TWI747011B

TWI747011B - 真皮纖維母細胞之功能活化劑及真皮纖維母細胞之基因表現調控劑

Info

Publication number: TWI747011B
Application number: TW108125848A
Authority: TW
Inventors: 山田義久; 多田祐也
Original assignee: 日商遺傳生物研究所股份有限公司; 日商最終未來國際股份有限公司
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2021-11-21
Also published as: US11554092B2; EP3677248A4; JP2020015672A; MY194768A; PH12020550395A1; JP6555674B1; BR112020006113A2; US20200237636A1; KR102366340B1; EP3677248B1; MX2020004602A; RU2744251C1; KR20200044934A; TW202015654A; WO2020022131A1; EP3677248A1

Abstract

本發明之課題在於提供一種安全性較高且可長期安心使用之皮膚之抗老化用劑、抗老化相關基因表現調控用劑及包含該抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑而成之化妝品。

本發明之皮膚之抗老化用劑、抗老化相關基因表現調控用劑及包含該抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑而成之化妝品包含特殊低分子化DNA與大豆萃取物、較佳為大豆芽萃取物作為有效成分。該有效成分具有真皮纖維母細胞之功能活化作用，因此期待預防或改善肌膚之緊緻或彈力之降低、皺紋或鬆弛等皮膚之老化。

Description

真皮纖維母細胞之功能活化劑及真皮纖維母細胞之基因表現調控劑

本發明係關於一種皮膚之抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑，進一步詳細而言，係關於一種包含特殊低分子化DNA及大豆萃取物作為有效成分之皮膚之抗老化用劑、抗老化相關基因表現調控用劑、及包含該抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑而成之化妝品。

皮膚可大體分為與外界接觸之表皮、位於其內側且與表皮以強力接著之真皮、進一步處於其內側且位於真皮與肌肉之間之皮下脂肪組織。位於表皮與皮下脂肪組織之間之真皮包括乳頭層、真皮網狀層及結合性纖維組織。該真皮之約70%由膠原蛋白所占，此外包含彈性纖維(彈力蛋白)、透明質酸等細胞外基質成分。該等構成真皮之膠原蛋白、彈力蛋白、透明質酸等藉由存在於真皮網狀層之真皮纖維母細胞而生成。

一般而言，認為由於紫外線、乾燥、年齡增加等，該等纖維被破壞，變老而彈力降低，並且細胞外基質成分之產生功能降低而導致肌膚之緊緻或彈力降低、皺紋或鬆弛等肌膚老化。如上所述，真皮之細胞外基質成分、特別是膠原蛋白或透明質酸之減少與皮膚之彈性之降低或皺紋形成等老化現象有關聯。

因此，認為若使真皮纖維母細胞之功能活化來增加上述細胞外基質成分之產生，則可預防或改善肌膚之老化。特別是形成於臉部之皺紋作為老化標誌對人類之外觀造成較大影響。因此，對作為保持青春之方法之具有預防或改善皺紋之效果之化妝品(抗老化、抗皺化妝品)的需求日益變高(非專利文獻1)。

此處，報告用作安全且效果優異之功能性食品之脫氧核糖核酸(DNA)具有改善肌膚狀態(水分量、皮脂量、溝表皮密度、皺紋、黃褐斑、雀斑等)之效果(專利文獻1、2)。

又，報告大豆之種子、胚芽(胚)或芽之萃取物包含較多之聚胺，具有支持皮膚結構之彈力蛋白、膠原蛋白、透明質酸等細胞外基質成分之產生促進作用(專利文獻3)。

然而，關於該等脫氧核糖核酸(DNA)與大豆萃取物之交互作用，據本發明者所知，未有報告。

[先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本專利特開2007-291062號公報

專利文獻2：日本專利特開2008-63315號公報

專利文獻3：日本專利特開2012-46544號公報

[非專利文獻]

非專利文獻1：鈴木正人主編「抗老化、美白、保濕化妝品之技術開發」(普及版)CMC股份有限公司出版2007年8月23日第1次印刷發行

若使真皮纖維母細胞之功能活化來使細胞外基質成分、特別是膠原蛋白或透明質酸之產生增加，則如上所述，可期待預防或改善肌膚之老化。因此，本發明之課題在於提供一種具有更加優異之真皮纖維母細胞之活化效果且安全性較高、可長期安心使用之皮膚之抗老化用劑、抗老化相關基因表現調控用劑及包含該抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑而成之化妝品。

本發明人等對上述課題進行了銳意研究，結果發現：即便長期服用亦安全之特殊低分子化DNA及大豆萃取物對真皮纖維母細胞具有協同活化作用，即細胞增生作用、膠原蛋白產生促進作用及透明質酸產生促進作用之協同效果(協同效應)；且協同地促進與透明質酸合成相關之基因表現，並且減少與透明質酸分解相關之基因表現。本發明係基於該等見解而完成者。即，本發明如下所示。

(1)一種皮膚之抗老化用劑，其特徵在於：包含特殊低分子化DNA及大豆萃取物作為有效成分，且上述特殊低分子化DNA為自動植物提取之DNA之水解處理物，上述大豆萃取物為選自由大豆之種子、胚芽及芽所組成之群中之至少1種之萃取物。

(2)如(1)記載之抗老化用劑，其中抗老化為真皮纖維母細胞之功能活化，且該功能活化為選自由真皮纖維母細胞之增生促進作用、I型膠原蛋白產生促進作用及透明質酸產生促進作用所組成之群中之至少1種作用。

(3)如(1)或(2)記載之抗老化用劑，其中特殊低分子化DNA之含量為0.001~1質量%，且大豆萃取物之含量為0.001~1質量%。

(4)一種皮膚之抗老化相關基因表現調控用劑，其特徵在於：包含特殊低分子化DNA及大豆萃取物作為有效成分，且上述特殊低分子化DNA為自動植物提取之DNA之水解處理物，上述大豆萃取物為選自由大豆之種子、胚芽及芽所組成之群中之至少1種之萃取物。

