TWI757273B - 放射性醫藥複合物 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種用於形成組織靶向性釷錯合物之方法，該方法包含： a)   形成八牙螯合劑，其包含其中N位置經甲基取代之四個羥基吡啶酮(HOPO)部分體及以羧酸基封端之偶合部分體； b)   將該八牙螯合劑偶合至靶向HER2之至少一個組織靶向性部分體；及 c)   使該組織靶向螯合劑與包含至少一種α-發射性釷同位素之離子的水性溶液接觸。 亦提供一種包括投與此類組織靶向性釷錯合物以治療贅生性或增生性疾病之方法，以及該錯合物及對應醫藥調配物。

Description

放射性醫藥複合物

本發明係關於用於形成釷227與某些共軛至靶向HER2抗原之組織靶向性部分體的八齒配位體之錯合物的方法。本發明亦係關於錯合物且係關於疾病(詳言之，贅生性疾病)之治療，涉及投與此類錯合物。

特異性細胞殺滅可對於成功治療哺乳動物個體中之各種疾病非常關鍵。其典型實例為治療惡性疾病，諸如肉瘤及癌瘤。然而，選擇性消除某些細胞類型亦可在治療其他疾病(詳言之，增生性疾病及贅生性疾病)中起重要作用。 選擇性治療之最常見方法目前為手術、化學療法及外束輻射。然而，靶向之放射核種療法為有前景及發展中的領域，其有潛力將高細胞毒性的輻射特異性地遞送至與疾病相關聯之細胞類型。目前授權用於人類之放射性藥物的最常見形式採用β-發射性放射核種及/或γ-發射性放射核種。然而，對於在治療中使用α-發射性放射核種存在一些興趣，係因為其潛在地用於較特異性之細胞殺滅。 生理環境中之典型的α-發射性體之輻射範圍通常小於100微米，相當於僅幾個細胞之直徑。此使得此等來源非常適合用於治療腫瘤，包括微小轉移灶，係因為其範圍達到腫瘤內之相鄰細胞，但若其經適當靶向，則極少輻射能量將穿越靶細胞。因此，不需要靶向每一細胞，但可將對周圍健康組織之損傷降至最低(參見Feinendegen等人，Radiat Res 148:195-201 (1997))。相比之下，β粒子在水中之範圍為1 mm或更大(參見Wilbur，Antibody Immunocon Radiopharm 4: 85-96 (1991))。 與藉由β粒子、γ射線及X射線攜載之能量相比，α粒子輻射之能量較高，通常為5 MeV至8 MeV，或為β粒子之能量的5倍至10倍及γ射線之能量的20倍或更高倍。因此，與γ輻射及β輻射相比，在極短距離內之大量能量之此沈積給予a-輻射異常高的線形能量轉移(LET)、較高相對生物效能(RBE)及較低氧增強比(OER) (參見Hall，「Radiobiology for the radiologist」，第五版，Lippincott Williams & Wilkins，Philadelphia PA，USA，2000)。此解釋了α-發射性放射核種之異常細胞毒性，且亦使得對此類同位素之生物靶向及α-發射性放射核種分佈之控制及研究水準的要求更加嚴格，此舉對於避免不可接受之副作用係必要的。 迄今為止，關於放射免疫療法中之應用，注意力主要集中於²¹¹ At、²¹³ Bi及²²⁵ Ac，且已在臨床免疫療法試驗中探究此三個核種。 已提出之若干放射核種壽命短，亦即具有小於12小時之半衰期。此類短半衰期使得難以按商業方式製造且分配基於此等放射核種之放射性藥物。投與短壽命核種亦增加將在到達靶位點之前在體內發射之輻射劑量之比例。 來自α-發射性之反沖能在許多情況下將導致自母本之衰變位置釋放子核種。此反沖能足以使許多子核種自可保持母本之化學環境脫離，例如母本藉由諸如螯合劑之配位體錯合的化學環境。此甚至將在子體與相同配位體化學相容(亦即，可藉由相同配位體錯合)之情況下發生。同樣，在子核種為氣體，尤其係諸如氡之惰性氣體，或與配位體化學不相容的情況下，此釋放效應將甚至更大。當子核種之半衰期多於幾秒時，其可擴散至血液系統中，不受保持母本之配位劑的限制。此等游離放射性子體接著可引起非所需的全身性毒性。 幾年前已提出在維持對²²³ Ra子同位素之控制的條件下使用釷-227 (T_1/2 =18.7天) (參見WO 01/60417及WO 02/05859)。此情況出現在使用允許子核種由封閉的環境保持之載劑系統時。在一種情況下，放射性核種係安置於脂質體內，且脂質體之實質性大小(與反沖距離相比)有助於保持子核種在脂質體內。在第二情況下，使用放射性核種之趨骨性錯合物，其併入至骨基質中並因此限制子核種之釋放。其為潛在高度有利之方法，但投與脂質體在一些情況下為非所需的，且存在許多軟組織疾病，其中放射性核種不可由礦化基質包圍以便保持子同位素。 最近，已確定，與自在相當的核上進行的先前測試所預期的相比，在²²⁷ Th之衰變後釋放的²²³ Ra子核之毒性在哺乳動物身體中可耐受的程度大得多。在不存在保持上文所論述之釷-227之鐳子體之特定手段時，關於鐳毒性之公眾可用資訊較清楚地表明，不可能將釷-227用作治療劑，因為自釷-227衰變達成之治療效果所需劑量將導致高度毒性及可能致命劑量的來自鐳子體之衰變的輻射，亦即，不存在治療窗。 WO 04/091668描述出人意料的發現：治療性治療窗確實存在，其中治療有效量之靶向釷-227放射性核種可投與給個體(通常為哺乳動物)，而不會產生足以引起不可接受的骨髓毒性之量的鐳-223。其因此可用於治療及預防骨位點及軟組織位點處之所有類型的疾病。 鑒於以上發展，現有可能在體腔內放射性核種療法中採用α-發射性釷-227核，而不會導致源自所產生之²²³ Ra的致命骨髓毒性。儘管如此，治療窗保持相對地窄且在所有情況下期望除絕對需要之外不再向個體投與α-發射性放射性同位素。若α-發射性釷-227核可以高度可靠性錯合及靶向，則將因此極大地增強此新治療窗之有用開發。 因為放射性核種持續衰變，在向個體分離與投與之間處理材料所花費之時間非常重要。若α-發射性釷核可以快速及方便製備的形式錯合、靶向及/或投與，較佳地需要極少步驟、短培育週期及/或不會不可逆地影響靶向實體之性質的溫度，則其亦將具有相當大的價值。另外，可在投與之前不需要移除之溶劑中(實質上在水性溶液中)進行之製程具有避免溶劑蒸發或透析步驟之相當大的優點。 若可研發顯示經顯著增強之穩定性的經釷標記之藥品調配物，則其亦將被視為具有相當大的價值。此對於確保穩健的產品品質標準得到遵守係重要的，同時賦能邏輯路徑以遞送患者劑量。因此，在1天至4天之時段內具有最小放射分解之調配物係較佳的。 先前已展示含有羥基吡啶酮基團之八牙螯合劑適合用於配位α-發射體釷-277，以供隨後連接至靶向部分體(WO2011098611)。描述八牙螯合劑，其含有藉由連接基團與胺基架構連接之四個3,2-羥基吡啶酮基團，具有用於共軛至靶向分子之分離反應性基團。先前發明之較佳結構含有3,2-羥基吡啶酮基團且將異硫氰酸酯部分體用作與如化合物ALG-DD-NCS中所展示之抗體組份之較佳偶合化學試劑。異硫氰酸酯係廣泛用於經由胺基將標記連接至蛋白質。異硫氰酸酯基團與蛋白質中之胺基端及一級胺反應且已用於標記包括抗體之許多蛋白質。儘管形成於此等共軛物中之硫脲鍵係相當穩定的，但已報告，由螢光異硫氰酸酯製備之抗體共軛物隨時間推移劣化。[Banks PR，Paquette DM.，Bioconjug Chem (1995) 6:447-458]。藉由使異硫氰酸螢光素與胺反應而形成之硫脲在鹼性條件下亦易轉化成胍[Dubey I，Pratviel G，Meunier BJournal: Bioconjug Chem (1998) 9:627-632]。由於偶合至單株抗體之較長生物半衰期之釷-227有較長衰變半衰期(18.7天)，期望使用更穩定的鍵聯部分體以便產生在活體內及儲存中更化學穩定之共軛物。 關於羥基吡啶酮配位體之共軛之最相關的先前著作公佈於WO2013/167754中且揭示具有包含羥基烷基官能性之水溶解部分體的配位體。由於此螯合類羥基具有反應性，隨著發生經由酯化反應產生複雜的產物混合物的多個競爭性反應，活化為活化酯係不可能的。因此，WO2013/167754之配位體必須經由替代性化學法(諸如，給予如上文所描述之較不穩定的硫脲共軛物的異硫氰酸酯)偶合至組織靶向蛋白質。此外，WO2013167755及WO2013167756揭示分別應用於CD33靶向抗體及CD22靶向抗體之羥基烷基/異硫氰酸酯共軛物。 HER家族之受體酪胺酸激酶為細胞生長、分化及存活之重要介體。受體家族包括四個不同成員，包括表皮生長因子受體(EGFR、ErbB1或HER1)、HER2 (ErbB2或p185^neu )、HER3 (ErbB3)及HER4 (ErbB4或tyro2)。 已在包括胃、子宮內膜、唾液腺、肺、腎臟、結腸、甲狀腺、胰臟及膀胱之癌瘤的癌瘤中觀測到HER2之過度表現(由於基因擴增頻繁但不均一)。 HER2係單株抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)之靶標。 用於治療患有轉移性乳癌的患者(其腫瘤過度表現HER2蛋白質)之曲妥珠單抗於1998年9月25日獲得來自食品與藥物管理局之上市許可證之。製造曲妥珠單抗之方法揭示於WO92/22653中。 本發明人現已確定，藉由將特異性螯合劑與作為靶向部分體之HER2之單株抗體偶合而形成組織靶向錯合物，接著添加α-發射性釷離子，可在溫和條件下且藉助於保持更穩定以儲存及投與錯合物之鍵聯部分體快速地產生錯合物。

