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TWI632369B - 用於測定細胞中神經毒素多肽之生物活性的工具及方法 - Google Patents

用於測定細胞中神經毒素多肽之生物活性的工具及方法 Download PDF

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TWI632369B
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Abstract

本發明係有關於用於直接測定神經毒素多肽在細胞中的生物活性之一種方法，其步驟包括：a)在容許神經毒素多肽展現其生物活性之一段時間及條件下，將易受神經毒素毒害的細胞與一種神經毒素多肽一起培養；b)固定細胞，及選擇性地用一種清潔劑使細胞透化；c)在容許該捕獲抗體與該受質結合的條件下，讓細胞與至少一種第一捕獲抗體接觸，該第一捕獲抗體係以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質，及讓細胞與至少一種第二捕獲抗體接觸，該第二捕獲抗體接觸係以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點；d)在容許該第一檢測抗體與該第一捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第一捕獲抗體之至少一種第一檢測抗體接觸，從而形成第一檢測複合體；及在容許該第二檢測抗體與該第二捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第二捕獲抗體之至少一種第二檢測抗體接觸，從而形成第二檢測複合體；e)測定步驟d)中之第一與第二檢測複合體的量，及f)藉由第二檢測複合體，計算該神經毒素多肽在該細胞中所剪切的受質之量，藉此測定該神經毒素多肽在該細胞中的生物活性。本發明進一步提供用於進行本發明的方法之一套組。

Description

用於測定細胞中神經毒素多肽之生物活性的工具及方法
本發明係有關於用於直接測定神經毒素多肽在細胞中的生物活性之一種方法，其步驟包括：a)在容許神經毒素多肽展現其生物活性之一段時間及條件下，將易受神經毒素毒害的細胞與一種神經毒素多肽一起培養；b)固定細胞，及選擇性地用一種清潔劑使細胞透化；c)在容許該捕獲抗體與該受質結合的條件下，讓細胞與至少一種第一捕獲抗體接觸，該第一捕獲抗體係以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質，及讓細胞與至少一種第二捕獲抗體接觸，該第二捕獲抗體接觸係以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點；d)在容許該第一檢測抗體與該第一捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第一捕獲抗體之至少一種第一檢測抗體接觸，從而形成第一檢測複合體；及在容許該第二檢測抗體與該第二捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第二捕獲抗體之至少一種第二檢測抗體接觸，從而形成第二檢測複合體；e)測定步驟d)中之第一與第二檢測複合體的量，及f)藉由第二檢測複合體，計算該神經毒素多肽在該細 胞中所剪切的受質之量，藉此測定該神經毒素多肽在該細胞中的生物活性。本發明進一步提供用於進行本發明的方法之一套組。
肉毒桿菌(Clostridium botulinum)與破傷風桿菌(Clostridium tetani)分別產生非常強效的神經毒素，即肉毒桿菌毒素(BoNT)與破傷風毒素(TeNT)。該等桿菌神經毒素(CNT)以特異性方式與神經元細胞結合，而中斷神經傳導物質之釋出。各毒素係以不活化及未經處理之約150kDa的單鏈蛋白形式合成。轉譯後的處理涉及形成雙硫鍵及細菌蛋白酶之有限的蛋白分解作用(切斷作用)。活化型神經毒素係由二鏈所組成，一為約50kDa的N端輕鏈，另一為約100kDa的重鏈，二鏈係由一個雙硫鍵連接。CNT在結構上與功能上係由三個域所組成，亦即催化性輕鏈、涵蓋易位域之重鏈(N端半段)及受體結合域(C端半段)；如見Krieglstein於1990年期刊“Eur.J.Biochem.”第188期第39頁乙文；Krieglstein於1991年期刊“Eur.J.Biochem.”第202期第41頁乙文；Krieglstein於1994年期刊“J.Protein Chem.”第13期第49頁乙文。肉毒桿菌神經毒素係以分子複合體的形式合成，其中包括150kDa的神經毒素蛋白及相關的非毒性蛋白。複合體的大小依桿菌菌株及獨特的神經毒素血清型而異，可為300kDa、大於500kDa及為900kDa。該等複合體中的非毒性蛋白使得該神經毒素安定，及保護該神經毒素免於降解作用；參見Silberstein於2004年期刊“Pain Practice”第4期 第S19-S26頁乙文。
肉毒桿菌(Clostridium botulinum)分泌七種在抗原上獨特的血清型，及稱為肉毒桿菌神經毒素(BoNT)A型至G型。所有血清型以及破傷風桿菌(Clostridium tetani)所分泌的相關破傷風神經毒素(TeNT)皆為Zn2+-內切蛋白酶，其藉由切斷SNARE蛋白而阻斷突觸胞吐作用；見Couesnon於2006年期刊“Microbiology”第152期第759頁乙文。CNT引發在肉毒桿菌中毒與破傷風中所見之弛緩性肌肉麻痺；見Fischer於2007年期刊“PNAS”第104期第10447頁乙文。
儘管其毒性效應，肉毒桿菌毒素複合體已被使用作為多種疾病的治療劑。美國於1989年核准肉毒桿菌毒素血清型A用於治療人類的斜視、瞼痙攣及其他疾患。可取得市售的肉毒桿菌毒素A(BoNT/A)蛋白製劑商品，例如商品名為BOTOX(愛力根(Allergan)有限公司)或商品名為DYSPORT/RELOXIN(益普生(Ipsen)公司)。市售商品XEOMIN(梅爾茨製藥(Merz Pharmaceuticals)公司)是一種改良、不含複合體的肉毒桿菌毒素A型製劑。就治療上的應用而言，係將該製劑直接注射至待治療的肌肉中。在生理pH值時，毒素從蛋白複合體中釋出，及產生所欲的藥理效應。肉毒桿菌毒素的效果只是暫時的，因此可能需要重複施打肉毒桿菌毒素，方能維持治療治療效果。
桿菌神經毒素削弱隨意肌的肌力，而為斜視、包括頸肌張力異常症在內的局部肌張力不全症及良性自發性瞼痙攣的有效療法。已顯示其等亦可紓解面肌痙攣及局部 痙攣，此外，桿菌神經毒素也在廣泛種類的適應症中有功效，諸如腸胃疾病、多汗症及美容除皺；見Jost於2007年期刊“Drugs”第67期第669頁乙文。
在桿菌神經毒素的生產製程中，該神經毒素的定性與定量測定以及生物活化型神經毒素多肽的品質管制特別重要。此外，政府機關只接受簡單、可靠和經過驗證的肉毒桿菌毒素活性分析法。目前，製藥廠商用來分析其等製劑的效力之“黃金準則”是一種致死性試驗，即小鼠LD50生物分析法；見Arnon等人於2001年期刊“JAMA”第285期第1059-1070頁乙文。然而，近年來，已大量投入尋求替代方法來減輕對於動物試驗的需求，並減少所有相關缺點、成本及與這類型動物式試驗相關的道德問題。此外，此外，主管機構也敦請製藥公司在測試肉毒桿菌神經毒素的效力時，採取“3R”原則：“減量、精確、替代”；見Straughan於2006年期刊“Altern.Lab.Anim”第34期第305-313頁乙文。因此，研發出細胞式測試系統，及提供作為活動物式方法之合理替代方法。然而，截至目前為止，用於測定神經毒素生物活性的細胞式測試系統中，只有三種對於神經毒素多肽的靈敏度夠高。該等細胞式測試系統包括使用從囓齒動物胚胎所分離及在試管內分化的初級神經元(Pellett等人(2011年)於期刊“Biochem.Biophys.Res.Commun.”第404期第388-392頁乙文)；誘發型多潛能幹細胞所分化的神經元(Whitemarsh等人(2012年)於期刊“Toxicol.Sci.”第126期第426-35頁乙文)；及SiMa細胞系的次選殖殖株(WO 2010/ 105234 A1)。
然而，需要宰殺動物才能分離出初級神經元，這是費力又費時的。此外，測試系統因所採用的初級神經元不同，而顯出大幅的變異。同樣地，要從誘發型多潛能幹細胞分化出神經元是困難與費時的。此外，如何儲存該等細胞也是個問題。採用腫瘤細胞系之分析法對於BoNT的靈敏度往往不足。此外，該腫瘤細胞系需要複雜的分化程序，而導致採用該細胞系之分析法的大幅變異及/或高失敗率。
技藝中所述用於測定桿菌神經毒素的生物活性之分析法包括西方印漬分析，其中藉由細胞溶胞產物中之經剪切型神經毒素受質的量而量化神經毒素的活性。在其他分析法中，藉由電化學發光(ECL)雙抗體夾心ELISA測量桿菌神經毒素的活性；見WO 2009/114748 A1。此外，在該案例中，從細胞溶胞產物中分離出經剪切型桿菌神經毒素受質之後，藉由檢測該受質而測定桿菌神經毒素的生物活性。此外，在上述二種分析法中，神經毒素受質必須進行濃縮。
鑑於上述情況，亟需政府機關認可的其他測試系統，以用於測定神經毒素多肽活性及/或提供作為替代動物式測試系統之用。
因此，可將本發明所面臨的技術問題視為提供與上述需求相符的工具及方法。在實施例中解決了該技術問題，而實施例的特徵係如申請專利範圍及本申請案後續所 述。
在第一部分中，本發明係有關用於直接測定神經毒素多肽在細胞中的生物活性之一種方法，其步驟包括：a)在容許神經毒素多肽展現其生物活性之一段時間及條件下，將易受神經毒素毒害的細胞與一種神經毒素多肽一起培養；b)固定細胞，及選擇性地用一種清潔劑使細胞透化；c)讓細胞與至少一種第一捕獲抗體接觸，該第一捕獲抗體係以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質，及在容許該捕獲抗體與該受質結合的條件下，讓細胞與至少一種第二捕獲抗體接觸，該第二捕獲抗體接觸係以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點；d)在容許該第一檢測抗體與該第一捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第一捕獲抗體之至少一種第一檢測抗體接觸，從而形成第一檢測複合體；及在容許該第二檢測抗體與該第二捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第二捕獲抗體之至少一種第二檢測抗體接觸，從而形成第二檢測複合體；e)測定步驟d)之第一與第二檢測複合體的量；及f)藉由第二檢測複合體，計算該神經毒素多肽在該細胞中所剪切的受質之量，藉此測定該神經毒素多肽在該 細胞中的生物活性。
本發明的方法得以直接測定神經毒素多肽在細胞中的生物活性。不同於技藝中所述之方法，本發明的方法不再需要裂解細胞及從細胞溶胞產物中分離或濃縮經剪切的神經毒素受質。例如，在技藝中之西方印漬分析式的分析法中，藉由在SDS聚丙烯醯胺凝膠中分離與濃縮個別試樣的組分，而濃縮神經毒素受質。上文所提及之技藝中所述的ECL雙抗體夾心ELISA，係在細胞溶胞產物的微量滴定平皿上，藉由使用以特異性方式結合經剪切型神經毒素受質之抗體，而進行神經毒素受質的濃縮作用。藉由與所述抗體結合，將經剪切的神經毒素受質從溶胞產物中分離，而濃縮該經剪切的桿菌神經毒素受質。反之，在本發明的方法中，可直接在細胞中檢測經剪切的神經毒素受質，如SNAP-25所例示。為此，如本申請案他處更詳細界定之易受神經毒素毒害的細胞，係在容許神經毒素多肽展現其生物活性之一段時間及條件下，與一種神經毒素多肽一起培養。在下一個步驟中，例如藉由添加一種固定劑諸如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或所述固定劑的混合物，將細胞固定。選擇性地，可藉由使用如本申請案他處所界定之至少一種清潔劑諸如曲拉通(Triton)X-100、妥文(Tween)20、皂素、毛地黃皂苷或正辛基-ß-葡哌喃糖苷，而使細胞透化。可將該清潔劑納入一種適當的緩衝劑諸如PBS中。之後，在容許該捕獲抗體與該受質結合的條件下，讓細胞與至少一種第一捕獲抗體接觸，該第一捕獲抗體接觸係以特異性方式結 合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質；及讓細胞與至少一種第二捕獲抗體接觸，該第二捕獲抗體係以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點。在本申請案中，第一捕獲抗體可藉由以特異性方式結合一個同時存在於未經剪切型與經神經毒素剪切型神經毒素受質中的適當抗原決定位，而測定細胞中的神經毒素受質總含量或量。第二捕獲抗體辨識並以特異性方式結合僅存在於經剪切型神經毒素受質中的一個抗原決定位，例如，藉由以特異性方式結合神經毒素受質中的神經毒素剪切位點。任擇地，細胞可與該第一與第二捕獲抗體的混合物接觸；亦即在所述條件下，細胞同時與至少一種第一捕獲抗體及至少一種第二捕獲抗體接觸。在下一步驟中，在容許該第一檢測抗體與該第一捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第一捕獲抗體的至少一種第一檢測抗體接觸，從而形成第一檢測複合體。在後續步驟中，在容許該第二檢測抗體與該第二捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第二捕獲抗體的至少一種第二檢測抗體接觸，從而形成第二檢測複合體。任擇地，細胞可與該第一與第二檢測抗體的混合物接觸；亦即在所述條件下，細胞同時與至少一種第一檢測抗體及至少一種第二檢測抗體接觸。任擇地，在細胞透化作用後，在所述條件下，其等可同時與該第一與第二捕獲抗體及該第一與第二檢測抗體的混合物接觸。在下一步驟中，測定第一與第二檢測複合體的量。最後，藉由第二檢測複合體，計算該神經毒素多肽在該細胞中所 剪切的受質之量。藉此，直接測定該神經毒素多肽在細胞中的生物活性。
在下文中，更詳細地說明本發明的方法。就細胞培養而言，首先將如本申請案所界定之易受神經毒素毒害的細胞，諸如神經元細胞、SiMa細胞或iPS衍生型神經元，接種至96孔微量滴定平皿。例如依據WO 2010/105234中所揭露之程序，讓SiMa細胞分化成一種神經元表現型；及例如依據WO 2012/135621中所述之分析法，讓iPS衍生型神經元分化成一種神經元表現型。然後，讓細胞接觸一種神經毒素多肽諸如BoNT/A約72小時。在後續步驟中，在ELISA分析法之前，將細胞固定在微量滴定平皿上。就細胞的固定作用而言，例如可在-20℃，在細胞上添加冰冷甲醇(-20℃)達20分鐘。
