TWI751401B - 藥物增效劑用於防治感染性疾病及其相關慢性疾病及方法 - Google Patents

Abstract

本發明提供一系列醫藥組合物(PTM)用於防治傳染病，神經退化性疾 病，失智症，糖尿病，肥胖症，代謝綜合症，牙周炎，齲齒，骨質疏鬆症，癌症和/或慢性疼痛。其中該醫藥組合物(PTM)包含植多酚(P)、選擇性標靶之臨床藥物(T)以及金屬離子(M)。

Description

藥物增效劑用於防治感染性疾病及其相關慢性疾病及方法

本發明提供一系列醫藥組合物(具有廣效神經保護、抗菌及抗癌之作用，可應用於防治失憶症及感染症、糖尿病、肥胖症、代謝症候群及骨質疏鬆症，尤其是口腔牙周病，蛀牙及口腔癌症。本發明尤指廣效抗菌，抗癌，防治骨質疏鬆，代謝症候群及神經保護的使用及操作方法。

世界上許多慢性疾病如老化失憶症、肥胖症、糖尿病、骨質疏鬆症和癌症的盛行率越來越高，目前這些疾病大部分都還沒有能夠完全治癒的藥物[1,2]。近期研究結果顯示，失憶症、糖尿病、肥胖症與癌症的共同病因是[2-6](1)發炎、(2)氧化壓力、(3)粒腺體功能異常、(4)感染、(5)免疫功能失調。其中的關鍵在於口腔至腸道菌相與這些無法治癒疾病，具有密切關係[5-12]，目前由於抗生素的濫用，不但改變菌相，而且造成抗藥性的感染症，無藥可治，因此，研發新型抗菌劑是醫療領域最迫切的問題，急待解決。

我們實驗室30多年的研究，已經證明多酚類具有多功能藥理性質，特別是茶多酚(tea polyphenols,EGCG)、薑黃素(curcumin,C)及其他黃酮類(flavonoids如apigenin、quercetin)等等，它們均具有多功能的藥理性質如抗發炎、抗氧化、防癌、抗糖尿病、瘦身減肥，防治骨質疏鬆及慢性疾病，神經保護及抗菌等等[13-18]。除此之外，二價金屬離子如銅離子、錳離子、鋅離子、鍶離子和氧化硒，已證實對細胞膜鈣離子通透性、離子通道、ATPases及粒腺體具有調節功效，因此對於神經傳導物質的釋放有很大的調控作用，對細胞功能具有廣泛的調節作用。

關於失憶症的治療藥物中，Memantine是美國FDA核准的，但有幻想及眩暈等等副作用，我們曾經發表使用茶多酚EGCG併用Memantine，具有增益加強Memantine藥效(包括失憶症等等)之新療法[23-25]，並取得相關的美國專利(Pub.No.：US 2014/0094513)。

針對日益嚴重且尚無法治癒的慢性疾病(老化失憶症、糖尿病、肥胖症、骨質疏鬆症和癌症)，特別是具有多重抗藥性的感染疾病，我們的應對策略是開發多功能(pleiotropic effects)醫藥組合物的新療法。

本發明提供了用於抑制致病菌及/或預防及/或治療傳染病，神經退化性疾病，失智症，糖尿病，肥胖症，代謝綜合症，牙周炎，齲齒，骨質疏鬆症，癌症和/或慢性疼痛的醫藥組合物(PTM)，其包含多酚類化合物(P)、選擇性標靶之臨床藥物(T)，以及金屬離子(M)。

根據上述構想，多酚類化合物(P)包含至少一多酚選自茶多酚、薑黃素、茶黃素、芹菜素、槲皮素、單寧酸、兒茶素、綠原酸、異黃酮、花青素、可可多酚、檸檬黃素、芸香苷，川芎嗪及白藜蘆醇組成的群組。

根據上述構想，選擇性標靶之臨床藥物(T)包含至少一藥物選自受體促效劑、受體拮抗劑、膜離子通道調節劑、膜離子轉運蛋白、粒線體功能調節劑及抗生素組成的群組。

根據上述構想，選擇性標靶之臨床藥物包含至少一藥物選自NaF(氟化鈉)、明美丁(memantine)、二甲雙胍(metformin)、甲硫達嗪(Thioridazine)、酚塞素(chlorpromazine)、托普黴素(tobramycin)、利福平(rifampin)、鏈黴素(streptomycin)、異菸鹼醯胼錠(isoniazide)、維拉帕米(verapamil)、地爾硫卓(diltiazem)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、二丁卡因(dibucaine)、洋地黄(digitonin)、多粘菌素B(polymycin B)、順鉑(cisplatin)、地喹氯銨(dequalinium)、4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)、羥基乙叉二磷酸(etidronate)、格列本脲(glibenclamide)和3,4-二氨基吡啶(3,4-diaminopyridine)組成的群組。

根據上述構想，金屬離子包含至少一金屬離子選自銅離子、錳離子、鋅離子、釩離子、鍶離子、氧化硒、銀離子及釕紅(ruthenium red，RuR)組成的群組。

根據上述構想，致病菌包含至少一病菌選自牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、鏈球菌屬(Streptococcus mutans)、大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)以及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等等組成的群組。

根據上述構想，多酚類化合物與選擇性標靶之臨床藥物之濃度比例為1：0.1-3。

根據上述構想，多酚類化合物、選擇性標靶之臨床藥物以及金屬離子相互作用下具有協同(增效，synergism)作用。

一方面，本發明提供了一種用於抗病原體的抗微生物作用和/或用於預防和治療傳染病、神經退化性疾病、失智症、糖尿病、肥胖症、代謝綜合症、骨質疏鬆症、牙周炎、齲齒、癌症和/或慢性疼痛的方法，其包含給予個體治療有效劑量之多酚類化合物、選擇性標靶之臨床藥物，以及金屬離子，其中多酚類化合物、選擇性標靶之臨床藥物以及金屬離子相互作用下具有協同(增效)作用。