(5)如(4)記載之抗老化相關基因表現調控用劑，其中抗老化相關基因表現調控為選自由I型膠原蛋白合成酵素基因、透明質酸合成酵素1基因及透明質酸合成酵素2基因所組成之群中之至少1種之基因表現促進、或膠原蛋白分解酵素基因及/或透明質酸分解酵素基因之基因表現減少。

(6)如(4)或(5)記載之抗老化相關基因表現調控用劑，其中特殊低分子化DNA之含量為0.001~1質量%，且大豆萃取物之含量為0.001~1質量%。

(7)一種化妝品，其係包含如(1)至(3)中任一項記載之抗老化用劑、或如(4)至(6)中任一項記載之抗老化相關基因表現調控用劑而成。

根據本發明，作為有效成分之特殊低分子化DNA及大豆萃取物對真皮纖維母細胞具有協同活化作用，因此可期待皮膚之抗老化，即預防或改善肌膚之緊緻或彈力之降低、皺紋或鬆弛等肌膚老化等效果。

圖1係表示實施例中所使用之水解DNA-Na之利用凝膠滲透層析法(Gel Permeation Chromatography：GPC)所得之分析結果之圖。圖之橫軸為保持時間(分鐘)，縱軸為紫外區域(波長為260nm)之吸光度。

以下，對本發明之實施形態進行詳細說明，但以下之說明為本發明之實施形態之一例，本發明並不限定於以下之記載內容。再者，本說明書中，於使用「~」之表達之情形時，作為包括其前後之數值或物性值在內之表達來使用。又，有效成分之含量(%)只要未特別明確記載，則為質量百分比(wt%)。

本發明之皮膚之抗老化用劑之特徵在於：包含特殊低分子化DNA及大豆萃取物作為有效成分，且特殊低分子化DNA為可藉由對自動植物提取之DNA進行水解處理而製備之成分，大豆萃取物為選自由大豆之種子、胚芽及芽所組成之群中之至少1種之萃取物。

此處，所謂皮膚之抗老化意指真皮纖維母細胞之功能活化，所謂該功能活化意指選自由真皮纖維母細胞之增生促進作用、I型膠原蛋白產生促進作用及透明質酸產生促進作用所組成之群中之至少1種作用。

又，本發明之皮膚之抗老化相關基因表現調控用劑之特徵在於：包含上述特殊低分子化DNA及大豆萃取物作為有效成分，且特殊低分子化DNA為可藉由對自動植物提取之DNA進行水解處理而製備之成分，大豆萃取物為選自由大豆之種子、胚芽及芽所組成之群中之至少1種之萃取物。

此處，於本發明中，所謂皮膚之抗老化相關基因意指如下所示之編碼參與真皮纖維母細胞中之膠原蛋白或透明質酸之合成或分解之任一種酵素的基因。

‧I型膠原蛋白合成酵素基因(Human Collagen Type1 Alpha 1；COL1A1)

‧膠原蛋白分解酵素基因(Human Matrix Metallopeptidase 1；MMP1)

‧透明質酸合成酵素1基因(Human Hyaluronan Synthase 1；HAS1)

‧透明質酸合成酵素2基因(Human Hyaluronan Synthase 2；HAS2)

‧透明質酸分解酵素基因(Human Hyaluronidase 1；HYAL1)

又，所謂基因表現調控，意指上述合成酵素基因之表現促進(表現量之增加)及/或分解酵素基因之表現減少(表現量之減少)。作為該等皮膚之抗老化相關基因表現調控，較佳為意指選自由I型膠原蛋白合成酵素基因(COL1A1)、透明質酸合成酵素1基因(HAS1)及透明質酸合成酵素2基因(HAS2)所組成之群中之至少1種之基因表現促進、或膠原蛋白分解酵素基因(MMP1)及/或透明質酸分解酵素基因(HYAL1)之基因表現減少。

進而，所謂上述真皮纖維母細胞之功能活化，可為真皮纖維母細胞中之上述基因表現促進或上述基因表現減少。

本發明之皮膚之抗老化用劑或皮膚之抗老化相關基因表現調控用劑亦可包含特殊低分子化DNA及大豆萃取物作為有效成分，且視需要進而包含其他任意成分。

本發明中之特殊低分子化DNA係可藉由對自動植物提取之DNA進行水解處理而製備之成分。DNA之供給源可為動物、植物、微生物等各種生物，又，亦可使用合成DNA作為DNA。該等中，就包含較多DNA或可有效地利用水產加工之廢棄物之觀點而言，特佳為使用源自鮭魚、鱒魚、鱈魚等魚類之精巢(魚白)的DNA。

自魚類之精巢之DNA之萃取及純化可藉由常規方法(例如依據日本專利特開2005-245394號公報之記載)進行。例如，粗粉碎魚類之精巢，對於經粗粉碎之魚類之精巢，於DNA不會分解之條件下進行蛋白質分解酵素(蛋白酶)處理，向經酵素處理之溶液中添加醇(甲醇、乙醇、異丙醇等)，使DNA以DNA鹽(DNA鈉鹽)之形式沈澱，回收該沈澱物。或者向經酵素處理之溶液中添加酸(鹽酸、磷酸、檸檬酸等)，使DNA沈澱，回收該沈澱物，用氫氧化鈉進行中和並進行乾燥，藉此可獲得DNA鹽(DNA鈉鹽)。

使用核酸酶等核酸分解酵素使所獲得之DNA鹽水解，藉此可獲得特殊低分子化DNA。作為水解處理所使用之核酸酶，例如可使用源自青黴菌之核酸酶。

水解例如可藉由如下方式進行：向調整至65℃左右之溫水中投入上述DNA鹽(DNA鈉鹽)作為原料，攪拌後，進一步加溫至70℃，添加核酸酶並使之反應。作為水解處理時之溫度，較佳為60~75℃，更佳為70℃。