在進行ELISA分析法時，首先清洗細胞。可使用例如位於10mM PBS緩衝劑(pH 7.4)中的0.1%曲拉通(Triton)X-100作為清洗緩衝液。之後，藉由驟冷緩衝液諸如位於10mM PBS(pH 7.4)中的0.6%過氧化氫，將內源性蛋白酶驟冷，接著進行另一清洗步驟。在下一個步驟中，藉由一種適當的阻斷緩衝劑諸如位於10mM PBS緩衝劑(pH 7.4)中的2% BSA及0.05%曲拉通(Triton)X-100，阻斷微量滴定平皿上尚未結合的位點。然後，藉由使用一種適當的清潔劑，使細胞透化。可使用例如位於10mM PBS緩衝劑中的0.5%曲拉通(Triton)X-100作為透化緩衝液。透化作用使抗體得以擴散通過在細胞中所形成的孔洞。之後，藉由上述的清洗緩 衝液清洗細胞。
在下一步驟中，經透化的細胞例如與二種不同抗體的混合物一起培養。該混合物包括以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質之一種第一捕獲抗體及以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點之一種第二捕獲抗體。該第一與第二捕獲抗體亦可依序施加。例如，第一捕獲抗體能同時以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型SNAP-25，藉此得以測定在細胞中的SNAP-25總量或含量。此外，在進行如本申請案中所述的評估作用之際，該第一捕獲抗體可用於進行細胞中經剪切型SNAP-25的量之正規化。第二捕獲抗體以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點，因此得以測定及檢測經剪切的神經毒素受質，諸如經BoNT/A剪切的SNAP-25。
接著，在本發明的方法中，可直接在微量滴定平皿或細胞培養皿亦即在細胞內，檢測總神經毒素受質及經神經毒素剪切的神經毒素受質。不同於技藝中所述之方法，有利地，本發明的方法因此不需製備細胞萃取物及從細胞溶胞產物中分離及/或濃縮神經毒素受質。之後，清洗細胞，除去未與個別抗原結合的過量抗體。在後續步驟中，經透化的細胞與至少一種第一檢測抗體及至少一種第二檢測抗體接觸。該等抗體能以混合物的形式同時施加，或依序施加。第一檢測抗體係以特異性方式結合第一捕獲抗體。藉此，形成第一檢測複合體。第一檢測抗體可被導向對抗衍 生第一捕獲抗體之物種。例如，在使用兔多株抗SNAP-25抗體S9684(西克瑪(Sigma)公司)作為第一捕獲抗體及以特異性方式結合未經剪切型及經BoNT/A剪切型受質SNAP-25之情況下，可使用抗兔鹼性磷酸酶複合抗體作為第一檢測抗體。第二檢測抗體係以特異性方式結合第二捕獲抗體。藉此，形成第二檢測複合體。第二檢測抗體可被導向對抗衍生第二捕獲抗體之物種。例如，在使用本申請案他處所述之本發明的小鼠單株抗體(mAb)20-2-5作為第二捕獲抗體及以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25之情況下，可使用一種抗小鼠山葵過氧化酶(HRP)複合抗體作為第二檢測抗體。如嫻熟技藝者所顯而易見，第一檢測抗體與第二檢測抗體係與不同酵素複合，以促成特異性檢測如本發明方法中所用之個別的第一與第二捕獲抗體。例如，如本申請案他處所述之山葵過氧化酶式檢測作用可用於經BoNT/A剪切型SNAP-25，而鹼性磷酸酶式檢測作用可用於總SNAP-25(經BoNT/A剪切型與未經剪切型SNAP-25)。之後，再度清洗細胞。在後續步驟中，將山葵過氧化酶的螢光性受質添加至細胞。例如，可使用在540奈米激發及在600奈米發射的Amplex UltraRed(英杰(Invitrogen)公司)作為山葵過氧化酶的受質。與山葵過氧化酶的受質培養一段時間，這段時間足以讓山葵過氧化酶充分轉化受質。在與山葵過氧化酶的受質一起培養之後，可將例如鹼性磷酸酶的受質DiFMUP(6,8-二氟-4-甲基繖形酮醯磷酸酯；在360奈米激發；在450奈米發射)添加至山葵過 氧化酶受質，讓細胞與該二受質的混合物一起培養。與該鹼性磷酸酶受質培養一段時間，這段時間足以讓鹼性磷酸酶充分轉化受質。如技藝中所知，根據檢測極限之定義，受質的轉化量必須充分，使得所測得的訊號係至少為空白的平均值加上平均值的三倍標準偏差。可依據文獻中所述，測定檢測極限；如見Armbruster與Pry於2008年期刊“Clinical Biochem.Rev.”第29期(附刊1)第S49-S52頁乙文。因為鹼性磷酸酶的最佳pH值係位於鹼性範圍，對應的受質緩衝液呈現強鹼性。若將鹼性磷酸酶受質添加至山葵過氧化酶受質，因著鹼性pH值終止山葵過氧化酶的反應，鹼性磷酸酶則將DiFMUP轉化。轉化後的山葵過氧化酶受質並不受鹼性pH值之影響。最後，如下測量該二受質的螢光：Amplex UltraRed：在540奈米激發；在600奈米發射DiFMUP：在360奈米激發；在450奈米發射如嫻熟技藝者所瞭解，唯有展現所用受質的不同激發/發射波長之該等螢光受質，才適合在本發明的方法中檢測第一與第二捕獲抗體。唯有在這種情況下，其等促成以特異性方式檢測各抗原，亦即總神經毒素受質(諸如未經剪切型與經神經毒素剪切型SNAP-25)及經剪切的神經毒素受質(諸如經神經毒素剪切的SNAP-25)。藉此，方可能同時量化各孔或細胞培養皿中之神經毒素受質總含量及經剪切的神經毒素受質含量。有鑑於此，有利地可能將本發明的方法自動化。如在本申請案他處所說明，可設想本發明方法所選擇使用的螢光受質在激發/發射光譜之間展現充分的位移， 容許以特異性方式檢測個別受質。例如，山葵過氧化酶的受質Amplex及其衍生物以及鹼性磷酸酶的受質DiFMUP均符合這項要求。而在最佳情況下，所用螢光受質的激發/發射光譜之間沒有重疊，按經驗，就所用螢光受質之激發光譜的峰面積而言，可容忍高達30%的重疊。
如嫻熟技藝者所進一步知悉，本發明的方法得以直接檢測及量化神經毒素多肽在細胞中所剪切的神經毒素受質，藉此測定該神經毒素多肽在該細胞中的生物活性。有利地，本發明的方法不需要製備細胞溶胞產物或萃取物，也不需要從細胞溶胞產物/萃取物中分離或濃縮經剪切的神經毒素受質，這些是技藝中所知方法所需要的。因此，可省下試樣物料。此外，因可同時測定試樣中之總神經毒素受質的量及經剪切型神經毒素受質的量，藉由本發明的方法可減少試樣製備作用及試樣數目。在技藝中所述的分析法中，必需將試樣分開，以檢測二種抗原，亦即總神經毒素受質與經剪切的神經毒素受質係各自分開檢測。本發明的方法不需要將試樣分開。藉此，可避免因分開試樣所引起的不均勻性，及可省下試樣物料。此外，在技藝中所述的分析法中，抗原可能降解，而可能扭曲經剪切的神經毒素受質之檢測作用。這是因為在技藝中所述的分析法中，細胞係與含有清潔劑的裂解緩衝液一起培養，然而該緩衝液無法使神經毒素多肽或其他內源性蛋白酶失去活性，導致在試樣長期儲存時之神經毒素受質降解作用。在先前技術所述的ECL雙抗體夾心ELISA中，無法使用較強的裂解緩 衝液，因為在該分析法中需要使用細胞溶胞產物。這是因為上述抗原的聚集作用可導致該抗原以非特異性方式吸附在細胞培養皿或微量滴定平皿的塑料表面，進而干擾適當抗體對於抗原的檢測作用。因為用於檢測抗原之抗體亦與溶胞產物接觸，抗體亦可能聚集。在這種情況下，抗原的檢測不可能是可靠與準確的。本申請案發明者在使用技藝中所述之西方印漬分析法來檢測神經毒素的生物活性時，曾經歷該等降解反應。當溶胞產物在-20℃長期儲存時，相較於新鮮的溶胞產物試樣，發現總SNAP-25的檢測訊號大幅降低，經剪切的神經毒素受質SNAP-25相對於未經剪切的神經毒素受質SNAP-25之比例則因冷凍期間的降解作用而偏移。本申請案發明者發現藉由將細胞直接固定在細胞培養皿上，可避免神經毒素受質的降解作用及/或試樣的不安定性，因為神經毒素受質及神經毒素或其他內源性蛋白酶同樣因著在細胞培養皿上的聚集作用而立即失去活性。這可藉由使用例如甲醇或技藝中所知的其他固定液或固定劑諸如乙醇、丙酮、甲醛或其混合物，或使用在本申請案中所述的其他固定劑，來固定細胞而達成。當使用該固定方法時，由親代SiMa細胞(人類神經母細胞瘤神經母細胞瘤細胞；DSMZ編號：ACC 164)及iPS衍生型神經元(Whitemarsh等人(2012年)於期刊“Toxicol.Sci.”第126期第426-35頁乙文)之安定性分析顯示，在新鮮與在冰箱存放數天的細胞培養皿之間並無任何差異。
如本申請案所用之單數形式的“一(a)”、“一(an)” 及“該”係同時包括單數與複數的提述對象，除非上下文另有明確說明。例如，“一細胞”係指一或多個細胞。
如本申請案所用之“約”一詞，當用於量化一指定物件、數目、百分比或詞彙之數值時，係指該指定物件、數目、百分比或詞彙的數值之正負10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%之範圍。較佳是正負10%之範圍。
如本申請案所用之“包含(comprising)”、“包含(comprises)”及“由...所組成”一詞係與“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”同義，其具有包容性及為開放式的，不排除未列舉的其他成員、元件或方法步驟。顯然，“包含”一詞涵蓋“由...所組成”一詞。更詳細地，如本申請案所用之“包含”一詞所主張者，係涵蓋所列的所有元件或方法步驟，但亦可包括未提及的其他元件或方法步驟。例如，就最狹隘的含意而言，一種包括步驟a)、b)與c)的方法係涵蓋一種由步驟a)、b)與c)所組成的方法。“由...所組成”一詞係指組合物(或裝置或方法)具有所列舉的元件(或步驟)，及僅此而已。反之，“包括”一詞亦可涵蓋一種包括其他步驟之方法，例如除了步驟a)、b)與c)之外，還包括步驟d)與e)。
當本申請案使用數值範圍時，諸如“濃度介於1與5微莫耳之間”，該範圍不僅包括1與5微莫耳，亦包括1與5微莫耳之間的任一數值，例如2微莫耳、3微莫耳及4微莫耳。
如本申請案所用之“在試管內”一詞，係指在動物 或人體之外或在外部。應將本申請案所用之“在試管內”一詞理解為包括“在生物體外”。“在生物體外”一詞通常係指組織或細胞從動物或人體內取出，並在體外例如在培養容器中維持或增殖。如本申請案所用之“在生物體內”一詞係指在動物或人體之內或是在內部。
如本申請案所用之“神經毒素多肽”一詞，係指肉毒桿菌(Clostridium botulinum)與破傷風桿菌(Clostridium tetani)的神經毒素，亦即肉毒桿菌毒素(BoNT)與破傷風毒素(TeNT)。更詳細地，該詞涵蓋BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G及破傷風神經毒素(TeNT)。神經毒素多肽及特別是其輕鏈與重鏈係可衍生自上述肉毒桿菌神經毒素之抗原上不同的血清型。就一方面而言，神經毒素多肽的該輕鏈與重鏈係選自由BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G所組成的群組之一種神經毒素的輕鏈與重鏈。就另一方面而言，編碼該神經毒素多肽之聚核苷酸包括如序列辨識編號：1(BoNT/A)、序列辨識編號：3(BoNT/B)、序列辨識編號：5(BoNT/C1)、序列辨識編號：7(BoNT/D)、序列辨識編號：9(BoNT/E)、序列辨識編號：11(BoNT/F)、序列辨識編號：13(BoNT/G)或序列辨識編號：15(TeNT)中所示的一核酸序列。此外，就一方面而言係涵蓋一聚核苷酸，其所包括的一核酸序列係編碼如序列辨識編號：2(BoNT/A)、序列辨識編號：4(BoNT/B)、序列辨識編號：6(BoNT/C1)、序列辨識編號：8(BoNT/D)、序列辨識編號：10(BoNT/E)、序列 辨識編號：12(BoNT/F)、序列辨識編號：14(BoNT/G)或序列辨識編號：16(TeNT)中任一者所示的一胺基酸序列。就本發明的工具及方法方面而言，係進一步涵蓋一神經毒素多肽，其包含選自由下列所組成的群組之一胺基酸序列或由其所組成：序列辨識編號：2(BoNT/A)、序列辨識編號：4(BoNT/B)、序列辨識編號：6(BoNT/C1)、序列辨識編號：8(BoNT/D)、序列辨識編號：10(BoNT/E)、序列辨識編號：12(BoNT/F)、序列辨識編號：14(BoNT/G)及序列辨識編號：16(TeNT)。
就另一方面而言，該聚核苷酸係前述聚核苷酸的一變異體，其包括一或多個核苷酸取代作用、刪除作用及/或添加作用，就又一方面而言，可能產生一種多肽，其具有一或多個胺基酸取代作用、刪除作用及/或添加作用。此外，就另一方面而言，本發明的變異體聚核苷酸包括一核酸序列變異體，其與序列辨識編號：1、3、5、7、9、11、13或15中任一者所示的核酸序列之一致性係至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%；或包括一核酸序列變異體，其所編碼的一胺基酸序列與序列辨識編號：2、4、6、8、10、12、14或16中任一者所示的胺基酸序列之一致性係至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%。如本申請案所用之“一致性”一詞係指序列一致性，其 特徵在於測定二個核酸序列或二個胺基酸序列之間相符的胺基酸數目，其中以獲得最高的比對相符數目之方式進行序列比對。可使用編入電腦程式之公開技術或方法進行計算，諸如BLASTP、BLASTN或FASTA(Altschul於1990年期刊“J Mol Biol”第215期第403頁乙文)。就一方面而言，一致性%數值係以完整胺基酸序列計算。有基於多種演算法的一系列程式可供嫻熟人員用於比較不同序列。在這種情況下，Needleman與Wunsch或Smith與Waterman的演算法所得的結果尤其可靠。可使用PileUp程式(Higgins於1989年期刊“CABIOS”第5期第151頁乙文)或Gap程式與BestFit程式(Needleman於1970年期刊“J Mol Biol”第48期第443頁乙文；Smith於1981年期刊“Adv Appl Math”第2期第482頁乙文)，這些是GCG軟體包(美國53711威斯康辛州麥迪遜科學道575號的遺傳學電腦集團(Genetics Computer Group)於1991年推出)中的一部分，進行序列比對。就本發明的另一方面而言，使用GAP程式測定整個序列區之如上述以百分比(%)為單位之序列一致性，程式的設定如下：缺口權重：50，長度權重：3，平均比對相符：10.000及平均比對不相符：0.000，這些將是序列比對時的標準設定，除非另有說明。就一方面而言，前述各變異體聚核苷酸所編碼的多肽保有個別神經毒素多肽的一或多種生物性質，而就另一方面而言，保有所有的生物性質，神經毒素多肽亦即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或破傷風神經毒素(TeNT)。該等嫻熟技藝者將瞭解，唯有 在蛋白分解性活化作用之後，方能維持完整的生物活性，但是可想而知地，未經處理的前驅物可能展現一些生物功能或為部分活化型。如本申請案所用之“生物性質”係指(a)受體結合作用，(b)內化作用，(c)運轉通過胞內體膜而進入細胞質液中，及/或(d)涉及突觸囊泡膜融合的蛋白之內切蛋白酶分解性剪切作用。用於評估生物活性之生物體內分析法包括小鼠LD50分析法，及包括如Pearce等人(Pearce於1994年期刊“Toxicol.Appl.Pharmacol.”第128期第69-77頁乙文)與Dressler等人(Dressler於2005年期刊“Mov.Disord.”第20期第1617-1619頁乙文，Keller於2006年期刊“Neuroscience”第139期第629-637頁乙文)所述之生物體外小鼠半橫膈分析法。生物活性一般以小鼠單位(MU)為單位示之。如用於本申請案中之1MU，係在腹膜內注射之後，殺死50%的指定小鼠族群之神經毒性組分的量，亦即小鼠i.p.LD50。就另一方面而言，變異體聚核苷酸所編碼的神經毒素所具有的生物性質可能已改良或改變，例如其等可包括增進酵素辨識作用的剪切位點，或在受體結合或上述所指其他任何性質上獲得改良。
