TWI629283B - 來自血漿中的免疫球蛋白之ｉ-ｉｖ-１部分沉澱 - Google Patents

Abstract

本發明尤其提供由彙集血漿製造血液蛋白質組成物之方法。在一個具體實例中，本發明提供一種醇分部分離方案，該方案可顯著增加自起始血漿樣品純化之血液蛋白質之產率。在一個特定具體實例中，提供一種分部分離彙集血漿之方法，該方法包含初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟。本發明亦提供治療性血液蛋白質之醫藥組成物。

Description

來自血漿中的免疫球蛋白之I-IV-1部分沉澱

本發明係關於由彙集血漿製造血液蛋白質組成物之方法以及治療性血液蛋白質之醫藥組成物。

在1952年首次使用來自人類血漿之免疫球蛋白產物治療免疫缺乏。最初所選方法為肌肉內或皮下投予自血漿分離之免疫球蛋白同型G(IgG)。然而，該等方法不允許投予有效治療多種疾病所需的較大量IgG。因此，已研究可靜脈內投予之IgG產品。通常，靜脈內免疫球蛋白(IVIG)含有自超過一千名獻血者之血漿彙集之免疫球蛋白G(IgG)。該等製劑通常含有超過95%的未經修飾之IgG(其具有完整的Fc依賴性效應子功能)且僅含有微量免疫球蛋白A(IgA)及免疫球蛋白M(IgM)。典型地，IVIG經無菌過濾且製造方法含有使病毒失活及/或移除病毒之步驟。該等純化之IgG產品主要用於治療三大類醫學病狀：(1)免疫缺乏：X性聯無γ球蛋白血症(X-linked agammaglobulinemia)；低γ球蛋白血症(原發性免疫缺乏)及後天性免疫缺乏病狀(繼發性免疫缺乏)，其特徵為抗體含量較低；(2)發炎性及自體免疫疾病；及(3)急性感染。

特定而言，許多患有原發性免疫缺乏病症的人缺乏抗感染所需之抗體。在某些情況下，該等缺乏可由輸注純化之IgG(通常經靜脈內投予(亦即IVIG療法))補充。若干種原發性免疫缺乏病症通常以該方式治 療，包括X性聯無γ球蛋白血症(XLA)、普通變異型免疫缺乏(CVID)、IgM過高症候群(HIM)、嚴重複合型免疫缺乏症(SCID)及一些IgG子類缺乏(Blaese及Winkelstein,J.Patient & Family Handbook for Primary Immunodeficiency Diseases.Towson,MD：Immune Deficiency Foundation；2007)。

儘管IgG療法可極有效地管理原發性免疫缺乏病症，但此療法僅暫時性替代體內未產生之抗體而非治癒疾病。因此，患者依賴於重複給予IgG療法，典型地為約每月一次，持續終生。此療法特別需要IgG組成物之持續產生。然而，與經由重組DNA載體之活體外表現所產生之其他生物製劑不同，IgG係自人類血液及血漿捐獻物分部分離得到。因此，市售IgG之量受可用血液及血漿捐獻物之供應量限制。

若干因素促使對IgG之需求，包括接受IgG治療、鑑別IgG療法可有效之其他適應症以及患者診斷及IgG處方增加。值得注意的是，在1990年至2009年間，全世界對IgG之需求增加超過四倍，且每年還在以約7%至10%之速率增加(Robert P.,Pharmaceutical Policy and Law,11(2009)359-367)。舉例而言，據澳大利亞國家血液管理局(Australian National Blood Authority)報導，在2008至2009財政年度，澳大利亞對IgG之需求增長10.6%(National Blood Authority Australia Annual Report 2008-2009)。

部分地由於全世界需求增加及免疫球蛋白產品之可用供應量之波動，包括澳大利亞及英國在內之若干國家已實施需求管理計劃以在產品短缺時期保護該等產品對需求程度最高之患者之供應。

據報導，在2007年，已分部分離26,500,000公升血漿，產生75.2公噸IgG，平均產率為2.8公克/公升(Robert P.，見上文)。該報告估計，預期到2012年，全世界IgG產率會增加至約3.43公克/公升。然而，由於全世界對IgG之需求持續增長，預計當前至2015年間每年增加約7%至13%，將需要進一步改良整體IgG產率以滿足全世界之需求。

