TWI763071B - 微乳液及其用途、醫藥組成物與製藥用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種微乳液，其包含：水相組成物，包含水溶液與保濕劑；油相組成物；以及界面活性劑組成物；其中，以該水相組成物、油相組成物和界面活性劑組成物之總重為基準，該水相組成物之含量為25至39重量百分比，該油相組成物之含量為8至22重量百分比，以及該界面活性劑組成物之含量為53至67重量百分比；本發明之微乳液可作為提升水溶性活性成分穿透皮膚角質層之載劑。本發明另提供一種微乳液之用途、包含該微乳液之醫藥組成物，與該醫藥組成物用於治療乾癬之製藥用途。

Description

微乳液及其用途、醫藥組成物與製藥用途

本發明提供一種載劑，特別是一種微乳液載劑。本發明另提供一種微乳液之用途、一種醫藥組成物，其包含所述微乳液載劑及丹酚酸B，以及將所述醫藥組成物用於製備藥品之用途。

乾癬(Psoriasis)，又稱銀屑病或牛皮癬，為常見的慢性皮膚炎，非屬病菌感染之傳染性皮膚病，並好發於頭皮、四肢、下背部、耳朵、手指關節、指甲、肚臍、股溝與陰部，並於嚴重時，可遍布全身。其組織學上之病理特徵包含：表皮過度增生、角質細胞分化異常和伴隨血管擴張的血管增生，導致病患皮膚異常肥厚、變粗糙、脫屑、出現紅色斑塊、丘疹和點狀出血。

乾癬病患常出現皮膚搔癢、乾裂和疼痛等不適症狀，雖無致命風險，但較麻煩者為，乾癬病患之皮膚外觀將影響正常社交生活，導致患者易有尷尬和失去自信等情緒低落問題，而情緒壓力又為誘發乾癬的因素之一，導致乾癬不僅不易復原，更容易一再復發。

現行治療乾癬之外用藥膏包含：類固醇、維他命A、維他命D衍生物、煤焦油和水楊酸。然而，類固醇僅適合短期控制病情；維他命A和水楊酸可能造成皮膚刺激；維他命D衍生物長期使用者，可能反而導致皮膚紅腫發癢；煤焦油則可能使皮膚變乾，並易有刺鼻味，和沾黏至其他接觸物，例如：家具等導致髒汙之問題，而有使用上不方便之處。

事實上，除了上述乾癬有無法根治，而需長期治療之需求外，其他皮膚疾病，例如：過敏性皮膚病亦可能經常性復發，而有必要開發新的活性成分傳遞系統，以供更多活性成分可被應用於問題皮膚的日常照護和急性症狀治療，使病患有更多元之選擇，以避免長期使用特定藥物而衍生進一步之副作用或帶來額外的生活困擾。

為達上述目的，本發明提供一種微乳液，其包含：水相組成物，包含水溶液與保濕劑；油相組成物；以及界面活性劑組成物；其中，以該水相組成物、油相組成物和界面活性劑組成物之總重為基準，該水相組成物之含量為25重量百分比至39重量百分比，該油相組成物之含量為8重量百分比至22重量百分比，以及該界面活性劑組成物之含量為53重量百分比至67重量百分比。

本發明所述之微乳液是呈現「微乳化」狀態的載劑，也就是一種將活性成分包埋至尺寸介於微米至奈米之間的微乳化液滴(emulsion droplet)的活性成分傳遞系統，且該活性成分傳遞系統的微乳化液滴包含水相組成物、油相組成物和界面活性劑組成物，透過上述特定比例之調配，其等可共同形成一熱力學穩定(thermodynamically stable)之等向性(isotropic)混合物，並通常為澄清的。

舉例而言，以該水相組成物、油相組成物和界面活性劑組成物之總重為基準，該水相組成物之含量為25重量百分比、26重量百分比、27重量百分比、28重量百分比、29重量百分比、30重量百分比、31重量百分比、32重量百分比、33重量百分比、34重量百分比、35重量百分比、36重量百分比、37重量百分比、38重量百分比或39重量百分比。

舉例而言，以該水相組成物、油相組成物和界面活性劑組成物之總重為基準，該油相組成物之含量為8重量百分比、9重量百分比、10重量百分比、11重量百分比、12重量百分比、13重量百分比、14重量百分比、15重量百分比、16重量百分比、17重量百分比、18重量百分比、19重量百分比、20重量百分比、21重量百分比或22重量百分比。

舉例而言，以該水相組成物、油相組成物和界面活性劑組成物之總重為基準，該界面活性劑組成物之含量為53重量百分比、54重量百分比、55重量百分比、56重量百分比、57重量百分比、58重量百分比、59重量百分比、60重量百分比、61重量百分比、62重量百分比、63重量百分比、64重量百分比、65重量百分比、66重量百分比或67重量百分比。

此外，微乳化與乳化並不相同，原因在於乳化產物係混濁的，且最終將出現相分離(phase separation)，而欠缺熱力學穩定性，且乳化的過程上亦較微乳化耗能。因此，微乳化與乳化在熱力學穩定性、產品外觀和製法等三方面皆不相同。

