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TWI631213B - 生產由乙醯輔酶ａ衍生之化學物質的微生物 - Google Patents

生產由乙醯輔酶ａ衍生之化學物質的微生物 Download PDF

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TWI631213B
TWI631213B TW103102744A TW103102744A TWI631213B TW I631213 B TWI631213 B TW I631213B TW 103102744 A TW103102744 A TW 103102744A TW 103102744 A TW103102744 A TW 103102744A TW I631213 B TWI631213 B TW I631213B
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Abstract

本發明揭露一種生產乙醯輔酶A之微生物，該微生物的取得，係藉由對於不具有下列(a)、(b)、(c)、或(d)之微生物，在(a)、(b)、(c)或(d)中之任一者均不賦予或即便當賦予(a)、(b)、(c)或(d)中之一者以上時也不允許其功能發揮的情況下，賦予蘋果酸硫激酶、及蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素活性：(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之二氧化碳固定循環；(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基(glutaconyl)輔酶A之酵素反應之二氧化碳固定循環；(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之二氧化碳固定循環。

Description

生產由乙醯輔酶A衍生之化學物質的微生物
本發明係與一種生產乙醯輔酶A的微生物相關，該微生物能夠藉由導入二氧化碳固定途徑產生高產率及高產量之由乙醯輔酶A衍生的化學物質，例如：L-麩胺酸。
乙醯輔酶A在微生物代謝途徑中係一相當重要的中間體。各種不同的代謝物經由乙醯輔酶A產生。經由乙醯輔酶A所產生之物質的已知範例包含：胺基酸，如：L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-脯胺酸、L-精胺酸、L-亮胺酸、及L-異亮胺酸；有機酸，如：乙酸、丙酸、丁酸、己酸、檸檬酸、3-羥基丁酸、3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸、及聚(3-羥基丁酸)；醇，如：異丙醇、乙醇、及丁醇；丙酮；聚麩胺酸。
L-麩胺酸，或2-胺基戊二酸係天然產生的胺基酸，並係如醬油、魚露、發酵性豆製品及奶酪之發酵食品的成分。稱作麩胺酸鈉或MSG的麩胺酸鈉鹽係作為調味劑廣泛地使用在食品工業中。
用於工業性麩胺酸生產的有希望的候選者係屬於來自腸桿菌科(Enterobacteriaceae)中之泛菌屬(Pantoea)的革蘭氏陰性菌。除了生產高麩胺酸滴定濃度外，Pantoea ananatis菌也耐受高濃度的麩胺酸，並可於酸性pH值下生長(Appl.Microbiol.Biotechnol.93：331-341(2012))。隨著P.ananatis之基因操作技術的建立，已成功地發展出展現實質上較高麩胺酸生產能力的優越重组菌株(US6331419B1,US7015010B1)。
在P.ananati中，如葡萄糖的碳源係經由 Embden-Meyerhof-Parnas途徑代謝成丙酮酸。接著，丙酮酸經由丙酮酸脫氫酶及/或丙酮酸甲酸裂解酶的作用，並伴隨著以副產物形式(如：二氧化碳及/或甲酸)源自糖類的有效碳失去，形成乙醯輔酶A。之後，乙醯輔酶A經由克氏循環(Kreb cycle)的中間物α-酮戊二酸(2-oxoglutarate)產生麩胺酸。自然地，於此途徑中，可達成之麩胺酸最大產率係受成為二氧化碳之碳的固有耗損所限制，且因此設計出一種替代途徑以能夠避免此損耗及/或促成進入此途徑之二氧化碳固定作用，可以有助於提升發酵過程的總產率、效率、及經濟性。
已知有諸多在微生物中固定二氧化碳以提供碳源的途徑(Appl.Environ.Microbiol.77(6),1925-1936(2011))。該等途徑的具體範例包含：卡文-本忪循環(Calvin-Benson cycle)、還原性的TCA循環、伍-盧途徑(Wood-Ljungdahl pathway)、3-羥基丙酸(3-hydroxypropionate)循環、及4-羥基丁酸(4-hydroxybutyrate)循環。Calvin-Benson循環係一種CO2固定途徑，其存在植物及光合菌中且由約12種酵素所構成，其中以核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RubisCO)固定CO2而產生甘油醛3-磷酸。還原性的TCA循環係一種在厭氧菌及微需氧菌(包含：綠硫菌)中發現的循環，且由11種酵素所構成。該循環特徵在於使用鐵氧化還原蛋白(ferredoxin)作為輔酶的CO2固定酵素(乙醯輔酶A羧化酶、α-酮戊二酸合酶)，並以標準TCA循環反向之反應，從CO2產生丙酮酸。伍-盧途徑係一種在厭氧微生物(如：生產乙酸的細菌)中發現的途徑，且由9種酵素所構成，其中CO2及輔酶上的甲酸係由甲酸脫氫酶、CO脫氫酶等還原，最後達成轉換成乙醯輔酶A。3-羥基丙酸循環係一種在綠曲撓屬菌(Chloroflexus bacteria)和類似者中發現的循環，且由13種酵素構成，其中利用乙醯輔酶A(丙醯基輔酶A)羧化酶的作用固定CO2，並經由丙二醯基輔酶A(malonyl CoA)等產生乙醯輔酶A。4-羥基丁酸循環係一種存在古菌等中的途徑。在此循環中，以丙酮酸合成酶、乙醯輔酶A(丙醯基輔酶A)羧化酶，及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvic acid carboxylase)的反應固定CO2，並經由4-羥基丁醯基輔酶A等產生乙醯輔酶A。
US7785858B2專利文件描述形成乙醯輔酶A替代途徑的設 計，其藉由增強Bifidum途徑酶D-木酮糖-5-磷酸磷酸酮醇酶(D-xylulose-5-phosphate phosphoketolase)及/或果糖-6-磷酸磷酸酮醇酶(fructose-6-phosphate phosphoketolase)之活性降低二氧化碳的產生。結果，理論上，經由此替代途徑所消耗每莫耳葡萄糖可以省下1莫耳的CO2。當將該途徑引入P.ananatis之生產麩胺酸的菌株時，麩胺酸滴定濃度增加2.6g/L，相當於整體麩胺酸產率增加6%。
另一方面，已提出一些構想報告，其嘗試將二氧化碳固定途徑導入生產有用化合物的微生物，以生產有用物質。例如：WO2009/094485及WO2010/071697揭露數個方案，該等方案使用將類似乙酸菌中之Wood-Ljungdahl途徑的途徑導入的微生物，以從二氧化碳生產乙醯輔酶A。此外，作為以CO2的固定作用生產有用化合物之範例，WO2009/046929揭露為了從二氧化碳生產乳酸，而嘗試使用有導入氫化酶(hydrogenase)與四氫葉酸裂解酶(tetrahydrofolate lyase)的微生物。此外，WO2011/099006提出了一種循環，其中經由乙醯輔酶A上之二氧化碳固定反應及丙二醯基輔酶A之還原反應將CO2固定。DE 102007059248 A提出以類似4-羥基丁酸循環之途徑生產乙醯輔酶A。
如以上所述，可這樣敘述：固定CO2且使CO2轉換為乙醯輔酶A的理想條件係(a)構成該途徑之每個酵素的活性需充分高；(b)循環中所包含的酵素不應消耗乙醯輔酶A；及(c)所額外賦予的酵素數目應為少量，且該循環應係簡單的。然而，至今所報告之經由CO2固定作用產生乙醯輔酶A或乙醯輔酶A衍生的化學物質之範例並不滿足(a)到(c)的全部條件，且所有此類的範例係相當難以實現。
為使乙醯輔酶A衍生之化學物質的工業生產更具有成本的競爭性，故較高的產物滴定濃度、及產率係所期望。因此，需要設計出經由CO2固定作用將葡萄糖轉換成乙醯輔酶A或乙醯輔酶A衍生之化學物質的有效率及高活性途徑。在發酵期間的乙醯輔酶A衍生之化學物質(如： 麩胺酸)產率中之任何顯著的增加，實際上係表示其前驅物乙醯輔酶A之產率的增加。因此，判斷用於增加乙醯輔酶A產率之CO2固定作用的引進效果的一種方法，係觀察引進的CO2固定作用對乙醯輔酶A衍生產物(如：麩胺酸)產率的影響。
由產業觀點之另一等同重要的方面係最小化廢棄物的形成，否則將需要纯化、再循環、或處置廢棄物的額外成本。廢棄物可能包含副產物般的化學物質、沉積鹽、細胞團及細胞碎片、及會汙染產物流之類似物質。降低在發酵期間所形成之如此化學或生物廢棄物對減少下游處理、再循環、或處置的成本是相當有利。
本發明係在以上所述之情況下完成，且目的係提供一種屬於泛菌屬的微生物，其對於藉由導入有效率的二氧化碳固定途徑來高產率生產乙醯輔酶A及衍生自乙醯輔酶A之化學物質(如：麩胺酸)產物係相當有用。換句話說，本發明目的係提供具有一種二氧化碳固定途徑之泛菌屬菌的微生物，該二氧化碳的固定途徑能夠以高產率、高效率、及減少副產物的方式，將二氧化碳經由乙醯輔酶A轉換成有用代謝物。本發明目的也係提供一種使用該微生物產生有用代謝物的方法。
更具體而言，本發明的實施態樣包含以下。
<1>，一種泛菌屬之生產乙醯輔酶A的微生物，該微生物的取得，係藉由對於下列(a)、(b)、(c)、及(d)皆無之微生物，在(a)、(b)、(c)或(d)中之任一者均不賦予或即便當賦予(a)、(b)、(c)或(d)中之一者以上時也不允許其功能發揮的情況下，賦予蘋果酸硫激酶、及蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素活性：(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之二氧化碳固定循環；(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基(glutaconyl)輔酶A之酵素反應之二氧化碳固定循環；(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之二氧化碳固定循環。