因此，如本申請案所用之“一神經毒素多肽的生物活性”一詞，係指一神經毒素多肽的生物性質特徵，亦即a)受體結合，(b)內化作用，(c)運轉通過胞內體膜而進入細胞質液中，及/或(d)涉及突觸囊泡膜融合的蛋白之內切蛋白酶分解性剪切作用。可設想如本申請案所用的神經毒素多肽展現上述a)至d)性質中的至少一者，較佳為涉及突觸囊泡 膜融合的蛋白之內切蛋白酶分解性剪切作用，或展現上述a)至d)的四種生物性質中之二者或三者或四者。
就一方面而言，本揭露內容包括來自一種確立細胞系之一細胞。如本申請案所用之“細胞”一詞，係指容易因著一種神經毒素諸如BoNT/A而受神經毒素毒害的任一真核細胞，或為可攝取神經毒素的任一真核細胞。細胞一詞涵蓋來自多種生物體之細胞，諸如鼠類、大鼠、豬、牛、馬、靈長類動物與人類之細胞；來自多種細胞類型諸如神經元與非神經元之細胞；及可分離自異源細胞群體、組織或生物體或為其一部分之細胞。如本申請案所用之“確立細胞系”一詞，係與“永生細胞系”或“轉形細胞系”同義，及係指從一生物體、組織或器官來源所衍生的一細胞群體挑選出用於無限增殖之細胞的細胞培養。根據定義，確立細胞系不包括初代細胞的細胞培養在內。如本申請案所用之“初代細胞”一詞，係指直接從新鮮組織或器官採集及不具有無限增殖潛力之細胞。例如，在本發明的方法中可使用初級神經元細胞。一種確立細胞系可包括異質細胞群體或同質細胞群體。衍生自單一細胞的確立細胞系係稱作選殖細胞系。細胞進行整體細胞機制所需的所有組分，皆可在確立細胞系之細胞的細胞內表現，藉此神經毒素諸如BoNT/A係以蛋白分解的方式剪切一受質諸如SNAP-25；及涵蓋一神經毒素與一神經毒素受體的結合作用，諸如BoNT/A與一種BoNT/A受體的結合作用；神經毒素/受體複合體的內化作用；神經毒素輕鏈從胞內囊泡運轉進入細胞質；及神經毒素受 質的蛋白分解性剪切作用。任擇地，已從一外部來源，將細胞進行整體細胞機制所需的至少一種組分導入確立細胞系之細胞中，藉此神經毒素諸如BoNT/A係以蛋白分解的方式剪切一受質諸如SNAP-25；及涵蓋一神經毒素與一受體的結合作用，諸如BoNT/A與一種BoNT/A受體的結合作用；神經毒素/受體複合體的內化作用；神經毒素輕鏈從胞內囊泡運轉進入細胞質；及一神經毒素受質的蛋白分解性剪切作用。確立細胞系亦指基因工程細胞系，其中來自該確立細胞系之細胞例如可表現外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2、外源性神經毒素受質諸如SNAP-25或其任一組合。
本申請案中所述之“易受神經毒素毒害的細胞”一詞，係指可進行整體細胞機制之一細胞及藉此一神經毒素多肽(如BoNT/A)剪切一神經毒素受質(如BoNT/A的受質SNAP-25)，及涵蓋神經毒素與其對應受體的結合作用(如BoNT/A與BoNT/A受體的結合作用)；神經毒素/受體複合體的內化作用；神經毒素輕鏈從胞內囊泡運轉進入細胞質；及神經毒素受質的蛋白分解性剪切作用。用於測定神經毒素多肽的生物活性之分析法係技藝中眾所周知，亦述於本申請案他處；如見Pellett等人(2011年)於期刊“Biochem.Biophys.Res.Commun.”第404期第388-392頁乙文；Whitemarsh等人(2012年)於期刊“Toxicol.Sci.”第126期第426-35頁乙文。因此，如本申請案所用之“易受神經毒素毒害的細胞”係指對於神經毒素敏感的細胞。該詞包括一細胞 或一細胞系，例如一種分離的初代細胞或其細胞系，或一種確立細胞系的一細胞或一種確立細胞系，例如可分化成為神經元細胞之腫瘤細胞或腫瘤細胞系，神經元細胞諸如本申請案他處所界定之神經母細胞瘤細胞或神經母細胞瘤細胞系。例如，該神經母細胞瘤細胞系可為SiMa細胞系，其可自DSMZ取得商品(ACC 164)。WO 2010/105234中進一步揭露SiMa細胞系的特定植株。可用於本發明方法中之其他神經母細胞瘤細胞系可自ATCC或DSMZ取得，其等的ATCC或DSMZ編號如下：編號為CRL-2263的細胞系N1E-115、編號為CCL-131的細胞系Neuro2a、編號為CRL-2266的細胞系SH-SY5Y、編號為CRL-1721的細胞系PC12、編號為ACC 157的細胞系MHH-NB-11(DSMZ)及編號為CRL-2271的細胞系SK-N-BE(2)。其他易受神經毒素毒害的腫瘤細胞為P-19細胞(鼠類胚胎性癌細胞系)(DSMZ編號ACC 316)。易受神經毒素毒害的細胞進一步涵蓋誘導型多潛能幹細胞(iPS)所衍生的神經元，較佳為人類誘導型多潛能幹細胞(iPS)所衍生的神經元；如見上文所引述之Whitemarsh等人(2012年)乙文。亦可取得該等人類iPS衍生型神經元之商品，例如自細胞動力(Cellular Dynamics)公司取得。產生iPS細胞之方法係述於例如Yu等人乙文(於2009年5月8日之期刊“Science”第324(5928)期第797-801頁乙文。電子出版2009年)、WO 2011/056971及WO 2011/025852。在一些方面，使用適宜方法將iPS分化成神經元，如WO 2012/135621及美國專利申請案US 2010/0279403與US 2010/0216181中所述 的該等方法。
“固定細胞”一詞係指使用技藝中所述的方法將細胞固定。一般而言，固定作用是一種化學方法，藉此保存生物組織免於腐化，從而防止自體分解作用。固定作用終止任何正進行中的生化反應，亦可增加所處理組織的機械強度或安定性。在預備一生物材料試樣諸如一組織或細胞進行檢驗或分析之過程中，固定作用保存該組織或細胞盡可能接近其自然狀態。為此，固定液的作用通常使內在生物分子失去功效，特別是蛋白分解性酵素，以免該等酵素消化分解或損壞試樣。此外，固定液通常保護試樣免於受到外來損傷。固定液對於包括細菌在內的最常見微生物具有毒性，這些微生物可能存在於組織或細胞培養中，在其他情況下可能在所固定的組織或細胞培養中群聚生長。此外，許多固定液在化學上改變所固定的物質，使其無法消化或具有毒性，而減少對於伺機微生物的吸引力。最後，固定液通常在分子層級改變細胞或組織，以增加其等的機械強度或安定性。所增加的強度與剛性可在試樣經處理供進一步分析時，有助於保存形態，諸如保存試樣的外形與結構。如嫻熟技藝者所顯而易見的，固定液與固定程序的選擇可能取決於其他處理步驟及所規劃的最終分析。例如，免疫組織化學法使用抗體，該抗體以特異性方式結合一特定蛋白標的，即抗原。耗時較長的固定作用可能在化學上遮蔽該等標的，而阻止抗體結合作用。在這些情況下，例如，可採用使用冷福馬林之快速固定法。任擇地，可藉由 添加冰冷甲醇(-20℃)，而固定細胞。除了醛類諸如甲醛或戊二醛與醇類諸如乙醇或甲醇之外，可在固定程序中使用氧化劑；4-羥乙基哌乙磺酸(Hepes)-麩胺酸緩衝劑媒介型有機溶劑保護作用(HOPE)固定液；丙酮或其混合物，諸如甲醇與丙酮、甲醇與乙醇、聚甲醛與曲拉通(Triton)X-100或聚甲醛與甲醇之混合物。就本發明方法的一方面而言，藉由添加選自由甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或其混合物所組成的群組之一固定劑，進行細胞固定作用。為確保及/或利於抗體自由接觸其抗原，選擇性地可藉由使用一種適當的透化緩衝液，而使得細胞透化；該透化緩衝液包含至少一種清潔劑，諸如曲拉通(Triton)X-100。在本發明的方法中，例如可使用位於10mM PBS緩衝劑中的0.5%曲拉通(Triton)X-100作為透化緩衝液。就本發明方法的其他方面而言，可藉由使用一種透化緩衝液諸如PBS，使得細胞透化；該透化緩衝液中包含選自妥文(Tween)20、皂素、毛地黃皂苷或正辛基-ß-葡哌喃糖苷的至少一種清潔劑。就其他方面而言，該透化緩衝液可使用本申請案中所提及的二或多種清潔劑之混合物。一般而言，細胞固定作用之強度與時間係顯著低於用於結構複雜又厚的組織切片之強度與時間。就免疫細胞化學法而言，試樣製備作用實際上使得標的細胞固定在載玻片、細胞培養皿或微量滴定平皿上。完美的固定作用使得抗原固定不動，同時保留真實細胞和次細胞結構，並允許抗體不受阻礙地與所有的細胞及細胞內區室接觸。一般使用如上所列舉之廣泛種類的固定液，而正確方法之 選擇將取決於所檢驗抗原的本質，及取決於所用抗體的性質。固定方法通常分為兩類：有機溶劑與交聯劑。有機溶劑諸如醇類與丙酮除去脂質及將細胞脫水，同時使蛋白沉澱在細胞結構上。交聯劑諸如聚甲醛一般經由游離胺基形成分子間橋鍵，從而產生由連結的抗原所組成之網絡。交聯劑保存細胞構造的能力優於有機溶劑，但可能降低一些細胞組分的抗原性，及通常需要增加如上述的一個透化步驟，以容許抗體接觸試樣。使用上述二種方法進行的固定作用可能使蛋白質抗原變性，及鑒於該項因素，製備用於對抗變性蛋白之抗體可能對於細胞染色作用更為有利。應根據相關應用來選擇適當的固定方法。技藝中對於細胞固定方法有詳細的描述(如見學術出版社(Academic Press)於1993年出版及由David J.Asai所編輯之“細胞生物學中之方法(Methods in cell biology)”乙書第37冊之“細胞生物學中之抗體(Antibodies in cell biology)”)。
如本發明方法所用之“接觸”一詞，係指讓細胞與個別抗體實質上接近，而容許物理及/或化學交互作用發生。促成特定交互作用發生的適宜條件係嫻熟技藝者眾所周知。顯然，該等條件將取決於在本發明方法中所用的抗體與細胞，及嫻熟技藝者可定期加以改良。此外，嫻熟的工作人員無需多費周折，亦可判定讓交互作用發生所需的充分時間。應理解可在細胞與本發明方法中所述的個別抗體接觸之各個步驟之間，採行清洗步驟，以獲致適於接觸的條件。例如，在本發明方法的步驟c)中，當以特異性方式結合未 經剪切型與經神經毒素剪切型受質的至少一種第一捕獲抗體及以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點之至少一種第二捕獲抗體接觸細胞之後，可在施用第一檢測抗體及/或第二檢測抗體之前納入一清洗步驟，以移除所殘留的溶液及/或過量的第一與第二捕獲抗體。同樣地，在本發明的方法中，在細胞與第一及/或第二檢測抗體接觸之後，可納入一清洗步驟。適當的清洗緩衝液例如位於10mM PBS緩衝劑(pH 7.4)中的0.1%曲拉通(Triton)X-100。更詳細地，如本申請案所用之“接觸”一詞，係指在本發明方法的步驟c)中，在容許該捕獲抗體與該受質結合的條件下，讓細胞與至少一種第一捕獲抗體接觸，該第一捕獲抗體係以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質；及讓細胞與至少一種第二捕獲抗體接觸，該第二捕獲抗體接觸係以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點。第一與第二捕獲抗體可同時施用至細胞，例如以混合物的形式，或依序施用。“接觸”進一步指在本發明方法的步驟d)中，在容許該第一檢測抗體與該第一捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第一捕獲抗體之至少一種第一檢測抗體接觸；及在容許該第二檢測抗體與該第二捕獲抗體結合的條件下，讓細胞與以特異性方式結合第二捕獲抗體的至少一種第二檢測抗體。藉此，形成第一與第二檢測複合體。任擇地，亦可依序施用第一與第二檢測抗體。