本發明之水相組成物添加保濕劑可滋潤皮膚或軟化皮膚角質層，並利於水溶性活性成分穿透皮膚角質層。

在一實施態樣中，本發明之微乳液係供外用，亦即施用或塗抹於皮膚或黏膜，例如：具毛髮之皮膚或皺褶處內之皮膚。

較佳的，上述微乳液之液滴尺寸為500奈米至900奈米，例如：500奈米、600奈米、700奈米、800奈米或900奈米；更佳的為690奈米至700奈米。

較佳的，上述微乳液尺寸分布之分散指數(polydispersity index)為0.43至0.44；更佳的為0.435。

較佳的，上述微乳液之介面電位為-14 mV至-16 mV；更佳的為-14.5 mV至-15.45mV。

較佳的，上述微乳液之黏稠度為3000 cP至3200 cP；更佳的為3100 cP至3120 cP。

較佳的，上述微乳液之電導度為20 μS/cm至30 μS/cm；更佳的為23.65μS/cm至24.65 μS/cm。

較佳的，該微乳液為一水包油及油包水之雙連續相微乳液(bicontinuous microemulsion)。本發明之微乳液同時具有水包油及油包水之雙相，故除有助於保存活性成分之活性外，更利於提升活性成分之皮膚穿透率。

較佳的，該水相組成物之含量為25重量百分比至35重量百分比，該油相組成物之含量為8重量百分比至12重量百分比，以及該界面活性劑組成物之含量為53重量百分比至67重量百分比。

較佳的，該水溶液為細胞等張溶液，且該保濕劑包含山梨醇(sorbitol)和甘油(glycerol)，並以該細胞等張溶液、山梨醇和甘油之總重為基準，該細胞等張溶液之含量為31重量百分比至39重量百分比，山梨醇之含量為45重量百分比至55重量百分比，以及甘油之含量為12重量百分比至18重量百分比。

舉例而言，以該細胞等張溶液、山梨醇和甘油之總重為基準，該細胞等張溶液之含量為31重量百分比、33重量百分比、35重量百分比、37重量百分比或39重量百分比；山梨醇之含量為45重量百分比、47重量百分比、49重量百分比、51重量百分比、53重量百分比或55重量百分比；以及甘油之含量為12重量百分比、13重量百分比、14重量百分比、15重量百分比、16重量百分比、17重量百分比或18重量百分比。

更佳的，該細胞等張溶液為PBS緩衝液。

在一實施態樣中，該PBS緩衝液包含0.01莫耳濃度之磷酸鹽緩衝液，0.0027莫耳濃度之氯化鉀和0.137莫耳濃度之氯化鈉，且25°C之pH值為7.4。

較佳的，該油相組成物包含矽油(silicone oil)、角鯊烯(squalene)和三酸甘油酯(triglyceride)，且矽油、角鯊烯和三酸甘油酯之重量比例為8至12比0.8至1.2比2.5至3.5。

舉例而言，矽油、角鯊烯和三酸甘油酯之重量比例為8、9、10、11或12比0.8、0.9、1.0、1.1或1.2比2.5、2.7、2.9、3.1、3.3或3.5。

更佳的，上述矽油於25℃之黏稠度為180 mPa.s至220 mPa.s，例如為180 mPa.s、190 mPa.s、200 mPa.s、210 mPa.s或220 mPa.s。

較佳的，該界面活性劑組成物包含聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyl hydrogenated castor oil)、吐溫(tween)、聚乙二醇(PEG)和1,2-丙二醇(1,2-PG)，且聚氧乙烯蓖麻油、吐溫、聚乙二醇和1,2-丙二醇之重量比例為8至12比0.8至1.2比0.8至1.2比0.8至1.2。

舉例而言，聚氧乙烯蓖麻油、吐溫、聚乙二醇和1,2-丙二醇之重量比例為8、9、10、11或12比0.8、0.9、1.0、1.1或1.2比0.8、0.9、1.0、1.1或1.2比0.8、0.9、1.0、1.1或1.2。

上述聚氧乙烯蓖麻油又稱氫化蓖麻油。

較佳的，上述聚氧乙烯蓖麻油為聚氧乙烯40蓖麻油(polyoxyl 40 hydrogenated castor oil，又稱Kolliphor ^®RH 40、Cremophor RH 40和macrogolglycerol hydroxystearate 40、polyethylene glycol (PEG)-40 castor oil、PEG-40氫化蓖麻油以及聚乙二醇40氫化蓖麻油)。

較佳的，上述吐溫為吐溫80 (tween 80)。

較佳的，上述聚乙二醇為聚乙二醇400 (PEG 400)。

根據本發明，上述微乳液可提升活性成分之皮膚穿透率及/或生體可用率(bioavailability)。

在一實施態樣中，上述微乳液進一步載有一活性成分，該活性成分為水溶性，且分子量為500道耳頓至1000道耳頓。

舉例言之，該活性成分之分子量為500道耳頓、550道耳頓、600道耳頓、650道耳頓、700道耳頓、750道耳頓、800道耳頓、850道耳頓、900道耳頓、950道耳頓或1000道耳頓。