在第一態樣中，本發明因此提供一種用於形成組織靶向性釷錯合物之方法，該方法包含： a)   形成式(I)或式(II)之八牙螯合劑：

其中Rc為以羧酸部分體封端之連接基部分體，諸如 [-CH₂ -Ph-N(H)-C(=O)-CH₂ -CH₂ -C(=O)OH]， [-CH₂ -CH₂ -N(H)-C(=O)-(CH₂ -CH₂ -O)_1-3 -CH₂ -CH₂ -C(=O)OH]或 [-(CH₂ )_1-3 -Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂ )_1-5 -C(=O)OH]，其中Ph為伸苯基，較佳為對伸苯基； b)   將該八牙螯合劑偶合至組織靶向性部分體，該組織靶向性部分體包含與序列1具有序列一致性之肽鏈：輕鏈

及與以下序列2至6中之任一者具有序列相似性或一致性的肽鏈：重鏈

由此產生組織靶向螯合劑；及 c)   使該組織靶向螯合劑與包含α-發射性釷同位素²²⁷ Th之4⁺ 離子的水性溶液接觸。 在此類錯合物中(且較佳地在本發明之所有態樣中)，釷離子通常將由含有八牙羥基吡啶酮之配位體錯合，其又將經由醯胺鍵連接至組織靶向性部分體。 通常，該方法將為一種用於合成包含反應性羧酸酯官能基之3,2-羥基吡啶酮基八牙螯合物之方法，該反應性羧酸酯官能基可經由原位活化或藉由合成及隔離活性酯本身而以活性酯(諸如N -羥基丁二醯亞胺酯(NHS酯))之形式活化。 所得NHS酯可用於簡單共軛步驟以產生廣泛範圍之經螯合物改質之蛋白質型式。此外，高度穩定的抗體共軛物易於經釷-227標記。此可處於環境溫度或接近環境溫度，通常呈高放射性化學產率及純度。 本發明之方法將較佳地在水性溶液中實行，且在一個實施例中，可在不存在或實質上不存在任何有機溶劑(小於1體積%)時實行。 本發明之組織靶向錯合物可調配成適和用於投與給人類或非人類動物個體之藥劑。 在第二態樣中，本發明因此提供用於產生醫藥調配物之方法，該等方法包含形成如本文所描述之組織靶向錯合物，接著添加至少一種醫藥載劑及/或賦形劑。合適的載劑及賦形劑包括此項技術中已知及本文中之任何態樣中所描述之緩衝液、螯合劑、穩定劑及其他合適組份。 在另一態樣中，本發明另外提供組織靶向性釷錯合物。此類錯合物將具有遍及本文所描述之特徵，詳言之，本文所描述之較佳特徵。錯合物可藉由本文所描述之方法中之任一者形成或可形成。此等方法可因此產生如本文中之任何態樣或實施例中所描述之至少一種組織靶向性釷錯合物。 在另一態樣中，本發明提供包含本文所描述之錯合物中之任一者的醫藥調配物。調配物可藉由本文所描述之方法中之任一者形成或可形成，且可含有至少一種緩衝液、穩定劑及/或賦形劑。選擇緩衝液及穩定劑可使得其一起有助於保護組織靶向錯合物免於放射分解。在一個實施例中，甚至在製造調配物之若干天後，調配物中之錯合物之放射分解係最小的。此為重要的優點，係因為其解決與作為此技術之實現及實際應用之關鍵的產品品質及藥物供應之物流相關聯之潛在問題。

在本發明之上下文中，本文所用之「組織靶向」指示所討論之物質(尤其係當呈如本文所描述之組織靶向錯合物之形式時)用以將其本身較佳地定位(且尤其係用以定位任何經共軛釷錯合物)於至少一個需要其存在之組織位點(例如，用以遞送放射性衰變)。因此，與不具有靶向部分體之等效錯合物之濃度相比，組織靶向基團或部分體用以在投與給個體後，提供更大程度的定位於該個體之身體中之至少一個所要位點。 在本發明之情況下，靶向部分體具有針對HER2之特異性。 如本文所描述之本發明之各種態樣係關於疾病之治療，尤其係針對患病組織之選擇性靶向，以及與適用於此等方法之錯合物、共軛物、藥劑、調配物、套組等相關。在所有態樣中，患病組織可存在於身體中之單個位點(例如，在侷限性實體腫瘤之情況下)或可存在於複數個位點(例如其中在關節炎中幾個關節受影響或在分散式或轉移性癌症疾病之情況下)。 待靶向之患病組織可在軟組織位點處、在鈣化組織位點或複數個位點處，該複數個位點可全部在軟組織中、全部在鈣化組織中或可包括至少一個軟組織位點及/或至少一個鈣化組織位點。在一個實施例中，至少一個軟組織位點經靶向。靶向之位點及疾病起源之位點可為相同的，但或者可為不同的(諸如，在轉移性位點經特異性靶向之情況下)。在涉及多於一個位點之情況下，此可包括起源位點或可為複數個繼發性位點。 本文所用之術語「軟組織」指示不具有「硬」礦化基質之組織。詳言之，如本文所使用之軟組織可為不係骨骼組織之任何組織。對應地，如本文所使用之「軟組織疾病」指示在如本文所使用之「軟組織」中所發生之疾病。本發明尤其適合用於治療癌症，且「軟組織疾病」因此涵蓋出現在任何「軟」(亦即，非礦化)組織中之癌瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤及混合型癌症，以及此類組織之其他非癌疾病。癌的「軟組織疾病」包括出現在軟組織中之實體腫瘤以及轉移性及微轉移性腫瘤。實際上，軟組織疾病可包含軟組織之原發性實體腫瘤及相同患者中之軟組織之至少一個轉移性腫瘤。替代地，「軟組織疾病」可僅由原發性腫瘤組成或僅由其中原發性腫瘤係骨骼疾病之轉移組成。 適合用於使用本發明之人類表皮成長因子受體-2 (HER2)靶向劑治療的贅瘤之實例包括乳癌、胃癌、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及子宮癌。 抗體共軛物在儲存時穩定持續可接受時段對本發明成功有關鍵作用。因此，非放射性抗體共軛物及最終經釷標記之藥品兩者之穩定性必須符合製造及分配放射性藥物產品所需之嚴格準則。出人意料地發現，包含組織靶向錯合物的本文所描述之調配物在儲存時顯示出色的穩定性。此即使在高溫下適用，通常用於經加速之穩定性研究。 在適用於本發明之所有可相容態樣之一個實施例中，組織靶向錯合物可溶解於合適的緩衝液中。詳言之，已發現使用檸檬酸鹽緩衝液提供出人意料穩定的調配物。其較佳地為在1 mM至100 mM之範圍內(pH 為4至pH 7)，尤其在10 mM至50 mM之範圍內，但最佳地為20 mM至40 mM之檸檬酸鹽緩衝液。 在適用於本發明之所有可相容態樣之另一實施例中，組織靶向錯合物可溶解於含有對胺基丁酸(PABA)之合適的緩衝液中。較佳組合係檸檬酸鹽緩衝液(較佳地在本文所描述之濃度下)與PABA組合。包括與其他試劑組合之供本發明之任何態樣使用的PABA之較佳濃度係大約0.005 mg/ml至5 mg/ml、較佳地0.01 mg/ml至1 mg/ml且更佳地0.01 mg/ml至1 mg/ml。0.1 mg/ml至0.5 mg/ml之濃度係最佳的。 在適用於本發明之所有可相容態樣之另一實施例中，組織靶向錯合物可溶解於含有乙二胺四乙酸(EDTA)之合適的緩衝液中。較佳組合係使用EDTA與檸檬酸鹽緩衝液。尤佳組合係在PABA之存在下使用EDTA與檸檬酸鹽緩衝液。此組合中之較佳的係，檸檬酸鹽、PABA及EDTA將視情況以本文中所指示之濃度範圍及較佳濃度範圍存在。包括與其他試劑組合之供本發明之任何態樣使用的EDTA之較佳濃度係大約0.02 mM至200 mM、較佳0.2 mM至20 mM且最佳0.05 mM至8 mM。 在適用於本發明之所有可相容態樣之另一實施例中，組織靶向錯合物可溶解於含有至少一種聚山梨醇酯(PEG接枝脫水山梨糖醇脂肪酸酯)之合適的緩衝液中。較佳的聚山梨醇酯包括聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單油酸酯)、聚山梨醇酯60 (聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單硬脂酸酯)、聚山梨醇酯40 (聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯)、聚山梨醇酯80 (聚氧乙烯(20)脫水山梨糖醇單月桂酸)及其混合物。聚山梨醇酯80 (P80)係最佳的聚山梨醇酯。包括與其他試劑組合之供本發明之任何態樣使用的聚山梨醇酯(如本文中所指示之尤其較佳的聚山梨醇酯)之較佳濃度係大約0.001% w/v至10% w/v、較佳0.01% w/v至1% w/v且最佳0.02% w/v至0.5% w/v。 儘管PABA先前已經描述為放射性穩定劑(參見US4880615A)，在儲存時觀測到本發明中之PABA對非放射性共軛物的正面效應。在不存在放射分解時之此穩定化效應構成尤其出人意料的優點，係因為合成組織靶向螯合劑通常將在與釷離子接觸之前有效地進行。因此，組織靶向螯合劑可在與釷離子接觸前1小時至3年產生且將較佳地在該時期之至少一部分期間儲存而與PABA接觸。亦即，本發明之步驟a)及b)可在步驟c)前1小時至3年及在步驟b)與步驟c)之間進行，可儲存組織靶向螯合劑而與PABA接觸，尤其儲存於緩衝液(檸檬酸鹽緩衝液)中，及視情況與EDTA及/或聚山梨醇酯接觸。所有材料較佳地為本文中所指示之類型及濃度。因此，PABA為本發明之調配物之高度較佳組份且可產生針對組織靶向螯合劑及/或針對組織靶向性釷錯合物的長期穩定性。 使用如本文所描述之檸檬酸鹽緩衝液提供相對於本發明之調配物中之組織靶向性釷錯合物之穩定性的另一出人意料的優點。由本發明人進行關於緩衝溶液對過氧化氫之作用的輻射研究，具有出人意料之結果。已知水放射分解會形成過氧化氫，且促成溶液中之蛋白質共軛物之化學改質。因此，過氧化氫之產生對產物之純度及穩定性具有不期望之影響。圖2展示出人意料的觀測：與所有其他測試之緩衝液相比，在檸檬酸鹽緩衝液中，經過Co-60 (10 kGy)照射之本發明抗體HOPO共軛溶液量測到較低含量之過氧化氫。因此，本發明之調配物將較佳地包含如本文所描述之檸檬酸鹽緩衝液。 本發明人另外已確定與本發明之調配物中某些組份之組合效果相關的另一出人意料的發現。此點又與放射性標記共軛物之穩定性相關。已發現檸檬酸鹽係最有效的緩衝液，出人意料地發現，藉由添加PABA而又進一步改良此效果。 本發明之方法、錯合物及調配物之關鍵組份係八牙螯合劑部分體。關於釷離子與羥基吡啶酮配位體之錯合的最相關的先前著作已公佈在WO2011/098611，且揭示相當容易產生與含有八牙HOPO之配位體錯合之釷離子。 先前已知之釷之螯合劑亦包括聚胺基聚酸螯合劑，其包含具有在主鏈氮處連接酸性(例如羧基烷基)基團的直鏈、環狀或分支鏈聚氮雜烷烴主鏈。此類螯合劑之實例包括DOTA衍生物，諸如對異硫氰氧基苄基-1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(p-SCN-Bz-DOTA)，及DTPA衍生物，諸如對異硫氰氧基苄基-二伸乙三胺五乙酸(p-SCN-Bz-DTPA)，第一者為環狀螯合劑，後者為直鏈螯合劑。 先前已例示1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸之衍生物，但標準方法無法輕易用於使釷與DOTA衍生物螯合。DOTA衍生物與金屬加熱可以有效地提供螯合劑，但通常產率較低。至少一部分配位體在製程期間有不可逆地變性的趨勢。此外，由於其對不可逆變性之相對較高的易感性，通常有必要避免連接靶向部分體，直至所有加熱步驟完成。此增加了額外化學步驟(伴隨所有必要的處理及分離)，其必須在α-發射性釷同位素之衰變壽命內進行。顯然，最好不要以此方式處理α-發射性材料或產生超過所需程度之相應廢物。此外，製備共軛物花費的所有時間會浪費一定比例之釷，該一定比例之釷將在此製備時期內衰變。 所有態樣中之本發明之關鍵態樣係使用式(I)或式(II)之八牙螯合劑：