根據上述構想，多酚類化合物包含至少一多酚選自茶多酚、薑黃素、茶黃素、芹菜素、槲皮素、單寧酸、兒茶素、綠原酸、異黃酮、花青素、可可多酚、檸檬黃素、芸香苷及白藜蘆醇組成的群組。

根據上述構想，選擇性標靶之臨床藥物包含至少一藥物選自受體促效劑、受體拮抗劑、膜離子通道調節劑、膜離子轉運蛋白及粒線體功能調節劑組成的群組。

根據上述構想，選擇性標靶之臨床藥物包含至少一藥物選自NaF(氟化鈉)、明美丁(memantine)、二甲雙胍(metformin)、甲硫達嗪(Thioridazine)、酚塞素(chlorpromazine)、托普黴素(tobramycin)、利福平(rifampin)、鏈黴素(streptomycin)、異菸鹼醯胼錠(isoniazide)、維拉帕米(verapamil)、地爾硫卓(diltiazem)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol)、二丁卡因(dibucaine)、洋地黄(digitonin)、多粘菌素B(polymycin B)、順鉑(cisplatin)、地喹氯銨(dequalinium)、4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)、羥基乙叉二磷酸 (etidronate)、格列本脲(glibenclamide)和3,4-二氨基吡啶(3,4-diaminopyridine)組成的群組。

根據上述構想，金屬離子包含至少一金屬離子選自銅離子、錳離子、鋅離子、釩離子、鍶離子、氧化硒、銀離子及釕紅組成的群組。

根據上述構想，致病菌包含至少一病菌選自牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、鏈球菌屬(Streptococcus mutans)、大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)以及金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)組成的群組。

根據上述構想，多酚類化合物與選擇性標靶之臨床藥物之濃度比例為1：0.1-3。

本發明將藉由以下實施例和描述，使所述技術領域具有通常知識者更容易理解本案所公開的前述內容、其它特性與多數優點。

圖一為新方案(藥物組合物)增強羅伊氏乳桿菌生長。

圖二為新方案(藥物組合物)增加了培養的前成骨細胞MC3T3-E1的鹼性磷酸酶(ALP)和ARS礦物質含量。

圖三為新方案(藥物組合物)降低培養的破骨細胞RAW細胞的抗酒石酸酸性去磷酸酶活性(tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP)activities)。

圖四A為新方案(藥物組合物)對培養神經瘤母細胞的H₂O₂細胞毒性的神經保護作用，向培養的細胞中加入10分鐘的H₂O₂後的結果。

圖四B為新方案(藥物組合物)對培養神經瘤母細胞的H₂O₂細胞毒性的神經保護作用，向培養的細胞中加入30分鐘的H₂O₂後的結果。

圖五A為新方案(藥物組合物)對口服藥物後的小鼠運動行為的影響，其中小鼠總移動數據。

圖五B為新方案(藥物組合物)對口服藥物後的小鼠運動行為的影響，其中小鼠休息時間數據。

本發明公開了用於提供一系列藥物組合物的方法和組合物及其用途。參考以下實施方案和描述，本領域技術人員將能夠實施本發明。

基於上述疾病發病機制中涉及的主要常見致病因素(炎症、氧化應激反應、粒線體代謝功能障礙、免疫功能障礙和感染)[1-6]，我們開發了新的防治方案”PTM”，其具有化學(多酚與金屬離子間的複雜組合)和藥理學相互作用的優勢，導致它們之間具有協同增益作用(抗氧化、抗發炎、抗微生物和神經保護)[23-25]；P：植物多酚；T：具有選擇性靶向的臨床藥物，如受體促效劑或拮抗劑、離子通道調節劑、膜離子轉運蛋白、粒線體功能調節劑、抗生素等；M：Cu，Mn，Zn，VO₄，Sr，SeO₃ ^-2，Ag，Ge132，釕紅(ruthenium red，RuR)等金屬。

病原菌培養

厭氧菌鏈球菌屬(S.m.,UA159)和牙齦卟啉單胞菌(P.g.)是分別在BHI培養基(BHI,Becton Dickinson,Sparks,MD)與Wilkins-Chalgren Anaerobe培養基中所培養，厭氧培養箱溫度為37±0.5℃，並含有10% H2、5% CO2和85% N2(Forma Scientific Inc.,Marietta,OH,USA)[26]。

其他四種病原菌包括大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(P.a.)、枯草桿菌(B.s.)、金黃色葡萄球菌(S.a.)和益生菌洛德乳酸桿菌(L.r.)是以37±0.5℃有氧培養。

藥物對病原菌增生之抑菌效果

在一實施例中，培養病原菌之增生率是由酵素免疫分析測讀儀所讀取，光學密度為600nm(OD600)。經過16小時的培養後，培養病原菌的OD600數值調整至約0.55，此時細菌濃度約為1.7x10⁹CFU/ml。然後以培養液稀釋10⁶倍含菌量為1.7x10³CFU/ml，在96孔微盤中添加不同濃度的藥物(10μl/well)至90μl/well的稀釋病原菌，藉由OD600數值的改變評估此藥物對細菌增生的影響。對照組以賦形劑鹽水處理，藥物處理組之OD600值，與對照的OD600值計算百分比[26]。

本實驗是以一式三重覆進行。該藥物之抑菌效果是透過抑制濃度曲線進行定量，並計算每種藥物達50%抑制(IC₅₀)的濃度。

細胞培養

細胞培養基(RPMI)和補充物購自Sigma(St.Louise，USA)。所有培養基均添加以熱滅菌的胎牛血清FBS(JRH Biosciences或Hyclone，Thermo Scientific)[19-20]。

