋白質；(d)口蹄疫病毒樣顆粒；(e)衍生自其他病毒的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒展示口蹄疫病毒的重組肽、多肽或蛋白質；(f)蛋白質作為載體或分子佐劑與衍生自口蹄疫病毒的肽、多肽和/或蛋白質融合；(g)佐劑、乳化劑、分子佐劑和載體體系。
在一個實施例中，本發明的疫苗製劑能夠針對口蹄疫病毒特定血清型的所有毒株。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑能夠針對該病毒的一種或多種血清型的所有毒株，誘導保護性免疫，該血清型包含O、A、C、Asia 1、SAT-1、SAT-2和SAT-3。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑能夠針對口蹄疫病毒的所有血清型的所有毒株，誘導保護性免疫。
在一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含一種或多種編碼口蹄疫病毒蛋白質的全部、部分或變異氨基酸序列的多核苷酸，所述氨基酸序列衍生自口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)及其變異序列。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含編碼表1同源的肽的多核苷酸序列。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含編碼表1功能類似物的肽的多核苷酸序列。
在一個實施例中，本發明含有口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白質的疫苗製劑包含一種或多種口蹄疫病毒蛋白質的全部、部分或變異的序列，例如衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或氨基酸序列SEQ ID NO.1-55。在另一個實施例中，該肽或多肽包含表1的肽的同源或功能類似物的氨基酸序列。在另一個實施例中，本發明的口蹄疫病毒多肽是人工或重組肽或多肽衍生自(i)口蹄疫病毒VP1衣殼
蛋白的全部、部分或變異的G-H環高可變區域(氨基酸135-160)的天然、合成或重組肽或多肽，和(ii)包含RGD基序(3個氨基酸序列：Arg-Gly-Asp)的序列。在一個實施例中，口蹄疫病毒多肽是線性肽。在另一個實施例中，本發明的口蹄疫病毒多肽是具有不同構型的樹狀聚合肽，包括但不限於任意超分枝型、接枝型、樹枝狀聚合物、樹枝狀高分子。在一個實施例中，通過僅融合口蹄疫病毒免疫原性肽構建樹狀聚合肽。
在一個實施例中，本發明含有滅活口蹄疫病毒的疫苗製劑包含源自任何血清型或毒株的口蹄疫病毒。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含一種或多種源自不同血清型或毒株的口蹄疫病毒。
在一個實施例中，本發明含有口蹄疫病毒樣顆粒的疫苗製劑包含一種或多種天然或突變形式的口蹄疫病毒VP0、VP1和VP3蛋白質。在一個實施例中，該突變形式的VP0、VP1和VP3蛋白質能形成完整的空衣殼蛋白。
在一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含衍生自其他病毒的病毒樣顆粒與一種或多種衍生自全部、部分或變異的口蹄疫病毒的氨基酸序列融合，例如衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或氨基酸序列SEQ ID NO.1-55；或表1所示的肽的同源或功能類似物的肽的氨基酸序列。
在一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含肽、多肽或蛋白質作為載體或分子佐劑，並與一種或多種口蹄
疫病毒肽、多肽或蛋白質的全部、部分或變異的序列融合，例如衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4；非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D；或氨基酸序列SEQ ID NO.1-55；或表1所示的肽的同源或功能類似物的肽的氨基酸序列。在一個實施例中，本發明的口蹄疫病毒多肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的全部、部分或變異的G-H環高可變區域(氨基酸135-160)的天然、合成或重組肽或多肽。
在一個實施例中，本發明的蛋白質、多肽或肽載體可以使用任何接頭與目標序列融合。