對所獲得之水解產物例如進行冷凍乾燥，藉此可獲得粉末狀之特殊低分子化DNA。利用上述方法所得之特殊低分子化DNA通常能夠以鈉鹽之狀態獲得。再者，鹽並不限於鈉鹽，例如亦可為鉀鹽或鈣鹽。又，特殊低分子化DNA亦可不為鹽而為游離體。

特殊低分子化DNA較佳為含有分子量為12,000以下之組分10~80%，更佳為含有分子量為5,000以下之組分10~80%。再者，分子量分佈之測定可藉由如下方式進行：藉由GPC將試樣基於分子量進行分級後藉由UV(ultraviolet，紫外線)檢測器進行定量。

本發明中之大豆萃取物為選自由大豆之種子、胚芽及芽所組成之群中之至少1種之萃取物。萃取條件並無特別限定，較佳為獲得包含聚胺之植物萃取物之方法、例如如專利文獻3所記載，將大豆之種子、胚芽(胚)或芽於適當之介質中進行粉碎，於酸性條件下進行萃取之方法。再者，用作原料之胚芽只要收集自種子分離者即可，關於大豆之芽，只要收集於適當之條件下使大豆種子發芽所得之芽部分即可。

此處，大豆萃取物中包含較多聚胺。聚胺為具有2個以上一級胺基之直鏈脂肪族烴之總稱，並作為存在於所有生物中且參與細胞分裂或蛋白合成之生長因子而為人所知。

大豆萃取物中之聚胺含量並無特別限制，較佳為0.05%以上，更佳為0.1%以上，進而較佳為0.15%以上，特佳為0.2%以上。再者，聚胺含量可藉由高效液相層析法進行測定。

大豆萃取物、特別是大豆芽部分之萃取物(以下，有時稱為「大豆芽萃取物」)中包含較多聚胺(腐胺、屍胺、亞精胺、精胺等)(專利文獻3)。藉由使用包含較多聚胺之大豆芽萃取物，可期待聚胺所發揮之效果。

作為大豆萃取物，可使用市售品。具體而言，例如可列舉：東洋紡公司製造之大豆芽萃取物(Phytopolyamine(註冊商標)-S(商品號：SPA-301)、Phytopolyamine-SP(商品號：SPA-308))、Combi股份有限公司製造之大豆萃取物素材(Soypolya(註冊商標))等。

抗老化用劑中之有效成分之含量係根據製劑之種類或形態、使用目的、使用頻率等而不同，難以統一規定，但各成分之含量或含量比較佳為對真皮纖維母細胞之活化作用發揮協同效應之含量或含量比。

例如，將抗老化用劑應用於皮膚(抗老化用劑為化妝品)之情形係如下所示。特殊低分子化DNA之含量較佳為0.01~10mg/mL(約0.001~1%)，更佳為0.01~5mg/mL(約0.001~0.5%)，進而較佳為0.01~2mg/mL(約0.001~0.2%)。又，大豆萃取物之含量較佳為0.01~10mg/mL(0.001~1%)，更佳為0.1~5mg/mL(0.01~0.5%)，進而較佳為 0.1~2mg/mL(0.01~0.2%)。

又，特殊低分子化DNA與大豆萃取物之含量比並無特別限制，以質量比計，較佳為特殊低分子化DNA：大豆萃取物=1：50~50：1，更佳為1：20~10：1，進而較佳為1：10~5：1。

進而，抗老化用劑中之聚胺濃度係根據製劑之種類或製品形態、使用目的、使用頻率等而決定，並無特別限定，適宜為通常0.00001~100mM、較佳為0.00005~75mM、更佳為0.0001~50mM。

若特殊低分子化DNA或大豆萃取物之含量或含量比為較佳之範圍內，則如下述實施例中具體所示，於對真皮纖維母細胞之活化作用(細胞增生、膠原蛋白產生促進、透明質酸產生促進、透明質酸合成酵素基因表現促進、透明質酸分解酵素基因表現減少)發揮協同效應或顯著效果之方面上有利。

此處，所謂真皮纖維母細胞之活化作用之協同效應意指：對真皮纖維母細胞併用特殊低分子化DNA與大豆萃取物時，細胞增生率、膠原蛋白產生率、透明質酸產生率之任一者大於(明顯大於)單獨使用各者時之程度之和；或對真皮纖維母細胞併用特殊低分子化DNA與大豆萃取物時，膠原蛋白或透明質酸合成酵素基因之表現量、較佳為透明質酸合成酵素基因之表現量、膠原蛋白或透明質酸分解酵素基因之表現減少量、較佳為透明質酸分解酵素表現減少量之任一者大於(明顯大於)單獨使用各者時之程度之和。又，所謂顯著效果意指在與陰性對照比較之情形時存在有意義差之效果。

本發明之抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑可藉由如下方式製成所需劑型：藉由常規方法將特殊低分子化DNA、大豆萃取物、及視需要之其他成分加以混合。此處，作為其他成分，可列舉與下述本發明之化妝品可含有之任意成分相同之成分。

本發明之化妝品係包含皮膚之抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑而成者。此處，所謂「包含而成」意指亦可包含與所需之製品形態對應之生理學上可容許之載體或可併用之其他輔助成分等任意成分。

本發明之化妝品例如可作為基礎化妝品或用於塗抹於頭皮及毛髮上之頭髮用化妝品等而提供。再者，於本發明中，所謂化妝品，除日本藥事法之化妝品以外，亦包含準藥品。

於將本發明之抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑作為化妝品來提供之情形時，可採用之劑型只要為可應用於皮膚者即可，並無特別限制。具體而言，可以液狀、乳劑狀、凝膠狀、乳霜狀、軟膏狀、泡沫狀、霧狀、氣溶膠狀等劑型製成化妝水、乳液、乳霜、凝膠、凍膠、香精、唇膏、敷劑、面膜等來提供。