較佳的，該活性成分為丹酚酸B(salvianolic acid B)，其為水溶性，且分子量為718.62。

更佳的，以該微乳液之總重為基準，該丹酚酸B之安全濃度為0.3重量百分比至5重量百分比。所述「安全濃度」係指在權衡活性成分於使用後所得利益與所生風險後，仍可合法用於人體之濃度。

本發明另提供一種提升活性成分之皮膚穿透率及/或生體可用率(bioavailability)之方法，其中該活性成分使用上述之微乳液作為載劑。

本發明再提供一種滋潤皮膚或軟化皮膚角質層之方法，其包括局部施用上述之微乳液。

本發明又提供一種微乳液醫藥組成物，其包含上述微乳液及一治療有效濃度的丹酚酸B(salvianolic acid B)。

較佳的，該治療有效濃度是以該微乳液醫藥組成物之總重為基準，丹酚酸B之濃度為0.3重量百分比至5重量百分比。

本發明另提供一種上述微乳液醫藥組成物用於製備抑制皮膚細胞表現細胞激素或增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen)之藥物的用途，其中該細胞激素選自由以下所組成之群：介白素-17A(IL-17A)、介白素-17F(IL-17F)、介白素-22(IL-22)和介白素-23(IL-23)。

本發明再提供一種上述微乳液醫藥組成物用於製備治療、改善或減緩皮膚發炎所引發之皮膚症狀之藥物的用途。

本發明又提供一種上述微乳液醫藥組成物用於製備治療、改善或減緩自體免疫所引發之皮膚症狀之藥物的用途。

本發明另提供一種上述微乳液醫藥組成物用於製備治療、改善或減緩乾癬之藥物的用途。

本發明再提供一種上述微乳液醫藥組成物用於製備提升或恢復皮膚屏障或皮膚含水量，或改善皮膚水分異常蒸散，或改善表皮細胞異常增生之藥物的用途，其中該皮膚為受損皮膚或發炎皮膚。

上述治療有效濃度係指能達到下述功效之濃度：(1)抑制皮膚細胞表現細胞激素或增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen)之功效，其中該細胞激素選自由以下所組成之群：介白素-17A(IL-17A)、介白素-17F(IL-17F)、介白素-22(IL-22)和介白素-23(IL-23)；(2)治療、改善或減緩皮膚發炎所引發之皮膚症狀；(3)治療、改善或減緩自體免疫所引發之皮膚症狀；(4)治療、改善或減緩乾癬；或是(5)提升或恢復皮膚屏障或皮膚含水量，或改善皮膚水分異常蒸散，或改善表皮細胞異常增生之功效，其中該皮膚為受損皮膚或發炎皮膚。

綜上，本發明之微乳液可作為載劑，不僅可穩定保存活性成分，並可用於提升活性成分之皮膚穿透率及/或生體可用率，以及同時滋潤皮膚或軟化皮膚角質層，使不易穿透皮膚角質層的水溶性活性成分亦可為皮膚所吸收；更重要者，本發明之微乳液對於已受損或發炎之皮膚，其刺激性及致敏性亦極低。因此，本發明可使皮膚受損或發炎之使用者具有更多元、安全之選擇。最後，本發明之微乳液進一步包含丹酚酸B者，具有以下功效：(1)抑制發炎性細胞激素之蛋白表現和表皮細胞異常增生；(2)治療、改善或減緩皮膚發炎所引發之皮膚症狀；(3)治療、改善或減緩自體免疫所引發之皮膚症狀；(4)治療、改善或減緩乾癬；以及(5)提升或恢復皮膚屏障或皮膚含水量，或改善皮膚水分異常蒸散，而可提供皮膚受損或發炎之病患新的外用藥選項，有助於避免長期使用特定藥品而進一步引發其他副作用。

以下提供數種操作方式，以便說明本發明之實施方式；熟習此技藝者可經由本說明書之內容輕易地了解本發明所能達成之優點與功效，並且於不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更，以施行或應用本發明之內容。

製備例1：三相圖繪製

為找尋可形成微乳液之區域範圍，本實驗使用水性滴定法於室溫構建「三相圖」(pseudo ternary phase diagram)。各成分分別為水相組成物、油相組成物和界面活性劑組成物；其中，該水相組成物包含PBS緩衝液、山梨醇和甘油，並以PBS緩衝液、山梨醇和甘油之總重為基準，PBS緩衝液之含量為35重量百分比，山梨醇之含量為50重量百分比，以及甘油之含量為15重量百分比；該油相組成物包含矽油AR200 (silicon oil AR200)、角鯊烯和三酸甘油酯，且矽油AR200、角鯊烯和三酸甘油酯之重量比例為10:1:3；該界面活性劑組成物包含聚氧乙烯40氫化蓖麻油(Cremophor RH 40)、吐溫80 (tween 80)、聚乙二醇400 (PEG 400)和1,2-丙二醇，且聚氧乙烯40氫化蓖麻油、吐溫80、聚乙二醇400和1,2-丙二醇之重量比例為10:1:1:1。上述各成分皆購自德國默克(Merck KGaA)。