<2>，一種生產乙醯輔酶A之方法，包含下列數個步驟：將<1>中所述之生產乙醯輔酶的微生物與碳源材料接觸並培養；並收集經由接觸步驟而獲得之目的生產物。
<3>，<2>中所描述之生產乙醯輔酶A之方法，更包含下列步驟：對用於該培養步驟之培養基供給選自由碳酸根離子、碳酸氫根離子、二氧化碳氣體，及還原劑所組成的群組中的至少一者。
<4>，<2>或<3>中所描述之生產乙醯輔酶A之方法，更包含下列步驟：收集經由培養步驟而產生之含有二氧化碳的氣體，並將該氣體供給至用於該培養步驟之培養基。
<5>，一種生產麩胺酸之方法，包含下列步驟：將<1>中所述之生產乙醯輔酶的微生物與碳源材料接觸並培養；以及收集經由接觸步驟而獲得之目的生產物。
根據本發明，可以提供一種屬於泛菌屬的微生物，其對於藉由導入有效率的二氧化碳固定途徑來高產率生產乙醯輔酶A及衍生自乙醯輔酶A之化學物質(如：麩胺酸)產物係有用，並且，本發明也可以提供一種使用該微生物生產乙醯輔酶A或如麩胺酸之有用代謝物的方法。換句話說，根據本發明，可以提供一種具有能夠高效率地將二氧化碳經由乙醯輔酶A轉換成有用代謝物之二氧化碳固定途徑的泛菌屬菌之微生物。此外，根據此發明，可以提供使用該微生物來生產有用代謝物的方法。
作為一個額外的優點，本發明的微生物於發酵期間產生較少的廢棄副產物般的化學物質，且因此該微生物相當有助於減少下游處理、再循環、或處置的成本。此外，本發明的微生物在廢棄流中產生較少的生物量，如此在降低工業製程的廢棄物再循環或處置成本中具有顯著的意義。
本發明之生產乙醯輔酶A的微生物係泛菌屬的生產乙醯輔酶A的微生物，該微生物的取得係藉由對於下列(a)、(b)、(c)、及(d)皆無的微生物，賦予蘋果酸硫激酶、及蘋果醯輔酶A裂解酶(malyl-CoA lyase) 之酵素活性，而不賦予任何(a)、(b)、(c)或(d)，或者即便當賦予(a)、(b)、(c)或(d)中之一者以上時也不容許其中功能發揮：(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之二氧化碳固定循環；(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應之二氧化碳固定循環；及(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之二氧化碳固定循環。
根據本發明，藉由賦予酵素活性，將建構一種會固定糖類代謝中所產生的CO2或固定由外部所供給之CO2的二氧化碳固定循環，並可以提供一種生產乙醯輔酶A的微生物，該生產乙醯輔酶A的微生物具有會使CO2有效地轉換成乙醯輔酶A的乙醯輔酶A生產途徑。
亦即，本發明係藉由深入地研究CO2轉換成乙醯輔酶A而加以完成，且因此如以上所述發現藉由對於下列(a)、(b)、(c)、及(d)任一者皆無的微生物，在(a)、(b)、(c)或(d)任一者均不賦予或者即便當賦予(a)、(b)、(c)或(d)中之一者以上時也不容許其功能發揮的情況下，藉由賦予蘋果酸硫激酶、及蘋果醯輔酶A裂解酶(malyl-CoA lyase)之酵素活性而可將CO2轉換成乙醯輔酶A：(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(b)具有從乙醯輔酶A及CO2至丙酮酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A酵素反應的二氧化碳固定循環；及(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應的二氧化碳固定循環。
此外，藉由使用將CO2轉換成乙醯輔酶A之生產乙醯輔酶A的微生物，或進一步藉由對該微生物賦予酵素活性，則可以有效地生產乙醯輔酶A、及由乙醯輔酶A衍生之有用的代謝物，例如：異丙醇、乙醇、丙酮、檸檬酸、衣康酸、乙酸、丁酸，(聚)3-羥基丁酸、3-羥基異丁酸、 3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸、(聚)麩胺酸，麩胺醯胺、精胺酸、鳥胺酸、瓜胺酸、亮胺酸、異亮胺酸和脯胺酸。
將於以下描述本發明。
於本發明中的用語「CO2固定」指的是將糖類代謝中所產生的CO2、或由外部供給之CO2轉換成有機化合物。CO2也可以係HCO3 -。於本說明書中，「CO2固定」也可稱為「二氧化碳固定」。
本說明書中之用語「步驟」非僅是包含獨立的步驟。即便當一個步驟無法明確地由其他步驟加以區別，只要該步驟的期望目的可以達成，則該步驟包含於此用語中。此外，在本說明書中，每個使用「到」所代表的數值範圍指的將「到」之前及之後所述數值分別作為最小值最大值的數值範圍。
在本發明中，當提及組成物中之各成分之量且該組成物包含對應各個成分之物質時，若無特別指明，該量指的是組成物中包含之該等物質之總量。
本發明中酵素活性的「降低」指的是一種狀態，其中藉由對編碼一酵素之基因所應用的基因重組技術，使得與執行該處理前的狀態相比顯著地降低該酵素的活性。
於本發明中之「活性」的「增強」泛指的是，相對於增強前之活性，將微生物中之各種不同酵素活性增強。
只要微生物的酵素活性可以增加，不限制增強的方法，且該方法之範例包含：藉由從細胞外引進的酵素基因之增強；藉由增加細胞中酵素基因的表現之增強；以及這些方法的組合。
藉由從細胞外將酵素基因引進之增強的具體範例包含：藉由基因重組技術，由寄主微生物細胞外引進會編碼高於寄主衍生酵素活性之酵素基因，以藉由所引進之酵素基因來增加酵素活性，或以此酵素活性取代寄主原有的酵素活性；增加源自寄主的酵素基因數量，或源自細胞外的酵素基因數量，使這些酵素基因數量不少於2；及該等方法的組合。藉由增加微生物中之酵素基因表現之增強的具體範例包含：由寄主微生物外，將會增加酵素基因表現之鹼基序列引入該微生物中；以會增加酵 素基因表現之另一啟動子取代寄主微生物基因組中所存有的酵素基因啟動子；及該等方法的組合。
於本發明中之「活性」的「賦予」泛指由外部將酵素基因引入到無法發現對象酵素基因的生物中，以對該生物賦予對象酵素的活性。只要可對微生物賦予對象酵素之活性，則不加以限制賦予的方法，且該方法之範例包含：使用具有酵素基因之質體的轉型作用；將酵素基因引進基因組；及這些方法之組合。
只要啟動子會使基因表現，則不加以限制用於「活性」之「增強」或「賦予」的啟動子，且啟動子的範例包含：組成性啟動子(constitutive promoter)、及可誘導啟動子(inducible promoter)。
當判斷微生物是否具有對象酵素之基因時，可參考例如KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes；http：//www.genome.jp/kegg/)或NCBI(National Center for Biotechnology Information；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)登載的各菌株之基因資訊。在本發明中，僅使用KEGG或NCBI登載之基因資訊。
於本發明中，可利用基因重組技術從寄主微生物之細胞外將會編碼酵素之基因引入細胞中來賦予酵素活性。在此情形中，欲引入的酵素基因的來源物種可與寄主細胞的物種相同或不同。
從細胞外將基因引入細胞內時所必需之基因組DNA的製備、DNA的裂解和連接作用、轉形作用、PCR(聚合酶鏈反應)、以及作為引子使用的寡核苷酸之設計及合成，可藉由熟習此技藝者已知的習知方法完成。該等方法描述於例如Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，Sambrook,J等人的「Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition」。
本發明中之用語「利用/藉由基因重組技術」包含任何情形，只要係藉由將另一DNA插入原有基因的鹼基序列中、或藉由置換或刪除(或上述之組合)基因的某些部份而修飾鹼基序列即可。修飾作用也可因例如突變發生所造成。
本發明中之「寄主」指的是在可發揮本發明功效之狀態的泛菌屬微生物，該狀態係藉由從該微生物外部引進一個以上的基因而實現。
本發明中之「寄主」更指的是可具有以特定方法從碳源材料生產乙醯輔酶A之能力的泛菌屬微生物，不論該微生物是否本質地具有從碳源材料產生乙醯輔酶A之能力。
本發明中之「寄主」可具有產生有用代謝物的途徑。本發明中之「有用的代謝物」係用於微生物代謝途徑中之主要代謝物的總稱，例如：醇類、胺基酸、有機酸、以及萜類。該微生物可係一種具有以特定方法產生有用代謝物之能力的微生物，不論該微生物是否本質地具有產生有用代謝物的能力。
本發明中之「乙醯輔酶A衍生的有用代謝物」係指在經由代謝路徑中之乙醯輔酶A而生產的有用代謝物總稱。就醇類而言，有用代謝物之範例包含：異丙醇、乙醇、及丁醇。就胺基酸而言，有用代謝物之範例包含：L-麩胺酸、L-麩醯胺酸、L-精胺酸、L-鳥胺酸、L-瓜胺酸、L-亮胺酸、及L-脯胺酸。就有機酸而言，有用代謝物之範例包含：3-羥基丁酸、聚-3-羥基丁酸、聚麩胺酸，3-羥基異丁酸、3-胺基異丁酸、2-羥基異丁酸、甲基丙烯酸、檸檬酸、乙酸、丙酸、丁酸、己酸、及甲羥戊酸。就萜類而言，有用代謝物之範例包含：異戊二烯、角鯊烯、類固醇、及類胡蘿蔔素。有用代謝物之其他範例包含丙酮。該微生物可係一種具有以特定方法生產乙醯輔酶A衍生之有用代謝物之能力的微生物，不論該微生物是否本質地具有產生乙醯輔酶A衍生之有用代謝物的能力。
於本發明中之「乙醯輔酶A的生產」指的是於代謝途徑中將特定物質轉換成乙醯輔酶A之情形。因為乙醯輔酶A係一種代謝中間物，且於代謝途徑中會快速地轉換成各種不同的物質，故所明顯觀察到的乙醯輔酶A的量不一定會增加。然而，可利用偵測來自乙醯輔酶A衍生物質中之CO2的標記，利用觀察相對於糖類消耗之乙醯輔酶A衍生物產率的增加，或其他方法，間接地知道此結果。因為在轉換中涉及了各種不同的因素(如：輔酶量、受質量、及由於回饋抑制所致的代謝變化)，故乙醯輔酶A之生產量不一定正比於乙醯輔酶A衍生之全部物質的量。然而，倘若增強從乙醯輔酶A至特定物質之間的生產途徑，或如此之生產途徑係本質上相當強的(例如：將於以下描述之生產麩胺酸之微生物的例子中)，則在乙醯 輔酶A之後的轉換效率係幾乎不會被外在因素影響，故該物質的生產效率可視為乙醯輔酶A生產效率的指標。