作為該等化妝品可含有之其他任意成分，並無特別限制，可使用可調配於普通化妝品之添加劑等。作為此種添加劑，例如可列舉：水、油脂類、蠟類、烴類、脂肪酸類、醇類、酯類、界面活性劑、香料、收斂劑、殺菌、抗菌劑、美白劑、紫外線吸收劑、保濕劑、細胞活化劑、消炎、抗過敏劑、抗氧化劑、維生素劑、天然萃取物等。該等其他任意成分之含量亦無特別限制，可視所需劑型等而適宜地選擇。

又，本發明之抗老化用劑或抗老化相關基因表現調控用劑可以用於經口攝取之飲食品之形式來提供。飲食品除包含健康食品(例如，功能性食品、營養輔助食品、健康輔助食品、營養強化食品、營養調整食品、補充品等)、保健功能食品(例如，特定保健用食品、營養功能食品、功能性顯示食品等)、特殊用途食品(例如，患者用食品、嬰幼兒用調製奶粉、孕產婦或哺乳期婦女用奶粉等)以外，亦包含如附帶因真皮纖維母細胞之功能降低所導致之疾病或狀態(症狀)之風險降低、預防或改善之顯示之飲食品之分類者。

作為該等飲食品可含有之其他任意成分，並無特別限制，可使用可調配於普通飲食品之添加劑等。

[實施例]

以下，藉由實施例對本發明更具體地進行說明，但本發明之技術範圍並不限定於該等例示。

[實施例1]細胞增生作用、膠原蛋白、透明質酸產生促進作用

1 試驗之目的及概要

認為皮膚內之膠原蛋白或透明質酸對皮膚之緊緻、皮膚之柔軟性或潤澤發揮重要作用。因此，藉由真皮纖維母細胞之增生作用或膠原蛋白、透明質酸產生促進作用，對試驗樣品(特殊低分子化DNA與大豆萃取物)之協同效應進行評價。

2 材料與試驗方法

2-1 細胞

使用源自人類新生兒之真皮纖維母細胞株NB1RGB細胞(RIKEN BRC，Japan)，於CO₂培養箱(CO₂濃度為5%，37℃)內進行培養。

2-2 培養基

使用包含0.1%(v/v)胎牛血清(Fetal Bovine Serum)(FBS，Hyclone， UK)及1.0%(v/v)抗真菌劑(Invitrogen，USA)之伊格爾最低必需培養基(Eagle's Minimal Essential Medium)(EMEM，Wako，Japan)。

2-3 試驗樣品

(1)特殊低分子化DNA

使用日生生物股份有限公司製造之水解DNA-Na(粉末)。本品係藉由利用上述方法自鮭魚科魚類之精巢(魚白)提取DNA之Na鹽，使其水解而製備所得者。

再者，將所使用之日生生物股份有限公司製造之水解DNA-Na之利用凝膠滲透層析法(GPC)所得之分析結果示於圖1，保持時間與分子量之關係係示於表1。分子量標準之12,000係以細胞色素C(Cytochrome c)(MW為12,400)之保持時間為基礎。

根據上述分析結果，日生生物股份有限公司製造之水解DNA-Na之基於分子量之組分如下所示。

分子量為12,000~5,000之組分(溶出時間為20分鐘~未達25分鐘)：32.0%

分子量為5,000以下之組分(溶出時間為25分鐘以下)：32.4%

由此，日生生物股份有限公司製造之水解DNA-Na之分子量為12,000以下之組分為64.4%。

藉由30μM之L-抗壞血酸(CAS No.50-81-7，Wako， Japan)及含有0.1%FBS之EMEM，將調整至3.0mg/mL之試驗樣品(水解DNA-Na)以公比10進行連續稀釋而用時製備為共2個濃度(0.03mg/mL、0.3mg/mL)(最終濃度為0.01mg/mL、0.1mg/mL)。

(2)大豆萃取物

使用東洋紡公司製造之Phytopolyamine(註冊商標)-SP(商品號：SPA-308、調配比率：大豆芽萃取物約為70%、檸檬酸Na約為30%)。

藉由30μM之L-抗壞血酸(CAS No.50-81-7，Wako，Japan)及含有0.1%FBS之EMEM，用時製備0.39mg/mL、0.81mg/mL及1.53mg/mL之試驗樣品(SPA-308)(最終濃度為0.13mg/mL、0.27mg/mL及0.51mg/mL)。

(3)混合溶液(併用)

使用上述2種試驗樣品。

藉由30μM之L-抗壞血酸(CAS No.50-81-7，Wako，Japan)及含有0.1%FBS之EMEM，並藉由調整至0.81mg/mL之含有SPA-308之EMEM，將調整至3.0mg/mL之水解DNA-Na以公比10進行連續稀釋而用時製備為共2個濃度(0.03mg/mL、0.3mg/mL)[SPA-308之最終濃度為0.27mg/mL，水解DNA-Na之最終濃度為0.01mg/mL、0.1mg/mL]。

2-4 試驗構成

於細胞增生、膠原蛋白產生及透明質酸產生之算出時，1個處理組使用3孔之平均值。又，1板設置試驗樣品投予組、操作對照組各1組而實施試驗。包括試驗樣品製備在內，有關試驗之操作只要無特別記載，則均於室溫下實施。

2-5 試驗操作

(1)細胞培養

向96孔板(Lot.3595，Corning，USA)中每1孔接種2.0×10⁴cells/200μL之NB1RGB細胞，於CO₂培養箱內培養24小時。又，為了防止培養時之乾燥，向不用於試驗之孔中添加200μL之磷酸鹽緩衝溶液(Phosphate buffer saline)(PBS(-)，Lot.198601，Nissui，Japan)。