在一個實施例中，用作載體和/或分子佐劑的蛋白質來自BLS蛋白的天然氨基酸序列或其變異的序列。在一個實施例中，可以使用任何肽或多肽接頭融合BLS蛋白與口蹄疫病毒肽、多肽或蛋白質。在一個實施例中，BLS蛋白作為載體或分子佐劑，並與一種或多種口蹄疫病毒肽、多肽或蛋白質的全部、部分或變異的序列融合，該序列衍生自衣殼蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)或非結構蛋白(2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D)。在一個實施例中，BLS蛋白作為載體或分子佐劑，並與表1所示具有口蹄疫病毒表位的肽(SEQ ID NO.1-55)融合，或與表1所示的肽(SEQ ID NO.1-55)的突變序列融合，或其同源或功能類似物的肽融合。在另一個實施例中，本發明的口蹄疫病毒多肽是衍生自口蹄疫病毒VP1衣殼蛋白的全部、部分或變異的G-H環高可變區域(氨基酸135-160)的天然、合成
或重組肽或多肽。在另一個實施例中，可以使用任何肽或多肽接頭融合BLS蛋白與任何肽、多肽和蛋白質。在一個實施例中，BLS蛋白與來自相同口蹄疫病毒毒株或血清型的一種或多種口蹄疫病毒肽、多肽或蛋白質融合。在另一個實施例中，BLS蛋白與來自不同口蹄疫病毒毒株或血清型的一種或多種口蹄疫病毒肽、多肽和/或蛋白質融合。在另一個實施例中，BLS蛋白或其突變體不與任何口蹄疫病毒肽、多肽和蛋白質融合。在另一個實施例中，BLS的突變體是具有點突變的BLS蛋白以提高穩定性。
在一個實施例中，本發明的佐劑和乳化劑可以選自鋁鹽、氫氧化鋁凝膠、皂苷或衍生物如QS21、淋巴細胞因子、CpG、聚肌胞(poly I：C)、Toll樣受體激動劑、免疫刺激複合物(ISCOMs)、脂質體、不完全弗氏佐劑、脂質體、硬脂酸酪氨酸酯、角鯊烯、L121、Emulsigen、單磷醯脂質A、Montanide ISA佐劑(ISA 15 VG、ISA 25 VG、ISA 28 VG、ISA 35 VG、ISA 201 VG、ISA 206 VG、ISA 207 VG、ISA 50 V2、ISA 50 V4、ISA 61 VG、ISA 70、ISA 71 VG、ISA 71 R VG、ISA 720、ISA 760、ISA 761 VG、ISA 763 A VG、ISA 775、ISA 780)、Montanide IMS佐劑(IMS 251 C、IMS 1312 VG、IMS 1313 VG N、IMS 2215、IMS 3012)、Montanide GEL 01、Montanide GEL 02、輕質礦物油、代謝油、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、聚山梨醇酯120、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、脫水
山梨醇三硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨醇單油酸酯、脫水山梨醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯和其他有效的佐劑和乳化劑。
在一個實施例中，疫苗製劑是乳液，如油包水(W/O)乳液或水包油(O/W)乳液或水包油包水(W/O/W)乳液或油包水包油(O/W/O)乳液。在另一個實施例中，疫苗製劑包含乳液和一種或多種其他佐劑的混合物。
在一個實施例中，載體系統可以是脂質體、微米球、納米顆粒、樹枝狀大分子、膠束系統或免疫刺激複合物(ISCOM)。
本發明提供一種對易受口蹄疫病毒感染的宿主接種疫苗的方法，包含向宿主施用一種或多種本發明所述之疫苗製劑以誘導免疫反應。在一個實施例中，該疫苗製劑的組分於不同時間點施用在宿主上。在另一個實施例中，其中該疫苗製劑的組分在宿主的不同位置於相同時間點施用。在另一個實施例中，該疫苗製劑的組分在宿主的不同位置於不同時間點施用。在一個實施例中，該宿主是牛、羊、山羊或豬。
在一個實施例中，該宿主未感染口蹄疫病毒，該誘導的免疫反應是保護性免疫反應。在另一個實施例中，該宿主已被口蹄疫病毒感染，該誘導的免疫應答是治療性免疫反應。在一個實施例中，該誘導的免疫反應是體液免疫反應。在另一個實施例中，該誘導的免疫反應是細胞免疫反應。在另一個實施例中，該誘導的免疫反應包括
針對一種或多種口蹄疫病毒血清型或毒株的交叉保護中和抗體。在另一個實施例中，誘導的免疫應答與口蹄疫病毒的各種血清型和/或毒株交叉反應。
在一個實施例中，本發明提供一種能夠誘導針對不同血清型或病毒株的交叉保護的疫苗製劑，其中該疫苗製劑包含全滅活病毒和至少一種以下成分：(a)編碼該病毒的肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；(b)該病毒的人工肽或多肽；(c)該病毒的重組肽、多肽或蛋白質；(d)該病毒的病毒樣顆粒；(e)衍生自其他病毒的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒展示該病毒的重組肽、多肽或蛋白質；或(f)肽、多肽或蛋白質作為載體或分子佐劑，其中該肽、多肽或蛋白質會或不會與任何上述的成分融合。所述病毒包括但不限於口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1)、牛疱疹病毒-5型(BoHV-5)、副流感病毒-3型(BPIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(Bovine Respiratory Syncytial Virus，BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)及狂犬病病毒等。