IgG產品之商業供應商使用了多種IgG製備方法。當前IgG製造方法之常見問題為在純化過程期間IgG之顯著損失，估計損失佔起始物質之總IgG含量至少30%至35%。一項挑戰為在改良製程效率以增加IgG產率之同時，保持病毒失活之品質及移除可引起不良反應之雜質。在當前IgG製造水準下，可使產率小幅增加之任何措施均認為實際上極具意義。舉例而言，在2007年之製造水準下，效率提高2%(等於附加56毫克/公升)將多產生1.5公噸IgG。

在已公開的關於血清及血漿蛋白質之製備及性質的一系列獨創性論文之第四期中，Cohn等人(J.Am.Chem.Soc.,1946,68(3)：459-475)首先描述了一種用醇分部分離血漿蛋白質之方法(方法6)，該方法允許自人類血漿分離出富含IgG之部分。若干年後，Oncley等人(J.Am.Chem.Soc.,1949,71(2)：541-550)基於Cohn方法進行擴展，公開了一種分離更純的IgG製劑之方法(方法9)。

該等方法儘管奠定了整個血漿源性血液蛋白質工業之基礎，但無法提供具有足夠高純度從而可用於治療若干種免疫相關疾病(包括川崎症候群(Kawasaki syndrome)、免疫性血小板減少性紫癜及原發性免疫缺乏)的IgG製劑。因此，研究使用各種技術(諸如離子交換層析)之其他方法來提供更高純度的IgG調配物。其中Hoppe等人(Munch Med Wochenschr 1967(34)：1749-1752)、Falksveden(瑞典專利第348942號)以及Falksveden及Lundblad(Methods of Plasma Protein Fractionation 1980)首次使用離子交換層析達成此目的。

自血漿純化免疫球蛋白之多種現代方法使用了沉澱步驟，諸如與管柱層析法結合之辛酸鹽沉澱(Lebing等人，Vox Sang 2003(84)：193-201)及Cohn(I+)II+III部分乙醇沉澱(Tanaka等人，Braz J Med Biol Res 2000(33)37-30)。最近，Teschner等人(Vox Sang,2007(92)：42-55)描述了一種製 備10% IgG產品之方法，其中首先自彙集血漿移出低溫沉澱物且接著進行經改良之科恩-昂科利冷乙醇分部分離(Cohn-Oncley cold ethanol fractionation)，接著進行中間物之S/D處理、離子交換層析、奈米過濾(nanofiltration)及視情況選用之超濾/滲濾。

儘管該等IgG分離方法提供純度、安全性及產率之改良，但仍可改良自血漿回收IgG之產率。舉例而言，Teschner等人報導其方法使IgG產率增加65%(Teschner等人，見上文)。如各個血漿產品會議期間所報導，在最終容器中大規模製備IgG(諸如自Baxter、CSL Behring、Upfront Technology、Cangene、Prometric BioTherapeutics及Finnish Red Cross)之平均產率在約61%至約65%範圍內。儘管優於先前使用之方法，但此IgG回收量仍表示在分離過程期間損失了彙集血漿部分中至少約三分之一的IgG。

由於可用於製造血漿源性產品之血漿供應有限，故可藉由將純化整合於單一構架中來實現自常見起始血漿池分離若干種血液蛋白質。舉例而言，通常經由形成科恩II+III部分沉澱物或祁斯特勒-尼斯克曼沉澱A(Kistler-Nitschmann precipitate A)來增濃IgG，接著使用其相應上清液製造α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)及白蛋白。類似地，已描述若干種自IgG免疫球蛋白製造期間形成之副產物製造因子H(Factor H)之方法，包括WO 2008/113589及WO 2011/011753。

因此，需要經改良且更有效的製造治療性IgG產品之方法。此外，該等方法亦應允許自單一血漿源製造其他血漿源性產品。本發明藉由提供IgG分離方法以及由其獲得之IgG組成物來滿足該等及其他需求，該等IgG分離方法之產率比當前可達到的產率高約20%至25%。有利的是，本文中提供之方法可共分離其他治療學上重要的血漿源性蛋白質，包括α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、因子H、間-α-抑制劑蛋白質(IaIp)、凝血酶原複合物、因子VII(FVII)、因子VIII(FVIII)、抗凝血酶III(ATIII)、纖維 蛋白原、丁醯膽鹼酯酶等。