本發明之生產乙醯輔酶A的微生物之取得，係藉由對於下列(a)、(b)、(c)、及(d)皆無之微生物，在(a)、(b)、(c)或(d)中之任一者均不賦予或者即便當賦予(a)、(b)、(c)或(d)之一者以上時也不使其中功能發揮的情況下，藉由賦予蘋果酸硫激酶、及蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素活性：(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之二氧化碳固定循環；(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應之二氧化碳固定循環；及(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之二氧化碳固定循環。
基於乙醯輔酶A之生產效率的觀點，賦予生產乙醯輔酶A之微生物蘋果酸硫激酶與蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素活性係較佳。
本文中之術語「非"本質”具有」指的是寄主微生物於自然環境中非本質具有該循環。
本說明書中之「具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的二氧化碳固定循環」指的是以下(1)到(7)的循環：(1)WO2011/099006之圖1中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、3-羥基丙酸、丙醯基輔酶A、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A；(2)WO2011/099006之圖4A中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、丙二酸半醛、β-丙胺酸、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A；(3)WO2011/099006之圖4B、16或18中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、羥基丙酸、(R)-乳酸或(S)-乳酸、蘋果酸、及蘋果 醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A；(4)WO2011/099006之圖8所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、丙二酸半醛或羥基丙酸、丙酮酸、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A；(5)WO2011/099006之圖9A、9B、或9C中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、羥基丙酸、2-酮基戊二酸、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A；(6)WO2011/099006之圖9D、或9F中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、羥基丙酸、甲基丙二醯基輔酶A、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A；及(7)WO2011/099006之圖17中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙二醯基輔酶A、丙二酸半醛或羥基丙酸、甲基丙二醯基輔酶A、丙酮酸、草醯乙酸、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A。
以上所描述之全部的二氧化碳固定循環(1)到(7)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸的酵素反應。如此反應係經由丙二酸半醛脫氫酶或丙二醯基輔酶A還原酶來催化(WO2011/099006)。據說羧酸或其(硫代)酯的還原反應(如：琥珀醯基輔酶A之還原、或丙二醯基輔酶A之還原)一般而言就酵素反應而言係相當困難，且應儘可能地於發酵途徑中避免(Atsumi et al.,Nature,451,(3),86-89,2008；Yim et al.,Nat.Chem.Biol.,7,445-452,2011)。
本說明書中之「具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的二氧化碳固定循環」指的是以下(8)至(10)的循環：(8)WO2011/099006之圖1中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸、草醯乙酸、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A；(9)WO2011/099006之圖7C、7D、或7E中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙酮酸、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A；及(10)WO2011/099006之圖9M中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由丙 酮酸、2-酮基戊二酸、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A。
全部的二氧化碳固定循環(8)到(10)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸的酵素反應。此反應係經由丙酮酸合成酶催化(WO2011/099006)。經由丙酮酸合成酶之丙酮酸的合成反應需要使用鐵氧化還蛋白的強還原能力；該反應僅緩慢地進行；且因該反應對氧相當敏感，故該反應僅於極度厭氧條件下進行。
本說明書中之「具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應的二氧化碳固定循環」指的是WO2011/099006之圖9H、或9J中所示的循環，其中乙醯輔酶A經由經由巴豆醯輔酶A、乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A、草醯乙酸、蘋果酸、及蘋果醯輔酶A，再次轉換成乙醯輔酶A之循環。
以上所述之從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之間的轉換作用係經由巴豆醯輔酶A羧化酶/還原酶和甲基巴豆醯輔酶A羧化酶催化。因為對碳酸鹽而言，巴豆醯輔酶A羧化酶/還原酶具有高Km(14mM；PNAS 104(25)10631-10636、(2007))，故無法於低濃度範圍中預期活性。此外，3-羥基丁醯基輔酶A經由脫水反應產生作為受質之巴豆醯輔酶A，且在此酵素中，逆反應之水合反應於一般的水溶液環境中係優勢的。因此，無法期望足夠高的速率。此外，經報導之甲基巴豆醯輔酶A羧化酶的比活性並非如此高(0.2-0.6U/mg；Arch Biochem Biophys.310(1)64-75(1994))，且相似於上述例子，無法預望作為受質之巴豆醯輔酶A之足夠高的生產率，而這樣的情形係一大問題。
本說明書中之「具有從CO2至甲酸之酵素反應的二氧化碳固定循環」指的是WO2009/046929之圖5、6、13、或14中所示的循環，亦即，具有一途徑，其中反應從CO2經由甲酸及絲胺酸，且草醯乙酸經由蘋果酸、蘋果醯輔酶A、甘油酸、再次轉換成草醯乙酸。
從CO2至甲酸的酵素反應需要強的還原力；該反應僅緩慢地進行；且因該反應對氧相當敏感，故該反應僅於極度厭氧條件下進行。
於本說明書中，用語「即便賦予二氧化碳固定循環，也不使二氧化碳 固定循環功能發揮」指的是將具有活性之酵素基因引進無法於其中發現對象酵素基因之微生物，以賦予對象酵素活性，但此二氧化碳固定循環並無作用。例如藉由在使用標定CO2的測試中無法在循環中的代謝物或源自代謝物之物質中偵測到來自CO2的標記，或藉由相對於糖消耗之來自循環中代謝物之物質的產率並未增加的情形，可間接地得知「二氧化碳固定循環並無作用」的事實。
以上所述之生產乙醯輔酶A之微生物中所建構的乙醯輔酶A生產途徑係一種包含蘋果酸硫激酶及蘋果酸輔酶A裂解酶之途徑。乙醯輔酶A生產途徑不具有會消耗乙醯輔酶A的酵素，如：乙醯輔酶A羧化酶或丙酮酸合成酶。
不用特別地限制賦予至泛菌屬微生物的酵素活性，只要有賦予蘋果酸硫激酶及蘋果酸輔酶A裂解酶之酵素活性，且可適當地依照寄主微生物之種類選擇酵素活性，其中本發明中的二氧化碳固定途徑可利用該等酵素活性加以功能性建構。
消耗乙醯輔酶A之酵素指的是一種酵素，其使用乙醯輔酶A作為受質，並使乙醯輔酶A轉變成其他物質。酵素的範例包含：乙醯輔酶A羧化酶，其根據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會的報告係分類為酵素號(enzyme code number)6.4.1.2，並會將乙醯輔酶A轉換成丙二醯基輔酶A；及丙酮酸合成酶，其係分類為酵素號1.2.7.1並會將乙醯輔酶A轉換成丙酮酸。
根據國際生化學聯盟(I.U.B.))酵素委員會的報告，蘋果酸硫激酶係分類為酵素號6.2.1.9，且蘋果酸硫激酶係使蘋果酸與輔酶A結合而轉換成蘋果醯輔酶A之酵素的總稱。在此反應中，消耗一分子的ATP而產生一分子的ADP及磷酸根。該酵素係由約400個胺基酸的大次單位及300個胺基酸的小次單位所組成。在基因上，通常以大次單位後為小次單位的順序存在。在本專利中，為求便利，將大次單位簡稱為mtkB，及將小次單位簡稱為mtkA。該酵素之比活性據報告係例如以經純化之酵素而言為2.5U/mg(Anal Biochem.227(2),363-367(1995))。
