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TWI636739B - 解澱粉芽孢桿菌、穀物醱酵物、其製備方法及其用途、食品組成物、血栓分解用組成物、消化改善用組成物、腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物及抗氧化用組成物 - Google Patents

解澱粉芽孢桿菌、穀物醱酵物、其製備方法及其用途、食品組成物、血栓分解用組成物、消化改善用組成物、腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物及抗氧化用組成物 Download PDF

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趙成捘
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Abstract

本申請案是有關於一種新穎的解澱粉芽孢桿菌菌株、利用上述菌株的穀物醱酵物的製備方法、包括上述菌株的穀物醱酵物及包括上述菌株或穀物醱酵物的血栓分解用組成物、消化改善用組成物、腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物、或抗氧化用組成物。

Description

解澱粉芽孢桿菌、穀物醱酵物、其製備方法及其用途、食品組成物、血栓分解用組成物、消化改善用組成物、腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物及抗氧化用組成物
本申請案是有關於一種新穎的解澱粉芽孢桿菌菌株、利用上述菌株的穀物醱酵物的製備方法、包括上述菌株的穀物醱酵物及包括上述菌株或穀物醱酵物的血栓分解用組成物、消化改善用組成物；腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物、或抗氧化用組成物。
酶是作用於體內代謝活動的重要蛋白質，且為發揮化學作用的觸媒作用的物質。大致可將酶分為無法於體內產生而需 自外部攝取的食品酶、於體內自行產生而發揮助消化作用的消化酶、發揮有助於除消化以外的其他代謝作用的作用的代謝酶。其中，曾有報導指出食品酶可發揮消化吸收作用、分解排出作用、抗炎/抗菌作用、解毒殺菌作用、血液淨化作用及細胞復活作用等生理作用(Sin Hyeon Jae、酶治療、第29-41頁、2013)。
酶食品是為了強化酶的此種功能而於食用原料中培養食用微生物以含有大量的酶者、自食品中萃取含酶部分者、或對其等加工所得者的統稱。曾報告此種酶食品藉由食品本身的酶與微生物的醱酵及熟成過程，增加含有藉由各種生理活性物質與營養素的生成作用及有益菌的增殖作用而有助於消化吸收的各種微量元素及生理活性物質(Huh,S.H.與Kim,M.H.現代健康與健康食品、1997.Hongikjea press.Korea、第35-36頁)。
於前述背景下，本發明者為了開發可用作酶食品的穀物醱酵物而進行銳意研究，結果篩選出澱粉及蛋白質分解能力優異的菌株，利用此種菌株製備穀物醱酵物，藉此確認各種效果而完成了本申請案。
本申請案的一個目的在於提供一種新穎的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株。
本發明的另一目的在於提供一種穀物醱酵物的製備方 法，其包括如下步驟：(a)將本申請案的菌株接種至穀物的步驟；及(b)培養上述菌株而獲得穀物醱酵物的步驟。
本發明的又一目的在於提供一種包括本申請案的菌株的穀物醱酵物。
本發明的又一目的在於提供一種包括本申請案的菌株或穀物醱酵物的血栓分解用組成物、消化改善用組成物、腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物、或抗氧化用組成物、及包括本申請案的菌株或穀物醱酵物的食品組成物(例如，酶食品組成物)。
作為用以達成上述目的的一個實施方式，本申請案提供一種解澱粉芽孢桿菌BA245菌株(KCTC 12905BP)。
具體而言，本申請案的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株生成活性較強的澱粉及蛋白分解酶而水解作為高分子的碳水化合物及蛋白質來低分子化，藉此不僅將碳水化合物及蛋白質分解成微生物易於利用的糖類而有助於微生物的作用，而且可藉由提供經低分子化的肽而明顯增加消化吸收率。再者，本申請案的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株利用作為穀物的主要構成成分的碳水化合物活躍地繁育而轉化成構成菌體的蛋白質，故而可相對增加酶食品內的粗蛋白含量。藉由利用BA245菌株的醱酵而膳食纖維的含量亦增加，膳食纖維可使排便通暢，且作為腸內有益菌的重要營養素，有助於增加有益菌的數量而營造健康的腸內環境。
本申請案的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株是自源自傳統醱酵食品的菌株中篩選的澱粉及蛋白質分解酶生成能力最優異的菌株，且為自酒麴分離的菌株。
為了鑑定篩選出的BA245而進行16S rRNA基因鹼基序列分析，結果確認到BA245菌株具有序列號1的16S rRNA基因鹼基序列，根據上述序列而與公知的菌株進行序列同源性比較及分析系統分類學上的親緣關係，結果BA245菌株與解澱粉芽孢桿菌表現出99.9%的相似性(圖2)，於旋轉酶A基因鹼基序列的比較中，亦判斷出與解澱粉芽孢桿菌的親緣關係最高(參照圖3)。
對此，將本申請案的BA245菌株命名為解澱粉芽孢桿菌BA245，根據布達佩斯條約，於2015年9月23日委託韓國生命工學研究院微生物資源中心(Korean Collection for Type Cultures，KCTC)而獲得了寄存編號KCTC12905BP。
作為另一實施方式，本申請案提供包括如下步驟的穀物醱酵物的製備方法：(a)將寄存編號為KCTC12905BP的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株接種至穀物的步驟；及(b)培養上述菌株而獲得穀物醱酵物的步驟。
若按照步驟對本申請案的製備方法進行說明，則如下。
步驟(a)：將菌株接種至穀物的步驟
可使用於申請案的步驟(a)中的穀物可包括選自由小 麥、小麥胚芽、麩殼、白米、玄米、發芽玄米、大麥、燕麥、紅米、黑糯米、糯米、米糠、大豆、藥豆、黑豆、藜麥、紅扁豆及薏苡所構成的族群中的一種以上的穀物。上述穀物可使用粉碎形態、粉末形態或無粉碎過程而直接使用。
具體而言，上述步驟(a)的穀物可包括小麥胚芽及麩殼。於此情形時，相對於穀物為100重量份，小麥胚芽及麩殼可包括40重量份至100重量份、50重量份至100重量份、50重量份至90重量份、50重量份至80重量份或60重量份至80重量份。