當前製造IVIG及α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)之方法依賴多個蛋白質沉澱步驟來使免疫球蛋白IgG及A1PI與人類血漿中發現之其他組分分離。舉例而言，許多製造商使用科恩-昂科利方法6之變化型式，其中使用了三個初始醇沉澱步驟。第一個沉澱步驟(稱為I部分沉澱)係在高pH值(7.2)及低乙醇濃度(8%至10% v/v)下進行以使諸如纖維蛋白原及因子XIII之蛋白質沉澱而與IgG及A1PI分離，IgG及A1PI保留在上清液中。IgG接著在第二個沉澱反應(稱為II+III部分沉澱)中自I部分上清液沉澱，該第二沉澱反應係在中等pH值(6.8)及高乙醇濃度(20%至25%)下進行。大部分A1PI保留在II+III部分沉澱反應之上清液中，隨後使其在第三初始沉澱反應(稱為I-IV-1部分沉澱)中與白蛋白分離，該第三初始沉澱反應係在低pH值(5.2)及中等乙醇濃度(18%)下進行。

不幸的是，因為上述科恩-昂科利方法以及類似的使用四次初始沉澱來分部分離IgG及A1PI之祁斯特勒-尼斯克曼方法以一系列複雜的沉澱反應來分離個別組分，所以分部分離之效率很低。在該等初始沉澱步驟中，IgG及A1PI之產率之顯著損失可歸因於非目標部分中之部分沉澱以及目標部分中之不完全沉澱。舉例而言，IgG在一定程度上與纖維蛋白原及因子XIII一起於I部分沉澱中共沉澱且一些IgG在II+III部分沉澱中不沉澱。在使溶解之II+III部分沉澱物澄清後，IgG產率典型地介於起始科恩池中存在之IgG之75%與85%之間。因此，在該兩個分部分離步驟後，損失起始物質中總IgG含量之15%至25%。

本發明藉由去除多個初始沉澱步驟來對自彙集血漿回收IgG及A1PI加以改良。實情為，本文中所描述之方法依賴於單一初始沉澱步驟，其捕獲I部分、II+III部分及IV-1部分沉澱之組合中通常沉澱之所有 蛋白質。此單一沉澱步驟在本文中稱為「I+II+III+IV-1部分沉澱」、「I-IV-1部分沉澱」或「初始低pH值、高濃度醇沉澱」。有利的是，已發現無需使用後續蛋白質沉澱即可自I-IV-1部分沉澱物高效地提取IgG及A1PI。此外，已發現I-IV-1部分沉澱物含有血漿源中幾乎所有的IgG及A1PI內含物，而白蛋白則保留於上清液中。該等益處共同引起該等重要商業產品之總回收率顯著增加。

如實施例中所示，使用低pH值、高濃度醇沉澱步驟(I-IV-1部分沉澱)作為初始步驟自去低溫沉澱物血漿(cryo-poor plasma)純化IgG允許製造醫藥級IgG組成物，且產率前所未有地達到4.3至4.7公克IgG/公升血漿源。與目前先進技術製造方法(諸如用於自相同類型血漿製造GAMMAGARD LIQUID^®(Baxter International；Deerfield,IL)之方法)相比，該等產率代表著產率增加約20%至25%。

因此，本發明尤其提供一種新的血漿分部分離方法，其在初始步驟中將血漿或去低溫沉澱物血漿分離為I-IV-1部分沉澱物及I-IV-1部分上清液。I-IV-1部分沉澱物含有幾乎所有的免疫球蛋白(例如IgG、IgA及IgM)及α 1彈性蛋白酶抑制劑(A1PI)，而上清液主要含有白蛋白。

在一個態樣中，本發明提供一種自科恩池製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)在第一個沉澱步驟中使免疫球蛋白與α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)一起自去低溫沉澱物血漿共沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；(b)使第一沉澱物中之免疫球蛋白溶解以形成第一懸浮液，該第一懸浮液具有包含免疫球蛋白之可溶部分及包含A1PI之不可溶部分；(c)將第一懸浮液之可溶部分與第一懸浮液之不可溶部分分離；及(d)回收第一懸浮液之可溶部分，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。

在上述方法之一個具體實例中，第一個沉澱步驟為醇沉澱步驟。

在上述方法之一個具體實例中，醇沉澱步驟包含在pH 5至pH 6下向去低溫沉澱物血漿中添加乙醇以達到20%至30%乙醇(v/v)之最終濃度。

在上述方法之一個具體實例中，第一個沉澱步驟中乙醇之最終濃度為25±4%。在上述方法之一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25±3%。在上述方法之一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25±2%。在上述方法之一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25±1%。在上述方法之一個具體實例中，乙醇之最終濃度為25%。