24小時後，向96孔板中添加100μL之試驗樣品及陰性對照，於CO₂培養箱內培養48小時。陰性對照使用30μM之L-抗壞血酸及含有0.1%FBS之EMEM。

48小時後，將培養上清液分注、冷凍保存(-20℃)至新的96孔板。使用2-5(3)及(4)所示之ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay，酵素結合免疫吸附分析法)測定該培養上清液中之膠原蛋白量及透明質酸量，評價試驗樣品之膠原蛋白、透明質酸產生促進作用。又，藉由2-5(2)所示之方法測定去除培養上清液之96孔板之細胞數，評價試驗樣品之細胞增生作用。

(2)細胞增生作用

如下述般評價試驗樣品對真皮纖維母細胞之增生所造成之效果。

將去除了培養基之96孔板之各孔用加溫至37℃之PBS(-)300μL安靜地洗淨2次。繼而，每1孔添加0.5mg/mL之3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-噻唑蘭(3-(4,5-dimethylthiazol-2-ul)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)(MTT，CAS No.298-93-1，Sigm α-Aldrich，USA)溶液100μL，於CO₂培養箱內培養2小時。

培養結束後，去除MTT溶液，用200μL之PBS(-)進行洗淨。為了使所生成之不溶性甲

(formazan)可溶，添加包含0.04N之鹽酸 (CAS No.7647-01-0，Kanto Chemical，Japan)之2-丙醇(CAS No.67-63-0，Kanto Chemical，Japan)200μL，於遮光下靜置1小時。

將96孔板以270rpm振盪10秒，使孔內之色素分散均勻後，使用微盤讀取器(SPARK^TM 10M，TECAN，Switzerland)測定570nm之吸光度(OD₅₇₀)。

算出將陰性對照之OD₅₇₀設為100%之試驗樣品投予組之OD₅₇₀作為細胞增生率(%)。利用不對應之2組檢定(Student's t-test，史都登氏t試驗法)對陰性對照與試驗樣品投予組之細胞增生率(%)進行有意義差檢定。檢定均於兩側將有意義水準設為未達5%(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。

(3)膠原蛋白產生促進作用

利用競爭ELISA如下述般評價試驗樣品對所謂對肌膚賦予緊緻或彈力之I型膠原蛋白之產生量的效果。

培養上清液中之膠原蛋白量之測定係使用人I型膠原ELISA套組(Human Collagen typeI ELISA kit)(Lot.EC1-E105，ACEL，Japan)。

藉由稀釋緩衝液(Dilution buffer)將膠原蛋白標準溶液以公比2進行連續稀釋，製備共7個濃度。又，藉由稀釋緩衝液將培養上清液進行2倍稀釋。

向126μL之膠原蛋白標準溶液及經2倍稀釋之培養上清液中添加14μL之生物素標記膠原蛋白抗體溶液，藉由輕敲進行混合。

藉由200μL之洗淨緩衝液(Wash buffer)將膠原蛋白固相化微量滴定盤洗淨3次，添加含有50μL之生物素標記膠原蛋白抗體之標準溶液及培養上清液，以約270rpm振盪1小時。

1小時後，藉由200μL之洗淨緩衝液洗淨3次，添加50μL之過氧化酶標記抗生物素蛋白溶液，以約270rpm振盪1小時。1小時後，藉由200μL之洗淨緩衝液洗淨3次，每1孔添加3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)受質溶液50μL，並靜置15分鐘。

其次，每1孔添加停止溶液(Stop solution)50μL，將微量滴定盤以270rpm振盪1分鐘而使孔內之色素均勻後，使用微盤讀取器測定450nm之吸光度(OD₄₅₀)。

根據膠原蛋白標準溶液之OD₄₅₀將校準曲線藉由4-參數邏輯斯蒂模型(4-Parameter logistic model)進行回歸。用由回歸方程式所獲得之值乘以稀釋倍率而算出陰性對照及試驗樣品之膠原蛋白產生量(μg/mL)。

將陰性對照之膠原蛋白產生量設為100%，算出試驗樣品之膠原蛋白產生率(%)。利用不對應之2組檢定(Student's t-test)對陰性對照與試驗樣品添加之膠原蛋白產生率(%)進行有意義差檢定。檢定均於兩側將有意義水準設為未達5%(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。

(4)透明質酸產生促進作用

利用夾層ELISA如下述般評價試驗樣品對所謂於膠原蛋白或彈力蛋白之間含有水分之透明質酸之產生量的效果。

培養上清液中之透明質酸量之測定係使用Hyaluronan Quantikine ELISA套組(Lot.DHYAL0，R&D Systems，USA)。

藉由稀釋緩衝液將透明質酸標準溶液以公比2進行連續稀釋，製備共7個濃度。又，藉由稀釋緩衝液將培養上清液進行8倍稀釋。

向聚集蛋白聚糖固相化微量滴定盤中每1孔添加50μL之生物素標記透明質酸抗體溶液。進而，添加50μL之經稀釋之培養上清液，以約270rpm振盪1小時。

1小時後，藉由400μL之洗淨緩衝液洗淨5次，添加100μL之過氧化酶標記抗生物素蛋白溶液，以約270rpm振盪1小時。1小時後，藉由400μL之洗淨緩衝液洗淨5次，每1孔添加100μL之3,3',5,5'-四甲基聯苯胺受質溶液，於遮光下靜置30分鐘。

其次，每1孔添加100μL之停止溶液，將微量滴定盤以270rpm振盪1分鐘而使孔內之色素均勻後，使用微盤讀取器測定450nm之吸光度(OD₄₅₀)。

根據透明質酸標準溶液之OD₄₅₀將校準曲線藉由4-參數邏輯斯蒂模型進行回歸。用由回歸方程式所獲得之值乘以稀釋倍率，算出陰性對照及試驗樣品之透明質酸產生量(ng/mL)。

