TWI754345B - 山竹發酵液用於製備美肌及/或減脂組合物的用途 - Google Patents
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Abstract
一種山竹發酵液的用途，其用於製備一組合物。此組合物具有下列一種或多種功能：提升抗氧化活性、抑制糖化終產物形成、抑制酪胺酸酶形成、抑制脂肪累積、減少受體的體脂肪以及改善肌膚狀況。並且，此山竹發酵液是由一山竹培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。
Description
本發明是關於山竹相關產品，特別是關於山竹發酵液用於製備美肌及/或減脂組合物的用途。
自有機及天然的飲食概念興起後，生技公司及食品業者積極投入關於天然植物的相關產品之研發。為使植物相關產品對身體健康助益有科學驗證的基礎，植物的活性成分分析及功效評估成為產品開發的重點項目。而原產於東南亞地區的山竹（Garcinia mangostana）亦成為研究開發的對象之一。
在一實施例中，一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以提升抗氧化活性的組合物。其中，山竹發酵液是由一山竹培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。山竹培養液包括山竹及水，且山竹與水的比例為1:2-5。相對於山竹培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一實施例中，一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以抑制糖化終產物形成的組合物。其中，山竹發酵液是由一山竹培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。山竹培養液包括山竹及水，且山竹與水的比例為1:2-5。相對於山竹培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一實施例中，一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以抑制酪胺酸酶形成的組合物。其中，山竹發酵液是由一山竹培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。山竹培養液包括山竹及水，且山竹與水的比例為1:2-5。相對於山竹培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一實施例中，一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以抑制脂肪累積的組合物。其中，山竹發酵液是由一山竹培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。山竹培養液包括山竹及水，且山竹與水的比例為1:2-5。相對於山竹培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一實施例中，一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以減少一受體的體脂肪的組合物。其中，山竹發酵液是由一山竹培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。山竹培養液包括山竹及水，且山竹與水的比例為1:2-5。相對於山竹培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一實施例中，一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以改善肌膚狀況的組合物。其中，山竹發酵液是由一山竹培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。山竹培養液包括山竹及水，且山竹與水的比例為1:2-5。相對於山竹培養液，複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