在上述方法之一個具體實例中，第一個沉澱步驟之pH值為5.5±0.4。在上述方法之一個具體實例中，pH值為5.5±0.3。在上述方法之一個具體實例中，pH值為5.5±0.2。在上述方法之一個具體實例中，pH值為5.5±0.1。在上述方法之一個具體實例中，pH值為5.5。

在上述方法之一個具體實例中，pH值在第一個沉澱步驟期間保持不變。

在上述方法之一個具體實例中，第一個醇沉澱步驟包含藉由噴霧來添加醇。

在上述方法之一個具體實例中，第一個醇沉澱步驟包含在與葉輪相鄰的位點添加醇。在另一具體實例中，在超過一個位點處將醇引入溶液中。在一個具體實例中，在複數個小端口處將醇引入溶液中。在一個特定具體實例中，多個醇添加位點係位於葉輪或其他分散元件處或者接近葉輪或其他分散元件。在另一具體實例中，經由包含複數個開口之擴散器端口將醇引入溶液中。在一個特定具體實例中，擴散器端口中之複數個開口中之一或多個各別開口係位於葉輪或其他分散元件處或者鄰近葉輪或其他分散元件。

在上述方法之一個具體實例中，第一個沉澱步驟係在-3℃至-10℃之溫度下進行。在上述方法之一個具體實例中，第一個沉澱步驟係在-5℃至-9℃之溫度下進行。

在上述方法之一個具體實例中，第一沉澱物係用每公斤沉澱物4L至60L緩衝液來懸浮。在上述方法之一個具體實例中，第一沉澱物係用每公斤沉澱物8L至15L緩衝液來懸浮。

在上述方法之一個具體實例中，第一懸浮液之pH值為4.0至5.4。在上述方法之一個具體實例中，第一懸浮液之pH值為4.7至5.1。

在上述方法之一個具體實例中，第一懸浮液之電導率為0mS/cm至4mS/cm。在上述方法之一個具體實例中，第一懸浮液之電導率為0.5mS/cm至2mS/cm。

在上述方法之一個具體實例中，第一沉澱物係懸浮於包含乙酸鹽及/或磷酸鹽之緩衝液中。

在上述方法之一個具體實例中，藉由離心或過濾將第一懸浮液之可溶部分與第一懸浮液之不可溶部分分離。

在上述方法之一個具體實例中，將第一懸浮液之可溶部分與第一懸浮液之不可溶部分分離之步驟包含：(i)將細粉狀二氧化矽(SiO₂)與第一懸浮液混合；及(ii)將SiO₂與懸浮液分離。

在上述方法之一個具體實例中，細粉狀二氧化矽(SiO₂)之平均表面積為350m²/g至410m²/g。

在上述方法之一個具體實例中，細粉狀二氧化矽(SiO₂)係以每公斤第一沉澱物15公克至每公斤第一沉澱物80公克之最終濃度添加至第一懸浮液中。

在上述方法之一個具體實例中，該方法包含以下步驟：(a)在第一個沉澱步驟中，在介於5.3與5.7之間之pH值及介於-6℃與-8℃之間 之溫度下，用24%至26%之醇使免疫球蛋白自去低溫沉澱物血漿沉澱，從而形成第一沉澱物及第一上清液；(b)使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；(c)用細粉狀二氧化矽(SiO2)處理第一懸浮液；(d)將第一懸浮液之可溶部分與第一懸浮液之不可溶部分分離；及(e)回收第一懸浮液之可溶部分，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。

在上述方法之一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物中所含免疫球蛋白含量佔步驟(a)中所用科恩池中存在之IgG免疫球蛋白含量之至少90%。

在上述方法之一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物中所含免疫球蛋白含量佔步驟(a)中所用科恩池中存在之IgG免疫球蛋白含量之至少95%。

在上述方法之一個具體實例中，該方法進一步包含以下步驟：(f)在第二個沉澱步驟中使免疫球蛋白自第一懸浮液之可溶部分沉澱以獲得第二沉澱物及第二上清液；(g)使第二沉澱物懸浮以形成第二懸浮液；及(h)回收第二懸浮液之可溶部分，從而形成另一份增濃之免疫球蛋白組成物。