將陰性對照之透明質酸產生量設為100%，算出試驗樣品之透明質酸產生率(%)。利用不對應之2組檢定(Student's t-test)對陰性對照與試驗樣品添加之透明質酸產生率(%)進行有意義差檢定。檢定均於兩側將有意義水準設為未達5%(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。

3 試驗結果

3-1 特殊低分子化DNA

(1)細胞增生作用

將陰性對照之細胞增生量(OD₅₇₀)設為100%來算出時之試驗樣品(水解DNA-Na)0.01mg/mL及0.1mg/mL之細胞增生率±標準偏差分別為101.3±6.8%及102.6±3.3%。

(2)I型膠原蛋白產生促進作用

將陰性對照之膠原蛋白產生量設為100%來算出時之試驗樣品(水解DNA-Na)0.01mg/mL及0.1mg/mL之膠原蛋白產生率±標準偏差分別為126.4±7.9%(p<0.01)及134.0±3.6%(p<0.01)。

(3)透明質酸產生促進作用

將陰性對照之透明質酸產生量設為100%來算出時之試驗樣品(水解DNA-Na)0.01mg/mL及0.1mg/mL之透明質酸產生率±標準偏差分別為102.2±5.0%及102.9±7.5%。

3-2 大豆萃取物

(1)細胞增生作用

將陰性對照之細胞增生量(OD₅₇₀)設為100%時之試驗樣品(SPA-308)0.13mg/mL、0.27mg/mL及0.51mg/mL之細胞增生率±標準偏差分別為111.6±1.0%(p<0.01)、123.7±2.4%(p<0.01)及137.0±6.9%(p<0.01)。

(2)I型膠原蛋白產生促進作用

將陰性對照之膠原蛋白產生促進作用設為100%來算出時之試驗樣品(SPA-308)0.13mg/mL、0.27mg/mL及0.51mg/mL之膠原蛋白產生促進率±標準偏差分別為135.1±1.3%(p<0.01)、174.1±6.3%(p<0.01)及199.9±11.8%(p<0.01)。

(3)透明質酸產生促進作用

將陰性對照之透明質酸產生量設為100%來算出時之試驗樣品(SPA-308)0.13mg/mL、0.27mg/mL及0.51mg/mL之透明質酸產生率±標準偏差分別為113.1±4.7%(p<0.01)、123.3±3.8%(p<0.01)及137.8±10.3%(p<0.01)。

3-3 特殊低分子化DNA與大豆萃取物之併用

(1)細胞增生作用

將陰性對照之細胞增生量(OD₅₇₀)設為100%來算出之試驗樣品(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL及0.1mg/mL+0.27mg/mL之細胞增生率±標準偏差分別為133.0±4.8%(p<0.01)及140.8±5.7%(p<0.01)。

(2)I型膠原蛋白產生促進作用

將陰性對照之膠原蛋白產生量設為100%來算出時之試驗樣品(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL及0.1mg/mL+0.27mg/mL之膠原蛋白產生率±標準偏差分別為178.1±5.5%(p<0.01)及230.6±9.9%(p<0.01)。

(3)透明質酸產生促進作用

將陰性對照之透明質酸產生量設為100%來算出時之試驗樣品(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL及0.1mg/mL+0.27mg/mL之透明質酸產生率±標準偏差分別為132.7±7.6%(p<0.01)及139.8±2.9%(p<0.01)。

將上述結果示於表2。表2中，「DNA-Na」為「水解DNA-Na」。由表2可知，併用特殊低分子化DNA(水解DNA-Na)與大豆萃取物(SPA-308)時之細胞增生率、膠原蛋白產生率、透明質酸產生率顯著大於單獨使用各者時之程度(率)之和。藉此，可確認特殊低分子化DNA與大豆萃取物對真皮纖維母細胞之功能活化作用(細胞增生作用、膠原蛋白產生促進作用及透明質酸產生促進作用)之協同效應。

[實施例2]透明質酸合成或分解酵素基因表現調控1試驗之目的及概要

已知皮膚內之膠原蛋白或透明質酸對皮膚之緊緻、柔軟性或潤澤發揮重要作用，特別是真皮內之透明質酸量之減少與皮膚之彈力之降低或皺紋形成相關聯。此處，於本實施例中，藉由即時聚合酶鏈鎖反應法對真皮纖維母細胞之透明質酸之合成或分解等試驗樣品(特殊低分子化DNA與大豆萃取物)對與抗老化相關之基因之表現的效果進行評價。

2 材料與試驗方法

2-1 細胞

於相同條件下培養與實施例1之2-1相同之細胞並使用。

2-2 培養基

將FBS(Fetal Bovine Serum)之含量變為10.0%(v/v)，除此以外，使用與實施例1之2-2相同之組成之培養基(EMEM)。

2-3 試驗樣品

(1)特殊低分子化DNA溶液

使用與實施例1之2-3之(1)相同之特殊低分子化DNA(水解DNA- Na)。

藉由含有10%FBS之EMEM，將調整至1mg/mL之試驗樣品(水解DNA-Na)以公比10進行連續稀釋而用時製備成共2個濃度(最終濃度為0.01mg/mL、0.1mg/mL)。

(2)大豆萃取物溶液

使用與實施例1之2-3之(2)相同之大豆萃取物(SPA-308)。

藉由含有10%FBS之EMEM，將調整至2.7mg/mL之試驗樣品(SPA-308)以公比10進行連續稀釋而用時製備成共2個濃度(最終濃度為0.027mg/mL、0.27mg/mL)。

(3)混合溶液(併用)