先將上述油相組成物與界面活性劑組成物按重量比例為1∶9，2∶8，3∶7，4∶6，5∶5，6∶4，7∶3，8∶2，9∶1之組別分別配成混合液，並以水相組成物進行滴定，直至混合液變混濁，記錄所使用的水相組成物之含量，繪製油相、界面活性劑和水相來構建三相圖(如圖1所示)；其中，黑色點線右側區域為微乳化區域，與其他左側未形成微乳液的配方比例相比，微乳化區域內之配方比例可形成澄清溶液，且各成分不分層。

製備例2：微乳液

依圖1中A點至E點所示比例配置微乳液，其配方比例如表1所示。

表1：微乳液配方

組別	水相組成物(wt%)	油相組成物(wt%)	界面活性劑組成物(wt%)
A	30	10	60
B	20	20	60
C	10	30	60
D	10	40	50
E	10	50	40

上述重量百分比之基準是以水相組成物、油相組成物和界面活性劑組成物三者之總重作為100重量百分比。

實驗材料準備：

(一)實驗動物：

本實驗之實驗動物為6-8週齡的雄性BALB/c 小鼠，飼養於台南國家實驗動物中心(National Laboratory Animal Center)，並於濕度控制在40%、溫度控制在24±2°C及12小時之光暗循環週期之條件下飼養。本發明所有動物實驗均遵守公認之人道動物照護標準，以及依據國泰綜合醫院之機構動物照護和使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)所核准制定之標準流程進行。

(二)鼠皮之製備：

將正常小鼠麻醉後犧牲，切取其背側的全厚層皮膚後，先以脫毛膏(Nair, Church & Dwight Co., Inc., Ewing, NJ, USA)除毛，再以手術方式移除皮下組織，並用蒸餾水清洗後，立即供後述實驗使用。

實施例1：皮膚刺激性試驗

本實驗之控制組(Control)和實驗組各採用4隻小鼠，自第0天起，皆先連續6天塗抹咪喹莫特(Imiquimod，簡稱IMQ)以誘發乾癬症狀；再其後之連續5天中，控制組並未接受任何處理，實驗組則分別每天一次塗抹上述A組(Formulation A)至E組(Formulation E)之微乳液，並於第11天犧牲小鼠，接著將鼠皮浸泡於10%福馬林水溶液中進行固定，再進行包埋、切片與組織染色以找尋最不具皮膚刺激性之組別，實驗結果如圖2A至圖2F；其中，圖式中各組底部之黑線為比例尺，且為100微米。

從圖2A至圖2F可知，塗抹A組(Formulation A)微乳液所得之實驗結果與控制組(Control)最為相近，並以A組微乳液所致皮膚增厚程度為最低，顯示A組微乳液對於皮膚之刺激性最低。

由於界面活性劑對於皮膚具有刺激性，但從實驗結果可發現，雖然A組微乳液之界面活性劑組成物之含量高於D組微乳液和E組微乳液，但A組微乳液對於皮膚之刺激性卻反而較低，故A組微乳液具有低刺激性之不可預期功效。

實施例2：微乳液之安定性試驗

將上述A組微乳液進行離心測試以評估其物理穩定性，和壓力測試，以評估其熱穩定性；其中，離心測試是將A組微乳液以3500 rpm離心30分鐘；壓力測試為將A組微乳液先儲藏於4℃環境中48小時，再儲藏於45℃環境中48小時，並重複6循環；接著，先儲藏於25℃環境中48小時，再儲藏於-21℃環境中48小時，並重複3循環。經上述測試後，A組微乳液並未出現分層情況，故A組微乳液具有良好的安定性。

實驗例3：微乳液之特性分析

(一)液滴粒徑(直徑)和ζ 電位(介面電位)量測

使用奈米粒度分析儀 (SZ-100，Horiba Ltd., Kyoto, Japan)在室溫下以90°散射角測量A組微乳液之液滴尺寸，並進行三重複，結果如表2所示。

(二)電導度量測

使用電導度計 (Eutech COND 6+，Eutech Instruments Ple Ltd, Thermo Fisher Scientific, Singapore)在室溫下對A組微乳液進行測試，並進行三重複，結果如表2所示。

(三)黏稠度量測

使用Visco-895黏度計(Atago Co., Inc.，Tokyo，Japan)，轉針號碼為A3 RE-77106，於室溫下測定A組微乳液之黏稠度，結果如表2所示。

表2：A組微乳液之物化特性

特性 (單位)	A組微乳液
液滴尺寸 (nm)	696.2 ± 188.3
尺寸分布 (PI)	0.435 ± 0.004
ζ 電位 (mV) (介面電位)	-14.95 ± 0.64
黏稠度 (cP)	3112.3 ± 5.8
電導度 (μS/cm)	24.15 ± 0.07

表2中之PI為分散指數(polydispersity index)。

從表2可知，A組微乳液之液滴為奈米級，可提升微乳液之皮膚穿透度；ζ電位(介面電位)為懸浮安定性的重要指標，ζ電位的值越高表示微乳液之膠狀分散體的安定性越高。此外，當微乳液之電導度為10.3 μS/cm至52.5 μS/cm時，即被界定為具有水包油和油包水之雙連續相微乳液(bicontinuous microemulsion)，因A組微乳液的電導度約為24 μS/cm，表示A組微乳液為具有水包油和油包水之雙連續相微乳液。可知，A組微乳液具有水包油型微乳液而可提升活性成分之皮膚穿透率，並具有油包水型微乳液而可降低載劑對於皮膚之刺激性，故特別適合用於受損或發炎皮膚。