在上述方法之一個具體實例中，第二個沉澱步驟為醇沉澱步驟。

在上述方法之一個具體實例中，第二個醇沉澱步驟包含在介於6.5與7.5之間之pH值下向第一懸浮液之可溶部分中添加乙醇以達到介於22%與28%之間之乙醇最終濃度。

在上述方法之一個具體實例中，第二個醇沉澱步驟包含藉由噴霧來添加醇。

在上述方法之一個具體實例中，第二個醇沉澱步驟包含在與葉輪相鄰的位點添加醇。在另一具體實例中，在超過一個位點處將醇引入 溶液中。在一個具體實例中，在複數個小端口處將醇引入溶液中。在一個特定具體實例中，多個醇添加位點係位於葉輪或其他分散元件處或者接近葉輪或其他分散元件。在另一具體實例中，經由包含複數個開口之擴散器端口將醇引入溶液中。在一個特定具體實例中，擴散器端口中之複數個開口中之一或多個各別開口係位於葉輪或其他分散元件處或者鄰近葉輪或其他分散元件。

在上述方法之一個具體實例中，第二個沉澱步驟係在-3℃與-10℃之間的溫度下進行。

在上述方法之一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物中所含IgG含量佔步驟(a)中所用去低溫沉澱物血漿中存在之IgG含量之至少90%。

在上述方法之一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物中所含IgG含量佔步驟(a)中所用去低溫沉澱物血漿中之IgG含量之至少95%。

在上述方法之一個具體實例中，該方法進一步包含陰離子交換層析增濃步驟。

在上述方法之一個具體實例中，該方法進一步包含陽離子交換層析增濃步驟。

在上述方法之一個具體實例中，該方法進一步包含病毒失活或移除步驟。

在上述方法之一個具體實例中，該方法包含溶劑/清潔劑(S/D)病毒失活步驟。

在上述方法之一個具體實例中，該方法包含奈米過濾步驟。

在上述方法之一個具體實例中，該方法包含將組成物在pH4.0至pH 5.0下及20℃至40℃之溫度下保溫至少一週之步驟。

在上述方法之一個具體實例中，最終增濃之IgG組成物包含 至少98% IgG。

在上述方法之一個具體實例中，最終增濃之IgG組成物包含至少99% IgG。

在上述方法之一個具體實例中，該方法中每公升步驟(a)中所用去低溫沉澱物血漿產生至少4公克IgG。

在上述方法之一個具體實例中，該方法中每公升步驟(a)中所用去低溫沉澱物血漿產生至少4.25公克IgG。

在上述方法之一個具體實例中，該方法中每公升步驟(a)中所用去低溫沉澱物血漿產生至少4.5公克IgG。

在上述方法之一個具體實例中，自第一懸浮液之不可溶部分進一步純化α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)。

在上述方法之一個具體實例中，自第一懸浮液之不可溶部分進一步純化纖維蛋白原。

在上述方法之一個具體實例中，自第一懸浮液之不可溶部分進一步純化因子H。

在上述方法之一個具體實例中，自第一懸浮液之不可溶部分進一步純化間-α-胰蛋白酶抑制蛋白(I α Ip)。

在上述方法之一個具體實例中，用細粉狀二氧化矽(SiO₂)處理第一懸浮液之不可溶部分。

在上述方法之一個具體實例中，自第一上清液進一步純化白蛋白。

在一個態樣中，本發明提供一種根據技術方案1至63中任一項之方法製備之增濃之免疫球蛋白組成物。

在一個態樣中，本發明提供一種用於治療有需要之個體之免疫缺乏、發炎疾病、自體免疫疾病或急性感染之方法，該方法包含投予個 體根據技術方案64之增濃之免疫球蛋白組成物。

圖1. 根據本文中所描述之一個具體實例之血漿分部分離圖解。

I.前言

本發明尤其提供一種更高效地自彙集血漿分離治療性蛋白質之方法。本文中提供之用於分部分離彙集血漿之方法可提高多種治療學上重要的血漿源性血液蛋白質(包括免疫球蛋白及α-1-抗胰蛋白酶(A1PI))之產率。在一個特別重要之態樣中，本發明提供與目前先進技術中用於製造治療性IgG組成物之方法相比可顯著增加自血漿分離之免疫球蛋白(IgG)之產率的方法。在一個具體實例中，該等改良之產率係藉由使免疫球蛋白及AIP1在低pH值、高濃度醇條件下自起始血漿樣品(本文中稱為「科恩池」)沉澱來實現。低pH值、高濃度醇沉澱步驟使得大量捕獲起始科恩池中之免疫球蛋白組成物。與目前先進技術之免疫球蛋白製造方法相比，本文中提供之方法使上游血漿分部分離期間之免疫球蛋白損失量顯著降低。