綜上所述，根據本發明任一實施例的山竹發酵液，其可製備美肌及/或減脂的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：提升抗氧化活性、抑制糖化終產物形成、抑制酪胺酸酶形成、抑制脂肪累積、減少受體的體脂肪以及改善肌膚狀況。
關於本文中所使用之濃度符號「%」通常是指重量百分濃度，而濃度符號「vol%」通常是指體積百分濃度。關於本文中所使用之「山竹」通常是指山竹果實。
在一些實施例中，山竹發酵液是由山竹培養液與及複數菌種進行一發酵程序所得。其中，山竹培養液包括山竹及水。在山竹培養液中，山竹與水的比例為1:2-5。在發酵程序中，相對於山竹培養液，此些菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
在一些實施例中，酵母菌可以是啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。在一些實施例中，乳酸菌可以是胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）或植物乳桿菌。在一些實施例中，醋酸菌可以是乙酸醋酸菌（Acetobacter aceti）。
在一些實施例中，在發酵程序中，先添加0.01%-0.5%的酵母菌至山竹培養液內，並將山竹培養液與酵母菌進行發酵1日至3日以形成第一初發酵液。換言之，0.01%-0.5%的酵母菌與山竹培養液混合成的第一混合液進行發酵1日至3日以形成第一初發酵液。在一些實施例中，第一混合液是在28℃-37℃下進行發酵。
於第一初發酵液形成後，再添加0.01%-0.25%乳酸菌至第一初發酵液內，並將第一初發酵液與乳酸菌進行發酵1日至5日以形成第二初發酵液。換言之，0.01%-0.25%乳酸菌與第一初發酵液混合成的第二混合液進行發酵1日至5日以形成第二初發酵液。在一些實施例中，第二混合液是在28℃-37℃下進行發酵。
於第二初發酵液形成後，再添加1%-15%的醋酸菌至第二初發酵液內，並將第二初發酵液與醋酸菌進行發酵3日至10日以形成第三初發酵液。換言之，1%-15%的醋酸菌與第二初發酵液混合成的第三混合液進行發酵3日至10日以形成第三初發酵液。在一些實施例中，第三混合液是在28℃-37℃下進行發酵。
於第三初發酵液形成後，過濾第三初發酵液以得到山竹發酵液。在第一示範例中，第三初發酵液的過濾步驟包括以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第三初發酵液。在第二示範例中，第三初發酵液的過濾步驟包括在40℃至70℃下減壓濃縮及以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第三初發酵液。在第三示範例中，第三初發酵液的過濾步驟包括在40℃至70℃下減壓濃縮及以200目數至400目數的網孔的濾網過濾第三初發酵液以得到一發酵原液，以及調整發酵原液的糖度（Degrees Brix）以形成山竹發酵液。
在一些實施例中，可透過添加55%-70%的賦形劑（excipient）來調整發酵原液的糖度。在一些實施例中，用以調整糖度的賦形劑可為異麥芽寡糖。
在一些實施例中，山竹發酵液的pH值為3.7±1.0，且山竹發酵液的糖度為40±2。
在一些實施例中，山竹發酵液的多酚含量為691ppm。
在一些實施例中，山竹培養液的製備方法如下。首先，將山竹打碎以形成山竹顆粒，然後將山竹顆粒與水以1：2-5的比例混合以得到原料混合液。接著，將得到的原料混合液進行一滅菌程序以得到山竹培養液（亦可稱之為山竹萃取液）。
在一些實施例中，於此所選用的山竹可為帶殼的全果。換言之，山竹全果連果殼一起打碎成山竹顆粒。在一些實施例中，於此所選用的山竹可為成熟可食用的山竹果實。在一些實施例中，山竹顆粒的粒徑可為12mm（公厘）以下。
在一些實施例中，原料混合液的滅菌程序可為將原料混合液在80℃至100℃下滅菌0.2小時至1小時，並將滅菌後的原料混合液冷卻至室溫（即25℃至30℃）以形成山竹培養液。在一些實施例中，滅菌後的原料混合液可採取自然降溫的方式冷卻至室溫。
在一些實施例中，山竹發酵液具有美肌及/或減脂之作用。在一些實施例中，山竹發酵液能透過減少一受體的體脂肪來達成減脂的作用。在一些實施例中，山竹發酵液能透過改善一受體的肌膚狀況來達成美肌的作用。在一些示範例中，改善受體的肌膚狀況可為提升受體的肌膚含水量、降低受體的深層斑、減少受體的皺紋、減少受體的肌膚紋理或其組合。在一些實施例中，山竹發酵液能透過下列一種或多種細胞層面的作用來達成美肌及/或減脂之作用：提升抗氧化活性、抑制糖化終產物形成、抑制酪胺酸酶形成、以及抑制脂肪累積。其中，受體可為人。