更具體而言，於上述步驟(a)中，穀物可更包括選自由燕麥、紅扁豆、玄米、糯麥及藜麥所構成的族群中的一種以上的穀物。相比於穀物為100重量份，這些穀物的含量範圍可為1重量份至20重量份，具體而言，可為3重量份至10重量份。再者，上述步驟(a)的穀物可為水分含量為30%(體積/重量(v/w))至70%(v/w)的穀物。具體而言，上述水分含量可為30%(v/w)至60%(v/w)、30%(v/w)至50%(v/w)或30%(v/w)至40%(v/w)。於水分含量低於30%的情形時，因水分較少而芽孢桿菌的醱酵速度延遲，特別是，因於醱酵過程中水分蒸發而於最終醱酵後成為芽孢桿菌難以生長的水分含量為20%的程度，故而會不適宜。於水分含量高於70%的情形時，會產生於乾燥製程需投用較多的費用的問題。
具體而言，上述水分含量可為穀物本身的水分含量、 或藉由對以預先含有水分的方式進行預處理所得的穀物或對上述(a)的穀物進一步進行水分處理而具有的水分含量(即，上述步驟(a)的穀物可為經水分處理的穀物)。可向穀物直接噴霧或混合適量的水而實施上述水分處理。
再者，本申請案的穀物醱酵物的製備方法於步驟(a)前，可更包括對穀物進行熱處理的步驟。即便無熱處理步驟，亦可於穀物中培養菌株，但藉由進行熱處理，於殺滅穀物中的雜菌的同時可破壞穀物細胞壁而發揮糊化作用、且使蛋白質改質，藉此可提供可使微生物活躍地繁育的環境，可減少菌株接種量降低成本。上述熱處理可利用本技術領域內公知的各種方法，例如可利用蒸汽(steam)或過熱蒸汽(superheated steam)執行。具體而言，能夠以70℃至140℃的蒸汽進行10分鐘至60分鐘的蒸煮處理，或以200℃至300℃的過熱蒸汽進行數秒至數分的短時間的熱處理。更具體而言，能夠以70℃至130℃的蒸汽蒸煮20分鐘至60分鐘，或以80℃至125℃的蒸汽蒸煮20分鐘至45分鐘。於熱處理溫度較低或處理時間較短的情形時，雜菌的殺菌效果會下降，無法順利地進行後續的醱酵製程，於熱處理溫度較高或處理時間變長的情形時，因穀物內的蛋白質改質而醱酵效率下降，從而最終製品的品質會下降。
再者，本申請案的穀物醱酵物的製備方法於步驟(a)前，可更包括於對穀物進行水分處理後進行熱處理的步驟。水分處理與熱處理的內容如上。
接著，將寄存編號為KCTC12905BP的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株接種至上述穀物。
於進行上述接種前，可更包括冷卻任意熱處理的穀物的步驟。可於熱處理結束後自然地進行冷卻，或可提高冷卻速度來防止過熱而均勻地進行冷卻(例如，利用輸送機(conveyor)式放冷機)。具體而言，冷卻溫度可為30℃至50℃、35℃至45℃或35℃至40℃。
於對穀物接種解澱粉芽孢桿菌BA245菌株時，可直接使用培養上述菌株的預培養液、使用分離的菌株、或使用以凍結乾燥等形態粉末化的菌株或其培養物。就BA245菌株的接種量而言，剛剛接種後的菌數可為1×105CFU/g至1×1010CFU/g或1×106CFU/g至1×109CFU/g。於接種量小於1×105CFU/g的情形時，種菌醱酵液的消耗量較少，相反地，使穀物醱酵所需時間較多，從而具有製品生產所需的醱酵時間變長，受到雜菌污染的可能性較高的缺點。相反地，於接種量超出1×1010CFU/g的情形時，可大幅縮短醱酵時間，但具有接種用種菌的生產成本增加的缺點。
步驟(b)：培養菌株而獲得穀物醱酵物的步驟
於實施步驟(a)後，可將本申請案的菌株與穀物一併培養而獲得穀物醱酵物。如下述實施例所證明，藉由將本申請案的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株培養至穀物中，可因上述菌株的優異的澱粉分解酶活性及蛋白分解酶活性而將所獲得的穀物醱酵物 內的蛋白質低分子化來提高消化吸收率，包括膳食纖維等各種有用成分，且具有血栓分解作用、消化改善作用、腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療作用、或抗氧化作用等有利的活性。
上述培養可為液體培養或固體培養，但具體而言，可為固體培養。培養溫度可為20℃至50℃、30℃至45℃或37℃，培養時間可為1小時至48小時、6小時至48小時、6小時至36小時、12小時至36小時、12小時至30小時、18小時至30小時、22小時至26小時或24小時。
培養方法並無特別限定，但例如可使用液體培養槽、轉鼓式醱酵器(rotary drum fermentor)或托盤醱酵器(tray fermentor)進行培養。除上述轉鼓式醱酵器或托盤醱酵器以外，只要為對穀物或其混合物的醱酵有用者，則可不限制於其形式而使用於本申請案的方法中，可根據生產規模而選擇使用適當的裝置。
本申請案的製備方法可更包括對在步驟(b)中獲得的穀物醱酵物進行乾燥及/或粉碎的步驟。可藉由本技術領域內公知的各種方法實現上述乾燥及/或粉碎，但於過度地於高溫下進行乾燥的情形時，會殺滅穀物醱酵物中的活菌，亦會降低酶活性，因此應予以注意。具體而言，應於不會殺滅本申請案的菌株且亦保持酶活性的低溫下進行乾燥，可於低溫、例如40℃至75℃或50℃至70℃下，利用低濕度的熱風以穀物醱酵物中的水分含量成為 20%以下或10%以下的方式進行乾燥。粉碎過程可根據利用穀物醱酵物的目的而粉碎成各種尺寸，作為粉碎方法，例如可利用錘磨機(hammer mill)等。
本申請案的又一實施方式提供一種包括以寄存編號KCTC12905BP寄存的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株的穀物醱酵物。
具體而言，上述解澱粉芽孢桿菌BA245菌株可包括其培養物或其破碎物等。上述BA245菌株的內容如上。
再者，本申請案的穀物醱酵物可更包括：(a)50重量%至60重量%的碳水化合物；(b)20重量%至30重量%的粗蛋白；(c)50mg/100g至200mg/100g的離胺酸；(d)15mg/100g至150mg/100g異白胺酸；(e)100mg/100g至300mg/100g的白胺酸；(f)10mg/100g至70mg/100g的甲硫胺酸；(g)100mg/100g至300mg/100g的苯丙胺酸；(h)50mg/100g至100mg/100的g的色胺酸；及(i)50mg/100g至300mg/100g的纈胺酸。具體而言，本申請案的穀物醱酵物可更包括：(j)25重量%至30重量%的膳食纖維；及(k)3mg/100g至80mg/100g的蘇胺酸。更具體而言，穀物醱酵物中的碳水化合物可為53重量%至60重量%，膳食纖維可為26重量%至29重量%，粗蛋白可為21重量%至25重量%。作為必需胺基酸的蘇胺酸可包括40mg/100g至70mg/100g或40mg/100g至60mg/100g、離胺酸包括70mg/100g至150mg/100g或100mg/100g至150mg/100 g、異白胺酸包括70mg/100g至120mg/100g或80mg/100g至110mg/100g、白胺酸包括150mg/100g至250mg/100g或170mg/100g至240mg/100g、甲硫胺酸包括30mg/100g至60mg/100g或40mg/100g至50mg/100g、苯丙胺酸為150mg/100g至250mg/100g或170mg/100g至240mg/100g、色胺酸為60mg/100g至90mg/100g或65mg/100g至85mg/100g、及纈胺酸包括150mg/100g至250mg/100g或170mg/100g至240mg/100g。