在一個實施例中，本發明的疫苗製劑能夠針對該病毒特定血清型的所有毒株，或針對該病毒的所有血清型的所有毒株，誘導保護性免疫。
在一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含口蹄疫病毒，其中該多核苷酸衍生自以下各選擇中全部、部分或變異的序列：(a)編碼一個或多個口蹄疫病毒衣殼蛋白基因VP1、VP2、VP3和VP4的多核苷酸序列；(b)編碼一個或多個口蹄疫病毒非結構蛋白基因2A、2B、2C、2D、3A、
3B、3C和3D的多核苷酸序列；(c)編碼一個或多個氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)的多核苷酸序列；或(d)編碼一個或多個與氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)同源或功能類似物的肽的多核苷酸序列。在一個實施例中，其中該同源肽與氨基酸序列SEQ ID NO.1-55具有55、60、65、70、75、80、85、90或95%的同源性。在一個實施例中，其中該多核苷酸序列可以編碼表1所示的肽的功能類似物的肽。在另一個實施例中，該功能性類似物的肽與SEQ ID NO.1-55中任一個氨基酸序列具有低至10%的同源性。
在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含口蹄疫病毒，其中該重組或人工病毒肽、多肽或蛋白質編碼選自以下各選擇中全部、部分或變異的序列：(a)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；(b)口蹄疫病毒非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；(c)一個或多個SEQ ID NO.1-55(表1)的氨基酸序列；或(d)編碼一個或多個與氨基酸序列SEQ ID NO.1-55(表1)同源或功能類似物的肽的氨基酸序列。在一個實施例中，其中該同源肽與氨基酸序列SEQ ID NO.1-55具有55、60、65、70、75、80、85、90或95%的同源性。在另一個實施例中，該功能性類似物的肽與SEQ ID NO.1-55中任一個氨基酸序列具有低至10%的同源性。在一個實施例中，該重組或人工的病毒肽或多肽是線性或樹狀聚合肽。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含的滅活口蹄疫病毒衍生自口蹄疫病毒的任何血清型或毒株。在一
個實施例中，該滅活口蹄疫病毒包含一種或多種口蹄疫病毒的血清型或毒株。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑含有的口蹄疫病毒樣顆粒包括一種或多種天然或突變形式的口蹄疫病毒VP0、VP1和VP3蛋白質，或其突變形式的口蹄疫病毒VP0、VP1和VP3蛋白質能形成完整的空衣殼蛋白。
在一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含口蹄疫病毒，其中該衍生自其他病毒的病毒樣顆粒與病毒肽、多肽或蛋白質融合，其中該病毒肽、多肽或蛋白質選自以下各選擇中全部、部分或變異的序列：(a)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；(b)口蹄疫病毒非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；(c)與表1所示的氨基酸序列同源或功能類似物的肽的氨基酸序列。在一個實施例中其中該同源肽與氨基酸序列SEQ ID NO.1-55具有55、60、65、70、75、80、85、90或95%的同源性。在另一個實施例中，該功能性類似物的肽可以與SEQ ID NO.1-55中任一個氨基酸序列具有低至10%的同源性。
在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含口蹄疫病毒，其中該載體或分子佐劑與多肽融合，其中該多肽編碼選自以下各選擇中全部、部分或變異的序列：(a)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；(b)口蹄疫病毒非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；(c)一個或多個SEQ ID NO.1-55的