OECM-1(口腔鱗狀細胞癌細胞)，SG(牙齦上皮細胞)，RAW(前破骨細胞)和SHSY5Y(神經母細胞瘤)在CO₂(5%)，37±0.2℃的環境下培養。MC3T3-E1(前成骨細胞)細胞培養於生長培養基α-MEM(含有10%FBS，2mM L-谷氨酰胺和20mM HEPES，10mM(毫莫耳每升)β-甘油磷酸鹽和50mg/L(毫克/升)抗壞血酸)。所有細胞均在37±0.2℃和5%CO₂下培養。

鹼性去磷酸酶測定和茜素紅礦素含量檢測

MC3T3-E1細胞的鹼性去磷酸酶(ALP)活性藉由基質8mM對硝基苯基磷酸酯(PNPP)與ALP在Na₂CO₃緩衝液(pH10)中的反應產物硝 基酚(nitrophenol)，於37±0.5℃下測量30分鐘後，測量OD405nm值的變化[27]。

通過與茜素紅(ARS)的反應測量MC3T3-E1細胞的礦物質含量並以OD562nm定量[27]。

抗酒石酸酸性去磷酸酶(TRAP)測定

RAW細胞的TRAP活性經由p-硝基酚(p-nitrophenol)的產生來測量，在基質8mM PNPP(對硝基苯基-磷酸酯)經含有40mM酒石酸鈉(Na tartrate)的0.1M乙酸鈉(Na acetate)(pH5.7)，在37±0.5℃下培育30分鐘後測定405nm的吸光度[28]。

以培養神經母細胞瘤細胞(SHSY5Y)測定藥物對H₂O₂氧化細胞毒性的神經保護作用

通過MTT試驗測定對照H₂O₂在0.5，1和3mM對37±0.5℃SHSY5Y細胞24小時的細胞毒性作用，並以%和以載體處理的細胞對照。

通過在施加1mM H₂O₂後10分鐘或30分鐘再添加藥物，來檢測藥物的神經保護作用，並且通過MTT測試測量的細胞存活率，與僅用1mM H₂O₂處理的細胞存活率進行比較[29.30]。

TruScan photobeam Tracking(動物運動量測定裝置)

TruScan photobeam Tracking用於記錄小鼠的行為(在邊緣和中心區域的步行距離，跳躍的次數，休息時間和行走的總時間)，以計算我們之前報導的情緒變化[31，32]。抑鬱小鼠的追踪活動表現出有限的中心區步行距離；而正常小鼠在邊緣和中心區域步行距離均勻分佈。此外，跳躍和站立的計數顯示了正常小鼠的探索和好奇行為。

藥物之製備

茶多酚(TP)之準備

在部分實施例中，將茶多酚分離[13,15]，將100g的綠茶或紅茶(由台灣台北有記名茶公司生產)懸浮於75±0.5℃ 1公升的蒸餾水中30分鐘，接著收集上層液，此步驟會重複三次。過濾該上層液以去除葉綠素和未溶解的粒子。總水層在使用旋轉真空蒸發器減壓下濃縮至0.5公升。濃縮溶液利用等體積的三氯甲烷(氯仿)萃取三次，以去除咖啡因與色素。然後將剩餘的水層用等體積的乙酸乙酯萃取三次以萃取茶多酚。將茶多酚在乙酸乙酯中合併，並真空蒸發。將殘留物溶於少量蒸餾水中並冷凍乾燥。這種金紅色的固體物質被稱作茶多酚(tea polyphenols)。

在部分實施例中，純化的薑黃素(C)是購自德國默克公司(Merck Co.)，明美丁(memantine，Mem)、二甲雙胍(metformin，MF)、羥基乙叉二磷酸(etidronate,Eti)、甲硫達嗪(thioridazine，TRZ)、酚塞素(chlorpromazine，CPZ)和釕紅(ruthenium red，RuR)均購自美國Sigma Chemical Company公司。

評估藥物組合在抑菌能力的相互作用

在部分實施例中，以組合指數(CI,combination index)比較多種藥物組合與單獨使用藥物的抑菌能力[33]。

CI<1,synergism；CI=1,addition；CI>1,antagonism

統計

每個實驗的結果以平均值±SEM顯示，單因子獨立變因素分析(One way ANOVA)後，以事後t檢定(post-hoc t test)評估各組之間的差異，顯著水平(the level of significance)定義為p<0.05。

實驗結果

1.單獨或組合多酚和金屬離子的抗菌作用

在部分實施例中，如實驗結果總結在表一至表十七中所示，三種藥物組合中每個成分的IC₅₀顯示出協同抑菌作用。如同實驗程序中之方程式之估計，表一至表七顯示各藥物組合抑菌及抗癌效果平均效價(average potency)的增加倍數。

如表1A和1B所示，植物多酚(EGCG、綠茶多酚及薑黃素，不包含肉桂)對各種培養的病原體(P.g.,UA159,P.a.,S.a)的增殖表現出廣效抑制作用(pleiotropic inhibitory effects)。如金屬離子的IC₅₀(mM)所示，多酚和金屬離子的組合協同增益抑制細菌生長超過10倍(表1C)。肉桂-金屬離子組合物對細菌生長沒有影響，只有肉桂-RuR組合物在以降低的IC₅₀計算的情況下，協同抑制P.g.和P.a.分別為2.6倍和1.3倍。

