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TWI745275B - 使用醣脂激活人類ｉＮＫＴ細胞 - Google Patents

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TWI745275B
TWI745275B TW104129739A TW104129739A TWI745275B TW I745275 B TWI745275 B TW I745275B TW 104129739 A TW104129739 A TW 104129739A TW 104129739 A TW104129739 A TW 104129739A TW I745275 B TWI745275 B TW I745275B
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cells
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TW104129739A
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翁啟惠
陳鈴津
吳岱娜
林昆賢
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中央研究院
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Abstract

本發明揭示用於iNKT非依賴性誘導趨化激素的鞘醣脂(glycosphingolipid；GSL)組合物及方法。

Description

使用醣脂激活人類iNKT細胞
本發明大體上關於免疫療法領域。詳言之，本發明係關於醣脂及其變體，該等可調節人類恆定型自然殺手T(iNKT)細胞及刺激細胞激素及/或趨化激素產生且因此反式激活下游免疫細胞，由此銜接先天性及適應性免疫。
似自然殺手T(NKT)細胞為在諸如癌症及自體免疫病症之疾病的治療中具有巨大治療潛能的獨特T淋巴球群體。恆定型自然殺手T(iNKT)細胞形成具有先天性及適應性免疫特徵的調節性T細胞子集。相較於習知T細胞係經MHC I類或II類分子呈現之肽激活，iNKT細胞係識別在抗原呈現細胞(APC)上表現之非經典MHC I分子CD1d之情形中存在的脂質衍生物。
已發現某些與葡萄糖或半乳糖以α鍵聯的醣脂會展現活體外及活體內抗腫瘤活性，並且顯示其為已知小鼠及人類恆定型自然殺手T細胞(iNKT細胞)的最強力配位體。
恆定型NKT細胞(iNKT細胞)攜有恆定TCR-α鏈(小鼠中之Vα14/Jα18及人類中之Vα24/Jα18)且共表現CD161抗原(小鼠中之NK細胞標記NK1.1及人類中之NKR-P1A)。(1)Lantz,O.；Bendelac,A.J.Exp.Med.1994,180,1097；(2)Dellabona,P.；Padovan,E.；Casorati,G.；Brockhaus,M.；Lanzavecchia,A.J.Exp.Med.1994,180,1171；(3) Makino,Y.；Kanno,R.；Ito,T.；Higashino,K.；Taniguchi,M.Int.Immunol.1995,7,1157；及(4)Davodeau,F.；Peyrat,M.A.；Necker,A.；Dominici,R.；Blanchard,F.；Leget,C.；Gaschet,J.；Costa,P.；Jacques,Y.；Godard,A.；Vie,H.；Poggi,A.；Romagne,F.；Bonneville,M.J.Immunol.1997,158,5603。其等會回應藉由抗原呈現細胞上之CD1d分子呈現的αGalCer而分泌大量Th1(例如IFN-γ、IL-2)及Th2(例如IL-4、IL-6)細胞激素。5-9(5)Kawano,T.；Cui,J.；Koezuka,Y.；Toura,I.；Kaneko,Y.；Motoki,K.；Ueno,H.；Nakagawa,R.；Sato,H.；Kondo,E.；Koseki,H.；Taniguchi,M.Science 1997,278,1626；(6)Yoshimoto,T.；Paul,W.E.J.Exp.Med.1994,179,1285；(7)Arase,H.；Arase,N.；Nakagawa,K.；Good,R.A.；Onoe,K.Eur.J.Immunol.1993,23,307；(8)Kawakami,K.；Yamamoto,N.；Kinjo,Y.；Miyagi,K.；Nakasone,C.；Uezu,K.；Kinjo,T.；Nakayama,T.；Taniguchi,M.；Saito,A.Eur.J.Immunol.2003,33,3322；及(9)Nieuwenhuis,E.E.；Matsumoto,T.；Exley,M.；Schleipman,R.A.；Glickman,J.；Bailey,D.T.；Corazza,N.；Colgan,S.P.；Onderdonk,A.B.；Blumberg,R.S.Nat.Med.2002,8,588。此等經分泌的細胞激素可接著反式激活下游免疫細胞，包括樹突狀細胞(DC)、自然殺手細胞(NK)、B細胞、CD4+ T及CD8+ T細胞，且由此銜接先天性及適應性免疫。10-12(10)Eberl,G.；MacDonald,H.R.Eur.J.Immunol.2000,30,985；(11)Eberl,G.；Brawand,P.；MacDonald,H.R.J.Immunol.2000,165,4305；及(12)Kitamura,H.；Ohta,A.；Sekimoto,M.；Sato,M.；Iwakabe,K.；Nakui,M.；Yahata,T.；Meng,H.；Koda,T.；Nishimura,S.；Kawano,T.；Taniguchi,M.；Nishimura,T.Cell.Immunol.2000,199,37。
然而，Th1及Th2細胞激素的抗衡會限制αGalCer用於治療多種病症的臨床應用。13-16(13)Tahir,S.M.；Cheng,O.；Shaulov,A.； Koezuka,Y.；Bubley,G.J.；Wilson,S.B.；Balk,S.P.；Exley,M.A.J.Immunol.2001,167,4046；(14)Dhodapkar,M.V.；Geller,M.D.；Chang,D.H.；Shimizu,K.；Fujii,S.；Dhodapkar,K.M.；Krasovsky,J.J.Exp.Med.2003,197,1667；(15)Giaccone,G.；Punt,C.J.；Ando,Y.；Ruijter,R.；Nishi,N.；Peters,M.；von Blomberg,B.M.；Scheper,R.J.；van der Vliet,H.J.；van den Eertwegh,A.J.；Roelvink,M.；Beijnen,J.；Zwierzina,H.；Pinedo,H.M.Clin.Cancer Res.2002,8,3702；及(16)Bricard,G.；Cesson,V.；Devevre,E.；Bouzourene,H.；Barbey,C.；Rufer,N.；Im,J.S.；Alves,P.M.；Martinet,O.；Halkic,N.；Cerottini,J.C.；Romero,P.；Porcelli,S.A.；Macdonald,H.R.；Speiser,D.E.J.Immunol.2009,182,5140。
因此，許多類似物係經設計以刺激iNKT細胞之選擇性Th1或Th2細胞激素反應。醣脂在小鼠及人類中均具有顯著Th1偏向，從而產生優異的活體內腫瘤保護。舉例而言，具有截短的神經鞘胺醇尾的鞘醣脂(GSL)可驅使免疫反應朝著Th2方向且預防自體免疫腦脊髓炎。Miyamoto,K.；Miyake,S.；Yamamura,T.Nature 2001,413,531。另一方面，在醯基鏈上具有苯環之GSL會誘導小鼠及人類之偏向Th1之細胞激素且顯示出對小鼠乳房腫瘤、肺腫瘤及黑色素瘤之更有效的抗癌活性。(Chang,Y.J.；Huang,J.R.；Tsai,Y.C.；Hung,J.T.；Wu,D.；Fujio,M.；Wong,C.H.；Yu,A.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2007,104,10299及Wu,T.N.；Lin,K.H.；Chang,Y.J.；Huang,J.R.；Cheng,J.Y.；Yu,A.L.；Wong,C.H.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2011,108,17275。
CD1d與醣脂之間的二元相互作用以及iNKT TCR與CD1d-醣脂複合物之間的三元相互作用的檢查闡明其結構-活性關係(SAR)的潛在機 制。與αGalCer相比，具有相同醣基之苯基GSL展現更強二元及三元相互作用，從而產生更加偏向Th1之反應，且生物反應與小鼠及人類之三元複合物的結合親合力具有顯著相關性。19-21 Wu,T.N.；Lin,K.H.；Chang,Y.J.；Huang,J.R.；Cheng,J.Y.；Yu,A.L.；Wong,C.H.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2011,108,17275；Liang,P.H.；Imamura,M.；Li,X.；Wu,D.；Fujio,M.；Guy,R.T.；Wu,B.C.；Tsuji,M.；Wong,C.H.J.Am.Chem.Soc.2008,130,12348；及Li,X.；Fujio,M.；Imamura,M.；Wu,D.；Vasan,S.；Wong,C.H.；Ho,D.D.；Tsuji,M.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2010,107,13010。
已知恆定型自然殺手T(iNKT)細胞因其產生大量效應細胞激素之能力而具有顯著的免疫調節能力。需要可刺激人類恆定型NKT(iNKT)細胞及調節人類之細胞激素及趨化激素產生之經改良鞘醣脂。
因此，本發明係基於以下意外發現：鞘醣脂(GSL)具有出人意料的免疫刺激功效。本發明揭示藉由此等例示性GSL用於iNKT非依賴性誘導趨化激素之方法，亦提供使用GSL之人類免疫刺激方法。
本發明提供一種強化有需要之個體之抗原免疫原性的方法，其包含以共投與或共調配形式組合投與該抗原與包含通式1之GSL的佐劑組合物。
根據本發明，使用GSL作為免疫佐劑可引起由抗原誘導之保護性免疫的增強及/或持續時間延長，且至少部分歸因於抗原特異性Th1型反應之增強及/或延長。
本發明之含GSL佐劑可與任何抗原(詳言之，與來源於感染物或腫瘤之抗原)聯合投與。較佳地，佐劑及抗原同時投與，最佳以單一劑型投與。
在另一個實施例中，本發明提供一種用於治療個體之疾病的預防及/或治療方法，其包含向該個體投與免疫保護性抗原以及包括 GSL之佐劑組合物。如本文所規定，此方法可用於預防及/或治療各種感染性或贅生性疾病。
結合本發明之方法，亦提供醫藥組合物及疫苗組合物，其包含免疫原性有效量之抗原及免疫原性有效量之選自式1內之GSL的佐劑，以及視情況存在之醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。
因此，在一個態樣中，本發明係關於式(I)之免疫佐劑化合物的結構及功能範例：
Figure 104129739-A0202-12-0005-2
或其醫藥學上可接受之鹽；其中R1、R2、R3、R4、R5、n及m如本文所述。
在一些實施例中，R4具有式(II)：
Figure 104129739-A0202-12-0005-3
其中i及R6如本文所述。
在一些實施例中，R4具有式(III)：
Figure 104129739-A0202-12-0005-199
其中j、k、R7及R8如本文所述。
在某些態樣中，本發明之實施例可包括或排除(例如不符合限制條件)本文中列出的任何成員或範例，包括圖1中列出的範例的成員。在某些實施例中，範例可包括或排除化合物C34、II-1至II-12、III-1至III-24及化合物43及53中之任一或多者。
在某些實施例中，提供以下化合物：
Figure 104129739-A0202-12-0006-5
Figure 104129739-A0202-12-0006-6
Figure 104129739-A0202-12-0006-7
本發明之態樣亦關於醫藥組合物，其包含(i)當向個體(包括人類)投與時足以刺激免疫反應之量的本文所揭示之化合物及(ii)醫藥學上可接受之賦形劑。
在一些實施例中，醫藥組合物包含抗原及疫苗佐劑。在某些實施例中，抗原為腫瘤抗原。
在一些實施例中，醫藥組合物包含抗癌治療劑。
在醫藥組合物之一些實施例中，化合物中之R4係選自經取代或未經取代之芳基及經取代或未經取代之雜芳基，且其中該化合物能夠增加人類之Th1細胞激素，同時伴隨最少Th2細胞激素增加。
本發明之態樣係關於用於刺激有需要之人類個體之免疫反應的方法，該方法包含：向該個體投與治療有效量之本文所揭示之組合 物。
在一些態樣中，化合物以能夠升高人類之恆定型自然殺手T(iNKT)細胞之量投與。
在一些態樣中，化合物之投與增加人類之細胞激素及/或趨化激素產生。在一些實施例中，細胞激素產生足以反式激活下游免疫細胞。在一些實施例中，下游免疫細胞包含樹突狀細胞(DC)、自然殺手細胞(NK)、B細胞、CD4+ T及CD8+ T細胞中之一或多者。
在一些態樣中，細胞激素包含Th1細胞激素。在一些實施例中，Th1細胞激素係選自：干擾素-γ(IFN-γ)、GM-CSF、TNFα、介白素2、介白素12。
在一些態樣中，趨化激素係選自：RANTES、MIP-1α、KC、MCP-1、IP-10及MIG。
在一些態樣中，組合物之投與具有抗癌效應。在一些實施例中，癌症係選自由以下組成之群：肺癌、乳癌、肝癌、白血病、實體腫瘤及癌瘤。
在一些實施例中，化合物中之R4係選自經取代或未經取代之芳基及經取代或未經取代之雜芳基，且其中人類Th1細胞激素之增加超過任何Th2細胞激素之增加。
本發明之態樣係關於用於升高有需要之人類個體之恆定型自然殺手T(iNKT)細胞產生的方法，該方法包含：向該個體投與治療有效量之組合物，其中該組合物包含本文所揭示之化合物。在一些實施例中，iNKT含量之升高當與由投與等量包含α-半乳糖(αGal)作為醣基頭基之醣脂類似物引起之iNKT含量升高相比時較大。
本發明之態樣係關於用於刺激有需要之人類個體之細胞激素及/或趨化激素產生的方法，該方法包含：向該個體投與治療有效量之組合物，其中該組合物包含足以增加細胞激素/趨化激素產生之量的本 文所揭示之化合物。
在一些實施例中，細胞激素產生足以反式激活下游免疫細胞。在一些實施例中，下游免疫細胞包含樹突狀細胞(DC)、自然殺手細胞(NK)、B細胞、CD4+ T及CD8+ T細胞中之一或多者。
在一些態樣中，細胞激素包含Th1細胞激素。在一些實施例中，細胞激素係選自：干擾素-γ(IFN-γ)、GM-CSF、TNFα、介白素2及介白素12。
在一些態樣中，趨化激素係選自：RANTES、MIP-1α、KC、MCP-1、IP-10及MIG。
此等及其他態樣將由以下較佳實施例之描述結合以下圖式而變得顯而易見，但可在不脫離本發明之新穎概念的精神及範疇之情況下，於其中進行變化及修改。
以下圖式形成本發明之一部分且經包括以進一步證明本發明之某些態樣，其發明內容可藉由參照此等圖式中之一或多者結合本文中存在之特定實施例的詳細描述而被理解的更好。
圖1展示：(1A)具有αGal或αGlc之醣脂的結構。7DW8-5-Man為唯一具有αMan之化合物。在某些態樣中，本發明之實施例可包括或排除(例如不符合限制條件)本文中列出的任何成員或範例。(1B)合成流程。
圖2A. 與半乳糖鍵聯之例示性代表性C34 GSL衍生物(C34、K691、K705、K706)。具有Vα14 T細胞抗原受體DN3A4-1.2之CD1d反應性T細胞融合瘤細胞在96孔中用小鼠CD1d呈現細胞A20-CD1d培養且用1、0.1、0.01μg/mL之不同醣脂刺激。在培育18小時後，藉由ELISA分析量測釋放於培養基中之IL-2作為iNKT細胞激活的讀數。與1及0.1μg/mL的C34相比，K691分泌顯著較少量的IL-2，表明C34之第 2苯環上存在F的重要性。K706在1μg/mL下刺激iNKT IL-2分泌顯著不如C34有效。在誘導小鼠IL-2分泌時，K705在所有濃度下與C34類似且在1及0.1μg/mL下與K706相比較佳，表明第2個F在鄰位比在間位更好地激活小鼠iNKT細胞。綜合而言，在第2苯環上之F原子的數目及位置可極大地調節小鼠iNKT激活。
圖2B-1至圖2B-19例示性C34衍生物之合成流程。(2B-1)試劑及條件：(a)C13H27PPh3Br、LHMDS、THF；(b)H2、Pd(OH)2、EtOAc；(c)Tf2O、2,6-二甲基吡啶、TMGA、CH2Cl2；(d)施陶丁格反應；(e)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-2)試劑及條件：(a)C13H27PPh3Br、LHMDS、THF；(b)H2、Pd(OH)2、EtOAc；(c)Tf2O、2,6-二甲基吡啶、TMGA、CH2Cl2；(d)施陶丁格反應；(e)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-3)試劑及條件：(a)C15H31PPh3Br、n-BuLi、THF；(b)OsO4、NMO、t-BuOH、H2O；(c)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-4)試劑及條件：(a)C15H31PPh3Br、n-BuLi、THF；(b)OsO4、NMO、t-BuOH、H2O；(c)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-5)試劑及條件：(a)C12H25PPh3Br、n-BuLi、THF；(b)施陶丁格反應；(c)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-6)試劑及條件：(a)C12H25PPh3Br、n-BuLi、THF；(b)施陶丁格反應；(c)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-7)試劑及條件：(a)C13H27PPh3Br、LHMDS、THF；(b)H2、Pd/C、EtOAc；(c)MsCl、吡啶；(d)NaBH4、甲醇；(e)施陶丁格反應；(f)EDU、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-8)試劑及條件：(a)C13H27PPh3Br、LHMDS、THF；(b)H2、Pd/C、EtOAc；(c)MsCl、吡啶；(d)NaBH4、甲醇；(e)施陶丁格反應；(f)EDU、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-9)試劑及條件：(a)NaIO4；(b)C13H27PPh3Br、LHMDS、THF；(c)施陶丁格反應；(d)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-10)試劑及條件：(a)NaIO4；(b)C13H27PPh3Br、LHMDS、THF；(c)施陶丁格反應；(d)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-11)試劑及條件：(a)NaIO4、PBS；(b)C14H29MgCl、THF；(c)施陶丁格反應；(d)EDC、HBTU、 Et3N、CH2Cl2。(2B-12)試劑及條件：(a)NaIO4、PBS；(b)C14H29MgCl、THF；(c)施陶丁格反應；(d)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-13)試劑及條件：(a)CH3PPh3Br、LHMDS、THF；(b)第二代格拉布催化劑；(c)施陶丁格反應；(d)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-14)試劑及條件：(a)CH3PPh3Br、LHMDS、THF；(b)第二代格拉布催化劑；(c)施陶丁格反應；(d)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-15)試劑及條件：(a)CH3PPh3Br、LHMDS、THF；(b)丙烯醯氯、Et3N、DMAP、CH2Cl2；(c)第二代格拉布催化劑；(d)1-十二烯、第二代格拉布催化劑；(e)施陶丁格反應；(f)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-16)試劑及條件：(a)CH3PPh3Br、LHMDS、THF；(b)丙烯醯氯、Et3N、DMAP、CH2Cl2；(c)第二代格拉布催化劑；(d)1-十二烯、第二代格拉布催化劑；(e)施陶丁格反應；(f)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-17)試劑及條件：(a)CH3PPh3Br、LHMDS、THF；(b)丙烯醯氯、Et3N、DMAP、CH2Cl2；(c)第二代格拉布催化劑；(d)1-十二烯、第二代格拉布催化劑；(e)施陶丁格反應；(f)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-18)試劑及條件：(a)C13H27PPh3Br、LHMDS、THF；(b)施陶丁格反應；(c)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。(2B-19)試劑及條件：(a)1-十四炔、BuLi、THF；(b)施陶丁格反應；(c)EDC、HBTU、Et3N、CH2Cl2。
圖3展示：CD1d-醣脂複合物與iNKT細胞之三元相互作用。(3A)DN3A4-1.2 Vα14+ iNKT融合瘤細胞及(3B)7DW8-5-擴增Vα24+ iNKT細胞分別用各種濃度之指定二聚mCD1d-醣脂及hCD1d-醣脂複合物在4℃下培育30分鐘。在指定濃度下結合複合物之含量藉由抗mIgG1二級抗體偵測且藉由流動式細胞測量術分析。CD1ddi-醣脂複合物之結合百分比與濃度之間的關係標繪在小鼠(3A)及人類(3B)中。小鼠(3C)及人類(3D)中之KD值分別由標繪圖(3A)及(3B)之史卡查變換(Scatchard transformation)計算得到。所進行之分析為二重複。
圖4展示：mCD1d相較於hCD1d調換分析。(4A)鼠類DN3A4-1.2 Vα14+ iNKT融合瘤細胞或(4B)C1-擴增Vα24+ iNKT細胞用由mCD1d(A20-CD1d細胞)或hCD1d(HeLa-CD1d細胞)呈現之指定醣脂在1、0.1及0.01μg/ml下脈衝。在18小時後，收集清液層以藉由ELISA分析(4A)或使用Beadlyte®人類細胞激素套組及Luminex® 200TM閱讀系統(4B)量測IL-2分泌。所進行之分析為三重複。8-5為7DW8-5之縮寫。
圖5展示：CD1d-GSL-iNKT TCR三元複合物之電腦模型化。展示小鼠(5A)及人類(5B)之CD1d-C1-iNKT TCR複合物內的(5A)/(5B)氫鍵。注意氫鍵之形成在保守殘基中，包括CD1d之人類Asp80(小鼠Asp80)、人類Thr154(小鼠Thr156)、人類Asp151(小鼠Asp 153)及iNKT TCR之人類Gly96(小鼠Gly96)。此外，iNKT TCR之小鼠Asn30以及人類Phe29及Ser30為與C1之3'-及/或4'-OH形成H鍵相互作用的關鍵殘基。(5C)葡萄糖之水平位4'-OH可藉由與結晶水之較強相互作用補償Phe29相互作用之缺失，結晶水由人類iNKT TCR-Phe51及hCD1d-Trp153捕獲。(5D)來自芳族相互作用之較高能量可驅使C34或C34-Glc之醯基鏈至CD1d內A'通道之較低位置(接近Cys12)，產生對頭基取向之細微擾動。(5E)使用Autodock4.2計算得到的三元複合物的自由能
圖6展示：由7DW8-5-Glc觸發之劑量依賴性趨化激素分泌。B6野生型小鼠以每隻小鼠0.1或1μg靜脈內注射7DW8-5-Glc。針對趨化激素分泌物，諸如IP-10(6A)、KC(6B)、MCP-1(6C)及MIP-1α(6D)，對注射後2小時及18小時收集之血清加以分析。此等趨化激素在注射後2小時達至峰值。
圖7展示：細胞激素及趨化激素之iNKT依賴性產生。B6野生型及Jα18基因剔除小鼠靜脈內注射指定醣脂(1微克/小鼠)或媒劑。針對細胞激素，如IL-2(7A)、IL-6(7B)、GM-CSF(7C)及TNFα(7D)，以及趨化激素，諸如IP-10(7E)、MIG(7F)、KC(7G)及MCP-1(7H)，對注射後2小時及18小時收集之血清加以分析。僅MIG在注射後18小時達 至峰值，而其餘在注射後2小時達至峰值。
圖8展示：在指定醣脂刺激後野生型小鼠免疫細胞之螢光流式細胞分選儀分析。用指定醣脂(1微克/小鼠)或媒劑(含1% DMSO之PBS)處理之B6野生型小鼠在注射後72小時處死且對其脾細胞進行螢光流式細胞分選儀分析。(8A)總脾細胞，(8B)總CD11Chi細胞，(8C)CD11Chi/CD80+細胞，(8D)CD11Chi/CD86+細胞，(8E)CD4+ T細胞及(8F)CD8+ T細胞。
圖9展示：在指定醣脂刺激後Jα18 KO小鼠免疫細胞之螢光流式細胞分選儀分析。用指定醣脂(1微克/小鼠)或媒劑(含1% DMSO之PBS)處理之B6 Jα18 KO小鼠在注射後72小時處死且對其脾細胞進行螢光流式細胞分選儀分析。(9A)總脾細胞，(9B)總CD11Chi細胞，(9C)CD11Chi/CD80+細胞，(9D)CD11Chi/CD86+細胞，(9E)CD4+ T細胞及(9F)CD8+ T細胞(學生t檢驗：*，與D相比p<0.05)
圖10展示：mCD1d與醣脂之間二元複合物的結合強度。(10A,10B)塗佈於ELISA盤上之不同濃度的mCD1d-醣脂複合物用飽和量之與生物素結合之L363抗體培育，後為抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測及ELISA量測。(10A)標繪反映L363抗體結合之OD值與CD1ddi-醣脂複合物之濃度之間的關係。(10B)如材料及方法中所述計算L363抗體與指定mCD1d-醣脂複合物之間的解離常數(KD)。(10C)標繪反映L363抗體結合之OD值與醣脂濃度之間的關係。(10D)由L363抗體結合曲線(10C)之史卡查變換的線性回歸計算得到二元複合物之KD值。
圖11展示：活體內C1脈衝脾細胞之CD1d二聚體染色。在注射C1(1微克/小鼠)後3天收集B6野生型脾細胞(n=3)且在4℃下用CD3、CD45R及與RPE結合之指定二聚體複合物染色1小時。(11A)CD3+/CD45R-細胞經閘控以分析二聚體染色。(11B)未負載之二聚體用作對照。(11C)負載有7DW8-5-Glc之mCD1d二聚體使17.1±0.8%之 C1脈衝脾細胞染色。(11D)負載有7DW8-5之mCD1d二聚體使36.2±5.0%之C1脈衝脾細胞染色。
圖12展示：mCD1d相較於hCD1d調換分析。C1-擴增Vα24+ iNKT細胞用由mCD1d(A20-CD1d細胞)或hCD1d(HeLa-CD1d細胞)呈現之指定醣脂抗原在1、0.1及0.01μg/ml下脈衝。在18小時後，收集清液層用於量測IFN-γ(12A)及IL-4(12B)分泌。(12C)在不同濃度之醣脂下計算得到IFN-γ比IL-4之比率。藉由學生t檢驗使不同醣脂之IFN-γ比IL-4之比率與指定濃度之C1相比(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001)。所進行之分析為三重複。
圖13展示：在由K691、K706及C34刺激人類iNKT細胞後之細胞激素產生。藉由磁性珠粒使人類Vα24受限NKT細胞與PBMC分離，且用50μg/mL重組人類IL-2培養iNKT細胞。兩天後，iNKT細胞與源於自體單核細胞之DC及1μg/mL之不同醣脂在96孔中共培養。在72小時，收集上清液以藉由Luminex測定細胞激素概況。(A)全部醣脂當中IFN-γ及IL-4之分泌為相似的。(B)C34、K691及K706中IFN-γ/IL-4之比率顯著高於C1。(C)此等醣脂當中GM-CSF之分泌未展示統計學上顯著之差異，表明C34之F系列類似物具有與C34相似的激活骨髓細胞的活性。(D)在誘導IL-10及IL-13時，在此等醣脂當中未觀測到統計學顯著性，表明C34之F系列類似物展示與C34可比的誘導Th2抑制細胞激素的活性。使用單因子變異數分析進行統計分析。***與C1相比P<0.001。#，與C34相比P<0.05。
自然殺手T細胞(NKT)表示具有獨特特性之T淋巴球子集，該等特性包括對由CD1d呈現之天然或合成醣脂的反應性及恆定型T細胞抗原受體(TCR)α鏈之表現。NKT不同於功能上分化之習知αβ T細胞，因為其共用自然殺手細胞及T細胞之特性，在用其配位體刺激後可快速 產生TH1型及TH2型反應(先天性免疫)。NKT之激活自相矛盾地可引起免疫反應之抑制或刺激。舉例而言，TH1細胞激素之產生被認為促進具有抗腫瘤、抗病毒/抗細菌及佐劑活性之細胞免疫，而TH2細胞激素產生被認為減輕自體免疫疾病且促進抗體產生。因為NKT在免疫系統中發揮調節作用，所以其為引人注目之免疫療法之目標。
因此，本文提供包含例示性GSL之方法及組合物。
除非另外指明，否則本發明之實踐將採用屬於此項技術之技能範圍內的習知分子生物學、微生物學、重組DNA及免疫學技術。此類技術充分解釋於文獻中。參見例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，第2版，Sambrook,Fritsch及Maniatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)；DNA Cloning，卷I及II(D.N.Glover編，1985)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,Alan R.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；the treatise,Methods In Enzymology(Academic Press,Inc.,N.Y.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller及M.P.Calos編，1987,Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，卷154及155(Wu等人編)，Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(Mayer及Walker編，Academic Press,London,1987)；Antibodies：A Laboratory Manual,by Harlow及Lanes(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1988)；及Handbook Of Experimental Immunology，卷I-IV(D.M.Weir及C.C.Blackwell編，1986)。另外，製造及使用免疫佐劑之方法描述於美國專利第7,488,491號及第7,928,077號中，其相關揭示內容以引用的方式併入本文中。
如本文所用，術語「脂質」係指參與細胞信號傳導路徑之任何脂溶性(親脂性)分子。如本文所用，術語「醣脂」係指充當細胞識別 標記之附接碳水化合物的脂質。
如本文所用，術語「聚醣」係指多醣或寡醣。聚醣在本文中亦用於指以下醣結合物之碳水化合物部分，諸如醣蛋白、醣脂、醣肽、醣蛋白質組、肽聚醣、脂多醣或蛋白聚醣。聚醣通常僅由單醣之間的O-醣苷鍵聯組成。舉例而言，纖維素為由β-1,4-連接型D-葡萄糖組成的聚醣(或更特定言之，葡聚糖)，且甲殼素為由β-1,4-連接型N-乙醯基-D-葡糖胺組成的聚醣。聚醣可為單醣殘基之均聚物或雜聚物，且可為線性或分枝的。如在醣蛋白及蛋白聚醣中，可發現聚醣附接於蛋白質。其一般發現於細胞外表面上。O-連接型及N-連接型聚醣在真核生物中很常見，且亦可發現於原核生物中(但不常見)。發現N-連接型聚醣附接於序列子中天冬醯胺之R-基團氮(N)。序列子為Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列，其中X為除脯胺酸之外的任何胺基酸。
如本文所用，術語「醣蛋白」係指經聚醣共價修飾之蛋白質。存在四種類型之醣蛋白：1)N-連接型醣蛋白、2)O-連接型醣蛋白(黏蛋白)、3)葡糖胺聚糖(GAG，其亦稱為蛋白聚醣)、4)GPI錨定型。大多數醣蛋白具有結構微異質性(多種不同聚醣結構附接在同一醣基化位點內)及結構巨異質性(多個位點及類型之聚醣附接)。
如本文所用，術語「類似物」係指結構與另一種化合物有關、但其化學及生物特性可非常不同的化合物，例如藥物。
如本文所用，術語「抗原」定義為能夠引發免疫反應的任何物質。
如本文所用，術語「病原體」為造成其宿主患病或生病的生物因子。身體含有許多以人類免疫系統形式抵抗一些常見病原體(諸如肺囊蟲屬(Pneumocystis))之天然防禦。
如本文所用，術語「免疫原」係指抗原或能夠誘導抗原產生之物質，諸如DNA疫苗。
如本文所用，術語「免疫原性」係指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫反應的能力。