本發明之方法減少在用於治療性投藥之足夠高純度下自人類血漿分離蛋白質所需之蛋白質沉澱步驟數目，同時增加治療學上重要的血液蛋白質(諸如免疫球蛋白(IgG))之回收率。具體言之，該等方法無需源自於科恩-昂科利、祁斯特勒-尼斯克曼及德馳(Deutsch)分部分離方案之製造方法中所用的初始高pH值、低濃度醇沉澱步驟(通常稱為I部分沉澱)。本文中提供之方法改為使用初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟(本文中稱為I-IV-1部分沉澱)，其將血漿中之大部分IgG、IgA、IgM及α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)內含物分入沉澱物中且將大部分白蛋白分入上清液中。接著經由各種方法將IgG與IgA、IgM及A1PI分離，產生高產率IgG組成物。 與使用I部分沉澱步驟之方法相比，在初始I-IV-1部分沉澱步驟中大量捕獲IgG使得該製造方法之最終產率提高至少10%至25%。

E. J. Cohn在1946年首次建立了使用乙醇而非鹽來分部分離血漿之方法。從此，乙醇沉澱法變為大規模製造血漿源性產品(諸如IgG及A1PI)之選擇方法。典型地，該等製造方法使用一系列乙醇分部分離步驟，由此提供多種血漿源性血液蛋白質之粗物質部分，該等粗物質部分藉由多種不同的下游程序/技術進一步增濃。

最初研究的科恩程序藉由用醇進行部分沉澱來獲得相對較高(95%)純度之白蛋白。然而，Oncley等人、Deutsch等人以及Kistler及Nitschmann很快認識到來自6號科恩方法之特定蛋白質沉澱物(II+III部分)可用作純化高度增濃之免疫球蛋白組成物之起始物質。為獲得供靜脈內投予IgG組成物所需的較高純度及安全性，已在IgG製造方法中在醇分部分離步驟後增加若干純化及研磨步驟(例如通用或所有不同層析技術中之吸附、交叉流過濾等)。

典型地，IgG製造商依賴於科恩方法6之II+III部分沉澱物或祁斯特勒-尼斯克曼沉澱A作為下游加工之起始物質。該兩個部分均藉由兩步驟方法形成，其中：i.)藉由在高pH值(7.2)及低乙醇濃度(8%至10% v/v)下進行之初始沉澱步驟(I部分沉澱)移除諸如纖維蛋白原及因子XIII之蛋白質；及ii.)IgG在pH 6.8及20%至25%(v/v)乙醇下(II+III部分)或在pH 5.85及19%乙醇(v/v)下(沉澱A)自I部分上清液沉澱，同時白蛋白及大部分A1PI保留於上清液中。然而，如上文所描述，使用II+III部分沉澱物或沉澱A作為製造IgG組成物之起始物質引起該方法中若干步驟之IgG損失。

為克服該等問題，本發明者已研究出一種初始純化步驟，其使免疫球蛋白與A1PI共沉澱以產生含有血漿源中之幾乎所有IgG及A1PI 內含物的起始物質，同時白蛋白保留於上清液中。此分部分離步驟本質上將如由Oncley等人(見上文)描述之部分沉澱步驟I、II+III及IV-1合併為單一沉澱反應，本文中稱為I+II+III+IV-1部分(或I-IV-1部分)沉澱。

在一個態樣中，本發明提供一種使用I-Iv-1部分沉澱物作為起始物質來製造用於靜脈內、皮下或肌肉內投藥之高產率免疫球蛋白組成物之方法。在各種具體實例中，該方法進一步包含將α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)分入在自I-IV-1部分沉澱物提取免疫球蛋白期間所形成之懸浮液之不可溶部分中。接著可使用分離之不可溶部分作為製造血漿源性A1PI組成物之起始物質。

在一個具體實例中，本發明提供製造自彙集血漿分離之蛋白質之治療性組成物的方法。在一些具體實例中，該等製造方法包括初始低pH值、高濃度醇(例如乙醇)沉澱步驟，與傳統方法相比，該沉澱步驟可增加各種血液蛋白質之回收率。在一些具體實例中，該等方法可用於製造一或多種治療性組成物，該一或多種治療性組成物含有自人類血液、血漿分離之免疫球蛋白(例如IgG)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H或間-α-胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質或其衍生物。