在一些實施例中，山竹發酵液能用於製備用以提升抗氧化活性的組合物。
在一些實施例中，山竹發酵液能用於製備用以抑制糖化終產物形成的組合物。
在一些實施例中，山竹發酵液能用於製備用以抑制酪胺酸酶形成的組合物。
在一些實施例中，山竹發酵液能用於製備用以抑制脂肪累積的組合物。
在一些實施例中，山竹發酵液能用於製備用以減少一受體的體脂肪的組合物。
在一些實施例中，山竹發酵液能用於製備用以改善肌膚狀況的組合物。其中，改善肌膚狀況可為提升肌膚含水量、降低深層斑、減少皺紋、減少肌膚紋理或其組合。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為醫藥品。換言之，此醫藥品包含有效含量的山竹發酵液。
在一些實施例中，前述之醫藥品可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成適合於經腸道地、非經腸道地（parenterally）、口服地、或局部地（topically）投藥劑型。
在一些實施例中，經腸道或口服的投藥劑型可為，但不限於，錠劑（tablet）、片劑（troche）、口含錠（lozenge）、丸劑（pill）、膠囊（capsule）、分散性粉末（dispersible powder）或細顆粒（granule）、溶液、懸浮液（suspension）、乳劑（emulsion）、糖漿（syrup）、酏劑（elixir）、濃漿（slurry）或類似之物。在一些實施例中，非經腸道地或局部地投藥劑型可為，但不限於，注射品（injection）、無菌的粉末（sterile powder）、外部製劑（external preparation）或類似之物。在一些實施例中，注射品的投藥方式可為皮下注射（subcutaneous injection）、表皮內注射（intraepidermal injection）、皮內注射（intradermal injection）或病灶內注射（intralesional injection）。
在一些實施例中，前述之醫藥品可包含被廣泛地使用於藥物製造技術之醫藥上可接受的載劑（pharmaceutically acceptable carrier）。在一些實施例中，醫藥上可接受的載劑可為下列載劑中一種或多種：溶劑（solvent）、緩衝液（buffer）、乳化劑（emulsifier）、懸浮劑（suspending agent）、分解劑（decomposer）、崩解劑（disintegrating agent）、分散劑（dispersing agent）、黏結劑（binding agent）、賦形劑、安定劑（stabilizing agent）、螯合劑（chelating agent）、稀釋劑（diluent）、膠凝劑（gelling agent）、防腐劑（preservative）、潤濕劑（wetting agent）、潤滑劑（lubricant）、吸收延遲劑（absorption delaying agent）、脂質體（liposome）以及類似之物。關於選用之載劑的種類與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。在一些實施例中，作為醫藥上可接受的載劑的溶劑可為水、生理鹽水（normal saline）、磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS）、或含有醇的水性溶液（alcohol containing aqueous solution ）。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為食用組合物。換言之，食用組合物包含特定含量的山竹發酵液。在一些實施例中，前述之食用組合物可為食品產品或食品添加物（food additive）。在一些實施例中，食品產品可為但不限於：飲料（beverages）、發酵食品（fermented foods）、烘培產品（bakery products）、健康食品（health foods）或膳食補充品（dietary supplements）。