如本文所用，術語「免疫療法」係指基於調節免疫系統以達到預防及/或治療目標之概念的一系列治療策略。
其他定義
如本文所用，術語「治療(treating及treatment)」係指向罹患不良病狀、病症或疾病之有臨床症狀的個體投與藥劑或調配物，以便實現症狀嚴重程度及/或頻率降低、消除症狀及/或其潛在病因及/或有助於損傷好轉或修復。術語「預防(preventing及prevention)」係指向易罹患具體不良病狀、病症或疾病之無臨床征狀的個體投與藥劑或組合物，且因此係關於預防症狀出現及/或其潛在病因。除非本文中另外明確或藉由暗示指明，否則若在未提及可能的預防的情況下使用術語「治療」，則意欲亦涵蓋預防。
「視情況選用」或「視情況存在」(如在「視情況選用之取代基」或「視情況存在之添加劑」中)意味著隨後描述之組分(例如取代基或添加劑)可能存在或可能不存在，以使得描述包括組分存在之情形及其不存在之情形。
「醫藥學上可接受」意味著材料並非生物學或其他方面不合需要的，例如該材料可併入本發明之調配物中而不會導致任何不合需要的生物效應或以有害方式與劑型調配物之其他組分中之任一者相互作用。然而，當術語「醫藥學上可接受」用以指醫藥賦形劑時，其暗示該賦形劑已滿足毒理學及製造測試所要求之標準及/或其包括在由美國食品藥物管理局(the U.S.Food and Drug Administration)準備的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)上。如下文進一步詳細解釋，如「藥理學活性」衍生物或類似物中之「藥理學活性」(或簡單地「活性」)係指具有與親本藥劑相同類型之藥理學活性的衍生物或類 似物。
如本文所用，術語「免疫原」係指抗原或能夠誘導抗原產生之物質，諸如DNA疫苗。
如本文所用，術語「免疫原性」係指免疫原、抗原或疫苗刺激免疫反應的能力。
如本文所用，術語「免疫療法」係指基於調節免疫系統以達到預防及/或治療目標之概念的一系列治療策略。
如本文所用，術語「細胞激素」係指藉由影響免疫細胞分化過程調節免疫反應之強度及持續時間的許多小型分泌蛋白中之任一者，該免疫細胞分化過程通常涉及使前體細胞變成獨特的特化細胞類型的基因表現變化。細胞激素已基於其推測的功能、分泌細胞或作用目標而不同地命名為淋巴激素、介白素及趨化激素。舉例而言，一些常見介白素包括(但不限於)IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21及TGF-β。「細胞激素」為由一種細胞群體釋放而作用於另一種細胞群體之一組蛋白質(如細胞間介體)的通用術語。此類細胞激素之實例為淋巴激素、單核球激素及傳統多肽激素。細胞激素包括干擾素(IFN，尤其IFN-γ)、介白素(IL，尤其IL-1、IL-2、IL-4、IL-10、IL-12)、群落刺激因子(CSF)、血小板生成素(TPO)、紅血球生成素(EPO)、白血病抑制因子(LIF)、kit配位體、生長激素(GH)、胰島素樣生長因子(IGF)、副甲狀腺激素、甲狀腺素、胰島素、鬆弛素、促卵泡素(FSH)、促甲狀腺素(TSH)、黃體生成激素(LH)、造血生長因子、肝生長因子、纖維母細胞生長因子(FGF)、促乳素、胎盤生乳素、腫瘤壞死因子(TNF)、苗勒氏管抑制物(mullerian-inhibiting substance)、小鼠促性腺激素相關肽、抑制素、活化素、血管內皮生長因子(VEGF)、整合素、神經生長因子(NGF)、血小板生長因子、轉型生長因子(TGF)、骨誘導因子等。
如本文所用，術語「趨化激素」係指在感染部位釋放之各種小型趨化性細胞激素中之任一者，其提供用於淋巴球移動及激活之方式。趨化激素將白血球吸引至感染部位。趨化激素具有允許將其分配成四組的保守半胱胺酸殘基。具有代表性趨化激素之各組為C-C趨化激素(RANTES、MCP-1、MIP-1α及MIP-1β)、C-X-C趨化激素(IL-8)、C趨化激素(淋巴細胞趨化激素)及CXXXC趨化激素(弗拉塔凱(Fractalkine))。
如本文所用，術語「抗原決定基」定義為抗原分子之一部分，其接觸抗體或T細胞受體之抗原結合位點。
為進一步解釋小鼠及人類三元複合物之差異性結合親合力，分別基於鼠類及人類CD1d-αGalCer-iNKT TCR複合物之x射線結構進行電腦模型化(PDB存取碼3HUJ、3QUX、3QUY、3QUZ及3HE6)。27-29(27)Borg,N.A.；Wun,K.S.；Kjer-Nielsen,L.；Wilce,M.C.；Pellicci,D.G.；Koh,R.；Besra,G.S.；Bharadwaj,M.；Godfrey,D.I.；McCluskey,J.；Rossjohn,J.Nature 2007,448,44；(28)Pellicci,D.G.；Patel,O.；Kjer-Nielsen,L.；Pang,S.S.；Sullivan,L.C.；Kyparissoudis,K.；Brooks,A.G.；Reid,H.H.；Gras,S.；Lucet,I.S.；Koh,R.；Smyth,M.J.；Mallevaey,T.；Matsuda,J.L.；Gapin,L.；McCluskey,J.；Godfrey,D.I.；Rossjohn,J.Immunity 2009,31,47；及(29)Aspeslagh,S.；Li,Y.；Yu,E.D.；Pauwels,N.；Trappeniers,M.；Girardi,E.；Decruy,T.；Van Beneden,K.；Venken,K.；Drennan,M.；Leybaert,L.；Wang,J.；Franck,R.W.；Van Calenbergh,S.；Zajonc,D.M.；Elewaut,D.EMBO J.2011,30,2294。
如本文所用，術語「疫苗」係指含有抗原的製劑，其由完整致病生物體(殺死或減毒)或該等生物體之組分(諸如蛋白質、肽或多醣)組成，用於賦予針對該等生物體所致之疾病的免疫力。疫苗製劑可為 天然的、合成的或藉由重組DNA技術獲得。
如本文所用，術語「免疫佐劑」係指結合免疫原使用的增強或調節針對免疫原之免疫反應的物質。特定言之，術語「佐劑」及「免疫佐劑」可在本發明中互換使用且係指當單獨投與宿主時可為非免疫原性，但當與另一種抗原聯合投與時強化宿主對該抗原之免疫反應的化合物或混合物。佐劑介導之免疫反應增強及/或持續時間延長可藉由此項技術中已知之任何方法評定，包括(但不限於)以下中之一或多者：(i)回應於使用佐劑/抗原組合免疫產生之抗體的數目相較於回應於單獨使用抗原免疫產生之抗體的數目增加；(ii)識別抗原或佐劑之T細胞的數目增加；以及(iii)一或多種I型細胞激素之含量增加。
本發明之例示性佐劑包含可由通式1表示之化合物。
較佳地，本發明之例示性佐劑用於人類為醫藥學上可接受的。
本發明之佐劑可作為包含抗原之醫藥疫苗組合物之一部分投與，或作為單獨調配物與含有抗原之第二組合物聯合投與。在此等組合物中之任一者中，鞘醣脂(GSL)可與其他佐劑及/或賦形劑/載劑組合。此等其他佐劑包括(但不限於)基於油乳劑及乳化劑之佐劑，諸如弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant)、弗氏不完全佐劑、MF59或SAF；礦物凝膠，諸如氫氧化鋁(礬)、磷酸鋁或磷酸鈣；源於微生物之佐劑，諸如霍亂毒素(CT)、百日咳毒素、大腸桿菌不耐熱毒素(LT)、突變體毒素(例如LTK63或LTR72)、卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)、DNA CpG基元、胞壁醯二肽或單磷醯基脂質A；微粒佐劑，諸如免疫刺激複合物(ISCOM)、脂質體、可生物降解微球或皂苷(例如QS-21)；細胞激素，諸如IFN-γ、IL-2、IL-12或GM-CSF；合成佐劑，諸如非離子嵌段共聚物、胞壁醯肽類似物(例如N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸[thr-MDP]、N-乙醯基-去甲基-胞壁醯基-L-丙胺醯基-D-異麩醯胺酸、N-乙醯基胞壁醯基- L-丙胺醯基-D-異麩醯胺醯基-L-丙胺酸-2-[1'-2'-二軟脂醯基-sn-甘油-3-羥基磷醯氧基]-乙胺)、聚磷氮烯或合成聚核苷酸；及表面活性物質，諸如溶血卵磷脂、普洛尼克多元醇(pluronic polyol)、聚陰離子、肽、烴乳液或匙孔螺血氰蛋白(KLH)。較佳地，此等額外佐劑用於人類亦為醫藥學上可接受的。
在本發明之含義內，術語「聯合投與或共投與」用以指免疫佐劑及抗原同時在一個組合物中或同時在不同組合物中或依次投與。然而，對於被視為「聯合」的依序投與，抗原及佐劑必須相隔一定時間間隔投與，該時間間隔仍允許佐劑強化對抗原的免疫反應。舉例而言，當抗原為多肽時，抗原及佐劑在同一天、較佳地彼此在一小時內且最佳同時投與。然而，當向個體遞送核酸且在個體細胞中表現多肽抗原時，佐劑在核酸投與24小時內、較佳在6小時內投與。
如本文所用，術語「免疫原性」意味著藥劑能夠引發體液或細胞免疫反應且較佳兩者。免疫原性實體亦為抗原性。免疫原性組合物為當向具有免疫系統之動物投與時引發體液或細胞免疫反應或兩者的組合物。
術語「抗原」係指當引入具有免疫系統之宿主、動物或人類中(如在例如DNA疫苗中直接或在表現後)時，由該宿主之免疫系統識別且能夠引發免疫反應之任何藥劑(例如蛋白質、肽、多醣、醣蛋白、醣脂、核酸或其組合)。如本文所定義，抗原誘導之免疫反應可為體液或細胞介導型或兩者。當藥劑能夠與免疫系統之抗原識別分子(諸如免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體(TCR))特異性相互作用時，其被稱為「抗原性」。在本發明之含義內，抗原較佳為「表面抗原」，亦即天然表現在病原體表面或感染細胞表面或腫瘤細胞表面上。抗原性分子無需自身具有免疫原性，亦即能夠在無佐劑或載劑的情況下引發免疫反應。如本文所用，術語「抗原特異性」係指細胞群體之特性， 其使得特定抗原或抗原片段之供應引起特異性細胞特徵。
術語「抗原決定基」或「抗原決定子」係指由B細胞或T細胞或兩者識別之抗原的任何部分。較佳地，此類抗原決定基與免疫球蛋白(抗體)或T細胞抗原受體(TCR)之抗原識別位點的相互作用誘導抗原特異性免疫反應。T細胞僅在以下情況識別蛋白質：當其已裂解成較小肽且呈現在位於另一細胞表面上之稱為「主要組織相容性複合體(MHC)」的複合物中時。存在兩種類別之MHC複合物(I類及II類)且每一類別由許多不同對偶基因組成。I類MHC複合物發現於幾乎每一細胞上且呈現來自細胞內部產生之蛋白質的肽。因此，I類MHC複合物適用於殺死由病毒感染之細胞或由於致癌基因表現已變成癌性的細胞。在表面上具有稱為CD8之蛋白質的T細胞經由T細胞受體(TCR)特異性結合至I類MHC/肽複合物。此引起溶胞效應活性。II類MHC複合物僅發現於抗原呈現細胞(APC)上且用於呈現來自已由APC吞噬之循環病原體的肽。具有稱為CD4之蛋白質的T細胞經由TCR結合至II類MHC/肽複合物。此引起刺激免疫反應之特異性細胞激素的合成。為經由I類MHC呈現而由免疫系統有效識別，抗原性多肽必須含有至少約8至10個胺基酸之抗原決定基，而為經由II類MHC呈現而由免疫系統有效識別，抗原性多肽必須含有至少約13至25個胺基酸之抗原決定基。參見例如Fundamental Immunology，第3版，W.E.Paul編，1999,Lippincott-Raven Publ。
術語「物種特異性」抗原係指僅存在於或來源於特定物種之抗原。因此，術語「源於瘧疾」或「瘧疾特異性」抗原係指包含來源於構成瘧原蟲(該瘧原蟲為(但不限於)惡性瘧原蟲(P.falciparum)、間日瘧原蟲(P.vivax)、三日瘧原蟲(P.malariae)、卵形瘧原蟲(P.ovale)、里氏瘧原蟲(P.reichenowi)、諾氏瘧原蟲(P.knowlesi)、食蟹猴瘧原蟲(P.cynomolgi)、巴西瘧原蟲(P.brasilianum)、約氏瘧原蟲(P.yoelii)、 伯氏瘧原蟲(P.berghei)或夏氏瘧原蟲(P.chabaudi))之蛋白質中之任一者之至少一個抗原決定基(B細胞及/或T細胞)且包含至少5-10個胺基酸殘基之天然(例如經輻照子孢子)或合成(例如以化學方式產生之多抗原肽[MAP]或以重組方式合成之多肽)抗原。用於抗原生成之較佳瘧原蟲蛋白質為環子孢子(CS)蛋白，然而，亦可使用其他蛋白質，例如血小板反應蛋白相關黏附(匿名)蛋白(TRAP)，亦稱為子孢子表面蛋白2(SSP2)、LSA I、hsp70、SALSA、STARP、Hep17、MSA、RAP-1、RAP-2等。
術語「疫苗」係指可用於引起接受者之保護性免疫的組合物(例如蛋白質或載體，諸如腺病毒載體、辛德比病毒載體(Sindbis virus vector)或痘病毒載體)。應注意有效的是，本發明之疫苗可在一部分經免疫群體中引起免疫，因為一些個體可能未能建立穩固或保護性免疫反應或在一些情況下，任何免疫反應。此無效性可源於個體之遺傳背景或由於免疫缺陷病狀(後天性或先天性)或免疫抑制(例如歸因於用化學療法治療或使用免疫抑制藥物，例如以防止器官排斥反應或抑制自體免疫病狀)。可在動物模型中確定疫苗功效。
術語「DNA疫苗」為此項技術之非正式術語且在本文中用以指借助於重組載體遞送之疫苗。本文中所用之替代性且更具描述性術語為「載體疫苗」(因為一些可能的載體(諸如反轉錄病毒及慢病毒)為RNA病毒，且因為在一些情況下，經由載體向細胞遞送非病毒RNA而非DNA)。一般而言，活體內投與載體，但亦涵蓋適當抗原呈現細胞(諸如樹突狀細胞(DC))之離體轉導及活體內投與轉導細胞。
術語「治療」在本文中用以意指減輕或緩解個體疾病之至少一種症狀。在本發明之含義內，術語「治療」亦可意指延長顯露前期，亦即疾病之感染與臨床表現之間的時段。較佳地，疾病為感染性疾病(例如病毒、細菌、寄生蟲或真菌)或惡性病(例如實體或血液腫瘤，諸 如肉瘤、癌瘤、神經膠質瘤、母細胞瘤、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤等)。
術語「保護」在本文中用以意指按需要預防或治療或預防及治療個體疾病之出現或持續。在本發明之含義內，疾病可選自由以下組成之群：感染(例如病毒、細菌、寄生蟲或真菌)及/或惡性病(例如實體或血液腫瘤，諸如肉瘤、癌瘤、神經膠質瘤、母細胞瘤、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、黑色素瘤等)。舉例而言，根據本發明，腫瘤特異性抗原與包含式1之例示性藥劑之佐劑聯合的治療性投與可增強抗腫瘤免疫反應，使得腫瘤生長及癌轉移減緩或甚至腫瘤消退。
術語「保護性免疫」係指宿主動物中之免疫反應(主動/後天性或被動/先天性或兩者皆有)，其引起該抗原之不活化及/或負荷減小及生成持久的免疫(亦即後天性，例如經由抗體產生)，其在反覆暴露於相同或相關抗原時預防或延緩疾病出現。「保護性免疫反應」包含有效例如消除或減小病原體或感染細胞之負荷(或產生任何其他可量測之感染緩解)或減小經免疫(接種)個體之腫瘤負荷的體液(抗體)免疫或細胞免疫或兩者皆有。在本發明之含義內，保護性免疫可為部分。
免疫系統分類成兩個一般系統，亦即「先天性」或「天然」免疫系統及「後天性」或「適應性」免疫系統。據認為先天性免疫系統最初保持感染在控制下，允許適應性免疫系統有一定時間產生適當反應。近期研究已提出先天性免疫系統之各種組分觸發且強化適應性免疫系統之組分，包括抗原特異性B及T淋巴球(Fearon及Locksley，見上文；Kos,1998,Immunol.Res.,17：303；Romagnani,1992,Immunol.Today,13：379；Banchereau及Steinman,1988,Nature,392：245)。
術語「先天性免疫」或「天然免疫」係指不受與抗原預先接觸影響之先天性免疫反應。先天性免疫系統之細胞，包括巨噬細胞及樹 突狀細胞(DC)，經由模式識別受體攝取外來抗原，組合此等抗原之肽片段與MHC I類及II類分子且分別刺激初始CD8+及CD4+ T細胞。(Banchereau及Steinman，見上文；Holmskov等人，1994,Immunol.Today,15：67；Ulevitch及Tobias,1995,Annu.Rev.Immunol.,13：437)。專職性抗原呈現細胞(APC)與此等T細胞通信，使得初始CD4+ T細胞分別分化成介導細胞及體液免疫之輔助性T-1(Th1)或輔助性T-2(Th2)淋巴球(Trinchieri,1995,Annu.Rev.Immunol.,13：251；Howard及O'Garra,1992,Immunol.Today,13：198；Abbas等人，1996,Nature,383：787；Okamura等人，1998,Adv.Immunol.,70：281；Mosmann及Sad,1996,Immunol.Today,17：138；O'Garra,1998,Immunity,8：275)。
術語「後天性免疫」或「適應性免疫」在本文中用以意指在動物生命期間建立的特異性針對誘導性抗原且以在反覆遇到該抗原時反應增強為標誌的主動或被動體液或細胞免疫。適應性免疫系統之T淋巴球的關鍵特徵為其偵測由細胞表面上之MHC分子呈現之源於病原體之肽的微小濃度的能力。
如本文所用，術語「強化免疫反應」意指增強免疫反應或延長其持續時間或兩者皆有。當提及藥劑(例如佐劑)之特性時，術語「[能夠]強化免疫原性」係指增強抗原免疫原性之能力或延長針對抗原之免疫反應的持續時間的能力或兩者皆有。
在本發明之含義內，片語「增強免疫反應」係指增加針對給定抗原之免疫反應性的規模及/或功效的特性或過程，該免疫反應性為體液或細胞免疫或兩者皆有。若抗原特異性免疫反應性之任何可量測參數(例如抗體力價、T細胞產生)增加至少兩倍、較佳十倍、最佳三十倍，則咸信免疫反應增強。
應用於劑量或量之術語「治療有效」係指化合物或醫藥組合物 或疫苗之數量在向有需要之哺乳動物投與後足以產生所需活性。如本文關於含佐劑及抗原之組合物或疫苗所用，術語「治療有效量/劑量」可與術語「免疫原性有效量/劑量」互換使用且係指在向哺乳動物投與後足以產生有效免疫反應之化合物(例如抗原及/或包含鞘醣脂(GSL)之佐劑或醫藥組合物或疫苗的量/劑量。
如與本發明之組合物結合使用之片語「醫藥學上可接受」係指此類組合物之分子實體及其他成分為生理學上可耐受的且當向人類投與時通常不產生不良反應。較佳地，如本文所用，術語「醫藥學上可接受」意指經聯邦或州政府之監管機構批准或在美國藥典或其他公認的適用於哺乳動物(且更特定言之，適用於人類)之藥典中列出。
應用於本發明之醫藥或疫苗組合物之術語「載劑」係指與化合物(例如抗原及/或包含鞘醣脂(GSL)之佐劑一起投與之稀釋劑、賦形劑或媒劑。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石油、動物、植物或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油及其類似物。水或水溶液、生理鹽水溶液以及右旋糖及丙三醇水溶液較佳用作載劑，尤其用於可注射溶液。適合之醫藥載劑描述於「Remington's Pharmaceutical Sciences」E.W.Martin，第18版中。
術語「天然抗體」或「免疫球蛋白」係指通常由兩個相同輕(L)鏈及兩個相同重(H)鏈組成之約150,000道爾頓的雜四聚體醣蛋白。各輕鏈藉由一個共價二硫鍵與重鏈連接，而不同免疫球蛋白同型之重鏈間，二硫鍵之數目不同。各重鏈及輕鏈亦具有有規律間隔之鏈內二硫橋鍵。各重鏈在一端具有可變結構域(VH)，其後為多個恆定結構域。各輕鏈在一端具有可變結構域(VL)且在其另一端具有恆定結構域；輕鏈之恆定結構域與重鏈之第一恆定結構域對準，且輕鏈可變結構域與重鏈之可變結構域對準。咸信特定胺基酸殘基在輕鏈與重鏈可變結構域之間形成介面(Clothia等人，J Mol.Biol.,186：651-663,1985； Novotny及Haber,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82：4592-4596,1985)。
術語「抗體」或「Ab」以最廣泛的意義使用且特定言之，涵蓋不僅天然抗體，而且單一單株抗體(包括促效劑及拮抗劑抗體)、具有多抗原決定基特異性之抗體組合物以及抗體片段(例如Fab、F(ab')2、scFv及Fv)，只要其展現所需生物活性即可。
如本文所用，術語「CD1d」係指各種人類抗原呈現細胞表面上所表現之醣蛋白之CD1(分化叢集1)家族的一員。CD1d呈現的脂質抗原激活自然殺手T細胞。CD1d具有供醣脂抗原結合於其中的較深抗原結合凹槽。表現於樹突狀細胞上之CD1d分子可結合且呈現醣脂。
如本文所用，術語「適應性免疫系統」係指消除致病性攻擊之高度特化全身性細胞及過程。適應性免疫系統之細胞為一類白血球，稱為淋巴球。B細胞及T細胞為淋巴球之主要類型。
如本文所用，術語「T細胞」及「T」係指一群稱為淋巴球之白血球，其在細胞介導之免疫中發揮中心作用。T細胞可藉由其細胞表面上稱為T細胞受體(TCR)之特殊受體的存在而區別於其他淋巴球類型，諸如B細胞及NK。已描述數個不同子集之T細胞，其各自具有獨特功能。輔助性T(TH)細胞為適應性免疫系統之「中間人」。在激活後，其快速分裂且分泌調節或「輔助」免疫反應之稱為細胞激素的小型蛋白質。視所接受之細胞激素信號而定，此等細胞分化成TH1、TH2、TH17或其他子集中之一者，其分泌不同細胞激素。
如本文所用，術語「抗原呈現細胞」(APC)係指在表面上呈現與主要組織相容性複合體(MHC)複合之外來抗原的細胞。T細胞可使用其TCR識別此複合物。APC分成兩種類別：專職性或非專職性。樹突狀細胞(DC)屬於專職性類別且在CD1之情形下能夠向T細胞呈現抗原。在一個例示性實施方案中，本發明方法中所採用之DC可為數個DC子集中之任一者，其在一個實施方案中，自淋巴分化或在另一個 實施方案中，自骨髓祖細胞分化。
如本文所用，術語「初始細胞」係指未分化之免疫系統細胞，例如尚未經特化以識別特異性病原體之CD4 T細胞。
如本文所用，術語「自然殺手細胞」及「NK」係指藉由干擾素激活以促成抵抗病毒及其他細胞內病原體之先天性宿主防禦的一類淋巴細胞。
如本文所用，術語「自然殺手T細胞」(NKT)係指與習知T及NK共享特徵/受體之T細胞子集。許多此等細胞識別非多形性CD1d分子，亦即結合自身及外來脂質及醣脂之抗原呈現分子。NKT之TCR能夠識別由CD1d分子呈現(伴隨)之醣脂抗原。在刺激後，NKT之主要反應為快速分泌細胞激素，包括IL-4、IFN-γ及IL-10，且因此影響不同免疫反應及致病過程。NKT可為均質群體或非均質群體。在一個例示性實施方案中，群體可為「非恆定型NKT」，其可包含人類及小鼠骨髓及人類肝臟T細胞群體，其為例如CD1d反應性非恆定型T細胞，表現不同TCR且亦可產生大量IL-4及IFN-γ。CD1d依賴性NKT之最佳已知子集表現恆定TCR-α鏈。其稱為I型或恆定型NKT(iNKT)。此等細胞在人類(Vα24i NKT)與小鼠(Vα14i NKT)之間保守且牽涉在許多免疫過程中。
如本文所用，術語「細胞激素」係指藉由影響免疫細胞分化過程調節免疫反應之強度及持續時間的許多小型分泌蛋白中之任一者，該免疫細胞分化過程通常涉及使前體細胞變成獨特的特化細胞類型的基因表現變化。細胞激素已基於其推測的功能、分泌細胞或作用目標而不同地命名為淋巴激素、介白素及趨化激素。舉例而言，一些常見介白素包括(但不限於)IL-12、IL-18、IL-2、IFN-γ、TNF、IL-4、IL-10、IL-13、IL-21及TGF-β。
如本文所用，術語「趨化激素」係指在感染部位釋放之各種小 型趨化性細胞激素中之任一者，其提供用於淋巴球移動及激活之方式。趨化激素將白血球吸引到感染部位。趨化激素具有允許將其分配成四組的保守半胱胺酸殘基。具有代表性趨化激素之各組為C-C趨化激素(RANTES、MCP-1、MIP-1α及MIP-1β)、C-X-C趨化激素(IL-8)、C趨化激素(淋巴細胞趨化激素)及CXXXC趨化激素(弗拉塔凱)。
如本文所用，術語「TH2型反應」係指使得某些類型之細胞激素、干擾素、趨化激素產生之細胞激素表現模式。典型TH2細胞激素包括(但不限於)IL-4、IL-5、IL-6及IL-10。
如本文所用，術語「TH1型反應」係指使得某些類型之細胞激素、干擾素、趨化激素產生之細胞激素表現模式。典型TH1細胞激素包括(但不限於)IL-2、IFN-γ、GM-CSF及TNF-β。
如本文所用，術語「偏向TH1」係指TH1細胞激素及/或趨化激素之產生與TH2細胞激素及/或趨化激素之產生相比增加至更大程度之免疫原性反應。
如本文所用，術語「抗微生物劑」係指殺死或抑制微生物(諸如細菌、真菌或病毒)生長之物質。
如本文所用，術語「類毒素」係指毒性已藉由化學(福馬林(formalin))或熱處理而減弱或抑制，同時維持其他特性(通常免疫原性)之細菌毒素。類毒素用於疫苗中，因為其誘導針對原始毒素之免疫反應或增加針對另一種抗原之反應。舉例而言，破傷風類毒素來源於由破傷風梭菌(Clostridium tetani)產生之破傷風痙攣毒素且導致破傷風。破傷風類毒素由美國許多血漿中心用於研發富含血漿之疫苗。
如本文所用，術語「DNA疫苗」係指引入細胞中且隨後轉譯成特異性抗原蛋白之DNA構築體。
如本文所用，術語「質體」係指能夠複製之染色體外環狀DNA，其可用作選殖載體。
如本文所用，術語「微生物(microorganism及microbe)」係指微觀(太小而無法由人類肉眼看見)之生物體。微生物極為多樣且包括(但不限於)細菌及真菌。
如本文所用，術語「佐劑或免疫佐劑」係指結合免疫原使用的增強或調節針對免疫原之免疫反應的物質。在一個範例中，本發明之化合物/類似物用作調節或強化疫苗效應之免疫佐劑，其藉由刺激疫苗所投與之患者之免疫系統以對疫苗產生更強烈的反應。
如本文所用，術語「礬佐劑」係指具有免疫佐劑活性的鋁鹽。此藥劑吸附溶液中的蛋白質抗原且使其沈澱；所得沈澱物藉由促進接種位點處所形成之疫苗儲槽中的抗原緩慢釋放來改良疫苗免疫原性。
如本文所用，術語「抗腫瘤免疫療法活性劑」係指抑制、減小及/或消除腫瘤之本發明之例示性化合物/類似物。
如本文所用，術語「顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子」(GM-CSF)係指充當刺激白血球(詳言之，顆粒球(嗜中性白血球、嗜鹼性血球及嗜伊紅血球)、巨噬細胞及骨髓中作為血小板前體之細胞)產生之群落刺激因子的細胞激素。
如本文所用，術語「抗原特異性」係指細胞群體之特性，其使得特定抗原或抗原片段之供應引起特異性細胞增生。
如本文所用，術語「流動式細胞測量術」或「FACS」意指經由光學及電子偵測裝置檢查懸浮於流體流中之粒子或細胞的物理及化學特性的技術。
肽中之胺基酸殘基在下文中將簡化如下：苯丙胺酸為Phe或F；白胺酸為Leu或L；異白胺酸為Ile或I；甲硫胺酸為Met或M；纈胺酸為Val或V；絲胺酸為Ser或S；脯胺酸為Pro或P；蘇胺酸為Thr或T；丙胺酸為Ala或A；酪胺酸為Tyr或Y；組胺酸為His或H；麩醯胺酸為Gln或Q；天冬醯胺為Asn或N；離胺酸為Lys或K；天冬胺酸為Asp或D；麩 胺酸為Glu或E；半胱胺酸為Cys或C；色胺酸為Trp或W；精胺酸為Arg或R；以及甘胺酸為Gly或G。關於胺基酸之進一步描述，請參考Proteins：Structure and Molecular Properties by Creighton,T.E.,W.H.Freeman & Co.,New York 1983。
已知哺乳動物及分支桿菌脂質由人類CD1a、CD1b、CD1c及CD1d呈現。海綿(Agelas mauritianus)中發現之脂質α-半乳糖苷基神經醯胺已成為最廣泛研究之CD1d之配位體。已展示藉由α-GalCer活體外刺激小鼠脾臟細胞分別引起NKT增生及IFN-γ及IL-4產生，亦即TH1型及TH2型反應。鼠類研究已展示細胞可藉由攜帶α-GalCer之不成熟樹突狀細胞(iDC)快速激活且激活之iNKT可繼而誘導DC完全成熟。
包含鞘醣脂之佐劑的使用
在一個態樣中，本發明提供一種用於強化抗原在哺乳動物中之免疫原性的方法，其包含使該抗原與包含式1之鞘醣脂(GSL)之佐劑組合物聯合投與。根據本發明，使用鞘醣脂(GSL)作為佐劑使得藉由抗原誘導之保護性免疫增強及/或持續時間延長。舉例而言，如本文所揭示，聯合投與鞘醣脂(GSL)與相當於腫瘤或病毒抗原之T細胞或B細胞抗原決定基之肽或表現此等抗原之DNA構築體增強抗原特異性免疫反應。
本發明之含有鞘醣脂(GSL)之佐劑可與任何抗原(詳言之，與來源於感染物或腫瘤之抗原)聯合投與。
小鼠及人類之免疫刺激效應可視CD1d分子之表現而定且藉由NKT細胞介導。實際上，本發明證實佐劑活性至少部分歸因於其增強及/或延長NKT介導之抗原特異性Th1型T細胞反應及CD8+ T細胞(或Tc)反應的能力。
根據免疫療法觀點，NKT細胞系統之鞘醣脂(GSL)激活似乎出於以下原因而具有優於其他機制之獨特優勢：(a)激活之NKT細胞的細 胞毒性水準極高且有效抵抗廣泛多種腫瘤細胞或感染細胞；(b)藉由鞘醣脂(GSL)激活NKT細胞完全取決於CD1d分子，其在個體當中呈單形性(Porcelli,Adv.Immunol.,59：1-98,1995)，表明含有鞘醣脂(GSL)之佐劑可被全部患者利用，與MHC單倍型無關；(c)人類患者之DC及NKT激活的抗原呈現功能可在免疫療法前藉由在小鼠中使用Vα14 NKT細胞狀態作為指標進行評估。
根據本發明，包含式1之鞘醣脂(GSL)的佐劑及抗原可作為兩種單獨的調配物或作為同一組合物之一部分投與。若分別投與，則佐劑及抗原可依次或同時投與。如本文所揭示，同時投與鞘醣脂(GSL)佐劑與抗原為較佳的且一般允許達成最高效的免疫刺激。
由於本發明之鞘醣脂(GSL)佐劑與複數種不同抗原組合而發揮其免疫刺激活性，因此其適用於預防性及治療性應用。因此，在另一個態樣中，本發明提供一種用於治療哺乳動物疾病之預防及/或治療方法，其包含向該哺乳動物聯合投與抗原及包含式1之鞘醣脂(GSL)的佐劑。此方法可適用於例如防禦及/或治療各種感染以及治療各種贅生性疾病。
本發明之免疫原性增強方法可用於對抗感染，其包括(但不限於)寄生蟲感染(諸如由瘧原蟲屬等所導致之感染)、病毒感染(諸如由流感病毒、白血病病毒、免疫缺陷病毒(諸如HIV)、乳頭狀瘤病毒、疱疹病毒、肝炎病毒、麻疹病毒、痘病毒、流行性腮腺炎病毒、巨細胞病毒[CMV]、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barr virus)等所導致之感染)、細菌感染(諸如由葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、肺炎球菌屬(pneumococcus)、淋病雙球菌(Neisseria gonorrhea)、疏螺旋體屬(Borrelia)、假單胞菌屬(pseudomonas)等所導致之感染)及真菌感染(諸如由假絲酵母屬(candida)、發癬菌屬(trichophyton)、皮屑芽孢菌屬(pityrosporum)等所導致之感染)。
本發明之方法亦適用於治療各種癌症，其包括(但不限於)纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏腫瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、淋巴瘤、白血病、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓性癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤(Wilms' tumor)、宮頸癌、睪丸腫瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、神經管胚細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑色素瘤、神經母細胞瘤及視網膜母細胞瘤。
如本文中所進一步揭示，當同時投與抗原及鞘醣脂(GSL)佐劑時，達到本發明之免疫原性增強方法的最大效率。
本發明之方法可與其他治療結合使用。舉例而言，本發明之使用腫瘤特異性抗原及含有鞘醣脂(GSL)之佐劑的抗癌治療可與化學療法及/或放射療法及/或IL-12治療組合使用。包含含有鞘醣脂(GSL)之佐劑的抗病毒疫苗可與IFN-α治療組合使用。
含有鞘醣脂(GSL)之醫藥及疫苗組合物
結合本發明之方法，亦提供醫藥及疫苗組合物，其包含免疫原性有效量之抗原及免疫原性有效量之包含鞘醣脂(GSL)之佐劑以及視情況存在之額外免疫刺激劑、載劑或賦形劑(較佳全部為醫藥學上可接受的)。該抗原及佐劑可調配為單一組合物或兩種單獨的組合物，其可同時或依次投與。
本發明之佐劑包含屬於神經鞘醣脂類別之化合物，特定言之，可由通式1表示之鞘醣脂(GSL)： 本發明之免疫原性(例如疫苗)組合物中所用之抗原可來源於真核細胞(例如腫瘤、寄生蟲、真菌)、細菌細胞、病毒粒子或其任何部分(例如減毒病毒粒子或病毒組分)。在免疫原性反應所針對之材料的抗原性不良的情況下，該材料可另外使用標準共價結合技術(例如藉由數個市售試劑套組中之一者)結合至諸如白蛋白或半抗原之載劑分子。
本發明之較佳腫瘤抗原的實例包括腫瘤特異性蛋白，諸如ErbB受體、Melan A[MART1]、gp100、酪胺酸酶、TRP-1/gp75及TRP-2(在黑色素瘤中)；MAGE-1及MAGE-3(在膀胱癌、頭頸癌及非小細胞癌中)；HPV EG及E7蛋白(在宮頸癌中)；黏蛋白[MUC-1](在乳癌、胰臟癌、結腸癌及前列腺癌中)；前列腺特異性抗原[PSA](在前列腺癌中)；癌胚抗原[CEA](在結腸癌、乳癌及胃腸道癌中)及共有的腫瘤特異性抗原，諸如MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1,2,8、CAGE-3至7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV及TRP2-INT2。上述抗原清單意欲為例示性的，因為所關注之抗原可來源於任何動物或人類病原體或腫瘤。