如本申請案所用之抗體”一詞，係指由免疫系統 針對一特定抗原所產生的一分子，該分子係以特異性方式結合該抗原，及同時包括天然存在的抗體與非天然存在的抗體。如本申請案所用之“抗體”涵蓋單株抗體、多株抗體、單鏈抗體、雙元抗體或多元抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、雙特異性單鏈抗體、多特異性抗體、合成抗體、人化抗體、雙功能抗體、細胞結合型抗體如Ig受體、線性抗體、雙鏈抗體、微抗體或該等抗體中之任一者的片段。該等抗體的片段例如包括Fab、Fv或scFv片段，或該等片段中任一者之經化學修飾的衍生物。可藉由技藝中所述的方法產生抗體；如見美國冷泉港CSH出版公司於1988年出版及由Harlow與Lane所著之“抗體：實驗室手冊(Antibodies,A Laboratory Manual)”乙書。可藉由最初述於Köhler於1975年期刊“Nature”第256期第495頁乙文及Galfré於1981年期刊“Meth.Enzymol.”第73期第3頁乙文之技術，製備單株抗體。該等技術包括小鼠骨髓瘤細胞與衍生自產生免疫的哺乳類動物的脾臟細胞之融合作用。可藉由技藝中眾所周知的技術，進一步改良抗體。例如，可使用畢亞寇(Biacore)系統中所採用的表面電漿共振，以提高噬菌體抗體與抗原決定位結合之效率；如見Schier於1996年期刊“Human Antibodies Hybridomas”第7期第97頁乙文；Malmborg於1995年期刊“J.Immunol.Methods”第183期第7頁乙文。如本申請案所用之抗體亦包括抗體的功能性等效物，亦即能以特異性方式結合所欲的抗原決定位或神經毒素受質的一部分之試劑。就一方面而言，該等功能性等效物包括以特異性方式結合神 經毒素受質之結合蛋白，或能媒介該特異性結合作用之域。如本申請案所用之抗體可為一種全長式免疫球蛋白分子，其包括VH與VL域以及一輕鏈固定域(CL)與重鏈固定域CH1、CH2及CH3；或為全長式免疫球蛋白分子的一個免疫活化型片段，諸如Fab片段、F(ab')2片段、Fc片段、Fd片段或Fv片段。抗體可衍生自任一脊椎動物物種(如人類、山羊、馬、驢、鼠類、大鼠、兔或雞)，及可為任一類(如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)、任一型(如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)或任一亞型(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)。關於天然存在的抗體、非天然存在的抗體及其抗原性化合物結合型片段的結構之一般揭露內容，如見美國紐約施普林格(Springer-Verlag)公司所出版及由Rosenburg與Moore編輯之“單株抗體之藥理學(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)”乙書(1994年)第113冊第269-315頁之Plueckthun乙文；Borrabeck所著“抗體工程(Antibody Engineering)”乙書第二版(牛津大學出版社)。天然存在的抗體通常為約150,000道爾頓的異四聚體醣蛋白，由兩個相同的輕(L)鏈與兩個相同的重(H)鏈所組成。各輕鏈係藉由一個共價雙硫鍵與一重鏈連結，而不同的免疫球蛋白亞型之重鏈的雙硫鍵聯數目不同。各重鏈與輕鏈亦具有間隔規則的鏈內雙硫橋鍵。在各重鏈的一端具有一個可變域(VH)，接著是若干個固定域。在各輕鏈的一端具有一個可變域(VL)及另一端具有一個固定域。輕鏈的固定域係與重鏈的第一固定域對齊，而輕鏈的可變域係與重鏈的可變域對齊。據 信由特定的胺基酸殘基形成輕鏈與重鏈可變域之間的界面。
完整的抗原辨識與抗原結合位點係包含在抗體的可變域之內，亦即Fv片段。該片段包括一個雙元抗體，其係由緊密、非共價結合的一個重鏈可變域(VH)與一個輕鏈可變域(VL)所組成。各域包括四個架構區域(FR)，其大致上係由三個高度可變區連接的β摺板構形，該等高度可變區形成環形連接及在一些情況形成部分的β摺板結構。各高度可變區包括一胺基酸序列，其對應一個互補決定區(CDR)。整體而言，由六個CDR區的三維構形界定VH-VL雙元抗體表面上的一個抗原結合位點，及該抗原結合位點賦予抗原結合特異性。如見Cyrus Chothia等人於1989年期刊“Nature”第342(6252期第877-883頁之“免疫球蛋白高度可變區之構形(Conformations of Immunoglobulin Hypervariable Regions)”乙文；美國馬里蘭州貝塞斯達(Bethesda)的國家衛生研究院公共衛生服務部門出版及由Elvin A.Kabat等人編輯之“具免疫重要性之蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”第五版(1991年)。抗體的固定域並未直接涉及抗體與抗原的結合作用，但展現各種的效應或功能，諸如抗體在抗體依賴性細胞毒性中所扮演的角色。
如本申請案所用之“選擇性結合”或“特異性結合作用”係包括結合性質，諸如結合親和力、結合特異性及結合親和強度；如見David J.King於“單株抗體應用與工程(Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies)”第 240頁乙文(1998年)。結合親和力係指抗體駐留在其抗原決定位的結合位點之時間長度，及可視為抗體與其抗原決定位結合之強度。可用抗體的平衡解離常數(KD)來描述結合親和力，平衡解離常數係界定為平衡時的Kd/Ka比值。Ka係抗體的結合速率常數，而Kd係抗體的解離速率常數。結合親和力係同時由結合作用與解離作用決定，單單憑藉高結合作用或低解離作用都不能確保高親和力。結合速率常數(Ka)或駐留在抗原上之速率常數(Kon)係測量每單位時間的結合事件數目，或抗體與抗原以可逆方式結合成為其抗體抗原複合體之傾向。結合速率常數的單位為M-1s-1，及以符號示為：[Ab]x[Ag]x Kon。結合速率常數越大，抗體與其抗原的結合作用越快速，或者抗體與抗原之間的結合親和力越高。解離速率常數(Kd)或脫離抗原之速率常數(Koff)係測量每單位時間的解離事件數目，一抗體抗原複合體以可逆方式分離(解離)成其組分分子，亦即抗體與抗原之傾向。解離速率常數的單位為s-1，及以符號示為：[Ab+Ag]x Koff。解離速率常數越小，抗體與其抗原的結合作用越緊密，或者抗體與抗原之間的結合親和力越高。平衡解離常數(KD)係測量形成新的抗體抗原複合體之速率，其等於在平衡時之抗體抗原複合體解離之速率。平衡解離常數的單位為M，及界定為Koff/Kon=[Ab]x[Ag]/[Ab+Ag]，其中[Ab]為抗體的莫耳濃度，[Ag]為抗原的莫耳濃度，而[Ab+Ag]為抗體抗原複合體的莫耳濃度，其中所有濃度係該等組分在系統達到平衡時之濃度。平衡解離常數越小，抗體與其抗原的結 合作用越緊密，或者抗體與抗原之間的結合親和力越高。因此，就本發明方法的一方面而言，以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質之第一捕獲抗體的結合速率常數例如可小於1x105M-1s-1，小於1x106M-1s-1，小於1x107M-1s-1或小於1x108M-1s-1。就另一方面而言，以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質之第一捕獲抗體的結合速率常數，例如可大於1x105M-1s-1，大於1x106M-1s-1，大於1x107M-1s-1或大於1x108M-1s-1。就另一方面而言，以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質之第一捕獲抗體的解離速率常數例如可小於1x10-3M-1s-1，小於1x10-4M-1s-1，小於1x10-5M-1s-1或小於1x10-6M-1s-1。在又一方面而言，以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質之第一捕獲抗體的解離速率常數例如可大於1x10-3M-1s-1，大於1x10-4M-1s-1，大於1x10-5M-1s-1或大於1x10-6M-1s-1。就另一方面而言，以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點之第二捕獲抗體的結合速率常數例如可小於1x105M-1s-1，小於1x106M-1s-1，小於1x107M-1s-1或小於1x108M-1s-1。就另一方面而言，以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點之第二捕獲抗體的結合速率常數例如可大於1x105M-1s-1，大於1x106M-1s-1，大於1x107M-1s-1或大於1x108M-1s-1。就另一方面而言，以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點之第二捕獲抗體的解離速率常數例如可小於1x10-3M-1s-1，小於1x10-4M-1s-1，小於1x10-5M-1s-1或小於1x10-6M-1s-1。在又一 方面而言，以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點之第二捕獲抗體的解離速率常數例如可大於1x10-3M-1s-1，大於1x10-4M-1s-1，大於1x10-5M-1s-1或大於1x10-6M-1s-1。
諸如經神經毒素剪切或未經剪切的神經毒素受質SNAP-25、VAMP/突觸囊泡蛋白(Synaptobrevin)或神經突觸素(Syntaxin)之標的抗原一般具有一或多個結合位點，亦稱為抗原決定位，抗體CDR所形成的抗原結合位點所辨識者即為抗原決定位。如本申請案所用之“抗原決定位”係與“抗原性決定位”同義，及係指一標的抗原上的位點，標的抗原諸如一種肽、多肽、多醣或含脂質分子，其能與一免疫球蛋白或T細胞受體進行特異性結合，或在其他情況下與一分子交互作用。以特異性方式與不同的抗原決定位結合之各抗體，係具有不同結構。因此，一抗原可能具有一種以上的對應抗體。可藉由各種眾所周知的技術測試本申請案中所指的“特異性結合作用”，例如包括競爭實驗與西方印漬術。如本發明所用之抗原決定位係有關於神經毒素受質如SNAP-25、VAMP/突觸囊泡蛋白或神經突觸素中之抗原性決定位，其係抗體所辨識者。如本申請案所用之“以特異性方式”一詞係指以選擇性方式，及係指具有一獨特的效應或影響，或者僅以一種方式或僅與一對象反應。如本申請案參照一抗體或結合蛋白或結合域所用之“以特異性方式結合”或“以選擇性方式結合”一詞，係指抗體或結合蛋白/域與所示標的抗原決定位之差別性結合作用，使得抗體或 結合蛋白/域實質上不與非標的抗原決定位交叉反應。如本申請案所界定之一種肽抗原決定位的最小尺寸係約5個胺基酸殘基，而肽抗原決定位通常包含至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少11個、至少12個、至少13個、至少14個、至少15個、至少16個、至少17個、至少18個、至少19個、至少20個、至少21個、至少22個、至少23個、至少24個、至少25個或至少30個胺基酸殘基。肽抗原決定位可為一種線性抗原決定位或為一種不連續抗原決定位。不連續抗原決定位包含在肽的一級構造中並非相鄰的胺基酸殘基，但是藉由該肽的二級、三級或四級結構而聚集成為一個抗原決定位。此外，也注意到抗原決定位可包括胺基酸序列以外之一分子的一部分，諸如醣基團；脂質基團如醣脂或脂蛋白；或一種經化學修飾的胺基酸基團，如磷酸化胺基酸。
如本發明的方法，“第一捕獲抗體”係以特異性方式結合由未經剪切型與經神經毒素剪切型受質所組成的一個抗原決定位。該神經毒素受質例如可為SNAP-25、VAMP/突觸囊泡蛋白或神經突觸素。例如，已知SNAP-25為BoNT/A、BoNT/C1及BoNT/E的受質。VAMP/突觸囊泡蛋白為BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G及TeNT的受質，而神經突觸素為BoNT/C1的受質。藉由該第一捕獲抗體得以測定總量，亦即細胞中之個別神經毒素受質的整體含量。例如，在總長度為205個胺基酸殘基的SNAP-25中，BoNT/A的剪切位點係位於第197個胺基酸殘基麩醯胺與第198個胺 基酸殘基精胺酸之間。因此，一抗體若以特異性方式結合位於BoNT/A剪切位點的N端側之一個抗原決定位，亦即位於SNAP-25的第1個與第198個胺基酸殘基之間的一個抗原決定位，則可使用該抗體作為第一捕獲抗體。例如，該抗體能以特異性方式與一個N端抗原決定位結合，或與位於SNAP-25的中間部分之一個抗原決定位結合。就BoNT/C1而言，位於BoNT/C1剪切位點(精胺酸198-丙胺酸199)的N端側之一個抗原決定位，亦即介於SNAP-25的第1個與第199個胺基酸殘基之間，可使用作為第一捕獲抗體。就BoNT/E而言，位於BoNT/E剪切位點(精胺酸180-異白胺酸181)的N端側之一個抗原決定位，亦即介於SNAP-25的第1個與第181個胺基酸殘基之間，可使用作為第一捕獲抗體。若使用VAMP作為神經毒素受質，位於BoNT/B剪切位點(麩醯胺76-苯丙胺酸77)的N端側之一個抗原決定位，亦即介於VAMP的第1個與第77個胺基酸殘基之間，可使用作為第一捕獲抗體。位於BoNT/D剪切位點(離胺酸59-白胺酸60)的N端側之一個抗原決定位，亦即介於VAMP2的第1個與第60個胺基酸殘基之間，可使用作為第一捕獲抗體。位於BoNT/F剪切位點(麩醯胺58-離胺酸59)的N端側之一個抗原決定位，亦即介於VAMP2的第1個與第59個胺基酸殘基之間，可使用作為第一捕獲抗體。位於BoN/G剪切位點(丙胺酸81-丙胺酸82)的N端側之一個抗原決定位，亦即介於VAMP2的第1個與第82個胺基酸殘基之間，可使用作為第一捕獲抗體。若使用神經突觸素作為受質，位於BoN/C1剪切位點(離胺酸 253-丙胺酸254)的N端側之一個抗原決定位，亦即介於神經突觸素1a型的第1個與第254個胺基酸殘基之間，可使用作為第一捕獲抗體。
就本發明的一方面而言，BoNT/A蛋白酶所辨識與剪切的神經毒素剪切位點，係衍生自對BoNT/A的剪切作用敏感的一種蛋白。就一方面而言，該蛋白係人類SNAP-25A或SNAP-25B，或為來自大鼠、小鼠、牛、丹尼魚(Danio)屬、鯽(Carassius)屬、爪蟾(Xenopus)屬、電鰩(Torpedo)屬、紫海膽(Strongylocentrotus)屬、槍烏賊(Loligo)屬、椎實螺(Lymnaea)屬或海兔(Aplysia)屬之同源物、同種同源物或異種同源物。自該蛋白所衍生的適宜剪切位點係揭露於例如EP 1 926 744 B1中。
就本發明的一方面而言，BoNT/B蛋白酶所辨識與剪切的一神經毒素剪切位點，係衍生自對BoNT/B的剪切作用敏感的一種蛋白。就一方面而言，該蛋白係人類或小鼠VAMP-1、VAMP-2與VAMP-3/細胞囊泡蛋白(cellubrevin)；牛VAMP-2；大鼠VAMP-2或VAMP-3；雞VAMP-1、VAMP-2或VAMP-3；電鰩(Torpedo)屬VAMP-1；紫海膽(Strongylocentrotus)屬VAMP；果蠅(Drosophila)屬sybA、synB、synC、synD或syn；水蛭(Hirudo)屬VAMP；爪蟾(Xenopus)屬VAMP-2或VAMP-3；丹尼魚(Danio)屬VAMP-1或VAMP-2；槍烏賊(Loligo)屬VAMP；椎實螺(Lymnaea)屬VAMP；海兔(Aplysia)屬VAMP或隱桿線蟲(Caenorhabditis)屬SNR1類或其任一異種同源物、同種同源物或同源物。自 該蛋白所衍生的適宜剪切位點係揭露於EP 1 926 744 B1中。