於上述穀物醱酵物中，相對於粗蛋白為100重量份，5Mw(kDa)以下的肽含量可為50重量份至80重量份，30Mw(kDa)以上的肽含量可為5重量份至20重量份。具體而言，相對於粗蛋白100重量份，上述5Mw(kDa)以下的肽含量可為55重量份至70重量份，30Mw(kDa)以上的肽含量可為5重量份至15重量份。
再者，上述穀物醱酵物的α-澱粉酶活性可為2000U/g至4000U/g、2000U/g至4000U/g、2300U/g至3500U/g、2500U/g至3500U/g或2500U/g至3000U/g。
再者，上述穀物醱酵物的蛋白酶活性可為2000U/g至4000U/g、2500U/g至4000U/g、3000U/g至4000U/g、3500U/g至4000U/g或3700U/g至4000U/g。
本申請案的穀物醱酵物可藉由作為本申請案的一實施方式的上述穀物醱酵物的製備方法而製備。
作為又一實施方式，本申請案提供一種包括本申請案的上述菌株或穀物醱酵物的食品組成物。上述食品組成物只要為可食用的食品，則並無特別限定。
具體而言，上述食品組成物可為酶食品。於本申請案中，用語“酶食品”是指為了強化酶的功能而於食用原料中培養食用微生物來含有大量的酶者、自食品中萃取含酶部分者、或對其等進行加工所得者。
本申請案的食品組成物亦可包括健康食品組成物。於將本申請案的菌株或穀物醱酵物使用於食品或健康食品組成物的情形時，可直接添加本申請案的菌株或穀物醱酵物、或與其他食品或食品成分一併使用，可藉由通常的方法適當地使用。可根據使用目的(預防、健康或治療用途)適當地確定本申請案的菌株或穀物醱酵物的混合量。上述食品組成物於為可食用的組成物的情形時，可無限制地包括各種組成物。作為食品組成物的例子，有包括肉類、香腸、麵包、蛋糕、巧克力、糖果類、點心類、餅乾類(餅乾、蘇打餅乾等)、比薩、麵類(拉麵等)、口香糖類、包括冰淇淋類的乳製品、各種湯類、番茄醬、沙司、肉醬(gravies)、調味醬、飲料、茶、口服液、酒精飲料及維生素複合劑等。
本申請案的食品或健康食品組成物可如通常的飲料般含有多種香味劑或天然碳水化合物等作為添加成分。上述天然碳水化合物為如葡萄糖及果糖的單醣、如麥芽糖及蔗糖的雙醣、如 糊精及環糊精的多醣、木糖醇、山梨糖醇及赤藻糖醇等糖醇。作為甜味劑，可使用如索馬甜、甜菊萃取物的天然甜味劑、或如糖精、阿斯巴甜糖的合成甜味劑等。於本申請案的食品或健康食品組成物每100ml中，上述天然碳水化合物的比率通常為約0.01g至0.20g，具體而言，可為約0.04g至0.10g。
除此之外，本申請案的食品或健康食品組成物可含有多種營養劑、維生素、電解質、風味劑、著色劑、果膠酸及其鹽、海藻酸及其鹽、有機酸、保護性膠體增黏劑、pH值調節劑、穩定劑、防腐劑、甘油、酒精、使用於碳酸飲料的碳酸化劑等。除此之外，本申請案的食品或健康食品組成物可含有用以製備天然果汁、果汁飲料及蔬菜飲料的果肉。此種成分可單獨使用或組合使用。於本申請案的食品或健康食品組成物每100重量份中，可於0.01重量份至0.20重量份的範圍內選擇此種添加劑的比率。
作為另一實施方式，本申請案提供一種包括解澱粉芽孢桿菌BA245菌株或包括其的穀物醱酵物的血栓分解用組成物、消化改善用組成物、腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物、或抗氧化用組成物。
本申請案的用語“預防”是指抑制或延緩目標疾病的發病的所有行為，本申請案的用語“改善”是指減輕或緩和所患疾病的症狀及副作用的所有行為。本申請案的用語“治療”是指使所患疾病的症狀及副作用改善、好轉或朝向有利方向改變的所 有行為。
如下述實施例所證明，具體地確認到本申請案的菌株或穀物醱酵物具有纖維蛋白分解活性(實施例8)；改善固體成分的胃排空能力(實施例9)；於急性腸炎動物模型中，改善腸通透性(實施例10)、強化腸膜(實施例11)、治療腸組織的損傷(實施例12)；以及高抗氧化活性較高(實施例13)。因此，可知本申請案的菌株或穀物醱酵物具有血栓分解活性；消化改善活性；腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療活性；及抗氧化活性；從而可知可用作血栓分解用藥品及食品；消化改善用藥品及食品；腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用藥品及食品；或抗氧化用藥品及食品(或健康功能食品)。
具體而言，上述血栓分解用組成物可藉由血栓分解作用而有效地預防或治療心肌梗塞、脈血栓症、腦中風、腦梗塞、腦血栓症或腦塞栓症。
本申請案的組成物可根據目標方法而進行口服或非口服(例如，應用於靜脈內、皮下、腹腔內或身體局部)，具體而言，可口服。
於本申請案的組成物用作醫藥組成物的情形時，為了投用，除本申請案的菌株或穀物醱酵物以外，可更包括於醫藥學上可容許的一種以上的載劑。於醫藥學上可容許的載劑可使用鹽水、滅菌水、林格氏液、緩衝鹽水、葡萄糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇及混合這些成分中的一種成分以上而使用，可視 需要而添加抗氧化劑、緩衝液、抑菌劑等其他通常的添加劑。再者，可更添加稀釋劑、分散劑、界面活性劑、結合劑及潤滑劑而製劑化成如水溶液、懸浮液、乳濁液等的注射用劑型、丸藥、膠囊、顆粒或錠劑。進而，可利用糖領域的適當的方法或雷明頓醫藥科學(22nd)((Remington's Pharmaceutical Science(22nd))、馬克出版公司(Mack Publishing Company)、伊斯頓(Easton PA)中所揭示的方法而根據各疾病或成分來製劑化。
本申請案的醫藥組成物可單獨使用、或與手術、激素治療、藥物治療及使用生物學反應調節劑的方法併用。