在一些實施例中，前述之食用組合物可以口服方式施予受體。其中，食用組合物的型態可為粉末、顆粒、溶液、膠體或膏體。
在一些實施例中，前述之任一組合物可為化妝品或保養品。換言之，化妝品或保養品包含特定含量的山竹發酵液。
在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可為下列任一種型態：化妝水、凝膠、凍膜、泥膜、乳液、乳霜、唇膏、粉底、粉餅、蜜粉、卸妝油、卸妝乳、洗面乳、沐浴乳、洗髮精、護髮乳、防曬乳、護手霜、指甲油、香水、精華液及面膜。在一些實施例中，前述之化妝品或保養品可視需要更包含外用品可接受成分。在一些實施例中，外用品可接受成分可例如為乳化劑、滲透促進劑、軟化劑、溶劑、賦型劑、抗氧化劑、或其組合。
例一：山竹發酵液的製備
首先將山竹全果（含殼）打碎成粒徑12mm以下的山竹顆粒。將山竹顆粒與水以1:3的比例混合均勻以得到原料混合液。然後，將原料混合液在約100℃下滅菌0.5小時，並將滅菌後的原料混合液冷卻至約30℃以得到山竹培養液。
於山竹培養液中殖入0.1%啤酒酵母（購自食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC)，寄存編號BCRC20271）並在約30℃下發酵1天，以得到第一初發酵液。接著，於第一初發酵液中殖入0.05%胚芽乳酸桿菌（購自BCRC，寄存編號BCRC910760）並在約30℃下發酵1天，以得到第二初發酵液。最後，於第二初發酵液中殖入10%乙酸醋酸菌（購自BCRC，寄存編號BCRC11688）並在約30℃下發酵5天，以得到第三初發酵液。
再將第三初發酵液在約60℃下進行減壓濃縮並以目數的網孔的濾網過濾，以得到發酵原液。最後，添加60%異麥芽寡糖至發酵原液後進行滅菌，以得到山竹發酵液。
於此，分別對山竹培養液、發酵原液以及山竹發酵液進行糖度檢測。其中，山竹培養液的糖度約為10.6，發酵原液的糖度約為3.9，以及山竹發酵液的糖度約為40。
例二：總多酚含量測試
秤取10.0mg的沒食子酸（Gallic acid）置於10mL容量瓶中，然後以水（H2
O）定量至10mL，以得到沒食子酸的儲備溶液（stock solution）。將沒食子酸的儲備溶液稀釋10倍，即100μL沒食子酸的儲備溶液加900μL的水，以得到100μg/mL沒食子酸的初始溶液（即含1000ppm的沒食子酸）。然後，依據下表一配置0μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、及100μg/mL之沒食子酸的標準溶液，並分別取100μL之各濃度的標準溶液至玻璃試管中。加入500μL之福林酚試劑（Folin-Ciocalteu's phenol reagent，購自Merck）至各玻璃試管內與標準溶液混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到標準反應溶液。取200μL之標準反應溶液至96孔板中，並測量其在750nm下之吸光值，以獲得標準曲線。
表一
| 標準溶液（μg/mL） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 初始溶液（μL） | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 |
| 水（μL） | 100 | 80 | 60 | 40 | 20 | 0 |
分別以例一中所得到的山竹培養液與發酵原液作為樣本。將各樣本取100mL到玻璃試管中。接著，加入500μL之福林酚試劑至玻璃試管中與樣本混合均勻並靜置3分鐘後，再加入400μL之7.5%碳酸鈉混合均勻後反應30分鐘以得到待測反應溶液。將裝有待測反應溶液的玻璃試管進行震盪以確保無氣泡後，取200μL之待測反應溶液至96孔板中，並測量待測反應溶液於750nm下之吸光值。
接著，各樣本對應的待測反應溶液的吸光值先除以樣本的糖度，再利用標準曲線以內插法換算成總多酚含量。於此，可得到山竹培養液的總多酚含量為334ppm及山竹發酵液的總多酚含量為691ppm，如圖1所示。由此可知，山竹透過微生物發酵後，可增加總多酚含量2.1倍。即，相對於山竹培養液，山竹酵素液能提升抗氧化活性。
例三：抗醣化測試
以200mM磷酸鈉緩衝液（Sodium phosphate buffer，pH7.4）、疊氮化鈉（Sodium azide，NaN3