在一個特定實施例中，本發明之抗原可藉由表現該抗原之重組病毒呈現。較佳地，病毒係選自由重組腺病毒、重組痘病毒及重組辛德比病毒組成之群。
在本發明組合物中，抗原及鞘醣脂(GSL)佐劑皆以免疫原性有效量存在。對於各特異性抗原，最佳免疫原性有效量應以實驗方式確定(考慮指定患者之具體特徵及/或治療類型)。一般而言，此量在每公斤體重0.1μg-100mg抗原的範圍內。對於本發明之鞘醣脂(GSL)佐劑，最佳免疫原性有效量較佳在每公斤體重10-100μg佐劑的範圍內。
本發明亦提供一種用於製備疫苗組合物之方法，該疫苗組合物包含至少一種抗原及包含式1之鞘醣脂(GSL)的佐劑，該方法包含混合 該佐劑及該抗原以及視情況存在之一或多種生理學上可接受之載劑及/或賦形劑及/或輔助物質。
調配物及投藥
本發明提供含有本發明之治療劑(呈單一組合物或兩種單獨的組合物形式之抗原及鞘醣脂(GSL)佐劑，其可同時或依次投與)的醫藥及疫苗調配物，該等調配物適用於投與以引起抗原特異性保護性免疫反應用於治療及預防上文所述之感染性或贅生性疾病。本發明之組合物可使用一或多種生理學上可接受之載劑或賦形劑以任何習知方式調配。因此，抗原及/或包含式1之鞘醣脂(GSL)的佐劑可經調配以藉由經皮遞送或藉由經黏膜投與，包括(但不限於)經口、經頰、鼻內、經眼、經陰道、經直腸、腦內、皮內、肌肉內、腹膜內、靜脈內、皮下途徑、經由劃痕(例如使用分叉針頭劃痕穿過皮膚表層)；藉由吸入(經肺)或吹入(經由嘴或鼻)；或藉由離體投與抗原呈現細胞，隨後將該等細胞投與個體；或藉由任何其他標準免疫途徑而投與。
較佳地，本發明之免疫原性調配物可非經腸遞送，亦即藉由靜脈內(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜內(i.p.)、肌肉內(i.m.)、皮下(s.d.)或皮內(i.d.)投與、藉由經由例如快速注射、連續輸注或基因槍(例如向個體投與載體疫苗，諸如裸DNA或RNA)直接注射。注射用調配物可呈單位劑型(例如安瓶)或添加有防腐劑之多劑量容器。組合物可採用諸如於油性或水性媒劑中之賦形劑、懸浮液、溶液或乳液之形式且可含有諸如懸浮劑、穩定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成分可呈粉末形式以便在使用前用適合之媒劑(例如無菌無熱原質水)復原。
本發明亦涵蓋多種黏膜疫苗接種策略。雖然黏膜可為局部遞送疫苗之靶點，但可使用多種策略向黏膜遞送免疫原性組合物。舉例而言，在一個特定實施例中，免疫原性多肽或載體疫苗可以與霍亂毒素(諸如霍亂毒素B或霍亂毒素A/B嵌合體)之混合物形式或以與其之結合 物或嵌合融合蛋白形式投與(參見例如Hajishengallis,J Immunol.,154：4322-32,1995；Jobling及Holmes,Infect Immun.,60：4915-24,1992；Lebens及Holmgren,Dev Biol Stand 82：215-27,1994)。在另一個實施例中，可製備與熱不穩定腸毒素(LT)之混合物用於黏膜疫苗接種。其他黏膜免疫策略包括將免疫原囊封於微膠囊中(參見例如美國專利第5,075,109號；第5,820,883號及第5,853,763號)及使用免疫增強膜性載劑(參見例如PCT申請案第WO 98/0558號)。經口投與免疫原之免疫原性可藉由使用紅血球(rbc)或rbc翳(參見例如美國專利第5,643,577號)或藉由使用藍舌抗原(參見例如美國專利第5,690,938號)增強。目標免疫原之全身性投與亦可產生黏膜免疫(參見美國專利第5,518,725號)。多種策略亦可用於遞送基因以便在黏膜組織中表現，諸如使用嵌合鼻病毒(參見例如美國專利第5,714,374號)、腺病毒、牛痘病毒或特異性靶向核酸(參見例如申請案第WO 97/05267號)。
對於經口投與，本發明之調配物可呈例如錠劑或膠囊形式，其係藉由習知方式用醫藥學上可接受之賦形劑製備，該等賦形劑諸如黏合劑(例如預膠凝化玉米澱粉、聚乙烯吡咯啶酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或氧化矽)；崩解劑(例如馬鈴薯澱粉或羥基乙酸澱粉鈉)；或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)。錠劑可藉由此項技術中熟知之方法包覆。本發明之組合物亦可引入例如由聚-乙醇酸/乳酸(PGLA)製造之微球或微膠囊中(參見美國專利第5,814,344號、第5,100,669號及第4,849,222號；PCT公開案第WO 95/11010號及第WO 93/07861號)。用於經口投與之液體製劑可呈例如溶液、糖漿、乳液或懸浮液形式，或其可以乾燥產物形式呈現以便在使用前用水或其他適合之媒劑復原。此類液體製劑可藉由習知方式用醫藥學上可接受之添加劑製備，該等添加劑諸如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化可食用脂 肪)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性媒劑(例如杏仁油、油酯、乙醇或分餾植物油)；及防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸)。該等製劑亦可按需要含有緩衝鹽、調味劑、著色劑及甜味劑。可適當調配用於經口投與之製劑以得到活性化合物之控制釋放。
對於藉由吸入投與，本發明之治療劑適宜以來自加壓包裝或噴霧器之氣溶膠噴霧表現形式遞送，其中使用適合之推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他適合氣體。在加壓氣溶膠情況下，劑量單位可藉由提供閥以遞送所計量之量來測定。用於吸入器或吹入器中之例如明膠之膠囊及藥筒可經調配以含有該化合物與諸如乳糖或澱粉之適合粉末基質之粉末混合物。
本發明之組合物亦可調配於例如含有習知栓劑基質(諸如可可脂或其他甘油酯)之經直腸組合物(諸如栓劑或保留灌腸劑)中。
除上述調配物外，組合物亦可調配為儲槽式製劑。此類長效調配物可藉由植入(例如皮下或肌肉內)或藉由肌肉內注射投與。因此，例如，該等化合物可用適合之聚合或疏水性材料(例如調配為於可接受之油劑中之乳液)或離子交換樹脂調配，或調配為微溶性衍生物(例如調配為微溶性鹽)。
如本文所揭示，抗原及/或鞘醣脂(GSL)佐劑可與醫藥學上可接受且與活性成分相容之賦形劑混合。適合之賦形劑為例如水、生理鹽水、緩衝生理鹽水、右旋糖、丙三醇、乙醇、無菌等張水性緩衝劑或其類似物及其組合。另外，若需要，製劑亦可包括少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑及/或免疫刺激劑(例如除鞘醣脂(GSL)以外增強醫藥組合物或疫苗之有效性的佐劑。可增強本發明組合物之有效性的額外免疫刺激劑的非限制性實例包括免疫刺激性、免疫增強性或促炎性細胞激素、淋巴激素或趨化激素或編碼其之核酸(特定實 例包括介白素(IL)-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13、顆粒球-巨噬細胞(GM)-群落刺激因子(CSF)及其他群落刺激因子、巨噬細胞炎性因子、Flt3配位體，參見題為「定義」之部分中免疫刺激細胞激素之額外實例)。此等額外免疫刺激分子可以蛋白質形式或藉由表現編碼用於分子表現之載體而全身性或局部遞送。上文所述用於遞送抗原及鞘醣脂(GSL)佐劑之技術亦可用於遞送額外免疫刺激分子。
本發明亦提供一種醫藥封裝或套組，其包含一或多個用本發明之免疫原性調配物的一或多種成分填充的容器。在相關實施例中，本發明提供一種用於製備包含至少一種抗原及含有鞘醣脂(GSL)之佐劑的醫藥或疫苗組合物的套組，該套組包含在第一容器中之該抗原及在第二容器中之該佐劑及視情況存在之混合該抗原及該佐劑及/或投與該組合物之說明書。套組之各容器亦可視情況包括一或多種生理學上可接受之載劑及/或賦形劑及/或輔助物質。與該(等)容器相關聯的可為由管理醫藥或生物產物之製造、使用或銷售之政府機構所規定形式之注意事項，該注意事項反映由人類投藥之製造、使用或銷售機構之批准。
若需要，組合物可以封裝或施配器裝置呈現，其可含有一或多個含有活性成分(亦即抗原及/或含有鞘醣脂(GSL)之佐劑)之單位劑型。封裝可例如包含金屬或塑膠箔，諸如泡殼封裝。封裝或施配器裝置可附有投藥用法說明書。亦可製備調配於相容醫藥載劑中之本發明組合物，置於適當容器中且標註用於治療指定病狀。
有效劑量及安全性評估
根據本發明之方法，本文所述之醫藥及疫苗組合物以免疫原性有效劑量、較佳在最小毒性下投與患者。如題為「定義」之部分中所敍述，所揭示調配物之「免疫原性有效劑量」或「治療有效劑量」係指足以在經治療個體中產生有效免疫反應且因此足以產生對該個體之 健康益處的抗原及/或鞘醣脂(GSL)佐劑的量。
按照此項技術中公認的方法(參見例如reports on evaluation of several vaccine formulations containing novel adjuvants in a collaborative effort between the Center for Biological Evaluation and Food and Drug Administration and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases[Goldenthal等人，National Cooperative Vaccine Development Working Group.AIDS Res.Hum.Retroviruses,1993,9：545-9])，本發明之化合物及組合物的有效劑量及毒性首先在臨床前研究中使用小型動物模型(例如小鼠)測定，其中已發現抗原及含有鞘醣脂(GSL)之佐劑具有免疫原性且可藉由提議用於人類臨床試驗之相同途徑可再現地經免疫。特定言之，對於本發明方法中所用之任何醫藥組合物或疫苗，治療有效劑量可起初由動物模型估計以實現包括IC50(亦即實現半最大症狀抑制之測試化合物濃度)之循環血漿濃度範圍。來源於動物系統之劑量反應曲線接著用於確定用於人類初始臨床研究的測試劑量。在各組合物之安全性測定中，免疫之劑量及頻率應符合或超過預期適用於臨床試驗之劑量及頻率。
如本文所揭示，確定本發明組合物中具有α-葡萄糖(α-Glc)之鞘醣脂(GSL)、抗原及其他組分的劑量，以確保連續或間歇投與之劑量不會超過基於測試動物中之結果及患者個體狀況考量的一定量。特定劑量視給藥程序、患者或個體動物之狀況(諸如年齡、體重、性別、敏感性、攝食)、給藥時段、組合使用之藥物、疾病嚴重性而自然變化。在某些條件下之適當劑量及給藥時間可藉由基於上述指數的測試來確定且應根據醫師判斷及各患者之情況根據標準臨床技術來決定。與此相關，抗原之劑量一般係每公斤體重0.1μg-100mg的範圍內，而強化針對該抗原之免疫反應所需的鞘醣脂(GSL)佐劑的劑量一般在每公斤體重10-100μg的範圍內。
本發明之含有鞘醣脂(GSL)之免疫原性組合物的毒性及治療功效可藉由標準醫藥程序在實驗動物中測定，例如藉由測定LD50(50%群體致死的劑量)及ED50(有效治療50%群體之劑量)。毒性效應與治療效應之間的劑量比為治療指數且其可表示為比率LD50/ED50。展現大治療指數之組合物較佳。雖然可使用展現毒性副作用之治療劑(例如當治療重型癌症或危及生命的感染時)，但應小心設計遞送系統，使此類免疫原性組合物靶向特定部位(例如調節免疫反應之淋巴組織、腫瘤或支撐感染物複製之器官)，以便使對其他組織及器官之潛在損傷減至最小且由此減小副作用。如本文所揭示(亦參見先前技術部分及實例)，本發明之鞘醣脂(GSL)佐劑不僅在相對低的劑量(例如每公斤體重10-100μg佐劑)下具有高度免疫刺激性，而且具有低毒性且不產生顯著副作用。
如上文所指明，由動物研究獲得之資料可用於調配一系列適用於人類之劑量。本發明之含有鞘醣脂(GSL)之組合物在人類中的治療有效劑量較佳處於包括ED50且具有極小或無毒性之循環濃度的範圍內。劑量可視所用劑型及所用投藥途徑而在此範圍內變化。理想地，應使用單一劑量。
關於化學結構之定義 特定官能基及化學術語之定義更詳細地描述於下文。化學元素係根據Handbook of Chemistry and Physics，第75版，內封面之元素週期表(CAS版)來鑑別，且特定官能基一般如其中所述來定義。另外，有機化學之一般原理以及特定官能部分及反應性描述於Thomas Sorrell,Organic Chemistry,University Science Books,Sausalito,1999；Smith及March,March's Advanced Organic Chemistry,第5版，John Wiley & Sons,Inc.,New York,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers,Inc.,New York,1989；及Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis， 第3版，Cambridge University Press,Cambridge,1987中。
本文所述之化合物可包含一或多個不對稱中心，且因此可以各種異構體形式(例如對映異構體及/或非對映異構體)存在。舉例而言，本文所述之化合物可呈個別對映異構體、非對映異構體或幾何異構體形式，或可呈立體異構體之混合物形式，包括外消旋混合物及一或多種立體異構體增濃之混合物。異構體可利用熟習此項技術者已知之方法(包括例如對掌性高壓液相層析(HPLC)及對掌性鹽的形成及結晶)而自混合物中分離；或可藉由不對稱合成來製備較佳異構體。參見例如Jacques等人，Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Wilen等人，Tetrahedron 33：2725(1977)；Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；及Wilen,Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions第268頁(E.L.Eliel編，Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)。本發明另外涵蓋呈實質上不含其他異構體之個別異構體形式及替代地呈各種異構體之混合物形式的本文所述化合物。
當列舉值範圍時，意欲涵蓋該範圍內的每個值及子範圍。舉例而言，「C1-6」意欲涵蓋C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C2-6、C2-5、C2-4、C2-3、C3-6、C3-5、C3-4、C4-6、C4-5及C5-6。
「烷基」係指具有1至20個碳原子的直鏈或分支鏈飽和烴基(「C1-20烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至10個碳原子(「C1-10烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至9個碳原子(「C1-9烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至8個碳原子(「C1-8烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至7個碳原子(「C1-7烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至6個碳原子(「C1-6烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至5個碳原子(「C1-5烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至4個碳原子(「C1-4烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至3個碳原子(「C1-3 烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1至2個碳原子(「C1-2烷基」)。在一些實施例中，烷基具有1個碳原子(「C1烷基」)。在一些實施例中，烷基具有2至6個碳原子(「C2-6烷基」)。C1-6烷基之實例包括甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、異丙基(C3)、正丁基(C4)、第三丁基(C4)、第二丁基(C4)、異丁基(C4)、正戊基(C5)、3-戊基(C5)、戊基(C5)、新戊基(C5)、3-甲基-2-丁基(C5)、第三戊基(C5)及正己基(C6)。烷基之額外實例包括正庚基(C7)、正辛基(C8)及其類似基團。除非另外規定，否則烷基之各實例獨立地視情況經取代，亦即未經取代(「未經取代之烷基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之烷基」)。在某些實施例中，烷基為未經取代之C1-10烷基(例如-CH3)。在某些實施例中，烷基為經取代之C1-10烷基。
「烯基」係指具有2至20個碳原子、一或多個碳-碳雙鍵且無參鍵的直鏈或分支鏈烴基(「C2-20烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至10個碳原子(「C2-10烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至9個碳原子(「C2-9烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至8個碳原子(「C2-8烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至7個碳原子(「C2-7烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至6個碳原子(「C2-6烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至5個碳原子(「C2-5烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至4個碳原子(「C2-4烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2至3個碳原子(「C2-3烯基」)。在一些實施例中，烯基具有2個碳原子(「C2烯基」)。一或多個碳-碳雙鍵可在內部(諸如2-丁烯基中)或末端(諸如1-丁烯基中)。C2-4烯基之實例包括乙烯基(C2、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)及其類似基團。C2-6烯基之實例包括前述C2-4烯基以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)及其類似基團。烯基之其他實例包括庚烯基(C7)、辛烯基(C8)、辛三烯基(C8)及其類似基團。除非另外規定，否則烯基之 各實例獨立地視情況經取代，亦即未經取代(「未經取代之烯基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之烯基」)。在某些實施例中，烯基為未經取代之C2-10烯基。在某些實施例中，烯基為經取代之C2-10烯基。
「炔基」係指具有2至20個碳原子、一或多個碳-碳參鍵及視情況存在之一或多個雙鍵的直鏈或分支鏈烴基(「C2-20炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至10個碳原子(「C2-10炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至9個碳原子(「C2-9炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至8個碳原子(「C2-8炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至7個碳原子(「C2-7炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至6個碳原子(「C2-6炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至5個碳原子(「C2-5炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至4個碳原子(「C2-4炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2至3個碳原子(「C2-3炔基」)。在一些實施例中，炔基具有2個碳原子(「C2炔基」)。一或多個碳-碳參鍵可在內部(諸如2-丁炔基中)或末端(諸如1-丁炔基中)。C2-4炔基之實例包括(但不限於)乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)及其類似基團。C2-6烯基之實例包括前述C2-4炔基以及戊炔基(C5)、己炔基(C6)及其類似基團。炔基之其他實例包括庚炔基(C7)、辛炔基(C8)及其類似基團。除非另外規定，否則炔基之各實例獨立地視情況經取代，亦即未經取代(「未經取代之炔基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之炔基」)。在某些實施例中，炔基為未經取代之C2-10炔基。在某些實施例中，炔基為經取代之C2-10炔基。
「碳環基」或「碳環」係指在非芳環系統中具有3至10個環碳原子(「C3-10碳環基」)及0個雜原子之非芳族環烴基。在一些實施例中，碳環基具有3至8個環碳原子(「C3-8碳環基」)。在一些實施例中，碳環基具有3至6個環碳原子(「C3-6」碳環基)。在一些實施例 中，碳環基具有3至6個環碳原子(「C3-6」碳環基)。在一些實施例中，碳環基具有5至10個環碳原子(「C5-10」碳環基)。例示性C3-6碳環基包括(但不限於)環丙基(C3)、環丙烯基(C3)、環丁基(C4)、環丁烯基(C4)、環戊基(C5)、環戊烯基(C5)、環己基(C6)、環己烯基(C6)、環己二烯基(C6)及其類似基團。例示性C3-8碳環基包括(但不限於)前述C3-6碳環基以及環庚基(C7)、環庚烯基(C7)、環庚二烯基(C7)、環庚三烯基(C7)、環辛基(C8)、環辛烯基(C8)、雙環[2.2.1]庚基(C7)、雙環[2.2.2]辛基(C8)及其類似基團。例示性C3-10碳環基包括(但不限於)前述C3-8碳環基以及環壬基(C9)、環壬烯基(C9)、環癸基(C10)、環癸烯基(C10)、八氫-1H-茚基(C9)、十氫萘基(C10)、螺[4.5]癸基(C10)及其類似基團。如前述實例所說明，在某些實施例中，碳環基為單環(「單環碳環基」)或含有稠合、橋連或螺環系統，諸如雙環系統(「雙環碳環基」)，且可為飽和的或可為部分不飽和的。「碳環基」亦包括以下環系統，其中如上文所定義之碳環基環與一或多個芳基或雜芳基稠合，其中連接點在碳環基環上，且在此等情況下，碳的編號繼續指示碳環基環系統中碳的編號。除非另外規定，否則碳環基之各實例獨立地視情況經取代，亦即未經取代(「未經取代之碳環基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之碳環基」)。在某些實施例中，碳環基為未經取代之C3-10碳環基。在某些實施例中，碳環基為經取代之C3-10碳環基。
在一些實施例中，「碳環基」為具有3至10個環碳原子之單環飽和碳環基(「C3-10環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有3至8個環碳原子(「C3-8環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有3至6個環碳原子(「C3-6環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有5至6個環碳原子(「C5-6環烷基」)。在一些實施例中，環烷基具有5至10個環碳原子(「C5-10環烷基」)。C5-6環烷基之實例包括環戊基(C5)及環己基(C5)。C3-6環烷基之實例包括前述C5-6環烷基以及環丙基(C3)及環丁基(C4)。 C3-8環烷基之實例包括前述C3-6環烷基以及環庚基(C7)及環辛基(C8)。除非另外規定，否則環烷基之各實例獨立地未經取代(「未經取代之環烷基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之環烷基」)。在某些實施例中，環烷基為未經取代之C3-10環烷基。在某些實施例中，環烷基為經取代之C3-10環烷基。
「雜環基」或「雜環」係指具有環碳原子及1至4個環雜原子的3員至10員非芳環系統之基團，其中各雜原子獨立地選自氮、氧、硫、硼、磷及矽(「3-10員雜環基」)。在某些實施例中，雜原子獨立地選自氮、硫及氧。在含有一或多個氮原子之雜環基中，價數允許時，連接點可為碳或氮原子。雜環基可為單環(「單環雜環基」)或稠合、橋連或螺環系統，諸如雙環系統(「雙環雜環基」)，且可為飽和或部分不飽和的。雜環基雙環系統可在一個或兩個環中包括一或多個雜原子。「雜環基」亦包括如上文所定義之雜環與一或多個碳環基稠合之環系統，其中連接點在碳環基或雜環上；或如上文所定義之雜環與一或多個芳基或雜芳基稠合之環系統，其中連接點在雜環上，且在此等情況下，環成員的編號繼續表示雜環系統中環成員的編號。除非另外規定，否則雜環基之各實例獨立地視情況經取代，亦即未經取代(「未經取代之雜環基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之雜環基」)。在某些實施例中，雜環基為未經取代之3-10員雜環基。在某些實施例中，雜環基為經取代之3-10員雜環基。
在一些實施例中，雜環基為具有環碳原子及1-4個環雜原子的5-10員非芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧、硫、硼、磷及矽(「5-10員雜環基」)。在一些實施例中，雜環基為具有環碳原子及1-4個環雜原子的5-8員非芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-8員雜環基」)。在一些實施例中，雜環基為具有環碳原子及1-4個環雜原子的5-6員非芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及 硫(「5-6員雜環基」)。在一些實施例中，5-6員雜環基具有1-3個選自氮、氧及硫之環雜原子。在一些實施例中，5-6員雜環基具有1-2個選自氮、氧及硫之環雜原子。在一些實施例中，5-6員雜環基具有一個選自氮、氧及硫之環雜原子。
含有一個雜原子之例示性3員雜環基包括(但不限於)環氮乙基、環氧乙基及環硫乙基。含有一個雜原子之例示性4員雜環基包括(但不限於)氮雜環丁烷基、氧雜環丁烷基及硫雜環丁烷基。含有一個雜原子之例示性5員雜環基包括(但不限於)四氫呋喃基、二氫呋喃基、四氫噻吩基、二氫噻吩基、吡咯啶基、二氫吡咯基及吡咯基-2,5-二酮。含有兩個雜原子之例示性5員雜環基包括(但不限於)二氧雜戊環基、氧硫雜呋喃基、二硫雜呋喃基及噁唑啶-2-酮。含有三個雜原子之例示性5員雜環基包括(但不限於)三唑啉基、氧雜二唑啉基及硫雜二唑啉基。含有一個雜原子之例示性6員雜環基包括(但不限於)哌啶基、四氫哌喃基、二氫吡啶基及噻烷基。含有兩個雜原子之例示性6員雜環基包括(但不限於)哌嗪基、嗎啉基、二噻烷基及二噁烷基。含有兩個雜原子之例示性6員雜環基包括(但不限於)三氮雜環己烷基。含有一個雜原子之例示性7員雜環基包括(但不限於)氮雜環庚烷基、氧雜環庚烷基及硫雜環庚烷基。含有一個雜原子之例示性8員雜環基包括(但不限於)氮雜環辛基、氧雜環辛基及硫雜環辛基。與C6芳基環稠合之例示性5員雜環基(在本文中亦稱為5,6-雙環雜環)包括(但不限於)二氫吲哚基、異吲哚啉基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基、苯并噁唑啉酮及其類似基團。與芳基環稠合之例示性6員雜環基(在本文中亦稱為6,6-雙環雜環)包括(但不限於)四氫喹啉基、四氫異喹啉基及其類似基團。
「芳基」係指單環或多環(例如雙環或三環)4n+2芳環系統(例如環狀陣列中共用6、10或14個π電子)之基團，該芳環系統中具有6至14 個環碳原子及零個雜原子(「C6-14芳基」)。在一些實施例中，芳基具有六個環碳原子(「C6芳基」；例如苯基)。在一些實施例中，芳基具有十個環碳原子(「C10芳基」；例如萘基，諸如1-萘基及2-萘基)。在一些實施例中，芳基具有十四個環碳原子(「C14芳基」；例如蒽基)。「芳基」亦包括如上文所定義之芳基環與一或多個碳環基或雜環基稠合之環系統，其中連接基團或連接點在芳基環上，且在此等情況下，碳原子的編號繼續指示芳基環系統中碳原子的編號。除非另外規定，否則芳基之各實例獨立地視情況經取代，亦即未經取代(「未經取代之芳基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之芳基」)。在某些實施例中，芳基為未經取代之C6-14芳基。在某些實施例中，芳基為經取代之C6-14芳基。
「芳基烷基」為如本文所定義之烷基及芳基之子集且係指經視情況經取代之芳基取代的視情況經取代之烷基。在某些實施例中，芳烷基為視情況經取代之苯甲基。在某些實施例中，芳烷基為苯甲基。在某些實施例中，芳烷基為視情況經取代之苯乙基。在某些實施例中，芳烷基為苯乙基。
「雜芳基」係指具有芳環系統中所提供之環碳原子及1-4個環雜原子之5-10員單環或雙環4n+2芳環系統(例如環狀陣列中共用6或10個π電子)之基團，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-10員雜芳基」)。在含有一或多個氮原子之雜芳基中，價數允許時，連接點可為碳或氮原子。雜芳基雙環系統可在一個或兩個環中包括一或多個雜原子。「雜芳基」包括如上文所定義之雜芳基環與一或多個碳環基或雜環基稠合之環系統，其中連接點在雜芳基環上，且在此等情況下，環成員的編號繼續指示雜芳基環系統中環成員之編號。「雜芳基」亦包括如上文所定義之雜芳基環與一或多個芳基稠合之環系統，其中連接點在芳基或雜芳基環上，且在此等情況下，環成員的編號指示稠合 (芳基/雜芳基)環系統中環成員的編號。其中一個環不含雜原子之雙環雜芳基(例如吲哚基、喹啉基、咔唑基及其類似基團)，連接點可在任一環上，亦即攜帶雜原子之環(例如2-吲哚基)或不含雜原子之環(例如5-吲哚基)。
在一些實施例中，雜芳基為具有芳環系統中所提供之環碳原子及1-4個環雜原子的5-10員芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-10員雜芳基」)。在一些實施例中，雜芳基為具有芳環系統中所提供之環碳原子及1-4個環雜原子的5-8員芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-8員雜芳基」)。在一些實施例中，雜芳基為具有芳環系統中所提供之環碳原子及1-4個環雜原子的5-6員芳環系統，其中各雜原子獨立地選自氮、氧及硫(「5-6員雜芳基」)。在一些實施例中，5-6員雜芳基具有1-3個選自氮、氧及硫之環雜原子。在一些實施例中，5-6員雜芳基具有1-2個選自氮、氧及硫之環雜原子。在一些實施例中，5-6員雜芳基具有1個選自氮、氧及硫之環雜原子。除非另外規定，否則雜芳基之各實例獨立地視情況經取代，亦即未經取代(「未經取代之雜芳基」)或經一或多個取代基取代(「經取代之雜芳基」)。在某些實施例中，雜芳基為未經取代之5-14員雜芳基。在某些實施例中，雜芳基為經取代之5-14員雜芳基。
含有一個雜原子之例示性5員雜芳基包括(但不限於)吡咯基、呋喃基及噻吩基。含有兩個雜原子之例示性5員雜芳基包括(但不限於)咪唑基、吡唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基及異噻唑基。含有三個雜原子之例示性5員雜芳基包括(但不限於)三唑基、噁二唑基及噻二唑基。含有四個雜原子之例示性5員雜芳基包括(但不限於)四唑基。含有一個雜原子之例示性6員雜芳基包括(但不限於)吡啶基。含有兩個雜原子之例示性6員雜芳基包括(但不限於)噠嗪基、嘧啶基及吡嗪基。含有三個或四個雜原子之例示性6員雜芳基分別包括(但不限於) 三嗪基及四嗪基。含有一個雜原子之例示性7員雜芳基包括(但不限於)氮呯基、氧呯基及噻呯基。例示性5,6-雙環雜芳基包括(但不限於)吲哚基、異吲哚基、吲唑基、苯并三唑基、苯并噻吩基、異苯并噻吩基、苯并呋喃基、苯并異呋喃基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、苯并異噁唑基、苯并噁二唑基、苯并噻唑基、苯并異噻唑基、苯并噻二唑基、吲哚嗪基及嘌呤基。例示性6,6-雙環雜芳基包括(但不限於)
Figure 104129739-A0202-12-0048-197
啶基、喋啶基、喹啉基、異喹啉基、
Figure 104129739-A0202-12-0048-198
啉基、喹喏啉基、酞嗪基及喹唑啉基。
「雜芳烷基」為如本文所定義之烷基及雜芳基之子集且係指經視情況經取代之雜芳基取代的視情況經取代之烷基。
如本文所定義之作為二價橋連基團的烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基另外使用後綴-伸基指代例如伸烷基、伸烯基、伸炔基、伸碳環基、伸雜環基、伸芳基及伸雜芳基。
如本文所用，術語「視情況經取代」係指經取代或未經取代之部分。