其中Rc為以羧酸部分體封端之連接基部分體，諸如 [-CH₂ -Ph-N(H)-C(=O)-CH₂ -CH₂ -C(=O)OH]， [-CH₂ -CH₂ -N(H)-C(=O)-(CH₂ -CH₂ -O)_1-3 -CH₂ -CH₂ -C(=O)OH]或 [-(CH₂ )_1-3 -Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂ )_1-5 -C(=O)OH]，其中Ph為伸苯基，較佳為對伸苯基。 在諸如WO2013/167756、WO2013/167755及WO2013/167754之某些先前發明中，連接至3,2-HOPO部分體之N原子之甲基主要為諸如羥基或羥基烷基之溶解基團(例如，-CH₂ OH、-CH2-CH₂ OH、-CH₂ -CH₂ -CH₂ OH等)。此具有關於更高溶解度之某些優點，但此類螯合劑難以使用醯胺鍵與靶向部分體連接。 螯合劑部分體可藉由此項技術中已知之方法形成，包括US 5,624,901 (例如實例1及實例2)及WO2008/063721 (兩者均以引用之方式併入本文中)中所描述的方法。 R_C 表示偶合部分體。合適部分體包括以羧酸基團封端之烴基，諸如烷基或鏈烯基。本發明人已確定，諸如藉由本發明之方法使用羧酸鍵聯部分體形成醯胺在螯合劑與組織靶向性部分體之間提供更穩定的共軛。 在本發明之最佳實施例中，將八牙配位體連接至靶向部分體之偶合部分體(R_C )經選擇為 [-CH₂ -Ph-N(H)-C(=O)-CH₂ -CH₂ -C(=O)OH]， [-CH₂ -CH₂ -N(H)-C(=O)-(CH₂ -CH₂ -O)_1-3 -CH₂ -CH₂ -C(=O)OH]或 [-(CH₂ )_1-3 -Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂ )_1-5 -C(=O)OH]， 其中Ph為伸苯基，較佳為對伸苯基。 在較佳實施例中，R_C 為[-(CH₂ )_1-3 -Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂ )_1-5 -C(=O)OH]。在更佳實施例中，R_C 為[-(CH₂ )-對伸苯基-N(H)-C(=O)-(CH₂ )₂ -C(=O)OH]。 高度較佳之八牙螯合劑包括以下式(III)及式(IV)之彼等者：

化合物(III)之合成係描述於以下本文中且遵循以下本文所描述之合成途徑。 本發明之方法之步驟a)可藉由任何合適的合成途徑進行。下文在以下實例中給出合成方法之一些特定實例。此類方法提供特定實例，但本文中所說明之合成方法亦將可由熟習此項技術者用於一般情形中。因此，實例中所說明之方法亦意欲作為在上下文允許之情況下適用於本發明之所有態樣及實施例的一般揭示內容。 較佳地，本發明之所有態樣中之α-發射性釷及八牙配位體之錯合物在不加熱至60℃以上之情況下(例如，在不加熱至50℃以上之情況下)，較佳在不加熱至38℃以上之情況下且最佳在不加熱至25℃以上之情況下(諸如在20℃至38℃之範圍內)形成，或可在該等情況下形成。典型範圍可為(例如)15℃至50℃或20℃至40℃。可進行錯合反應(本發明之方法中之部分體c)))持續任何合理時段，但此將較佳地在1分鐘與120分鐘之間，較佳在1分鐘與60分鐘之間，且更佳在5分鐘與30分鐘之間。 另外較佳的係，在添加α-發射性釷同位素²²⁷ Th⁴⁺ 離子之前製備靶向部分體與八牙配位體之共軛物。本發明之產物因此較佳地藉由利用八牙配位體與組織靶向性部分體(組織靶向螯合劑)之共軛物來錯合α-發射性釷同位素(²²⁷ Th⁴⁺ 離子)而形成或可形成。 各種類型的靶向錯合物可經由八牙螯合劑(包含如本文所描述之偶合部分體)連接至釷(例如，釷-227)。 大體而言，如本文所使用，組織靶向性部分體將為「肽」或「蛋白質」，其結構主要由胺基酸組份之間的醯胺主鏈形成，具有或不具有繼發性及第三結構性特徵。 根據本發明，²²⁷ Th可藉由靶向複合劑錯合，該等靶向複合劑藉由醯胺鍵合而與如本文所描述之組織靶向性部分體連接或可與其連接。 通常，靶向部分體之分子量將為100 g/mol至數百萬g/mol (尤其為100 g/mol至1百萬g/mol)，且將較佳地具有直接對於疾病相關受體之親和力，及/或將包含合適的預投與結合劑(例如，生物素或抗生素蛋白)，其結合於已靶向至提前投與²²⁷ Th之疾病的分子。 本發明之特異性結合劑(組織靶向性部分體)經選擇以靶向HER2抗原。 本發明之組織靶向性部分體包含與序列1具有序列一致性的肽鏈：輕鏈