）與牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，品牌：Gibco）配置含有0.06%NaN3
的60mg/mL BSA溶液。
以200mM磷酸鈉緩衝液與D果糖（D-(-)-Fructose，C6
H12
O6
）配置1.5M D-fructose溶液。
以200mM磷酸鈉緩衝液與氨基胍鹽酸鹽（Aminoguanidine hydrochloride，AG，CH6
N4
•HCl）配置3mM AG溶液。
取0.25mL例一中所得到的山竹發酵液加入0.25mL BSA溶液與D-fructose溶液並均勻混合以得到實驗組的待測溶液。
取0.25mL之3mM AG溶液加入0.25mL BSA溶液與D-fructose溶液並均勻混合以得到控制組的待測溶液。
取0.1mL各組別的待測溶液作為各組別的零點溶液。使用螢光分光光度計（Thermo Fisher Scientific）對0.1mL各組別的零點溶液以360nm之激發光以及460nm之放射光測定其螢光值，以得到反應前之零點之螢光值。
取0.45mL各組別的待測溶液於50℃下培養24小時，以得到各組別的終點溶液。取0.1mL各組別的終點溶液並使用螢光分光光度計對0.1mL各組別的終點溶液以360nm之激發光以及460nm之放射光測定其螢光值，以得到反應之終點之螢光值。
然後根據下列公式(1)計算各組別的相對糖化終產物（Advanced Glycation End products，AGEs）的形成量（%），以得知其抗醣化活性（Antiglycative activity）。換言之，於此，是將控制組的AGEs形成量視為1（即控制組的相對AGEs形成量為100%）來計算各組別的相對AGEs形成量（%）。
AGEs形成量(％)＝
(1)
其中，Fluorescence sample24hr
代表實驗組的終點之螢光值，Fluorescence sample0hr
代表實驗組的零點之螢光值，Fluorescence control24hr
代表控制組的終點之螢光值，Fluorescence control0hr
代表控制組的零點之螢光值。
參照圖2，相較於控制組，實驗組明顯減少70%的糖化終產物的形成量。由此可知，山竹發酵液能有效抑制糖化終產物的形成，即具有抗醣化的作用。
例四：黑色素含量檢測
於此，所使用的細胞培養基為添加有1vol%盤尼西林-鏈黴素（penicillin/streptomycin，品牌：Gibco）及10vol%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS，品牌：Gibco）之杜貝可氏改良的依格氏培養基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM，品牌：Gibco）。
首先，以每孔1.5×105
個細胞的細胞數，將小鼠黑色素瘤細胞株B16F10（購自美國典型培養物保存中心(ATCC)，編號CRL-6475）接種於含有3mL細胞培養基的6孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養24小時。
在培養24小時後，將B16F10細胞分成4個組別：二個實驗組（即實驗組A與實驗組B）、一個對照組以及一個控制組。移除各組別的細胞培養基，並更換成每孔3mL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養48小時。其中，實驗組A的實驗培養基為含有0.125vol%例一中所得到的山竹發酵液的細胞培養基。實驗組B的實驗培養基為含有0.125vol%例一中所得到的山竹培養液的細胞培養基。對照組的實驗培養基為含有0.125mg/mL麴酸（kojic acid）的細胞培養基。控制組的實驗培養基為單純的細胞培養基（即不含山竹發酵液、不含山竹培養液，也不含麴酸）。
於培養48小時後，移除各孔中的實驗培養基並以1倍（1x）的磷酸鹽緩衝液（phosphate buffered saline，PBS，品牌：Gibco）潤洗二次。於沖洗後，將胰蛋白酶（trypsin）加入至各孔中以處理細胞3分鐘。於3分鐘處理後，將各孔的懸浮的細胞個別收集於15mL離心管中，接而以400xg離心5分鐘以分離細胞沉澱物（cell pellet）與上清液。透過1xPBS再懸浮細胞沉澱物及離心反覆進行二次後，以200μL的1xPBS再懸浮細胞沉澱物，以得到細胞溶液。接著，將細胞溶液於液態氮中放置10分鐘，接而於室溫下靜置30分鐘進行解凍。在解凍完全之後，各離心管以12,000xg離心30分鐘。於30分鐘離心後，移除各離心管中上清液並添加入120μL 1N NaOH（配於ddH2