作為又一實施方式，本申請案提供一種包括對需進行投用的個體(subject)投用利用解澱粉芽孢桿菌BA245菌株或上述菌株而製備的穀物醱酵物及於醫藥學上或食品學上容許的載劑的組成物，且治療、改善或預防因血栓引起的疾病；改善消化功能；預防、改善或治療腸炎、腸膜弱化或腸損傷；或減少活性氧的方法。可藉由根據患者的體重、年齡、性別、健康狀態、飲食、投用時間、投用方法、排泄率及疾病的重症程度等而以各種投用量投用本申請案的組成物來實施本申請案的投用。本申請案的穀物醱酵物的每日投用量可為約0.0001mg/kg至600mg/kg、或約0.001mg/kg至500mg/kg，每日可分一次或多次投用。再者，本申請案的菌株能夠以5×104CFU/ml至5×108CFU/ml或1×106CFU/ml至1×108CFU/ml的量投用，每次可投用30ml至100ml或50ml至100ml，每日可投用一次至四次。
(a)本申請案提供一種澱粉分解酶活性及蛋白分解酶活性卓越的新穎的解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)BA245菌株(KCTC12905BP)、利用上述菌株製備穀物醱酵物的方法，包括上述菌株的穀物醱酵物、及包括上述菌株或上述穀物醱酵物的各種功能性組成物。
(b)於將上述菌株用作種菌而製備穀物醱酵物的情形時，上述穀物醱酵物因藉由碳水化合物及蛋白質的水解實現的低分子化、粗蛋白含量的增加、膳食纖維及必要游離胺基酸的增加等而有效地治療或預防因血栓引起的疾病、改善消化、腸炎、預防、改善或治療腸膜弱化或腸損傷、或發揮抗氧化作用。
(c)因此，可提供一種使用穀物醱酵物而可有助於營養素攝取、血栓溶解、改善消化、腸健康及抗氧化的高品質的藥品及食品(或健康食品)。
圖1a與圖1b是用以篩選可同時高產澱粉分解酶及蛋白分解酶的菌株的α-澱粉酶平板培養基(圖1a)及蛋白酶平板培養基(圖1b)的篩選結果。
圖2是表示基於16S rRNA基因鹼基序列的系統分類學上的親緣關係的系統發育樹(phylogenic tree)。
圖3是表示基於適於芽孢桿菌內菌株的系統分類的旋轉酶A基因鹼基序列的系統分類學上的親緣關係的系統發育樹(phylogenic tree)。
圖4是對BA245醱酵物的低分子肽的含量與原料及同類菌株BA474進行比較而分析的層析結果。
圖5是表示血栓分解活性的纖維蛋白平板分析結果。
圖6是表示纖維蛋白分解活性的柱狀圖。
圖7是BA245醱酵物為各含量時的腸通透性評估結果。
圖8是為了觀察腸膜強化程度而表示腸細胞的緊密連接蛋白即密連蛋白(Claudin)(圖8a)及緊連蛋白(Occludin)(圖8b)的表現程度的結果。
圖9是藉由對腸進行組織學上觀察而確認因攝取BA245醱酵物實現的腸上皮損傷的恢復程度的照片。
圖10是分別對穀物原料、BA245醱酵物及酶食品進行抗氧化活性(自由基消除能力)評估的結果。
以下，藉由實施例而更詳細地對本申請案進行說明。這些實施例僅用以更具體地說明本申請案，根據本申請案的主旨，於本申請案所屬的領域內具有常識者應明白，本申請案的範圍並不限制於這些實施例。
實施例1：高產澱粉分解酶及蛋白分解酶的菌株的篩選
本發明者等人為了分離澱粉分解酶及蛋白分解酶的生成能力優異的菌株，自各種傳統的醱酵食品(泡菜、醬類、酒麴、傳統酒及魚醬等)中分離約3000種微生物，試圖以其中的約1308種食品適宜性芽孢桿菌為中心而尋找澱粉分解酶及蛋白分解酶的表現較高的菌株。
於篩選高產澱粉分解酶及蛋白分解酶的菌株時，在分別含有1%(w/v)可溶性澱粉(Difco，USA)或2%(w/v)脫脂油(Difco，USA)的酵母麥芽(Yeast Malt，YM)瓊脂培養基(酵母萃取物(yeast extract)3.0g、麥芽萃取物(malt extract)3.0g、蛋白腖(peptone)5.0g、葡萄糖(dextrose)10.0g、瓊脂(agar)20.0g)中，對基質分解而產生的透明環的尺寸進行比較而篩選。
具體而言，於將菌株分別接種至胰蛋白腖大豆肉湯(Tryptone Soya Broth，TSB)培養基(酪蛋白酶消化物(enzymatic digest of casein)17.0g、大豆粉酶消化物(enzymatic digest of soybean meal)3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀(dipotassium phosphate)2.5g、葡萄糖(dextrose)2.5g、於25℃的最終pH值(final pH)：7.3±0.2)後，於37℃、200rpm的條件下培養12小時，以1.0μl為單位將培養液滴定(spotting)至含有可溶性澱粉及脫脂油的YM瓊脂培養基。於將上述瓊脂培養基於37℃下培養16小時後，測定形成於培養基上的透明環的直徑。
其結果顯示，1%(w/v)可溶性澱粉培養基的透明環直徑為5.85mm，2%(w/v)脫脂油(Difco，USA)培養基的透明環直徑為6.14mm，因此將澱粉分解酶活性及蛋白分解酶活性均優異的BA245菌株篩選為用以穀物醱酵的菌株(圖1a及圖1b)。
實施例2：BA245菌株的鑑定
2-1.BA245菌株的16S rRNA基因鹼基序列分析
為了鑑定於實施例1中篩選出的BA245菌株，委託韓國種菌協會附屬韓國微生物保存中心進行16S RNA基因的鹼基序列分析，獲得對鑑定而言重要的包括50bp至900bp的鹼基序列的1420bp(序列號1)的鹼基序列。再者，上述鹼基序列於美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)基因庫(GenBank)中獲得KR535604的寄存編號(Accession number)而登記於資料庫。
2-2.藉由BA245菌株的16S rRNA基因鹼基序列分析進行的系統發育樹分析
為了對BA245菌株進行系統分類學上的位置分析，利用登記於基因庫的鹼基序列數據調查芽孢桿菌屬內的位於接近BA245菌株的位置的多種標準菌株的16S rRNA基因鹼基序列，利用Bioedit程式(program)(Hall,1999)與Clustal X程式(program)(Thompson et al.,1997)對上述多種標準菌株的鹼基序列進行比對。追蹤菌株的進化過程的作業利用木村兩參數模型 (Kimura two-parameter model)(Kimura,1983)，藉由MEGA 3程式(Program)(Kumar et al.,2004)的鄰近歸併法(neighbor-joining)及最大簡約法(maximum parsimony)等方法確定系統分類學上的位置(圖2)。
2-3.根據BA245菌株的旋轉酶(gyrase)A(gyrA)基因鹼基序列進行的系統發育樹分析
利用基於旋轉酶A基因鹼基序列的系統分類學分析實施BA245菌株的鑑定。
為了分析旋轉酶A基因鹼基序列，於製備正向引子(序列號2：5'-CAG TCA GGA AAT GCG TAC GTC CTT-3')與反向引子(序列號3：5'-CAA GGT AAT GCT CCA GGC ATT GCT-3')後，委託Macrogen(股份有限公司)進行鹼基序列分析。調查位於接近BA245菌株的位置的多種標準菌株的旋轉酶A基因鹼基序列，利用Bioedit程式(Hall,1999)與Clustal X程式(Thompson et al.,1997)對上述多種標準菌株的旋轉酶A基因鹼基序列進行比對。追蹤菌株的進化過程的作業利用木村兩參數模型(Kimura,1983)，藉由MEGA 3程式(Kumar et al.,2004)的鄰近歸併法及最大簡約法等方法確定系統分類學上的位置(圖3)。