2.本報告研究的各種藥物和天然化合物的抗菌作用：

如表2A所示，在研究的舊藥新用藥物中，dequalinium，thioridazine和chlorpromazine比其他藥物(NaF,4-hexyl-resorcinol,memantine,metformin,etidronate和奎寧)具有更強的抗菌作用。天然產物(黃連素(berberine)，溶菌酶(lysozyme)，槲皮素(quercetin)，川芎嗪(tetramethylpyrazine)和去甲二氫癒創木酸(nordihydroguaiaretic acid))的抗菌作用也很弱(表2B)。然而，抗生素(妥布黴素，利福平和鏈黴素)具有很強的抗菌作用(表3A)，但單獨的制黴菌素(nystatin)和異菸鹼醯胼錠(isoniazide)都沒有這些作用(表3A)。多胜肽(聚精氨酸(polyarginine)，魚精蛋白(protamine)，聚賴氨酸(polylysine)，Arg-Phe)和毒素肽(虎蛇毒素(notexin)，眼鏡蛇心臟毒素(cobra cardiotoxin)，眼鏡蛇磷脂酶A₂(cobra phospholipase A₂)和α-銀環蛇毒素(α- bungarotoxin))的抗菌作用也很弱，但這些肽中有部分抑制P.g.增長(表3B)。

3.含有舊藥新用的藥物組合的強效抗菌作用：

如表2A所示，單獨使用thioridazine和chlorpromazine的抗菌作用對P.g.，UA159，S.a有效(效果依降序排列)。單獨使用Metformin幾乎沒有效果，但在新方案(藥物組合)中顯著增加20至80倍(表4)。在增強對所研究的4種病原體的抗菌力方面，EGCG(E)似乎比薑黃素(C)和紅茶多酚(T)效果更好。其中，E-MF-Zn是最好的，E-TRZ-Zn和E-CPZ-Zn次之。含釕紅(RuR)的藥物組合也是有效的，特別對S.a.(表4)。對含有六種金屬離子(Cu²⁺，Ag⁺，Mn²⁺，VO4²⁺，Zn²⁺和Sr²⁺)的TRZ和CPZ方案的進一步研究顯示，它們的抗菌作用也很有效，但其中一些標記為X的效果不如單獨使用(表5)。

4.含有膜轉運蛋白阻斷劑的新方案的抗菌作用：

如表2A所示，單用的膜轉運蛋白阻斷劑(verapamil,diltiazem,dithiothreitol,dibucaine和digitonin)是無抗菌作用的，但它們的藥物組合對P.g和P.a.顯示出有效的抗菌作用，對UA159和S.a.則無效(表6)。

5.含有抗生素和多胜肽的新方案的抗菌作用：

如表3所示，抗生素(妥布黴素，利福平和鏈黴素)單獨具有非常有效的抗菌作用，但在一些新方案中仍表現出更強的效力(表7和8)。含有多粘菌素B(polymycin B，PM)的方案也顯示出有明顯的有效性(表7)。儘管nystatin和isoniazid單獨使用幾乎無作用，但在新方案中成為很有效的抗菌藥物組合(表7)。

表9中所示的E-Q，E-F或E-R組合的多胜肽或毒素多胜肽在抑制P.g，UA159和P.a的增殖方面非常有效。但除了E-Q(F,R)之外對S.a. 無效。RF在抑制S.a.方面非常有效。另一方面，多胜肽與E-金屬離子的組合跟含有E-Q，E-F或E-R的上述方案效果比較，約只有1/10的效力(表9和10)。

6.含有memantine，metformin和天然產物的新方案的抗菌作用：

儘管單用memantine和metformin在抗菌作用方面幾乎無效(表2A)，但它們與各種多酚-金屬離子組合物組合顯著協同增益地發揮抗菌作用(表11)。類似地，天然化合物(berberine，quercetin，tetramethylpirazine和nordihydroguaiaretic acid)本身在抗菌功效方面非常弱(表2B)，但它們與多酚-金屬離子組合物組合顯著地協同地發揮抗菌作用(表12)。

7.含有etidronate，格列本脲(glibenclamide(Gbc))和3,4-二氨基吡啶(3,4-DAP)的新方案的抗菌作用：

如表13所示，etidronate(Eti),glibenclamide(Gbc)和3,4-diaminopyridine(3,4-DAP)與多酚-金屬離子組合物的組合也顯示出有明顯的抗菌作用，尤其是C-Eti-金屬離子組合物的方案，非常有效抑制S.a.的增殖(表13A)。Memantine的加入增強了含有Gbc或3,4-DAP的組合對P.g.的抗菌功效約2倍(表13C)。

8.含有Ag，Ge132和順鉑(Pt)的新方案的抗菌作用：

如表14所示，含有Ag，Ge132和順鉑(Pt)的新方案對P.a.和S.a.具有更好的抗菌功效。

9.草藥萃取物混合物的抗菌作用

草藥萃取物的混合物(GIM：阿米拉果，玫瑰果和酵母GSH的提取物混合物；或OP：越橘萃取物，決明子，金盞花與谷甾酮)和EGCG， 甘草和薄荷油混合被發現為跟小蘗鹼和槲皮素有同樣強度的抗菌作用(表15)。

10.新方案的抗菌作用的選擇性：

我們已經證明，在測試的282種有效抗菌方案中，有83%對益菌羅伊氏乳酸桿菌(Lactobacillus reuteri，L.r.)增殖無影響。此結果乃在每種方案高於IC₅₀濃度3-10倍的濃度下測試。實際上，其中特別是含有MnCl₂的方案顯著增加了L.r.增殖(圖1)。