O）以與各離心管中的沉澱物進行混合。在混合均勻之後，將含有混合溶液的各離心管於60℃乾浴槽中靜置1小時。之後，從各離心管中取100μL混合溶液至96孔培養盤中並於450nm的波長下以ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay，酵素結合免疫吸附法）讀取儀（廠牌：BioTek）來讀取96孔培養盤中各孔的吸光值（OD450）。
於量測後，藉由將所測得的吸光值代入下列公式(2)而計算出相對黑色素含量（%）。換言之，於此，是將控制組的黑色素含量視為1（即控制組的相對黑色素含量為100%）來計算各組別的相對黑色素含量（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗（student t-test）來統計分析，如圖3所示。在圖3中，「*」代表在與控制組比較下其p值小於0.05，「**」代表在與控制組比較下其p值小於0.01，「***」代表在與控制組比較下其p值小於0.001，以及「▲▲▲」代表在與對照組比較下其p值小於0.001。
相對黑色素含量(%)＝(OD450 sample/OD450 control)×100% (2)
其中，OD450 sample代表欲換算之組別的吸光值，而OD450 control代表控制組的吸光值。
參照圖3，相較於控制組，實驗組A的黑色素含量有顯著地降低，且其可降低21.58%的黑色素生成。並且，相較於對應濃度的麴酸，實驗組A的黑色素含量亦有顯著地降低，且其可降低21.58%的黑色素生成。相較於實驗組B，實驗組A亦可降低1.0%的黑色素生成。由此可知，山竹發酵液能有效抑制黑色素生成，即有效地抑制酪胺酸酶形成，具有美白之功效。
例五：脂肪累積檢測
於此，所使用的前脂肪細胞增殖培養基（pre-adipocyte expansion medium）為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之最低必需培養基α（Minimum Essential Medium Alpha，MEMα，品牌：Gibco)。所使用的分化培養基（differentiation medium）為添加有20vol% FBS（品牌：Gibco）及1vol%盤尼西林-鏈黴素之MEMα（品牌：Gibco)。並且，將油-紅O染色試劑（品牌：Sigma）徹底溶解於100%異丙醇（isopropanol，供應商：ECHO）以配製3mg/mL之油-紅O染色試劑的儲備溶液。為獲得可供使用的油-紅O工作溶液（oil-red O working solution），於使用前即時將油-紅O染色試劑的儲備溶液以二次水（ddH2O）稀釋至濃度1.8mg/mL，即為60%油-紅O染色試劑的儲備溶液。
首先，以每孔8×104
個細胞的細胞數，將小鼠骨髓基質細胞株OP9（購自ATCC，編號CRL-2749）接種於含有500μL前脂肪細胞增殖培養基的24孔培養盤的各孔中，並置於37°C下培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL分化培養基。於培養7天後，使用顯微鏡（廠牌：ZEISS）觀察各孔中的細胞內的油滴（lipid droplet）形成以確認細胞完全分化成脂肪細胞，供後續實驗使用。
在培養24小時後，將脂肪細胞分成3個組別：二個實驗組（即實驗組A與實驗組B）以及控制組。移除各組別的分化培養基，並更換成每孔500μL實驗培養基，然後置於37°C下接續培養7天。於7天的培養期間，每3天更換一次新鮮的500μL實驗培養基。其中，實驗組A的實驗培養基為含有0.0625vol%例一中所得到的山竹發酵液的分化培養基。實驗組B的實驗培養基為含有0.0625vol%例一中所得到的山竹培養液的分化培養基。控制組的實驗培養基為單純的分化培養基（即不含山竹發酵液）。