如本文所定義之烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基視情況經取代(例如「經取代」或「未經取代」之烷基、「經取代」或「未經取代」之烯基、「經取代」或「未經取代」之炔基、「經取代」或「未經取代」之碳環基、「經取代」或「未經取代」之雜環基、「經取代」或「未經取代」之芳基或「經取代」或「未經取代」之雜芳基)。一般而言，術語「經取代」，不論之前是否有術語「視情況」，均意指存在於基團(例如碳或氮原子)上之至少一個氫經容許取代基(例如在取代後產生穩定化合物(例如不會自發經歷諸如重排、環化、消除或其他反應之轉化的化合物)之取代基)置換。除非另外指明，否則「經取代」之基團在基團之一或多個可取代位置處具有取代基，且當任何既定結構中之一個以上位置經取代時，取代基在各位置 處相同或不同。術語「經取代」預期包括經有機化合物之所有容許取代基、導致穩定化合物形成之本文所述之任何取代基取代。本發明涵蓋任何及所有此類組合以便獲得穩定化合物。出於本發明之目的，雜原子(諸如氮)可具有氫取代基及/或滿足雜原子價數且導致穩定部分形成之如本文所述之任何適合取代基。
例示性碳原子取代基包括(但不限於)鹵素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORaa、-ON(Rbb)2、-N(Rbb)2、-N(Rbb)3 +X-、-N(ORcc)Rbb、-SH、-SRaa、-SSRcc、-C(=O)Raa、-CO2H、-CHO、-C(ORcc)2、-CO2Raa、-OC(=O)Raa、-OCO2Raa、-C(=O)N(Rbb)2、-OC(=O)N(Rbb)2、-NRbbC(=O)Raa、-NRbbCO2Raa、-NRbbC(=O)N(Rbb)2、-C(=NRbb)Raa、-C(=NRbb)ORaa、-OC(=NRbb)Raa、-OC(=NRbb)ORaa、-C(=NRbb)N(Rbb)2、-OC(=NRbb)N(Rbb)2、-NRbbC(=NRbb)N(Rbb)2、-C(=O)NRbbSO2Raa、-NRbbSO2Raa、-SO2N(Rbb)2、-SO2Raa、-SO2ORaa、-OSO2Raa、-S(=O)Raa、-OS(=O)Raa、-Si(Raa)3、-Osi(Raa)3-C(=S)N(Rbb)2、-C(=O)SRaa、-C(=S)SRaa、-SC(=S)SRaa、-SC(=O)SRaa、-OC(=O)SRaa、-SC(=O)ORaa、-SC(=O)Raa、-P(=O)2Raa、-OP(=O)2Raa、-P(=O)(Raa)2、-OP(=O)(Raa)2、-OP(=O)(ORcc)2、-P(=O)2N(Rbb)2、-OP(=O)2N(Rbb)2、-P(=O)(NRbb)2、-OP(=O)(NRbb)2、-NRbbP(=O)(ORcc)2、-NRbbP(=O)(NRbb)2、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-OP(Rcc)2、-OP(Rcc)3、-B(Raa)2、-B(ORcc)2、-BRaa(ORcc)、C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代；或碳原子上之兩個氫經基團=O、=S、=NN(Rbb)2、=NNRbbC(=O)Raa、=NNRbbC(=O)ORaa、=NNRbbS(=O)2Raa、=NRbb或=NORcc置換；Raa之各實例獨立地選自C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10 烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，或兩個Raa基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代；Rbb之各實例獨立地選自氫、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(=O)Raa、-C(=O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(=NRcc)ORaa、-C(=NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(=S)N(Rcc)2、-C(=O)SRcc、-C(=S)SRcc、-P(=O)2Raa、-P(=O)(Raa)2、-P(=O)2N(Rcc)2、-P(=O)(NRcc)2、C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，或兩個Rbb基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代；Rcc之各實例獨立地選自氫、C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，或兩個Rcc基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代；Rdd之各實例獨立地選自鹵素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORee、-ON(Rff)2、-N(Rff)2、-N(Rff)3 +X-、-N(ORee)Rff、-SH、-SRee、-SSRee、-C(=O)Ree、-CO2H、-CO2Ree、-OC(=O)Ree、-OCO2Ree、-C(=O)N(Rff)2、-OC(=O)N(Rff)2、-NRffC(=O)Ree、-NRffCO2Ree、-NRffC(=O)N(Rff)2、-C(=NRff)ORee、-OC(=NRff)Ree、-OC(=NRff)ORee、-C(=NRff)N(Rff)2、-OC(=NRff)N(Rff)2、-NRffC(=NRff)N(Rff)2,-NRffSO2Ree、-SO2N(Rff)2、-SO2Ree、-SO2ORee、-OSO2Ree、-S(=O)Ree、-Si(Ree)3、-Osi(Ree)3、-C(=S)N(Rff)2、-C(=O)SRee、-C(=S)SRee、-SC(=S)SRee、-P(=O)2Ree、-P(=O)(Ree)2、-OP(=O)(Ree)2、-OP(=O)(ORee)2、C1-6烷基、C1-6全鹵烷 基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-13碳環基、3-10員雜環基、C6-10芳基、5-10員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rgg基團取代，或兩個Rdd取代基可接合以形成=O或=S；Ree之各實例獨立地選自C1-6烷基、C1-6全鹵烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳環基、C6-10芳基、3-10員雜環基及3-10員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rgg基團取代；Rff之各實例獨立地選自氫、C1-6烷基、C1-6全鹵烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳環基、3-10員雜環基、C6-10芳基及5-10員雜芳基，或兩個Rff基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rgg基團取代；以及Rgg之各實例獨立地為鹵素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-OC1-6 alkyl、-ON(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)3 +X-、-NH(C1-6烷基)2 +X-、-NH2(C1-6烷基)+X-、-NH3 +X-、-N(OC1-6烷基)(C1-6烷基)、-N(OH)(C1-6烷基)、-NH(OH)、-SH、-SC1-6烷基、-SS(C1-6烷基)、-C(=O)(C1-6烷基)、-CO2H、-CO2(C1-6烷基)、-OC(=O)(C1-6烷基)、-OCO2(C1-6烷基)、-C(=O)NH2、-C(=O)N(C1-6烷基)2、-OC(=O)NH(C1-6烷基)、-NHC(=O)(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(=O)(C1-6烷基)、-NHCO2(C1-6烷基)、-NHC(=O)N(C1-6烷基)2、-NHC(=O)NH(C1-6烷基)、-NHC(=O)NH2、-C(=NH)O(C1-6烷基)、-OC(=NH)(C1-6烷基)、-OC(=NH)OC1-6烷基、-C(=NH)N(C1-6烷基)2、-C(=NH)NH(C1-6烷基)、-C(=NH)NH2、-OC(=NH)N(C1-6烷基)2、-OC(NH)NH(C1-6烷基)、-OC(NH)NH2、-NHC(NH)N(C1-6烷基)2、-NHC(=NH)NH2、-NHSO2(C1-6烷基)、-SO2N(C1-6烷基)2、-SO2NH(C1-6烷基)、-SO2NH2,-SO2C1-6烷基、-SO2OC1-6烷基、-OSO2C1-6烷基、-SOC1-6烷基、-Si(C1-6烷基)3、-Osi(C1-6烷基)3-C(=S)N(C1-6烷基)2、 C(=S)NH(C1-6烷基)、C(=S)NH2、-C(=O)S(C1-6烷基)、-C(=S)SC1-6烷基、-SC(=S)SC1-6烷基、-P(=O)2(C1-6烷基)、-P(=O)(C1-6烷基)2、-OP(=O)(C1-6烷基)2、-OP(=O)(OC1-6烷基)2、C1-6烷基、C1-6全鹵烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳環基、C6-10芳基、3-10員雜環基、5-10員雜芳基；或兩個Rgg取代基可接合以形成=O或=S；其中X-為相對離子。
「鹵基」或「鹵素」係指氟(氟基、-F)、氯(氯基、-Cl)、溴(溴基、-Br)或碘(碘基、-I)。
如本文所用，「醯基」係指選自由以下組成之群的部分：-C(=O)Raa、-CHO、-CO2Raa、-C(=O)N(Rbb)2、-C(=NRbb)Raa、-C(=NRbb)ORaa、-C(=NRbb)N(Rbb)2、-C(=O)NRbbSO2Raa、-C(=S)N(Rbb)2、-C(=O)SRaa及-C(=S)SRaa，其中Raa及Rbb如本文所定義。
價數允許時，氮原子可經取代或未經取代，且包括一級、二級、三級及四級氮原子。例示性氮原子取代基包括(但不限於)氫、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(=O)Raa、-C(=O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(=NRbb)Raa、-C(=NRcc)ORaa、-C(=NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(=S)N(Rcc)2、-C(=O)SRcc、-C(=S)SRcc、-P(=O)2Raa、-P(=O)(Raa)2、-P(=O)2N(Rcc)2、-P(=O)(NRcc)2、C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，或連接至氮原子之兩個Rcc基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代，且其中Raa、Rbb、Rcc及Rdd如上文所定義。
在某些實施例中，存在於氮原子上之取代基為氮保護基(亦稱為胺基保護基)。氮保護基包括(但不限於)-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、- C(=O)Raa、-C(=O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(=NRcc)Raa、-C(=NRcc)ORaa、-C(=NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(=S)N(Rcc)2、-C(=O)SRcc、-C(=S)SRcc、C1-10烷基(例如芳烷基、雜芳烷基)、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳烷基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代，且其中Raa、Rbb、Rcc及Rdd如本文所定義。氮保護基為此項技術中熟知的且包括Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene及P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley & Sons,1999中所描述之氮保護基，該文獻以引用的方式併入本文中。
舉例而言，氮保護基，諸如醯胺基(例如，-C(=O)Raa)，包括(但不限於)甲醯胺、乙醯胺、氯乙醯胺、三氯乙醯胺、三氟乙醯胺、苯基乙醯胺、3-苯基丙醯胺、吡啶醯胺、3-吡啶基甲醯胺、N-苯甲醯基苯丙胺醯基衍生物、苯甲醯胺、對苯基苯甲醯胺、鄰硝基苯基乙醯胺、鄰硝基苯氧基乙醯胺、乙醯乙醯胺、(N'-二硫苯甲氧基醯胺基)乙醯胺、3-(對羥苯基)丙醯胺、3-(鄰硝基苯基)丙醯胺、2-甲基-2-(鄰硝基苯氧基)丙醯胺、2-甲基-2-(鄰苯基偶氮基苯氧基)丙醯胺、4-氯丁醯胺、3-甲基-3-硝基丁醯胺、鄰硝基肉桂醯胺、N-乙醯基甲硫胺酸衍生物、鄰硝基苯甲醯胺及鄰(苯甲醯氧基甲基)苯甲醯胺。
氮保護基，諸如胺基甲酸酯基(例如-C(=O)ORaa)，包括(但不限於)胺基甲酸甲酯、胺基甲酸乙酯、胺基甲酸9-茀基甲酯(Fmoc)、胺基甲酸9-(2-磺酸基)茀基甲酯、胺基甲酸9-(2,7-二溴)茀基甲酯、胺基甲酸2,7-二第三丁基-[9-(10,10-二側氧基-10,10,10,10-四氫噻噸基)]甲酯(DBD-Tmoc)、胺基甲酸4-甲氧基苯甲醯甲酯(Phenoc)、胺基甲酸2,2,2-三氯乙酯(Troc)、胺基甲酸2-三甲基矽烷基乙酯(Teoc)、胺基甲酸2-苯基乙酯(hZ)、1-(1-金剛烷基)-1-甲基乙基(Adpoc)、胺基甲酸 1,1-二甲基-2-鹵基乙酯、胺基甲酸1,1-二甲基-2,2-二溴乙酯(DB-t-BOC)、胺基甲酸1,1-二甲基-2,2,2-三氯乙酯(TCBOC)、胺基甲酸1-甲基-1-(4-聯苯基)乙酯(Bpoc)、胺基甲酸1-(3,5-二第三丁基苯基)-1-甲基乙酯(t-Bumeoc)、胺基甲酸2-(2'-及4'-吡啶基)乙酯(Pyoc)、胺基甲酸2-(N,N-二環己基甲醯胺基)乙酯、胺基甲酸第三丁酯(BOC)、胺基甲酸1-金剛烷基酯(Adoc)、胺基甲酸乙烯酯(Voc)、胺基甲酸烯丙酯(Alloc)、胺基甲酸1-異丙基烯丙酯(Ipaoc)、胺基甲酸桂皮酯(Coc)、胺基甲酸4-硝基桂皮酯(Noc)、胺基甲酸8-喹啉基酯、胺基甲酸N-羥基哌啶基酯、胺基甲酸烷基二硫基酯、胺基甲酸苯甲酯(Cbz)、胺基甲酸對甲氧基苯甲酯(Moz)、胺基甲酸對硝基苯甲酯、胺基甲酸對溴苯甲酯、胺基甲酸對氯苯甲酯、胺基甲酸2,4-二氯苯甲酯、胺基甲酸4-甲基亞磺醯基苯甲酯(Msz)、胺基甲酸9-蒽基甲酯、胺基甲酸二苯甲酯、胺基甲酸2-甲基硫乙酯、胺基甲酸2-甲基磺醯基乙酯、胺基甲酸2-(對甲苯磺醯基)乙酯、胺基甲酸[2-(1,3-二噻烷基)]甲酯(Dmoc)、胺基甲酸4-甲基噻吩基酯(Mtpc)、胺基甲酸2,4-二甲基噻吩基酯(Bmpc)、胺基甲酸2-磷鎓基乙酯(Peoc)、胺基甲酸2-三苯基磷鎓基異丙酯(Ppoc)、胺基甲酸1,1-二甲基-2-氰基乙酯、胺基甲酸間氯對醯氧基苯甲酯、胺基甲酸對(二羥基氧硼基)苯甲酯、胺基甲酸5-苯并異噁唑基甲酯、胺基甲酸2-(三氟甲基)-6-色酮基甲酯(Tcroc)、胺基甲酸間硝基苯基酯、胺基甲酸3,5-二甲氧基苯甲酯、胺基甲酸鄰硝基苯甲酯、胺基甲酸3,4-二甲氧基-6-硝基苯甲酯、胺基甲酸苯基(鄰硝基苯基)甲酯、胺基甲酸第三戊酯、硫胺基甲酸S-苯甲酯、胺基甲酸對氰基苯甲酯、胺基甲酸環丁酯、胺基甲酸環己酯、胺基甲酸環戊酯、胺基甲酸環丙基甲酯、胺基甲酸對癸氧基苯甲酯、胺基甲酸2,2-二甲氧基醯基乙烯酯、胺基甲酸鄰(N,N-二甲基甲醯胺基)苯甲酯、胺基甲酸1,1-二甲基-3-(N,N-二甲基甲醯胺基)丙酯、胺基甲酸1,1-二甲基丙炔 酯、胺基甲酸二(2-吡啶基)甲酯、胺基甲酸2-呋喃基甲酯、胺基甲酸2-碘乙酯、胺基甲酸異冰片基酯、胺基甲酸異丁酯、胺基甲酸異菸鹼基酯、胺基甲酸對-(對'-甲氧基苯基偶氮基)苯甲酯、胺基甲酸1-甲基環丁酯、胺基甲酸1-甲基環己酯、胺基甲酸1-甲基-1-環丙基甲酯、胺基甲酸1-甲基-1-(3,5-二甲氧基苯基)乙酯、胺基甲酸1-甲基-1-(對苯基偶氮基苯基)乙酯、胺基甲酸1-甲基-1-苯基乙酯、胺基甲酸1-甲基-1-(4-吡啶基)乙酯、胺基甲酸苯酯、胺基甲酸對(苯基偶氮基)苯甲酯、胺基甲酸2,4,6-三第三丁基苯酯、胺基甲酸4-(三甲基銨)苯甲酯及胺基甲酸2,4,6-三甲基苯甲酯。
氮保護基，諸如磺醯胺基(例如，-S(=O)2Raa)，包括(但不限於)對甲苯磺醯胺(Ts)、苯磺醯胺、2,3,6,-三甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Mtr)、2,4,6-三甲氧基苯磺醯胺(Mtb)、2,6-二甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Pme)、2,3,5,6-四甲基-4-甲氧基苯磺醯胺(Mte)、4-甲氧基苯磺醯胺(Mbs)、2,4,6-三甲基苯磺醯胺(Mts)、2,6-二甲氧基-4-甲基苯磺醯胺(iMds)、2,2,5,7,8-五甲基色滿-6-磺醯胺(Pmc)、甲烷磺醯胺(Ms)、β-三甲基矽烷基乙烷磺醯胺(SES)、9-蒽磺醯胺、4-(4',8'-二甲氧基萘基甲基)苯磺醯胺(DNMBS)、苯甲基磺醯胺、三氟甲基磺醯胺及苯甲醯甲基磺醯胺。
其他氮保護基包括(但不限於)啡噻嗪基-(10)-醯基衍生物、N'-對甲苯磺醯基胺醯基衍生物、N'-苯基胺基硫代醯基衍生物、N-苯甲醯基苯基丙胺醯基衍生物、N-乙醯基甲硫胺酸衍生物、4,5-二苯基-3-噁唑啉-2-酮、N-鄰苯二甲醯亞胺、N-二硫雜丁二醯亞胺(Dts)、N-2,3-二苯基順丁烯二醯亞胺、N-2,5-二甲基吡咯、N-1,1,4,4-四甲基二矽烷基氮雜環戊烷加合物(STABASE)、5-取代1,3-二甲基-1,3,5-三氮雜環己-2-酮、5-取代1,3-二苯甲基-1,3,5-三氮雜環己-2-酮、1-取代3,5-二硝基-4-羥基、N-甲胺、N-烯丙胺、N-[2-(三甲基矽烷基)乙氧基]甲胺 (SEM)、N-3-乙醯氧基丙胺、N-(1-異丙基-4-硝基-2-側氧基-3-吡咯啉-3-基)胺、四級銨鹽、N-苯甲胺、N-二(4-甲氧基苯基)甲胺、N-5-二苯并環庚胺、N-三苯基甲胺(Tr)、N-[(4-甲氧基苯基)二苯甲基]胺(MMTr)、N-9-苯基茀基胺(PhF)、N-2,7-二氯-9-茀基亞甲基胺、N-二茂鐵基甲基胺基(Fcm)、N-2-吡啶甲基胺基N'-氧化物、N-1,1-二甲基硫基亞甲基胺、N-苯亞甲基胺、N-對甲氧基苯亞甲基胺、N-二苯基亞甲基胺、N-[(2-吡啶基)2,4,6-三甲苯基]亞甲基胺、N-(N',N'-二甲基胺基亞甲基)胺、N,N'-亞異丙基二胺、N-對硝基苯亞甲基胺、N-亞柳基胺、N-5-氯亞柳基胺、N-(5-氯-2-羥苯基)苯基亞甲基胺、N-亞環己基胺、N-(5,5-二甲基-3-側氧基-1-環己烯基)胺、N-硼烷衍生物、N-二苯基硼酸衍生物、N-[苯基(五醯基鉻-或鎢)醯基]胺、N-銅螯合劑、N-鋅螯合劑、N-硝基胺、N-亞硝基胺、N-氧化胺、二苯基膦醯胺(Dpp)、二甲基硫基膦醯胺(Mpt)、二苯基硫基膦醯胺(Ppt)、胺基磷酸二烷酯、胺基磷酸二苯甲酯、胺基磷酸二苯酯、苯亞磺醯胺、鄰硝基苯亞磺醯胺(Nps)、2,4-二硝基苯亞磺醯胺、五氯苯亞磺醯胺、2-硝基-4-甲氧基苯亞磺醯胺、三苯基甲基亞磺醯胺及3-硝基吡啶亞磺醯胺(Npys)。
在某些實施例中，存在於氧原子上之取代基為氧保護基(亦稱為羥基保護基)。氧保護基包括(但不限於)-Raa、-N(Rbb)2、-C(=O)SRaa、-C(=O)Raa、-CO2Raa、-C(=O)N(Rbb)2、-C(=NRbb)Raa、-C(=NRbb)ORaa、-C(=NRbb)N(Rbb)2、-S(=O)Raa、-SO2Raa、-Si(Raa)3、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-P(=O)2Raa、-P(=O)(Raa)2、-P(=O)(ORcc)2、-P(=O)2N(Rbb)2及-P(=O)(NRbb)2，其中Raa、Rbb及Rcc如本文所定義。氧保護基為此項技術中熟知的且包括Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene及P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley & Sons,1999中所描述之氧保護基，該文獻以引用的方式併入本文中。
例示性氧保護基包括(但不限於)甲基、甲氧基甲基(MOM)、甲硫基甲基(MTM)、第三丁基硫甲基、(苯基二甲基矽烷基)甲氧基甲基(SMOM)、苯甲氧基甲基(BOM)、對甲氧基苯甲氧基甲基(PMBM)、(4-甲氧基苯氧基)甲基(p-AOM)、愈創木酚甲基(GUM)、第三丁氧基甲基、4-戊烯氧基甲基(POM)、矽烷氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基(MEM)、2,2,2-三氯乙氧基甲基、雙(2-氯乙氧基)甲基、2-(三甲基矽烷基)乙氧基甲基(SEMOR)、四氫哌喃基(THP)、3-溴四氫吡喃基、四氫硫代哌喃基、1-甲氧基環己基、4-甲氧基四氫吡喃基(MTHP)、4-甲氧基四氫硫代哌喃基、4-甲氧基四氫硫代哌喃基S,S-二氧化物、1-[(2-氯-4-甲基)苯基]-4-甲氧基哌啶-4-基(CTMP)、1,4-二噁烷-2-基、四氫呋喃基、四氫硫代呋喃基、2,3,3a,4,5,6,7,7a-八氫-7,8,8-三甲基-4,7-甲醇苯并呋喃-2-基、1-乙氧基乙基、1-(2-氯乙氧基)乙基、1-甲基-1-甲氧基乙基、1-甲基-1-苯甲氧基乙基、1-甲基-1-苯甲氧基-2-氟乙基、2,2,2-三氯乙基、2-三甲基矽烷基乙基、2-(苯基氫硒基)乙基、第三丁基、烯丙基、對氯苯基、對甲氧基苯基、2,4-二硝基苯基、苯甲基(Bn)、對甲氧基苯甲基、3,4-二甲氧基苯甲基、鄰硝基苯甲基、對硝基苯甲基、對鹵基苯甲基、2,6-二氯苯甲基、對氰基苯甲基、對苯基苯甲基、2-吡啶甲基、4-吡啶甲基、3-甲基-2-吡啶甲基N-氧離子基、二苯甲基、對,對'-二硝基二苯甲基、5-二苯并環庚基、三苯甲基、α-萘基二苯基甲基、對甲氧基苯基二苯基甲基、二(對甲氧苯基)苯基甲基、三(對甲氧苯基)甲基、4-(4'-溴苯甲醯甲基氧基苯基)二苯甲基、4,4',4"-參(4,5-二氯鄰苯二甲醯亞胺基苯基)甲基、4,4',4"-參(乙醯丙醯基氧基苯基)甲基、4,4',4"-參(苯甲醯氧基苯基)甲基、3-(咪唑-1-基)雙(4',4"-二甲氧基苯基)甲基、1,1-雙(4-甲氧基苯基)-1'-芘基甲基、9-蒽基、9-(9-苯基)
Figure 104129739-A0202-12-0057-196
基、9-(9-苯基-10-側氧基)蒽基、1,3-苯并二硫雜環戊烷-2-基、苯并異噻唑基S,S-二氧離子基、三甲基矽烷基(TMS)、三乙 基矽烷基(TES)、三異丙基矽烷基(TIPS)、二甲基異丙基矽烷基(IPDMS)、二乙基異丙基矽烷基(DEIPS)、二甲基第三己基矽烷基、第三丁基二甲基矽烷基(TBDMS)、第三丁基二苯基矽烷基(TBDPS)、三苯甲基矽烷基、三對二甲苯基矽烷基、三苯基矽烷基、二苯基甲基矽烷基(DPMS)、第三丁基甲氧苯基矽烷基(TBMPS)、甲酸酯、苯甲醯基甲酸酯、乙酸酯、氯乙酸酯、二氯乙酸酯、三氯乙酸酯、三氟乙酸酯、甲氧基乙酸酯、三苯基甲氧基乙酸酯、苯氧基乙酸酯、對氯苯氧基乙酸酯、3-苯基丙酸酯、4-側氧基戊酸酯(乙醯丙酸酯)、4,4-(伸乙基二硫基)戊酸酯(乙醯丙醯基二硫縮醛)、新戊酸酯、金剛酸酯、巴豆酸酯、4-甲氧基巴豆酸酯、苯甲酸酯、對苯基苯甲酸酯、2,4,6-三甲基苯甲酸酯(均三甲苯酸酯)、碳酸甲酯、碳酸9-茀基甲酯(Fmoc)、碳酸乙酯、碳酸2,2,2-三氯乙酯(Troc)、碳酸2-(三甲基矽烷基)乙酯(TMSEC)、碳酸2-(苯磺醯基)乙酯(Psec)、碳酸2-(三苯基磷鎓基)乙酯(Peoc)、碳酸異丁酯、碳酸乙烯基酯、碳酸烯丙基酯、碳酸第三丁酯(BOC)、碳酸對硝基苯酯、碳酸苯甲酯、碳酸對甲氧基苯甲酯、碳酸3,4-二甲氧基苯甲酯、碳酸鄰硝基苯甲酯、碳酸對硝基苯甲酯、硫代碳酸S-苯甲酯、碳酸4-乙氧基-1-萘基酯、二硫代碳酸甲酯、2-碘苯甲酸酯、4-疊氮基丁酸酯、4-硝基-4-甲基戊酸酯、鄰(二溴甲基)苯甲酸酯、2-甲醯基苯磺酸酯、2-(甲基硫代甲氧基)乙基、4-(甲基硫代甲氧基)丁酸酯、2-(甲基硫代甲氧基甲基)苯甲酸酯、2,6-二氯-4-甲基苯氧基乙酸酯、2,6-二氯-4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯氧基乙酸酯、2,4-雙(1,1-二甲基丙基)苯氧基乙酸酯、氯二苯基乙酸酯、異丁酸酯、單丁二酸酯、(E)-2-甲基-2-丁烯酸酯、鄰(甲氧基醯基)苯甲酸酯、α-萘甲酸酯、硝酸酯、N,N,N',N'-四甲基二胺基磷酸酯、N-苯基胺基甲酸烷基酯、硼酸酯、二甲基膦基亞硫醯基、2,4-二硝基苯基亞磺酸烷基酯、硫酸酯、甲烷磺酸酯(甲磺酸酯)、苯甲基磺酸酯及甲苯磺酸酯 (Ts)。
在某些實施例中，存在於硫原子上之取代基為硫保護基(亦稱為硫醇保護基)。硫保護基包括(但不限於)-Raa、-N(Rbb)2、-C(=O)SRaa、-C(=O)Raa、-CO2Raa、-C(=O)N(Rbb)2、-C(=NRbb)Raa、-C(=NRbb)ORaa、-C(=NRbb)N(Rbb)2、-S(=O)Raa、-SO2Raa、-Si(Raa)3、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-P(=O)2Raa、-P(=O)(Raa)2、-P(=O)(ORcc)2、-P(=O)2N(Rbb)2及-P(=O)(NRbb)2，其中Raa、Rbb及Rcc如本文所定義。硫保護基為此項技術中熟知的且包括Protecting Groups in Organic Synthesis,T.W.Greene及P.G.M.Wuts，第3版，John Wiley & Sons,1999中所描述之硫保護基，該文獻以引用的方式併入本文中。
如本文所用，術語「離去基」具有合成有機化學技術中之一般含義且係指能夠經親核試劑置換之原子或基團。適合離去基之實例包括(但不限於)鹵素(諸如F、Cl、Br或I(碘))、烷氧基羰氧基、芳氧基羰氧基、烷磺醯基氧基、芳烴磺醯基氧基、烷基-羰氧基(例如乙醯氧基)、芳基羰氧基、芳氧基、甲氧基、N,O-二甲基羥胺基、9-苯基呫吨(9-phenylxanthyl，pixyl)及鹵基甲酸酯。在一些情況下，離去基為磺酸酯，諸如甲苯磺酸酯(-OT)、甲烷磺酸酯(-OM)、對溴苯磺酸酯(-OB)或三氟甲磺酸酯(-OTf)。在一些情況下，離去基為溴苯磺酸酯，諸如對溴苯磺醯基氧基。在一些情況下，離去基為硝基苯磺酸酯，諸如2-硝基苯磺醯基氧基。在一些實施例中，離去基為含磺酸酯之基團。在一些實施例中，離去基為甲苯磺酸酯基。離去基亦可為氧化膦(例如在光延反應(Mitsunobu reaction)期間形成)或內部脫離基，諸如環氧化物或環狀硫酸酯。離去基之其他非限制性實例為水、氨、醇、醚部分、硫醚部分、鹵化鋅、鎂部分、重氮鹽及銅部分。
例示性α-GalCer類似物(具有a-Glc之GSL)用作免疫佐劑以藉由刺激已經疫苗接種之患者的免疫系統而加速、增強、延長及/或調節或 強化疫苗之效應。在一個例示性實施方案中，類似物C34用作佐劑。如本文所用，術語「礬佐劑」係指具有免疫佐劑活性之鋁鹽，諸如磷酸鋁及氫氧化鋁。此等例示性藥劑可吸附溶液中的蛋白質抗原且使其沈澱；所得沈澱物藉由促進接種位點處所形成之疫苗儲槽中的抗原緩慢釋放來改良疫苗免疫原性。另外，本文中涵蓋之佐劑亦可包括適合之有機佐劑及適合之病毒顆粒。在某些實施例中，例示性有機佐劑可包括基於油之佐劑，諸如角鯊烯、MF59、QS-21及AS03。
如本文所用，術語「抗腫瘤免疫療法活性劑」係指單獨及/或與其他協同劑組合的藉由本發明之疫苗產生的抑制、減小及/或消除腫瘤的抗體。
已知攜帶α-半乳糖苷基(αGal)及在醯基鏈上之苯環的鞘醣脂(GSL)與α-半乳糖苷基神經醯胺(αGalCer)相比更有效地刺激鼠類及人類恆定型NKT(iNKT)細胞。其在小鼠及人類中之活性與iNKT TCR與CD1d-GSL複合物之間的三元相互作用的結合親合力相關。
本發明係關於以下出人意料的發現，具有葡萄糖(αGlc)之GSL與具有αGal之GSL相比在誘導細胞激素/趨化激素及免疫細胞擴增/激活的方面對於人類較強，但對於小鼠較弱。本文揭示具有葡萄糖(αGlc)及αGlc之F衍生物的GSL及其對於在人類中之免疫刺激性活性的影響。本文描述各物種之與三元相互作用強度相關聯的免疫刺激效能。如由本文中所揭示之mCD1d相較於hCD1d調換分析所證明，指出物種特異性反應的為iNKT TCR而非CD1d。具有αGlc之鞘醣脂(GSL)與具有αGal之GSL相比攜有較強三元相互作用且在人類中觸發更加偏向Th1之免疫。具有αGlc之GSL與具有αGal之GSL相比在小鼠中的刺激較小。如由如本文所述之mCD1d相較於hCD1d調換分析所證實，物種特異性反應歸因於物種之間三元複合物的差異性結合親合力，反映鼠類及人類iNKT TCR之間的差異。
此等新穎的發現指示物種中之差異且提供在醣基上具有修飾而更有效地用於人類療法之GSL的新穎設計。
化合物
本發明係關於式(I)之例示性免疫佐劑化合物：
Figure 104129739-A0202-12-0061-8
或其醫藥學上可接受之鹽；其中R1為-OH或鹵素；R2為氫或鹵素；R3為OH、氫或鹵素；R4及R5各自獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之芳基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之雜芳基、視情況經取代之烷氧基、視情況經取代之胺基或視情況經取代之醯基；n為1至15的整數，包括本數；以及m為1至20的整數，包括本數。
在化合物(I)之一些實施例中，R2為氫。在化合物(I)之一些實施例中，R2為鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R2為F。在化合物(I)之一些實施例中，R2為Cl。在化合物(I)之一些實施例中，R2為Br。在化合物(I)之一些實施例中，R2為I。
在化合物(I)之一些實施例中，R1為-OH。在化合物(I)之一些實施例中，R1為鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R1為F。在化合物(I)之一些實施例中，R1為Cl。在化合物(I)之一些實施例中，R1為Br。在化合物(I)之一些實施例中，R1為I。
在化合物(I)之一些實施例中，R3為OH。在化合物(I)之一些實施例中，R3為氫。在化合物(I)之一些實施例中，R3為鹵素。在化合物(I) 之一些實施例中，R3為F。在化合物(I)之一些實施例中，R3為Cl。在化合物(I)之一些實施例中，R3為Br。在化合物(I)之一些實施例中，R3為I。
在化合物(I)之一些實施例中，R1為-OH；R2為氫或鹵素；以及R3為OH、氫或鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R1為-OH；R2為氫；以及R3為OH、氫或鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R1為-OH；R2為氫；以及R3為OH、氫或鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R1為-OH；R2為鹵素；以及R3為OH、氫或鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R1為鹵素；R2為氫或鹵素；以及R3為OH、氫或鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R1為鹵素；R2為氫；以及R3為OH、氫或鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R1為鹵素；R2為鹵素；以及R3為OH、氫或鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R1為鹵素；R2為鹵素；以及R3為氫或鹵素。
在化合物(I)之一些實施例中，R4為苯基。在一些實施例中，R4為式(II)之視情況經取代之苯基：
Figure 104129739-A0202-12-0062-10
其中i=0、1、2、3、4或5；R6之各實例獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、-CN、-NO2、-N3、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之苯基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之雜芳基、視情況經取代之烷氧基、視情況經取代之胺基或視情況經取代之醯基。在某些實施例中，i為0。在某些實施例中，i為1。在某些實施例中，i為2。在某些實施例中，i為3。在某些實施例中，i為4。在某些實施例中，i為5。在某些實施例中，i為1且R6為鹵素。在某些實施例 中，i為1且R4為以下各式中之一者：