11.新方案的選擇性抗癌作用：

如表16所示，含有VO4^2-和RuR的新方案對培養的口腔鱗狀細胞癌細胞(OECM-1)的抑制作用，比其對牙齦上皮細胞SG細胞更強。

12.新方案促進成骨分化：

如圖2所示，新方案含有EGCG與靶向藥物Dequalinium(Q)，NaF(F)，4-hexyl-resorcinal(R)，Memantine(mem)，Glibenclamide(Gbc)或3,4-diaminopyridine(3,4-DAP)，以及金屬離子(ZnCl₂，SrCl₂或Ge132)可以增加培養的MC3T3-E1細胞的鹼性去磷酸酶(ALP)活性和ARS礦物質含量。

E-Mem-Sr，E-Q-Sr，E-R-Zn，E-Gbc-Zn(或Ge)和E-3,4-DAP-Sr有增強培養的MC3T3-E1細胞的鹼性去磷酸酶活性。另一方面，EQ-Mem，EF-Sr，E-Eti-Zn，E-Gbc-Zn(Sr)和E-3,4-DAP-Sr另加Mem明顯增加培養的MC3T3-E1細胞的ARS礦物質含量。

13.新方案降低破骨細胞分化作用：

如圖三所示，E-Eti-SeO₃(VO₄)和E-Clo-VO₄(Zn,Sr)降低了培養的前破骨細胞(RAW細胞)的抗酒石酸性去磷酸酶活性(tartrate-resistant acid phosphatase activities of the cultured preosteoblast RAW cells)。

14.新方案的神經保護作用：

如圖四A和四B所示，H₂O₂對培養的神經母細胞瘤SHSY5Y細胞的細胞毒性作用，可分別藉由E-TRZ(CPZ,MF)-RuR、T-MF(Eti)-RuR、E-(C)Mem-Zn和G-Mem-Zn的新方案減弱。

15.新方案對小鼠和斑馬魚測試安全性：

如圖五，小鼠經口服3週的藥物組合(C-TRZ(CPZ，MF)-Zn(RuR)顯示具安全性，C-TRZ(MF)-RuR方案略微增加小鼠的運動活性。斑馬魚方案的毒性試驗，顯示肌肉注射1-5天後零死亡率。

新方案具有的應用：

1.腸道和口腔菌相與人類健康的關係密切，許多研究結果顯示牙周炎、失智症、神經退化性疾病、糖尿病、肥胖症、代謝綜合症、腸道炎症、骨質疏鬆症及癌症等均與腸道及口腔菌相有關連。新型方案不僅具有抗病原菌作用，而且增強了益生菌的生長，這表明它們有可能改變人體內菌相失調情形，因而減輕疾病並增強健康狀態。

2.防治感染疾病的應用：

各種新方案顯示對培養的病原體具有廣效抑制作用。最近，我們與Drs.H.Y.Dou和T.L.Yang合作(感染症與疫苗研究所，國家衛生研究院，台灣)測試C-TRZ(CPZ，MF)-RuR對多重抗藥(MDR)細菌的抑制作用。初步結果表明，這些新方案可有效抑制多重抗藥結核分枝桿菌(MDR-Mycobacterium tuberculosis)、抗藥性金黃葡萄球菌(MRSA)和及抗藥性綠膿桿菌和多重抗藥糞腸球菌(MDR-E facalis)的增殖。

3.防治神經退化性疾病的應用：

我們先前的研究表明，EGCG與memantine協同增益作用可減輕小鼠中樞神經過度興奮性的毒性(excite neurotoxicity)。

計畫中E(C，G)-Memantine-金屬離子的新方案能抑制口腔牙周菌增值(減少牙周炎)，另具有神經保護和調節作用，因此，有助於失智症，帕金森氏症和其他神經退化性疾病的防治。類似地，E(T)-TRZ(CPZ，MF，Eti)-RuR組合表現神經保護作用，因具有抑制H₂O₂的氧化細胞毒性。因此，它們可能具有防治這些神經退化性疾病的潛在益處。

4.預防和治療代謝綜合症、糖尿病和肥胖症：

含有metformin(E(C,G)-MF-Zn(RuR))的方案組合藥物明顯比單用metformin更有效地預防和治療這些代謝疾病及其相關的菌相調節和諧正常化。

5.用於預防和治療骨質疏鬆症：

含有etidronate、Zn²⁺、Sr²⁺、memantine、glibenclamide(Gbc)和3,4-diaminopyridine的新方案顯示出有明顯增加前成骨細胞(MC3T3-E1)的鹼性去磷酸酶(ALP)活性(圖2)，而E,Eti(Clo)VO₄和E,Clo,Zn(Sr)降低了前破骨細胞(RAW)之抗酒石酸性去磷酸酶(TRAP)的活性(圖3)。這些方案可能對骨質疏鬆症具有預防和治療作用。

6.預防和治療癌症：

如表17所示，新方案對培養的口腔癌細胞(OECM-1)的選擇性抗癌作用可能具有預防和治療癌症的潛在應用。

7.對於慢性疼痛的預防和治療：

我們先前已報告，茶多酚和memantine的組合不僅有效減輕口腔顏面疼痛，而且抑制嗎啡鎮痛耐受性之產生。E(C,G)-Mem(MF)-Metals(特別是RuR)組合的新方案，可有效預防和治療慢性疼痛的潛在功效。

表一~表十七中各類藥物簡稱對照：

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

本表中列出的藥物組合濃度高出IC₅₀的3至10倍時，對培養的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的增殖沒有抑制作用。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

本表中列出的藥物組合濃度高出IC₅₀的3至10倍時，對培養的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的增殖沒有抑制作用。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

本表中列出的藥物組合濃度高出IC₅₀的3至10倍時，對培養的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的增殖沒有抑制作用。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

本表中列出的藥物組合濃度高出IC₅₀的3至10倍時，對培養的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的增殖沒有抑制作用。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