接著，移除各孔中的實驗培養基並以1xPBS潤洗二次。繼而，於各孔內添加1mL的10%甲醛（formaldehyde，供應商：ECHO）並於室溫下培養30分鐘，藉以固定細胞。之後，移除各孔內的甲醛並以1mL PBS對各孔潤洗二次。於再次潤洗後，添加1mL的60%異丙醇至每孔中並作用1分鐘。接著，移除異丙醇，再添加1mL油-紅O工作溶液並於室溫下作用1小時。
於作用1小時候，移除油-紅O工作溶液並以1mL的60%異丙醇快速退染5秒。於退染後，染色後的細胞以1xPBS潤洗後，加入100%異丙醇至各孔中，並置於振盪器（shaker）上反應10分鐘以溶解染劑。然後，從各孔中取100μL前述之溶染劑-異丙醇溶液至96孔培養盤並於510nm的波長下以ELISA讀取儀（廠牌：BioTek）讀取各孔的吸光值（OD510）。
於量測後，藉由將所測得的吸光值代入下列公式(3)而計算出相對脂肪油滴量（%）。換言之，於此，是將控制組的脂肪油滴量視為1（即控制組的相對脂肪油滴量為100%）來計算各組別的相對脂肪油滴量（%）。並且，各組之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖4所示。在圖4中，「**」代表在與控制組比較下其p值小於0.01。
相對脂肪油滴量(%)＝(OD510 sample/OD510 control)×100% (3)
其中，OD510 sample代表欲換算之組別的吸光值，而OD510 control代表控制組的吸光值。
參照圖4，相較於控制組，實驗組A的相對脂肪油滴量有顯著地降低，且其可減少16.9%的油滴量。相較於實驗組B，實驗組A的相對脂肪油滴量亦有明顯下降，且其可減少8.7%的油滴量。由此可知，山竹發酵液能有效地抑制脂肪累積，具有減脂之功效。並且，山竹透過微生物發酵後可能產出較山竹培養液多的減脂活性成分。
例六：減脂瘦身之人體檢測
令8位肥胖受試者（即其體脂率大於25%或BMI值大於24）每日飲用一瓶6mL山竹發酵飲料（其含有12vol%例1中所得到的山竹發酵液與88vol%水），連續飲用4週。並且，於飲用前（即第0週）及飲用4週後（即第4週），以體脂計（廠牌：TANITA BC-601FS）測量此些受試者全身體脂率，以及以布尺量測此些受試者的腰圍。並且，第0週的量測結果與第4週的量測結果之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖5及圖6所示。在圖5及圖6中，「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05。
參照圖5及圖6，相比飲用前（第0週），持續4週飲用山竹發酵飲料可使全身體脂率顯著地減少約0.4%，以及使腰圍顯著地減少約2.0公分。由此可知，長期使用山竹發酵液可改善肥胖者的脂肪累積指數，即山竹發酵液具瘦身減脂之功效。
例七：美肌之人體檢測
令8位胖受試者每日飲用一瓶6mL山竹發酵飲料（其含有12vol%例1中所得到的山竹發酵液與88vol%水），連續飲用6週。並且，於飲用前（即第0週）及飲用6週後（即第6週），以VISIA肌膚檢測儀（VISIA Complexion Analysis System，購自美國Canfield公司）及皮膚表面濕度測試儀（Corneometer CM825，購自德國C+K公司）檢測肌膚狀況。於此，以VISIA肌膚檢測儀量測肌膚深層斑點（褐斑）、肌膚皺紋及肌膚紋理，並且以皮膚表面濕度測試儀量測肌膚含水量。
於量測後，將第0週之肌膚狀況作為基準（即第0週之相對肌膚狀況為100%），計算第6週的相對肌膚狀況（%）。並且，第0週的相對肌膚狀況與第6週的相對肌膚狀況之間的統計學顯著差異是藉由學生t-試驗來統計分析，如圖7至圖10所示。在圖7至圖10中，「*」代表在與第0週比較下其p值小於0.05。
參照圖7至圖10，相比飲用前（第0週），持續6週飲用山竹發酵飲料可使肌膚深層斑點顯著地減少約8.5%，使肌膚皺紋減少約8.3%，使肌膚紋理減少約6.7%，以及使肌膚含水量顯著地增加約18.6%。由此可知，長期使用山竹發酵液可改善肌膚狀況，即山竹發酵液具美肌之功效。
綜上所述，根據本發明任一實施例的山竹發酵液，其可製備美肌及/或減脂的組合物。換言之，前述之組合物具有下列一種或多種功能：提升抗氧化活性、抑制糖化終產物形成、抑制酪胺酸酶形成、抑制脂肪累積、減少受體的體脂肪以及改善肌膚狀況。
無
圖1是繪示山竹發酵前與發酵後的總多酚含量的變化之長條圖。
圖2是繪示各組別的相對糖化終產物形成量之長條圖。