氨基酸序列；或(d)一個或多個與氨基酸序列SEQ ID NO.1-55同源或功能類似物的肽的氨基酸序列。在一個實施例中，其中該同源肽與氨基酸序列SEQ ID NO.1-55具有55、60、65、70、75、80、85、90或95%的同源性。在另一個實施例中，該功能性類似物的肽可以與SEQ ID NO.1-55中任一個氨基酸序列具有低至10%的同源性。在一個實施例中，其中該載體或分子佐劑是線性或樹狀聚合物。
在另一個實施例中，該載體或分子佐劑衍生自天然的BLS蛋白或其突變的氨基酸序列。在一個實施例中，BLS蛋白與一個或多個衍生自相同口蹄疫病毒毒株或血清型的口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白質融合。在另一個實施例中，BLS蛋白與一個或多個衍生自不同口蹄疫病毒毒株或血清型的口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白質融合。在一個實施例中，BLS蛋白或突變的BLS蛋白沒有與任何口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白質融合。在另一個實施例中，BLS的突變體是具有點突變的BLS蛋白以提高穩定性。
本發明提供了一種對易受口蹄疫病毒感染的宿主接種疫苗的方法，包含向宿主施用本發明所述的疫苗製劑以誘導免疫反應。在一個實施例中，該疫苗製劑的組分在宿主的不同位置同時施用。在一個實施例中，該疫苗製劑的組分在宿主的相同位置於不同時間點施用。在一個實施例中，該疫苗製劑的組分在宿主的不同位置於不同時間點施用。在一個實施例中，該宿主是牛、羊、山羊或
豬。
在一個實施例中，該宿主未感染口蹄疫病毒，其中該誘導的免疫反應是保護性免疫反應。在另一個實施例中，該誘導的免疫反應是體液免疫反應或細胞免疫反應。
在一個實施例中，該誘導的免疫反應包括針對一種或多種口蹄疫病毒血清型或毒株的交叉保護中和抗體。在另一個實施例中，該誘導的免疫反應與一種或多種口蹄疫病毒的血清型或毒株交叉反應。
本發明還提供了一種藥物組合，用於誘導針對宿主中的一種或多種病毒性疾病的一種或多種免疫反應和/或用於增強宿主接種疫苗的有效性，包含：(a)本發明所述能夠在宿主中引發免疫應答的疫苗製劑；和(b)一種或多種增強宿主免疫應答的分子佐劑，其中該疫苗製劑和分子佐劑可以單獨或一起施用。引發病毒性疾病的病毒包括但不限於，口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒。在一個實施例中，本發明的藥物組合是本發明所述的疫苗製劑包含一個或多個多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、病毒樣顆粒、滅活病毒、佐劑、乳化劑、分子佐劑和載體系統。在另一個實施例中，本發明的藥物組合含有一種或多種本發明所述的疫苗製劑，包含一個或多個多核苷酸、肽、多肽、蛋白質、病毒
樣顆粒、滅活病毒、佐劑、乳化劑、分子佐劑和載體系統。
在另一個實施例中，本發明的藥物組合中使用的疫苗製劑可以誘導針對目標病毒的不同血清型和/或毒株的交叉保護，該目標病毒包括但不限於口蹄疫病毒、牛輪狀病毒、牛疱疹病毒-1型(BoHV-1或BHV-1)和牛疱疹病毒-5型(BoHV-5或BHV-5)、牛副流感病毒-3型(PIV-3)、牛呼吸道合胞病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒和狂犬病病毒。在另一個實施例中，本發明的疫苗製劑包含一種或多種有效量的組分，例如佐劑、乳化劑、分子佐劑和載體，以觸發免疫應答，疫苗製劑中用於觸發免疫應答的組分包括但不限於：全滅活病毒；病毒樣顆粒；衍生自其他病毒的病毒樣顆粒並展示目標病毒的重組肽、多肽或蛋白質；編碼病毒肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；目標病毒的合成肽或多肽；目標病毒的重組肽、多肽或蛋白質；目標病毒的病毒樣顆粒；衍生自其他病毒的病毒樣顆粒。
在一個實施例中，藥物組合的分子佐劑選自：鋁鹽、氫氧化鋁凝膠、皂苷或衍生物如QS21、淋巴細胞因子、CpG、聚肌胞(poly I：C)、Toll樣受體激動劑、免疫刺激複合物(ISCOMs)、脂質體、不完全弗氏佐劑、脂質體、硬脂酸酪氨酸酯、角鯊烯、L121、Emulsigen、單磷醯脂質A、Montanide ISA佐劑(ISA 15 VG、ISA 25 VG、ISA 28 VG、ISA 35 VG、ISA 201 VG、ISA 206 VG、ISA 207 VG、ISA 50 V2、ISA 50 V4、ISA 61 VG、ISA 70、ISA 71