該酵素主要係在如甲烷之C1碳源的同化途徑(J.Bacteriol.176(23), 7398-7404(1994))、及3-羥基丙酸途徑(Arch.Microbiol.,151,252-256(1989))中所發現，且特徵在於蘋果醯輔酶A係存在該基因組上的附近。可適當地使用此酵素。
蘋果酸硫激酶之範例包含：源自甲基桿菌屬的蘋果酸硫激酶，如：Methylobacterium extorquens；源自生絲微菌屬(Hyphomicrobium)的蘋果酸硫激酶，如：Hyphomicrobium methylovorum、及Hyphomicrobium denitrificans；源自根瘤菌屬的蘋果酸硫激酶，如：Rhizobium sp NGR234；源自Granulibacter屬的蘋果酸硫激酶，如：Granulibacter bethesdensis；源自亞硝化單胞菌屬(Nitrosomorias)的蘋果酸硫激酶，如：Nitrosomonas europaea；源自甲基球菌屬(Methylococcus)的蘋果酸硫激酶，如：Methylococcus capsulatus；以及源自丙型變形菌綱(Gammaproteobacteria)的蘋果酸硫激酶。
基於經由乙醯輔酶A之有用物質的生產效率觀點，胺基酸序列之特佳的範例包含：源自生絲微菌屬的胺基酸序列、源自根瘤菌屬的胺基酸序列、源自亞硝化單胞菌屬的胺基酸序列、源自甲基球菌屬的胺基酸序列、及源自丙型變形菌綱的胺基酸序列。
生絲微菌屬來源的蘋果酸硫激酶、根瘤菌屬來源的蘋果酸硫激酶、及亞硝化單胞菌屬來源的蘋果酸硫激酶，彼此具有65%到80%的同源性。甲基球菌屬來源的蘋果酸硫激酶、與丙型變形菌綱來源的蘋果酸硫激酶具有70%~80%的同源性。
與本發明所揭露之生絲微菌屬來源之蘋果酸硫激酶、根瘤菌屬來源之蘋果酸硫激酶、亞硝化單胞菌屬來源之蘋果酸硫激酶、甲基球菌屬來源之蘋果酸硫激酶、及丙型變形菌綱來源之蘋果酸硫激酶的胺基酸序列之每一者具有70%以上同源性且具有蘋果酸硫激酶活性的蘋果酸硫激酶，可合適地用以生產本發明之乙醯輔酶A或來自於乙醯輔酶A之有用產物。
如蘋果酸硫激酶之基因(mtk)，可利用從上述來源微生物中之每一者所獲得的具有編碼為蘋果酸硫激酶之基因的鹼基序列的DNA，或利用依據其中已知的鹼基序列所合成的合成DNA序列。
DNA之較佳的範例包含：具有源自甲基桿菌屬(如：Methylobacterium extorquens)的基因鹼基序列的DNA；具有源自生絲微菌屬(如： Hyphomicrobium methylovorum、及Hyphomicrobium denitrificans)的基因鹼基序列的DNA；具有源自根瘤菌屬(如：Rhizobium sp NGR234)的基因鹼基序列的DNA；具有源自Granulibacter屬(如：Granulibacter bethesdensis)的基因鹼基序列的DNA；具有源自亞硝化單胞菌屬(如：Nitrosomonas europaea)的基因鹼基序列的DNA；具有源自甲基球菌屬(如：Methylococcus capsulatus)的基因鹼基序列的DNA；及具有源自丙型變形菌綱的基因鹼基序列的DNA。
基於乙醯輔酶A之生產效率之觀點，DNA之較佳範例包含：具有源自生絲微菌屬之鹼基序列的DNA、具有源自根瘤菌屬之鹼基序列的DNA、具有源自Granulibacter屬之鹼基序列的DNA、具有源自亞硝化單胞菌屬之鹼基序列的DNA、具有源自甲基球菌屬之鹼基序列的DNA、及具有源自丙型變形菌綱之鹼基序列的DNA。
鹼基序列之較佳的範例包含：源自生絲微菌屬之鹼基序列、源自於密碼子最適化後的根瘤菌屬之鹼基序列、源自亞硝化單胞菌屬之鹼基序列、源自甲基球菌屬之基因之鹼基序列、及源自丙型變形菌綱之鹼基序列。
蘋果醯輔酶A裂解酶係一酵素，其根據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會的報告被分類為酵素號4.1.3.24，且由蘋果醯輔酶A生成乙醛酸與乙醯輔酶A。該酵素之範例包含：源自甲基桿菌屬(如：Methylobacterium extorquens等)、生絲微菌屬(如：Hyphomicrobium methylovorum、及Hyphomicrobium denitrificans)、綠曲撓菌屬(如：Chloroflexus aurantiacus)、亞硝化單胞菌屬(如：Nitrosomonas europaea)、及甲基球菌屬(如：Methylococcus capsulatus)之酵素。
基於乙醯輔酶A生產效率之觀點，胺基酸序列之尤佳的範例包含：源自甲基桿菌屬的胺基酸序列、源自生絲微菌屬的胺基酸序列、源自亞硝化單胞菌屬的胺基酸序列、及源自甲基球菌屬的胺基酸序列。
例如，Methylobacterium extorquens中之蘋果醯輔酶A裂解酶的比活性據報告係以經純化之酵素而言的28.1U/mg(Biochem.J.139,399-405,(1974))。
如蘋果醯輔酶A裂解酶之基因(mcl)，可利用從上述來源微生物各者所獲得之具有編碼為蘋果酸硫激酶之基因的鹼基序列的DNA， 或利用依據其中已知的鹼基序列所合成的合成DNA序列。
DNA之較佳範例包含：具有源自甲基桿菌屬(如：Methylobacterium extorquens)之基因鹼基序列的DNA；具有源自生絲微菌屬(如：Hyphomicrobium methylovorum、及Hyphomicrobium denitrificans)之基因鹼基序列的DNA；及具有源自綠曲撓菌屬(如：Chloroflexus aurantiacus)之基因鹼基序列的DNA。基於乙醯輔酶A之生產效率之觀點，DNA之特佳範例包含：具有源自甲基桿菌屬之基因鹼基序列的DNA、及源自生絲微菌屬來源之基因鹼基序列的DNA。
源自甲基桿菌屬之基因鹼基序列的特佳範例包含源自Methylobacterium extorquens的基因鹼基序列。源自生絲微菌屬之基因鹼基序列的特佳範例包含：源自Hyphomicrobium methylovorum之基因鹼基序列、以及源自Hyphomicrobium denitrificans之基因鹼基序列。源自亞硝化單胞菌屬之基因鹼基序列的特佳範例包含源自Nitrosomonas europaea之基因鹼基序列。並且，源自甲基球菌屬之基因鹼基序列的特佳範例包含源自Methylococcus capsulatus之基因鹼基序列。
根據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會的報告，乙醯輔酶A羧化酶係分類為酵素號6.4.1.2，且乙醯輔酶A羧化酶係將乙醯輔酶A與CO2轉換成丙二醯基輔酶A之酵素的總稱。
根據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會的報告，丙二酸半醛脫氫酶係分類為酵素號1.2.1.18，且丙二酸半醛脫氫酶係將丙二醯基輔酶A轉換成丙二酸半醛之酵素的總稱。
丙二醯基輔酶A還原酶係將丙二醯基輔酶A轉換成丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素的總稱。
根據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會的報告，巴豆醯輔酶A羧化酶/還原酶係分類為酵素號1.3.1.85，且巴豆醯輔酶A羧化酶/還原酶係將巴豆醯輔酶A轉換成乙基丙二醯基輔酶A之酵素的總稱。
根據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會的報告，甲基巴豆醯輔酶A羧化酶被分類為酵素號6.4.1.4，且甲基巴豆醯輔酶A羧化酶係指將巴豆醯輔酶A轉換成戊烯二醯基輔酶A之酵素的總稱。
根據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會的報告，丙酮酸合酶係分類為酵素號1.2.7.1，且丙酮酸合酶係將乙醯輔酶A轉換成丙酮酸之酵素的總稱。
根據國際生化學聯盟(I.U.B.)酵素委員會的報告，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶係分類為酵素號4.1.1.31，且磷酸烯醇丙酮酸羧化酶係將磷酸烯醇丙酮酸與二氧化碳轉換成草醯乙酸與磷酸之酵素的總稱。該酵素之範例包含：源自埃希氏菌屬細菌(如：大腸桿菌)、泛菌屬細菌(如：Pantoea ananatis)、棒桿菌屬細菌(如：Corynebacterium glutamicum)、生絲微菌屬細菌(如：Hyphomicrobium methylovorum)、Starkeya屬細菌(如：Starkeya novella)、紅色無硫黃細菌屬(Rhodopseudomonas)細菌(如：Rhodopseudomonas sp)、及鏈絲菌屬細菌(Streptomyces)(如：Streptomyces coelicolor)之酵素。
如磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)之基因，可利用從上述來源微生物各者所獲得的具有編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之基因之鹼基序列的DNA，或使用依據其已知的鹼基序列所合成的合成DNA序列。此DNA的較佳範例包含：具有源自埃希氏菌屬細菌(如：大腸桿菌)、泛菌屬細菌(如：Pantoea ananatis)、棒桿菌屬細菌(如：Corynebacterium glutamicum)、生絲微菌屬細菌(如：Hyphomicrobium methylovorum)、Starkeya屬細菌(如：Starkeya novella)、紅色無硫黃細菌屬細菌(如Rhodopseudomonas sp)、及鏈絲菌屬細菌(如：Streptomyces coelicolor)之基因的鹼基序列之DNA。
除了將乙醯輔酶A轉換成有用代謝物之途徑外，生產乙醯輔酶A之微生物也可具有利用乙醯輔酶A作為原料來生產另一代謝物之途徑，或者可增強與該生產另一代謝物之途徑相關的酵素活性。藉此，可以由碳源材料及二氧化碳來生產由乙醯輔酶A衍生之有用代謝物，且同時可以提高由乙醯輔酶A衍生之有用代謝物的生產力。