及與以下序列2至6中之任一者具有序列相似性或一致性的肽鏈：重鏈

在較佳實施例中，組織靶向性部分體包含與序列1具有序列一致性的肽鏈：輕鏈

及與序列2具有序列相似性或一致性的肽鏈：重鏈

. 實質序列一致性/相似性可被視為具有與完整序列至少80%及/或與特異性結合區(以上序列中以粗體展示之彼等區及視情況選用之帶下劃線的彼等區段)至少90%之序列相似性/一致性。較佳序列相似性或更佳一致性對於粗體區且較佳地亦對於全部序列可為至少92%、95%、97%、98%或99%。可使用來自威斯康星州大學之Genetics Computer Group第10版軟體套裝之「BestFit」程式來測定序列相似性及/或一致性。該程式使用具有以下預設值之局部Smith及Waterman演算法：空隙創建罰分=8、空隙延伸罰分=2、匹配平均值=2.912、失配平均值=2.003。 在較佳實施例中，組織靶向性部分體包含與序列1具有序列一致性的肽鏈及與序列2至6中之任一者具有98%或更高之序列相似性或一致性的肽鏈。 在更佳實施例中，組織靶向性部分體包含與序列1具有序列一致性的肽鏈及與序列2至6中之任一者具有99%或更高序列相似性或一致性的肽鏈。 在另一較佳實施例中，組織靶向性部分體包含與序列1具有序列一致性的肽鏈及與序列2具有98%或更高之序列相似性或一致性的肽鏈。 在更佳實施例中，組織靶向性部分體包含與序列1具有序列一致性的肽鏈及與序列2具有99%或更高之序列相似性或一致性的肽鏈。 本發明之組織靶向性部分體表示曲妥珠單抗之變體： SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2：不具有C端離胺酸之曲妥珠單抗 SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.3：不具有C端離胺酸及重鏈突變E359D、M361L之曲妥珠單抗 SEQ ID NO.1及 SEQ ID NO.4：不具有C端離胺酸及重鏈突變N300A、E359D、M361L之曲妥珠單抗 SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.5：不具有C端離胺酸及重鏈突變N300Q、E359D、M361L之曲妥珠單抗  SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.6：不具有C端離胺酸及重鏈突變Q298N、N300Q、E359D、M361L之曲妥珠單抗 可藉由重組表現在宿主細胞中編碼輕鏈及重鏈或其部分之核酸序列來製備本發明之HER2抗體。為以重組方式表現抗體、抗原結合部分或其變體，可用攜載編碼輕鏈及/或重鏈或其部分之DNA片段的一或多個重組表現載體轉染宿主細胞,以使得輕鏈及重鏈表現在宿主細胞中。標準重組DNA方法用於製備及/或獲得編碼重鏈及輕鏈之核酸，將此等核酸併入至重組表現載體中且將載體引進至宿主細胞中，諸如Sambrook、Fritsch及Maniatis (編)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，Ausubel、F .M.等人(編)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)中及Boss等人之美國專利第4,816,397號中所描述之彼等者。 此外，可將編碼重鏈及/或輕鏈之可變區的核酸序列可轉化(例如)為編碼全長抗體鏈、Fab片段之核酸序列或轉化為scFv。可操作性地將VL-編碼或VL-編碼DNA片段連接(以使得由兩個DNA片段編碼之胺基酸序列同框)至編碼(例如)抗體恆定區或柔性連接子之另一DNA片段。人類重鏈及輕鏈恆定區之序列為此項技術中已知的(參見(例如) Kabat、E. A.等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版物第91-3242號)且涵蓋此等區之DNA片段可藉由標準PCR擴增獲得。 為產生編碼scFv之多核苷酸序列，可將VH-編碼及VL-編碼核酸操作性地連接至編碼柔性連接子之另一片段，以使得VH及VL序列可表現為鄰近的單鏈蛋白質，其中VL區及VH區藉由柔性連接子連接(參見(例如) Bird等人(1988) Science 242:423-426；Huston等人(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；McCafferty等人，Nature (1990) 348:552-554)。 為表現抗體、其抗原結合片段或其變體，可使用標準重組DNA表現方法(參見(例如) Goeddel；Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif. (1990))。舉例而言，可將編碼所要多肽之DNA插入至接著轉染至合適的宿主細胞中之表現載體中。合適的宿主細胞為原核細胞及真核細胞。原核宿主細胞之實例為(例如)細菌，真核宿主細胞之實例為酵母、昆蟲及昆蟲細胞、植物及植物細胞、轉殖基因動物或哺乳動物細胞。在一些實施例中，將編碼重鏈及輕鏈之DNA插入至單獨載體中。在其他實施例中，將編碼重鏈及輕鏈之DNA插入至相同載體中。應瞭解，表現載體之設計，包括調節序列之選擇，受諸如宿主細胞之選擇、所要蛋白質之表現水平及表現是否為組成性或誘導性的因素影響。 用於細菌用途之適用表現載體藉由將編碼所要蛋白質之DNA序列與功能性啟動子插入而建構，該DNA序列與合適的轉譯起始及終止信號一起處於可操作讀取階段。該載體將包含一或多種表現型可選標記物及一複製起點以確保載體之維護，且視需要，提供宿主內之擴增。用於轉形之合適的原核宿主包括(但不限於)大腸桿菌(E. coli )、枯草桿菌(Bacillus subtilis )、鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium )及假單胞菌屬、鏈黴菌屬及葡萄球菌屬內之各種物種。 細菌載體可(例如)以噬菌體、質體或噬菌粒為主。此等載體可含有衍生自通常含有熟知選殖載體pBR322 (ATCC 37017)之元素的市售質粒之可選標記及細菌複製起點。在對合適的宿主菌株進行轉形且宿主菌株生長至適當細胞密度之後，所選啟動子藉由適當手段(例如，溫度變化或化學誘導)去抑制/誘導且將細胞另外培養一時段。細胞通常藉由離心採集、由物理或化學手段破壞且保留所得粗製提取物以供進一步純化。 在細菌系統中，可有利地選擇多個表現載體，其視預期用於所表現之蛋白質的用途而定。舉例而言，在將產生大量此類蛋白質時，為產生抗體或為篩選肽庫，例如，導引高含量之易於純化的融合蛋白產物之表現的載體可為理想的。 本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體包括經自然純化之產物、化學合成程序之產物及藉由重組技術自原核宿主產生之產物，包括(例如)大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門桿菌及假單胞菌屬、鏈黴菌屬及葡萄球菌屬內之各種物種，較佳來自大腸桿菌細胞。 用於哺乳動物宿主細胞表現之較佳調節序列包括導引哺乳動物細胞中之高含量之蛋白質表現的病毒元素，諸如衍生自巨細胞病毒(CMV)之啟動子及/或強化子(諸如CMV啟動子/強化子)、猴病毒40 (SV40) (諸如SV40啟動子/強化子)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))及多瘤病毒。抗體之表現可為組成型或調節型的(例如，可藉由添加或移除諸如與Tet系統結合之四環素的小分子感應體誘導)。關於病毒調節元素及其序列之進一步描述，參見(例如) Stinski之U.S. 5,168,062、貝爾等人之U.S. 4,510,245及Schaffner等人之U.S. 4,968,615。重組表現載體亦可包括複製起點及可選標記物(參見(例如) U.S. 4,399,216、4,634,665及U.S. 5,179,017)。合適的可選標記物包括在引入載體之宿主細胞上賦予藥物抗性之基因，該等藥物諸如G418、嘌呤黴素、濕球菌素、殺稻瘟菌素、勻黴素/博萊黴素或甲胺喋呤，或利用諸如麩胺合成酶之營養要求性菌的可選標記物(Bebbington 等人，Biotechnology (N Y). 1992年2月；10(2):169-75)。舉例而言，二氫葉酸還原酶(DHFR)基因賦予對甲胺喋呤之抗性、neo基因賦予對G418之抗性、來自土麴菌(Aspergillus terreus)之bsd基因賦予對殺稻瘟菌素之抗性、嘌呤黴素N-乙醯基-轉移酶賦予對嘌呤黴素之抗性、Sh ble基因產物賦予對勻黴素之抗性及藉由大腸桿菌濕球菌素抗性基因(hyg或hph)賦予對濕球菌素之抗性。如同DHFR或麩胺合成酶之可選標記物亦與MTX及MSX結合而適用於擴增技術。 可使用標準技術進行表現載體至宿主細胞中之轉染，該等標準技術諸如電穿孔、核轉染、磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、諸如基於聚乙烯亞胺(PEI)之轉染的基於聚陽離子之轉染及DEAE-聚葡萄糖轉染。 用於表現本文中所提供之抗體、其抗原結合片段或其變體的合適的哺乳動物宿主細胞包括(但不限於)：中國倉鼠卵巢(CHO細胞)，諸如CHO-K1、CHO-S、CHO-K1SV [包括dhfr-CHO細胞，描述於Urlaub及Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220及Urlaub等人的Cell. 1983年6月；33(2):405-12中，與DHFR可選標記物(例如，如R. J. Kaufman及P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621中所描述)一起使用；及例示於Fan等人，Biotechnol Bioeng. 2012年4月；109(4):1007-15中之其他基因剔除細胞]；NS0骨髓瘤細胞；COS細胞；HEK293細胞；HKB11細胞；BHK21細胞；CAP細胞；EB66細胞及SP2細胞。 表現在表現系統中亦可為短暫性的或半穩定的，該等表現系統諸如HEK293、HEK293T、HEK293-EBNA、HEK293E、HEK293-6E、HEK293-自由式、HKB11、Expi293F、293EBNALT75、CHO自由式、CHO-S、CHO-K1、CHO-K1SV、CHOEBNALT85、CHOS-XE、CHO-3E7或CAP-T細胞(例如，Durocher等人，Nucleic Acids Res. 2002年1月15日；30(2):E9)。 在一些實施例中，表現載體經設計以使得經表現蛋白質分泌至生長宿主細胞之培養基中。可使用標準蛋白質純化方法自培養基回收抗體、其抗原結合片段或其變體。 可藉由熟知方法自重組細胞培養物回收且純化本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體，該等熟知方法包括(但不限於)硫酸銨或乙醇沈澱、酸萃取、蛋白質A層析法、蛋白質G層析法、陰離子或陽離子交換層析法、磷酸纖維素層析法、疏水作用層析法、親和性層析法、氫氧磷灰石層析法、混合模式層析法及凝集素層析法。亦可採用高效液相層析法(「HPLC」)以供純化。參見(例如) Colligan，Protocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science，John Wiley & Sons，NY, N.Y., (1997-2001)，例如第1章、第4章、第6章、第8章、第9章、第10章，其各自以全文引用之方式併入本文中。 本發明之抗體或其抗原結合片段或其變體包括經自然純化之產物、化學合成程序之產物及藉由重組技術自真核宿主產生之產物，包括(例如)酵母菌、高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞。取決於重組生產程序中所採用之宿主，本發明之抗體可經糖基化或可不經糖基化。此類方法描述於許多標準實驗室手冊中，諸如Sambrook，同前文獻，章節17.37至17.42；Ausubel，同前文獻，第10章、第12章、第13章、第16章、第18章及第20章。 在較佳實施例中，抗體經純化(1)至大於抗體之95重量%，如(例如)藉由Lowry方法、UV-Vis光譜法或藉由SDS-毛細管凝膠電泳(例如，在測徑規LabChip GXII、GX 90或Biorad生物分析儀裝置上)所測定，且在更佳實施例中大於99重量%，(2)經純化至足以獲得N端或內部胺基酸序列之至少個15殘基的程度或(3)在還原或非還原條件下使用庫馬斯藍或較佳銀色料藉由SDS-PAGE而經純化至均質。經分離的天然存在之抗體包括重組細胞內之原位抗體，係因為抗體之天然環境之至少一種組份將不存在。然而，通常，經分離抗體將藉由至少一個純化步驟來製備。 關於α-發射性釷組份，最近的關鍵發現係，²²⁷ Th可按治療有效的且不產生無法忍受的骨髓毒性之量投與。如本文所使用，術語「可接受的非骨髓毒性」係用於指示，最重要地，藉由經投與之釷-227放射性同位素之衰變產生之鐳-223之量通常不足以對個體直接致命。然而，熟習此項技術者將清楚，將為此治療之可接受副作用的骨髓損傷之量(及致死性反應的機率)將隨以下顯著變化：正治療之疾病的類型、治療方案之目標及針對個體之預後。儘管本發明之較佳個體為人類，但其他哺乳動物，尤其係諸如狗之伴侶動物將受益於本發明之使用且可接受之骨髓損傷位準亦可反映個體之物種。可接受之骨髓損傷位準在惡性疾病之治療中將通常比在非惡性疾病大。骨髓毒性之位準之一種熟知量度為嗜中性球細胞計數，且在本發明中，²²³ Ra之可接受的非骨髓毒性量通常將為受控量，使得在其最低點(最底點)處之嗜中性球分率不少於治療前計數之10%。較佳地，²²³ Ra之可接受的非骨髓毒性量將為使得最底點處之嗜中性球細胞分率為至少20%且更佳至少30%之量。最佳的係，最底點嗜中性球細胞分率為至少40%。 此外，含有放射性²²⁷ Th之化合物可用於高劑量治療方案中，其中當包括幹細胞支援或相當的回收方法時，所產生之²²³ Ra之骨髓毒性通常將係無法忍受的。在此等情況下，嗜中性球細胞計數可減少至低於最底點處之10%，且特別係將減少至5%，或視需要低於5%，條件為採取合適的預防措施並給出隨後的幹細胞支援。此類技術係在此項技術中熟知的。 釷-227相對容易產生且可間接地由經中子照射之²²⁶ Ra製備，其將含有母核種²²⁷ Th，亦即²²⁷ Ac (T_1/2 =22年)。錒-227可相當輕易地由²²⁶ Ra靶標分離且用作²²⁷ Th之產生劑。若需要，此製程可按比例調整至工業規模，且因此可避免使用大多數其他α-發射體(被視為分子靶向之放射療法之候選者)可見的供應問題。 釷-227可按足以提供所需治療效果而不會產生太多鐳-223以致於引起無法忍受的骨髓抑制的量投與。期望在靶向區域中維持子同位素，以使得另外的治療效果可衍生自其衰變。然而，為了具有有用的治療效果而不會誘導不可接受的骨髓毒性而維持控制釷衰變產物係不必要的。 假定腫瘤細胞殺滅效應將主要來自釷-227而非來自其子體，該同位素之可能的治療劑量可藉由與其他α-發射體比較而確定。舉例而言，對於砹-211，動物中之治療劑量通常為每kg 2 MBq至10 MBq。藉由校正半衰期及能量，釷-227之相對應劑量將為至少36-200 kBq/kg體重。此將對²²⁷ Th之量設定下限，該²²⁷ Th之量在治療效果之預期下可有用地投與。此計算假定砹與釷相當的保持力。但明顯地，釷之18.7天半衰期將最可能導致該同位素在其衰變之前的較大消除。此經計算劑量因此通常應被視為最小有效量。以完全保留之²²⁷ Th (亦即未自身體消除之²²⁷ Th)表示之治療劑量將通常為至少18或25 kBq/kg，較佳為至少36 kBq/kg且更佳為至少75 kBq/kg，例如100 kBq/kg或更多。將預期較大量之釷具有較大治療效果，但若結果係將出現無法忍受的副作用則無法投與。同樣，若以具有較短生物學半衰期(亦即，在自體內消除之前仍攜載釷的半衰期)之形式投與釷，則較大量之放射性同位素對於治療效果將為必需的，係因為大量釷將在其衰變之前消除。然而，鐳-223之產量將相應降低。當同位素完全保留時，上述之釷-227投藥量很容易與具有較短生物半衰期之等效劑量相關。此類計算係此項技術中熟知者，且已出示於WO 04/091668中(例如，在文本中及在實例1及實例2中)。 若放射性標記之化合物釋放子核種，則重要的是要知道任何放射性子核種(若適用)之命運。使用²²⁷ Th時，主要子體產物係²²³ Ra，²²³ Ra由於其趨骨性而處於臨床評估中。鐳-223非常快速地從血液中清除，且富集在骨骼中或經由腸道及腎途徑排泄(參見Larsen，J Nucl Med 43(5, Supplement)：160P (2002))。因此，活體內自²²⁷ Th釋放之鐳-223對健康軟組織的影響程度不大。Müller在Int. J. Radiat. Biol. 20:233-243 (1971)中對²²⁷ Th呈溶解之檸檬酸鹽之分佈的研究中，發現自軟組織中之²²⁷ Th產生的²²³ Ra易於再分配至骨或排泄。α-發射性鐳之已知毒性，尤其係對於骨髓之毒性，因此成為與釷劑量有關之問題。 首次在WO 04/091668中確定的係，事實上，可以投與至少200 kBq/kg之²²³ Ra之劑量，且人類個體可以耐受。此等數據呈現在該公開案中。因此，現在非常出乎意料地看到，的確存在一個治療窗口，其中可向哺乳動物個體投與治療有效量之²²⁷ Th (諸如大於36 kBq/kg)，而且不需預期此個體可能遭受不可接受的嚴重風險或甚至致命的骨髓毒性。儘管如此，極其重要的係最好利用此治療窗口，且因此必需讓放射性釷迅速且有效地錯合，並以極高親和力維持，以遞送最大可能比例之劑量至靶位點。 自²²⁷ Th藥物產生之²²³ Ra之量將取決於放射性標記化合物之生物半衰期。理想的情境將為使用腫瘤快速吸收之錯合物，包括內化進入腫瘤細胞、強力滯留在腫瘤、及在正常組織中之短生物半衰期。然而，小於理想生物半衰期之錯合物也適用，只要²²³ Ra之劑量維持在可耐受程度內即可。活體內之鐳-223產量將為釷之投與量及釷錯合物之生物滯留時間之因素。在任何特定情況中，一般熟習此項技術者很容易計算鐳-223產量。²²⁷ Th之最大可投與量將藉由活體內之鐳產量測定，且必須小於將產生無法耐受之副作用程度(尤其係骨髓毒性)時之投與量。此量將通常小於300 kBq/kg，尤其小於200 kBq/kg且更佳小於170 kBq/kg (例如，小於130 kBq/kg)。最小有效劑量將由以下測定：釷之細胞毒性、患病組織對所產生之α輻射之易感性及釷藉由靶向錯合物有效地組合、保留及遞送之程度(在此情況下為配位體與靶向部分體之組合)。 在本發明之方法中，以18至400 kBq/kg體重，較佳36至200 kBq/kg、(諸如50至200 kBq/kg)，更佳75至170 kBq/kg，特別100至130 kBq/kg之釷-227劑量合意地投與釷錯合物。對應地，單一劑量直至可包含大約此等範圍中之任一者乘以合適體重，諸如30至150 Kg，較佳40至100 Kg (例如，540 kBq/劑至4000 KBq/劑之範圍等)。此外，釷劑量、錯合劑及投與途徑將合意地為，使得活體內產生之鐳-223劑量小於300 kBq/kg，更佳小於200 kBq/kg，仍更佳小於150 kBq/kg，特別小於100 kBq/kg。再次，此將提供對²²³ Ra之暴露，其藉由使此等範圍乘以所指示體重中之任一者而指示。以上劑量較佳為²²⁷ Th之完全保留劑量，但可為考慮到一些²²⁷ Th在其衰變之前將自身體清除的經投與量。 在²²⁷ Th錯合物之生物半衰期比物理半衰期短(例如，少於7天，尤其少於3天)的情況下，可需要顯著較大投與劑量以提供等同保留劑量。因此，例如，150 kBq/kg之完全保留劑量等同於以711 kBq/kg之劑量投與的具有5天半衰期的錯合物。可使用本領域中熟知之方法自錯合物之生物清除率計算任何適當保留劑量之等同投與劑量。 由於一個²²⁷ Th核之衰變提供一個²²³ Ra原子，²²⁷ Th之保留及治療活性將與患者承受之²²³ Ra劑量直接相關。可使用熟知方法計算在任何特定情境中產生之²²³ Ra的量。 在一較佳實施例中，本發明因此提供一種用於治療哺乳動物個體(如本文所描述)中之疾病之方法，該方法包含向該個體投予治療有效數量之如本文所描述之至少一種組織靶向性釷錯合物。 明顯需要最小化個體對²²³ Ra子同位素之暴露，除非該子同位素之性質係非常有用的。詳言之，活體內產生之鐳-223之量將通常大於40 kBq/kg，例如大於60 kBq/Kg。在一些情況下，活體內產生之²²³ Ra必須大於80 kBq/kg，例如大於100 kBq/kg或115 kBq/kg。 適當載液中之經釷-227標記之共軛物可以經靜脈、腔內(例如腹膜內)、皮下、經口或局部投與，作為單次施用或分次施用方案。較佳地，共軛至靶向部分體之錯合物將藉由不經腸的(例如，經皮)途徑作為溶液投與，特別係經靜脈或藉由腔內途徑投與。較佳地，對於不經腸投與，本發明之組合物將以無菌溶液調配。 本發明之方法及產物中之釷-227可單獨使用或與其他治療形態組合使用，該等治療形態包括手術、外束輻射療法、化學療法、其他放射性核種或組織溫度調節等。此形成本發明之方法之另外的較佳實施例，且調配物/藥劑可對應地包含至少一種另外的治療活性劑，諸如另一放射性試劑或化學治療劑。 在一個尤佳實施例中，個體亦經受幹細胞治療及/或其他支援性療法以降低經鐳-223誘導之骨髓毒性的作用。 本發明之經釷(例如，釷-227)標記之分子可藉由靶向疾病相關受體而用於治療癌症或非癌症疾病。通常，²²⁷ Th之此類醫療用途將藉由放射性免疫療法用於治療癌症或非癌症疾病，該放射性免疫療法基於藉由螯合劑將²²⁷ Th連接至抗體、抗體片段，或抗體或抗體片段之構築體。²²⁷ Th在根據本發明之方法及藥物中之用途尤其適合用於治療乳癌、胃癌、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及子宮癌。 在本發明之另一實施例中，患有軟組織及骨骼疾病之患者可藉由²²⁷ Th及藉由自投與之釷而在活體內產生之²²³ Ra兩者治療。在此尤其有利之態樣中，治療之額外治療組份藉由靶向骨骼疾病而源自可接受的非骨髓毒性量的²²³ Ra。在此治療方法中，²²⁷ Th通常用於藉由適當地靶向其而治療軟組織之原發性及/或轉移性癌症，且由²²⁷ Th衰變產生之²²³ Ra用於治療同一個體中之相關骨骼疾病。此骨骼疾病可源於原發性軟組織癌症而轉移至骨骼，或可為軟組織治療抵消轉移性癌症的原發性疾病。間或，軟組織疾病及骨骼疾病可為不相關的(例如，患有風濕性軟組織疾病的患者之骨骼疾病的另外治療)。 以下提供一些實例合成。展示於此等合成中之步驟將適用於本發明之許多實施例。步驟a)例如可經由以下在本文所描述之許多或所有實施例中展示之中間物AGC0021繼續進行。合成 AGC0020 關鍵中間物 N,N,N',N'- 肆 (2- 胺基乙基 )-2-(4- 硝基苄基 ) 丙烷 -1,3- 二胺