VG、ISA 71 R VG、ISA 720、ISA 760、ISA 761 VG、ISA 763 A VG、ISA 775、ISA 780)、Montanide IMS佐劑(IMS 251 C、IMS 1312 VG、IMS 1313 VG N、IMS 2215、IMS 3012)、Montanide GEL 01、Montanide GEL 02、輕質礦物油、代謝油、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯85、聚山梨醇酯120、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、脫水山梨醇三硬脂酸酯、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨醇單油酸酯、脫水山梨醇三油酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、油包水(W/O)乳液、水包油(O/W)乳液、水包油包水(W/O/W)乳液、油包水包油(O/W/O)乳液、聚乳酸-乙醇酸、多醣、樹狀聚合物、金納米粒子、衍生自病毒衣殼蛋白的抗原表位、BLS蛋白、BLS蛋白與能夠引發免疫應答的成分融合或突變的BLS蛋白與能夠引發免疫應答的成分融合。
在一個實施例中，BLS蛋白與能夠引發免疫應答的成分融合，並以肽或多肽作為接頭。
本發明提供了一種對易受口蹄疫病毒感染的宿主接種疫苗的方法，包括對宿主施用本發明的藥物組合以誘導免疫應答，其中疫苗和分子佐劑分別或一起施用。
在一個實施例中，本發明的藥物組合通過口服、肌內、皮下、皮內、鼻內噴霧施用。
在一個實施例中，本發明的藥物組合在宿主的相同位置同時施用。在另一個實施例中，本發明的藥物組合在宿主的相同位置於不同時間點施用。在另一個實
施例中，本發明的藥物組合在宿主的不同位置同時施用。在另一個實施例中，本發明的藥物組合在宿主的不同位置於不同時間點施用。
通過引用以下的實驗細節，可以更好地理解本發明。然而，本領域技術人員應理解所提供的實施例僅作為說明作用，而非限制本發明的範圍。本發明的範圍將由隨後的申請專利範圍所界定。
在本申請中的引用了不同的參考文獻或出版物。這些參考或出版物的全文和公開都結合到本申請中，從而更全面地描述本發明的情況。過渡語“包含”與“包括”、“含有”或“以......為特徵”是同義的，是包括性或開放式的，當中並不排除有另外未列舉的元素或方法步驟。
本實例說明瞭製備針對不同類型的口蹄疫病毒的疫苗製劑和步驟。
在一個實施例中，具有重組蛋白或滅活全口蹄疫病毒抗原的疫苗製劑包含以下化學物質和溶液：
-水相(抗原相)溶液：三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.02M，NaCl 0.3M，pH=8。
-油相溶液：Montanide ISA 50 V2。
在另一個實施例中，具有質粒DNA的疫苗製劑包含以下化學物質和溶液：
-磷酸鹽緩衝鹽水10X(PBS)：80g/L NaCl，2g/L
KCl，11.5g/L Na2HPO4，2g/L KH2PO4.pH=7.2。
表3顯示了四種用於測試的不同疫苗製劑(D、E、F和G)。
在一個實施例中，按照以下步驟配製基於重組BLS蛋白的口蹄疫病毒疫苗製劑：
1)在50mL的錐形瓶中製備水相，其體積如表3所示。
2)把油相的體積加入100mL燒杯中。
3)把Ultra-Turrax(T10、T18、T25或T50)的小莖(S10N-10G、S10N-10G-ST、S18N-10G、S18N-19G、S25N-10G、S25N-10G-ST、S25N-18G、S25N-18G-ST、S25N-25G、S25N-25G-ST和其他類
似物)置於具有油相的管內。當該油相以6500rpm攪拌時，以5mL/min的流速加入適當體積的水相。
4)加入所有水相後，混合物在21500rpm下乳化30秒。
5)為了測量顆粒尺寸的分佈，每種製劑各取500μl等分於Eppendorf管中。如果d(0.9)(第90個百分位數，這表明90%的水相體積已經形成了具有小於指定尺寸(μm)的直徑的顆粒)的值小於3微米，然後，進行填裝和完成的過程。否則，將其再均化30秒，並重新測量d(0.9)以獲得指定值。
6)將製劑無菌分裝在25mL小瓶中，隨後將其封閉並用橡膠塞蓋住並使用無菌鑷子翻轉。
7)不同的製劑儲存於4℃。
在另一個實施例中，按照以下步驟配製基於BLS的質粒DNA的口蹄疫病毒疫苗製劑：：
1)含有BLS-I(DNA)的質粒pVAX1通過QIAGEN's EndoFree Plasmid Giga Kit從大腸桿菌(E.coli DH5α)的培養物在50μg/ml卡那黴素的LB無菌培養液中於37℃下純化。
2)通過瓊脂糖凝膠電泳證實質粒pVAX1-BLS-I(DNA)的存在。
3)使用10X PBS緩衝液把純化的pVAX1-BLS-I(DNA)稀釋至最終濃度1mg/mL。
在另一個實施例中，按照以下步驟配製滅活全口蹄疫病毒抗原的疫苗：