不加以限制本發明所使用之微生物，只要該微生物屬於泛菌屬，並不具有以下(a)、(b)、(c)、或(d)中之任一者：(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應之二氧化碳固定循環；(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應之二氧化碳固定循 環；(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應之二氧化碳固定循環；及(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應之二氧化碳固定循環。
泛菌屬細菌之代表菌株的範例包含：Pantoea ananatis、Pantoea stewartii、Pantoea agglomerans、及Pantoea citrea。該等菌株之具體範例包含以下：
‧Pantoea ananatis AJ13355株(FERM BP-6614)(EP 0952221 A)
‧Pantoea ananatis AJ1335株(FERM BP-6615)(EP 0592221 A)
雖然該等菌株在EP 0952221 A中記載為Enterobacter agglomerans，但如上述依據16S rRNA之鹼基序列分析等，該等菌株重新分類為Pantoea ananatis。
使用乙醯輔酶A作為原料之其他代謝物的生產途徑的範例包含一種由乙醯輔酶A生產麩胺酸之途徑。藉由使用具有有效率地生產麩胺酸的途徑之微生物(以下可稱為「生產麩胺酸之微生物」)作為寄主，並藉由賦予或增強該途徑中的以上所述之個別酵素活性以由乙醯輔酶A生產麩胺酸，或失活或減活該等酵素活性以抑制來自乙醯輔酶A的麩胺酸生產，從而所產生之微生物，可係具有會生產其他代謝物途徑之微生物的較佳範例，或係涉及生產代謝物途徑之酵素活性被增強之微生物的較佳範例。
只要賦予生產麩胺酸能力的基因之引進和修飾係可能的，則生產麩胺酸之微生物可係任何一種微生物。生產麩胺酸的微生物可更佳地為泛菌屬菌，其中可對該泛菌屬菌預先賦予麩胺酸生產能力，而藉此可更有效率生產麩胺酸。
對微生物賦予生產麩胺酸能力之方法的範例包含：修飾該微生物，以使編碼為與L-麩胺酸生物合成相關之酵素的基因表現增大，及/或使該基因過度表現。L-麩胺酸生物合成酵素包含：麩胺酸脫氫酶、麩胺醯胺合成酶、麩胺酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、丙酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合成酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、 甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構酶、果糖二磷酸醛縮酶、磷酸果糖激酶、及磷酸葡萄糖異構酶。較佳地，在該等酵素中，檸檬酸合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、及麩胺酸脫氫酶其中一者以上具有增加的活性，且更佳地，全部的該三個酵素具有增強的活性。
如此生產麩胺酸之微生物的範例包含一種描述於日本專利申請公開案第2005-278643號中的生產麩胺酸之微生物。
對於生產L-麩胺酸之微生物，可使用一種微生物，該微生物於酸性條件下培養時，具有在液體培養基中累積超過L-麩胺酸之飽和濃度之量的L-麩胺酸之能力(如此在以下稱為於酸性條件下之L-麩胺酸累積能力)。例如：可藉由EP 1078989 A所述之方法獲得具有在低pH環境中之L-麩胺酸耐性增加的菌株，以賦予會累積超出飽和濃度之量的L-麩胺酸之能力。
本質具有於酸性狀況下L-麩胺酸累積能力之微生物的具體範例包含：Pantoea ananatis AJ13356株(FERM BP-6615)、及AJ13601株(FERM BP-7207)(該等菌株參照EP 0952221 A)。Pantoea ananatis AJ13356寄存於National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry(現今名稱為International Patent Organism Depositary,National Institute of Technology and Evaluation(IPOD,NITE)；地址為Tsukuba Central 6,1-1-1 Higashi，Tsukuba，Ibaraki 305-8566,Japan)，寄存號為第FERM P-16645號，寄存日期為西元1998年2月19日；而於西元1999年1月11日，依照Budapest條約轉至國際寄存，寄存號為第FERM BP-6615號。應注意的是該菌株首次分離時曾被識別為聚團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)，且以Enterobacter agglomerans AJ13355之名寄存，但根據現今的16S rRNA之鹼基序列分析等，該菌株重新分類為Pantoea ananatis(見以下範例)。此外，雖然由AJ13355來源的後續提及的AJ13356及AJ13601株也同樣作為Enterobacter agglomerans於前述寄存機關寄存，但這些菌株於本說明書中記載為Pantoea ananatis。AJ13601寄存於National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry(現 今名稱為International Patent Organism Depositary,National Institute of Technology and Evaluation(IPOD,NITE))，寄存號為第FERM P-17156號，寄存日期為西元1999年8月18日；而於西元2000年7月6日，依照Budapest條約轉至國際寄存，寄存號為第FERM BP-7207號。
賦予或增強L-麩胺酸生產能力的方法之其他範例包含：賦予對於有機酸類似物或呼吸抑制劑的耐性之方法、及賦予對於細胞壁合成抑制劑的感受性之方法。該方法之具體範例包含：賦予單氟乙酸耐性之方法(JP 50-113209 A)、賦予腺嘌呤耐性或胸腺嘧啶耐性之方法(JP 57-065198 A)、弱化尿素酶之方法(JP 52-038088 A)、賦予丙二酸耐性之方法(JP 52-038088 A)、賦予苯并哌哢(benzopyrone)或萘醌類之耐性之方法(JP 56-1889 A)、賦予HOQNO耐性之方法(JP 56-140895 A)、賦予α-酮丙二酸耐性之方法(JP 57-2689 A)、賦予胍(guanidine)耐性之方法(JP 56-35981 A)、及賦予盤尼西林耐性之方法(JP 4-88994A)。
如此的耐性微生物之具體例包含下列菌株。
‧Brevibacterium flavum AJ3949(FERM BP-2632；參照JP 50-113209A)
‧Corynebacterium glutamicum AJ11628(FERM P-5736；參照JP 57-065198 A)
‧Brevibacterium flavum AJ11355(FERM P-5007；參照JP 56-1889 A)
‧Corynebacterium glutamicum AJ11368(FERM P-5020；參照JP 56-1889 A)
‧Brevibacterium flavum AJ11217(FERM P-4318；參照JP 57-2689 A)
‧Corynebacterium glutamicum AJ11218(FERM P-4319；參照JP 57-2689 A)
‧Brevibacterium flavum AJ11564(FERM P-5472；參照JP 56-140895 A)
‧Brevibacterium flavum AJ11439(FERM P-5136；參照JP 56-35981 A)
‧Corynebacterium glutamicum H7684(FERM BP-3004；參照JP 04-88994 A)
‧Brevibacterium lactofermentum AJ11426(FERM P-5123；參照JP 56-048890 A)
‧Corynebacterium glutamicum AJ11440(FERM P-5137；參照JP 56-048890 A)
‧Brevibacterium lactofermentum AJ11796(FERM P-6402；參照JP 58-158192 A)
本質具有mtk及mcl的微生物之範例包含甲烷營養性(methanotrophic)微生物，如：Methylobacterium extorquens。因尚未發展出適用於甲烷營養性微生物之載體系統、或甲烷營養性微生物基因組基因之 修飾的技術，故該等微生物之基因操作比起如泛菌屬之微生物係更為困難。此外，該等微生物通常增殖緩慢，而因此不適用於生產有用代謝物。
本發明之乙醯輔酶A或麩胺酸的生產方法包含：使用生產乙醯輔酶A之微生物來從碳源材料生產作為感興趣產物的乙醯輔酶A或麩胺酸。亦即，生產乙醯輔酶A之方法包含：將生產乙醯輔酶A之微生物與碳源材料接觸，且進行培養(以下簡稱為培養步驟)；並回收經由接觸所獲得之感興趣的產物(乙醯輔酶A或麩胺酸)(以下簡稱為回收步驟)。
根據生產乙醯輔酶A之方法，因為於培養生產乙醯輔酶A之微生物時將該微生物與碳源材料接觸，故碳源材料被生產乙醯輔酶A之微生物吸收掉，且可一面固定二氧化碳固一面有效率地生產感興趣的產物。
只要材料包含該微生物可吸收之碳源，則不須限制碳源材料，而該材料較佳為植物來源材料。
植物來源材料之範例包含：如根、莖、幹、枝、葉、花、及種子之器官；含該等器官之植物體；及該等植物器官之分解產物。此外，由植物體所獲得的碳源之中，可於微生物培養中作為碳源利用之植物器官及其經分解的產物也包含在植物來源的材料中。