使用上述2種試驗樣品。

藉由含有10%FBS之EMEM，並藉由調整至0.27mg/mL之含有SPA-308之EMEM，將調整至1mg/mL之水解DNA-Na以公比10進行連續稀釋而用時製備成共2個濃度(SPA-308之最終濃度為0.27mg/mL，水解DNA-Na之最終濃度為0.01mg/mL、0.1mg/mL)。

2-4 基因表現分析

使用TaqMan Assay(Applied Biosystems，USA)，對編碼如下酵素之基因實施表現分析。

‧透明質酸合成酵素1(Human Hyaluronan Synthase 1(HAS1)，Assay ID.Hs00758053_m1)

‧透明質酸合成酵素2(Human Hyaluronan Synthase 2(HAS2)，Assay ID.Hs00193435_m1)

‧透明質酸分解酵素(Human Hyaluronidase 1(HYAL1)，Assay ID. Hs00201046_ml)

作為內部標準基因，使用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Human Glyceraldehyde-3-PhosphateDehydrogenase(GAPDH)，Assay ID.Hs02786624_g1)基因。

2-5 試驗構成

於基因表現量之分析時，1個處理組使用3片35mm之皿(Cat No.150318，Thermo Scientific，USA)之平均值。包括試驗樣品製備在內之與試驗相關之操作只要無特別記載，則均於室溫下實施。

2-6 試驗方法

(1)細胞培養及試驗樣品添加

向35mm之皿中接種5.0×10⁵cells/2mL之NB1RGB細胞，於CO₂培養箱內培養24小時。24小時後，去除35mm之皿之培養基並添加試驗樣品及含有陰性對照之培養基，於CO₂培養箱內培養24小時。

(2)RNA(ribonucleic acid，核糖核酸)提取、純化及定量

使用PureLink^TM RNA迷你套組(Cat No.12183018A，Invitrogen，USA)，如下述般進行RNA提取、純化。

培養24小時後，將去除了培養基之35mm之皿用加溫至37℃之PBS(-)2mL洗淨2次。向其中添加600μL之含有2M之二硫蘇糖醇(Dithiothreitol)(CAS No.27565-41-9，Invitrogen，USA)之細胞溶解緩衝液(Lysis Buffer)而使細胞溶解，回收溶菌液。

進而，使用均質器(Homogenizer)(Cat No.12183-026，Invitrogen，USA)，將所回收之溶菌液中之細胞破碎。

向細胞破碎液中添加600μL之70%乙醇(CAS No.64-17- 5，Japan Alcohol，Japan)溶液後，移至帶有氧化矽薄膜之管柱後，於12,000×g、室溫下離心15秒，廢棄濾液。

向氧化矽薄膜中添加700μL之含有異硫氰酸胍之洗淨緩衝液I及500μL之含有乙醇之洗淨緩衝液II，洗淨後，於12,000×g、室溫下離心15秒，使其乾燥。向其中添加30μL之去RNA酶水(RNase-Free Water)，於室溫下靜置1分鐘後，於12,000×g、室溫下離心15秒。將該等步驟重複2次，使RNA自膜溶出。

將所溶出之RNA之一部分分取至UV透過性96孔板(Cat No.8404，Thermo Scientific，USA)中並藉由三羥甲基胺基甲烷-四乙酸乙二胺緩衝液(Tris-EDTA Buffer)(TE(pH值為8.0)，Cat No.310-90023，NIPPON GENE，Japan)進行25倍稀釋，使用微盤讀取器(SPARK^TM10M TECAN，Switzerland)測定260nm之吸光度(OD₂₆₀)。

使用OD₂₆₀並藉由下式算出陰性對照及試驗樣品之RNA濃度，藉由TE緩衝液進行稀釋而將RNA濃度調整至10μg/mL。

RNA濃度(μg/mL)=A×K×0.3(光程長度：cm)×25(稀釋倍率)

A：陰性對照或試驗樣品之OD₂₆₀

K：K=40、RNA之吸光係數

(3)利用即時聚合酶鏈鎖反應法所進行之基因表現分析

使用SuperScript^TM IV VILO^TM Master Mix with ezDNase(Cat No.11766050，Invitrogen，USA)，如下述般進行RNA之反轉錄。

向8連管(AB1182，Thermo Scientific，USA)中每1孔添加1μL之10×ezDNase Buffer、1μL之ezDNase enzyme、6μL之去核酸酶水(Nuclease-free Water)及2μL之10μg/mL之RNA，於37℃下保溫2分鐘。2分鐘後，向8連管中每1孔添加4μL之SuperScript^TM IV VILO^TM Master Mix及6μL之去核酸酶水，使用即時聚合酶鏈鎖反應(QuantStudio^TM3，Applied Biosystems，USA)於25℃下加熱10分鐘、於50℃下加熱10分鐘、於85℃下加熱5分鐘而合成cDNA。

向PCR板(Cat No.N8010560，Thermo Scientific，USA)中每1孔添加10μL之TaqMan^TM Fast Advanced Master Mix(Cat No.4444557，Applied Biosystems，USA)、1μL之TaqMan Gene Expressior、7μL之UltraPure^TMDistilled Water(Invitrogen，Cat No.10977-015，USA)及2μL之cDNA，藉由板封(Cat No.4360954，Thermo Scientific，USA)進行密封。

使用板式離心機將溶液短暫離心，去除起泡後，使用即時聚合酶鏈鎖反應系統，進行即時螢光定量聚合酶鏈鎖反應(Real-Time qPCR)，算出陰性對照及試驗樣品中之各基因之螢光訊號達到任意閾值時之循環數即閾值循環數(Threshold Cycle)(Ct)值。藉由內部標準基因來修正Ct值，設為△Ct值。藉由陰性對照之△Ct值之平均來修正△Ct值，將其設為△△Ct值。藉由△△Ct法，假定每1循環之檢測之差成為2倍量之差，代入2^-△△Ct而分析將陰性對照之基因表現量設為1時之試驗樣品之基因表現量。利用有對應之2組檢定(paired t-test)對陰性對照與試驗樣品添加之基因表現量進行有意義差檢定。檢定均於兩側將有意義水準設為未達5%(p<0.05，p<0.01，p<0.001)。