1)使用磁力攪拌器在第一個5升無菌玻璃瓶中把油相混合。
2)在第二個5升無菌玻璃瓶中製備包含從生產過程中獲得的滅活全口蹄疫病毒抗原的水相，然後使用蠕動泵和無菌矽膠管，逐漸轉移水相至包含油相的第一個5升無菌玻璃瓶中，在13.5-15℃下以均速混合。
3)溫度降至2-8℃，用磁力攪拌器進行高速攪拌約15-16小時。
4)然後把混合物從第一個5升瓶通過試點規模的SilversonL4RT高速剪切混合機轉移至第三個無菌5升玻璃瓶中，以產生最終乳液。高速剪切混合機的轉速為4000rpm。
5)乳化完成後再攪拌30-35分鐘。
6)停止攪拌，在2-8℃下靜置乳液直至填裝和完成的過程。
本實例說明瞭使用不同疫苗製劑，包括基於BLS的口蹄疫病毒重組疫苗，接種動物的方法。
本實例使用了22只18至24個月大及沒有施用口蹄疫疫苗的赫里福德小牛。對所有動物進行了針對口蹄疫病毒的血清學檢測，由此證實不存在初乳抗體和/或疫苗相關抗體。整個臨床試驗中，動物留於同一場地。
把動物隨機分為6個實驗組：第1組(n=4)於不同時間施用1mL疫苗製劑D(表3,SEQ ID NO.56：編碼融合蛋白BLS-I的BLS-I(DNA)質粒DNA(pVAX1))及5mL疫苗製劑E(表3,SEQ ID NO.57：BLS-I)；第2組(n=4)於不同時間施用1mL疫苗製劑D(Table 3,SEQ ID NO.56：編碼融合蛋白BLS-I的BLS-I(DNA)質粒DNA(pVAX1))及5mL疫苗製劑F(表3所示的融合蛋白組合SEQ ID NO.57(BLS-I)、SEQ ID NO.58(BLS-D)和SEQ ID NO.59(BLS-A1))；第3組(n=4)於不同時間施用兩次5mL疫苗製劑E(表3，SEQ ID NO.57：BLS-I)；第4組(n=4)於不同時間施用5mL疫苗製劑F(融合蛋白組合SEQ ID NO.57(BLS-I)、SEQ ID NO.58(BLS-D)和SEQ ID NO.59(BLS-A1))；第5組(n=2)為對照組對應於未接種疫苗的動物。最後，第6組(n=4)施用2mL疫苗製劑G(如表3所示包含四種滅活的口蹄疫病毒抗原的四價疫苗作為陽性對照)
實驗疫苗在研究的第0天和第30天使用首劑/加強方案施用：第0天的第一次注射啟動免疫，第30天的第二次注射加強免疫。
在接種疫苗後30，60，90和105天(DPV)進行抽血。表4列出不同的接種方案。
進行ELISA測定以測量包含DNA(BLS-I)及BLS-肽(BLS-D、BLS-I及BLS-A1)(圖1及圖2，第1及第2組)的疫苗製劑和包含BLS-肽混合物(BLS-D、BLS-I和BLS-A1的不同組合)(圖1及圖2，第3及第4組)的疫苗製劑應用於牛隻(劑量為每疫苗製劑2或5mL)中產生的O1 Campos毒株特異性總抗體。結果顯示，兩種類型的疫苗只能誘導非常低的抗體產生，並明顯低於陽性對照(圖1及圖2，第6組)。
本實例說明實例2的動物接種疫苗後，獲得針對口蹄疫病毒毒株O1 Campos的免疫保護。
在第一次接種後112天(DPV)，來自實施例2的動物，在生物安全水平4的OIE設施中以10,000半數致死劑量(LD 50)(在乳鼠中測定的致死劑量)口內注射強毒口蹄疫病毒O1 Campos毒株。在感染後7天(DPI)從廣泛性口蹄疫病毒疫苗對足部感染的試驗(Podal Generalization)獲得的保護結果。當動物的位置(RFM、LFM、RHM和LHM)沒有
顯示任何症狀時，會被定義為“受保護”。因為舌頭是接種部位，所以不考慮對該部位進行分析。
結果：為了檢測這些疫苗是否能夠賦予保護性免疫力，進行了感染攻毒。結果顯示，這些疫苗不能保護動物免受病毒感染，因為結果坍均呈現典型的與口蹄疫病毒相關的病變。只有使用滅活的全口蹄疫病毒疫苗作為陽性對照能夠提供完全的保護(圖3)。這些實驗的結果顯示，當肽疫苗用作唯一抗原時，不能為接種疫苗的動物針對自體口蹄疫病毒提供任何保護
本實例說明瞭結合使用BLS-口蹄疫病毒(O1 Campos)重組疫苗和滅活全口蹄疫病毒(A2001)疫苗接種動物所實現的效果。
在一個實施例中，疫苗製劑包含以下化學物質和溶液：
-水相溶液：三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.02M，NaCl 0.3M，pH=8。
-油相溶液：Montanide ISA 61 VG
使用與實施例1中包含BLS肽的疫苗相同的步驟配製疫苗製劑A。
使用與實施例1中包含全滅活病毒抗原的疫苗相同的步驟配製疫苗製劑B和C。
表5顯示了測試的三種不同製劑(A、B和C)
使用了25頭6至10個月大及沒有施用口蹄疫疫苗的黑色阿伯丁安格斯小牛(公牛及母牛)。對所有動物進行了針對口蹄疫病毒的血清學檢測，由此證實不存在初乳抗體和/或疫苗相關抗體。整個臨床試驗中，動物留於同一場地。
把動物隨機分為4個實驗組：第1組(n=6)同時在右側施用2mL疫苗製劑B(A Argentina 2001毒株)和在左側施用2mL疫苗製劑A(表5，BLS-I)；第2組(n=6)施用2mL疫苗製劑B(表5，A Argentina 2001毒株)；第3組(n=9)