實驗例4：皮膚穿透實驗

將上述實驗材料準備(二)中新鮮製備之鼠皮以經皮吸收垂直擴散槽(矽新科技，台灣)進行體外穿透性實驗；其中，實驗組以A組微乳液作為丹酚酸B之載劑；對照組以75%乙醇作為丹酚酸B之載劑。

首先，將皮膚樣品置放於擴散槽 (diffusion cells) (面積為0.985 cm ²)，並在實驗前於37±0.5°C靜置30分鐘以達到溫度平衡，再將200 μL含有濃度為300 μg/mL的丹酚酸B之A組微乳液加入樣品槽 (donor cells)，並以pH值為7.4的PBS緩衝液作為接收緩衝液(receiver buffer)。將乙醇加入接收緩衝液中，以增加丹酚酸B的溶解度，避免接收緩衝液中的藥物因飽和而影響實驗；其中，該接收緩衝液中的乙醇和PBS緩衝液之重量比為2比8。接收槽中的液體經由鐵氟龍包被的攪拌子以600 rpm的轉速進行攪拌，並在37±0.5°C維持平衡6小時。使用0.22 μm的濾膜過濾接收槽樣品，並以高效能液相層析儀 (high-performance liquid chromatography，HPLC)進行分析。

對照組亦依上述流程進行實驗及分析，結果如表3所示。

表3：丹酚酸B採不同載劑之皮膚穿透結果

參數(單位)	實驗組(A組微乳液)	對照組(乙醇)
J s(ng/cm 2h)	574.44 ± 280.00*	52.66 ± 8.09
t lag(hr)	1.78 ± 0.32	0.82 ± 0.14*
Q (ng/cm 2)	2411.23 ± 877.94*	305.14 ± 65.05
K p( x10 -3cm/h)	1.91 ± 0.93*	0.18 ± 0.03

從表3可知，實驗組的皮膚通量(J _s)和穿透係數(K _p)皆為對照組之10倍以上。此外，實驗組的累積量(Q)為對照組之約8倍。雖然對照組採用乙醇可達成穩定狀態通量之時間較快，但相較之下，實驗組所採用之A組微乳液仍較適合作為丹酚酸B之外用藥劑的載劑。

實驗例5：活性成分之皮膚沉積量(skin deposition)測試

接續實驗例4，分為實驗組和對照組，並進行下述實驗：

(一)進行皮膚沉積測試以量化丹酚酸B於皮膚的沉積量：在經過6小時的實驗例4之皮膚穿透實驗後，以乙醇與純水的混合溶液(體積比1：1)清洗前述實驗組及對照組的皮膚表面五次後以水去除表面的多餘藥物後，將皮膚切成小塊並添加乙腈後進行均質，以使蛋白質變性。完成後，於所得之均質液中加入氯黴素(chloramphenicol)作為內部標準品，濃度為0.1 mg/mL，並於室溫下以13,200 rpm離心10分鐘。取20 μL上清液進行如下高效能液相層析分析；其中高效能液相層析分析時，丹酚酸B在濃度為0.1 μg/mL，其從鼠皮之萃取回收率為91.5 ± 11.6%。

(二)高效能液相層析分析：以HPLC (Primaide 1110泵、Primaide 1410紫外光(UV)檢出器、Primaide 1210自動進樣器，Hitachi，Tokyo，Japan)進行分析，並使用 Mightysil RP-18管柱、4.6 mm×250 mm且粒徑5 μm (Kanto, Chemical Co. Inc., Tokyo, Japan)。流動相為甲醇-超純水(體積比為60：40，以正磷酸調整pH值至3)，再以0.22 μm Millipore過濾膜過濾。HPLC流速設為0.6毫升(mL)/分鐘(min)，樣品進樣體積(即注射量)為20 μL，並在室溫下以波長288 nm對丹酚酸B及氯黴素(內部標準品)進行檢測。其中，丹酚酸B及氯黴素的滯留時間分別為6.0 ± 0.1分鐘及8.3 ± 0.1分鐘，丹酚酸B的偵測極限(limit of detection, LOD)和定量極限(limit of quantitation, LOQ)皆為0.1 μg/mL；以及丹酚酸B在0.1 μg/mL濃度時的準確度(accuracy)及精確度(precision)分別介於-2.6%至-13.2%及0.8%至5.1%，結果如圖3所示。

從圖3可知，實驗組的曲線下面積(AUC _0-6)為15.45 ± 1.84 μg/g tissue h；其為對照組曲線下面積5.95 ± 4.22 μg/g tissue h之約3倍；可知，實驗組所採用之A組微乳液較75%乙醇適合作為丹酚酸B之外用藥劑的載劑。

實驗例6：皮膚屏障功效(barrier function)測試

(一)誘發乾癬：各組實驗動物為4隻，並依2019年發表於Scientific reports之期刊文獻：Methodological refinement of Aldara-induced psoriasiform dermatitis model in mice所載標準作法，先將上述6-8週齡的雄性BALB/c 小鼠鼠背進行除毛，再連續6日每日塗抹62.5毫克之樂得美乳膏5% (ALDARA CREAM 5%，藥商為3M)，即咪喹莫特(IMQ)的每日劑量為3.125毫克。