3 試驗結果

3-1 特殊低分子化DNA

(1)透明質酸合成酵素1基因(HAS1)表現

將陰性對照之HAS1表現量設為1時之試驗樣品(水解DNA-Na)0.01mg/mL及0.1mg/mL之HAS1表現量±標準偏差分別為1.11±0.04及1.02±0.07。

(2)透明質酸合成酵素2基因(HAS2)表現

將陰性對照之HAS2表現量設為1時之試驗樣品(水解DNA-Na)0.01mg/mL及0.1mg/mL之HAS2表現量±標準偏差分別為1.25±0.09(p<0.05)及1.49±0.05(p<0.001)。

(3)透明質酸分解酵素基因(HYAL1)表現

將陰性對照之HYAL1表現量設為1時之試驗樣品(水解DNA-Na)0.01mg/mL及0.1mg/mL之HYAL1表現量±標準偏差分別為1.06±0.12及1.34±0.14。

3-2 大豆萃取物

(1)透明質酸合成酵素1基因(HAS1)表現

將陰性對照之HAS1表現量設為1時之試驗樣品(SPA-308)0.027mg/mL及0.27mg/mL之HAS1表現量±標準偏差分別為1.03±1.2及0.99±0.16。

(2)透明質酸合成酵素2基因(HAS2)表現

將陰性對照之HAS2表現量設為1時之試驗樣品(SPA-308)0.027mg/mL及0.27mg/mL之HAS2表現量±標準偏差分別為1.88±0.46(p<0.05)及1.50±0.11(p<0.01)。

(3)透明質酸分解酵素基因(HYAL1)表現

將陰性對照之HYAL1表現量設為1時之試驗樣品(SPA-308)0.027mg/mL及0.27mg/mL之HYAL1表現量±標準偏差分別為0.97±0.08及 0.84±0.06。

3-3 特殊低分子化DNA與大豆萃取物之併用

(1)透明質酸合成酵素1基因(HAS1)表現

將陰性對照之HAS1表現量設為1時之試驗樣品(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL及0.1mg/mL+0.27mg/mL之HAS1表現量±標準偏差分別為0.99±0.08及1.51±0.26(p<0.05)。

(2)透明質酸合成酵素2基因(HAS2)表現

將陰性對照之(HAS2)表現量設為1時之試驗樣品(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL及0.1mg/mL+0.27mg/mL之(HAS2)表現量±標準偏差分別為1.41±0.10(p<0.01)及1.54±0.07(p<0.001)。

(3)透明質酸分解酵素基因(HYAL1)表現

將陰性對照之(HYAL1)表現量設為1時之試驗樣品(水解DNA-Na+SPA-308)0.01mg/mL+0.27mg/mL及0.1mg/mL+0.27mg/mL之(HYAL1)表現量±標準偏差分別為0.58±0.11(p<0.01)及0.93±0.05。

將上述結果示於表3。表3中，「DNA-Na」為「水解DNA-Na」。由表3可知，於併用特殊低分子化DNA(水解DNA-Na)與大豆萃取物(SPA-308)之情形時，透明質酸合成酵素-1基因(HAS1)之表現量協同增加，透明質酸合成酵素-2基因(HAS2)之表現量與陰性對照相比顯著增加。進而，可知透明質酸分解酵素基因(HYAL1)表現量協同減少。由此，可確認藉由併用特殊低分子化DNA(水解DNA-Na)與大豆萃取物(SPA-308)，與透明質酸合成相關之基因表現之促進及與分解相關之基因表現之減少同時發生。

由以上結果可推測，併用實施例1所示之特殊低分子化DNA(水解DNA-Na)與大豆萃取物(SPA-308)時之膠原蛋白與透明質酸之協同產生增加的原因在於：與膠原蛋白及透明質酸之合成相關之基因表現之促進及與分解相關之基因表現之減少同時發生。

[產業上之可利用性]

本發明之皮膚之抗老化用劑具有與先前之抗老化劑不同之作用、功能，可較先前之抗老化劑更有效率地預防及/或改善肌膚之老化，因此於化妝品之領域特別有用。

Claims

一種特殊低分子化DNA及大豆萃取物作為有效成分之用途，其係用於製備真皮纖維母細胞之功能活化劑，上述特殊低分子化DNA為自魚類之精巢(魚白)提取之DNA之水解處理物，且含有分子量為12,000以下之組分10~80%，上述大豆萃取物為選自由大豆之種子、胚芽及芽所組成之群中之至少1種之萃取物，上述真皮纖維母細胞之功能活化劑為選自由真皮纖維母細胞之增生促進劑、I型膠原蛋白產生促進劑及透明質酸產生促進劑所組成之群中之至少1種劑。
如請求項1之用途，其中特殊低分子化DNA之含量為0.001~1質量%，且大豆萃取物之含量為0.001~1質量%。
一種特殊低分子化DNA及大豆萃取物作為有效成分之用途，其係用於製備真皮纖維母細胞之基因表現調控劑，上述特殊低分子化DNA為自魚類之精巢(魚白)提取之DNA之水解處理物，且含有分子量為12,000以下之組分10~80%，上述大豆萃取物為選自由大豆之種子、胚芽及芽所組成之群中之至少1種之萃取物，上述真皮纖維母細胞之基因表現調控劑為真皮纖維母細胞之透明質酸合成酵素1基因及透明質酸合成酵素2基因之任一者或二者之基因表現促進劑、或透明質酸分解酵素基因之基因表現減少劑。
如請求項3之用途，其中特殊低分子化DNA之含量為0.001~1質量%，且大豆萃取物之含量為0.001~1質量%。