施用2mL疫苗製劑C(表5，O1 Campos毒株)。第4組(n=2)為對照組對應於未接種疫苗的動物。
實驗疫苗在研究的第0天施用。表6顯示了不同的接種方案。
在接種疫苗後29和58天(DPV)如表6所示進行抽血。
使用特異性O1 Campos抗體的液相ELISA測定進行分析。在接種後的兩個時間點，第29和58天，使用單價病毒疫苗免疫的組別中獲得的抗體滴度在預期值內，在同源O1 Campos疫苗的情況下獲得最大數值，而在使用毒株A2001接種的動物中獲得最少針對O1 Campos的交叉反應性抗體。結合使用兩種不同疫苗的免疫方案，在一側施用重組BLS-I疫苗和在另一側施用全滅活A2001病毒抗原，能夠產生明顯良好的抗O1 Campos抗體水平(圖4和圖5)。
本實例的BLS蛋白用作載體和分子佐劑，以將
免疫應答重定向到特定毒株或血清型。實驗中使用BLS-I(SEQ ID NO.57)，蛋白質載體BLS與具有口蹄疫病毒表位的肽融合，結果顯示，當使用兩種不同疫苗組合的疫苗接種方案時，滅活全口蹄疫病毒(A2001)疫苗和融合肽BLS-I(SEQ ID NO.57)疫苗同時接種在動物的不同部位，可有效誘導針對O1 Campos毒株的強烈免疫應答。另一方面，單獨使用滅活全口蹄疫病毒(A2001)疫苗，但沒有使用融合肽BLS-I，未能產生良好水平的O1 Campos抗體。此外，如實例2所示，通過單獨使用BLS-1免疫原獲得的非常低的O1 Campos特異性抗體水平，而結合免疫方案所獲得的血清學結果特別高。
本實例在牛測試了三種疫苗製劑，以分析結合使用2種疫苗的免疫方案，口蹄疫病毒(A2001)重組肽與BLS蛋白融合的疫苗和滅活全口蹄疫病毒(O1 Campos)顆粒疫苗，在動物中產生對A2001的免疫應答的效果。測試的疫苗製劑和組合是：I(A2001全滅活病毒顆粒為陽性對照)，J(O1 Campos全滅活病毒顆粒為陰性對照)，H+J(結合使用2種疫苗：含有BLS-I_A2001融合蛋白SEQ ID NO.60的疫苗(H)和O1 Campos全滅活病毒顆粒疫苗(J)(表7))。
在一個實施例中，疫苗製劑包含以下化學物質和溶液：
-水相溶液：三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.02M，NaCl 0.3M，pH=8。
-油相溶液：Montanide ISA 61 VG
使用與實施例1中包含BLS肽的疫苗相同的步驟配製疫苗製劑H。
使用與實施例1中包含全滅活病毒抗原的疫苗相同的步驟配製疫苗製劑I和J。
本實例使用了38頭18至24個月大及沒有施用口蹄疫疫苗的赫里福德小牛小牛。對所有動物進行了針對口蹄疫病毒的血清學檢測，由此證實不存在初乳抗體和/或疫苗相關抗體。整個臨床試驗中，動物留於同一場地。表9顯示了感染攻毒的方案。
實驗疫苗在研究的第0天或第0天和第28天施用。表8列出不同的接種方案。
在接種疫苗後28，63和98天(DPV)如表8所示進行抽血。
進行ELISA測定以測量三種疫苗製劑產生的A2001毒株的總抗體。結果顯示，結合使用滅活全口蹄疫病毒(O1 Campos)顆粒和BLS-I_A2001的組合可以誘導產生與陽性對照(A2001全病毒疫苗)相同水平的抗體，然而單獨使用O1 Campos疫苗接種則產生非常低的抗A2001血清學結果(圖6和7)。上述結果與實例4所獲得的結果一致，並且在實例4中顯示的方案證明令人驚奇的協同效應，可用於靶向其它任何口蹄疫病毒毒株：本實例通過改變整個滅活病毒(O1 Campos)和融合肽(BLS-I_A2001)的毒株而成功實現。因此，實例4和5的結果表明，本發明所述的方案和方法可有效獲得廣效型口蹄疫疫苗。
本實例說明瞭實例5的動物接種疫苗後，獲得針對口蹄疫病毒毒株A2001的免疫保護。
在第一次接種(DPV)後112天，來自實施例5的動物，在生物安全水平4的OIE設施中以10,000半數致死劑量(LD 50)(在乳鼠中測定的致死劑量)口內注射強毒口蹄疫病毒A2001毒株。在感染後7天(DPI)從廣泛性口蹄疫病毒疫苗對足部感染的試驗(Podal Generalization)獲得的保護結果。當動物的位置(RFM、LFM、RHM和LHM)沒有顯示任何症狀時，會被定義為“受保護”。因為舌頭是接種部位，所以不考慮對該部位進行分析。
結果：為了檢測這些疫苗是否能夠賦予保護性免疫力，進行了感染攻毒。結果顯示結合使用全滅活病毒
顆粒(疫苗製劑J)和BLS-I_A2001融合蛋白肽(疫苗製劑H)能夠保護實例5第1組中的12只動物中的7只，為這些動物提供完全的保護。因此，與單獨使用O1 Campos全滅活病毒顆粒疫苗的結果比較(實例5，第3組，疫苗製劑J，陰性對照，6只動物中0只受保護)，顯然BLS-I_A2001肽能夠重定向針對A2001毒株的免疫應答，並與基於全病毒O1 Campos毒株的疫苗產生協同效應，以保護動物免受病毒毒株A2001感染。因此，這些實驗的結果表明，這些肽疫苗與滅活的全口蹄疫病毒疫苗組合對免疫系統引起了非常驚人和不可預期的效果，並且能夠在接種疫苗的動物中針對異源毒株產生適當的交叉保護。