a)丙二酸二甲酯、氫化鈉、THF；b) DIBAL-H、THF；c)MsCl、NEt₃ 、CH₂ Cl₂ ； d)咪唑、Boc₂ O、CH₂ Cl₂ 、甲苯；e) D1PEA、乙腈；f) MeOH、水、AcCl合成 AGC0021 關鍵中間物 3-( 苄氧基 )-1- 甲基 -4-[(2- 硫酮基 -1,3- 噻唑啶 -3- 基 ) 羰基 ] 吡啶 -2(1H)- 酮

a)乙二酸二乙酯、乙醇鉀、甲苯、EtOH；b) Pd/C、對二甲苯；c) Mel、K₂ CO₃ 、DMSO、丙酮； d) i) BBr₃ 、DCM，ii) BnBr、K₂ CO₃ 、Kl、丙酮；e) NaOH、水、MeOH； f)

、DCC、DMAP、DCM合成式 (VIII) 之 化合物之螯合物 4-{[4-(3-[ 雙 (2-{[(3- 羥基 -1- 甲基 -2- 側氧基 -1,2- 二氫吡啶 -4- 基 ) 羰基 ] 胺基 } 乙基 ) 胺基 ]-2-{[ 雙 (2-{[(3- 羥基 -1- 甲基 -2- 側氧基 -1,2- 二氫吡啶 -4- 基 ) 羰基 ] 胺基 } 乙基 ) 胺基 ] 甲基 } 丙基 ) 苯基 ] 胺基 }-4- 氧丁酸