Figure 104129739-A0202-12-0063-134
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-135
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-136
或
Figure 104129739-A0202-12-0063-138
。在某些實施例中，i為2且R4為以下各式中之一 者：
Figure 104129739-A0202-12-0063-139
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-141
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-142
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-143
或
Figure 104129739-A0202-12-0063-144
。在 某些實施例中，i為3且R4為以下各式中之一者：
Figure 104129739-A0202-12-0063-146
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-151
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-152
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-153
或
Figure 104129739-A0202-12-0063-155
。在某些實施例 中，i為4且R4為以下各式中之一者：
Figure 104129739-A0202-12-0063-156
、
Figure 104129739-A0202-12-0063-157
或
Figure 104129739-A0202-12-0063-147
。在某些實施例中，i為5且R4為式
Figure 104129739-A0202-12-0063-149
。
在化合物(I)之一些實施例中，R6為鹵素。在化合物(I)之一些實施例中，R6為F。在化合物(I)之一些實施例中，R6為Cl。在化合物(I)之一些實施例中，R6為Br。在化合物(I)之一些實施例中，R6為I。
在化合物(I)之一些實施例中，R4為視情況經取代之芳基。在化合物(I)之一些實施例中，R4具有式(III)：
Figure 104129739-A0202-12-0064-11
其中j為0、1、2、3或4；k為0、1、2、3、4或5；R7及R8之各實例係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、-CN、-NO2、-N3、視情況經取代之烷基、視情況經取代之烯基、視情況經取代之炔基、視情況經取代之碳環基、視情況經取代之苯基、視情況經取代之雜環基、視情況經取代之雜芳基、視情況經取代之烷氧基、視情況經取代之胺基或視情況經取代之醯基。在某些實施例中，k為0。在某些實施例中，k為1。在某些實施例中，k為2。在某些實施例中，k為3。在某些實施例中，k為4。在某些實施例中，k為5。在某些實施例中，k為1且R8為鹵素。在某些實施例中，k為1且R4為以下各式中之一者：
Figure 104129739-A0202-12-0064-158
、
Figure 104129739-A0202-12-0064-159
或
Figure 104129739-A0202-12-0064-160
。在某些實施 例中，k為2且R4為以下各式中之一者：
Figure 104129739-A0202-12-0064-162
、
Figure 104129739-A0202-12-0064-164
Figure 104129739-A0202-12-0064-165
或
Figure 104129739-A0202-12-0064-167
。在某些實施例中，k為3且R4為 以下各式中之一者：
Figure 104129739-A0202-12-0064-168
、
Figure 104129739-A0202-12-0064-169
、
Figure 104129739-A0202-12-0065-170
、
Figure 104129739-A0202-12-0065-171
或
Figure 104129739-A0202-12-0065-172
。在某些實 施例中，k為4且R4為以下各式中之一者：
Figure 104129739-A0202-12-0065-173
、
Figure 104129739-A0202-12-0065-174
或
Figure 104129739-A0202-12-0065-176
。在某些實施例中，k為5且R4具 有式
Figure 104129739-A0202-12-0065-178
。
在化合物(I)之一些實施例中，n為1至15的整數，包括本數。在化合物(I)之一些實施例中，n為5至15的整數，包括本數。在化合物(I)之一些實施例中，n為10至15的整數，包括本數。在化合物(I)之一些實施例中，n為10。在化合物(I)之一些實施例中，n為11。在化合物(I)之一些實施例中，n為12。在化合物(I)之一些實施例中，n為13。在化合物(I)之一些實施例中，n為14。在化合物(I)之一些實施例中，n為15。
在化合物(I)之一些實施例中，m為1至20的整數，包括本數。在化合物(I)之一些實施例中，m為5至20的整數，包括本數。在化合物(I)之一些實施例中，m為5至15的整數，包括本數。在化合物(I)之一些實施例中，m為10至15的整數，包括本數。在化合物(I)之一些實施例中，m為10。在化合物(I)之一些實施例中，m為11。在化合物(I)之一些實施例中，m為12。在化合物(I)之一些實施例中，m為13。在化合物(I)之一些實施例中，m為14。在化合物(I)之一些實施例中，m為15。
在化合物(I)之一些實施例中，R7為氫；R8為F；以及k為1、2或3。在化合物(I)之一些實施例中，R7為F；R8為氫；以及j為1、2或3。在化合物(I)之一些實施例中，R7及R8皆為F；k為1、2或3；以及j為1、2或3。
在式(I)之一些實施例中，所提供之化合物可包括或排除(例如不符合限制條件)以下化合物中之一者：
Figure 104129739-A0202-12-0066-12
Figure 104129739-A0202-12-0066-13
Figure 104129739-A0202-12-0066-14
Figure 104129739-A0202-12-0066-15
Figure 104129739-A0202-12-0067-16
Figure 104129739-A0202-12-0067-17
Figure 104129739-A0202-12-0067-18
Figure 104129739-A0202-12-0067-21
Figure 104129739-A0202-12-0067-22
Figure 104129739-A0202-12-0068-23
Figure 104129739-A0202-12-0068-24
Figure 104129739-A0202-12-0068-25
Figure 104129739-A0202-12-0068-26
Figure 104129739-A0202-12-0068-27
Figure 104129739-A0202-12-0069-28
Figure 104129739-A0202-12-0069-29
Figure 104129739-A0202-12-0069-30
Figure 104129739-A0202-12-0069-31
Figure 104129739-A0202-12-0069-32
Figure 104129739-A0202-12-0070-33
Figure 104129739-A0202-12-0070-34
Figure 104129739-A0202-12-0070-35
Figure 104129739-A0202-12-0070-36
Figure 104129739-A0202-12-0070-37
Figure 104129739-A0202-12-0071-38
Figure 104129739-A0202-12-0071-39
Figure 104129739-A0202-12-0071-40
Figure 104129739-A0202-12-0071-41
Figure 104129739-A0202-12-0071-42
Figure 104129739-A0202-12-0072-43
Figure 104129739-A0202-12-0072-44
Figure 104129739-A0202-12-0072-45
Figure 104129739-A0202-12-0072-46
Figure 104129739-A0202-12-0072-47
Figure 104129739-A0202-12-0073-48
Figure 104129739-A0202-12-0073-49
Figure 104129739-A0202-12-0073-50
Figure 104129739-A0202-12-0073-179
Figure 104129739-A0202-12-0073-180
Figure 104129739-A0202-12-0073-53
醫藥組合物
本發明提供醫藥組合物，其包含本文所述之例示性化合物及醫 藥學上可接受之賦形劑。本文中所揭示之組合物可連同額外活性劑、載劑、媒劑、賦形劑或熟習此項技術者在閱讀本發明後可鑑別之輔助劑一起包括於醫藥或營養組合物中。
醫藥組合物較佳包含至少一種醫藥學上可接受之載劑。在此類醫藥組合物中，本文所揭示之組合物形成「活性化合物」，亦稱為「活性劑」。如本文所用，措辭「醫藥學上可接受之載劑」包括與醫藥投與相容的溶劑、分散介質、包衣劑、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物。亦可將補充活性化合物併入組合物中。醫藥組合物經調配可與其預期的投藥途徑相容。投藥途徑之實例包括非經腸，例如靜脈內、皮內、皮下、經口(例如吸入)、經皮(局部)、經黏膜及經直腸投藥。用於非經腸、皮內或皮下施用的溶液或懸浮液可包括以下組分：無菌稀釋劑，諸如注射用水、生理鹽水溶液、不揮發性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗細菌劑，諸如苯甲醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩衝劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及張力調節劑，諸如氯化鈉或右旋糖。可用酸或鹼(諸如鹽酸或氫氧化鈉)調節pH。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成的安瓿、拋棄式注射器或多劑量小瓶中。
如本文所用之個體係指人類及非人類靈長類動物(例如大猩猩、獼猴、狨猴)、家畜動物(例如羊、牛、馬、驢及豬)、伴侶動物(例如狗、貓)、實驗室測試動物(例如小鼠、兔、大鼠、天竺鼠、倉鼠)、豢養野生動物(例如狐狸、鹿)及任何其他可受益於本發明藥劑之生物體。對可受益於目前描述之藥劑的動物類型不存在限制。個體，不論其是否為人類或非人類生物體，可稱為患者、個體、動物、宿主或接受者。
適於可注射使用之醫藥組合物包括無菌水溶液(其中可溶於水)或 分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散液之無菌粉末。對於靜脈內投藥，適合載劑包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF,Parsippany N.J.)或磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)。在所有情況下，該組合物應為無菌的且流動性應達到存在易於注射性之程度。其應在製造及儲存條件下穩定且保存以防諸如細菌及真菌之微生物的污染作用。載劑可為含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物)及其適合混合物之溶劑或分散介質。適當流動性可例如藉由使用諸如卵磷脂之包衣、在分散液之情況下藉由維持所需粒度及藉由使用界面活性劑來維持。微生物活動之防止可藉由各種抗細菌及抗真菌劑達成，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，組合物中將較佳包括等張劑，例如糖、多元醇(諸如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。可藉由將延遲吸收之藥劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)包括在組合物中而實現可注射組合物之延長吸收。
本文所述之組合物的用途
本發明提供適用於刺激有需要之人類個體之免疫反應的組合物，方法包含：向該個體投與治療有效量之本文中所揭示之組合物。
本文所述之組合物亦可用於提高有需要之人類個體的恆定型自然殺手T(iNKT)細胞產生，方法包含：向該有需要之個體投與治療有效量之醫藥學上可接受之組合物，其中該組合物包含本文所揭示之例示性化合物。
本文所述之例示性組合物亦可用於刺激有需要之人類個體的細胞激素及/或趨化激素產生，方法包含：向該個體投與治療有效量之醫藥學上可接受之組合物，其中該組合物包含足以增加細胞激素/趨化激素產生之量的本文所揭示之化合物。
「有效」量或「治療有效」量之活性劑意指無毒性但足以提供 有益效應之量的該藥劑。活性劑的「有效」量將在個體之間變化，視個體之年齡及一般狀況、特定活性劑及其類似物而定。除非另外指明，否則如本文所用之術語「治療有效」量意欲涵蓋有效預防不良病狀及/或改善不良病狀之量，亦即除有效治療不良病狀之量以外。
如本文所定義，活性化合物之治療有效量(亦即有效劑量)可介於每公斤體重約0.001至100g之範圍內，或在無不當實驗的情況下應由此項技術者清楚及瞭解的其他範圍。熟習此項技術者應瞭解某些因素可影響有效治療個體所需的劑量及時序，其包括(但不限於)疾病或病症之嚴重程度、先前治療、個體之一般健康狀況或年齡及存在之其他疾病。
作為本文中所用之術語的不良病狀可為常常在個體中所見之「正常」病狀或可能或可能不與提出之疾病相關聯的病理性病狀。
如本文所用，術語「脂質」係指參與細胞信號傳導路徑之任何脂溶性(親脂性)分子。
如本文所用，術語「醣脂」係指充當細胞識別標記之附接碳水化合物的脂質。
根據另一個態樣，可由熟習此項技術者設想一或多個分裝部分之套組，亦即進行本文所揭示方法中之至少一者的分裝部分之套組、包含兩種或兩種以上組合物之分裝部分之套組，根據以上所提及之方法中之至少一者該等組合物包含單獨或組合之有效量之本文所揭示之組合物。
套組可能亦包括包含活性劑之組合物、生物事件之標識符或有技術的個人在閱讀本發明後可鑑別之其他化合物。套組亦可包含至少一種包含有效量之本文所揭示之組合物或細胞株的組合物。分裝部分之套組之組合物及細胞株將用於根據熟習此項技術者可鑑別之程序進行至少一種本文所揭示之方法。
如本文所用，術語「特異性結合」係指結合對(例如抗體及抗原)之間的相互作用。在各種情形下，特異性結合可以約10-6莫耳/公升、約10-7莫耳/公升或約10-8莫耳/公升或小於10-8莫耳/公升之親和力常數體現。
如熟習此項技術者在閱讀本發明後將顯而易知，本文中所描述及說明之個別實施例中之每一者具有離散組分及特徵，其可易於與其他若干實施例中之任一者的特徵分離或組合而不悖離本發明之範疇或精神。任何所述方法均可以所述事件順序或以邏輯上可能的任何其他順序進行。
在一個態樣中，本文所述之免疫組合物可非經腸投與(例如靜脈內注射、皮下注射或肌肉內注射)。或者，包括栓劑及經口調配物之其他投藥模式可為所需的。對於栓劑，黏合劑及載劑可包括例如聚烷二醇或甘油三酯。經口調配物可包括通常採用之輔料，諸如醫藥等級之糖精、纖維素、碳酸鎂及其類似物。此等組合物呈溶液、懸浮液、錠劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末形式且含有10-95%本文所述之免疫組合物。
免疫組合物以與劑型相容的方式且以治療上具有有效性、保護性及免疫原性的量投與。投藥量視所治療之個體而定，包括例如個體免疫系統合成抗體及必要時產生細胞介導免疫反應的能力。需要投與之活性成分的精確量視從業者之判斷而定。然而，熟習此項技術者容易確定適合的劑量範圍。初始投藥及加強劑量的適合方案亦為可變的，但可包括初始投藥，後為後續投藥。疫苗劑量亦可視投藥途徑而定且根據宿主體型而變。
本發明之免疫組合物亦可用於在用於產生抗體的動物中產生可用於癌症治療與診斷的抗體。用動物(例如小鼠、兔、山羊、綿羊或馬)產生單株及多株抗體及其片段的方法在此項技術中已熟知。參見 例如Harlow及Lane,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。術語「抗體」包括完整免疫球蛋白分子以及其片段，諸如Fab、F(ab)2、Fv、scFv(單鏈抗體)及dAb(域抗體；Ward等人，(1989)Nature,341,544)。
除非另外規定，否則本文中所用之所有技術及科學術語具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解相同之含義。在發生衝突之情況下，以本文獻(包括定義)為准。雖然類似或等效於本文所述之彼等方法及材料之任何方法及材料可用於本發明之實踐或測試中，但現在描述較佳方法及材料。本文特別提及的所有公開案及專利以引用的方式併入本文中用於所有目的，包括描述及揭示公開案中所報導、可聯合本發明使用的化學品、細胞株、載體、動物、儀器、統計學分析及方法。本說明書中所引用的所有參考文獻視為此項技術中之技能水準之指示。本文不應解釋為承認本發明無權先於憑藉先前發明之此類揭示內容。
在描述本發明材料及方法之前，應理解本發明不限於所述特定方法論、方案、材料及試劑，因為其可變化。亦應理解，本文中所用之術語僅出於描述特定實施例之目的而並不意欲限制本發明之範疇，本發明之範疇將僅由所附申請專利範圍限制。
當提供值範圍時，應理解除非上下文另外明確指出，否則在彼範圍之上限與下限之間的各個中間值(至下限之單位的十分之一)及在彼規定範圍內之任何其他指定值或中間值均涵蓋於本發明內。此等較小範圍之上限及下限可獨立地包括於較小範圍內，且亦涵蓋於本發明中，在所陳述範圍內受到任何特定排他性限制。在所陳述範圍包括一個或兩個限制的情況下，範圍排除包括彼等限制之一者或兩者。
實例
提出以下實例以便給熟習此項技術者完整發明及如何製造及使 用本發明實施例之描述，且不意欲限制本發明者視為其發現的範疇。已努力確保關於所使用之數字(例如量、溫度等)的精度，但應考慮一些實驗誤差及偏差。除非另外指示，否則份數為重量份，分子量為重量平均分子量，溫度以攝氏度計，且壓力為大氣壓或近大氣壓。
概要：所有試劑化學品均以試劑級購買且不經進一步純化即使用。諸如二氯甲烷(CH2Cl2)、四氫呋喃(THF)、N,N-二甲基甲醯胺(DMF)、甲醇(MeOH)、吡啶之無水溶劑均購自Acros。HPLC級溶劑氯仿(CHCl3)及甲醇均購自Merck。用於醣基化之分子篩4Å(MS 4Å)購自Acros且藉由火焰激活。反應用分析型薄層層析(TLC)在EM矽膠60 F254盤中監測且在UV(254nm)下觀測及/或用酸性鉬酸鈰銨或茚三酮染色。急驟管柱層析在矽膠60Geduran(40-63μm,Merck)上進行。用於最終產物純化的Biogel LH20購自Aldrich。在20℃下在Bruker Topspin-600(600MHz)光譜儀上記錄1H NMR譜。化學位移(δ ppm)根據CDCl3(δ=7.24ppm)、MeOD(δ=3.31ppm)及吡啶-d5(δ=7.58ppm)之內標物信號賦值。13C NMR譜在Bruker Topspin-600(150MHz)光譜儀上獲得且使用CDCl3(δ=77.23ppm)、MeOD(δ=49.15ppm)之信號校準而以δ ppm標度報告。以Hz報告耦合常數(J)。分裂模式藉由使用以下縮寫描述：s，單峰；d，二重峰；t，三重峰；dd，雙二重峰；m，多重峰。1H NMR譜以此順序報告：化學位移；多重性；質子數；耦合常數(s)。
化學合成
在本發明之某些實施例中，組合物及使用方法可包括或排除以下化合物及製造/使用該等化合物之方法中之任一或多者。在某些實施例中，包括或排除攜帶α-葡萄糖(α-Glc)及在4及/或6位具有F之α-Glc衍生物的GSL。
Figure 104129739-A0202-12-0080-181
葡糖基供體8之合成
Figure 104129739-A0202-12-0080-182
化合物2：在0℃下，向1,2,3,4,6-五-O-乙醯基-β-D-葡萄哌喃糖1(40g，102.5mmol)於200mL無水CH2Cl2中之溶液中添加對甲苯硫醇(15.4g，123mmol)及BF3OEt2(15.4mL，123mmol)，反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。所得溶液直接用飽和NaHCO3溶液及鹽水萃取，經硫酸鎂(MgSO4)乾燥且蒸發。接著在乙酸乙酯(AcOEt)-己 烷溶液中再結晶，得到呈白色固體狀之2(32.6g,70%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 7.36(2H,d,J=7.2Hz),7.10(2H,d,J=7.8Hz),5.18(1H,t,J=9.0Hz),5.00(1H,t,J=9.6Hz),4.91(1H,t,J=9.0Hz),4.61(1H,d,J=10.2Hz),4.14-4.20(2H,m),3.67(1H,s),2.33(3H,s),2.07(3H,s),2.06(3H,s,),1.99(3H,s),1.96(3H,s)。13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 170.78,170.40,169.59,169.45,139.00,134.04,129.88,127.73,86.03,75.94,74.21,70.10,68.38,62.32,21.39,20.97,20.94,20.79,20.78。C21H26O9SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(HRMS)(ESI-TOF)計算值477.1190，實驗值477.1201。
化合物3：向2(32.6g，71.8mmol)於500mL無水甲醇(MeOH)中之溶液中添加催化量之甲醇鈉(NaOMe)且在環境溫度下攪拌3小時。反應物藉由添加Amberlite IR-120中和且過濾，將所得溶液濃縮至乾，得到呈白色固體狀之3(20.3g，99%)，其未經進一步純化即直接用於下一反應。1H NMR(MeOD,600MHz)δ 7.46(2H,d,J=7.8Hz),7.12(2H,d,J=7.8Hz),4.50(1H,d,J=9.6Hz),3.85(1H,d,J=12.6,1.8Hz),3.66(1H,dd,J=12.0,5.4Hz),3.36(1H,t,J=9.0Hz),3.24-3.28(2H,m),3.17(1H,t,J=9.0Hz),2.13(3H,s)。13C NMR(MeOD,150MHz)δ 138.90,133.66,131.33,130.67,89.79,82.16,79.81,73.82,71.50,63.03,21.24。C13H18O5SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值309.0767，實驗值309.0772。
化合物4：向3(11.1g，38.8mmol)於48mL無水吡啶中之溶液中添加三苯甲基氯(13.5g，46.6mmol)。反應物在60℃下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯：甲醇1：1：0.1)純化，得到呈白色粉末狀之4(12.3g，60%)。1H NMR(MeOD,600MHz)δ 7.56(2H,d,J=7.8Hz),7.47(6H,d,J=7.8Hz),7.27(6H,t,J=7.2Hz),7.22(3H,t,J=7.2Hz),7.05 (2H,d,J=8.4Hz),4.58(1H,d,J=9.6Hz),3.40-3.43(2H,m),3.31(1H,m),3.23-3.27(3H,m),2.27(3H,s)。13C NMR(MeOD,150MHz)δ 145.69,138.71,133.62,131.51,130.77,130.16,128.87,128.13,89.46,87.88,80.98,80.02,73.93,71.85,65.14,21.34。C32H32O5SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值551.1863，實驗值551.1876。
化合物5：在0℃下，向4(21.1g,39.9mmol)於200mL無水N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之溶液中添加氫化鈉(60%於礦物油中)(5.8g，143.6mmol)。反應物攪拌1小時，接著添加苯甲基溴(17.2mL，143.6mmol)，接著在氬氣下在環境溫度下攪拌16小時。反應物藉由甲醇淬滅且蒸發至乾。殘餘物用乙酸乙酯稀釋，溶液用H2O及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯9：1)純化，得到呈白色粉末狀之5(22.3g，70%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 7.60(2H,d,J=7.8Hz),7.50(6H,d,J=7.8Hz),7.42(2H,d,J=7.2Hz),7.34(2H,t,J=7.2Hz),7.24-7.32(12H,m),7.18-7.23(4H,m),7.14-7.17(2H,m),7.05(2H,d,J=7.8Hz),6.82(2H,d,J=7.8Hz),4.91(1H,d,J=10.8Hz),4.84(1H,d,J=10.8Hz),4.80(1H,d,J=10.8Hz),4.74(1H,d,J=10.2Hz),4.64(2H,dd,J=9.6,5.4Hz),4.30(1H,d,J=10.2Hz),3.74(1H,t,J=9.6Hz),3.64(1H,t,J=8.4Hz),3.60(1H,d,J=9.6Hz),3.55(1H,t,J=9.6Hz),3.42(1H,m),3.25(1H,dd,J=10.2,4.2Hz),2.30(3H,s)。13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 144.14,138.57,138.43,137.94,137.90,133.01,130.10,129.96,129.07,128.73,128.67,128.45,128.42,128.31,128.20,128.16,128.15,128.07,128.01,127.89,127.20,87.90,87.07,86.70,80.96,79.04,78.04,76.25,75.61,75.21,62.68,45.18,21.37。C53H50O5SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值821.3271，實驗值821.3310。
化合物6：在75℃下攪拌5(30.0g，37.5mmol)於1065mL乙酸水溶液(AcOH：H2O 4：1)中之溶液3小時。在溶劑移除後，殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯2：1)純化，得到呈白色固體狀之6(16.7g，80%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 7.37-7.41(4H,m),7.25-7.33(13H,m),7.10(2H,d,J=7.8Hz),4.91(1H,d,J=10.2Hz),4.89(1H,d,J=10.8Hz),4.84(1H,d,J=10.8Hz),4.83(1H,d,J=10.8Hz),4.74(1H,d,J=10.8Hz),4.62(1H,d,J=10.2Hz),3.83-3.86(1H,m),3.65-3.71(2H,m),3.54(1H,t,J=9.6Hz),3.44(1H,t,J=9.0Hz),3.33-3.36(1H,m),2.31(3H,s),1.87(1H,t,J=6.6Hz)。13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 138.51,138.24,138.14,138.02,132.85,129.99,129.63,128.71,128.66,128.63,128.40,128.22,128.16,128.09,127.98,127.94,87.99,86.75,81.27,79.43,77.81,76.01,75.69,75.30,62.34,21.31。C34H36O5SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值579.2176，實驗值579.2188。
化合物7：向6(5.0g，9.0mmol)於18mL無水吡啶中之溶液中添加乙酸酐(1.0mL)。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，溶液用H2O及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯5：1)純化，得到呈白色固體狀之7(5.3g，99%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 7.44(2H,d,J=7.8Hz),7.38(2H,d,J=7.8Hz),7.26-7.34(11H,m),7.22-7.24(2H,m),7.08(2H,d,J=7.8Hz),4.91(1H,d,J=10.2Hz),4.90(1H,d,J=11.4Hz),4.83(1H,d,J=10.8Hz),4.82(1H,d,J=10.8Hz),4.71(1H,d,J=10.2Hz),4.57(1H,d,J=9.6Hz),4.55(1H,d,J=10.8Hz),4.34(1H,d,J=12.0Hz),4.17-4.20(1H,m),3.67-3.70(1H,m),3.49-3.50(2H,m),3.45(1H,t,J=9.6Hz),2.32(3H,s),2.03(3H,s)。13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 170.90, 138.44,138.16,138.13,137.81,132.98,129.85,128.76,128.72,128.68,128.45,128.30,128.26,128.15,128.02,88.00,86.93,81.07,77.74,76.08,75.68,75.32,63.51,21.35,21.09。C36H38O6SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值621.2281，實驗值621.2301。
化合物8：向7(5.5g，9.2mmol)於129mL丙酮水溶液(丙酮：H2O 4：1)中之溶液中添加N-溴代丁二醯亞胺(1.7g，9.5mmol)。反應物在環境溫度下攪拌1小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、硫代硫酸鈉(NaS2O3)水溶液、鹽水萃取，接著經硫酸鎂乾燥。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯2：1)純化，得到呈白色固體狀之8(3.1g，69%，α/β=1：1)。1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 7.24-7.35(30H,m),5.18(1H,t,J=3.0Hz),4.96(1H,d,J=10.2Hz),4.94(2H,d,J=10.8Hz),4.86(1H,d,J=10.8Hz),4.85(1H,d,J=10.2Hz),4.84(1H,d,J=10.2Hz),4.80(1H,d,J=10.8Hz),4.76(2H,d,J=11.4Hz),4.71(1H,dd,J=7.2,5.4Hz),4.68(1H,d,J=12.0Hz),4.55(2H,d,J=10.8Hz),4.34(1H,dd,J=12.0,1.2Hz),4.23-4.28(2H,m),4.17(1H,dd,J=12.0,4.8Hz),4.06-4.09(1H,m),3.98(1H,t,J=9.6Hz),3.67(1H,t,J=8.4Hz),3.50-3.56(3H,m),3.48(1H,t,J=9.0Hz),3.37-3.40(2H,m),3.01(1H,d,J=3.0Hz),2.02(3H,s),2.01(3H,s)。13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 138.64,138.49,138.39,137.96,137.89,137.81,128.75,128.70,128.68,128.65,128.63,128.33,128.29,128.27,128.22,128.20,128.14,128.06,127.99,127.93,97.62,91.33,84.71,83.20,81.82,80.18,77.39,75.96,75.92,75.23,75.21,74.98,73.47,73.19,69.02,63.35,63.27,21.06。C29H32O7Na+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值515.2040，實驗值515.2052。