就本發明的一方面而言，BoNT/C1蛋白酶所辨識與剪切的一神經毒素剪切位點，係衍生自對BoNT/C1的剪切作用敏感的一種蛋白。就一方面而言，該蛋白係人類與小鼠神經突觸素1A型、神經突觸素1B1型、神經突觸素2-1型、神經突觸素2-2型、神經突觸素2-3型、神經突觸素3A型或神經突觸素1B2型、牛或大鼠神經突觸素1A型、神經突觸素1B1型或神經突觸素1B2型、大鼠神經突觸素2型或大鼠神經突觸素3型、小鼠神經突觸素1A型、神經突觸素1B1型、神經突觸素1B2型、神經突觸素2型、神經突觸素3A型、神經突觸素3B型或神經突觸素3C型、雞神經突觸素1A型或神經突觸素2型；爪蟾(Xenopus)屬神經突觸素1A型或神經突觸素1B型、丹尼魚(Danio)屬神經突觸素1A型、神經突觸素1B型或神經突觸素3型、電鰩(Torpedo)屬神經突觸素1A型或神經突觸素1B型、紫海膽(Strongylocentrotus)屬神經突觸素1A型或神經突觸素1B型、果蠅(Drosophila)屬神經突觸素1A型或神經突觸素1B型、水蛭(Hirudo)屬神經突觸素1A型或神經突觸素1B型、槍烏賊(Loligo)屬神經突觸素1A型或神經突觸素1B型、椎實螺(Lymnaea)屬神經突觸素1A型或神經突觸素1B型或其任一異種同源物、同種同源物或同源物。自該蛋白所衍生的適宜剪切位點係揭露於EP1926744B1中。
就本發明的一方面而言，BoNT/D蛋白酶所辨識 與剪切的一神經毒素剪切位點，係衍生自對BoNT/D的剪切作用敏感的一種蛋白。就一方面而言，該蛋白係人類或小鼠VAMP-1、VAMP-2與VAMP-3/細胞囊泡蛋白；牛VAMP-2；大鼠VAMP-2或VAMP-3；雞VAMP-1、VAMP-2或VAMP-3；電鰩(Torpedo)屬VAMP-1；紫海膽(Strongylocentrotus)屬VAMP；果蠅(Drosophila)屬sybA、synB、synC、synD或syn；水蛭(Hirudo)屬VAMP；爪蟾(Xenopus)屬VAMP-2或VAMP-3；丹尼魚(Danio)屬VAMP-1或VAMP-2；槍烏賊(Loligo)屬VAMP；椎實螺(Lymnaea)屬VAMP；海兔(Aplysia)屬VAMP或隱桿線蟲(Caenorhabditis)屬SNB1類或其任一異種同源物、同種同源物或同源物。自該蛋白所衍生的適宜剪切位點係揭露於EP 1 926 744 B1中。
就本發明的一方面而言，BoNT/E蛋白酶所辨識與剪切的一神經毒素剪切位點，係衍生自對BoNT/E蛋白酶的剪切作用敏感的一種蛋白。就一方面而言，該蛋白係人類SNAP-25A或SNAP-25B或為來自大鼠、小鼠、牛、丹尼魚(Danio)屬、鯽(Carassius)屬、爪蟾(Xenopus)屬、電鰩(Torpedo)屬、紫海膽(Strongylocentrotus)屬、槍烏賊(Loligo)屬、椎實螺(Lymnaea)屬或海兔(Aplysia)屬之同源物、同種同源物或異種同源物。自該蛋白所衍生的適宜剪切位點係揭露於EP 1 926 744 B1中。
就本發明的一方面而言，BoNT/F蛋白酶所辨識與剪切的一神經毒素剪切位點，係衍生自對BoNT/F的剪切作用敏感的一種蛋白。就一方面而言，該蛋白係人類或小 鼠VAMP-1、VAMP-2與VAMP-3/細胞囊泡蛋白；牛VAMP-2；大鼠VAMP-2或VAMP-3；雞VAMP-1、VAMP-2或VAMP-3；電鰩(Torpedo)屬VAMP-1；紫海膽(Strongylocentrotus)屬VAMP；果蠅(Drosophila)屬sybA、synB、synC、synD或syn；水蛭(Hirudo)屬VAMP；爪蟾(Xenopus)屬VAMP-2或VAMP-3；丹尼魚(Danio)屬VAMP-1或VAMP-2；槍烏賊(Loligo)屬VAMP；椎實螺(Lymnaea)屬VAMP；海兔(Aplysia)屬VAMP或隱桿線蟲(Caenorhabditis)屬SNB1類或其任一異種同源物、同種同源物或同源物。自該蛋白所衍生的適宜剪切位點係揭露於EP 1 926 744 B1中。
就本發明的一方面而言，BoNT/G蛋白酶所辨識與剪切的一神經毒素剪切位點，係衍生自對BoNT/G的剪切作用敏感的一種蛋白。就一方面而言，該蛋白係人類或小鼠VAMP-1、VAMP-2與VAMP-3/細胞囊泡蛋白；牛VAMP-2；大鼠VAMP-2或VAMP-3；雞VAMP-1、VAMP-2或VAMP-3；電鰩(Torpedo)屬VAMP-1；紫海膽(Strongylocentrotus)屬VAMP；果蠅(Drosophila)屬sybA、synB、synC、synD或syn；水蛭(Hirudo)屬VAMP；爪蟾(Xenopus)屬VAMP-2或VAMP-3；丹尼魚(Danio)屬VAMP-1或VAMP-2；槍烏賊(Loligo)屬VAMP；椎實螺(Lymnaea)屬VAMP；海兔(Aplysia)屬VAMP或隱桿線蟲(Caenorhabditis)屬SNB1類或其任一異種同源物、同種同源物或同源物。自該蛋白所衍生的適宜剪切位點係揭露於EP 1 926 744 B1中。
就本發明的一方面而言，TeNT蛋白酶所辨識與 剪切的一神經毒素剪切位點，係衍生自對TeNT的剪切作用敏感的一種蛋白。就一方面而言，該蛋白係人類或小鼠VAMP-1、VAMP-2與VAMP-3/細胞囊泡蛋白；牛VAMP-2；大鼠VAMP-2或VAMP-3；雞VAMP-1、VAMP-2或VAMP-3；電鰩(Torpedo)屬VAMP-1；紫海膽(Strongylocentrotus)屬VAMP；果蠅(Drosophila)屬sybA、synB、synC、synD或syn；水蛭(Hirudo)屬VAMP；爪蟾(Xenopus)屬VAMP-2或VAMP-3；丹尼魚(Danio)屬VAMP-1或VAMP-2；槍烏賊(Loligo)屬VAMP；椎實螺(Lymnaea)屬VAMP；海兔(Aplysia)屬VAMP或隱桿線蟲(Caenorhabditis)屬SNB1類或其任一異種同源物、同種同源物或同源物。自該蛋白所衍生的適宜剪切位點係揭露於EP 1 926 744 B1中。
在本發明的方法中，可作為第一捕獲抗體的適當抗體實例如包括兔多株抗SNAP-25抗體S9684(西克瑪公司)(Fernández-Salas E,Wang J,Molina Y,Nelson JB,Jacky BPS等人(2012年)於期刊“PLoS ONE”第7(11)期第e49516頁之“用於取代小鼠生物分析法之肉毒桿菌神經毒素血清型a型特異性細胞式效力分析法(Botulinum Neurotoxin Serotype a Specific Cell-Based Potency Assay to Replace the Mouse Bioassay)”乙文。PLoS ONE 7(11)：e49516。doi：10.1371/journal.pone.0049516)；兔多株抗SNAP25抗體PA5-19708(皮爾斯抗體(Pierce Antibodies)公司)；兔多株抗SNAP25抗體PA5-19701(皮爾斯抗體公司)；VAMP/突觸囊泡蛋白抗體sc-13992(聖克魯斯生物技術(Santa Cruz Biotechnology)公司)或# 104 203(突觸系統(Synaptic Systems)公司)；或神經突觸素抗體ADI-VAM-SV013(安卓生命科學(Enzo Life Sciences)公司)。
就一方面而言，如下列實例中所示，辨識未經剪切型與經神經毒素剪切型受質以測定細胞中的神經毒素受質總量之第一捕獲抗體，係用於進行正規化。
如本申請案所用之“第二捕獲抗體”係以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點。因此，該第二捕獲抗體係以選擇性方式辨識經神經毒素剪切的神經毒素受質，例如經BoNT/A剪切的SNAP-25產物。反之，該第二捕獲抗體無法與未經剪切的神經毒素受質結合，諸如未經剪切的SNAP-25。在本發明的方法中，可作為第二捕獲抗體的適當抗體實例如包括如本發明下文所示之小鼠單株抗體；辨識經BoNT/A剪切的SNAP-25之小鼠單株抗體MC-6053(R&D系統(R&D Systems)公司)(Baldwin與Barbieri於2007年期刊“Biochemistry”第46期第3200-3210頁乙文)；以及小鼠單株抗體DMAB4345(創新診斷設備(Creative Diagnostics)公司)。
就另一方面而言，本發明提供新穎的單株抗體，其係以特異性方式結合經神經毒素剪切型SNAP-25的剪切位點，亦即僅與經神經毒素剪切型SNAP-25結合，而不與未經剪切的SNAP-25結合。已依據下列實例所述產生該單株抗體並進行特徵分析，及發現因其等對於經神經毒素剪切型SNAP-25的高親和力及特異性，而特別適用作為本發 明方法的第二捕獲抗體。本發明的單株抗體較佳辨識並以特異性方式結合序列辨識編號：74中所示的抗原決定位SNAP-25190-197“TRIDEANQ”及/或結合SNAP-25197，亦即經神經毒素(如BoNT/A)剪切的SNAP-25。本發明的單株抗體更佳辨識並以特異性方式結合序列辨識編號：75中所示的抗原決定位SNAP-25191-197“RIDEANQ”及/或結合SNAP-25197，結合序列辨識編號：76中所示序列的抗原決定位SNAP-25192-197“IDEANQ”及/或結合SNAP-25197，或結合序列辨識編號：77中所示的抗原決定位SNAP-25193-197“DEANQ”及/或結合SNAP-25197。
就一方面而言，本發明係有關於一抗體或其片段，其以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切位點，及其所包括的一重鏈可變區(VH)係包含序列辨識編號18中所示的一胺基酸序列，及/或其所包括的一輕鏈可變區(VL)係包含序列辨識編號19中所示的一胺基酸序列。本發明進一步涵蓋抗體或其片段，其包括該重鏈及/或輕鏈可變區的一個、二個或三個互補決定區(CDR)。對應的CDRH1、CDRH2及CDRH3序列係分別示於序列辨識編號20至22中，其中對應的CDRL1、CDRL2及CDRL3序列係分別示於序列辨識編號23至25中。所述序列係對應於下列實例中所示之小鼠單株抗體20-2-5。此外，本發明係有關於一抗體或其片段，其以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切位點，及其所包括的一重鏈可變區(VH)係包含序列辨識編號26中所示的一胺基酸序列，及/或其所包括的一輕鏈可變 區(VL)係包含序列辨識編號27中所示的一胺基酸序列。本發明進一步涵蓋抗體或其片段，其包括該重鏈及/或輕鏈可變區的一個、二個或三個互補決定區(CDR)。對應的CDRH1、CDRH2及CDRH3序列係分別示於序列辨識編號28至30中，其中對應的CDRL1、CDRL2及CDRL3序列係分別示於序列辨識編號31至33中。所述序列係對應於下列實例中所示之小鼠單株抗體5-10-5。此外，本發明係有關於一抗體或其片段，其以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切位點，及其所包括的一重鏈可變區(VH)係包含序列辨識編號34中所示的一胺基酸序列，及/或其所包括的一輕鏈可變區(VL)係包含序列辨識編號35中所示的一胺基酸序列。本發明進一步涵蓋抗體或其片段，其包括該重鏈及/或輕鏈可變區的一個、二個或三個互補決定區(CDR)。對應的CDRH1、CDRH2及CDRH3序列係分別示於序列辨識編號36至38中，其中對應的CDRL1、CDRL2及CDRL3序列係分別示於序列辨識編號39至41中。所述序列係對應於下列實例中所示之小鼠單株抗體1-10-4。本發明亦有關於一抗體或其片段，其以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切位點，及其所包括的一重鏈可變區(VH)係包含序列辨識編號42中所示的一胺基酸序列，及/或其所包括的一輕鏈可變區(VL)係包含序列辨識編號43中所示的一胺基酸序列。本發明進一步涵蓋抗體或其片段，其包括該重鏈及/或輕鏈可變區的一個、二個或三個互補決定區(CDR)。對應的CDRH1、CDRH2及CDRH3序列係分別示於序列辨識編號44至46中， 其中對應的CDRL1、CDRL2及CDRL3序列係分別示於序列辨識編號47至49中。所述序列係對應於下列實例中所示之小鼠單株抗體16-5-4。此外，本發明係有關於一抗體或其片段，其以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切位點，及其所包括的一重鏈可變區(VH)係包含序列辨識編號50中所示的一胺基酸序列，及/或其所包括的一輕鏈可變區(VL)係包含序列辨識編號51中所示的一胺基酸序列。本發明進一步涵蓋抗體或其片段，其包括該重鏈及/或輕鏈可變區的一個、二個或三個互補決定區(CDR)。對應的CDRH1、CDRH2及CDRH3序列係分別示於序列辨識編號52至54中，其中對應的CDRL1、CDRL2及CDRL3序列係分別示於序列辨識編號55至57中。所述序列係對應於下列實例中所示之小鼠單株抗體6-3-8。本發明係又關於一抗體或其片段，其以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切位點，及其所包括的一重鏈可變區(VH)係包含序列辨識編號58中所示的一胺基酸序列，及/或其所包括的一輕鏈可變區(VL)係包含序列辨識編號59中所示的一胺基酸序列。本發明進一步涵蓋抗體或其片段，其包括該重鏈及/或輕鏈可變區的一個、二個或三個互補決定區(CDR)。對應的CDRH1、CDRH2及CDRH3序列係分別示於序列辨識編號60至62中，其中對應的CDRL1、CDRL2及CDRL3序列係分別示於序列辨識編號63至65中。所述序列係對應於下列實例中所示之小鼠單株抗體18-3-3。此外，本發明係有關於一抗體或其片段，其以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切 位點，及其所包括的一重鏈可變區(VH)係包含序列辨識編號66中所示的一胺基酸序列，及/或其所包括的一輕鏈可變區(VL)係包含序列辨識編號67中所示的一胺基酸序列。本發明進一步涵蓋抗體或其片段，其包括該重鏈及/或輕鏈可變區的一個、二個或三個互補決定區(CDR)。對應的CDRH1、CDRH2及CDRH3序列係分別示於序列辨識編號68至70中，其中對應的CDRL1、CDRL2及CDRL3序列係分別示於序列辨識編號71至73中。所述序列係對應於下列實例中所示之小鼠單株抗體14-12-1。
如本申請案所用之“第一檢測抗體”一詞，係指以特異性方式結合第一捕獲抗體之一抗體。該第一檢測抗體促成以特異性方式檢測第一捕獲抗體。藉由測量所結合的第一檢測抗體之量，可測定第一檢測複合體的量，因為在第一檢測複合體中所結合的第一檢測抗體之量係與第一檢測複合體所包含之第一捕獲抗體的量(及因此總量亦即經剪切與未經剪切的神經毒素受質之量)相關聯。例如，可使用一種具物種特異性的適當抗體作為第一檢測抗體：當使用一種小鼠抗體作為第一捕獲抗體時，該第一檢測抗體可為以特異性方式結合小鼠抗體之一種抗小鼠抗體。第一檢測抗體例如可為一種鹼性磷酸酶(AP)複合抗體、一種山葵過氧化酶(HRP)複合抗體或一種螢光染料複合抗體。例如，藉由使用戊二醛所進行之酵素與抗體的複合作用，係技藝中眾所周知。