(二)實驗處理：上述小鼠於實驗過程中，各別於獨立籠中飼養，以避免小鼠間之互動活動將影響皮膚屏障功效之量測；同時，提供每一小鼠玩具，例如：木條，以符合IACUC之規定，並隨機分為如表4所示組別。

表4：皮膚屏障功效測試之各組別

組別	實驗處理	結果
正常組	未進行任何額外之藥物處理。	如圖4A、6A
控制組	塗抹咪喹莫特(IMQ)。	如圖4B、6B
乙醇組	塗抹IMQ和每日100 μL之75%乙醇。	如圖4C、6C
微乳液組	塗抹IMQ和每日100 μL的A組微乳液。	如圖4D、6D
低丹酚酸B 微乳液組	塗抹IMQ和每日100 μL、含100 μg/mL丹酚酸B的A組微乳液。	如圖4E、6E
高丹酚酸B 微乳液組	塗抹IMQ和每日100 μL、含300 μg/mL丹酚酸B的A組微乳液。	如圖4F、6F
陽性對照組	塗抹IMQ和每日60 mg的拭皮爽 ®軟膏。	如圖4G、6G

上述拭皮爽 ^®軟膏(Esperson ^®Ointment)含有0.25%的去氫氧迪皮質醇(desoximetasone，簡稱DXM)，藥商為賽諾菲股份有限公司。

除正常組外，上述各組於每日塗抹IMQ後3小時至4小時後，再依組別於鼠背皮上進行各自之實驗處理，結果如圖4A至圖4G。

(三)結果評估：使用裝有Tewameter TM300、Corneometer CM825和Mexmeter MX18探針的MPA 2系統(Courage and Khazaka, Köln, Germany)分別在第0天、第3天和第6天量測表4中各組小鼠鼠背表面之經皮水分散失量(transepidermal water loss, TEWL)、表皮水分(skin hydration)和皮膚紅斑生成值(skin erythema values)，結果如圖5A至圖5G所示。

從圖5A至圖5C可知，控制組在第0天的屏障量測值為正常基礎值：經皮水分散失量為7.39 ± 1.20 g/m ²/h；表皮水分為58.25 ± 5.84任意單位(arbitrary units，AU)；皮膚紅斑生成值為16.80 ± 1.74 AU。

從圖5A和圖5C可知，相較於控制組在第0天的量測值，控制組經過連續6天塗抹咪喹莫特後，其經皮水分散失量和皮膚紅斑生成值在第6天時，皆明顯增高，分別為40.79 ± 8.05 g/m ²/h和31.23 ± 4.17 AU；且從圖5B可知，表皮水分亦明顯降低，在第6天時僅有3.69 ± 1.55 AU。

從圖5A和圖5B可知，相較於控制組和乙醇組，微乳液組在第3天時具有相對較低的經皮水分散失量：14.80 ± 3.47 g/m ²/h，並具有顯著較高的表皮水分：45.59 ± 6.85 AU；可知，微乳液組所用之A組微乳液確實比乙醇組所用之75%乙醇更適合作為丹酚酸B之外用藥劑的載劑，並具有滋潤皮膚之功效。

從圖5D可知，控制組在第6天的經皮水分散失量為40.79 ± 8.05 g/m ²/h，相較之下，高丹酚酸B微乳液組和陽性對照組在第6天時的經皮水分散失量分別為22.85 ± 6.69 g/m ²/h和20.49 ± 5.69 g/m ²/h，可知高丹酚酸B微乳液組所用之含高濃度丹酚酸B之A組微乳液，以及陽性對照組所用之去氫氧迪皮質醇(DXM)皆顯著回復了經皮水分散失量。

從圖5E可知，控制組在第3天的表皮水分為22.29 ± 4.82 AU；相較之下，高丹酚酸B微乳液組和陽性對照組在第3天時，具有顯著較高的表皮水分，兩組之量測值並分別為52.29 ± 6.91 AU和35.49 ± 5.56 AU。此外，控制組和陽性對照組在第6天的表皮水分分別為3.84 ± 1.60 AU和6.10 ± 4.03 AU，高丹酚酸B微乳液組在第6天時，則具有顯著較高的表皮水分：13.94 ± 7.04 AU。可知，高丹酚酸B微乳液組具有較佳的表皮水分提升功效。

從圖5F可知，控制組、高丹酚酸B微乳液組和陽性對照組在皮膚紅斑生成值之量測值上，彼此並無顯著差異。

綜上，相較於控制組，高丹酚酸B微乳液組和陽性對照組皆展現改善經皮水分散失量和表皮水分之顯著功效，可知，本發明之丹酚酸B微乳液具有與市售去氫氧迪皮質醇(DXM)相同或更佳之功效，而可用於改善因乾癬而受損或發炎之皮膚屏障功能損害，並提升或恢復皮膚屏障及皮膚含水量，以及改善皮膚水分異常蒸散。