本實例說明瞭在同一疫苗製劑結合使用BLS-口蹄疫病毒(A2001)重組肽疫苗和滅活全口蹄疫病毒(O1 Campos)疫苗進行接種所實現的效果，與實例5分別使用BLS-口蹄疫病毒抗原和滅活全口蹄疫病毒的效果相近。
在一個實施例中，疫苗製劑包含以下化學物質和溶液：
-水相溶液：三羥甲基氨基甲烷(Tris)0.02M，NaCl 0.3M，pH=8。
-油相溶液：Montanide ISA 61 VG
配製和試驗了表10所示的三種疫苗製劑(K、L和M)。
使用與實例1中包含BLS肽的疫苗相同的步驟配製疫苗製劑K。該疫苗的唯一區別是該製劑同時含有BLS肽和全滅活的抗原。
使用與實例1中包含全滅活病毒抗原的疫苗相同的步驟配製疫苗製劑L和M。
使用了23頭6至10個月大及沒有施用口蹄疫疫苗的黑色阿伯丁安格斯小牛(公牛及母牛)。對所有動物進行了針對口蹄疫病毒的血清學檢測，由此證實不存在初乳抗體和/或疫苗相關抗體。整個臨床試驗中，動物留於同一場地。
把動物隨機分為4個實驗組：第1組(n=10)施用2mL疫苗製劑K(表7,BLS-I_A2001+全滅活病毒抗原毒株O1 Campos)；第2組(n=5)施用2mL疫苗製劑L(表7,BLS-I_A2001+全滅活病毒抗原毒株Argentina 2001)；第3組(n=5)施用2mL疫苗製劑M(全滅活病毒抗原毒株O1 Campos)；第4組(n=5)為對照組對應於未接種疫苗的動物。
實驗疫苗在研究的第0天施用。表11顯示了不同的接種方案。
在接種疫苗後31和63天(DPV)如表11所示進行抽血。
使用特異性A2001抗體的液相ELISA測定進行分析。在接種後的第31和63天，使用單價病毒疫苗免疫的組別中獲得的抗體滴度在預期值內，在同源A2001疫苗的情
況下獲得最大數值，而在使用毒株O1 Campos接種的動物中獲得最少針對A2001的交叉反應性抗體。另一方面，疫苗製劑K(BLS-I_A2001+O1 Campos)能夠產生明顯良好的抗A2001抗體水平，高達陽性對照的數量。這些實驗結果表明，重組BLS肽A2001抗原與全病毒O1 Campos抗原疫苗組合引起了非常驚人和不可預期的效果(圖10和11)。
總結而言，實例5和7已經證明不同的免疫方案結合使用重組口蹄疫抗原和全滅活的口蹄疫病毒能夠引發高抗體滴度，該免疫方案包括在同一疫苗中同時施用或者分別施。
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Claims (8)
- 一種能夠誘導針對一種或多種特定血清型或病毒株口蹄疫病毒的交叉保護的疫苗製劑，其中該疫苗製劑包含第一種血清型或病毒株的全滅活口蹄疫病毒；和作為載體或分子佐劑的肽、多肽或蛋白質，該肽、多肽或蛋白質與以下的成分融合：a)編碼該一種或多種特定血清型或病毒株口蹄疫病毒的肽、多肽或蛋白質的多核苷酸；b)該一種或多種特定血清型或病毒株口蹄疫病毒的人工肽或多肽；或c)該一種或多種特定血清型或病毒株口蹄疫病毒的重組肽、多肽或蛋白質。
- 如請求項1之疫苗製劑，該一種或多種特定血清型或病毒株口蹄疫病毒包含O、A、C、Asia 1、SAT-1、SAT-2和SAT-3。
- 如請求項1之疫苗製劑，其中該一種或多種特定血清型或病毒株口蹄疫病毒的重組或人工病毒肽、多肽或蛋白質編碼選自以下序列：a)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1、VP2、VP3和VP4的氨基酸序列；b)口蹄疫病毒非結構蛋白2A、2B、2C、2D、3A、3B、3C和3D的氨基酸序列；c)一個或多個SEQ ID NO.1-55的氨基酸序列；或 d)編碼一個或多個與氨基酸序列SEQ ID NO.1-55同源或功能類似物的肽的氨基酸序列。
- 如請求項3之疫苗製劑，其中該一種或多種特定血清型或病毒株口蹄疫病毒的重組或人工病毒肽、多肽或蛋白質是線性或樹狀聚合物。
- 如請求項1之疫苗製劑，其中該全滅活病毒包含A血清型的口蹄疫病毒。
- 如請求項1之疫苗製劑，其中該載體或分子佐劑與多肽融合，其中該多肽編碼選自以下各選擇中全部、部分或變異的序列：a)口蹄疫病毒衣殼蛋白VP1的氨基酸序列；b)口蹄疫病毒非結構蛋白3A的氨基酸序列；c)一個或多個SEQ ID NO.10的氨基酸序列；或d)編碼一個或多個與氨基酸序列SEQ ID NO.10同源或功能類似物的肽的氨基酸序列。
- 如請求項6之疫苗製劑，其中該載體或分子佐劑是線性或樹狀聚合物。
- 如請求項6之疫苗製劑，其中該載體或分子佐劑源自Brucella lumazine synthase(BLS)蛋白。
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