酵素連結免疫吸附分析(ELISA)用於定量廣泛種 類的化合物與病原體已將近40年。最初，該分析法使用放射性來定量，但放射性免疫分析(RIA)已被使用酵素獲得比色結果之分析法取代。最近，已研發出產生螢光與發光產物之新的受質。新分析法的基本原理仍與比色分析法相同。藉由與抗體複合的蛋白之活性，將受質轉化為可測量的化合物，而賦予特異性。
在ELISA中常用的酵素複合物是鹼性磷酸酶或山葵過氧化酶。因此，就一方面而言，第一檢測抗體例如可與鹼性磷酸酶或與山葵過氧化酶複合。在本發明的方法中可作為第一檢測抗體的酵素複合物之其他實例，係包括使用葡萄糖作為受質之葡萄糖氧化酶；酪胺酸酶，其轉化受質1-(4-甲基-香豆素-7-基)-3-(4-羥苯基)尿素)(PAP-AMC)(Stratis Avrameas於1969年1月期刊“Immunochemistry”第6卷第1期第43-48、IN9-IN11、49-52頁乙文)；或ß-半乳糖苷酶，其轉化受質6,8-二氟-4-甲基繖形酮醯基ß-d-半乳哌喃糖苷(DiFMUG)(Gee於1999年8月期刊“Analytical Biochemistry”第273卷第1期第41-48頁乙文)。在添加受質時，酵素將該受質轉化為一種可檢測的形式。例如，鹼性磷酸酶催化磷酸酯類的剪切作用。當使用鹼性磷酸酶(AP)複合抗體作為第一檢測抗體時，適當的受質諸如4-甲基繖形酮醯磷酸酯衍生物如6,8-二氟-4-甲基繖形酮醯磷酸酯(DiFMUP)，或為螢光素二磷酸酯(FDP)。藉由鹼性磷酸酶可將6,8-二氟-4-甲基繖形酮醯磷酸酯(DiFMUP)轉化為一種可檢測的形式，亦即螢光產物6,8-二氟-4-甲基繖形酮。該 受質例如由分子探針(Molecular Probes)公司所提供。可藉由在約358/450奈米的最大激發/發射，測量DiFMUP的反應產物之螢光強度。適用於該目的之其他受質為9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDAO-磷酸酯；英杰公司)；螢光素二磷酸酯(FDP；西克瑪艾爾迪希(Sigma Aldrich)公司)；或4-甲基繖形酮醯磷酸酯(MUP；英杰公司)。藉由鹼性磷酸酶將DDAO-磷酸酯轉化為螢光產物二甲基吖啶酮(DDAO)，其最大激發/發射係在約646/659奈米。當使用FDP作為鹼性磷酸酶的受質時，反應產物為螢光素，其最大激發/發射約在490/514奈米。就MUP而言，對應的反應產物為4-甲基繖形酮(7-羥基-4-甲基香豆素)，其最大激發/發射約在360/449奈米。該等受質亦為市售商品，如可自分子探針公司購得。任擇地，在本發明的方法中，可使用山葵過氧化酶作為第一檢測抗體中的酵素複合物。山葵過氧化酶(HRP)催化過氧化氫(H2O2)的還原作用，使其變成水(H2O)。在特定受質的存在下，該受質作用為氫供體，山葵過氧化酶的作用將無色或非螢光分子分別轉化成為有色及/或螢光基團。例如，Amplex® Red(生命科技(Life Technologies)公司)係供用於含有山葵過氧化酶的分析法之一受質。Amplex Red在過氧化酶酵素的存在下，與過氧化氫以1：1的化學計量反應，而產生試鹵靈，試鹵靈是一種紅色螢光化合物，其最大吸光與螢光發射係分別位於563奈米與587奈米。山葵過氧化酶的受質之另一實例為Amplex® UltraRed(生命科技公司)。據報導Amplex® UltraRed試劑(在 約570/585奈米激發/發射)的性能優於Amplex® Red試劑，在山葵過氧化酶或山葵過氧化酶偶合型酵素分析法中，Amplex® UltraRed試劑試劑每莫耳所提供的螢光更亮，靈敏度更高。氧化型Amplex® UltraRed試劑(Amplex® UltroxRed試劑)之螢光對於pH值的敏感性較低；而受質及其氧化產物所展現的安定性，係高於在過氧化氫(H2O2)或硫醇類諸如二硫蘇糖醇(DTT)存在下之Amplex® Red試劑。本發明的方法中，其他適用的山葵過氧化酶受質例如包括10-乙醯基-3,7-二羥基啡(ADHP；AnaSpec公司)或3-(4-羥苯基)丙酸(HPPA；AnaSpec公司)(Tuuminen等人於1991年期刊“J.Immunoassay”第12期第29-46頁乙文)。
任擇地，第一檢測抗體可帶有一種可檢測的適當標記，而得以檢測第一捕獲抗體。該標記可藉由直接或間接方法加上。附加標記之直接方法涉及讓該標記與第一檢測抗體直接(以共價方式或非共價方式)結合。附加標記之間接方法涉及讓該標記以共價方式或非共價方式結合一試劑，該試劑帶有一種可檢測的標記及以特異性方式結合第一檢測抗體。該試劑例如可為以特異性方式結合第一檢測抗體之二級(或更高級)抗體。在這種情況下，該二級抗體與一種可檢測的標記偶合。應瞭解可額外使用其他更高級抗體，以供檢測第一檢測複合體之用。更高級抗體通常用於增加訊號。適宜的更高級抗體亦可包括眾所周知的鏈黴抗生物素蛋白-生物素系統(載體實驗室(Vector Laboratories)有限公司)，可包括眾所周知的Dako LSABTM2與LSABTM+(加標 記型鏈黴抗生物素蛋白-生物素)或Dako PAP(過氧化酶抗過氧化酶)。就另一方面而言，該第一檢測抗體的標記係一種螢光染料，亦即第一抗體與一種螢光染料複合。在這種情況下，可藉由螢光分析儀直接測量螢光。典型的螢光標記包括螢光蛋白，諸如GFP及其衍生物；Cy染料諸如Cy3或Cy5；德克薩斯紅(Texas Red)；螢光素；及阿歷克斯(Alexa)染料，如阿歷克斯(Alexa)568。
如本申請案所用之“第二檢測抗體”係以特異性方式結合第二捕獲抗體之一抗體。第二檢測抗體例如可與諸如鹼性磷酸酶、山葵過氧化酶、葡萄糖氧化酶或酪胺酸酶之一酵素複合。因此，就一方面而言，第二檢測抗體係一種鹼性磷酸酶(AP)複合抗體、一種山葵過氧化酶(HRP)複合抗體、一種葡萄糖氧化酶複合抗體或一種酪胺酸酶複合抗體。該第二檢測抗體促成以特異性方式檢測第二捕獲抗體。藉由測量所結合的第二檢測抗體之量，可測定第二檢測複合體的量，因為在第二檢測複合體中所結合的第二檢測抗體之量係與第二檢測複合體所包含之第二捕獲抗體的量(及因此經剪切的神經毒素受質之量)相關聯。例如，當使用一種兔抗體作為第二捕獲抗體時，可使用一種抗兔抗體作為第二檢測抗體。如在本申請案他處就第一檢測抗體所述，第二檢測抗體可帶有如上述的一酵素或一標記諸如螢光染料(亦即第二檢測抗體係與一種螢光染料複合)。就本發明方法的一方面而言，與第一檢測抗體複合的酵素係不同於與第二檢測抗體複合的酵素，以促成在本發明的方法 中分別以特異性方式檢測第一與第二捕獲抗體。例如，當第一檢測抗體為鹼性磷酸酶(AP)複合抗體時，第二檢測抗體可為山葵過氧化酶(HRP)複合抗體，或反之亦然。此外，鹼性磷酸酶與山葵過氧化酶的螢光受質之激發/發射光譜實質上不重疊且互不相同，亦即其等顯示出明顯的位移，從而得以區別個別產物所發出的螢光強度。例如，DiFMUP所展現的激發/發射係在約358/450奈米，而Amplex UltraRed所展現的激發/發射係在約570/585奈米，藉此得以準確測量藉由個別酵素轉化該螢光受質所產生的螢光強度。就另一方面而言，使用鹼性磷酸酶(AP)複合抗體作為供細胞中過量存在的抗原所用之第一檢測抗體，亦即用於測量細胞中之總神經毒素受質(未經剪切與經剪切的神經毒素受質)的量，諸如總SNAP-25。使用山葵過氧化酶(HRP)複合抗體作為供細胞中存量較低的抗原所用之第二檢測抗體，亦即用於測量細胞中之經剪切的神經毒素受質之量，諸如經BoNT/A剪切的SNAP-25。如技藝中所知，山葵過氧化酶的受質比鹼性磷酸酶的受質更加敏感，表示可檢測出較低量的分析物。當使用山葵過氧化酶抗體作為用於檢測經剪切型SNAP-25之二級抗體時，可檢測出較低量的經剪切型SNAP-25。進而，可測定較低量的BoNT/A，從而增加分析法的靈敏度。因為鹼性磷酸酶抗體係測量細胞中的SNAP-25總量，鑒於該分析物過量存在，鹼性磷酸酶不需對於受質具有高靈敏度。
如本申請案所用之“至少”一詞，例如“至少一種 第一捕獲抗體”，係指除了以特異性方式結合未經剪切與經神經毒素剪切的受質之一種抗體之外，在本發明的方法中可使用具所述特異性之一或多種其他抗體。同樣地，“至少一種第二捕獲抗體”係指除了以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點之一種抗體之外，在本發明的方法中可使用具所述特異性之一或多種其他抗體。此外，在本發明的方法中可使用以特異性方式結合一種第一檢測抗體(或多種第一檢測抗體)之一或多種第一檢測抗體。同樣地，在本發明的方法中可使用以特異性方式結合一種第二檢測抗體(或多種第二檢測抗體)之一或多種第二檢測抗體。
“第一檢測複合體”一詞係指包括一種第一捕獲抗體與一種第一檢測抗體之複合體，其以特異性方式結合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質，藉此得以測定細胞中的神經毒素受質總含量。可藉由測定以特異性方式結合的第一檢測抗體之量，而測量第一檢測複合體的量。其進行係依第一檢測抗體之酵素或標記的性質而定，例如藉由測量螢光強度而進行之。
“第二檢測複合體”一詞係指包括第二捕獲抗體與第二檢測抗體之複合體，其以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質的剪切位點，藉此得以測定細胞中之經剪切的神經毒素受質的含量。可藉由測定以特異性方式結合的第二檢測抗體之量，而測量第二檢測複合體的量。其進行係依第二檢測抗體之酵素或標記的性質而定，例如藉由測量螢光強度而進行之。
可設想使用任一檢測系統來施行本發明的方法，而不採用酵素連結免疫吸附分析(ELISA)，前提在於其訊號雜訊比能以統計上顯著的程度辨別來自所形成的抗體抗原複合體之訊號及背景訊號。免疫式檢測系統之非限制性實例包括免疫印漬分析，如西方印漬術與點印漬術；免疫沉澱分析；及雙抗體夾心ELISA。可使用具有成像作用或磷成像作用的放射顯跡術(AU)、生物性發光(BL)、螢光、共振能量轉移、平面極化、比色或流動式細胞測量術(FC)進行訊號之檢測。免疫式檢測系統之說明例如揭露於“分子選殖之常用技術(Commonly Used Techniques in Molecular Cloning)”乙書第A8.1-A8-55頁(Sambrook與Russell編輯之“分子選殖：實驗室手冊(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)”第三冊第3.sup.rd版(2001年))；檢測系統(Detection Systems)第A9.1-A9-49頁(Sambrook與Russell編輯之“分子選殖：實驗室手冊”第三冊第3.sup.rd版(2001年))。
就另一方面而言，本申請案中所提及之細胞、抗體、神經毒素多肽與神經毒素受質或其他任何產物，係分別為分離型細胞、抗體、神經毒素多肽、神經毒素受質或產物。如本申請案所用之“分離型”一詞，諸如分離型抗體，係指藉由使用人為干預手段，使其從天然環境分離之一分子。
就本發明方法的一方面而言，該方法係一種螢光方法。
就本發明方法的另一方面而言，該神經毒素多肽 係一種BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G多肽或一種破傷風(TeNT)神經毒素多肽，如本申請案他處所詳細界定。
就本發明方法的另一方面而言，該神經毒素受質係VAMP/突觸囊泡蛋白、SNAP-25或神經突觸素。
在下文中，可用於本發明方法中的個別神經毒素受質之對應登錄序號係顯示如下：人類SNAP-25為P60880、人類神經突觸素1A型為Q16623、神經突觸素1B型為P61266、神經突觸素2型為P32856、神經突觸素3型為Q13277、神經突觸素4型為Q12846、神經突觸素5型為Q13190、神經突觸素6型為O43752型、神經突觸素7型為O15400、神經突觸素8型為Q9UNK0、神經突觸素10型為O60499、神經突觸素11型為O75558，神經突觸素12型為Q86Y82、神經突觸素16型為O14662型、神經突觸素17型為P56962、神經突觸素18型為Q9P2W9、神經突觸素19型為Q8N4C7；人類突觸囊泡蛋白1型為P23763、突觸囊泡蛋白2型為P63027、突觸囊泡蛋白3型為Q15836；人類突觸結合蛋白(synaptotagmin)：突觸結合蛋白1型為P21579、突觸結合蛋白2型為Q8N9I0、突觸結合蛋白3型為Q9BQG1、突觸結合蛋白4型為Q9H2B2、突觸結合蛋白5型為O00445、突觸結合蛋白6型為Q5T7P8、突觸結合蛋白8型為Q8NBV8、突觸結合蛋白9型為Q86SS6、突觸結合蛋白10型為Q6XYQ8、突觸結合蛋白11型為Q9BT88、突觸結合蛋白12型為Q8IV01、突觸結合蛋白13型為Q7L8C5、突觸結合蛋白14型為Q8NB59、突觸結合蛋 白15型為Q9BQS2、突觸結合蛋白16型為Q17RD7、突觸結合蛋白17型為Q9BSW7；人類囊泡相關膜蛋白(VAMP)：囊泡相關膜蛋白1型為P23763、囊泡相關膜蛋白2型為P63027、囊泡相關膜蛋白3型為Q15836、囊泡相關膜蛋白4型為O75379、囊泡相關膜蛋白5型為O95183、囊泡相關膜蛋白7型為P51809、囊泡相關膜蛋白8型為Q9BV40；突觸囊泡醣蛋白(SV2)：突觸囊泡醣蛋白2A型為Q7L0J3、突觸囊泡醣蛋白2B型為Q7L1I2、突觸囊泡醣蛋白2C型。
就本發明的另一方面而言，細胞為選自由下列所組成的群組之神經元細胞或神經元分化細胞：初級神經元細胞；可分化成神經元細胞之腫瘤細胞，諸如神經母細胞瘤細胞或如本申請案他處所界定之細胞系；P19細胞或誘導型多潛能幹細胞(iPS)所衍生的神經元，較佳為人類誘導型多潛能幹細胞(iPS)所衍生的神經元。
就本發明方法的另一方面而言，藉由添加選自由甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或其混合物所組成的群組之一固定劑，進行細胞固定作用。較佳藉由添加冰冷甲醇(-20℃)及在-20℃培養約20分鐘，而進行細胞固定作用。
就本發明方法的一方面而言，第一捕獲抗體係以特異性方式結合未經剪切與經神經毒素剪切的受質，而得以用於測定細胞中的神經毒素受質總量。個別神經毒素受質內之第一捕獲抗體的適宜結合區及抗原決定位，已在本申請案他處界定。