金屬離子的濃度以mM表示。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

本表中列出的藥物組合濃度高出IC₅₀的3至10倍時，對培養的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的增殖沒有抑制作用。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

本表中列出的藥物組合濃度高出IC₅₀的3至10倍時，對培養的羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)的增殖沒有抑制作用。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

P.g.：牙齦卟啉單胞菌；UA159：變形鏈球菌；P.a.：綠膿桿菌；S.a.：金黃色葡萄球菌。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

OECM-1：口腔鱗癌細胞；SG：正常牙齦上皮細胞。

IC₅₀：抑制50%細菌增殖的濃度。

在一實施例中，如表一至表十七所示，該多酚類化合物選自包含至少一多酚選自茶多酚、薑黃素、茶黃素、芹菜素、槲皮素、單寧酸、兒茶素、綠原酸、異黃酮、花青素、可可多酚、檸檬黃素、芸香苷、川芎嗪(TMP)、癒創木素(NDGA)及白藜蘆醇組成的群組。

在一實施例中，如表一至表十七所示，該選擇性標靶之臨床藥物選自包含受體促效劑、受體拮抗劑、膜離子通道調節劑、膜離子轉運蛋白及粒線體功能調節劑的群組之一。

在另一實施例中，如表一至表十七所示，該選擇性標靶之臨床藥物選自包含抗生素、明美丁(memantine，Mem)、二甲雙胍(metformin，MF)、甲硫達嗪(Thioridazine，TRZ)、酚塞素(chlorpromazine，CPZ)，托普黴素(tobramycin)，利福平(rifampin)，鏈黴素(streptomycin)，異菸鹼醯胼錠(isoniazide)，維拉帕米(verapamil)，地爾硫卓(diltiazem)，二硫蘇糖醇(dithiothreitol)，二丁卡因(dibucaine)，順鉑(cisplatin)，地喹氯銨(dequalinium)，4-己基間苯二酚(4-hexylresorcinol)，熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid)及羥基乙叉二磷酸(etidronate，Eti)的群組之一。

在另一實施例中，如表一至表十七所示，該金屬離子選自包含銅離子、錳離子、鋅離子、釩離子、鍶離子、氧化硒、銀離子及釕紅的群組之一。

在一實施例中，如表一至表十七所示，該致病菌包含牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)、鏈球菌屬(Streptococcus mutans)、大腸桿菌(E.coli)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)或金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)。

在另一實施例中，如表十七所示，該口腔表皮癌細胞為口腔鱗狀上皮細胞癌細胞(oral squamous cell carcinoma cell line，OECM-1)。

在一實施例中，如表一至表十七所示，該多酚類化合物與該選擇性標靶之臨床藥物之濃度比例為1：0.1-3。

在另一實施例中，如表一至表十七所示，該多酚類化合物、該選擇性標靶之臨床藥物以及該金屬離子相互作用下具有協同(增效)作用。

在另一實施例中，如表十六及表十七所示，含有釕紅(RuR)的各種醫藥組合物，不但具有廣泛及特強的抗菌作用，而且抑制癌細胞生長也特強，可望應用於感染症及癌症之預防及治療。

在一實施例中，測試增強羅伊氏乳桿菌生長的新方案，結果如圖一所示。藥物組合的最終濃度(1X：mg/ml˙mg/ml˙mM)如下：NaF：1mg/ml

EQCu：0.1˙0.0003˙0.03

EQMn：0.1˙0.0003˙0.03

EFCu：0.1˙0.03˙0.03

EFMn：0.1˙0.03˙0.03

EFSr：0.1˙0.03˙0.1

在一實施例中，測試新方案增加培養的前成骨細胞MC3T3-E1的鹼性去磷酸酶(ALP)和ARS礦物質含量，結果如圖二所示。每種藥物組合為1倍(1X，mg/ml˙mg/ml˙mM)時的最終濃度如下：EMemZn，EEtiZn：0.1˙0.1˙0.1；EMemSr，EEtiSr：0.1˙0.1˙0.3；EQ：0.15˙0.0005；ER：0.15˙0.0075mg/ml；EQMem：0.1˙0.0003˙0.1mg/ml；ERMem：0.1˙0.005˙0.1mg/ml；EQZn：0.03˙0.0001˙0.01； EQSr：0.03˙0.0001˙0.03；EFZn：0.03˙0.01˙0.01；EFSr：0.03˙0.01˙0.03；ERZn：0.1˙0.005˙0.03；EGbcZn：0.1˙0.00066˙0.1；EGbcSr：0.1˙0.00066˙0.3；EGbcGe：0.1˙0.00066˙0.033；EGbcZnMem：0.075˙0.0005˙0.075˙0.075mg/ml；EGbcGeMem：0.075˙0.0005˙0.025˙0.075mg/ml；EGbcSrMem：0.075˙0.0005˙0.225˙0.075mg/ml；E34DAPZn：0.1˙0.03˙0.1；E34DAPSr：0.1˙0.03˙0.3；E34DAPGe：0.1˙0.03˙0.03；E34DAPZnMem：0.075˙0.025˙0.075˙0.075mg/ml；E34DAPSrMem：0.075˙0.025˙0.225˙0.075mg/ml；E34DAPGeMem：0.075˙0.025˙0.025˙0.075mg/ml。

在一實施例中，測試新方案降低培養的前破骨細胞(RAW)的抗酒石酸酸性去磷酸酶活性，結果如圖三所示。每種藥物組合為1倍(1X，mg/ml˙mg/ml˙mM)時的最終濃度如下：EEtiCu：0.1˙0.1˙0.1；EEtiSe(Mn,VO4,Zn)：0.1˙0.1˙0.1；EEtiSr：0.1˙0.1˙0.3；ECloCu：0.1˙0.3˙0.1；ECloSe(Mn,VO4,Zn)：0.1˙0.3˙0.1； ECloSr：0.1˙0.3˙0.3。