植物來源材料所包含之碳源的範例實質上包含：糖類，如：澱粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖、及阿拉伯糖；包含大量這些成份之草本與木本材料的分解產物；纖維素水解物；及其中的組合。此外，源自植物油之甘油與脂肪酸也包含在本發明中的碳源。
植物來源材料的較佳範例包含多種農作物，如：穀物、玉米、小麥、大豆、甘蔗、甜菜、棉花、及其中的組合。原料使用型態之範例包含(但非僅限於此)：未加工品、榨汁、及粉碎物。碳源也可依原樣加以使用。
在培養的步驟中，藉由在含有植物來源之培養基中培養生產乙醯輔酶A之微生物，將生產乙醯輔酶A之微生物實質上地與植物來源材料接觸。
植物來源材料與生產乙醯輔酶A之微生物間的接觸密度係根據生產乙醯輔酶A之微生物的活性而變化，並且培養基中之植物來源材料的濃度， 就換算成葡萄糖的起始糖濃度而言，相對於混合物總質量實質上可在20質量%以下。基於生產乙醯輔酶A之微生物的葡萄糖耐受性，起始糖濃度可較佳在15質量%以下。不會限制其他成分，只要該等成分所添加之量係一般用於微生物之培養基即可。
生產乙醯輔酶A或麩胺酸之方法可更包含：對用於培養之培養基供給碳酸根離子、碳酸氫根離子、二氧化碳氣體(CO2氣體)、及/或還原劑(以下簡稱為「供給過程」)。
關於供給過程中的條件(如：溫度、或pH)，可應用與培養過程中之條件相同的條件。
對用於培養之培養基供給碳酸根離子、碳酸氫根離子、及/或二氧化碳氣體會增強例如磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、及/或磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的酵素活性，且會增加被固定的二氧化碳量，藉此可有效率地產生乙醯輔酶A或乙醯輔酶A衍生之有用代謝物。
供給至培養基的碳酸根離子或碳酸氫根離子可由能產生碳酸根離子及/或碳酸氫根離子之物質而獲得。能產生碳酸根離子及/或碳酸氫根離子之物質的範例包含：碳酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鉀、碳酸氫鉀、碳酸銨、碳酸氫銨、碳酸鎂、及碳酸鈣。
只要可有效率地生產乙醯輔酶A或乙醯輔酶A衍生之有用代謝物，則不特別限制供給至培養基之碳酸根離子及/或碳酸氫根離子的量。碳酸根離子及/或碳酸氫根離子較佳以培養基每升50mmol以上的總量供給。150mmol/L以上量的碳酸根離子及/或碳酸氫根離子的供給充分地增加乙醯輔酶A等的產率，而因此係較佳的。碳酸根離子及/或碳酸氫根離子更佳以培養基每升200mmol以上的總量供給。
所供給的碳酸根離子及/或碳酸氫根離子之總量較佳係培養基每升5mol以下。當培養基每升的總供給量係5mol以下時，則在培養過程中大量地存在沒有被微生物使用的碳酸根離子及碳酸氫根離子之情形係較不可能的。培養基每升所供給的碳酸根離子及/或碳酸氫根離子之總量更佳係3mol以下，且再更佳係2mol以下。
對培養基供給碳酸根離子及/或碳酸氫根離子的方法可為此 技術領域中已知的方法。碳酸根離子及/或碳酸氫根離子可於開始培養時或培養期間的時間點加以供給，且並不特別地限制供給碳酸根離子及/或碳酸氫根離子的時間點。可同時供給全部的碳酸根離子及/或碳酸氫根離子，或多次部分地供給。
二氧化碳氣體可係任何包含二氧化碳之氣體，且可係例如空氣。二氧化碳氣體之二氧化碳濃度係較佳相等或高於空氣的二氧化碳濃度，更佳為0.1v/v(體積/體積)%以上，且又更佳為1v/v%以上。
二氧化碳濃度較佳係75v/v%以下，更佳係50v/v%以下，且又更佳係25v/v%以下。
二氧化碳氣體可藉由起泡作用等而溶解至培養基中。只要可有效率地產生乙醯輔酶A或乙醯輔酶A衍生之有用代謝物，則不特別地限制供給至培養基中之二氧化碳氣體的平均氣泡直徑。
二氧化碳氣體較佳具有例如100μm以上之平均氣泡直徑。具有100μm以上之平均氣泡直徑的二氧化碳氣體係較佳的，因為當平均氣泡直徑在此範圍中時，因培養基中氣泡作用過度增加而使持續發酵培養變得困難之情形則係不太可能發生。具有200μm以上之平均氣泡直徑的二氧化碳氣體係更佳的，且具有500μm以上之平均氣泡直徑的二氧化碳氣體係又更佳的。然而，二氧化碳氣體之平均氣泡直徑較佳係100cm以下。100cm以下之平均氣泡直徑係較佳的，因為當平均氣泡直徑在此範圍中時，二氧化碳則會充分地溶解在培養基中。具有50cm以下平均氣泡直徑之二氧化碳氣體係更佳的，且具有20cm以下平均氣泡直徑之二氧化碳氣體係又更佳的。
二氧化碳氣體可使用一種通常使用的氣泡產生器供給至培養基中。氣泡產生器之範例包含空氣噴佈器。
測量平均氣泡直徑方法之範例包含：LS 13 320(由Beckman Colulter Inc.所製)，其使用雷射繞射散射(laser diffraction scattering)方法測量平均氣泡直徑；Multisizer 3(由Beckman Colulter Inc.所製)，其使用細孔電阻(pore electric resistance)方法測量平均氣泡直徑，及使用高速攝像機捕捉有陰影圖像，並經由二進制影像(binary image)處理獲得平均氣泡直徑之方法。
只要還原劑能夠於培養期間還原培養基皿中或微生物中之成分，且同時還原劑自身係被氧化的，則不特別地限制還原劑種類。其中的範例包含：含硫化合物、含碳化合物、氫等。
含硫化合物之範例包含：亞硫酸鹽(如：亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鉀、及亞硫酸銨)、硫代硫酸鹽(如：硫代硫酸鈉、及硫代硫酸鉀)、硫化物離子的鹽類(如：硫化鈉、硫氫化鈉、硫化鉀、及硫化銨)、半胱胺酸、二氧化硫、和硫化氫。
含碳化合物之範例包含：醇、脂肪酸、石蠟、及一氧化碳。
較佳的還原劑之範例包含含硫化合物，且其中亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫酸鈉、及半胱胺酸鈉係較佳的，而亞硫酸鈉係最佳的。
不特別地限制供給至培養基中的還原劑濃度，只要乙醯輔酶A或乙醯輔酶A衍生之有用代謝物可有效率地生產，並可按照所供應成分而適當地設定即可。例如：培養基每升之亞硫酸鈉的濃度較佳係0.01g以上，更佳係0.1g以上，且又更佳係1g以上。欲供給的還原劑濃度較佳係50g/L以下，更佳係20g/L以下，且又更佳係10g/L以下。
生產乙醯輔酶A或麩胺酸之方法可更包含：收集藉由培養產生之含二氧化碳的氣體；以及供給該氣體至用於培養之培養基(以下簡稱「氣體供給過程」)。換句話說，作為廢氣排放出而非消耗於培養基中之二氧化碳氣體可透過再供給至培養基的循環而再利用。
不用特別地限制用於供給氣體至培養基的方法，只要該方法通常用於此目的即可。其中的範例包含：透過圓形或矩形細孔( )以加壓方式將氣體注入到液體中之方法(其在氣體為空氣的實例中稱為「通氣器」或「通氣」)；從具有遍及週面之孔的中空管(其稱為「通風管」)供給氣體之方法；及使用空氣噴佈器(氣體擴散器)之方法，空氣噴佈器係具有多孔材料的塑膠或不銹鋼管，該多孔材料具有用於產生空氣等的微小氣泡的大量的孔，該多孔材料係附加至該管的端部。
培養基中之生產乙醯輔酶A微生物的含量係根據微生物之種類及活性而變化，且於起始送入培養基之預培養微生物之懸浮液量可係相對於培養液之0.1質量%到30質量%，而基於培養條件控制之觀點來看， 較佳為1質量%到10質量%。
只要培養基係包含碳源、氮源、無機離子、以及用於生產感興趣產物之微生物所需的無機微量營養物、核酸、與維他命之標準培養基，則不用限制用於培養生產乙醯輔酶A之微生物的培養基。
不用限制培養步驟中的培養條件，且舉例來說，培養可進行於有氧的條件下，且同時將pH值與溫度適當地控制在pH4至9，較佳為pH6至8，以及20℃至50℃，較佳為25℃至42℃的範圍中。
不加以限制混合物的通氣率，且當僅使用空氣為氣體時，通氣率於50至600rpm下實質上係0.02vvm至2.0vvm(vvm：通氣容量[mL]/液容量[mL]/時間[分])。基於抑制對微生物的物理性損害，通氣較佳以0.1vvm至2.0vvm，更佳以0.1vvm至1.0vvm進行。
培養步驟可從培養開始持續進行直到混合物中之碳源材料耗盡，或直到生產乙醯輔酶A之微生物的活性消失為止。培養步驟之時間週期係根據混合物中之生產乙醯輔酶A之微生物之數量及活性，以及根據碳源材料的量而變化。一般而言，時間週期可係1小時以上，較佳為4小時以上。藉由額外地供給碳源材料及/或生產乙醯輔酶A之微生物，培養週期可以無限制地延伸，但以處理效率之觀點來看，培養週期通常可為5日以下，較佳為72小時以下。就其他條件而言，可使用一般培養中所使用之其他條件。
不加以限制回收累積於培養液中之感興趣產物的方法，且可加以應用之該方法的範例包含：將微生物細胞經由離心法等由培養液中移除，接著在根據感興趣產物之種類的條件下，以如結晶或層析分離或膜分離的一般分離方法分離感興趣產物。
本發明生產乙醯輔酶A之方法可包含：在培養步驟前的預培養步驟，該預培養步驟係用於適當地調整細胞數量及/或所使用之生產乙醯輔酶A之微生物的活性狀態。只要該預培養步驟係在根據生產乙醯輔酶A之微生物種類而通常所使用之條件下的培養，則不限制預培養步驟。
本發明生產麩胺酸方法包含：使用生產乙醯輔酶A之微生物，以自碳源材料生產作為感興趣產物的麩胺酸。亦即，生產麩胺酸方法 包含：使生產乙醯輔酶A之微生物與碳源材料接觸，且進行培養(以下簡稱為培養步驟)；並回收由接觸所獲得之感興趣產物(麩胺酸)(以下簡稱為回收步驟)。
根據生產麩胺酸方法，因為當培養微生物時，生產乙醯輔酶A之微生物會與碳源材料接觸，故碳源材料被生產乙醯輔酶A之微生物吸收，且可以一面固定二氧化碳，一面有效率地生產感興趣之產物。
只要培養基係包含碳源、氮源、和無機鹽、以及所需之如胺基酸與維他命之有機微量營養物的一種一般培養基，則不限制用於培養之培養基。可使用合成培養基或天然培養基。培養基中所使用的碳源與氮源可係任何形式，只要欲培養之菌株可利用該等來源即可。
可以使用之碳源材料的範例包含：糖，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、澱粉水解物和糖蜜。如乙酸和檸檬酸的有機酸類，以及如乙醇的醇類也可單獨地加以使用，或與其他碳源結合使用。
可以使用之氮源的範例包含：胺；銨鹽，如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨、及乙酸銨；及硝酸鹽。