圖3是繪示各組別的相對黑色素含量之長條圖。
圖4是繪示各組別的相對脂肪累積量之長條圖。
圖5是繪示一示範例之山竹發酵液使用前與使用後的全身體脂率的變化之長條圖。
圖6是繪示一示範例之山竹發酵液使用前與使用後的腰圍的變化之長條圖。
圖7是繪示一示範例之山竹發酵液使用前與使用後的相對肌膚深層斑點的變化之長條圖。
圖8是一示範例之山竹發酵液使用前與使用後的相對肌膚皺紋的變化之長條圖。
圖9是一示範例之山竹發酵液使用前與使用後的相對肌膚紋理的變化之長條圖。
圖10是一示範例之山竹發酵液使用前與使用後的相對肌膚含水量的變化之長條圖。
Claims (9)
- 一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以抑制糖化終產物形成的組合物，其中該山竹發酵液是由一山竹培養液依序與醋酸菌、乳酸菌及醋酸菌進行三段發酵程序所得，其中該山竹培養液包括山竹及水，該山竹與該水的比例為1：2-5，以及相對於該山竹培養液，該複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
- 一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以抑制酪胺酸酶形成的組合物，其中該山竹發酵液是由一山竹培養液依序與醋酸菌、乳酸菌及醋酸菌進行三段發酵程序所得，其中該山竹培養液包括山竹及水，該山竹與該水的比例為1：2-5，以及相對於該山竹培養液，該複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
- 一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以抑制脂肪累積的組合物，其中該山竹發酵液是由一山竹培養液依序與醋酸菌、乳酸菌及醋酸菌進行三段發酵程序所得，其中該山竹培養液包括山竹及水，該山竹與該水的比例為1：2-5，以及相對於該山竹培養液，該複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
- 一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以減少一受體的體脂肪的組合物，其中該山竹發酵液是由一山竹培養液依序與醋酸菌、乳酸菌及醋酸菌進行三段發酵程序所得，其中該山竹培養液包括山竹及水，該山竹與該水的比例為1：2-5，以及相對於該山竹培養液，該複數 菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
- 一種山竹發酵液的用途，其是用於製備用以改善肌膚狀況的組合物，其中該山竹發酵液是由一山竹培養液依序與醋酸菌、乳酸菌及醋酸菌進行三段發酵程序所得，其中該山竹培養液包括山竹及水，該山竹與該水的比例為1：2-5，以及相對於該山竹培養液，該複數菌種包括0.01%-0.5%的酵母菌、0.01%-0.25%的乳酸菌及1%-15%的醋酸菌。
- 如請求項5所述的用途，其中改善該肌膚狀況為提升肌膚含水量、降低深層斑、減少皺紋、減少肌膚紋理或其組合。
- 如請求項1至6中的任一項所述的用途，其中該發酵程序包括：添加該酵母菌至該山竹培養液內；將該山竹培養液與該酵母菌進行發酵1日至3日以形成一第一初發酵液，其中該酵母菌為Saccharomyces cerevisiae；添加該乳酸菌至該第一初發酵液內；將該第一初發酵液與該乳酸菌進行發酵1日至5日以形成一第二初發酵液，其中該乳酸菌為Lactobacillus plantarum；添加該醋酸菌至該第二初發酵液內；將該第二初發酵液與該醋酸菌進行發酵3日至10日以形成一第三初發酵液，其中該醋酸菌為Acetobacter aceti；以及過濾該第三初發酵液以得到該山竹發酵液。
- 如請求項7所述的用途，其中該山竹發酵液的pH值為3.7±1.0，且該山竹發酵液的糖度為40±2。
- 如請求項1至6中的任一項所述的用途，其中該山竹發酵液的多酚含量為691ppm。
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| 查勇，抗氧化菌的篩選及抗氧化發酵飲料的研究，江南大學碩士論文，2009/03。 |
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