在形成本發明之錯合物之方法中，較佳的係，在水性溶液中進行八牙螯合劑與組織靶向性部分體之間的偶合反應。此具有若干優點。首先，其免除製造商將所有溶劑移除至低於可接受含量且證明該移除之負擔。其次，其減少廢料且最重要的係其藉由避免分離或移除步驟加快生產。在本發明之放射性藥物之情形中，儘可能快速地進行合成係重要的，係因為放射性同位素將一直衰變且製備所花費之時間會浪費寶貴材料且引入污染物子同位素。 合適的水性溶液包括純化水及緩衝液，諸如此項技術中所熟知之許多緩衝液中之任一者。乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸鹽(例如，PBS)及磺酸鹽緩衝液(諸如MES)為熟知水性緩衝液之典型實例。 在一個實施例中，該方法包含形成含有八牙羥基吡啶酮之配位體之第一水性溶液(如遍及本文所描述)及組織靶向性部分體的第二水性溶液(如遍及本文所描述)且使該第一水性溶液與該第二水性溶液接觸。 合適的偶合部分體在上文詳細論述且本文中論述為偶合基團及/或鍵聯基團之所有基團及部分體可適當地用於將靶向部分體偶合至配位體。一些較佳偶合基團包括醯胺偶合基團、酯偶合基團、醚偶合基團及胺偶合基團。酯及醯胺可適宜地藉由自羧酸產生經活化酯基而形成。此種羧酸可存在於靶向部分體上、偶合部分體上及/或配位體部分體上，且將通常與醇或胺反應以形成酯或醯胺。此類方法在此項技術中係非常熟知的且可利用熟知活化試劑，包括N-羥基順丁烯二醯亞胺、碳化二亞胺及/或諸如DCC、DIC、EDC、DEAD、DIAD等的偶氮二羧酸酯活化試劑。 在一較佳實施例中，可使用至少一種偶合試劑(諸如本文所描述之彼等中之任一者)及諸如N-羥基丁二醯亞胺(NHS)之活化試劑活化包含在N位置中經甲基烷基取代之四個羥基吡啶酮部分體及以羧酸基封端之偶合部分體的八牙螯合劑，由此形成八牙螯合劑之NHS酯。此經活化(例如，NHS)酯可經分離或在不分離之情況下使用，以用於與具有游離胺基(諸如在離胺酸側鏈上)之任何組織靶向性部分體偶合。其他經活化酯在此項技術中為熟知的且可為有效離去基之任何酯，諸如經氟化之基團、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、碘等。然而，NHS酯係較佳的。 偶合反應較佳地在相對較短時段內及在大約環境溫度下進行。1步驟或2步驟偶合反應之典型週期將為大約1分鐘至240分鐘，較佳5分鐘至120分鐘，更佳10分鐘至60分鐘。用於偶合反應之典型溫度將在0℃與90℃之間，較佳15℃與50℃之間，更佳20℃與40℃之間。大約25℃或大約38℃係適當的。 將八牙螯合劑偶合至靶向部分體將通常在不會不利地(或至少不會不可逆地)影響靶向部分體之結合能力之條件下進行。由於結合劑通常為基於肽或蛋白質之部分體，故此需要相對溫和條件以避免二級/三級結構之變性或損耗。水性條件(如在本文所有上下文中所論述)將為較佳的，且將需要避免pH之極值及/或氧還。步驟b)可因此在介於3與10之間，較佳介於4與9之間且更佳介於4.5與8之間的pH下進行。可需要就氧還而言係中性或非常輕度地還原以避免在空氣中氧化的條件。 適用於本發明之所有態樣的較佳組織靶向螯合劑係如本文所描述之AGC0018。AGC0018與²²⁷ Th之離子的錯合物形成本發明之錯合物及對應調配物、用途、方法等之較佳實施例。可用於本發明之所有此等態樣之其他較佳實施例包括與組織靶向性部分體共軛的AGC0019之²²⁷ Th錯合物(如本文所描述)，該等組織靶向性部分體包括對HER2具有結合親和力之單株抗體。 現將藉由以下非限制性實例說明本發明。例示於實例中之所有化合物形成本發明之較佳實施例(包括較佳的中間物及前驅體)且可單獨地使用或在情形允許時在任何態樣中以任何組合使用。實例 1 合成式 (III) 之 化合物

實例 1.1 合成 2-(4- 硝基苄基 ) 丙二酸二甲酯

在0℃下將氫化鈉(60%分散液，11.55 g，289 mmol)懸浮於450 mL四氫呋喃(THF)中。經大約30分鐘逐滴添加丙二酸二甲酯(40.0 mL，350 mmol)。在0℃下攪拌反應混合物30分鐘。在0℃下經大約30分鐘逐滴添加溶解於150 mL THF中之4-硝基溴甲苯(50.0 g，231 mmol)，接著在環境溫度下經兩小時添加。 在過濾溶液之前，添加500 mL乙酸乙酯(EtOAc)及250 mL NH₄ Cl (飽和水溶液)。分離各相。用2×250 mL EtOAc萃取水相。有機相經合併，用250 mL鹽水洗滌，經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾且在減壓下移除溶劑。 將300 mL庚烷及300 mL甲基第三丁基醚(MTBE)添加至殘餘物中且加熱至60℃。過濾溶液。將濾液置於冰箱中隔夜且過濾。濾餅用200 mL庚烷洗滌且在減壓下乾燥，得到呈灰白色固體狀之標題化合物。 產率：    42.03 g，157.3 mmol，68%。 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 3.30(d, 2H, 7.8 Hz), 3.68(t, 1H, 7.8 Hz), 3.70(s, 6H), 7.36(d, 2H, 8.7 Hz), 8.13(d, 2H, 8.7 Hz)。實例 1.2 合成 2-(4- 硝基苄基 ) 丙烷 -1,3- 二醇

在0℃下將2-(4-硝基苄基)丙二酸二甲酯(28.0 g，104.8 mmol)溶解於560 mL THF中。在0℃下經大約30分鐘逐滴添加二異丁基氫化鋁 (DIBAL-H) (1 M於己烷中，420 mL，420 mmol)。在0℃下攪拌反應混合物兩小時。 在0℃下將20 mL水逐滴添加至反應混合物。在0℃下將20 mL NaOH (水溶液，15%)逐滴添加至反應混合物，接著將20 mL水逐滴添加至反應混合物。在添加大約150 g MgSO₄ 之前，在0℃下攪拌混合物20分鐘。在布赫納(Büchner)漏斗上過濾混合物之前，在室溫下攪拌該混合物30分鐘。用500 mL EtOAc洗滌濾餅。在過濾溶液之前，用800 mL EtOAc及200 mL MeOH移除且攪拌濾餅大約30分鐘。濾液在減壓下經合併且經乾燥。 使用EtOAc於庚烷中之梯度，接著使用MeOH於EtOAc中之梯度的矽膠DFC得到呈淡黃色固體狀之標題化合物。 產率：15.38 g，72.8 mmol，69%。 1H-NMR (400MHz, CDCl3): 1.97-2.13(m, 3H), 2.79(d, 2H, 7.6 Hz), 3.60-3.73(m, 2H), 3.76-3.83 (m, 2H), 7.36(d, 2H, 8.4 Hz), 8.14(d, 2H, 8.4 Hz)。實例 1.3 合成二甲烷磺酸 2-(4- 硝基苄基 ) 丙烷 -1,3- 二酯

在0℃下將2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二醇(15.3 g，72.4 mmol)溶解於150 mL CH₂ Cl₂ 中。經大約15分鐘逐滴添加三乙胺(23 mL，165 mmol)，接著添加甲磺醯氯(12 mL，155 mmol)歷時，接著在環境溫度下攪拌一小時。 添加500 mL CH₂ Cl₂ ，且用2×250 mL NaHCO₃ (飽和水溶液)、125 mL HCl (水溶液，0.1 M)及250 mL鹽水洗滌混合物。有機相經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾且在減壓下乾燥，得到呈橙色固體狀之標題化合物。 產率：25.80 g，70.2 mmol，97 %。 1H-NMR (400MHz, CDCl3): 2.44-2.58(m, 1H), 2.87(d, 2H, 7.7 Hz), 3.03(s, 6H), 4.17(dd, 2H, 10.3, 6.0 Hz), 4.26(dd, 2H, 10.3, 4.4 Hz), 7.38(d, 2H, 8.6 Hz), 8.19(d, 2H, 8.6 Hz)。實例 1.4 合成二胺基甲酸 ( 氮二基雙 ( 乙烷 -2,1- 二基 ) ) 二第三丁酯

在室溫下將咪唑(78.3 g，1.15 mol)懸浮於500 mL CH₂ Cl₂ 中。逐份添加二碳酸二第三丁酯(Boc₂ O) (262.0 g，1.2 mol)。在室溫下攪拌反應混合物一小時。反應混合物係用3×750 mL水洗滌、經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾且減壓下移除揮發物。 將殘餘物溶解於250 mL甲苯中且添加二伸乙基三胺(59.5 mL，550 mmol)。在60℃下攪拌反應混合物兩小時。 添加1 L CH₂ Cl₂ ，且用2×250 mL水洗滌有機相。有機相經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾且在減壓下還原。 使用甲醇(MeOH)於CH₂ Cl₂ 之梯度與三乙胺的矽膠DFC得到呈無色固體狀之標題化合物。 產率：102 g，336 mmol，61 %。¹ H-NMR (400MHz, CDCl3): 1.41(s, 18H), 1.58(bs, 1H), 2.66-2.77(m, 4H), 3.13-3.26(m, 4H), 4.96(bs, 2H)。實例 1.5 合成 (((2-(4- 硝基苄基 ) 丙烷 -1,3- 二基 ) 雙 ( 氮烷三基 )) 肆 ( 乙烷 -2,1- 二基 ) ) 四胺基甲酸 四第三丁酯