II. 定義

如本文中所用，術語「IgG治療」通常係指對患者靜脈內、皮下或肌肉內投予IgG免疫球蛋白之組成物以治療多種病狀(諸如免疫缺乏、發炎疾病及自體免疫疾病)之治療方法。IgG免疫球蛋白係典型地自血漿彙集及製備。可使用完整抗體或片段。IgG免疫球蛋白可按較高濃度(例如大於10%)調配以用於皮下投藥，或經調配以用於肌肉內投藥。此對於特殊IgG製劑尤其常見，製備的該等特殊IgG製劑針對特定抗原(例如Rho D因子、百日咳毒素(pertussis toxin)、破傷風毒素(tetanus toxin)、臘腸菌毒素(botulism toxin)、狂犬病(rabies)等)之效價高於平均效價。

如本文中所用，「去低溫沉澱物血漿」係指在移除藉由使血漿或彙集血漿在接近冷凍之溫度下(例如在低於約10℃之溫度下，較佳在不高於約6℃之溫度下)解凍而形成之低溫沉澱物後產生之上清液。在本發明之情形中，血漿可互換地指回收血漿(亦即，離體自全血分離之血漿)或血漿源(亦即，經血漿清除術收集之血漿)。低溫沉澱通常例如藉由使已經過安全性及品質因素分析的先前冷凍之彙集血漿解凍來進行，但亦可使用新鮮血漿。在使冷凍血漿在低溫下完全解凍後，在低溫(例如□6℃)下藉由離心或過濾使固體低溫沉澱物與液體上清液分離。

如本文中所用，「科恩池(Cohn pool)」係指用於分部分離血漿樣品或血漿樣品池之起始物質。科恩池可包括全血漿、去低溫沉澱物血漿及經歷預加工步驟之去低溫沉澱物血漿中之一或多者。在某些具體實例中，科恩池為已在預加工步驟中，例如藉由吸附於固相(例如氫氧化鋁、細粉狀二氧化矽等)上或層析步驟(例如離子交換或肝素親和層析)移除一或多種血液因子之去低溫沉澱物血漿樣品。可在分部分離前自去低溫沉澱物血漿樣品分離各種血液蛋白質，包括(但不限於)因子VIII抑制劑旁路活性(Factor Eight Inhibitor Bypass Activity，FEIBA)、因子IX複合物、因子VII、凝血酶原複合物及/或抗凝血酶III。

如本文中所用，術語「增濃組成物(enriched composition)」係指自血漿樣品分離之蛋白質組成物，其中蛋白質之純度高於起始血漿樣品中蛋白質之純度。在一個具體實例中，增濃組成物中之蛋白質純度比起始血漿樣品中高至少25%。在其他具體實例中，增濃組成物之純度比起始血漿樣品高至少50%、75%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或10倍以上。舉例而言，總蛋白質之70%為IgG之增濃IgG組成物的濃度為總蛋白質之10%為IgG之起始血漿樣品的7倍。

如本文中所用，術語「擴散添加(diffuse addition)」係指以 非定域方式向液體系統中添加物質之方法。擴散添加可例如藉由將液體(例如醇、pH調節劑、溶劑、清潔劑或其他液體)噴霧或噴灑至液體系統(例如血漿部分)中、在多個位點處將液體引入系統中、使用擴散器端口將液體引入系統中、在葉輪或其他分散元件處或者在葉輪或其他分散元件附近引入液體，或將呈固態之化學物質分佈於液體系統之擴展區域之上來實現。

如本文中所用，術語「噴霧(spraying)」係指例如在醇沉澱步驟(諸如I-IV-1部分沉澱步驟)期間，將液體物質以液體物質之小液滴或細霧形式傳遞至系統中之方法。噴霧可由具有噴霧頭或噴嘴且可手動或自動操作以自液體產生細霧之任何加壓裝置(諸如容器，例如噴霧瓶)實現。典型地，噴霧係在接收液體物質之系統經歷連續攪拌或以其他方式混合時進行以確保系統內液體之快速及均勻分佈。

如本文中所用，術語「溶劑」涵蓋能夠溶解或分散一或多種其他物質之任何液體物質。溶劑本質上可為無機液體，諸如水，或其可為有機液體，諸如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。如術語「溶劑清潔劑處理(solvent detergent treatment)」中所用，溶劑表示有機溶劑(例如磷酸三正丁酯)，其為用於使溶液中之脂質包膜病毒失活之溶劑清潔劑混合物的一部分。