2-4.利用API試劑盒(kit)分析BA245的生化特性
利用使用於芽孢桿菌鑑定的API 50CH(bioMerieux Co.,France)調查解澱粉芽孢桿菌BA245菌株的生化特性。API 試劑盒按照製造公司的使用指南而如下所述般操作，將其結果示於以下的表1。
於將解澱粉芽孢桿菌BA245菌株接種至TSB(酪蛋白酶消化物17.0g、大豆粉酶消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、於25℃的最終pH值：7.3±0.2)液體培養基而於37℃下進行培養後，分株至菌管(Eppendorf)，之後於10,000rpm下離心分離5分鐘後回收細胞而利用滅菌鹽水(0.85%)清洗一次。細胞於接種至以滅菌蒸餾水懸浮而進行無菌處理的API 50CH培養基的安瓶後，進行移液而均勻地混合，之後以150μl為單位而分株至各試驗片的微管。於分株結束後，將API試劑盒於37℃的培養箱中培養24小時至48小時而觀察顏色的變化。
2-5.鑑定結果
綜合上述生化特性與系統分類學上的親緣關係的分析結果，結果將篩選出的上述BA245菌株鑑定為解澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)而命名為解澱粉芽孢桿菌BA245，根據布達佩斯條約，於2015年9月23日委託韓國生命工學研究院微生物資源中心(Korean Collection for Type Cultures， KCTC)而獲得寄存編號KCTC12905BP。
實施例3：利用BA245菌株的穀物醱酵物的製備
利用於實施例2中篩選出的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株(以下，記載為“BA245菌株”)製備如下所述的穀物醱酵物。
首先，於向穀物300g[麩殼；小麥胚芽；燕麥；玄米；藜麥；紅扁豆；糯麥；小麥胚芽與麩殼混合穀物(小麥胚芽60重量%與麩殼40重量%)及全穀物混合物(小麥胚芽40重量%、麩殼30重量%、燕麥10重量%、紅扁豆5重量%、玄米5重量%、糯麥5重量%與藜麥5重量%，以下，全穀物混合物記為“穀物原料”)分別為300g]添加水分後，在121℃下進行30分鐘蒸煮，冷卻至40℃以下。接著，將上述BA245菌株分別塗抹至TSB瓊脂培養基(酪蛋白酶消化物17.0g、大豆粉酶消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、瓊脂15.0g、於25℃的最終pH值：7.3±0.2)，於37℃下培養12小時而將菌株活化。將活化的菌株以約2鉑金環量懸浮於0.8%NaCl殺菌溶液9ml中(於A660nm下稀釋成0.2左右)，將上述懸浮液用作種菌。藉由如下方式進行正式培養：於將種菌懸浮液1%接種至預先準備的40ml的TSB培養基(酪蛋白酶消化物17.0g，大豆粉酶消化物3.0g、NaCl 5.0g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、於25℃的最終pH值：7.3±0.2)後，在37℃下以180rpm進行振盪培養。
於向將水分含量調整至36%而進行蒸煮所得的穀物中加入培養液30ml(6.0×107cfu/ml)而均勻地混合後，於在37℃下24小時保持恆濕的條件下實施靜置培養的固體醱酵，藉此製備穀物醱酵物。
再者，作為BA245菌株的對照組，使用相當於與BA245菌株同類的菌株即解澱粉芽孢桿菌BA474(以下，記載為“BA474菌株”)，利用上述BA474菌株醱酵所得的穀物醱酵物以全穀物混合物為原料而使用BA474菌株代替BA245菌株，除此之外，與實施例3相同地實施而製備。
實施例4：澱粉分解酶活性分析
為了對穀物醱酵物的澱粉分解酶活性進行分析而進行如下實驗。
於60℃的乾燥機中，對分別利用實施例3的BA245菌株及BA245菌株進行醱酵所得的穀物醱酵物進行乾燥直至水分含量成為10%以下，之後進行粉碎而用作測定澱粉分解酶活性的試料(以下，根據醱酵時所利用的菌株而將各穀物醱酵物記載為“BA245醱酵物”及“BA474醱酵物”，僅將使用全穀物混合物(小麥胚芽40重量%、麩殼30重量%、燕麥10重量%、紅扁豆5重量%、玄米5重量%、糯麥5重量%及藜麥5重量%)作為原料的情形以不記載原料的“BA245醱酵物”型式記載，於除此以外的將各穀物或小麥胚芽與麩殼混合穀物用作原料的情形時，在“BA245醱酵物”後端的括號內記載醱酵時所使用的原料)。藉 由“食品基準及標準”中的酶食品的α-澱粉酶試驗方法而測定澱粉分解酶活性。
具體而言，於精確地稱取各個試料5.0g而溶於水來調整成100ml後，進行過濾而設為試液，準備兩個20ml的試管而分別用作試驗用試驗管及空白試驗用試驗管。向試驗用試管中加入1%可溶性澱粉溶液5ml、麥克凡氏緩衝液(pH值為6.0)13ml與0.1%氯化鈣溶液1ml，以37℃進行加溫，加入試液1ml，之後於37℃下放置30分鐘而用作試驗用反應液。另外，與試驗用反應液相同地製備於100℃下加熱30分鐘而失去活性的試液1ml，將其用作空白試驗用反應液。將向上述試驗用反應液與空白試驗用反應液0.2ml加入碘試液10ml所得者用作試驗用液體，以水為對照液而於液體層1cm、波長660nm下測定吸光度。此時，試驗用液體的吸光度需較空白試驗用液體的吸光度小0.030以上。於顯色程度過大而難以進行測定的情形時，稀釋試液而進行試驗，應用稀釋倍數。藉由上述相同的碘(I2)溶液的呈色的標準曲線而算出澱粉含量，將α-澱粉酶1單位(Unit)定義為於30分鐘內消化10mg的澱粉的酶量。
其結果，如表2所示，確認到與作為對照組的BA474 醱酵物相比，BA245醱酵物及BA245醱酵物(小麥胚芽與麩殼的混合穀物)的澱粉分解酶活性非常優異。
實施例5：蛋白分解酶活性分析
為了對BA254醱酵物的蛋白分解酶活性進行比較，進行如下實驗。
於如實施例3所述獲得試料後，根據“食品基準及標準”中的酶食品的蛋白酶試驗法而進行測定。