將二甲烷磺酸2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二酯(26.0 g，71 mmol)及二第三丁基(氮二基雙(乙烷-2,1-二基))二胺基甲酸酯(76.0 g，250 mmol)溶解於700 mL乙腈中。添加N,N-二異丙基乙胺(43 mL，250 mmol)。在回流下攪拌反應混合物4天。 在減壓下移除揮發物。 使用EtOAc於庚烷中之梯度的矽膠DFC得到呈淡黃色固體發泡體狀之標題化合物。 產率：27.2 g，34.8 mmol，49 %。¹ H-NMR (400MHz, CDCl3): 1.40(s, 36H), 1.91-2.17(m, 3H), 2.27-2.54(m, 10H), 2.61-2.89(m, 2H), 2.98-3.26(m, 8H), 5.26(bs, 4H), 7.34(d, 2H, 8.5 Hz), 8.11(d, 2H, 8.5 Hz)。實例 1.6 合成 N¹ ,N^1' -(2-(4- 硝基苄基 ) 丙烷 -1,3- 二基 ) 雙 ( N¹ -(2- 胺基乙基 ) 乙烷 -1,2- 二胺 ) ， AGC0020

將(((2-(4-硝基苄基)丙烷-1,3-二基)雙(氮烷三基))肆(乙烷-2,1-二基))四胺基甲酸四第三丁酯(29.0 g，37.1 mmol)溶解於950 mL MeOH及50 mL水中。在30℃下經大約20分鐘逐滴添加氯化氯(50 mL，0.7 mol)。將反應混合物攪拌隔夜。 在減壓下移除揮發物且將殘餘物溶解於250 mL水中。添加500 mL CH₂ Cl₂ ，接著添加175 mL NaOH (水溶液，5 M，NaCl飽和)。分離各相且用4×250 mL CH₂ Cl₂ 萃取水相。有機相經合併，經Na₂ SO₄ 乾燥，過濾且在減壓下乾燥，得到呈黏稠的紅棕色油狀物之標題化合物。 產率：11.20 g，29.3 mmol，79 %。純度(HPLC 圖9)：99.3%。¹ H-NMR (300MHz, CDCl₃ ):    1.55(bs, 8H), 2.03(dt, 1H, 6.6, 13.3 Hz), 2.15(dd, 2H, 12.7, 6.6), 2.34-2.47(m, 10H), 2.64-2.77(m, 10H), 7.32(d, 2H, 8.7 Hz), 8.10(d, 2H, 8.7 Hz)。¹³ C-NMR (75MHz, CDCl₃ ):    37.9, 38.5, 39.9, 58.0, 58.7, 123.7, 130.0, 146.5, 149.5實例 1.7 合成 5- 羥基 - 6- 側氧基 -1,2,3,6- 四氫吡啶 -4- 甲酸乙酯

在室溫下將2-吡咯啶酮(76 mL，1 mol)及乙二酸二乙酯(140 mL，1.03 mol)溶解於1 L甲苯中。添加乙醇鉀(EtOK) (24%於EtOH中，415 mL，1.06 mol)，且將反應混合物加熱至90℃。 由於反應混合物之稠化，在反應之第一個小時期間逐份添加200 mL EtOH。將反應混合物攪拌隔夜且冷卻至室溫。在攪拌的同時緩慢添加210 mL HCl (5 M，水溶液)。 添加200 mL鹽水及200 mL甲苯，且分離各相。 用2×400 mL CHCl₃ 萃取水相。經合併之有機相經乾燥(Na₂ SO₄ )，過濾且在真空中還原。自EtOAc再結晶殘餘物，得到呈淡黃色固體狀之標題化合物。 產率：132.7g，0.72 mol，72%。實例 1.8 合成 3- 羥基 - 2- 側氧基 -1,2- 二氫吡啶 -4- 甲酸乙酯

將{5-羥基-6-側氧基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-甲酸乙酯} (23.00 g，124.2 mmol)溶解於150 mL對二甲苯中且添加鈀/碳(10%，5.75 g)。在回流下將反應混合物攪拌隔夜。冷卻至室溫後，反應混合物用300 mL MeOH稀釋且經由Celite®短墊過濾。用300 mL MeOH洗滌該墊。在真空中移除溶劑，得到呈淡紅棕色固體狀之標題化合物。 產率：19.63 g，107.1 mmol，86%。MS (ESI, pos): 206.1[M+Na]⁺ , 389.1[2M+Na]⁺ 實例 1.9 合成 3- 甲氧基 -1- 甲基 - 2- 側氧基 -1,2- 二氫吡啶 -4- 甲酸乙酯

在室溫下將{3-羥基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯} (119.2 g，0.65 mol)溶解於600 mL二甲亞碸(DMSO)及1.8 L丙酮中。添加K₂ CO₃ (179.7 g，1.3 mol)。在室溫下經大約1小時逐滴添加溶解於600 mL丙酮中之碘代甲烷(MeI) (162 mL，321 mmol)。 在添加MeI (162 mL，2.6 mol)之前，在室溫下攪拌反應混合物另外兩小時。在回流下將反應混合物攪拌隔夜。在減壓下還原反應混合物且添加2.5 L EtOAc。 混合物經過濾且在減壓下還原。藉由使用EtOAc於庚烷中之梯度的SiO₂ 乾燥急驟層析法(DFC)進行純化，得到標題化合物。 產率：56.1 g，210.1 mmol，32 %。MS (ESI, pos):234.1[M+Na]⁺ , 445.1[2M+Na]⁺ 實例 1.10 合成 3-( 苄氧基 )-1- 甲基 - 2- 側氧基 -1,2- 二氫吡啶 -4- 甲酸乙酯

在-78℃下將{3-甲氧基-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯} (5.93 g，28.1 mmol)溶解於80 mL二氯甲烷(DCM)中且逐滴添加溶解於20 mL DCM中之BBr₃ (5.3 mL，56.2 mmol)。在將反應物加熱至0℃之前在-78℃下攪拌反應混合物1小時。藉由逐滴添加25 mL第三丁基甲基醚(第三BuOMe)及25 mL MeOH來猝滅反應物。在真空中移除揮發物。將殘餘物溶解於90 mL DCM及10 mL MeOH中且經由SiO₂ 短墊過濾。用200 mL含10% MeOH之DCM洗滌該墊。在真空中移除揮發物。將殘餘物溶解於400 mL丙酮中。添加K₂ CO₃ (11.65 g，84.3 mmol)、KI (1.39 g，8.4 mmol)及溴甲苯(BnBr) (9.2 mL，84.3 mmol)。在回流下將反應混合物攪拌隔夜。反應混合物用200 mL EtOAc稀釋且用3×50 mL水及50 mL鹽水洗滌。經合併之水相用2×50 mL EtOAc萃取。經合併之有機相經乾燥(Na₂ SO₄ )，過濾且揮發物在真空中移除，且使用含EtOAc (40%至70%)之庚烷作為溶離劑藉由SiO₂ 乾燥急驟層析法純化，得到標題化合物。 產率：5.21 g，18.1 mmol，65 %。MS (ESI, pos): 310.2[M+Na]⁺ , 597.4[2M+Na]⁺ 實例 1.11 合成 3-( 苄氧基 )-1- 甲基 -2- 側氧基 -1,2- 二氫吡啶 -4- 甲酸

將{3-(苄氧基)-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸乙酯} (27.90 g，97.1 mmol)溶解於250 mL MeOH中且添加60 mL NaOH (5M，水溶液)。在真空中將反應混合物濃縮至大約1/3之前，在室溫下攪拌反應混合物2小時。殘餘物經150 mL水稀釋且使用氯化氫(HCl) (5 M，水溶液)酸化至pH 2。沈澱物經過濾且在真空中乾燥，得到呈無色固體狀之標題化合物。產率：22.52 g，86.9 mmol，89%。實例 1.12 合成 3-( 苄氧基 )-1- 甲基 -4-(2- 硫酮基噻唑啶 -3- 羰基 ) 吡啶 -2(1H)- 酮 (AGC0021)

將{3-(苄氧基)-1-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-4-甲酸} (3.84 g，14.8 mmol)、4-二甲基胺基吡啶(DMAP) (196 mg，1.6 mmol)及2-噻唑啉-2-硫醇(1.94 g，16.3 mmol)溶解於50 mL DCM中。添加N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC) (3.36 g，16.3 mmol)。將反應混合物攪拌隔夜。過濾反應物，用DCM洗滌固體且在真空中還原濾液。自異丙醇/DCM再結晶所得黃色固體，得到AGC0021。產率：4.65 g，12.9 mmol，87%。MS (ESI, pos): 383[M+Na]⁺ , 743[2M+Na]⁺ 實例 1.13 合成 AGC0023

將AGC0020 (8.98 g；23.5 mmol)溶解於CH₂ Cl₂ (600 mL)中。添加AGC0021 (37.43 g；103.8 mmol)。在室溫下攪拌反應物20小時。在減壓下濃縮反應混合物。 使用甲醇於EtOAc及CH₂ Cl₂ 之1:1混合物中之梯度的SiO₂ DFC產生呈固體發泡體狀的AGC0023。 平均產率：  26.95 g，20.0 mmol，85 %。實例 1.14 合成 AGC0024

將AGC0023 (26.95 g；20.0 mmol)溶解於乙醇(EtOH) (675 mL)中。添加鐵(20.76 g；0.37 mol)及NH₄ Cl (26.99 g；0.50 mol)，接著添加水(67 mL)。在70℃下攪拌反應混合物兩小時。添加更多鐵(6.75 g；121 mmol)，且在74 ℃下攪拌反應混合物一小時。添加更多鐵(6.76；121 mmol)，且在74℃下攪拌反應混合物一小時。冷卻反應混合物，之後在減壓下還原該反應混合物。 使用甲醇於CH₂ Cl₂ 中之梯度的SiO₂ DFC產生呈固體發泡體狀的AGC0024。 產率  18.64 g，14.2 mmol，71 %。實例 1.15 合成 AGC0025

將AGC0024 (18.64 g；14.2 mmol)溶解於CH₂ Cl₂ (750 mL)中且冷卻至0℃。添加BBr₃ (50 g；0.20 mol)且攪拌反應混合物75分鐘。藉由仔細添加甲醇(MeOH) (130 mL)，同時在0℃下攪拌來猝滅反應物。在減壓下移除揮發物。將HCl (含1.25 M之EtOH，320 mL)添加至殘餘物。接著在大氣壓力及環境溫度下使用旋轉式蒸發器使燒瓶自旋15分鐘，之後在減壓下移除揮發物。 使用乙腈(ACN)於水中之梯度的未封端C₁₈ 矽膠DFC產生呈淺橙色玻璃態固體狀之AGC0025。 產率  13.27 g，13.9 mmol，98 %。實例 1.16 合成 AGC0019