在一實施例中，測試新方案抑制培養神經瘤母細胞的H₂O₂細胞毒性的神經保護作用，結果如圖四所示。在向培養的細胞中加入10分鐘(圖四A)和30分鐘(圖四B)的H₂O₂後，研究藥物的神經保護作用。對於細胞毒性試驗，H₂O₂的濃度分別為0.5、1和3mM，每種藥物組合為1倍(1X，mg/ml˙mg/ml˙mM)時的最終濃度如下：ETRZRuR，ECPZRuR：0.3˙0.03˙0.035；EEtiRuR：0.3˙0.3˙0.035；TMFRuR：0.1˙0.1˙0.035；TEtiRuR：0.1˙0.3˙0.035；ECZn，EMemZn，GMemZn：0.1˙0.03˙0.03；EMFRuR：0.3˙0.1˙0.035。

在一實施例中，測試新方案對口服藥物後的小鼠運動行為的影響，結果如圖五所示，圖五A為小鼠總移動，圖五B為小鼠總休息時間。每種藥物組合為1倍(1X，mg/ml˙mg/ml˙mM)時的最終濃度如下：CTRZZn，CCPZZn：0.1˙0.01˙0.03；CTRZRuR，CCPZRuR：0.1˙0.01˙0.035；CMFZn：0.1˙0.1˙0.03；CMFRuR：0.1˙0.1˙0.035

參考文獻：

1. Franceschi, Claudio, et al. "The Continuum of Aging and Age-Related Diseases: Common Mechanisms but Different Rates."Frontiers in medicine 5 (2018): 61..

2. Zhang, Tianlang, et al. "Comparative Epidemiological Investigation of Alzheimer’s Disease and Colorectal Cancer: The Possible Role of Gastrointestinal Conditions in the Pathogenesis of AD." Frontiers in aging neuroscience 10 (2018).

3. Tzeng, Nian-Sheng, et al. "Are chronic periodontitis and gingivitis associated with dementia？ A nationwide, retrospective, matched-cohort study in Taiwan." Neuroepidemiology 47.2 (2016): 82-93.

4. Chen, Chang-Kai, Yung-Tsan Wu, and Yu-Chao Chang. "Association between chronic periodontitis and the risk of Alzheimer’s disease: a retrospective, population-based, matched-cohort study." Alzheimer's research & therapy 9.1 (2017): 56.

5. Spielman, Lindsay Joy, Deanna Lynn Gibson, and Andis Klegeris. "Unhealthy gut, unhealthy brain: The role of the intestinal microbiota in neurodegenerative diseases."Neurochemistry international (2018).

6. Rybnikova, Elena. "Brain, antibiotics, and microbiota-how do they interplay？ An Editorial for ‘Antibiotics- induced modulation of large intestinal microbiota altered aromatic amino acid profile and expression of neurotransmitters in the hypothalamus of piglets’ on page 219." Journal of neurochemistry 146.3 (2018): 208-210.

7. Giau, Vo, et al. "Gut Microbiota and Their Neuroinflammatory Implications in Alzheimer’s Disease." Nutrients 10.11 (2018): 1765.

8. Junges, Vilma M., et al. "Crosstalk between Gut Microbiota and Central Nervous System: A Focus on Alzheimer's Disease."Current Alzheimer Research 15.13 (2018): 1179-1190.

9. Sochocka, Marta, et al. "The Gut Microbiome Alterations and Inflammation-Driven Pathogenesis of Alzheimer’s Disease-a Critical Review." Molecular Neurobiology: 1-11.

10.Pritchard, Anna B., et al. "Periodontitis, microbiomes and their role in Alzheimer’s disease." Frontiers in Aging Neuroscience 9 (2017): 336.

11.Solas, Maite, et al. "Inflammation and gut-brain axis link obesity to cognitive dysfunction: plausible pharmacological interventions." Current opinion in pharmacology 37 (2017): 87-92.

12.Ide, Mark, et al. "Periodontitis and cognitive decline in Alzheimer’s disease." PLoS One 11.3 (2016): e0151081.

13.Lin, Yu-Li, et al. "Composition of polyphenols in fresh tea leaves and associations of their oxygen-radical-absorbing capacity with antiproliferative actions in fibroblast cells." Journal of Agricultural and Food Chemistry 44.6 (1996): 1387-1394.

14.Lin, Jen-Kun. "Cancer chemoprevention by tea polyphenols through modulating signal transduction pathways." Archives of pharmacal research 25.5 (2002): 561.

15.Lin, Jen- Kun, and Shoei- Yn Lin- Shiau. "Mechanisms of hypolipidemic and anti-obesity effects of tea and tea polyphenols." Molecular nutrition & food research 50.2 (2006): 211-217.

16.Deng, Yea-Tzy, and Jen-Kun Lin. "EGCG inhibits the invasion of highly invasive CL1-5 lung cancer cells through suppressing MMP-2 expression via JNK signaling and induces G2/M arrest."Journal of agricultural and food chemistry 59.24 (2011): 13318-13327.

17.Huang, Hsiu-Chen, and Jen-Kun Lin. "Pu-erh tea, green tea, and black tea suppresses hyperlipidemia, hyperleptinemia and fatty acid synthase through activating AMPK in rats fed a high-fructose diet." Food & function 3.2 (2012): 170-177.

18.Yang, Tsung- Yuan, et al. "Weight reduction effect of Puerh tea in male patients with metabolic syndrome." Phytotherapy research28.7 (2014): 1096-1101.