就本發明方法的具體方面而言，以特異性方式結 合未經剪切型與經神經毒素剪切型受質之第一捕獲抗體係兔多株抗SNAP-25抗體S9684、兔多株抗SNAP25抗體PA5-19708(皮爾斯抗體公司)或兔多株抗SNAP25抗體PA5-19701(皮爾斯抗體公司)。
就本發明方法的另一方面而言，第二捕獲抗體係本發明之小鼠單株抗體20-2-5、5-10-5、1-10-4、16-5-4、6-3-8、18-3-3或14-12-1，或小鼠單株抗體殖株MC-6053(R&D系統公司)。第二捕獲抗體較佳為小鼠單株抗體20-2-5。本發明的小鼠單株抗體之可變區與CDR的對應序列已述於本申請案他處。
就本發明方法的具體方面而言，第一及/或第二捕獲抗體係經固定化(immobilized)。例如，該第一及/或第二捕獲抗體係與一固態支撐體連結。如本申請案所用之“固態支撐體”一詞係與“固相”同義，係指可用於固定如本說明書中所揭露的第一及/或第二捕獲抗體之任一基質。固態支撐體的非限制性實例如包括管；板；柱；針或或“量桿”；一種磁性顆粒、珠粒或其他球狀或纖維狀層析介質，諸如洋菜糖、瓊脂糖、矽石與塑料；及薄片或膜，諸如硝化纖維素與聚二氟亞乙烯(PVDF)。可使用各種不同的材料來建造該固相載體，諸如玻璃、碳、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚葡萄糖、尼龍、重氮纖維素或澱粉。所選擇的固態支撐體之物理性質使其容易與可溶性或未結合的物質分離，即通常容許未結合的物質諸如過量試劑、反應副產物或溶劑與固態支撐體所結合的分析組分分離，或 在其他情況下被移除(如藉由清洗、過濾、離心等)。如何製作與使用固態支撐體之非限制性實例述於如上文之“分子選殖：實驗室手冊”乙書(2001年)；及上文之“當前分子生物學方法(Current Protocols in Molecular Biology)”乙書(2004年)，其中各者在此完整併入本案以為參考資料。就一方面而言，第一及/或第二捕獲抗體係與珠粒複合。可設想抗體-珠粒複合體的尺寸夠小，而得以經由細胞透化作用所產生的孔洞進入細胞中。
就本發明方法的具體方面而言，第一檢測抗體係一種鹼性磷酸酶(AP)複合抗體、一種山葵過氧化酶(HRP)複合抗體或一種螢光染料複合抗體。
就本發明方法的其他具體方面而言，第二檢測抗體係一種鹼性磷酸酶(AP)複合抗體、一種山葵過氧化酶(HRP)複合抗體、一種葡萄糖氧化酶複合抗體、一種酪胺酸酶複合抗體或ß-半乳糖苷酶複合抗體。
較佳使用鹼性磷酸酶(AP)複合抗體作為第一檢測抗體，以測量細胞中之總神經毒素受質(未經剪切與經剪切的神經毒素受質)的量，諸如總SNAP-25；及使用山葵過氧化酶(HRP)複合抗體作為第二檢測抗體，以測量細胞中之經剪切的神經毒素受質的量，諸如經BoNT/A剪切的SNAP-25。
就本發明方法的特定方面而言，鹼性磷酸酶的受質係一種4-甲基繖形酮醯磷酸酯衍生物諸如6,8-二氟-4-甲基繖形酮醯磷酸酯(DiFMUP)，或為螢光素二磷酸酯 (FDP)。
就本發明方法的具體方面而言，山葵過氧化酶的受質係Amplex UltraRed、10-乙醯基-3,7-二羥基啡(ADHP)或3-(4-羥苯基)丙酸(HPPA)。
就本發明方法更具體的一方面而言，該方法係如圖1所示進行。
本發明的另一方面係有關於用於進行本發明方法之一套組，其中包含：a)由一種第一捕獲抗體、一種第二捕獲抗體、一種第一檢測抗體及一種第二檢測抗體所組成之一配置，其中該配置得以用於進行本發明之方法；b)以如a)中的配置所測定之第一與第二檢測複合體的量為基礎，計算該神經毒素所剪切之受質的量之構件；及c)進行該方法之說明書。
如本申請案所用之“套組”一詞係指本發明的前述構件或試劑之組合，其等可能包裝在一起，也可能不包裝在一起。該套組的組分可能分開裝入不同的小瓶(亦即由分開的部件所組成之一套組)，或以單一小瓶的形式提供。此外，應理解本發明的套組係用於實施本申請案上述所指之方法。就一方面而言，可設想所提供的所有組分係立即可用於實施本申請案上述所指之方法。就另一方面而言，該套組包含進行該方法之說明書。所提供的說明書可為紙本或電子化的使用者手冊。例如，該手冊可包括當使用本發明的套組進行前述方法時，如何闡釋所得結果之說明。
最後，就另一方面而言，本發明係有關用於製造供藥妝應用之配方型神經毒素產品之一種方法，其包括(i)藉由本發明的方法測定一神經毒素產品的生物活性；及(ii)配製該神經毒素產品，以供藥妝應用之用。依所欲的應用目的而定，亦可藉由技藝中所知的不同技術配製該神經毒素產品。例如，該(生物活化型)神經毒素產品可與一或多種藥學上可接受的載劑組合，而以藥學組成物的形式供使用。在與配方中的其他成分相容並且對於使用者無害等方面，藥學上可接受的載體必須是可接受的。所用的藥學載劑可包括固體、凝膠或液體。例示性固體載劑為乳糖、白土、蔗糖、滑石、明膠、瓊脂、果膠、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸等。例示性液體載劑為甘油、磷酸鹽緩衝型食鹽水溶液、水、乳狀液、各種類型的濕潤劑等。適宜的載劑包括上述各者及技藝中眾所周知的其他載劑，如見美國賓州伊斯頓(Easton)之麥克(Mack)出版公司出版之雷明頓製藥學(Remington’s Pharmaceutical Sciences)乙書。就一方面而言，在投藥之前，可將該藥學組成物溶於一稀釋劑中。所選擇的稀釋劑亦不致影響神經毒素產品的生物活性。該等稀釋劑之實例為蒸餾水或生理食鹽水。此外，該藥學組成物或配方亦可包括其他載劑或非毒性、非治療性、非致免疫性安定劑等。因此，就一方面而言，該配方型神經毒素產品能以液態或冷凍乾燥形式存在。就一方面而言，其可與甘油、蛋白質類安定劑(HSA)或非蛋白質類安定劑一起存在，諸如聚乙烯氫吡咯酮(PVP)、玻尿酸或游離胺基酸。就 一方面而言，適宜的非蛋白質類安定劑係揭露於WO 2005/007185或WO 2006/020208中。就一方面而言，如本發明方法的步驟(i)所測定之生物活性係對應於25、50、75、100、125、150或200U(小鼠LD50單位)的肉毒桿菌毒素活性。該配方型神經毒素產品可依治療有效劑量用於人類或動物之各種疾病或疾患的療法中，或供美容用途之用。
在本申請案中所提及之疾病或疾患係選自由下列所組成的群組：隨意肌的肌力、局部肌張力不全症，包括頸部、顱部肌張力不全症；及良性自發性瞼痙攣、面肌痙攣與局部痙攣；腸胃疾病；多汗症；及美容除皺；瞼痙攣；開顎型、閉顎型口頷部肌張力不全症；磨牙症；梅格斯氏(Meige)症候群；舌部肌張力不全症；眼瞼失用症；開放型頸肌張力異常症、頸前屈症、頸後傾症、頸側傾症、斜頸症；咽肌張力不全症、喉肌張力不全症、痙攣性發聲障礙/內收肌型、痙攣性發聲障礙/外展肌型；痙攣性呼吸困難；四肢肌張力不全症、臂部肌張力不全症；工作性肌張力不全症、作家痛性痙攣、音樂家痛性痙攣、高爾夫球員痛性痙攣；大腿內收型、大腿外展型腿部肌張力不全症；膝關節屈曲；膝關節伸展；踝關節屈曲；踝關節伸展；馬蹄內翻足；畸形足肌張力不全症；紋狀趾；趾屈曲；趾伸展；縱軸性肌張力不全症；比薩症候群；肚皮舞者肌張力不全症；節段性肌張力不全症；偏身肌張力不全症；全身性肌張力不全症；X連鎖肌張力不全型帕金森氏症中之肌張力不全症；皮質基底節變性中之肌張力不全症；X連鎖肌張 力不全型帕金森氏症中之肌張力不全；遲發性肌張力不全症；脊髓小腦性失調症中之肌張力不全；帕金森氏症中之肌張力不全；杭丁頓氏症中之肌張力不全；哈勒沃登-施帕茨氏(Hallervorden-Spatz)症中之肌張力不全；多巴誘發性運動障礙/多巴誘發性肌張力不全症；遲發性運動障礙/遲發性肌張力不全症；陣發性運動障礙/肌張力不全症；動作源性、非動作源性、動作誘發性顎肌陣攣；肌陣攣性肌纖維顫動；僵硬；良性肌肉痛性痙攣；遺傳性下頷顫抖；奇特的頷肌活動；單側咀嚼肌痙攣；肥大性臂肌病變；咀嚼肌肥大(maseteric hypertrophy)；脛骨前肌肥大症；眼球震顫症；振動幻視型核上凝視麻痺；持續性局部癲癇症；規劃進行痙攣性斜頸症手術；外展肌聲帶麻痹；頑固型突變性發聲障礙(recalcitrant mutational dysphonia)；上食道括約肌功能異常；聲帶肉芽腫；口吃型基列德拉妥瑞氏(Gilles de la Tourette)症候群；中耳肌陣攣；保護性喉部閉合；喉切除手術後無法言語；保護性上瞼下垂；瞼內翻型奧狄氏(Oddi)括約肌功能障礙；假性食道弛緩不能型、非弛緩不能型食道運動障礙；陰道痙攣症；手術後制動型震顫；膀胱功能障礙；逼尿肌括約肌協同失調症；膀胱括約肌痙攣；面肌痙攣；神經移植型運動障礙；頦肌型下巴凹陷；僵硬人症候群；破傷風型前列腺增生；肥胖症；治療小兒腦性麻痺性斜視；伴發性混合型麻痺；在視網膜剝離手術後、在白內障手術後、無晶狀體肌炎性斜視；肌病性斜視；分離性垂直斜視；作為斜視手術之輔助；內斜視；外斜視；弛緩 不能症；肛裂；外分泌腺機能亢進；佛雷氏(Frey)症候群；假哭性症候群；腋下、手掌、足底多汗症；鼻漏；在中風、帕金森氏症(Parkinsosn’s)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、痙攣性病況、腦炎及脊髓炎自體免疫過程中之相對流涎過多；多發性硬化症；橫貫性脊髓炎；戴維克(Devic)症候群；病毒感染、細菌感染；寄生蟲感染、真菌感染；遺傳性痙攣截癱；中風後症候群、腦半球梗塞、腦幹梗塞、脊髓梗塞；中樞神經系統創傷；腦半球病變、腦幹病變、脊髓病變；中樞神經系統出血、大腦內出血、蛛網膜下出血、硬膜下出血、脊椎內出血；贅生物形成、腦半球腫瘤、腦幹腫瘤、脊髓腫瘤及陰道痙攣(vaginism)。美容用途係選自治療或減少皺紋如魚尾紋或GFL、皺眉、臉部不對稱。
在本說明書中所引用的所有參考文獻，係在此將其等完整的揭露內容及在本說明書中所個別提及的揭露內容併入本申請案以為參考資料。
圖式顯示：圖1：圖示代表本發明的細胞式分析法之作用模式。將易受神經毒素毒害的細胞接種至多孔式平皿中，之後，用神經毒素多肽毒害細胞，及在所指定的毒害期間後，將細胞固定。經神經毒素剪切型SNAP-25的特異性抗體及未經剪切型SNAP-25的特異性抗體係與SNAP-25上的特異性結合位點結合。使用酵素偶合型抗宿主特異性二級抗體，該等結合事件可用於產生可測量的訊號，該訊號係與該孔 內之經神經毒素剪切型SNAP-25的濃度及SNAP-25的總量相關聯。隨著BoNT/A濃度之增加，所測得之經剪切型SNAP-25的量增加，造成訊號之增加。
圖2：該二圖代表如例2針對iPS衍生型神經元與SiMa細胞所得之BoNT/A校正曲線。其等顯示BoNT/A的濃度與活性分別與針對山葵過氧化酶受質所測定的螢光訊號(RFU)及與就該孔內的SNAP-25總量進行正規化之經BoNT/A剪切型SNAP-25的含量之間的相依性。當BoNT/A的濃度與活性分別增加時，更多的SNAP-25被神經毒素轉化，造成經剪切型SNAP-25的含量之增加。
圖3：該圖代表如例4針對iPS衍生型神經元所得之BoNT/A校正曲線。其顯示BoNT/A的濃度與活性分別與針對山葵過氧化酶受質所測定的螢光訊號(RFU)及與經BoNT/A剪切型SNAP-25的含量及與就該孔內的SNAP-25總量進行正規化之經BoNT/A剪切型SNAP-25的含量之間的相依性。當BoNT/A的濃度與活性分別增加時，更多的SNAP-25被神經毒素轉化，造成經剪切型SNAP-25的含量增加。
現在以下列實例說明本發明，然而，不應將該等實例解釋為限制本發明之範疇。
例1：產生以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質SNAP-25的剪切位點之單株抗體
使用融合瘤標準技術，產生以特異性方式結合經神經毒素 剪切型受質SNAP-25的剪切位點之小鼠單株抗體。為此，以在N端具有一個半胱胺酸殘基之SNAP-25190-197，即“C-TRIDEANQ”(序列辨識編號：17)，免疫接種Balb/c小鼠(雌性，8個星期大)。該N端的半胱胺酸殘基並非衍生自SNAP-25胺基酸序列，而是經導入用於連接SNAP-25190-197肽(序列辨識編號：74)與鑰孔血藍蛋白(KLH)。藉由將小鼠脾臟細胞與自德國微生物與細胞培養保存中心(德國布朗斯威克(Braunschweig)的DSMZ有限公司，ACC 146)購得的骨髓瘤細胞系SP2/0-Ag14(SP2/0)融合，而獲得融合瘤細胞；亦見Hemmerlein於2006年期刊“Molecular Cancer”第5期第41頁乙文。在ELISA中篩選以特異性方式結合經神經毒素剪切型受質SNAP-25的剪切位點之抗體。基於對於經BoNT/A剪切型SNAP-25的特異性與親和力進行篩選，而得到殖株。試驗殖株對於未經剪切的SNAP-25206之不結合性，而作為負對照組。因此，發現小鼠單株抗體20-2-5、5-10-5、1-10-4、16-5-4、6-3-8、18-3-3及14-12-1對於經BoNT/A剪切型SNAP-25197具有高度特異性，並且在ELISA與西方印漬術中，未檢測出對於SNAP25206的交叉反應性。使用小鼠單株抗體分型試驗套組(Serotec公司)，進行該單株抗體之亞型鑑定。因此，發現mAb 20-2-5、14-12-1、6-3-8及5-10-5為IgG1抗體，而mAb 18-3-3、16-5-4及1-10-4為IgG2a抗體。VH與VL鏈的對應胺基酸序列及所述小鼠單株抗體的對應CDR(互補決定區)序列係示於序列表中。
例2：雙螢光-CB-BoNT/A活性ELISA
細胞固定作用
1.將培養基/毒素溶液移除。添加100微升/孔的冰冷甲醇(-20℃)及在-20℃培養20分鐘。
註：後續所有步驟皆在室溫進行。
在細胞固定作用之後：
1.移除甲醇溶液及添加100微升/孔的PBS緩衝液。若要儲存較長的時間(超過1天)，則應添加300微升/孔的PBS緩衝液，及用石蠟膜封住平皿。將平皿儲存於冰箱中。
2.將PBS緩衝液移除，及用200微升/孔的清洗緩衝液清洗細胞三次。各步驟應在溫和搖動下進行1分鐘。
3.將清洗緩衝液移除，添加100微升/孔的驟冷緩衝液，及在溫和搖動下培養20分鐘。
4.將驟冷緩衝液移除，及在溫和搖動下，用300微升/孔的清洗緩衝液清洗細胞一次及為時5分鐘。
5.將清洗緩衝液移除，添加200微升/孔的阻斷緩衝液，及在溫和搖動下培養1小時。
6.將阻斷緩衝液移除，添加100微升/孔的透化緩衝液，及在溫和搖動下培養15分鐘。
7.將透化緩衝液移除，及用300微升/孔的PBS緩衝液清洗細胞一次。該步驟應在溫和搖動下進行1分鐘。
8.將PBS緩衝液移除，及在各孔中添加100微升的初級抗體混合物(用阻斷緩衝液稀釋抗體)。在溫和搖動下培養過夜(16至18小時)。細胞係同時與二種初級抗體一起培養：一種對於經BoNT/A剪切型SNAP-25具特異性之小鼠抗體及一 種辨識SNAP-25之多株兔抗體(用於測定SNAP-25總量以供進行正規化之抗體)。