受體18之合成
Figure 104129739-A0202-12-0085-183
化合物13：在0℃下，向D-來蘇糖12(20g，133mmol)於200mL無水N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之溶液中添加2-甲氧基丙烯(15mL，160mmol)及樟腦-10-磺酸(CSA)(3g，13.3mmol)。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。溶液用三乙胺(Et3N)淬滅，蒸發至乾且藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯：甲醇1：1：0.2)直接純化，得到呈白色固體狀之13(21g，83%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 5.22(s,1H),4.78(dd,1H,J=6.0,3.6Hz),4.53(d,1H,J=6.0Hz),4.17(m,1H,J=6.6,4.8Hz),3.82(dd,1H,J=11.7,4.8Hz),3.71(dd,1H,J=11.7,6.6Hz),1.40(s,3H),1.29(s,3H)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 113.62,102.27,87.42,81.73,81.35,61.37,26.46,25.02。C8H14O5Na+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值213.0733，實驗值213.0751。
化合物14：向13(21g，110mmol)於140mL無水吡啶中之攪拌溶液中添加三苯甲基氯(37.8g，132mmol)。反應物在60℃下在氬氣下攪拌16小時。將溶液濃縮至乾，殘餘物用乙酸乙酯(AcOEt)溶解，用H2O、鹽水洗滌且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯1：2)純化，得到呈白色粉末狀之 14(36.5g，77%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 7.46(m,6H),7.27(m,6H),7.21(m,3H),5.36(d,1H,J=1.8Hz),4.73(dd,1H,J=6.0,4.8Hz),4.57(d,1H,J=6.0Hz),4.31(ddd,1H,J=4.8,4.8,7.8Hz),3.41(dd,1H,J=9.6,4.8Hz),3.37(dd,1H,J=9.6,7.8Hz),2.41(m,1H,J=1.8Hz),1.27(s,3H),1.25(s,3H)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 143.95,128.82,127.75,126.95,112.48,101.22,86.85,85.41,80.11,79.70,61.85,26.02,25.09。C27H28O5Na+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值455.1829，實驗值455.1833。
化合物15：在0℃下，向14(8.4g，19.4mmol)於40mL無水四氫呋喃(THF)中之攪拌溶液中添加雙(三甲基矽烷基)胺基鋰(LHMDS)(20mL於THF中之1M溶液，20mmol)，反應物在氬氣下攪拌1小時。在0℃下，向由1-溴十三烷(C13H27Br)及三苯基膦(PPh3)於甲苯中回流5天製備之維蒂希試劑(Wittig reagent)C13H27PPh3Br(20.1g，38.2mmol)於83mL無水THF中之攪拌溶液中添加LHMDS(40mL於THF中之1M溶液，40mmol)，反應物在氬氣下攪拌1小時以產生亮橙色偶極體。在0℃下，將14之溶液逐滴添加至偶極體，且使反應物升溫至環境溫度並在氬氣下攪拌9小時。所得溶液用甲醇淬滅且蒸發至乾。殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O及鹽水萃取，經硫酸鎂乾燥，接著濃縮。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯15：1)純化，得到呈無色油狀之15(8.7g，75%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 7.40-7.45(m,9H),7.25-7.30(m,9H),7.19-7.23(m,5H),5.49-5.57(m,3H,J=6.6Hz),4.90(t,1H,J=6.6Hz),4.43(t,1.5H,J=6.6Hz),4.25(dd,0.5H,J=6.6,4.6Hz),4.20(dd,1H,J=6.6,4.5Hz),3.74(m,1H),3.68(m,0.5H),3.22(dd,0.5H,J=9.6,5.0Hz),3.15(dd,1H,J=9.3,5.1Hz),3.10(m,1.5H),2.37(m,1.5H),1.90-2.00(m,2H),1.75(m,1H),1.47(m,5H),1.37(m,5H),1.19-1.33(m,35H),0.86(t,5H,J=7.1 Hz)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 144.07,137.58,135.56,128.90,128.02,127.24,125.41,125.15,108.58,108.50,86.90,86.84,79.14,77.86,77.74,73.21,69.51,69.43,65.19,64.84,32.45,32.13,29.89,29.86,29.81,29.71,29.69,29.57,29.50,29.47,29.11,27.80,27.59,27.55,25.26,22.91,14.35。C40H54O4Na+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值621.3914，實驗值621.3919。
化合物16：化合物16由15(1g，1.7mmol)於含有催化量氫氧化鈀/碳(20% Pd)之10mL無水甲醇中之催化氫化製備。懸浮液在H2環境中攪拌4小時。溶液經由Celite 545過濾以移除催化劑，蒸發至乾，接著藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯20：1)純化，得到呈白色固體狀之16(903mg，90%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 7.43(m,6H),7.27(m,6H),7.21(m,3H),4.12(dd,1H,J=6.4,3.7Hz),4.05(ddd,1H,J=9.9,6.4,3.6Hz),3.69(m,1H,J=6.0,6.0,5.8,3.7Hz),3.18(m,2H,J=9.5,9.5,6.0,5.8Hz),2.29(d,1H,J=6.0Hz),1.60-1.67(m,1H),1.45-1.49(m,1H),1.43(s,3H),1.34-1.38(m,1H),1.33(s,3H),1.20-1.30(m,23H),0.86(t,3H,J=7.2Hz)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 144.09,128.91,128.05,127.26,107.95,87.02,77.67,69.15,65.43,32.15,29.92,29.88,29.83,29.77,29.58,27.60,26.99,25.43,22.92,14.36。C40H56O4Na+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值623.4071，實驗值623.4112。
化合物17：在環境溫度下，向16(5g，8.3mmol)及4Å分子篩(1g)於39mL無水CH2Cl2中之溶液中添加2,6-二甲基吡啶(3.5mL，30mmol)。當將溶液冷卻至-45℃時，逐滴添加三氟甲磺酸酐(Tf2O)(2.67mL，15.9mmol)且在氬氣下攪拌反應物1小時。接著添加疊氮化四甲基胍(TMGA)(3.9g，25mmol)，將反應物升溫至環境溫度且在氬氣下攪拌16小時。所得溶液經由Celite 545過濾以移除4Å分子篩且殘餘 物用CH2Cl2稀釋、用H2O及鹽水萃取，經硫酸鎂乾燥，接著蒸發。混合物簡單地藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯20：1)純化以移除大部分雜質且直接用於下一步驟。
化合物18：在4℃下，向17於20mL無水CH2Cl2中之溶液中添加四氟乙酸/四氟乙酸酐(含TFA/TFAA 1.8M/1.8M之CH2Cl2)(14mL，24.9mmol)且在氬氣下攪拌15分鐘。反應物藉由添加10mL Et3N淬滅，接著倒入200mL甲醇(MeOH)中且再攪拌15分鐘。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、飽和NaHCO3溶液及鹽水萃取，接著經硫酸鎂乾燥。真空濃縮有機層且混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯10：1)純化，得到呈黃色油狀之18(2g，兩步63%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 4.16(ddd,1H,J=9.7,5.6,3.6Hz),3.97(dd,1H,J=11.6,4.2Hz),3.94(dd,1H,J=9.4,5.6Hz),3.85(dd,1H,J=11.6,5.4Hz),3.45(ddd,1H,J=9.4,5.4,4.2Hz),1.50-1.62(m,2H,J=9.7,3.6Hz),1.41(s,3H),1.31-1.37(m,6H),1.22-1.30(m,22H),0.86(t,3H,J=6.9,6.9Hz)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 108.66,77.96,76.91,64.18,61.39,32.14,29.90,29.87,29.81,29.80,29.75,29.60,29.58,28.25,26.74,25.77,22.91,14.34。C21H41N3O3H+[M+H]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值383.3148，實驗值356.3157(-N2)。
α-葡糖神經醯胺類似物24-26之合成
Figure 104129739-A0202-12-0089-184
化合物19：在-45℃下在氬氣下，向葡糖基供體8(2.9g，5.9mmol)、二甲基硫醚(590μL，7.8mmol)、4Å分子篩(500mg)及2-氯吡啶(1.8mL，19.5mmol)於無水CH2Cl2(15mL)中之溶液中添加三氟甲磺酸酐(1mL，6mmol)。反應物在-45℃下攪拌20分鐘，在0℃下攪拌20分鐘且再在環境溫度下攪拌20分鐘，接著添加含受體18(1.5g，3.9mmol)之5mL CH2Cl2。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。溶液經由Celite 545過濾以移除分子篩。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，溶液用H2O及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯10：1)純化，得到呈無色油狀之19(2g，60%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)δ 7.36(2H,d,J=7.8Hz),7.24-7.33(13H,m),4,97(1H,d,J=10.8Hz),4.86(1H,d,J=10.8Hz),4.85(1H,d,J=3.6Hz),4.78(1H,d,J=10.8Hz),4.72(1H,d,J=12.0Hz),4.68(1H,d,J=12.0Hz),4.54(1H,d,J=10.8Hz),4.21-4.26(2H,m),4.08-4.11(1H,m),4.02-4.07(2H,m),3.97(1H,dd,J=9.6,5.4Hz),3.84-3.87(1H,m),3.60 (1H,dd,J=10.8,7.2Hz),3.54(1H,dd,J=9.6,3.6Hz),3.44-3.48(2H,m),2.00(3H,s),1.57-1.61(1H,m),1.50-1.55(1H,m),1.37(3H,s),1.22-1.35(27H,m),0.86(3H,t,J=7.2Hz)。13C NMR(CDCl3,150MHz)δ 170.93,138.82,138.58,138.05,128.68,128.61,128.59,128.34,128.31,128.13,127.90,127.86,81.82,80.26,77.97,77.30,75.93,75.61,75.24,72.92,69.50,69.34,63.26,59.99,32.13,29.90,29.87,29.82,29.77,29.57,29.54,28.42,26.73,25.89,22.90,21.03,14.33。C50H71N3O9Na+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值880.5083，實驗值880.5124。
化合物20：向19(269mg，0.31mmol)於吡啶/H2O(10：1，12mL)中之溶液中添加三苯基膦(165mg，0.63mmol)。反應物在45℃下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發至乾。混合物無需預先純化即用於下一步驟。
化合物21：向化合物20於36mL無水CH2Cl2中之溶液中添加二十六烷酸(159mg，0.4mmol)、Et3N(88μL)、EDC(90mg，0.47mmol)及HBTu(178mg，0.47mmol)。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯4：1)純化，得到呈白色固體狀之21(293mg，78%，兩步)。
化合物22：向21(293mg，0.24mmol)於50mL共溶劑(甲醇：CH2Cl2 1：1)中之溶液中添加甲醇鈉(0.024mmol)且在氬氣下在環境溫度下攪拌6小時。反應物藉由Amberlite IR-120中和且過濾。在溶劑移除後，殘餘物無需預先純化即用於下一步驟。
化合物23：將水解化合物22溶解於50mL乙酸水溶液(AcOH：H2O 4：1)中且在60℃下攪拌16小時。在溶劑移除後，混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯：甲醇1：1：0.1)純化。
化合物24
Figure 104129739-A0202-12-0091-185
將二丙酮衍生物23溶解於含有氫氧化鈀/碳(20% Pd)(催化劑)之50mL共溶劑(甲醇：CHCl3 4：1)中且在H2環境中攪拌16小時。溶液經由Celite 545過濾以移除催化劑且蒸發至乾，混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(甲醇：CHCl3 1：9)純化且用LH20(甲醇：CHCl3 1：1)溶離，得到呈白色固體狀之24(72mg，三步35%)。1H NMR(MeOD-CDCl3 1：1,600MHz)δ：4.83(s,1H),4.15(d,J=4.2Hz,1H),3.84(dd,J=10.8,4.2Hz,1H),3.76(d,J=12.0Hz,1H),3.64-3.70(m,2H),3.60(t,J=9.6Hz,1H),3.51-3.57(m,3H),3.41(d,J=9.6Hz,1H),3.31(m,1H),2.17(t,J=7.2Hz,2H),1.50-1.65(m,4H),1.19-1.39(m,68H),0.85(t,J=6.6Hz,6H)。13C NMR(MeOD-CDCl3 1：1,150MHz)δ：175.29,100.06,75.05,74.58,73.03,72.75,72.62,71.01,67.78,62.22,51.11,37.07,32.93,32.62,30.49,30.45,30.40,30.35,30.25,30.13,30.05,30.04,26.61,26.58,23.34,14.47。C50H99NO9Na+[M+Na]+之高解析度質譜(MALDI-TOF)計算值880.7223，實驗值880.7212。
化合物25
Figure 104129739-A0202-12-0091-186
化合物25使用與化合物24類似的程序合成。1H NMR(MeOD-CDCl3 1：1,600MHz)δ：7.09(dd,J=8.4,5.4Hz,2H),6.90(t,J=9.0Hz,2H),4.82(d,J=3.6Hz,1H),4.14-4.18(m,1H),3.84(dd,J=10.2,4.8Hz,1H),3.76(dd,J=12.0,2.4Hz,1H),3.64-3.68(m,2H),3.60(t,J=9.0Hz,1H),3.51-3.56(m,3H),3.41(dd,J=9.6,3.6Hz,1H),3.31(m,1H),2.54(t,J=7.8Hz,2H),2.17(t,J=7.8Hz,2H),1.51-1.65(m,6H),1.20-1.39(m,36H),0.85(t,J=6.6Hz,3H)。13C NMR(MeOD-CDCl3 1：1,150MHz)δ：175.30,162.67,161.07,139.18,139.16,130.34,130.29,115.46,115.32,100.00,75.03,74.52,72.97,72.68,72.55,70.93,67.71,62.15,51.11,51.03,37.06,37.00,35.72,32.90,32.58,32.32,30.45,30.41,30.35,30.30,30.22,30.15,30.11,30.05,30.00,29.82,26.57,26.53,23.29,14.44。C41H72FNO9Na+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值764.5083，實驗值764.5066。
化合物26
Figure 104129739-A0202-12-0092-200
化合物26使用與化合物24類似的程序合成。1H NMR(MeOD-CDCl3 1：1,600MHz)δ：7.10(d,J=8.4Hz,2H),6.99(t,J=7.8Hz,2H),6.92(m,2H),6.84(d,J=7.8Hz,2H),4.83(d,J=3.0Hz,1H),3.85(dd,J=10.2,4.2Hz,1H),3.77(d,J=11.4Hz,1H),3.67(m,2H),3.61(t,J=9.6Hz,1H),3.55(m,3H),3.42(dd,J=9.0,3.0Hz,1H),3.33(m,1H),2.55(t,J=7.8Hz,2H),2.18(t,J=7.8Hz,2H),1.50-1.64(m,6H),1.20-1.40(m,36H),0.85(t,J=6.6Hz,3H)。13C NMR(MeOD-CDCl3 1：1,150MHz)δ：175.34,160.27,158.67,156.22,154.38, 138.73,130.34,120.76,120.71,119.10,116.87,116.72,100.15,75.10,74.66,73.15,72.85,72.65,71.09,67.80,62.26,51.21,37.09,35.90,32.95,32.68,32.44,30.55,30.51,30.47,30.40,30.35,30.28,30.26,30.17,30.11,30.00,26.67,26.63,23.38,14.47。C47H76FNO10Na+[M+H]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值834.5526，實驗值834.5538。
氟化供體38之合成
Figure 104129739-A0202-12-0093-188
化合物32：在0℃下，向1,2,3,4,6-五-O-乙醯基-β-D-葡萄哌喃糖1於無水CH2Cl2中之溶液中添加4-甲氧基苯酚及BF3OEt2，反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。所得溶液直接用飽和NaHCO3溶液及鹽水萃取，經硫酸鎂乾燥且蒸發。產物自乙酸乙酯-己烷溶液再結晶，得到呈白色固體狀之32。
化合物33：向32於無水甲醇中之溶液中添加催化量之甲醇鈉(NaOMe)且在環境溫度下攪拌3小時。反應物藉由添加Amberlite IR-120中和且過濾，將所得溶液濃縮至乾，得到呈白色固體狀之33，其未經進一步純化即直接用於下一反應。
化合物34：向33於無水共溶劑(DMF及CH3CN)中之溶液中添加苯甲醛二甲基縮醛及催化量之甲醇鈉(NaOMe)。反應物在環境溫度下攪拌16小時。溶液藉由添加Et3N中和且濃縮。將混合物溶解於乙酸乙酯中，用飽和NaHCO3溶液及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發。產物自 乙酸乙酯-己烷溶液再結晶，得到呈白色固體狀之34。
化合物35：在0℃下，向34於無水N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之溶液中添加氫化鈉(60%於礦物油中)。反應物攪拌1小時，接著添加苯甲基溴且反應物在氬氣下在環境溫度下攪拌16小時。溶液藉由甲醇淬滅且蒸發至乾。殘餘物用乙酸乙酯稀釋，溶液用H2O及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。產物自乙酸乙酯-己烷溶液再結晶，得到呈白色固體狀之35。
化合物36：在0℃下，向35於CH2Cl2中之溶液中添加三乙基矽烷及三氟乙酸(TFA)。反應物在環境溫度下攪拌3小時。溶液直接用H2O、飽和NaHCO3溶液及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。產物自乙酸乙酯-己烷溶液再結晶，得到呈白色固體狀之36。
化合物37：向36於CH2Cl2中之溶液中添加三氟化二乙基胺基硫(DAST)。反應物在45℃下攪拌16小時且溶液直接用H2O、飽和NaHCO3溶液及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化，得到呈無色油狀之化合物37。
化合物38：向37於無水共溶劑(甲苯、H2O及CH3CN)中之溶液中添加硝酸鈰銨(CAN)。反應物在環境溫度下攪拌10分鐘。溶液用乙酸乙酯萃取，用H2O、飽和NaHCO3溶液及H2O洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化，得到呈無色油狀之化合物38。
氟化類似物43之合成
Figure 104129739-A0202-12-0095-190
化合物39：在-45℃下在氬氣下，向供體38、二甲基硫醚、4Å分子篩及2-氯吡啶於無水CH2Cl2中之溶液中添加三氟甲磺酸酐。反應物在-45℃下攪拌20分鐘，在0℃下攪拌20分鐘且再在環境溫度下攪拌20分鐘，接著添加含受體18之CH2Cl2。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。溶液經由Celite 545過濾以移除分子篩。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，溶液用H2O及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化以得到39。
化合物40：向39於吡啶/H2O(10：1)中之溶液中添加三苯基膦。反應物在45℃下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發至乾。混合物無需預先純化即用於下一步驟。
化合物41：向化合物40於無水CH2Cl2中之溶液中添加4-(4-氟苯氧基)苯基十一酸、Et3N、EDC及HBTu。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱 (flash column)層析純化以得到41。
化合物42：向化合物41於乙酸水溶液(AcOH：H2O 4：1)中之溶液中且在60℃下攪拌16小時。在溶劑移除後，將混合物溶解於乙酸乙酯中，用飽和NaHCO3溶液及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發。殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化以得到42。
化合物43
Figure 104129739-A0202-12-0096-191
將二丙酮衍生物42溶解於含有氫氧化鈀/碳(20% Pd)(催化劑)之共溶劑(甲醇：CHCl3 4：1)中且在H2環境中攪拌16小時。溶液經由Celite 545過濾以移除催化劑且蒸發至乾，混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化且用LH20溶離以得到43。1H NMR(MeOD-CDCl3 1：1,600MHz)δ：7.09(1H,d,J=8.4Hz),6.96-6.99(2H,m),6.91-6.92(2H,m),6.82-6.84(2H,m),4.84(1H,t,J=3.6Hz),4.25(0.5H,t,J=9.0Hz),4.15-4.18(2H,m),3.82-3.85(2H,m),3.75-3.77(1H,m),3.69-3.72(1H,m),3.64-3.68(2H,m),3.50-3.54(2H,m),3.44(1H,dd,J=9.6,3.6Hz),2.54(2H,t,J=7.2Hz),2.17(2H,t,J=7.8Hz),1.50-1.64(7H,m),1.22-1.27(41H,m),0.84(3H,t,J=7.2Hz)。13C NMR(MeOD-CDCl3 1：1,150MHz)δ：175.28,160.20,158.61,156.16,154.30,138.67,130.28,120.70,120.64,119.04,116.81,116.66,99.94,90.61,89.41,75.04,72.72,72.59,72.56,72.42,72.37,70.82,70.66,67.82,61.21,51.10,37.05,35.83,32.91,32.61,32.36,30.46,30.43,30.39,30.33,30.27,30.19,30.18,30.09,30.03,29.92,26.63,26.55,23.32,14.41。C47H75F2NO9H+[M+H]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值 836.5498，實驗值836.5483。
氟化供體48之合成
Figure 104129739-A0202-12-0097-192
化合物44：向32於無水吡啶中之溶液中添加三苯甲基氯。反應物在60℃下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化以得到44。
化合物45：在0℃下，向44於N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之溶液中添加氫化鈉(60%於礦物油中)。反應物攪拌1小時，接著添加苯甲基溴且在氬氣下在環境溫度下攪拌16小時。反應物藉由甲醇淬滅且蒸發至乾。殘餘物用乙酸乙酯稀釋，溶液用H2O及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化以得到45。
化合物46：在75℃下攪拌45於乙酸水溶液(AcOH：H2O 4：1)中之溶液3小時。在溶劑移除後，混合物用乙酸乙酯稀釋，溶液用H2O及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化以得到46。
Figure 104129739-A0202-12-0098-193
化合物47：向46於CH2Cl2中之溶液中添加三氟化二乙基胺基硫(DAST)。反應物在45℃下攪拌16小時且溶液直接用H2O、飽和NaHCO3溶液及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化以得到化合物47。
化合物48：向47於無水共溶劑(甲苯、H2O及CH3CN)中之溶液中添加硝酸鈰銨(CAN)。反應物在環境溫度下攪拌10分鐘。溶液用乙酸乙酯萃取，用H2O、飽和NaHCO3溶液及H2O洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化，得到呈無色油狀之化合物48。
氟化類似物53之合成
化合物49：在-45℃下在氬氣下，向供體48、二甲基硫醚、4Å分子篩及2-氯吡啶於無水CH2Cl2中之溶液中添加三氟甲磺酸酐。反應物在-45℃下攪拌20分鐘，在0℃下攪拌20分鐘且再在環境溫度下攪拌20分鐘，接著添加含受體18之CH2Cl2。反應物在環境溫度下在氬氣下攪 拌16小時。溶液經由Celite 545過濾以移除分子篩。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，溶液用H2O及鹽水洗滌，經硫酸鎂乾燥且蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯10：1)純化以得到49。
化合物50：向49於吡啶/H2O(10：1)中之溶液中添加三苯基膦。反應物在45℃下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發至乾。混合物無需預先純化即用於下一步驟。
化合物51：向化合物50於無水CH2Cl2中之溶液中添加4-(4-氟苯氧基)苯基十一酸、Et3N、EDC及HBTu。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，混合物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發至乾。殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化以得到51。
化合物52：將化合物51溶解於乙酸水溶液(AcOH：H2O 4：1)中且在60℃下攪拌16小時。在溶劑移除後，混合物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發至乾。殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化。
化合物53
Figure 104129739-A0202-12-0099-201
將二丙酮衍生物52溶解於含有氫氧化鈀/碳(20% Pd)(催化劑)之共溶劑(甲醇：CHCl3 4：1)中且在H2環境中攪拌16小時。溶液經由Celite 545過濾以移除催化劑且蒸發至乾，混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析純化且用LH20溶離以得到53。1H NMR(MeOD-CDCl3 1：1,600MHz)δ：7.51(0.6H,d,J=8.4Hz),7.09-7.11(2H,m),6.97-7.00(2H,m),6.91-6.94(2H,m),6.83-6.85(2H,m),4.85(1H,d,J=3.6Hz),4.49-4.59(2H,m),4.15-4.18(1H,m),3.85(1H,dd,J=10.8,4.8Hz),3.61-3.71(3H,m),3.52-3.58(2H,m),3.43(1H,d,J=9.6,3.6Hz),3.36(1H,t,J=9.0Hz),2.55(2H,t,J=7.8Hz),2.18(2H,t,J=7.8Hz),1.51-1.64(6H,m),1.23-1.39(39H,m),0.85(3H,t,J=7.2Hz)。13C NMR(MeOD-CDCl3 1：1,150MHz)δ：175.06,174.98,159.99,158.40,155.94,154.09,154.08,138.48,130.09,120.52,120.46,118.85,116.63,116.47,100.02,83.18,82.04,74.72,74.31,72.44,72.38,71.78,71.67,69.58,69.54,50.88,50.79,36.88,36.83,35.64,32.64,32.42,32.17,30.29,30.24,30.20,30.14,30.08,30.01,29.99,29.91,29.85,29.74,26.42,26.38,23.13,14.26。C47H75F2NO9H+[M+H]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值836.5483，實驗值836.5498。