19.Chen SH, Lin JK, Liang YC, Pan MH, Liu SH, Lin-Shiau SY. "Involvement of activating transcription factors JNK, NF-kappaB, and AP-1 in apoptosis induced by pyrrolidine dithiocarbamate/Cu complex"Eur J Pharmacol (2008) : 9-17.

20.Chen SH, Lin JK, Liu SH, Liang YC, Lin-Shiau SY. "Apoptosis of cultured astrocytes induced by the copper and neocuproine complex through oxidative stress and JNK activation. "Toxicol Sci. (2008) : 138-149

21.Cheng PW, Liu SH, Hsu CJ, Lin-Shiau SY. "Correlation of increased activities of Na+, K+-ATPase and Ca2+-ATPase with the reversal of cisplatin ototoxicity induced by D-methionine in guinea pigs. "Hear Res. (2005) : 102-109

22.Hsu CJ, Chen YS, Shau WY, Yeh TH, Lee SY, Lin-Shiau SY. "Impact of activities of Na(+)-K(+)-ATPase and Ca2(+)-ATPase in the cochlear lateral wall on recovery from noise-induced temporary threshold shift." Ann Otol Rhinol Laryngol. (2002) : 842-849

23.Chang-Mu C, Jen-Kun L, Shing-Hwa L, Shoei-Yn LS. "Characterization of neurotoxic effects of NMDA and the novel neuroprotection by phytopolyphenols in mice." Behav Neurosci. (2010) : 541-553

24.Chen CM, Lin JK, Liu SH, Lin-Shiau SY. "Novel regimen through combination of memantine and tea polyphenol for neuroprotection against brain excitotoxicity." J Neurosci Res. (2008) : 2696-2704

25.Chen CM, Liu SH, Lin-Shiau SY. "Honokiol, a neuroprotectant against mouse cerebral ischaemia, mediated by preserving Na+, K+- ATPase activity and mitochondrial functions." Basic Clin Pharmacol Toxicol. (2007) : 108-116

26.Lin Shiau, Shoei Yn and Kao, Chia Tze.” Tea Polyphenols Synergistic Enhancement of Antibacterial Effects of NaF on the Cultured Streptococcus Mutans.” Biomed J Sci & Tech Res (2018).

27.Worton LE, Shi YC, Smith EJ, Barry SC, Gonda TJ, Whitehead JP, Gardiner EM. "Ectodermal-Neural Cortex 1 Isoforms Have Contrasting Effects on MC3T3-E1 Osteoblast Mineralization and Gene Expression." J Cell Biochem. (2017) : 2141-2150

28.Park JK, Rosen A, Saffitz JE, Asimaki A, Litovsky SH, Mackey-Bojack SM, Halushka MK. " Expression of cathepsin K and tartrate-resistant acid phosphatase is not confined to osteoclasts but is a general feature of multinucleated giant cells: systematic analysis." Rheumatology (Oxford). (2013) : 1529-1533

29.Tseng WP, Lin-Shiau SY. "Activation of NMDA receptor partly involved in beta-bungarotoxin-induced neurotoxicity in cultured primary neurons." Neurochem Int. (2003) : 333-344

30.Tseng WP, Lin-Shiau SY. "Long-term lithium treatment prevents neurotoxic effects of beta-bungarotoxin in primary cultured neurons." J Neurosci Res. (2002) : 633-641

31.Chuu JJ, Huang ZN, Yu HH, Chang LH, Lin-Shiau SY. "Attenuation by methyl mercury and mercuric sulfide of pentobarbital induced hypnotic tolerance in mice through inhibition of ATPase activities and nitric oxide production in cerebral cortex." Arch Toxicol. (2008) : 343-353

32.Huang CF, Liu SH, Lin-Shiau SY. "Neurotoxicological effects of cinnabar (a Chinese mineral medicine, HgS) in mice." Toxicol Appl Pharmacol. (2007) : 192-201

33.Chou TC. "Drug comination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay Method."Cancer research. (2010) : 440-446

Claims (4)

1. 一種抑菌劑，其包含：一多酚類化合物；一金屬離子或硒離子；以及一臨床藥物，其中，該多酚類化合物選自由兒茶素、紅茶多酚、綠茶多酚及肉桂多酚組成的群組，該金屬離子選自由銅離子、錳離子、鋅離子、釩離子、鍶離子、銀離子及釕離子組成的群組，及該臨床藥物選自由氟化物、明美丁、二甲雙胍、甲硫達嗪、酚塞素、托普黴素、利福平、鏈黴素、異菸鹼醯胼錠、維拉帕米、地爾硫卓、二硫蘇糖醇、二丁卡因、順鉑、地喹氯銨、4-己基間苯二酚、熊去氧膽酸、羥基乙叉二磷酸、川芎嗪、降二氫癒創木酸、3,4-二氨基吡啶、黃連素、心臟毒素、洋地黃、格列本脲、溶菌酶、制黴菌素、多粘菌素B、魚精蛋白、α-銀環蛇毒素、β-銀環蛇毒素、虎蛇毒素、聚賴氨酸37、聚賴氨酸84、磷脂酶A2、聚精氨酸及短鏈胜肽組成的群組。
2. 如申請專利範圍第1項所述之抑菌劑，其中該多酚類化合物與該臨床藥物之濃度比為1：0.1~3。
3. 一種醫藥組合物用於製備抑制一致病菌之藥物的用途，其中，該醫藥組合物包含：一有效劑量之如申請專利範圍第1項所述之抑菌劑， 其中，該致病菌選自由牙齦卟啉單胞菌、鏈球菌屬、大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、多重抗藥金黄色葡萄球菌以及結核分枝桿菌組成的群組。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中，該多酚類化合物與該臨床藥物之濃度比例為1：0.1-3。

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