於精確地稱取試料約5g而溶於水來調整為100ml後，進行過濾而用作試液。將0.6%酪蛋白溶液1ml加入試管，於37℃的恆溫水浴中進行加溫，之後向其中準確地加入試液1ml而均勻地搖晃混合，之後立即加入至37℃的恆溫水浴而準確地反應10分鐘，之後向其中加入0.4M三氯乙酸溶液2ml而再次於37℃下放置25分鐘，之後進行過濾。將過濾液1ml準確地量取至試驗管，加入0.4M碳酸鈉溶液5ml及孔蛋白試液(對原液進行三倍稀釋所得的液體)1ml而均勻地搖晃混合。於在37℃下放置20分鐘後，將顯色的液體用作試驗用液體。另外，準確地量取試液1ml而加入至試管，於37℃下放置10分鐘，之後加入0.4M三氯乙酸溶液2ml進行混合，加入0.6%酪蛋白溶液1ml而於37℃下放置25分鐘，之後與試驗用液體相同地進行操作而用作空白試驗用液體。以水為對照液而於液體層1cm、波長660nm下測定吸光度。此時，試驗用液體的吸光度需較空白試驗用液體的吸光度大0.030以上。於顯色程度過大而難以進行測定的 情形時，稀釋試液而進行試驗，應用稀釋倍數。利用酪胺酸(tyrosine)製作標準曲線，以測定到的酪胺酸含量為基準而對蛋白酶活性進行比較分析，將蛋白酶1單位定義為於一分鐘內生成的酪胺酸的量(以ug表示)。
其結果，如表3所示，確認到與作為對照組的BA474醱酵物相比，BA245醱酵物的蛋白分解酶活性非常優異。
根據上述實施例3與實施例4的結果，確認到可將BA245有效地用於製備包括醱酵效價較高的穀物醱酵物的酶食品。
實施例6：低分子量的蛋白質含量的分析
於實施例4中，確認到於利用BA245進行穀物醱酵時，製備出蛋白分解酶活性優異的穀物醱酵物，為了確認穀物內的蛋白質是否以經水解的肽形態生成或分解為低分子量的蛋白質，對BA245醱酵物的各分子量範圍的蛋白質含量進行分析。
準確地稱取上述實施例3的試料0.1g而以5ml的8M尿素(Urea)進行萃取。於在8,000rpm下進行離心分離10分鐘後，僅單獨地獲取上澄液，之後藉由0.22μm的針筒過濾器進行過濾而用作分析試料。注入(injection)量設為25μl，向50mM 的NaPO4(pH值為7.2)混合150mM的NaCl而用作移動相(mobile phase)。流速設為0.5ml/min，於214nm的紫外線(Ultraviolet，UV)波長下進行檢測(detection)。
其結果，可確認到BA245醱酵物的尺寸較小的蛋白質分子側的峰值面積較穀物原料及BA474醱酵物更大，從而蛋白質的密度偏重於中央帶側(圖4)。於圖4的層析圖上，左側帶為分子量較大的蛋白質，中央帶為分子量較小的蛋白質，右側帶表示溶劑。將圖4的層析圖數值化而進行比較的結果如下述表4。
根據上述結果，可確認到藉由利用BA245的醱酵而原料(例如，穀物原料)中的分子量較大的蛋白質水解成分子量較小的蛋白質，水解程度亦明顯優於BA474。
實施例7：營養成分分析
於利用BA245菌株使穀物醱酵時，碳水化合物含量減小、膳食纖維含量增加以及粗蛋白及必需游離胺基酸的含量增加，因此為了確認營養成分增加及營養素吸收率增加，委託韓國功能食品研究院對穀物原料、BA245醱酵物、BA474醱酵物及三家公司市售的將穀物醱酵而成的酶食品[醱酵酶的秘密， DAESANG Wellife(以下，記載為“DAESANG”)；種子醱酵酶，LG生活健康(以下，記載為“LG”)；FullVita naemomae穀類酶消化物，Orga Whole Food(以下，記載為“pulmuone”)]進行營養成分分析。
其結果，如表5及表6所示，確認到與原料相比，利用BA245的穀物醱酵物的碳水化合物及糖含量減少、膳食纖維、粗蛋白及必需游離胺基酸增加等而營養成分得到強化，BA245穀物醱酵物及BA245穀物醱酵物(小麥胚芽與麩殼的混合穀物)於與BA474醱酵物及其他酶食品進行比較的結果中，亦確認到於營養成分方面更有優勢。
實施例8：纖維蛋白分解酶(fibrinolytic enzyme)的活性分析
為了確認BA245醱酵物的血栓分解活性，測定穀物原料及BA245醱酵物的纖維蛋白分解酶活性。作為對照組，使用胞 漿素(plasmin，1U/ml)及據稱具有血栓溶解活性的清曲醬(Taekwang)、納豆(pulmuone，ASMA及TAKANO)及市售的酶食品(DAESANG；Hi-Saeng，Himo(股份有限公司)自然健康事業部)。
於將試料1g混合至9ml的滅菌生理鹽水後，使用攪拌機(Wiseshaker，Daihan)以4℃混合30分鐘而萃取，於實施離心分離(8000×g，4℃，30分鐘)後，進行過濾而將上澄液用作分析試料。
8-1.纖維蛋白平板分析(Fibrin plate assay)
於向完全溶解的2.4%纖維蛋白溶液(pH值為7.0)10ml添加1.5%瓊脂糖溶液10mL而進行混合後，立即倒入至培養皿，於室溫下放置2小時至3小時以使凝膠完全凝固而製備纖維蛋白平板。於按照直徑為4.5mm的孔固定地對製備出的纖維蛋白平板進行沖孔後，將分析試料20μl滴加至各孔而於37℃下培養24小時。為了可清晰地觀察到所生成的透明環的尺寸，將0.11M三氯乙酸倒入至纖維蛋白凝膠。
其結果，確認到BA245醱酵物與胞漿素相比，表現出220%的血栓分解活性，與清曲醬相比，表現出177%的血栓分解活性，與納豆相比，分別表現出122%(pulmuone)、117%(TAKANO)及131%(ASMA)的血栓分解活性，與酶食品相比，表現出119%(DAESANG)及142%(Hi-Saeng)的血栓分解活性(表7及圖5)。
8-2.纖維蛋白分解活性(Fibrinolytic activity)的分析
向於實施例8中製備的試料0.1ml加入含有10mM的氯化鈣的0.1M Tris-HCl緩衝液(pH值為7.8)0.3ml，於30℃的恆溫水浴中加溫5分鐘。於向上述溶液添加1.2%纖維蛋白溶液(pH值為7.8)0.3ml而進行混合後，在30℃下反應10分鐘，之後加入0.11M三氯乙酸溶液0.6ml來抑制酶反應而用作試驗用液體。另外，向試料0.1ml加入0.1M Tris-HCl緩衝液(pH值為7.8)0.3ml而於30℃的恆溫水浴槽中反應10分鐘，之後加入0.11M三氯乙酸溶液0.6ml而混合，加入1.2%纖維蛋白溶液(pH值為7.8)0.3ml而用作空白試驗用液體。試驗用液體與空白試驗用液體於進行離心分離(12000rpm，5分鐘)後，回收上澄液而於275nm下測定吸光度來定量地對血栓分解酶活性進行比較。
其結果，確認到以BA245醱酵的穀物醱酵物內的纖維 蛋白分解活性最優異，同時亦明顯高於納豆(表8及圖6)。
8-3.BA245菌株的纖維蛋白分解活性分析
為了分析菌株本身的纖維蛋白分解活性，對BA245菌株與自市售的納豆中分離的3種菌株進行比較。
其結果，如表9所示，確認到BA245菌株的血栓分解酶活性明顯優於自市售的納豆中分離的菌株。
實施例9：藉由供給BA245醱酵物而改善固體成分的胃排空能力(gastric emptying)的評估
對各實驗組分配10隻8週齡的雄性史-道二氏(Sprague-dawley，SD)大鼠，對所有大鼠進行一週的實驗膳食及 環境適應。於適應後，為了測定胃排空能力，使大鼠節食20小時，但可自由飲水。
實驗例1於供給相同的固體成分的條件下，對相同的單位時間的胃排空能力進行評估。具體而言，於實驗當天，給SD大鼠口服硫酸鋇50%、瓊脂糖0.6%、飼料(AIN-93，Dyets)懸浮於水所得的實驗膳食3g。實驗組共為3組，向對照組供給飼料15%，向實驗組供給調配穀物原料5%+飼料10%、BA245醱酵物5%+飼料10%所得的膳食，使所供給的固體成分的量相同。於投用40分鐘後，摘取胃而測定殘留於胃內的膳食的重量來評估胃排空能力(%)。