α-半乳糖苷基神經醯胺類似物之合成
Figure 104129739-A0202-12-0101-195
α-半乳糖苷基神經醯胺類似物之合成、試劑及條件如下。a，甲苯硫酚，BF3OEt2,CH2Cl2,0℃,16h。b，甲醇鈉，甲醇，rt,3h，兩步90%。c，三苯甲基氯，吡啶，60℃,16h,64%。d,BnBr,NaH,DMF,0℃,16h,75%。e,80% AcOH,70℃,3h,92%。f,Ac2O，吡啶，0℃,5h,99%。g,NBS,80%丙酮，rt,1h,70%。h,Tf2O,2-cl-pyr.,Me2S,CH2Cl2,-45℃,16h,60%。i,PPh3,pyr/H2O,50℃。j,EDC,HBTu,Et3N,CH2Cl2,rt.,16h,80%。k，甲醇鈉，甲醇/CH2Cl2,90%。l,80% AcOH,70℃,16h,50%。m,H2,Pd(OH)2，甲醇/CH2Cl2,70%。
化合物55：在0℃下，向1,2,3,4,6-五-O-乙醯基-β-D-吡喃半乳糖54(40g，102.5mmol)於200mL無水CH2Cl2中之溶液中添加對甲苯硫 醇(15.4g，123mmol)及BF3OEt2(15.4mL，123mmol)，反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。所得溶液直接用飽和NaHCO3溶液、鹽水萃取，經硫酸鎂乾燥且蒸發。接著在乙酸乙酯-己烷溶液中再結晶，以得到呈白色固體狀之55。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 7.39(d,2H,J=8.0Hz),7.10(d,2H,J=8.0Hz),5.38(d,1H,J=3.3Hz),5.19(t,1H,J=10.0,10.0Hz),5.11(dd,1H,J=10.0,3.3Hz),4.62(d,1H,J=10.0Hz),4.16(dd,1H,J=11.3,6.6Hz),4.09(dd,1H,J=11.3,6.6Hz),3.88(t,1H,J=6.6,6.6Hz),2.32(s,3H),2.09(s,3H),2.08(s,3H),2.02(s,3H),1.95(s,3H)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 170.62,170.45,170.32,169.68,138.70,133.36,129.86,128.83,87.20,74.55,72.24,67.48,67.41,61.79,21.38,21.09,20.90,20.86,20.82。C21H26O9SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值477.1190，實驗值477.1236。
化合物56：向55於500mL無水甲醇中之溶液中添加催化量之甲醇鈉(NaOMe)且在環境溫度下攪拌3小時。反應物藉由添加Amberlite IR-120中和且過濾，將所得溶液濃縮至乾，得到呈白色固體狀之56(26.3g，兩步90%)，其未經進一步純化即直接用於下一反應。1H NMR(MeOD,600MHz)：δ 7.45(d,2H,J=8.1Hz),7.12(d,2H,J=8.1Hz),4.50(d,1H,J=9.6Hz),3.89(d,1H,J=3.3Hz),3.75(dd,1H,J=11.4,6.0Hz),3.70(dd,1H,J=11.4,6.0Hz),3.57(t,1H,J=9.6Hz),3.53(t,1H,J=6.0Hz),3.48(dd,1H,J=9.6,3.3Hz),2.31(s,3H)。13C NMR(MeOD,150MHz)：δ 138.55,133.03,132.26,130.67,90.83,80.72,76.49,71.15,70.55,62.73,21.22。C13H18O5SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值309.0767，實驗值309.0748。
化合物57：向56(26.3g，91.9mmole)於113mL無水吡啶中之溶液中添加三苯甲基氯(32g，116mmol)。反應物在60℃下在氬氣下攪 拌16小時，在溶劑移除後，混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯：甲醇1：1：0.1)純化，得到呈白色粉末狀之57(31.1g，64%)。1H NMR(MeOD,600MHz)：δ 7.53(d,2H,J=7.5Hz),7.45(m,6H),7.27(m,6H),7.22(m,6H),7.04(d,2H,J=7.5Hz),4.57(d,1H,J=9.5Hz),3.69(d,1H,J=3.3Hz),3.53-3.59(m,3H,J=9.5,8.4,1.2Hz),3.42(dd,1H,J=9.5,3.3Hz),3.12(dd,1H,J=8.4,1.2Hz),2.26(s,3H)。13C NMR(MeOD,150MHz)：δ 145.62,138.26,132.69,132.62,130.78,130.10,128.92,128.18,90.62,88.14,79.78,76.43,71.38,71.30,65.81,21.29。C32H32O5SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值551.1863，實驗值551.1840。
化合物58：在4℃下，向57(31.1g，58.7mmol)於300mL無水N,N-二甲基甲醯胺(DMF)中之溶液中添加氫化鈉(60%於礦物油中)(8.5g，211.3mmol)。反應物攪拌1小時，接著添加苯甲基溴(25.3mL，211.3mmol)，隨後在氬氣下在環境溫度下攪拌16小時。反應物藉由甲醇淬滅且蒸發至乾。殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O及鹽水萃取，接著經硫酸鎂乾燥。在溶劑移除後，混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯10：1)純化，以得到呈白色粉末狀之58(35g，75%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 7.42(d,2H,J=7.8Hz),7.37(d,8H,J=7.8Hz),7.18-7.34(m,20H,J=7.8Hz),7.11(m,2H),6.92(d,2H,J=7.8Hz),4.83(d,1H,J=11.4Hz),4.71-4.76(m,2H),4.66-4.70(m,2H),4.51(d,1H,J=9.6Hz),4.48(d,1H,J=11.4Hz),3.88(d,1H,J=2.4Hz),3.83(t,1H,J=9.6Hz),3.54(dd,1H,J=9.6,6.3Hz),3.51(dd,1H,J=9.6,2.4Hz),3.30(t,1H,J=6.3Hz),3.21(dd,1H,J=9.6,6.3Hz),2.25(s,3H)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 144.07,138.89,138.58,138.56,137.14,131.92,130.65,129.73,128.83,128.61,128.57,128.53,128.22,128.04,127.91,127.89, 127.82,127.43,127.23,88.13,87.13,84.38,77.71,77.50,75.79,74.32,74.15,73.07,63.00,21.29。C53H50O5SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值821.3271，實驗值821.3228。
化合物59：在75℃下，攪拌58(31.5g，39.4mmol)於1000mL乙酸水溶液(AcOH：H2O 4：1)中之溶液2小時。在溶劑移除後，殘餘物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯2：1)純化，得到呈無色油狀之59(20.2g，92%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 7.43(d,2H,J=7.8Hz),7.38(d,2H,J=7.2Hz),7.26-7.35(m,13H),7.02(d,2H,J=7.8Hz),4.95(d,1H,J=12.0Hz),4.82(d,1H,J=12.0Hz),4.75(d,1H,J=12.0Hz),4.74(d,1H,J=9.6Hz),4.72(d,1H,J=12.0Hz),4.62(d,1H,J=12.0Hz),4.57(d,1H,J=12.0Hz),3.90(t,1H,J=9.6Hz),3.82(d,1H,J=3.0Hz),3.81(dd,1H,J=11.1,6.6Hz),3.58(dd,1H,J=9.6,3.0Hz),3.50(dd,1H,J=11.1,6.6Hz),3.40(t,1H,J=6.6Hz),2.87(s,3H)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 138.53,138.49,138.35,137.63,132.43,130.20,129.85,128.72,128.61,128.57,128.55,128.43,128.04,128.02,127.99,127.86,88.24,84.49,78.94,77.74,75.89,74.33,73.45,73.26,62.50,21.32。C34H36O5SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值579.2176，實驗值579.2193。
化合物60：向59(3.1g，5.6mmol)於10mL無水吡啶中之溶液中添加乙酸酐(0.7mL，6.7mmol)。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取，接著經硫酸鎂乾燥。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯5：1)純化，得到呈白色固體狀之60(3.3g，99%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)：δ 7.45(d,2H,J=8.0Hz),7.37(d,2H,J=7.0Hz),7.26-7.35(m,13H),7.00(d,2H,J=8.0Hz),4.96(d,1H,J=11.0Hz),4.81(d,1H,J=11.0Hz),4.75(d,1H,J=11.0Hz),4.74(d,1H,J =9.3Hz),4.72(d,1H,J=11.0Hz),4.61(d,1H,J=11.0Hz),4.54(d,1H,J=11.0Hz),4.24(dd,1H,J=11.2,6.5Hz),4.09(dd,1H,J=11.2,6.5Hz),3.89(t,1H,J=9.3Hz),3.81(d,1H,J=2.5Hz),3.57(dd,1H,J=9.3,2.5Hz),3.55(t,1H,J=6.5Hz),2.28(s,3H),1.97(s,3H)。13C NMR(CDCl3,150MHz)：δ 170.84,138.46,138.33,137.60,132.57,130.31,129.73,128.70,128.57,128.46,128.33,128.00,127.89,127.80,88.32,84.40,77.55,76.14,75.90,74.43,73.47,73.32,63.63,21.32,21.05。C36H38O6SNa+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值621.2281，實驗值621.2322。
化合物61：向60(102mg，0.17mmol)於2mL丙酮水溶液(丙酮：H2O 4：1)中之溶液中添加N-溴代丁二醯亞胺(30mg，0.17mmol)。反應物在環境溫度下攪拌1小時。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、硫代硫酸鈉(NaS2O3)水溶液、鹽水萃取，接著經硫酸鎂乾燥。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯2：1)純化，得到呈白色固體狀之61(64mg，76%)。
化合物62：在-45℃下在氬氣下，向半乳糖苷供體61(5.8g，11.8mmol)、二甲基硫醚(1.1mL，15.6mmol)、4Å分子篩(1g)及2-氯吡啶(3.6mL，39mmol)於無水CH2Cl2(30mL)中之溶液中添加三氟甲磺酸酐(2mL，11.9mmol)。反應物在-45℃下攪拌20分鐘，在0℃下攪拌20分鐘且再在環境溫度下攪拌20分鐘，接著添加含半乳糖苷受體18之10mL CH2Cl2。反應物在環境溫度下在氬氣下攪拌16小時。溶液經由Celite 545過濾以移除分子篩。在溶劑移除後，殘餘物用乙酸乙酯稀釋，用H2O、鹽水萃取且經硫酸鎂乾燥，接著蒸發至乾。混合物藉由矽膠加壓管柱(flash column)層析(己烷：乙酸乙酯15：1)純化，得到呈無色油狀之62(4g，60%)。1H NMR(CDCl3,600MHz)δ：7.37-7.24(m,15H),4.95(d,J=11.5Hz,1H),4.91(d,J=3.6Hz,1H),4.86(d,J= 11.5Hz,1H),4.77(d,J=11.5Hz,1H),4.71(d,J=11.5Hz,1H),4.67(d,J=11.5Hz,1H),4.59(d,J=11.5Hz,1H),4.11(dd,J=10.7Hz,7.6Hz,1H),4.08(m,J=4.4Hz,1H),4.05(dd,J=10.1Hz,3.6Hz,1H),4.02(dd,J=10.7Hz,3.5Hz,1H),4.01(dd,J=10.5Hz,2.4Hz,1H),4.00(dd,J=9.2Hz,4.4Hz,1H),3.95(dd,J=10.1Hz,2.7Hz,1H),3.92(dd,J=7.6Hz,3.5Hz,1H),3.83(d,J=2.7Hz,1H),3.69(dd,J=10.5Hz,6.6Hz,1H),3.40(ddd,J=9.2Hz,6.6Hz,2.4Hz,1H),1.95(s,3H),1.60(s,3H),1.50(m,2H),1.35(s,3H),1.34-1.20(m,32H),0.85(t,J=6.8Hz,3H)。13C NMR(CDCl3,150MHz)δ：170.79,138.95,138.37,128.67,128.58,128.55,128.47,128.00,127.83,127.80,127.74,127.70,108.39,98.96,78.77,77.93,76.71,75.46,75.02,74.73,73.83,73.15,69.83,69.13,63.91,59.93,32.13,29.90,29.87,29.83,29.81,29.77,29.57,29.52,28.40,26.73,25.91,22.90,21.03,14.34。C50H71FN3O9Na+[M+Na]+之高解析度質譜(ESI-TOF)計算值880.5083，實驗值880.5050。
化合物K691： 1H NMR(MeOD-CDCl3 1：1,600MHz)：δ 7.26(t,2H,J=8.4Hz),7.09(d,2H,J=8.4Hz),7.02(t,1H,J=7.2Hz),6.92(d,2H,J=8.4Hz),6.86(d,2H,J=8.4Hz),4.85(d,1H,J=3.6Hz),4.16(dd,1H,J=9.6,4.8Hz),3.88(d,1H,J=3.0Hz),3.84(dd,1H,J=10.8,4.2Hz),3.74-3.78(m,2H),3.63-3.73(m,4H),3.48-3.54(m,2H),2.54(t,2H,J=7.8Hz),2.17(t,2H,J=7.8Hz),1.49-1.64(m,6H),1.19-1.35(m,39H).0.83(t,3H,J=7.2Hz)。13C NMR(MeOD-CDCl3 1：1,150MHz)：δ 175.53,158.77,155.96,138.90,130.48,130.42,123.71,119.74,119.18,100.77,75.32,72.74,72.06,71.22,70.70,69.91,68.09,62.59,51.48,37.19,36.04,32.99,32.81,32.57,30.63,30.57,30.52,30.47,30.40,30.37,30.30,30.23,30.12,26.82,26.76,23.50, 14.52。C47H77NO10H+[M+H]+之高解析度質譜(MALDI-TOF)計算值816.5620，實驗值816.5621。
化合物K705： 1H NMR(MeOD-CDCl3 1：1,600MHz)：δ 7.55(d,1H,J=9.0Hz),7.12(t,2H,J=8.4Hz),7.08(dd,1H,J=19.2,9.0Hz),6.87(d,2H,J=8.4Hz),6.75-6.78(m,1H),6.67-6.68(m,1H),4.86(d,1H,J=3.6Hz),4.14-4.18(m,1H),3.88(d,1H,J=3.0Hz),3.84(dd,1H,J=10.8,4.2Hz),3.74-3.79(m,2H),3.64-3.74(m,4H),3.48-3.54(m,2H),2.55(t,2H,J=7.2Hz),2.17(t,2H,J=7.8Hz),1.49-1.64(m,6H),1.19-1.38(m,38H).0.83(t,3H,J=6.6Hz)。13C NMR(MeOD-CDCl3 1：1,150MHz)：δ 175.40,155.21,155.07,155.05,154.99,152.17,152.08,150.53,150.44,147.91,147.82,146.30,146.22,139.64,130.55,119.83,118.26,118.13,114.55,114.52,114.51,114.49,108.40,108.27,100.63,75.27,72.65,71.87,71.10,70.57,69.78,67.99,62.49,51.34,37.12,35.94,32.98,32.69,32.40,30.53,30.51,30.47,30.40,30.35,30.28,30.25,30.18,30.11,30.00,26.69,26.64,23.39,14.47。C47H75F2NO10H+[M+H]+之高解析度質譜(MALDI-TOF)計算值852.5432，實驗值852.5443。
化合物K706： 1H NMR(MeOD-CDCl3 1：1,600MHz)：δ 7.08(d,2H,J=8.4Hz),6.99-7.03(m,1H),6.93-6.97(m,1H),6.79-6.85(m,3H),4.86(d,1H,J=4.2Hz),4.17(dd,1H,J=10.2,4.2Hz),3.88(d,1H,J=3.6Hz),3.85(dd,1H,J=10.8,4.8Hz),3.75-3.79(m,2H),3.64-3.74(m,4H),3.49-3.55(m,2H),2.53(t,2H,J=7.8Hz),2.17(t,2H,J=7.2Hz),1.50-1.65(m,6H),1.20-1.38(m,38H).0.84(t,3H,J=7.2Hz)。13C NMR(MeOD-CDCl3 1：1,150MHz)：δ 175.36,160.26,160.19,158.64,158.57,156.27,155.90,155.82,154.24,154.16,141.26,141.24,141.18,141.16,138.59,130.27,123.22,123.15,117.51,112.03, 112.01,111.88,111.86,106.07,105.92,105.89,105.74,100.57,75.27,72.63,71.78,71.05,70.52,69.73,67.97,62.48,51.28,37.09,35.81,33.01,32.64,32.38,30.49,30.47,30.42,30.36,30.31,30.24,30.21,30.13,30.07,29.95,26.65,26.59,23.36,14.46。C47H75F2NO10H+[M+H]+之高解析度質譜(MALDI-TOF)計算值852.5432，實驗值852.5446。
生物學研究 醣脂類似物注射於小鼠中
將全部醣脂以1-2mg/ml的濃度溶解於100% DMSO中。對於活體內實驗，在100μl稀釋的醣脂或100μl 1% DMSO臨注射於小鼠中之前，將全部化合物稀釋於生理鹽水中達到10μg/ml。自國家實驗室動物中心(National Laboratory Animal Center,Taipei,Taiwan)獲得6-12週齡之無病原體C57BL/6雌性小鼠。Jα18基因剔除(KO)B6小鼠為Dr.Masaru Taniguchi(RIKEN Research Center for Allergy and Immunology,Yokohama,Japan)之饋贈。全部小鼠維持在中央研究院細胞與個體生物學研究所(Institute of Cellular and Organismic Biology,Academia Sinica,Taipei,Taiwan)之無病原體飼養室中。
鼠類細胞激素/趨化激素分泌之測定
B6野生型或Jα18 KO小鼠以每隻小鼠0.1或1μg靜脈內注射媒劑或醣脂。在注射後2及18小時收集血清用於藉由Beadlyte® Mouse Cytokine套組(Millipore,NY)量測細胞激素/趨化激素且藉由Luminex® 200TM系統(Luminex,Austin,TX)讀取。
在特定醣脂刺激後小鼠免疫細胞之螢光流式細胞分選儀分析
用特定醣脂(每隻小鼠1μg)或媒劑(含1% DMSO之PBS)處理之B6野生型或Jα18 KO小鼠在注射後72小時處死且收集其脾。在按壓脾穿過70μm濾網且紅血球溶解之後，將有核細胞再懸浮於含有疊氮化物 (0.05%)之PBS緩衝液中且在4℃下用識別指定細胞表面抗原之抗體染色30分鐘。在洗滌後，對脾細胞進行螢光流式細胞分選儀分析。抗CD3、CD4、CD8α、CD11c、CD80及CD86之抗體自BD Bioscience-Pharmingen獲得。
mCD1d與醣脂之間二元複合物的結合強度
塗佈於ELISA盤上之不同濃度的mCD1ddi-醣脂複合物用飽和量之與生物素結合之L363抗體(BioLegend)培育，後為抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測及ELISA量測。L363抗體與指定mCD1ddi-醣脂複合物之間的KD由使用GraphPad Prism軟體之L363抗體結合曲線之史卡查變換的線性回歸計算得到。發現L363以類似結合強度識別mCD1ddi-7DW8-5-Glc複合物及mCD1ddi-7DW8-5複合物。接著，二元複合物之KD測定如下。不同濃度之醣脂與固定量之mCD1d二聚體一起在37℃下培育隔夜，且接著在4℃下將mCD1ddi-醣脂複合物塗佈在96孔ELISA盤上隔夜。在室溫(RT)下用BSA洗滌及阻斷1小時後，在室溫下添加與生物素結合之L363抗體30分鐘，接著與抗生蛋白鏈菌素-HRP一起在室溫下培育30分鐘且用ELSIA讀取器偵測。由L363抗體結合曲線之史卡查變換的線性回歸計算得到二元複合物之KD值。
人類iNKT細胞之擴增
人類初始Vα24+ iNKT細胞在第2天與在100ng/ml指定醣脂或DMSO下脈衝之自體不成熟CD14+ DC一起培養18小時。在第3天，將懸浮細胞轉移至新培養皿，在50U/ml IL-2(R & D Systems)存在下培養且每3天補充新鮮培養基。在第9天藉由流動式細胞測量術測定Vα24+/Vβ11+細胞之百分比。在擴增後之總細胞數為在Guava ViaCount試劑(Millipore,USA)下計算得到且藉由具有含有ViaCount模組之CytoSoftTM軟體的Guava系統(Millipore,USA)偵測。
各種負載CD1d之醣脂與Vα14+ iNKT細胞的結合親合力
簡言之，鼠類CD1d：Ig二聚體(BD Biosciences PharMingen,San Diego,CA)在37℃下以1：10之莫耳比負載有醣脂或媒劑隔夜。鼠類1.2Vα14+ iNKT細胞與各種劑量之二聚體-醣脂複合物一起在含有疊氮化物(0.05%)之緩衝液中在4℃下培育30分鐘。此等細胞接著在4℃下用抗小鼠IgG1-PE mAb(A85-1)再染色30分鐘，接著洗滌，用4%多聚甲醛(PFA)固定且藉由流動式細胞測量術偵測所結合之mCD1d二聚體複合物。史卡查變換之結合曲線及線性擬合藉由Graphpad Prism軟體標繪。
負載CD1d之醣脂與Vα24+ iNKT細胞之結合親合力
如先前所述測定人類CD1d-醣脂複合物與藉由7DW8-5在100ng/ml下擴增之Vα24+ iNKT細胞的結合親合力。19
人類Vα24+ iNKT細胞株及源於不成熟單核細胞之樹突狀細胞的分離及生成
如先前所述自末梢血液細胞分離Vα24+ iNKT細胞及CD14+細胞。19不成熟DC由CD14+細胞在300U/ml GM-CSF(R & D Systems)及100U/ml IL-4(R& D Systems)存在下培育2天後產生。
在7DW8-5或C1下擴增之Vα24+ iNKT細胞株產生如下。在用2,000 rad照射後，不成熟DC與同系Vα24+ iNKT細胞一起在100ng/ml 7DW8-5或C1存在下共培養1天。在脂質移除後，細胞在50U/ml IL-2存在下擴增10-14天。重複相同程序一次以進一步刺激及擴增iNKT細胞。顯示7DW8-5或C1擴增之iNKT細胞株表現Vα24 T細胞抗原受體(>95%純度)。
mCD1d相較於hCD1d調換分析
鼠類DN3A4-1.2 Vα14+ iNKT融合瘤細胞或C1-擴增之Vα24+ iNKT細胞用由mCD1d(A20-CD1d細胞)或hCD1d(HeLa-CD1d細胞)呈現之指定醣脂抗原在1、0.1及0.01μg/ml下脈衝。在18小時後，收集清液 層用於量測細胞激素分泌。藉由ELISA分析測定由Vα14+ iNKT細胞釋放之IL-2。使用Beadlyte® Human Cytokine套組(Millipore,NY,USA)及Luminex® 200TM閱讀系統偵測由Vα24+ iNKT細胞分泌之IFN-γ、IL-4及IL-2。
電腦模型化及模擬
呈現α-GalCer至其相應iNKT TCR之人類及小鼠CD1d(hCD1d及mCD1d)的晶體結構擷取自RCSB蛋白質資料庫(www.rcsb.org；編碼3HUJ、3QUX、3QUY、3QUZ及3HE6之PDB)。此等晶體結構藉由參考3QUX之主鏈原子而疊置。自3HE6及3HUJ獲得之兩種α-GalCer三元結構用於形成由不同GSL組成之其他三元複合物。含有C34之三元結構藉由修飾Meastro(Schrödinger LLC,USA)上之醯基鏈而衍生自含有C1之三元結構。攜帶C1-Glc及C34-Glc之三元結構藉由分別倒轉C1及C34之O4對掌性而形成。剩餘新三元複合物之模型化分別使用此等GSL及小鼠及人類之3QUX及3HUJ的CD1d-iNKT TCR結構構建。所有結構使用Protein Preparation wizard(Schrödinger LLC,USA)處理且脂質尾部使用MacroModel之構形搜尋及使用預設方法及在溶劑水中之OPLS2005力場之能量最小化進一步優化以使空間碰撞減至最少。GSL與iNKT TCR之結合模式藉由Autodock4.2使用半經驗自由能力場重新計算以評估在模擬期間之構形。在溶劑中所估計之結合自由能藉由Autodock4.2中構建之等式計算：△G=△VL(結合-未結合)+△VP(結合-未結合)+△VPL(結合-未結合+△Sconf)
其中L係指「配位體」；P係指「蛋白質」；V係指成對能量項目，包括對分散/排斥、氫鍵結及靜電之評估；△Sconf為在結合後損失之構形熵的估計值。運行Autodock4所需的所有輸入文件在MGLTools上準備。生成60×60×60Å3之網格及各種原子型能量圖。在各分子對接運 行中，所有羥基設定成自由旋光性且兩個脂質尾部經指派至其先前優化之位姿。採用拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm)(最大數目5.0×107次能量評估及27,000代以及突變率0.02，交叉率0.8)進行搜尋。在MGLTools中觀測結果且藉由在函數中構建獲得氫鍵結對個體殘基之貢獻。圖示在Maestro上完成。
實例：功效之論證
為比較C1、C34、K691、K705及K706激活人類iNKT細胞之能力，藉由磁性珠粒自PBMC分離人類Vα24限制之NKT細胞且與重組人類IL-2(50μg/mL)一起培育。兩天後，iNKT細胞與負載有不同醣脂(1g/mL)之源於自體單核細胞之DC一起在96孔中共培養三天，該等醣脂包括C1、C34、K691、K705及K706。收集清液層以藉由Luminex分析測定細胞激素/趨化激素。如圖13A中所示，展示不同醣脂之IFN-γ及IL-4分泌含量。C34、K691及K706之IFN-γ/IL-4比率與C1相比顯著較高(圖13B)，表明C34、K691及K706與C1相比在人類免疫系統中更偏向TH1，且K706甚至與C34相比更加如此。另外，所有醣脂在一些含量下誘導GM-CSF分泌，證實此等醣脂可促進骨髓細胞之激活。此等醣脂亦誘導IL-10及IL-13之產生。綜合而言，K706以最高IFN-g/IL-4比率及與C1及C34可比之IFN-g、GM-CSF、IL-10及IL-13誘導細胞激素，證實K706可與C1及C34相比更加有效地誘導人類iNKT細胞之偏向TH1之免疫反應。(使用單因子變異數分析進行統計學評估。*與C1相比P<0.05。#，使用學生T檢驗與C34相比P=0.002)。
Glc頭部為免疫調節劑之鞘醣脂(GSL)
先前，每隻小鼠0.1μg 7DW8-5足夠用於免疫刺激，19但葡萄糖類似物7DW8-5-Glc誘導免疫反應需要較高劑量(每隻小鼠1μg)(圖6)。因此，在每隻小鼠靜脈內注射1μg醣脂後2及18小時，在B6小鼠中測試新合成醣脂之生物活性。如圖2及圖7中所示，甘露糖類似物 7DW8-5-Man未能誘導任何細胞激素/趨化激素。與具有αGlc之GSL相比，具有αGal之GSL誘導較高含量之細胞激素及趨化激素，包括IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、GM-CSF、TNFα及IP-10。注意到具有不同醣基之αGalCer及C34類似物的類似趨勢(圖2A、2B及圖7)。
雖然C1-Glc及C34-Glc觸發細胞激素及趨化激素，但7DW8-5-Glc誘導極低含量之Th1及Th2細胞激素，但相對高含量之KC、MCP-1、IP-10及MIG趨化激素。為探測除iNKT細胞外之其他免疫細胞可藉由7DW8-5-Glc促成趨化激素誘導之可能性，不具有iNKT細胞之Jα18 KO小鼠以每隻小鼠1μg注射7DW8-5-Glc或7DW8-5。25在注射後2及18小時收集之小鼠血清未展示由7DW8-5或7DW8-5-Glc誘導細胞激素(圖2A、2B及圖7)。出人意料的是，7DW8-5-Glc而非7DW8-5觸發Jα18 KO小鼠之數個趨化激素的分泌，包括KC、MCP-1、IP-10及MIG。此等發現表明Jα18 KO小鼠中除iNKT細胞以外之免疫細胞一定對用7DW8-5-Glc處理之野生型小鼠及Jα18 KO小鼠的趨化激素產生具有貢獻。
接著，吾等分析在醣脂刺激後3天野生型小鼠之免疫細胞的擴增/激活。經具有αGal頭部之GSL處理之小鼠中總T細胞、CD4+ T及CD8+ T細胞的數目高於經具有αGlc之GSL處理之小鼠(圖2C、8E及8F)。此符合具有αGal之GSL與具有αGlc之GSL相比在小鼠中誘導更多細胞激素/趨化激素的觀察結果(圖2A、2B及7)。在具有αGlc之GSL當中免疫刺激活性的進一步比較揭示C1-Glc及C34-Glc與7DW8-5-Glc相比更好地誘導細胞激素/趨化激素(圖2A、2B及7)及擴增/激活DC(圖8B-8D)。C34-Glc與7DW8-5-Glc相比激活約2倍多的CD80+或CD86+ DC(圖8C及8D)，但其誘導類似數目之總脾細胞及DC(圖8A及8B)。與7DW8-5-Glc相比，C1-Glc不僅擴增約1.3倍多的脾細胞及DC(圖8A及8B)，而且激活約3.5倍多的CD80+ DC以及約3倍多的CD86+ DC(圖8C 及8D)。增加的DC擴增/激活可有助於活體內由C1-Glc及C34-Glc觸發與7DW8-5-Glc相比之較強免疫原性。相比之下，7DW8-5-Man未擴增任何類型之免疫細胞(圖2C及8)，與缺乏細胞激素/趨化激素之誘導相符(圖2A、2B及7)。
出乎意料地，吾等亦觀測到7DW8-5-Glc在Jα18 KO小鼠中誘導趨化激素(圖7)。在靜脈內注射7DW8-5-Glc或7DW8-5後3天Jα18 KO小鼠脾細胞的螢光流式細胞分選儀分析揭示源於CD11chi單核細胞之DC顯著擴增且由7DW8-5-Glc而非7DW8-5激活(圖9B-9D)。在用7DW8-5或7DW8-5-Glc刺激後，注意到總脾細胞、CD4+ T及CD8+ T細胞無顯著差異(圖9A、9E及9F)。此等發現指示單核細胞可負責在用7DW8-5-Glc處理之Jα18 KO小鼠中誘導趨化激素，諸如KC、MCP-1、IP-10及MIG。