實驗例7：組織染色

將實驗例6正常組之小鼠於除毛後48小時後犧牲，並取其全厚層皮膚作為發炎細胞激素分析的陰性對照組，並將樣品分為兩部分，一部份進行組織染色，另一部分則進行蛋白萃取，並將所得之蛋白樣品於-80℃中儲藏備用；其餘組別則於第6天完成上述皮膚屏障功效測試後犧牲，並取其全厚層皮膚分別進行組織染色和蛋白萃取。

組織染色是將皮膚樣品以10%福馬林水溶液中進行固定，經例行性處理及以石蠟進行包埋後，切取5微米厚之樣品切片，以蘇木素(hematoxylin)和伊紅(eosin)染色，並於光學顯微鏡(Olympus BX41, Tokyo, Japan)下觀察，其結果如圖6A至圖6G；其中，圖式中各組底部之黑線為比例尺，且為100微米。

從圖4A至圖4G可知，除正常組外，其餘組別的鼠背外觀形態均出現鱗屑、紅斑和皮膚乾燥問題；另從圖6A至圖6G所示組織病理學之染色照片可知，除正常組外，其餘組別的鼠皮切片皆出現棘皮、角化不全、乳頭真皮層(papillary dermis)出現曲折的微血管擴張以及發炎性細胞浸潤；然而，高丹酚酸B微乳液組和陽性對照組所具有之嚴重臨床症狀和病理特徵皆相對較少。可知，本發明之高丹酚酸B微乳液組同市售去氫氧迪皮質醇(DXM)，可用於改善具有與乾癬症狀相似之受損或發炎皮膚。最後，因低丹酚酸B微乳液組之嚴重臨床症狀和病理特徵之改善效果不如高丹酚酸B微乳液組，可知300 μg/mL為丹酚酸B之較佳濃度。換句話說，300 μg/mL之丹酚酸B濃度兼具更有效及安全之雙重優點。

實驗例8：發炎細胞激素蛋白評估

將實驗7所述蛋白樣品進行以下實驗，以分析介白素-17A(IL-17A)、介白素-17C(IL-17C)、介白素-17F(IL-17F)、介白素-22(IL-22)、介白素-23(IL-23)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)之蛋白表現。

介白素-17A、介白素-17F、介白素-22、介白素-23和腫瘤壞死因子α蛋白表現分析是使用LEGENDplex ^TM檢測套組(mouse inflammation panel, BioLegend, San Diego, CA, USA)；其中，蛋白樣品與標記微珠共同進行水浴，並依據操作手冊以流式細胞儀(Accuri C6, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)針對各別細胞激素進行測定，結果如圖7A、圖7C至圖7F所示。

介白素-17C蛋白表現分析則是採用小鼠介白素-17C檢測套組(ABcam, Cambridge, MA, USA)，依據操作手冊並於微量盤式分析儀(BioTek, Winooski, VT, USA)以450 nm波長進行測定，結果如圖7B所示。

從圖7A、圖7C至圖7F可知，控制組之介白素-17A、介白素-17F、介白素-22、介白素-23和腫瘤壞死因子α蛋白表現相較於正常組皆顯著提升，可知，皮膚經塗抹咪喹莫特後，發炎性細胞激素表現量明顯增加。

從圖7A、圖7C、圖7D和圖7E可知，相較於控制組，高丹酚酸B微乳液組和陽性對照組之蛋白濃度皆顯著降低，顯示本發明之高丹酚酸B微乳液組同市售去氫氧迪皮質醇，可用於抑制介白素-17A、介白素-17F、介白素-22和介白素-23之蛋白表現。

從圖7B和圖7F可知，本發明之高丹酚酸B微乳液組同市售去氫氧迪皮質醇，皆不會抑制介白素-17C和腫瘤壞死因子α之蛋白表現。

綜上可知，本發明之丹酚酸B微乳液之活性成分及載劑雖皆與市售去氫氧迪皮質醇不同，但亦可用於治療、改善或減緩乾癬症狀之皮膚疾病。

實驗例9：增殖細胞核抗原(PCNA)評估

表皮蛋白萃取自從全厚層鼠皮膚製備而得之表皮，並使用小鼠PCNA ELISA定量檢測套組(Cell Biolabs Inc., San Diego, CA, USA)檢測增殖細胞核抗原之濃度，結果如圖8所示。

從圖8可知，控制組之增殖細胞核抗原(PCNA)之蛋白表現相較於正常組顯著提升；其次，相較於控制組，高丹酚酸B微乳液組和陽性對照組之增殖細胞核抗原(PCNA)蛋白濃度皆顯著降低，顯示本發明之高丹酚酸B微乳液組同市售去氫氧迪皮質醇，皆可用於抑制增殖細胞核抗原之蛋白表現，亦即抑制角質細胞之異常增生。換句話說，本發明之丹酚酸B微乳液之活性成分及載劑雖皆與市售去氫氧迪皮質醇不同，但亦可用於治療、改善或減緩乾癬症狀之皮膚疾病。

綜上可知，本發明之高丹酚酸B微乳液組同市售去氫氧迪皮質醇(DXM)，可用於改善具有與乾癬症狀相似之受損皮膚，並作為病患之新治療選項，使病患有更多元之選擇，以避免長期使用特定藥物而衍生進一步之副作用或帶來額外的生活困擾。