實驗例2是於實際人體中反映服用法的模型，供給相同量的飼料，於更供給BA245醱酵物時，對胃排空能力的改善進行清穀，此時人體等效投用量(human equivalent dose)為大鼠基準的6倍。作為對照組，供給飼料15%，實驗組分別更供給穀物原料600mg/kg、BA245醱酵物600mg/kg。與實驗例1相同，投用40分鐘後摘取胃而測定殘留於胃內的膳食的重量來評估胃排空能力(%)。
其結果，於實驗例1中，確認到與單獨供給飼料及穀物原料的組相比，於投用BA245醱酵物時，胃排空能力顯著增加(p<0.05)(表10)，於實驗例2中，確認到與供給穀物原料的組相比，胃排空能力亦顯著增加(p<0.05)(表11)。
於臨床上，已知胃排空能力為因功能性消化不良而下 降的因素，可評估為於連同膳食一併攝取BA245醱酵物，可改善消化能力。
實施例10：於急性腸炎動物模型中，評估藉由攝取BA245醱酵物實現的腸通透性的改善
對大鼠投用酒精而製作急性腸炎動物模型，餵食攝取濃度不同的BA245醱酵物而測定與攝取量對應的腸功能恢復程度。
使用的動物為8週齡的200g至250g重量的SD大鼠，於聚碳酸酯籠中，以每12小時改變一次的明暗週期進行飼養。於適應1週後，進行自由膳食而根據下述實驗設計進行處理。
組1：對照組
組2：乙醇
組3：乙醇+BA245醱酵物50mg/kg/day
組4：乙醇+BA245醱酵物100mg/kg/day
組5：乙醇+BA245醱酵物150mg/kg/day
組6：乙醇+穀物原料100mg/kg/day
組2至組6口服酒精4週而誘發過敏性大腸綜合症，使腸功能下降。初期投用量為2g/kg/day。此時，口服的酒精量是每週增加1g/kg/day，於最後的第4週，口服5g/kg/day。於經過4週後，測定腸通透性。
具體而言，藉由如下方式測定腸通透性：將於使大鼠犧牲後分離的回腸浸泡至Krebs-Henseleit重碳酸鹽緩衝液(KHBB：bicarbonate buffer)，之後縫合腸的一側末端，向內腔(lumen)注入100μl的螢光異硫氰酸鹽(Fluorescein Isothiocyanate，FITC)-葡聚糖(dextran)。縫合腸的剩餘的末端而形成8cm的腸袋(gut sac)。於利用KHBB進行清洗後，將腸袋放置至2mL的KHBB中而於37℃下培育20分鐘。利用分光光度計(spectrophotometer)於530nm下測定自內腔通過培育液的FITC-葡聚糖的FD-4。以每分鐘1cm的量(μg)表示FD-4的通透性。
其結果，確認到藉由供給BA245醱酵物而因投用酒精增加的腸通透性顯著減少，特別是，於每kg投用100mg以上的組中，可確認到恢復至接近正常組(圖7)。
實施例11：利用急性腸炎動物模型分析藉由攝取BA245醱酵物實現的腸膜強化
若因腸膜弱化而導致腸液洩漏時，會誘發漿液性炎症(Serous inflammation)，於實施例10中，為了活用所設計的動物模型定量地測定因酒精增加的腸通透性的恢復程度，對與腸通透性有關的腸細胞的緊密連接蛋白(tight junction protein)進行分析。代表性的參與腸膜的細胞結合的主要緊密連接蛋白為ZO-1、密連蛋白(claudin)、緊連蛋白(occludin)，藉由定量反轉錄聚合酶鏈反應(quantitative Real Time-polymerase Chain Reaction，qRT-PCR)分析而測定與各蛋白質對應的基因的表現程度，確認腸細胞間的結合程度而確認醱酵物的攝取效應。於萃取核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)時，利用三賽唑，利用分光光度計(nanodrop spectrophotometer)測定濃度。
其結果，確認到密連蛋白及緊連蛋白的表現與BA245醱酵物投用及供給濃度成正比地增加，從而強化腸膜(p<0.05)(圖8a及圖8b)。
實施例12：根據腸的組織學上的分析而評估藉由攝取BA245醱酵物實現的結構損傷緩和程度
活用於實施例10中設計的動物模型執行腸的組織學上的檢查。將自各組中取樣的腸組織固定至10%福馬林溶液，利用乙醇進行脫水，之後固定至石蠟。向4μm厚壁(thick section)執行蘇木精-伊紅(hematoxylin-Eosin)染色，藉由顯微鏡觀察經 染色的各個切片。
可確認到若因酒精而腸受損，則腸壁的隱窩(crypt)與絨毛(villus)結構崩解，可於BA245醱酵物攝取組、特別是每kg攝取100mg以上的組中觀察到恢復至接近正常組織的情況(圖9)。
實施例13：BA245醱酵物的抗氧化活性測定
已知抗氧化活性可控制因氧化應力誘發的各種疾病(防止脂質及氧化物堆積、酶鈍化、細胞老化、動脈硬化、糖尿病、腦中風、癌症、去氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)合成減少、成人病及老化等)。對此，對穀物原料、BA245醱酵物及市售的兩種酶食品(DAESANG及Hi-Saeng)進行比較。
具體而言，於以1：9的比率混合試料與70%乙醇(試料：70%乙醇=1：9)後，使用攪拌機(Wiseshaker,Daihan)於30℃下混合3小時而萃取。於對上述混合物進行離心分離(8000×g，4℃，10分鐘)後，單獨回收上澄液，反覆進行相同的過程而進行萃取，之後對最終回收的上澄液進行過濾。過濾所得的上澄液於使用凍結乾燥機將溶劑完全乾燥後，將乾燥物用作分析試料。
將試料10mg完全溶解至70%乙醇1ml而用作試驗液。在將38.5mg的2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azinobis(3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic Acid)Diammonium Salt，ABTS)與6.6mg的過硫酸鉀(Potassium persulfate)分別溶解混合至5ml的蒸餾水以形成ABTS溶液後，在暗室條件下反應12小時至16小時而生成自由基。此後，於734nm下實現0.7±0.02的吸光度而製備ABTS溶液。
於向10μl的試驗液加入990μl的ABTS溶液而混合後，在暗室中反應10分鐘，之後測定734nm下的吸光度。於將所有實驗反覆實施3次以上後，求出平均值與標準偏差。
其結果，確認到BA245醱酵物的自由基消除能力為43.7%，明顯高於穀物原料及市售的酶食品(圖10)。藉此，可知利用BA245菌株進行醱酵時，抗氧化活性增加，抗氧化活性亦優於先前的兩種酶食品。
【生物材料寄存】
[國內寄存資訊]
寄存機構：財團法人食品工業發展研究所