如上所述，與具有αGlc之醣脂類似物相比，具有αGal之醣脂類似物為小鼠中較強的免疫調節劑，尤其用於7DW8-5與7DW8-5-Glc之間的比較。為研究類似趨勢是否亦適用於人類iNKT細胞，使自末梢血液分離之Vα24+ iNKT細胞在第2天與用100ng/ml指示醣脂脈衝之不成熟DC一起培育。在第3天移除抗原後，在IL-2存在下培養人類iNKT細胞。在第9天使用Guava ViaCount試劑計數擴增iNKT細胞之數目。出人意料的是，7DW8-5-Glc與7DW8-5相比顯著(p=0.0009)更好地活體外擴增人類iNKT細胞(圖2D)。綜合而言，此等發現表明具有αGal之GSL的生物活性與具有αGlc之GSL相比在小鼠中更有效，但在人類中不太有效。
mCD1d與醣脂之間的二元相互作用
為理解7DW8-5及7DW8-5-Glc之免疫調節活性的差異基礎，吾等使用可結合至與醣脂複合之mCD1d的L363 mAb量測mCD1d與特定醣脂之間的二元相互作用的結合強度。26各種濃度之在固定比率下的 mCD1ddi-醣脂複合物與飽和量之L363-生物素抗體一起培育，接著進行抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測及ELISA量測(圖10A)。使用GraphPad Prism軟體由標繪圖(圖10A)之史卡查變換的線性回歸計算得到L363與指定mCD1ddi-醣脂複合物之間的解離常數(KD)。發現L363以與mCD1ddi-7DW8-5複合物類似的結合強度識別mCD1ddi-7DW8-5-Glc複合物(圖10B)。接著，吾等藉由培育不同濃度之醣脂與固定量的mCD1d二聚體及L363-生物素抗體，接著進行抗生蛋白鏈菌素-HRP偵測及ELISA量測來測定二元複合物之KD(圖10C)。由L363偵測讀數繪製之結合曲線的史卡查變換計算得到KD(圖10D)。不出意料的是，具有與7DW8-5相同脂質尾部之7DW8-5-Glc以類似強度結合至mCD1d二聚體，但其結合親合力比αGalCer大約20倍。此指示二元相互作用之強度可能不造成7DW8-5與7DW8-5-Glc之間的差異性免疫激活能力。
CD1d-GSL複合物與iNKT細胞之間的三元相互作用
接著，吾等量測小鼠及人類中CD1d-醣脂複合物與iNKT TCR之間的三元相互作用。不同濃度之mCD1ddi-醣脂及hCD1ddi-醣脂複合物分別與固定量之DN3A4-1.2鼠類iNKT融合瘤細胞及人類Vα24+/Vβ11+ iNKT細胞一起培育。在指定濃度下結合複合物之含量藉由抗mIgG1二級抗體偵測且藉由流動式細胞測量術分析(圖3A及3B)。使用GraphPad Prism軟體由圖3A及3B中標繪圖的史卡查變換計算得到三元複合物之KD。如圖3C中所示，mCD1d-7DW8-5複合物與mCD1d-7DW8-5-Glc複合物相比呈現約10倍強的與iNKT TCR的相互作用。此與較高百分比之C1脈衝之脾細胞由mCD1d-7DW8-5複合物(36.2±5.0%)而非mCD1d-7DW8-5-Glc複合物(17.1±0.8%)染色之觀察結果相符(圖11)。當與mCD1d複合時，C1(KD：1.240±0.003nM)及C34(KD：0.735±0.010nM)皆展現分別與C1-Glc(KD：5.137±0.110nM)及C34-Glc(KD：7.960±1.269nM)相比對於iNKT TCR較強的三元相互作用(圖 3C)。
在人類中，具有αGlc之GSL(C1-Glc之KD：8.550±0.617；C34-Glc：0.378±0.019；7DW8-5-Glc：0.481±0.008nM)與具有αGal之GSL(C1之KD：16.410±4.200；C34：0.498±0.005；7DW8-5：0.777±0.022nM)相比在與hCD1d複合時展現對於Vα24+/Vβ11+ iNKT TCR較強的三元相互作用(圖3D)。因此，與脂質尾部之類型無關，具有αGal之GSL與具有αGlc之GSL相比展現與小鼠iNKT TCR之較強三元相互作用，但與人類iNKT TCR之較弱三元相互作用(圖3C及3D)。此可解釋具有αGal之GSL在小鼠中觸發較高含量之細胞激素/趨化激素及免疫細胞的較大擴增(圖2A~2C、7及8)，而在人類中之iNKT細胞擴增較小(圖2D)的觀察結果。綜合而言，在iNKT TCR、CD1d及GSL當中的三元相互作用相比CD1d與GSL之間的二元相互作用似乎與醣脂之生物活性更加相關。
調換人類相較於小鼠CD1d分子抵抗iNKT細胞的效應
為解釋物種特異性反應，吾等檢查調換人類相較於小鼠CD1d分子抵抗人類相較於鼠類iNKT細胞對於具有不同醣基之GSL的刺激活性的效應。鼠類iNKT融合瘤細胞(圖4A)或C1擴增之人類Vα24+ iNKT細胞(圖4B)用由mCD1d(A20-CD1d)或hCD1d(HeLa-CD1d)呈現之指定醣脂脈衝。24小時後收集清液層以量測細胞激素分泌。不論由mCD1d或hCD1d呈現，具有αGal之GSL與具有αGlc之GSL相比誘導更多IL-2自鼠類iNKT細胞分泌(圖4A)。此與具有αGal之GSL與具有αGlc之GSL相比更有效地誘導血清細胞激素分泌的活體內發現相符(圖2及7)。相比之下，當由mCD1d或hCD1d呈現時，具有αGlc之GSL與具有αGal之GSL相比觸發更多IL-2自人類iNKT細胞分泌(圖4B)。在人類iNKT細胞之IFN-γ及IL-4分泌上亦觀測到類似趨勢(圖12A及圖12B)。具有不同醣基之GSL的物種特異性刺激活性藉由鼠類相較於人類iNKT TCR(而 非CD1d)指示。相比而言，7DW8-5-Man可能不刺激小鼠及人類iNKT細胞分泌任何細胞激素，與其由mCD1d或hCD1d呈現無關。值得注意的是，所有具有αGlc之GSL與C1相比基於IFN-γ比IL-4之比率觸發顯著更加Th1偏斜之反應(圖12C)。此外，與脂質尾部無關，具有αGlc之GSL與具有αGal之GSL相比在人類中似乎更加偏向Th1(圖12C)。此等發現指示在醣基4'-OH處之修飾可選擇性誘導人類iNKT細胞朝向Th1方向之反應。
CD1d-GSL-iNKT TCR之三元複合物的結構模型化
為進一步解釋小鼠及人類三元複合物之差異性結合親合力，分別基於鼠類及人類CD1d-αGalCer-iNKT TCR複合物之x射線結構進行電腦模型化(PDB存取碼3HUJ、3QUX、3QUY、3QUZ及3HE6)。
(1)糖頭基之相互作用
如圖3A及3B中所示，當與CD1d複合時，具有Man之GSL可能不結合至小鼠及人類iNKT細胞。甘露糖中之立式2'OH形成抵抗iNKT TCR之位阻(人類中之Ser30及小鼠中之Asn30)且損失最初藉由半乳糖之2'OH對iNKT TCR形成的兩個氫鍵(人類中之Gly96及Asp151以及小鼠中之Gly96及Asp153)。對於具有Gal之GSL，C1與小鼠及人類之CD1d及iNKT TCR的結合分別展示於圖5A及5B中。在大多數保守殘基中觀測到氫鍵(H鍵)相互作用之形成，包括CD1d之人類Asp80(小鼠Asp80)、人類Thr154(小鼠Thr156)、人類Asp151(小鼠Asp 153)及iNKT TCR之人類Gly96(小鼠Gly96)。另一方面，C1之3'OH/4'OH與人類及小鼠iNKT TCR之H鍵相互作用非常不同。小鼠iNKT TCR之殘基Asn30對於結合至C1之3'-及4'-OH而言為關鍵的。使用MGLTools估計Asn30之自由能貢獻為-2.27~-3.38Kcal/mol。相比而言，人類iNKT TCR之Ser30距離C1之4'-OH較遠，產生僅與3'-OH之較弱H鍵，而H鍵可在C1之4'-OH與Phe29之主鏈C=O基團之間形成(圖5B)。C1之Ser30 與3'-OH及Phe29與4'-OH之自由能貢獻經計算為約-1.23~-1.63Kcal/mol。因此，4'OH之軸向(Gal)至水平向(Glc)方向的變化將損失與iNKT TCR之小鼠Asn30及人類Phe29的H鍵相互作用。分別與C1及C34相比，C1-Glc及C34-Glc缺乏與鼠類Asn30之小時鍵相互作用，使得自由能降低(藉由MGLTools計算得到-0.7~-0.9Kcal/mol)。此符合當半乳糖變成葡萄糖頭部時在KD量測中鼠類三元相互作用之下降(圖3C)。相反，具有葡萄糖之GSL的人類三元相互作用較大(圖3D)。基於電腦模型化，吾等發現葡萄糖之水平向4'-OH可藉由與結晶水之較強相互作用(~-1.84Kcal/mol)而補償Phe29相互作用之損失(-0.4Kcal/mol)，結晶水由人類iNKT TCR-Phe51及hCD1d-Trp153捕獲(圖5C)。在小鼠中無疏水性空間形成及捕獲之水分子的情況下，具有Glc之GSL的三元相互作用與具有Gal之GSL相比應較弱。
(2)脂質尾部之相互作用
C34之醯基尾部的兩個芳環可與CD1d之Phe70及Trp63形成芳族相互作用。因此，C1至C34之醯基尾部的變化可增加與CD1d之相互作用(藉由模型化-1.8~-2.4Kcal/mol)。另外，來自芳族相互作用之較高能量可驅使C34或C34-Glc之醯基鏈至CD1d內A'通道之較低位置(接近Cys12)，產生對頭基取向之細微擾動(圖5D)。因此，在小鼠iNKT TCR與葡萄糖頭部之水平向4'-OH之間無親和力的情況下，mCD1d-C34-Glc與iNKT TCR之結合與mCD1d-C1-Glc相比較弱(圖3C)。此可解釋為何在小鼠中C34-Glc不如C1-Glc有效，而C34優於C1。
(3)使用AUTODOCK4計算之自由能
計算三重複中結合至人類及小鼠CD1d-iNKT TCR之各GSL的自由能。在每一輪中，GSL對接至人類及小鼠CD1d-C1-iNKT TCR且選擇排列最高之自由能。如圖5E中所示，計算之自由能一般與對小鼠(圖3C)及人類(圖3D)量測之KD值的趨勢相關。
多種方式可用於調配本發明之組合物。調配及投與之技術可見於「Remington：The Science and Practice of Pharmacy,」Twentieth Edition,Lippincott Williams & Wilkins,Philadelphia,PA(1995)。關於人類或動物投與，製劑應滿足無菌性、發熱性及一般安全性及與由FDA所要求相當之純度標準。如本文所述，醫藥調配物之投與可以多種方式進行。
在GSL、CD1d及iNKT TCR當中的細胞激素誘導及三元相互作用
與αGalCer相比，已報導αGlcCer對鼠類iNKT細胞增生之刺激較小，但更有效地刺激人類iNKT細胞增生。在吾等研究中，在GSL、CD1d及iNKT TCR當中之細胞激素誘導及三元相互作用方面亦觀測到小鼠及人類中αGalCer與αGlcCer之間的差異性活性。此外，攜帶αGal或αGlc頭部之苯基GSL展示出類似物種特異性活性。因此，與脂質尾部無關，具有αGal之GSL與具有αGlc之GSL相比在小鼠中較好，但在人類中較糟。此指示醣脂在小鼠中之生物活性無法解讀成在人類中之生物活性，儘管小鼠與人類之間CD1d及iNKT TCR的序列高度同源。30
一如藉由mCD1d相較於hCD1d調換分析所證明，物種特異性反應最可能歸因於小鼠與人類之間的iNKT TCR差異。藉由mCD1d或hCD1d呈現，具有αGal之GSL與具有αGlc之GSL相比更能有效地刺激鼠類iNKT細胞，但對人類iNKT細胞之刺激較小。根據CD1d-αGalCer-iNKT TCR之晶體結構，iNKT TCR之CDR1α區中與半乳糖頭部之4'-OH接觸的殘基在小鼠(Asn30)與人類(Phe29)之間並不保守。吾等電腦模型化揭示4'-OH自軸向至水平方向的變化在小鼠中會導致4'OH與iNKT TCR-Asn30之間的氫鍵損失。相反，葡萄糖之水平向4'-OH可藉由與結晶水之較強相互作用補償Phe29相互作用之缺失，結晶水由人類iNKT TCR-Phe51及hCD1d-Trp153捕獲。因此，由具有αGlc之GSL 組成的三元相互作用與具有αGal之GSL相比在人類中較強，但在小鼠中較弱。綜合而言，鼠類及人類CD1d-GSL-iNKT TCR複合物之結構模型化提供物種特異性生物活性及計算之自由能變化與三元複合物量測之結合親合力的趨勢非常相關之良好解釋。
相比於具有相同尾部但不同醣基之吾等配對類似物，亦在具有相同醣基但不同脂質尾部之其他情況中看出物種特異性免疫反應。類似地，塑造兩種C-醣苷類似物在小鼠與人類之間之較佳活性的為iNKT TCR，而非CD1d，其與三元複合物之結合強度非常相關。對於吾等醣脂，三元相互作用與二元相互作用相比在預測小鼠及人類之生物反應時亦更加重要。與C1相比，7DW8-5及7DW8-5-Glc與mCD1d之結合強得多，可能歸因於苯環及氟化原子與CD1d A'袋之接觸增加。儘管具有相同脂質尾部之兩種醣脂展現對CD1d之類似結合強度，但其展示不同免疫刺激效能。7DW8-5-Glc與7DW8-5相比在人類中較好，但在小鼠中較糟，其與三元複合物之結合親合力具有良好關係。除7DW8-5及7DW8-5-Glc以外，其他兩種配對類似物(C1相較於C1-Glc及C34相較於C34-Glc)在小鼠及人類中之生物活性亦與三元相互作用之強度非常相關。亦即，具有αGal之GSL與具有αGlc之GSL相比在小鼠中展示較強三元相互作用及免疫刺激活性，但在人類中之趨勢相反。因此，活體外量測三元相互作用可用於預測吾等新醣脂之活體內免疫刺激效能。
在具有αGlc之GSL當中的進一步比較揭示C1-Glc及C34-Glc與7DW8-5-Glc相比皆在小鼠中較好地誘導細胞激素。然而，C34-Glc及7DW8-5-Glc之鼠類三元複合物之結合親合力為可比的。此等發現表明除KD以外之因素亦可調節活體內免疫反應。實際上，與7DW8-5-Glc相比，C1-Glc及C34-Glc激活更多CD80+或CD86+ DC，其可有助於小鼠中C1-Glc及C34-Glc的較強生物活性。綜合而言，包括三元相互 作用之強度及免疫細胞之擴增/激活的數個因素可調節活體內免疫刺激。
相比於具有αGal或αGlc之GSL，αManCer及7DW8-5-Man未能在小鼠及人類中誘導iNKT細胞增生、細胞激素/趨化激素及/或免疫細胞之擴增/激活。此可歸因於鼠類或人類iNKT TCR可識別αMan頭部之事實，如藉由iNKT細胞中不存在用CD1d-7DW8-5-Man二聚體之染色所證明。與7DW8-5-Man相比，7DW8-5-Glc即使在極低含量下仍能夠在小鼠中誘導Th1及Th2細胞激素。相比而言，在野生型及Jα18 KO小鼠中由7DW8-5-Glc觸發大量KC、MCP-1、IP-10及MIG趨化激素，表明除iNKT細胞以外之某些類型的免疫細胞可有助於此等趨化激素分泌。實際上，單核細胞在Jα18 KO小鼠中由7DW8-5-Glc顯著擴增/激活。已報告單核細胞可回應於刺激產生此等趨化激素，表明單核細胞可造成經7DW8-5-Glc處理之小鼠的趨化激素分泌。儘管如此，吾等仍不能排除Jα18 KO小鼠中存在之其他可能來源亦可發揮作用。Vα10 NKT細胞可活體外回應於αGalCer及αGlcCer產生IFN-γ及IL-4，38但IFN-γ未分泌於用αGalCer處理之Jα18 KO小鼠的血清中。39吾等未能偵測用7DW8-5或7DW8-5-Glc處理之Jα18 KO小鼠產生任何細胞激素。此等發現暗示Vα10 NKT細胞幾乎不促成在小鼠中由7DW8-5-Glc觸發趨化激素。
然而，大多數細胞激素及趨化激素不在用7DW8-5或7DW8-5-Glc刺激之Jα18 KO小鼠中產生，包括IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、GM-CSF及TNFα。如CD4+ T及CD8+ T細胞之免疫細胞不在Jα18 KO小鼠中擴增。因此，iNKT細胞仍在上文提及之藉由7DW8-5或7DW8-5-Glc之細胞激素/趨化激素誘導及免疫細胞擴增發揮關鍵作用。
總之，具有αGlc之GSL與具有αGal之GSL相比在人類中具有較強三元相互作用且觸發更加偏向Th1之免疫。然而，具有αGlc之GSL與 具有αGal之GSL相比在小鼠中的刺激較小。如由mCD1d相較於hCD1d調換分析所證實，物種特異性反應歸因於物種之間三元複合物的差異性結合親合力，反映鼠類及人類iNKT TCR之間的差異。此符合在小鼠及人類中基於CD1d-αGalCer-iNKT TCR複合物之結晶結構的藉由電腦模型化的預測。27-29除CD1d-醣脂複合物與TCR之間的三元相互作用以外，擴增/激活之單核細胞亦可調節活體內免疫反應，尤其對於具有αGlc之GSL。
根據吾等研究，醣基上之4'OH方向的變化在小鼠及人類中引起不同生物活性。此與引入至αGalCer頭部之4'OH的芳族基可影響小鼠之iNKT細胞細胞激素產生的報導相符，但其在人類中之效應未研究。在醣基6位處之改變亦展示對於生物反應的不同效應。29,41此等發現連同吾等研究提供未來設計及合成新GSL之新方向。
在本申請案通篇，引用各種公開案、專利及公開專利申請案。本申請案中提及之此等公開案、專利及公開專利申請案的發明內容以全文引用的方式併入本發明中。公開案、專利或公開專利申請案在本文中之引用並非承認該公開案、專利或公開專利申請案為先前技術。
本說明書中所引用之所有公開案及專利申請案以引用的方式併入本文中，就如同各個別公開案或專利申請案特定地且個別地指示以引用的方式併入一般。
儘管已出於清楚理解之目的藉由說明及實例相當詳細地描述前述發明，但根據本發明之教示，可在不背離隨附申請專利範圍之精神及範疇下對其進行某些變化及變更將對於一般熟習此項技術者易於變得顯而易見。
Figure 104129739-A0202-11-0002-1

Claims (39)

  1. 一種具有式(I)結構之免疫佐劑化合物或其醫藥學上可接受之鹽：
    Figure 104129739-A0305-02-0125-1
     其中：R1為-OH；R2為-氫；R3為-OH；R4具有式(III)結構：
    Figure 104129739-A0305-02-0125-2
     其中：j為0、1、2、3或4；k為2；R7係氫或鹵素；R8係F；R5係獨立地選自由以下組成之群：氫、鹵素、視情況經取代之C1-20烷基、視情況經取代之C2-20烯基、視情況經取代之C2-20炔基、視情況經取代之C3-10碳環基、視情況經取代之C6-14芳基、視情況經取代之具有1至4個選自氮、氧及硫之環雜原子的3員至10員雜環基、視情況經取代之具有1-4個選自氮、氧及 硫之環雜原子的5-10員雜芳基、視情況經取代之C1-20烷氧基、視情況經取代之胺基及視情況經取代之醯基，其中該醯基係-C(=O)Raa、-CHO、-CO2Raa、-C(=O)N(Rbb)2、-C(=NRbb)Raa、-C(=NRbb)ORaa、-C(=NRbb)N(Rbb)2、-C(=O)NRbbSO2Raa、-C(=S)N(Rbb)2、-C(=O)SRaa或-C(=S)SRaa，其中Raa及Rbb如下所定義；其中，該視情況之取代基可包括鹵素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORaa、-ON(Rbb)2、-N(Rbb)2、-N(Rbb)3 +X-、-N(ORcc)Rbb、-SH、-SRaa、-SSRcc、-C(=O)Raa、-CO2H、-CHO、-C(ORcc)2、-CO2Raa、-OC(=O)Raa、-OCO2Raa、-C(=O)N(Rbb)2、-OC(=O)N(Rbb)2、-NRbbC(=O)Raa、-NRbbCO2Raa、-NRbbC(=O)N(Rbb)2、-C(=NRbb)Raa、-C(=NRbb)ORaa、-OC(=NRbb)Raa、-OC(=NRbb)ORaa、-C(=NRbb)N(Rbb)2、-OC(=NRbb)N(Rbb)2、-NRbbC(=NRbb)N(Rbb)2、-C(=O)NRbbSO2Raa、-NRbbSO2Raa、-SO2N(Rbb)2、-SO2Raa、-SO2ORaa、-OSO2Raa、-S(=O)Raa、-OS(=O)Raa、-Si(Raa)3、-OSi(Raa)3-C(=S)N(Rbb)2、-C(=O)SRaa、-C(=S)SRaa、-SC(=S)SRaa、-SC(=O)SRaa、-OC(=O)SRaa、-SC(=O)ORaa、-SC(=O)Raa、-P(=O)2Raa、-OP(=O)2Raa、-P(=O)(Raa)2、-OP(=O)(Raa)2、-OP(=O)(ORcc)2、-P(=O)2N(Rbb)2、-OP(=O)2N(Rbb)2、-P(=O)(NRbb)2、-OP(=O)(NRbb)2、-NRbbP(=O)(ORcc)2、-NRbbP(=O)(NRbb)2、-P(Rcc)2、-P(Rcc)3、-OP(Rcc)2、-OP(Rcc)3、-B(Raa)2、-B(ORcc)2、-BRaa(ORcc)、C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基 及5-14員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、R、3、4或5個Rdd基團取代；或碳原子上之兩個氫經基團=O、=S、=NN(Rbb)2、=NNRbbC(=O)Raa、=NNRbbC(=O)ORaa、=NNRbbS(=O)2Raa、=NRbb或=NORcc置換；Raa之各實例獨立地選自C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，或兩個Raa基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代；Rbb之各實例獨立地選自氫、-OH、-ORaa、-N(Rcc)2、-CN、-C(=O)Raa、-C(=O)N(Rcc)2、-CO2Raa、-SO2Raa、-C(=NRcc)ORaa、-C(=NRcc)N(Rcc)2、-SO2N(Rcc)2、-SO2Rcc、-SO2ORcc、-SORaa、-C(=S)N(Rcc)2、-C(=O)SRcc、-C(=S)SRcc、-P(=O)2Raa、-P(=O)(Raa)2、-P(=O)2N(Rcc)2、-P(=O)(NRcc)2、C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，或兩個Rbb基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代；Rcc之各實例獨立地選自氫、C1-10烷基、C1-10全鹵烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10碳環基、3-14員雜環基、C6-14芳基及5-14員雜芳基，或兩個Rcc基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rdd基團取代；Rdd之各實例獨立地選自鹵素、-CN、- NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-ORee、-ON(Rff)2、-N(Rff)2、-N(Rff)3 +X-、-N(ORee)Rff、-SH、-SRee、-SSRee、-C(=O)Ree、-CO2H、-CO2Ree、-OC(=O)Ree、-OCO2Ree、-C(=O)N(Rff)2、-OC(=O)N(Rff)2、-NRffC(=O)Ree、-NRffCO2Ree、-NRffC(=O)N(Rff)2、-C(=NRff)ORee、-OC(=NRff)Ree、-OC(=NRff)ORee、-C(=NRff)N(Rff)2、-OC(=NRff)N(Rff)2、-NRffC(=NRff)N(Rff)2,-NRffSO2Ree、-SO2N(Rff)2、-SO2Ree、-SO2ORee、-OSO2Ree、-S(=O)Ree、-Si(Ree)3、-Osi(Ree)3、-C(=S)N(Rff)2、-C(=O)SRee、-C(=S)SRee、-SC(=S)SRee、-P(=O)2Ree、-P(=O)(Ree)2、-OP(=O)(Ree)2、-OP(=O)(ORee)2、C1-6烷基、C1-6全鹵烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳環基、3-10員雜環基、C6-10芳基、5-10員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rgg基團取代，或兩個Rdd取代基可接合以形成=O或=S；Ree之各實例獨立地選自C1-6烷基、C1-6全鹵烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳環基、C6-10芳基、3-10員雜環基及3-10員雜芳基，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rgg基團取代；Rff之各實例獨立地選自氫、C1-6烷基、C1-6全鹵烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳環基、3-10員雜環基、C6-10芳基及5-10員雜芳基，或兩個Rff基團接合以形成3-14員雜環基或5-14員雜芳基環，其中各烷基、烯基、炔基、碳環基、雜環基、芳基及雜芳基獨立地經0、1、2、3、4或5個Rgg基團取代；以及Rgg之各實例獨立地為鹵素、-CN、-NO2、-N3、-SO2H、-SO3H、-OH、-OC1-6 alkyl、-ON(C1-6 烷基)2、-N(C1-6烷基)2、-N(C1-6烷基)3 +X-、-NH(C1-6烷基)2 +X-、-NH2(C1-6烷基)+X-、-NH3 +X-、-N(OC1-6烷基)(C1-6烷基)、-N(OH)(C1-6烷基)、-NH(OH)、-SH、-SC1-6烷基、-SS(C1-6烷基)、-C(=O)(C1-6烷基)、-CO2H、-CO2(C1-6烷基)、-OC(=O)(C1-6烷基)、-OCO2(C1-6烷基)、-C(=O)NH2、-C(=O)N(C1-6烷基)2、-OC(=O)NH(C1-6烷基)、-NHC(=O)(C1-6烷基)、-N(C1-6烷基)C(=O)(C1-6烷基)、-NHCO2(C1-6烷基)、-NHC(=O)N(C1-6烷基)2、-NHC(=O)NH(C1-6烷基)、-NHC(=O)NH2、-C(=NH)O(C1-6烷基)、-OC(=NH)(C1-6烷基)、-OC(=NH)OC1-6烷基、-C(=NH)N(C1-6烷基)2、-C(=NH)NH(C1-6烷基)、-C(=NH)NH2、-OC(=NH)N(C1-6烷基)2、-OC(NH)NH(C1-6烷基)、-OC(NH)NH2、-NHC(NH)N(C1-6烷基)2、-NHC(=NH)NH2、-NHSO2(C1-6烷基)、-SO2N(C1-6烷基)2、-SO2NH(C1-6烷基)、-SO2NH2,-SO2C1-6烷基、-SO2OC1-6烷基、-OSO2C1-6烷基、-SOC1-6烷基、-Si(C1-6烷基)3、-Osi(C1-6烷基)3-C(=S)N(C1-6烷基)2、C(=S)NH(C1-6烷基)、C(=S)NH2、-C(=O)S(C1-6烷基)、-C(=S)SC1-6烷基、-SC(=S)SC1-6烷基、-P(=O)2(C1-6烷基)、-P(=O)(C1-6烷基)2、-OP(=O)(C1-6烷基)2、-OP(=O)(OC1-6烷基)2、C1-6烷基、C1-6全鹵烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10碳環基、C6-10芳基、3-10員雜環基、5-10員雜芳基；或兩個Rgg取代基可接合以形成=O或=S；其中X-為相對離子；n為1至15之整數；m為1至20之整數。
  2. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R7為氫。
  3. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中R7為F；且j為1、2或3。
  4. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係
    Figure 104129739-A0305-02-0130-5
    或其醫藥學上可接受之鹽。
  5. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其係
    Figure 104129739-A0305-02-0130-6
     或其醫藥學上可接受之鹽。
  6. 一種醫藥組合物，其包含：(i)當與抗原一起共投與人類個體時足以刺激免疫反應之量的如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及(ii)醫藥學上可接受之賦形劑。
  7. 如請求項6之醫藥組合物，其中該組合物為疫苗佐劑。
  8. 如請求項6之醫藥組合物，其中該組合物為抗癌治療劑。
  9. 如請求項6之醫藥組合物，其中該化合物能夠增加人類之Th1細胞激素，同時伴隨最少Th2細胞激素增加。
  10. 一種佐劑組合物之用途，其係用於製造用於強化有需要之個體之抗原免疫原性之醫藥，該醫藥包含供共投與之醫藥有效量之該抗原與佐劑組合物，其中該佐劑組合物包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
  11. 一種包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受 之鹽之免疫佐劑組合物之用途，其係用於製造用以刺激有需要之人類個體之免疫反應的醫藥，其中該免疫佐劑組合物包含於醫藥學上可接受之載劑中。
  12. 如請求項10之用途，其中該佐劑組合物為疫苗佐劑。
  13. 如請求項10之用途，其中該佐劑組合物係經投與能夠升高人類中恆定型自然殺手T(iNKT)細胞之量。
  14. 如請求項11之用途，其中投與該佐劑組合物增加人類之細胞激素及/或趨化激素產生。
  15. 如請求項14之用途，其中該細胞激素產生足以反式激活下游免疫細胞。
  16. 如請求項15之用途，其中該等下游免疫細胞包含樹突狀細胞(DC)、自然殺手細胞(NK)、B細胞、CD4+ T及CD8+ T細胞中之一或多者。
  17. 如請求項14之用途，其中該等細胞激素包含Th1細胞激素。
  18. 如請求項17之用途，其中該等Th1細胞激素係選自包含以下之群中之至少一者：干擾素-γ(IFN-γ)、GM-CSF、TNFα、介白素2及介白素12。
  19. 如請求項14之用途，其中該趨化激素係選自包含以下之群中之至少一者：RANTES、MIP-1α、KC、MCP-1、IP-10及MIG。
  20. 如請求項10之用途，其中投與該抗原與佐劑組合物具有抗癌效應。
  21. 如請求項20之用途，其中該抗癌效應係針對由以下組成之群之癌症：實體腫瘤及癌瘤。
  22. 如請求項21之用途，其中該癌症為肺癌、乳癌、肝癌或白血病。
  23. 如請求項10之用途，其中人類中Th1細胞激素之增加超過任何 Th2細胞激素之增加。
  24. 一種包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之醫藥組合物之用途，其係用於製造用於升高有需要之人類個體之恆定型自然殺手T(iNKT)細胞產生的醫藥。
  25. 一種包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽之醫藥組合物之用途，其係用於製造用於刺激有需要之人類個體之細胞激素及/或趨化激素產生的醫藥。
  26. 如請求項25之用途，其中該細胞激素產生足以反式激活下游免疫細胞。
  27. 如請求項26之用途，其中該等下游免疫細胞包含樹突狀細胞(DC)、自然殺手細胞(NK)、B細胞、CD4+ T及CD8+ T細胞中之一或多者。
  28. 如請求項25之用途，其中該等細胞激素包含Th1細胞激素。
  29. 如請求項28之用途，其中該等細胞激素係選自：干擾素-γ(IFN-γ)、GM-CSF、TNFα、介白素2及介白素12。
  30. 如請求項25之用途，其中該等趨化激素係選自：RANTES、MIP-1α、KC、MCP-1、IP-10及MIG。
  31. 一種包含一或多種抗原及免疫原性有效量之如請求項6之醫藥組合物之疫苗之用途，其係用於製造用於強化個體之免疫反應的醫藥。
  32. 如請求項31之用途，其中該一或多種抗原係選自由以下組成之群：細菌抗原、病毒抗原、真菌抗原、原蟲抗原、普利昂抗原、新抗原、腫瘤抗原及自身抗原。
  33. 如請求項31之用途，其中該疫苗係選自由以下組成之群：核酸、蛋白質、肽、醣蛋白、碳水化合物、融合蛋白、脂質、醣脂、碳水化合物-蛋白質結合物；細胞或其提取物；死細胞或減 毒細胞或其提取物；腫瘤細胞或其提取物；病毒粒子；以及過敏原或其混合物。
  34. 如請求項31之用途，其中該抗原為腫瘤抗原。
  35. 如請求項31之用途，其中該抗原量係經投與在每公斤體重0.1μg至100mg範圍內。
  36. 如請求項31之用途，其中該醫藥組合物為佐劑組合物，且該佐劑量係在每公斤體重10至100μg範圍內。
  37. 如請求項31之用途，其中該醫藥組合物為包含以該式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽及醫藥學上可接受之載劑共調配的醫藥學上可接受之組合物。
  38. 一種醫藥品，其包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
  39. 一種用於強化有需要之個體之抗原免疫原性、刺激有需要之人類個體之免疫反應、用於升高有需要之人類個體之恆定型自然殺手T(iNKT)細胞產生或用於刺激有需要之人類個體之細胞激素及/或趨化激素產生之套組，其包含如請求項1至5中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽及使用說明書。
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