可以使用之有機微量營養物的範例包含：胺基酸、維生素、脂肪酸、及核酸；以及含有該等微營養物之蛋白腖、酪蛋白胺基酸、酵母抽出物、及大豆蛋白水解物。當使用需要胺基酸等以生長之營養缺陷型突變菌株時，則較佳補充一種以上的必須營養物。
可以使用之無機鹽的範例包含：磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、及錳鹽。
培養基較佳進行於通氣狀況下，pH 3至9，20℃至45℃發酵溫度下。為調整pH值，可使用無機或有機之酸或鹼性物質、氨氣等等。在如此的條件下，L-胺基酸較佳在培養微生物10到120個小時之後累積在培養液中或於細胞中。
此外，當感興趣之L-胺基酸係L-麩胺酸時，可使用液態培養基進行培養，調整該液態培養基之狀況，使得L-麩胺酸容易沉澱析出，且同時允許培養基中之L-麩胺酸藉沉澱作用而生產及累積。允許L-麩胺酸沉澱之條件的範例包含：pH 5.0至4.0，較佳為pH 4.5至4.0，更佳為pH 4.3 至4.0，特別更佳pH值4.0。為於酸性條件下達成L-麩胺酸之生長增加與有效率的沉澱，pH較佳係5.0至4.0，更佳係4.5至4.0，仍更佳係4.3至4.0。於以上所述pH下之培養可於整個培養週期或於一部份的培養週期期間進行。
根據已知的收集方法，於培養完成後，可由培養液中收集L-麩胺酸。例如：可藉由在從培養液中移除細胞後進行濃縮晶析之方法，或藉由離子交換層析，來進行收集。當於允許於培養基中沉澱析出L-麩胺酸之條件下進行培養時，沉澱在培養液中之L-麩胺酸可以藉由離心法、過濾法等加以收集。在此情形中，仍溶解在培養基中之L-麩胺酸可能結晶化，且結晶化的L-麩胺酸可被一同分離出來。
範例
藉由以下範例詳細地描述本發明，然而，該等範例不會限制本發明。
[範例1]
<質體pMWGKC之製備>
為獲得GADPH啟動子，使用大腸桿菌MG1655菌株的基因組DNA作為模板，以及引子CGAGCTACATATGCAATGATTGACACGATTCCG(序列編號：1)與CGCGCGCATGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列編號：2)，進行PCR擴增(PCR amplification)。將經擴增之DNA片段以限制酶NdeI與SphI加以消化，以獲得相當於GAPDH啟動子之約110b的DNA片段。將所獲得之DNA片段與以限制酶NdeI和SphI來消化質體pBR322(GenBank accession number J01749)而獲得之片段加以混合，並使用連接酶將這些片段連接在一起。之後，使用產生的連接產物將大腸桿菌DH5 α菌株(Toyobo Co.,Ltd.,DNA-903)之勝任細胞(competent cells)轉型，而獲得在添加50μg/mL安比西林(ampicillin)之LB瓊脂板上生長的轉型株。將所獲得之菌落在37℃下，於添加安比西林50μg/mL之LB培養液中培養一晚，並由獲得之菌體細胞回收質體pBRgapP。
接著，使用pBRgapP作為模板，及引子CCGCTCGAGCATATGCTGTCGCAATGATTGACACG(序列編號：3)與 GCTATTCCATATGCAGGGTTATTGTCTCATGAGC(序列編號：4)進行PCR擴增。使用T4 Polynucleotide Kinase(Takara)磷酸化所擴增的DNA片段，而獲得含有GAPDH啟動子的DNA片段。此外，以限制酶AatII and NdeI處理質體pMW119(GenBank accession number AB005476)，並將經消化之DNA片段末端以KOD plus DNA polymerase(Takara)平滑化，而獲得具有pMW119複製起始點的DNA片段。使用連接酶將含有GAPDH啟動子的DNA片段及含有pMW119複製起始點的的DNA片段連接在一起。之後，以產生之連接產物將大腸桿菌DH5 α菌株的勝任細胞轉型，而獲得在添加50μg/mL安比西林(ampicillin)的LB瓊脂板上生長的轉型株。將獲得之菌落在37℃下，於添加安比西林50μg/mL之LB培養液中培養一晚，並由獲得之菌體細胞回收質體pMWG。
為獲得氯黴素耐性基因，使用pTH18cs1(GenBank accession No.AB019610)作為模板，及引子TCGGCACGTAAGAGGTTCC(序列編號：5)與CGGGTCGAATTTGCTTTCG(序列編號：6)，進行PCR擴增，且使用T4 Polynucleotide Kinase(Takara)磷酸化所取得的DNA片段，而獲得含有氯黴素耐性基因的DNA片段。接著，使用pMWG作為模板，及引子CTAGATCTGACAGTAAGACGGGTAAGCC(序列編號：7)與CTAGATCTCAGGGTTATTGTCTCATGAGC(序列編號8)進行PCR擴增。將產生的片段與含有氯黴素耐性基因的DNA片段混合，並使用連接酶連接在一起。以產生之連接產物將大腸桿菌DH5 α菌株的勝任細胞轉型，而獲得在添加25μg/mL氯黴素的LB瓊脂板上生長的轉型株。將獲得之菌落在37℃下，於添加氯黴素25μg/mL之LB培養液中培養一晚，且將所獲得之質體稱為pMWGC。
使用pMWGC基因作為模板，及引子CCTTTGGTTAAAGGCTTTAAGATCTTCCAGTGGACAAACTATGCC(序列編號：9)與GGCATAGTTTGTCCACTGGAAGATCTTAAAGCCTTTAACCAAAGG(序列編號：10)，進行PCR擴增，接著進行大腸桿菌DH5 α株之勝任細胞的轉形作用。之後，獲得在添加25μg/mL氯黴素之LB瓊脂板上生長的轉型株。將 獲得之菌落在37℃下，於添加氯黴素25μg/mL之LB培養液中培養一晚，並由所獲得之菌體細胞回收質體pMWGKC。
[範例2]
<源自Methylococcus capsulatus ATCC 33009之蘋果酸硫激酶與蘋果醯輔酶A裂解酶之表現質體的建構>
Methylococcus capsulatus ATCC 33009D-5之基因組DNA係購買自ATCC。使用Methylococcus capsulatus的染色體DNA作為模板，及引子GGAATTCCATATGGCTGTTAAAAATCGTCTAC(序列編號：11)與GCTCTAGATCAGAATCTGATTCCGTGTTC(序列編號：12)，進行PCR擴增，而獲得Methylococcus的mcl-mtk片段。將該片段連接至範例1中所製備之質體pMWGKC。將於是獲得之質體命名為pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(Mc)。
pMWGKC_mcl(Mc)_mtk(Mc)質體具有源自Methylococcus capsulatus之mcl基因序列(序列編號：13)、mtkA基因(序列編號：14)、及mtkB基因(序列編號：15)。源自Methylococcus capsulatus的mcl的胺基酸序列、mtkA的胺基酸序列、mtkB的胺基酸序列各自係如序列編號：16、序列編號：17、及序列編號：18所示。
[範例3]
<Pantoea ananatis PA株之建構>
從Pantoea ananatis AJ13601(專利寄存菌株BP-7207)回收質體RSFCPG。質體RSFCPG係具有催化L-麩胺酸之生物合成反應之酵素麩胺酸去氫酶、檸檬酸合酶、及磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的四環黴素耐性之質體(JP 2001-333769 A)。使用CaCl2法(Molecular Cloning,3rd edition,Cold Spring Harbor press,2001)，以RSFCPG將Pantoea ananatisAJ417(專利寄存菌株BP-8646)轉型，並培養在添加10μL/mL四環黴素的LB培養液中，而獲得Pantoea ananatis AJ417/RSFCPG(以下可簡稱為PA株)。
[範例4]
<用以評價的Pantoea ananatis株之建構>
範例3中所製備之Pantoea ananatis PA株經由電穿孔法以範例1中所述之質體pMWGKC以及範例2中所述之質體pMWGKC_mcl(Mc)_Mtk(MC)轉 型。將轉型株在添加30μg/mL氯黴素、及10μg/mL四環黴素之LB瓊脂培養基之上進行篩選，並將獲得之菌落作為評價用菌株。經建構之菌株整理於表1。
[範例5]
<藉由所建構的Pantoea ananatis菌株生產麩胺酸>
為了評估藉由表1中描述之所建構的Pantoea ananatis菌株的麩胺酸的生產速率及產率，Pantoea菌株中之每一者首先預培養在30ml的培養基中，其位於設有擋板之125ml容量的三角燒瓶中。該預培養之培養基由25g/L LB、0.5g/L葡萄糖、0.5g/L MgSO4.7H2O、3g/L KH2PO4,、0.5g/L NaCl、1g/L NH4Cl、6g/L Na2HPO4,、0.2g/L泛酸鈣(calcium pantothenate)、0.2g/L L-賴氨酸氯化氫(L-lysine hydrochloride)、0.2g/L L-甲硫氨酸、及0.2g/L 2,6-二氨基庚二酸(2,6-diaminopimelic acid)組成。抗生素按照需求以30μg/mL氯黴素及10μg/mL四環素濃度添加。該預培養之培養基接種於該菌株的甘油原種(glycerol stock)，並於34℃下之旋轉式培養箱中以200rpm速度攪動培養二天。將適當容量的預培養物在25℃下以6000rpm離心15min，並將其上清液介質丟棄。將細胞沉澱物接種於設有擋板之125ml容量的三角燒瓶中之5ml的發酵培養基，而達到在0.2-0.25範圍中之起始的細胞密度(OD600)值。發酵培養基(pH 7)由50g/L葡萄糖、20g/L(NH4)2SO4、0.5g/L MgSO4.7H2O、2g/L KH2PO4、0.5g/L NaCl、0.25g/L CaCl2.2H2O、20mg/L FeSO4.7H2O、20mg/L MnSO4.H2O、0.72mg/L ZnSO4.7H2O、0.64mg/L CuSO4.5H2O、0.72mg/L CoCl2.6H2O、0.4mg/L硼酸、1.2mg/L(NH4)6Mo7O24．4H2O、2g/L酵母菌萃取物、0.2g/L泛酸鈣、0.2g/L L-賴氨酸氯化氫、0.2g/L L-甲硫氨酸、0.2g/L 2,6-二氨基庚二酸、及20g/L碳酸鈣組成。抗生素按照需求以30μg/mL氯黴素及10μg/mL四環素的濃度添加。在以2N HCl稀釋發酵樣本後，以600nm測量光密度(OD600)。麩胺酸發酵係在34℃下之旋轉式培養箱中以250rpm轉速攪動來進行48小時。以週期性間隔抽出樣本，並以高效液相色譜法(HPLC)分析該樣本。葡萄糖的消耗係使用於標準條件下操作之Ultron PS-80H column(Shinwa Chemical Industries Ltd.,Japan)來監控，且同時麩胺酸生產係使用於標準條件下操作之RSpak NN-814 column(Showa Denko K.K.,Japan)來估算。於48小時發酵後之建構的Pantoea菌株之發酵效能的比較結果係總結於表2中。