在室溫下將AGC0025 (10.63 g；11.1 mmol)溶解於ACN (204 mL)及水(61 mL)中。添加丁二酸酐(2.17 g；21.7 mmol)且攪拌反應混合物兩小時。在減壓下還原反應混合物。使用ACN於水中之梯度的未封端C₁₈ 矽膠DFC產生綠色玻璃態固體。 在40℃下將固體溶解於MeOH (62 mL)及水(10.6 mL)中。在超聲處理下將溶液逐滴添加至EtOAc (750 mL)。沈澱物經過濾，用EtOAc洗滌且在減壓下乾燥，得到呈帶綠色色澤之灰白色固體狀的AGC0019。 產率：    9.20 g，8.7 mmol，78 %。H-NMR (400 MHz, DMSO-d₆ ),¹³ C-NMR (100 MHz, DMSO-d₆ )。實例 2 分離純釷 -227 自錒-227產生劑分離釷-227。經由鐳-226之熱中子照射，接著使鐳-227 (t1/2=42.2 m)衰變為錒-227來產生錒-227。藉由陰離子交換層析法在8 M HNO₃ 溶液中選擇性地自錒-227衰變混合物保留釷-227。使用2 mm內徑，長度30 mm，含有70 mg之AG^® 1-X8樹脂(200目至400目，硝酸酯形式)之管柱。在錒-227、鐳-223及子體自管柱溶離之後，用12 M HCl自管柱萃取釷-227。將含有釷-227之溶離液蒸發至乾燥且在標記步驟之前將殘餘物再懸浮於0.01 M HCl中。實例 3 實例 3.1 產生 HER2 之 單株抗體 (AGC1100) 含有本發明之IgG的胺基酸序列之DNA序列在Geneart/Life Technologies (Regensburg，Germany)合成且經選殖為合適的表現載體。所有基因經密碼子最佳化以用於CHO表現。使用NRC Canada (Durocher等人，Nucleic Acids Res. 2002年1月15日；30(2):E9)之表現系統或在CHO-K1細胞之穩定轉染之後，IgG短暫表現於HEK293 6E細胞中。抗體係經由蛋白質A親和性層析法及後續的如先前所描述之尺寸排外層析法(Hristodorov等人，Mol Biotechnol (2013) 53:326-335)純化。實例 3.2 將 mAb AGC1100 與 螯合劑 AGC0019 ( 式 (VIII) 之化合物 ) 偶合以得到共軛物 AGC1118

在共軛之前，將磷酸鹽緩衝液(pH 7.5)添加至抗體溶液(AGC1100)以增加溶液之緩衝能力。測定容器中之AGC1100之量(mAb)。 向含曲妥珠單抗之PBS添加11%之1 M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)。 將螯合劑AGC0019溶解於1:1的DMA:0.1 M MES緩衝液(pH 5.4)中。將NHS及EDC溶解於0.1 M MES緩衝液(pH 5.4)中。 製備螯合劑/N-羥基丁二醯亞胺(NHS)/1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)之1/1/3莫耳當量溶液以活化螯合劑。 為與抗體共軛，將莫耳比為8/8/25/1 (螯合劑/NHS/EDC/mAb)之經活化螯合劑裝入至mAb。在20分鐘至40分鐘之後，用12%之v/v 0.3 M檸檬酸淬滅共軛反應物以將pH調節至5.5。 藉由在連接至ÄKTA系統(GE Healthcare)之Superdex 200 (GE Healthcare)管柱上凝膠過濾來執行AGC0118共軛物之純化及緩衝液交換以進入30 mM檸檬酸鹽(pH 5.5)、154 mM NaCl。在用緩衝液調配產物之前量測Abs 280 nm下之蛋白濃度(以獲得含2.5 mg/mL AGC0118之30 mM檸檬酸鹽、154 mM NaCl、2mM EDTA、2mg/mL pABA，pH 5.5)。 最後，在儲存之前，經由0.2 mm過濾器將溶液過濾至無菌瓶中。實例 3.3 對 ²²⁷ Th-AGC0118 注射劑之劑量之製備 如先前所描述執行標記： 將小瓶20 MBq釷-227氯化物薄膜溶解於2 ml 8M HNO₃ 溶液中，且在抽取溶液以施用至陰離子交換管柱之前保持15分鐘，以移除隨時間推移生長之鐳-223。在用3 ml 3 M HCl溶離釷-227之前用3 ml 8 M HNO3及1 ml水洗滌管柱。量測釷-227之溶離活性且將10 MBq之劑量轉移至空的10 ml玻璃小瓶中。接著使用真空泵蒸發酸且使小瓶處於加熱塊(設定成120℃)中持續30分鐘至60分鐘。在達到室溫之後，添加6 ml AGC0118共軛物2.5 mg/ml以供放射性標記。輕輕混合小瓶且在室溫下保持15分鐘。接著將溶液無菌過濾至無菌小瓶中，且在使用之前抽取樣本，用於iTLC分析以測定RCP。實例 3.4 在不同總活性之情況下 ²²⁷ Th-AGC0118 抗 SKOV-3 之細胞毒性 藉由在4小時培育時間期間改變向槽孔增添之總活性測試對於各種劑量之²²⁷ Th-AGC0118之細胞毒性。在實驗前一天，在96孔板中每孔接種10000個SKOV-3細胞。在第1天將特異性活性為20 kBq/µg之一系列總活性5 kBq/ml、10 kBq/ml、20 kBq/ml及40 kBq/ml之經螯合²²⁷ Th-AGC0118添加至細胞。在培育期結束後，藉由多陣列移液管移除剩餘未結合之²²⁷ Th-AGC0118，接著用介質再清洗一次且隨後用新培養基再清洗一次。藉由10% FBS及1%青黴素/鏈黴素在Mc-Coy介質中培養SKOV-3細胞。在與²²⁷ Th-AGC0118一起培育期間，無血清介質置換培養基。在第四天，CellTiter-Glo發光細胞存活率測定(Promega)用於量測細胞存活率。參見圖6。實例 4 比較醯胺與經異硫氰酸酯連接之共軛物的穩定性 在40℃下將AGC1118及具有異硫氰酸酯偶合部分體之對應共軛物(AGC1115)儲存於水性溶液中，持續11天。定期取用樣本。 可看出，對於經醯胺偶合之共軛物，未發現共軛物濃度之可量測減小。相比之下，異硫氰酸酯共軛物減小。

Claims (22)

1. 一種用於形成組織靶向性釷錯合物之方法，該方法包含：a)形成式(I)或式(II)之八牙螯合劑：

   

   

   其中R_C為以羧酸部分體封端之連接基部分體，b)在醯胺偶合試劑存在下，將該八牙螯合劑偶合至組織靶向性部分體，該組織靶向性部分體包含與序列1具有序列一致性之肽鏈：輕鏈

   

   (SEQ ID NO.1)及與以下序列2至6中之任一者具有序列相似性或一致性的肽鏈：重鏈

   

   (SEQ ID NO.2)

   

   (SEQ ID NO.3)

   

   (SEQ ID NO.4)

   

   (SEQ ID NO.5)

   

   (SEQ ID NO.6)由此產生組織靶向性螯合劑；及c)使該組織靶向性螯合劑與包含α-發射性釷同位素²²⁷Th之4⁺離子的水性溶液接觸。
2. 如請求項1之方法，其中R_C為：[-CH₂-Ph-N(H)-C(=O)-CH₂-CH₂-C(=O)OH]，[-CH₂-CH₂-N(H)-C(=O)-(CH₂-CH₂-O)_1-3-CH₂-CH₂-C(=O)OH]或[-(CH₂)_1-3-Ph-N(H)-C(=O)-(CH₂)_1-5-C(=O)OH]，其中Ph為伸苯 基。
3. 如請求項1之方法，其中Ph為對伸苯基。
4. 如請求項1之方法，其中步驟b)係在水性溶液中進行。
5. 如前述請求項1或2之方法，其中該醯胺偶合試劑為碳化二亞胺偶合劑。
6. 如前述請求項1或2之方法，其中該醯胺偶合試劑為1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)、N,N'-二異丙基碳化二亞胺(DIC)或N,N'-二環己基碳化二亞胺(DCC)。
7. 如前述請求項1或2之方法，其中步驟b)係在pH介於4與9之間的水性溶液中進行。
8. 如前述請求項1或2之方法，其中步驟b)係在15℃與50℃之間進行5分鐘至120分鐘。
9. 如前述請求項1或2之方法，其中步驟c)係在15℃與50℃之間進行1分鐘至60分鐘。
10. 如前述請求項1或2之方法，其中R_C為[-(CH₂)_1-3-對伸苯基-N(H)- C(=O)-(CH₂)_1-5-C(=O)OH]。
11. 如前述請求項1或2之方法，其中R_C為[-(CH₂)-對伸苯基-N(H)-C(=O)-(CH₂)₂-C(=O)OH]。
12. 如前述請求項1或2之方法，其中該組織靶向性部分體包含與該序列1具有序列一致性的肽鏈：輕鏈

    

    (SEQ ID NO.1)及與序列2具有98%或更高序列相似性或一致性的肽鏈：重鏈

    

    (SEQ ID NO.2)。
13. 一種藉由如請求項1至12中任一項之方法形成或可形成之組織靶向性釷錯合物。
14. 如請求項13之組織靶向性釷錯合物，其包含下述化合物

    

    其中

    

    代表組織靶向性部分體，其包含不具有C端離胺酸之曲妥珠單抗(trastuzumab)；及α-發射性釷放射性核種諸如²²⁷Th之4⁺離子。
15. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至14中任一項定義之至少一種組織靶向性釷錯合物。
16. 如請求項15之醫藥調配物，其進一步包含檸檬酸鹽緩衝液。
17. 如請求項15或16之醫藥調配物，其進一步包含對胺基丁酸(PABA)及視情況選用之EDTA及/或至少一種聚山梨醇酯。
18. 一種如請求項1至14中任一項定義之組織靶向性釷錯合物或如請求項15至17中任一項之醫藥調配物的用途，其用於製造供治療增生性或贅生性疾病用之藥劑。
19. 如請求項18之用途，其中該疾病係選自：胃癌、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及子宮癌。
20. 如請求項13或14之組織靶向性釷錯合物，其用於治療胃癌、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及子宮癌。
21. 如請求項15或16之醫藥調配物，其用於治療胃癌、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLC)及子宮癌。
22. 一種套組，其包含：i)如請求項1至3、10及11中定義之八牙螯合劑；ii)如請求項1或12中定義之至少一種組織靶向性部分體；iii)至少一種醯胺偶合試劑；及iv)視情況選用且較佳的α-發射性釷放射性核種，諸如²²⁷Th。