無

圖1為形成微乳液比例區域的三相圖。

圖2A至圖2F為皮膚刺激性試驗之鼠皮組織切片染色照片。

圖3為丹酚酸B使用不同載劑之皮膚沉積量。

圖4A至4G為皮膚屏障功效測試中各組小鼠之鼠背照片。

圖5A至5F為皮膚屏障功效測試中之經皮水分散失量、表皮水分和皮膚紅斑生成值之比較分析圖。

圖6A至6G為皮膚屏障功效測試中各組小鼠之鼠皮組織切片染色照片。

圖7A至7F為皮膚屏障功效測試中之介白素-17A、介白素-17C、介白素-17F、介白素-22、介白素-23和腫瘤壞死因子α之蛋白表現之比較分析圖。

圖8為皮膚屏障功效測試中之增殖細胞核抗原之蛋白表現之比較分析圖。

無

Claims (16)

1. 一種微乳液，其包含：水相組成物，包含水溶液與保濕劑；油相組成物；以及界面活性劑組成物；其中，以該水相組成物、該油相組成物和該界面活性劑組成物之總重為基準，該水相組成物之含量為25重量百分比至39重量百分比，該油相組成物之含量為8重量百分比至22重量百分比，以及該界面活性劑組成物之含量為53重量百分比至67重量百分比；且該水溶液為細胞等張溶液，且該保濕劑包含山梨醇(sorbitol)和甘油(glycerol)，並以該細胞等張溶液、山梨醇和甘油之總重為基準，該細胞等張溶液之含量為31重量百分比至39重量百分比，山梨醇之含量為45重量百分比至55重量百分比，以及甘油之含量為12重量百分比至18重量百分比；該油相組成物包含矽油(silicone oil)、角鯊烯(squalene)和三酸甘油酯(triglyceride)，且矽油、角鯊烯和三酸甘油酯之重量比例為8至12比0.8至1.2比2.5至3.5；以及該界面活性劑組成物包含聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyl hydrogenated castor oil)、吐溫(tween)、聚乙二醇(PEG)和1,2-丙二醇(1,2-PG)，且聚氧乙烯蓖麻油、吐溫、聚乙二醇和1,2-丙二醇之重量比例為8至12比0.8至1.2比0.8至1.2比0.8至1.2。
2. 如請求項1所述之微乳液，其中該微乳液為一水包油及油包水之雙連續相微乳液(bicontinuous microemulsion)。
3. 如請求項1所述之微乳液，其中該水相組成物之含量為25重量百分比至35重量百分比，該油相組成物之含量為8重量百分比至12重量百分比，以及該界面活性劑組成物之含量為53重量百分比至67重量百分比。
4. 如請求項1所述之微乳液，其中該細胞等張溶液為PBS緩衝液；該矽油於25℃之黏稠度為180mPa.s至220mPa.s；該聚氧乙烯蓖麻油為聚氧乙烯40氫化蓖麻油(polyoxyl 40 hydrogenated castor oil)；該吐溫為吐溫80(tween 80)；或該聚乙二醇為聚乙二醇400(PEG 400)。
5. 如請求項1所述之微乳液，其進一步載有一活性成分，該活性成分為水溶性，且分子量為500道耳頓至1000道耳頓。
6. 如請求項5所述之微乳液，其中該活性成分為丹酚酸B(salvianolic acid B)。
7. 如請求項6所述之微乳液，其中以該微乳液之總重為基準，該丹酚酸B之安全濃度為0.3重量百分比至5重量百分比。
8. 一種微乳液醫藥組成物，其包含如請求項1至4中任一項所述之微乳液及一治療有效濃度的丹酚酸B(salvianolic acid B)。
9. 如請求項8所述之微乳液醫藥組成物，其中該治療有效濃度是以該微乳液醫藥組成物之總重為基準，該丹酚酸B之濃度為0.3重量百分比至5重量百分比。
10. 一種如請求項8或9所述之微乳液醫藥組成物用於製備抑制皮膚細胞表現細胞激素或增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen)之藥物的用途，其中該細胞激素選自由以下所組成之群：介白素-17A(IL-17A)、介白素-17F(IL-17F)、介白素-22(IL-22)和介白素-23(IL-23)。
11. 一種如請求項8或9所述之微乳液醫藥組成物用於製備治療、改善或減緩皮膚發炎所引發之皮膚症狀之藥物的用途。
12. 一種如請求項8或9所述之微乳液醫藥組成物用於製備治療、改善或減緩自體免疫所引發之皮膚症狀之藥物的用途。
13. 一種如請求項8或9所述之微乳液醫藥組成物用於製備治療、改善或減緩乾癬之藥物的用途。
14. 一種如請求項8或9所述之微乳液醫藥組成物用於製備提升或恢復皮膚屏障或皮膚含水量，或改善皮膚水分異常蒸散，或改善表皮細胞異常增生之藥物的用途，其中該皮膚為受損皮膚或發炎皮膚。
15. 一種提升活性成分之皮膚穿透率及/或生體可用率(bioavailability)之方法，其中該活性成分使用如請求項1至4中任一項所述之微乳液作為載劑。
16. 一種滋潤皮膚或軟化皮膚角質層之方法，其包括局部施用如請求項1至4中任一項所述之微乳液。

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