表2中之數據顯示Pantoea中之mtk和mcl的過度表現造成與不帶有mtk和mcl的控制株相比較高約35%的麩胺酸生產及產率，。如此顯著的產率提升可以幫助降低整體的麩胺酸生產成本及實質上改良生產過程的效率。此外，意外地觀察到在過度表現mtk和mcl之菌株中的生物量形成係顯著地低於該控制菌株，儘管過度表現mtk和mcl之菌株的麩胺酸生產係增強的。此暗示相對於該控制菌株，經改良的過度表現mtk及mcl之菌株可更加有效率地消耗碳源，而以較高速率及產率生產麩胺酸。發酵期間之低生物量的形成就降低生物性廢棄物而言也利於產業生產過程，因這些生物性廢物係須加以再循環及處理。
[範例6]
<添加劑之評估>
以如範例5中之相同方式進行培養以及分析，除了使用範例4中所建構之PA/pMWGKC-mtk-mcl來作為欲評估之變異株，且將碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑作為添加劑供給至培養基。
分析的結果，分別供給碳酸鹽氣體、二氧化碳氣體及還原劑之群組，展現高於未供給碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑之群組(該群組係使用範例4中所建構之PA/pMWGKC-mtk-mcl作為欲評估之變異株，且不供給任何的碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑)之較高的每單位糖產率。
因此顯示，在加以賦予CO2固定途徑的Pantoea菌株中，供給碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑就增高每單位糖之產率而言係有功效的。
[範例7]
<質體pMWGKC2之製備>
為獲得GAPDH啟動子，使用大腸桿菌MG1655株之基因組DNA作為模板，及引子CTACTAGTCTGTCGCAATGATTGACACGATTCCG(序列編號：19)與GCTCGAATTCCCATATGTTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAATAAAAGG(序列編號：20)進行PCR擴增。以限制酶EcoR1消化所擴增的DNA片段。使用T4 Polynucleotide Kinase(Takara)磷酸化該DNA片段，而獲得含有GAPDH啟動子之DNA片段。此外，以限制酶Ndel處理質體pMW119(GenBank accession number AB005476)，並以KOD plus DNA polymerase(Takara)將經消化的該DNA片段之末端平滑化，且將該片段以限制酶EcoR1處理，而獲得具有pMW119複製起始點之DNA片段。使用連接酶將含有GAPDH啟動子的DNA片段以及pMW119複製起始點之DNA片段連接起來。之後，以所獲得之連接產物將大腸桿菌DH5α株之勝任細胞轉型，而獲得在添加安比西林50μg/mL之LB瓊脂板上生長的轉形株。將獲得之菌落在37℃下，於添加安比西林50μg/mL之LB培養液中於培養一晚，並由獲得之菌體細胞回收質體pMWG2。
為獲得氯黴素耐性基因，使用pTH18csl(GenBank accession No.AB019610)作為模版，及引子TCGGCACGTAAGAGGTTCC(序列編號：5)與CGGGTCGAATTTGCTTTCG(序列編號：6)進行PCR擴增，並且使用T4 Polynucleotide Kinase(Takara)將獲得之DNA片段磷酸化，而獲得含有氯黴素耐性基因之DNA片段。接著，使用pMWG2作為模版，及引子CTAGATCTGACAGTAAGACGGGTAAGCC(序列編號：7)與CTAGATCTCAGGGTTATTGTCTCATGAGC(序列編號：8)進行PCR擴增。將產生之片段與含有氯黴素耐性基因之DNA片段混合，且使用連接酶連接起來。以產生之連接產物將大腸桿菌DH5α株的勝任細胞轉型，而獲得在添加25μg/mL氯黴素之LB瓊脂板上生長的轉型株。將獲得之菌落在37℃下，於添加氯黴素25μg/mL之LB培養液中培養一晚，並將獲得之質體稱為pMWGC2。
使用pMWG2作為模版，以及引子CCTTTGGTTAAAGGCTTTAAGATCTTCCAGTGGACAAACTATGCC(序列編號：9)與GGCATAGTTTGTCCACTGGAAGATCTTAAAGCCTTTAACCAAAGG(序列編號：10)進行PCR擴增，接著進行大腸桿菌DH5α株的勝任細胞轉型。之後，獲得於添加25μg/mL氯黴素LB瓊脂板上生長的轉型株。將獲得之菌落在37℃下，於添加氯黴素25μg/mL之LB培養液中培養一晚，並由所獲得之菌體細胞回收質體pMWGC2。
[範例8]
<以使用pMWGKC2載體所建構之Pantoea ananatis菌株生產麩胺酸>
將Methylococcus的mcl-mtk片段以與範例2相同的方式插入pMWGKC2中，並將獲得之質體稱為pMWGKC2_mcl(Mc)_mtk(Mc)。將Pantoea ananatis PA株以與範例4相同方式分別地使用質體pMWGKC2與pMWGKC2_mcl(Mc)_mtk(Mc)轉型，而將所獲得之菌株分別稱為為PA/pMWGKC2與PA/pMWGKC-mtk-mcl2。藉由範例5中所述之方法評估麩胺酸生產，顯示與表2中所示相同趨勢之麩胺酸滴定濃度、產率及細胞生長。
以與範例6相同的方式進行培養及分析步驟，並將碳酸鹽、二氧化碳氣體、或還原劑作為添加劑供給至培養基。基於分析的結果，分別供給碳酸鹽、二氧化碳氣體、及還原劑之群組展現相對於無添加任何碳 酸鹽、二氧化碳氣體、或還原劑之群組(該群組係使用PA/pMWGKC-mtk-mcl2作為欲評估之變異株而不供給任何的碳酸鹽、二氧化碳氣體或還原劑)較高的每單位糖產率。
2013年1月24日提申之日本專利申請案第2013-011535號之揭示內容藉由參照全體納入本說明書中。
本說明書記載之所有文獻、專利申請案、及技術規格，將各文獻、專利申請案、及技術規格以參照納入與具體且分別記載之情形以同程度納入於本說明書中作為參照。
<110> 三井化學股份有限公司
<120> 生產由乙醯輔酶A衍生之化學物質的微生物
<130> P001301430
<150> JP 2013-011535
<151> 2013-01-24
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<213> Methylococcus capsulatus
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<212> PRT
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Claims (4)

  1. 一種生產乙醯輔酶A之方法，該方法包含下列步驟：培養步驟：將泛菌屬之生產乙醯輔酶A的微生物與碳源材料接觸並進行培養；及收集步驟：收集經由該接觸而獲得之目的生產物，其中，該泛菌屬之微生物的取得，係藉由對於下列(a)、(b)、(c)、及(d)皆無之微生物，在(a)、(b)、(c)、或(d)中之任一者均不賦予或即便當賦予(a)、(b)、(c)、或(d)中之一者以上時也不容許其功能發揮的情況下，賦予蘋果酸硫激酶、及蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素活性：(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應的二氧化碳固定循環；及(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應的二氧化碳固定循環。
  2. 如申請專利範圍第1項之生產乙醯輔酶A之方法，更包含下列步驟：對用於該培養步驟之培養基，供給選自由碳酸根離子、碳酸氫根離子、二氧化碳氣體，及還原劑所組成之群組中的至少一者。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之生產乙醯輔酶A之方法，更包含下列步驟：收集由該培養步驟產生之含有二氧化碳的氣體，並將該氣體供給至用於該培養步驟之培養基。
  4. 一種生產麩胺酸之方法，該方法包含下列步驟：將泛菌屬之生產乙醯輔酶A的微生物與碳源材料接觸並進行培養；及收集經由該接觸而獲得的麩胺酸，其中，該泛菌屬之微生物的取得，係藉由對於下列(a)、(b)、(c)、及(d)皆無之微生物，在(a)、(b)、(c)、或(d)中之任一者均不賦予或即便當賦予(a)、(b)、(c)、或(d)中之一者以上時也不容許其功能發揮的情況下，賦予蘋果酸硫激酶、及蘋果醯輔酶A裂解酶之酵素活性：(a)具有從丙二醯基輔酶A至丙二酸半醛或3-羥基丙酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(b)具有從乙醯輔酶A與CO2至丙酮酸之酵素反應的二氧化碳固定循環；(c)具有從巴豆醯輔酶A與CO2至乙基丙二醯基輔酶A或戊烯二醯基輔酶A之酵素反應的二氧化碳固定循環；及(d)具有從CO2至甲酸之酵素反應的二氧化碳固定循環。
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