9.將初級抗體混合物移除，及用200微升的清洗緩衝液清洗細胞四次。各步驟應在溫和搖動下進行5分鐘。
10.將清洗緩衝液移除，在各孔中添加100微升的二級抗體混合物：山葵過氧化酶複合型抗小鼠二級抗體與鹼性磷酸酶複合型抗兔二級抗體(用阻斷緩衝液稀釋抗體)，及在溫和搖動下培養2.5至3小時。
11.將二級抗體混合物移除，及用200微升的清洗緩衝液清洗細胞五次，接著以300微升/孔的HEPES緩衝液進行一清洗步驟。各清洗步驟應在溫和搖動下進行5分鐘。
12.移除平皿中的PBS緩衝液，及在各孔中添加75微升之山葵過氧化酶的螢光受質(HRP受質)。在溫和搖動下培養50分鐘。保護平皿，避免光線直接照射。
13.在各孔中添加75微升之鹼性磷酸酶的螢光受質(AP受質)，及在溫和搖動下再培養50分鐘。保護平皿，避免光線直接照射。
14.使用螢光平皿分析儀讀取平皿：
讀取在540奈米之激發；在600奈米之發射。
讀取在360奈米之激發；在450奈米之發射。
15.計算
就正規化而言，經剪切型SNAP-25的RFU值(在600奈米之螢光)係就各孔中的總SNAP-25(450奈米)進行正規化。為利於在圖示中說明RFU值，使用下列公式將各數值乘以1000：
隨後將各標準或試樣所得的RFU值平均。
試劑之製備
清洗緩衝液：
位於10mM PBS緩衝液中之0.1%曲拉通(Triton)X-100(pH 7.4)
PBS緩衝液(10mM)：
磷酸鹽緩衝型食鹽水(西克瑪公司，# P5368)(pH 7.4)
驟冷緩衝液：
位於10mM PBS緩衝液中之0.6%過氧化氫(pH 7.4)
阻斷緩衝液：
位於10mM PBS緩衝液中之2% BSA(pH 7.4)+0.05%曲拉通(Triton)X-100
透化緩衝液：
位於10mM PBS緩衝液中之0.5%曲拉通(Triton)X-100
HEPES緩衝液：
50mM HEPES(pH 7.4)
山葵過氧化酶(HRP)受質：
50mM HEPES(pH 7.4)
0.007%過氧化氫
150pM Amplex UltraRed
鹼性磷酸酶(AP)受質：
25mM二乙醇胺(pH 9.8)
2mM氯化鎂
100μl M DiFMUP
例3：如本發明例2之CBA-ELISA中的BoNT/A校正曲線之說明
依據供應商的使用說明書，進行親代SiMa細胞之培養及BoNT/A的毒害作用。同樣地，依據製造商的程序，進行人類誘發型多潛能幹細胞(iPS)所衍生的神經元(細胞動力公司)之細胞培養及BoNT/A的毒害作用。
如例2進行ELISA。使用兔多株抗SNAP-25抗體S9684(西克瑪公司)，作為以特異性方式結合未經剪切型及經BoNT/A剪切型SNAP-25之第一捕獲抗體。藉由該抗體而得以檢測細胞中的SNAP-25總量。使用本發明(參見例1)的單株抗體殖株20-2-5，作為以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切位點之第二捕獲抗體。
圖2中的二圖式顯示所得的BoNT/A校正曲線。其等顯示BoNT/A的濃度與活性分別與針對山葵過氧化酶受質所測定的螢光訊號(RFU)及與經BoNT/A剪切型SNAP-25的含量之間的相依性(為說明單一BoNT/A標準之誤差，RFU值係未經空白校正)。當BoNT/A的濃度與活性分別增加時，更多的SNAP-25被神經毒素轉化，造成經剪切型SNAP-25的含量增加。藉由使用一個具四項參數之公式，說明BoNT/A濃度的訊號/BoNT/A活性之相依性。
例4：雙螢光-CB-BoNT/A活性ELISA
細胞固定作用
1.將培養基/毒素溶液移除。添加100微升/孔的冰冷甲醇(-20℃)及在-20℃培養20分鐘。
註：後續所有步驟皆在室溫進行。
在細胞固定作用之後：
1.移除甲醇溶液及添加100微升/孔的PBS緩衝液。若要儲存較長的時間(超過1天)，則應添加300微升/孔的PBS緩衝液，及用石蠟膜封住平皿。將平皿儲存於冰箱中。
2.將PBS緩衝液移除，及用200微升/孔的PBS緩衝液清洗細胞三次。各步驟應在溫和搖動下進行1分鐘。
3.將PBS緩衝液移除，及添加100微升/孔的驟冷緩衝液，及在溫和搖動下培養20分鐘。
4.將驟冷緩衝液移除，及在溫和搖動下，用300微升/孔的清洗緩衝液清洗細胞一次及為時3分鐘。
5.將PBS緩衝液移除，添加200微升/孔的阻斷緩衝液，及在溫和搖動下培養1小時。
6.將阻斷緩衝液移除，及在各孔中添加100微升的初級抗體混合物(用阻斷緩衝液稀釋抗體)。在溫和搖動下培養過夜(16至18小時)。細胞係同時與二種初級抗體一起培養：一種對於經BoNT/A剪切型SNAP-25具特異性之小鼠抗體及一種辨識SNAP-25之多株兔抗體(用於測定SNAP-25總量以供進行正規化之抗體)。
7.將初級抗體混合物移除，及用200微升的PBS緩衝液清 洗細胞四次。各步驟應在溫和搖動下進行3分鐘。
8.將PBS緩衝液移除，在各孔中添加100微升的二級抗體混合物：山葵過氧化酶複合型抗小鼠二級抗體與鹼性磷酸酶複合型抗兔二級抗體(用阻斷緩衝液稀釋抗體)，及在溫和搖動下培養2.5至3小時。
9.將二級抗體混合物移除，及用200微升/孔的PBS緩衝液清洗細胞五次，接著以300微升/孔的HEPES緩衝液進行一清洗步驟。各清洗步驟應在溫和搖動下進行3分鐘。
10.移除平皿中的HEPES緩衝液，及在各孔中添加75微升之山葵過氧化酶的螢光受質(HRP受質)。在溫和搖動下培養50分鐘。保護平皿，避免光線直接照射。
11.在各孔中添加75微升之鹼性磷酸酶的螢光受質(AP受質)，及在溫和搖動下再培養50分鐘。保護平皿，避免光線直接照射。
12.使用螢光平皿分析儀讀取平皿：
讀取在540奈米之激發；在600奈米之發射。
讀取在360奈米之激發；在450奈米之發射。
13.計算
就正規化而言，經剪切型SNAP-25的RFU值(於600奈米之螢光)係就各孔中的總SNAP-25(450奈米)進行正規化。為利於在圖示中說明RFU值，使用下列公式將各數值乘以1000：
隨後將各標準或試樣所得的RFU值平均。
試劑之製備
PBS緩衝液(10mM)：
磷酸鹽緩衝型食鹽水(西克瑪公司，# P5368)(pH 7.4)
驟冷緩衝液：
位於10mM PBS緩衝液中之0.6%過氧化氫(pH 7.4)
阻斷緩衝液：
位於10mM PBS緩衝液中之2% BSA(pH 7.4)+0.05%曲拉通(Triton)X-100
HEPES緩衝液：
50mM HEPES(pH 7.4)
山葵過氧化酶(HRP)受質：
50mM HEPES(pH 7.4)
0.007%過氧化氫
150pM Amplex UltraRed
鹼性磷酸酶(AP)受質：
25mM二乙醇胺(pH 9.8)
2mM氯化鎂
100μM DiFMUP
例5：如本發明例4之CBA-ELISA中的BoNT/A校正曲線之說明
依據製造商的程序，進行人類誘發型多潛能幹細胞(iPS)所衍生的神經元(細胞動力公司)之細胞培養及BoNT/A的毒害作用。
如例4進行ELISA。使用兔多株抗SNAP-25抗體S9684(西克瑪公司)，作為以特異性方式結合未經剪切型及經BoNT/A剪切型SNAP-25之第一捕獲抗體。藉由該抗體而得以檢測細胞中的SNAP-25總量。使用本發明(參見例1)的單株抗體殖株20-2-5，作為以特異性方式結合經BoNT/A剪切型SNAP-25的剪切位點之第二捕獲抗體。
圖3中所示的圖式係代表所得的BoNT/A校正曲線。其顯示BoNT/A的濃度與活性分別與針對山葵過氧化酶受質所測定的螢光訊號(RFU)及與經BoNT/A剪切型SNAP-25的含量之間的相依性。當BoNT/A的濃度與活性分別增加時，更多的SNAP-25被神經毒素轉化，造成經剪切型SNAP-25的含量增加。藉由使用一個具四項參數之公式，說明BoNT/A濃度的訊號/BoNT/A活性之相依性。
<110> 曼茲法瑪股份有限公司
<120> 用於測定細胞中神經毒素多肽之生物活性的工具及方法
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<170> 專利申請軟體3.5版
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Claims (21)

  1. 一種用於直接測定神經毒素多肽在細胞中的生物活性之方法，其步驟包括：a)在容許神經毒素多肽展現其生物活性之條件下，將易受神經毒素毒害的細胞與該神經毒素多肽一起培養一段時間；b)固定該細胞，及選擇性地用一種清潔劑使該細胞透化(permeabilizing)；c)在容許下述該等捕獲抗體與該等受質結合的條件下，讓該細胞與至少一種第一捕獲抗體接觸，該第一捕獲抗體係特異性結合至未經剪切型(non-cleaved)與經神經毒素剪切型(Neurotoxin-cleaved)受質，及讓該細胞與至少一種第二捕獲抗體接觸，該第二捕獲抗體係特異性結合至經神經毒素剪切型受質的剪切位點；d)在容許下述該第一檢測抗體與該第一捕獲抗體結合的條件下，讓該細胞與至少一種特異性結合至該第一捕獲抗體之第一檢測抗體接觸，從而形成第一檢測複合體，及在容許下述該第二檢測抗體與該第二捕獲抗體結合的條件下，讓該細胞與至少一種特異性結合至該第二捕獲抗體的第二檢測抗體接觸，從而形成第二檢測複合體，其中該第一檢測抗體與該第二檢測抗體係與不同酵素複合(conjugated with different enzymes)；e)測定步驟d)中之第一與第二檢測複合體的量；及 f)藉由該第二檢測複合體計算該受質在該細胞中被該神經毒素多肽所剪切的量，藉此測定該神經毒素多肽在該細胞中的生物活性。
  2. 如請求項1之方法，其中該方法係一種螢光方法。
  3. 如請求項1之方法，其中該神經毒素多肽係BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或TeNT。
  4. 如請求項2之方法，其中該神經毒素多肽係BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或TeNT。
  5. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該受質係VAMP/突觸囊泡蛋白(Synaptobrevin)、SNAP-25或神經突觸素(Syntaxin)。
  6. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該細胞係選自由下列所組成的群組之神經元細胞或神經元分化細胞：初級神經元細胞及可分化為神經元細胞之腫瘤細胞。
  7. 如請求項6之方法，其中該可分化為神經元細胞之腫瘤細胞為神經母細胞瘤細胞、P19細胞或誘導型多潛能幹細胞(IPS)所衍生的神經元。
  8. 如請求項1至4中任一項之方法，其中固定該細胞係藉由添加選自由下列所組成之群組之一固定劑來進行：甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或其混合物。
  9. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該第一捕獲抗體係特異性結合至未經剪切型與經神經毒素剪切型受質，而 得以用於測定該細胞中該神經毒素受質之總量。
  10. 如請求項9之方法，其中該特異性結合至未經剪切型與經神經毒素剪切型受質之第一捕獲抗體係抗SNAP-25之兔多株抗體S9684、抗SNAP25之兔多株抗體PA5-19708(皮爾斯抗體公司(Pierce Antibodies))或抗SNAP25之兔多株抗體PA5-19701(皮爾斯抗體公司)。
  11. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該第二捕獲抗體係包含如示於序列辨識編號20至22中之CDRH1、CDRH2及CDRH3與如示於序列辨識編號23至25中之CDRL1、CDRL2及CDRL3的抗體，或小鼠單株抗體MC-6053(R&D系統公司(R&D Systems))。
  12. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該第一及/或第二捕獲抗體係經固定化(immobilized)。
  13. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該第一檢測抗體係一種鹼性磷酸酶(AP)複合抗體、一種山葵過氧化酶(HRP)複合抗體或複合至一種螢光染料之抗體。
  14. 如請求項1至4中任一項之方法，其中該第二檢測抗體係一種鹼性磷酸酶(AP)複合抗體、一種山葵過氧化酶(HRP)複合抗體、一種葡萄糖氧化酶複合抗體、一種酪胺酸酶複合抗體或一種ß-半乳糖苷酶抗體。
  15. 如請求項13之方法，其中該山葵過氧化酶的受質係Amplex UltraRed、10-乙醯基-3,7-二羥基啡(ADHP)或3-(4-羥苯基)丙酸(HPPA)。
  16. 如請求項13之方法，其中該鹼性磷酸酶的受質係一種4- 甲基繖形酮醯磷酸酯(4-methylumbelliferryl phosphate)衍生物、或螢光素二磷酸酯(FDP)。
  17. 如請求項16之方法，其中該4-甲基繖形酮醯磷酸酯衍生物為6,8-二氟-4-甲基繖形酮醯磷酸酯(DiFMUP)。
  18. 如請求項14之方法，其中該山葵過氧化酶的受質係Amplex UltraRed、10-乙醯基-3,7-二羥基啡(ADHP)或3-(4-羥苯基)丙酸(HPPA)。
  19. 如請求項14之方法，其中該鹼性磷酸酶的受質係一種4-甲基繖形酮醯磷酸酯(4-methylumbelliferryl phosphate)衍生物、或螢光素二磷酸酯(FDP)。
  20. 如請求項19之方法，其中該4-甲基繖形酮醯磷酸酯衍生物為6,8-二氟-4-甲基繖形酮醯磷酸酯(DiFMUP)。
  21. 一種用於進行如請求項1至20中任一項的方法之套組，其包含：a)由一種第一捕獲抗體、一種第二捕獲抗體、一種第一檢測抗體及一種第二檢測抗體所組成之一配置，其中該第二捕獲抗體係一包含如示於序列辨識編號20至22中之CDRH1、CDRH2及CDRH3與如示於序列辨識編號23至25中之CDRL1、CDRL2及CDRL3的抗體，且其中該配置係可允許進行如請求項1至20中任一項之方法；b)用於以如a)中的配置所測定之第一與第二檢測複合體的量為基礎，計算經該神經毒素所剪切之受質的量之構件；及c)進行該方法之說明。
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