寄存編號：BCRC910766
寄存日期：20170125
[國外寄存資訊]
寄存機構：韓國微生物保存中心
寄存編號：KCTC12905BP
寄存日期：20150917
<110> CJ第一製糖
<120> 解澱粉芽孢桿菌、穀物醱酵物、其製備方法及其用途、食品組成物、血栓分解用組成物、消化改善用組成物、腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物及抗氧化用組成物
<130> P16-6180
<150> KR 15/0148663
<151> 2015-10-26
<160> 3
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 1420
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 解澱粉芽孢桿菌BA245的16S rRNA
<400> 1
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引子
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引子
<400> 3

Claims (25)

  1. 一種寄存編號為KCTC12905BP(BCRC910766)的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株。
  2. 一種穀物醱酵物的製備方法，其包括如下步驟：(a)將寄存編號為KCTC12905BP(BCRC910766)的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株接種至穀物的步驟；及(b)培養所述菌株而獲得穀物醱酵物的步驟。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的穀物醱酵物的製備方法，其中所述步驟(a)的所述穀物包括選自由小麥、小麥胚芽、麩殼、白米、玄米、發芽玄米、大麥、燕麥、紅米、黑糯米、糯米、米糠、大豆、藥豆、黑豆、藜麥、紅扁豆及薏苡所構成的族群中的一種以上的穀物。
  4. 如申請專利範圍第2項所述的穀物醱酵物的製備方法，其中所述步驟(a)的所述穀物包括小麥胚芽及麩殼。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的穀物醱酵物的製備方法，其中以所述步驟(a)的所述穀物為100重量份，包括40重量份至100重量份的所述小麥胚芽及所述麩殼。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的穀物醱酵物的製備方法，其中所述步驟(a)的所述穀物更包括選自由燕麥、紅扁豆、玄米、糯麥及藜麥所構成的族群中的一種以上的穀物。
  7. 如申請專利範圍第2項所述的穀物醱酵物的製備方法，其中所述步驟(a)的所述穀物為水分含量為30%(體積/重 量)至70%(體積/重量)的穀物。
  8. 如申請專利範圍第2項所述的穀物醱酵物的製備方法，其於所述步驟(a)前，更包括對所述穀物進行水分處理的步驟。
  9. 如申請專利範圍第2項所述的穀物醱酵物的製備方法，其於所述步驟(a)前，更包括對所述穀物進行熱處理的步驟。
  10. 如申請專利範圍第2項所述的穀物醱酵物的製備方法，其於所述步驟(a)前，更包括於對穀物進行水分處理後，進行熱處理的步驟。
  11. 如申請專利範圍第2項所述的穀物醱酵物的製備方法，其中於所述步驟(b)中，所述培養為固體培養。
  12. 如申請專利範圍第2項所述的穀物醱酵物的製備方法，其中於所述步驟(b)中，在20℃至50℃的溫度下實施所述培養。
  13. 一種穀物醱酵物，其包括寄存編號為KCTC12905BP(BCRC910766)的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株。
  14. 如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物，其藉由如申請專利範圍第2項所述的方法而製備。
  15. 一種食品組成物，其包括如申請專利範圍第1項所述的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株或如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的食品組成物，其中所述食品組成物為酶食品。
  17. 一種血栓分解用組成物，其包括如申請專利範圍第1項所述的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株或如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的血栓分解用組成物，其為心肌梗塞、脈血栓症、腦中風、腦梗塞、腦血栓症或腦塞栓症的預防、改善或治療用組成物。
  19. 一種消化改善用組成物，其包括如申請專利範圍第1項所述的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株或如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物。
  20. 一種腸炎、腸膜弱化或腸損傷的預防、改善或治療用組成物，其包括如申請專利範圍第1項所述的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株或如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物。
  21. 一種抗氧化用組成物，其包括如申請專利範圍第1項所述的解澱粉芽孢桿菌BA245菌株或如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物。
  22. 一種如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物之用途，其係用於製備預防、改善或治療個體的心肌梗塞、脈血栓症、腦中風、腦梗塞、腦血栓症或腦塞栓症之藥物。
  23. 一種如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物之用途，其係用於製備改善個體的消化功能之藥物。
  24. 一種如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物之用途，其係用於製備預防、改善或治療腸炎、腸膜弱化或腸損傷之藥物。
  25. 一種如申請專利範圍第13項所述的穀物醱酵物之用途，其係用於製備於個體中減少活性氧之藥物。
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