如本文中所用，本申請案中所用術語「清潔劑(detergent)」與術語「界面活性劑(surfactant)」或「表面活性劑(surface acting agent)」可互換使用。界面活性劑典型地為兩親媒性有機化合物，亦即同時含有疏水性基團(「尾端(tail)」)及親水性基團(「頭端(head)」)，從而使得界面活性劑可溶於有機溶劑及水中。界面活性劑可由其頭端中形式上帶電基團之存在來進行分類。非離子性界面活性劑在其頭端中不具有帶電基團，而離子性界面活性劑在其頭端中帶有淨電荷。兩性離子性界面活性劑含有具有兩個帶相反電荷之基團的頭端。常用界面活性劑之一些實例包括：陰離 子性界面活性劑(基於硫酸根、磺酸根或羧酸根陰離子)：全氟辛酸鹽(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸銨及其他烷基硫酸鹽、月桂醇醚硫酸鈉(亦稱為十二烷基醚硫酸鈉或SLES)、烷基苯磺酸鹽；陽離子性界面活性劑(基於四級銨陽離子)：溴化鯨蠟基三甲基銨(CTAB；亦稱為溴化十六烷基三甲基銨)，及其他烷基三甲基銨鹽、氯化鯨蠟基吡錠(CPC)、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)、氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride，BAC)、苯甲索氯銨(benzethonium chloride，BZT)；長鏈脂肪酸及其鹽：包括辛酸鹽、辛酸、庚酸鹽、己酸、庚酸、壬酸、癸酸及其類似物；兩性離子性(兩性)界面活性劑：十二烷基甜菜鹼、椰油醯胺基丙基甜菜鹼、椰油醯兩性基甘胺酸鹽(coco ampho glycinate)；非離子性界面活性劑：烷基聚(氧化乙烯)、烷基酚聚(氧化乙烯)、聚(氧化乙烯)與聚(氧化丙烯)之共聚物(商業上稱為泊洛沙姆(Poloxamer)或泊洛沙胺(Poloxamine))、烷基聚葡萄糖苷(包括辛基葡萄糖苷、癸基麥芽糖苷)、脂肪醇(例如鯨蠟醇及油醇)、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA、聚山梨醇酯(Tween 20、Tween 80等)、Triton清潔劑及十二烷基二甲基胺氧化物。

「治療有效量或劑量(therapeutically effective amount or dose)」或「足夠/有效量或劑量(sufficient/effective amount or dose)」意謂產生投藥所達成之作用之劑量。精確劑量將視治療目的而定且可由熟習此項技術者使用已知技術(參見例如Lieberman,Pharmaceutical Dosage Forms(第1-3卷，1992)；Lloyd,The Art,Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999)；Pickar,Dosage Calculations(1999)；及Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，2003,Gennaro編，Lippincott,Williams & Wilkins)確定。

如本文中所用，術語「初始低pH值、高濃度醇沉澱(initial low pH,high alcohol precipitation)」及「I-IV-1部分沉澱(Fraction I-IV-1 precipitation)」可互換地指在20%至30%(v/v)之最終醇濃度(典型地為乙 醇)及pH 5.0至pH 6.0下使蛋白質自科恩池沉澱。通常，所得I-IV-1部分沉澱物中所含免疫球蛋白含量佔起始科恩池中免疫球蛋白含量之至少90%，較佳佔起始科恩池中免疫球蛋白含量之至少95%，更佳佔至少98%，最佳佔至少99%。在一個較佳具體實例中，免疫球蛋白包含IgG免疫球蛋白。在另一較佳具體實例中，α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)與免疫球蛋白一起在I-IV-1沉澱步驟中共沉澱。

III. 分部分離血漿

在一個態樣中，本發明提供使用初始沉澱步驟自彙集血漿分部分離治療性蛋白質之方法，其中起始血漿中之大部分免疫球蛋白及α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)內含物均沉澱且起始血漿中之大部分白蛋白內含物保留於上清液中。自此初始沉澱步驟開始，可以高回收率製造多種治療學上重要的血液蛋白質。

在一個具體實例中，本發明提供一種分部分離血漿樣品中之血液蛋白質的方法，該方法包含使免疫球蛋白及A1PI在低pH值、高濃度醇條件下自起始血漿沉澱。此低pH值、高濃度醇沉澱步驟引起沉澱物(本文中稱為I-IV-1部分沉澱)及上清液(本文中稱為I-IV-1部分上清液)之形成。

I-IV-1部分上清液中所含白蛋白含量將為起始血漿中白蛋白含量之至少70%，較佳為至少80%，最佳為至少90%。因此，此上清液可用作製造醫藥用白蛋白組成物之起始物質。

I-IV-1部分沉澱物中所含免疫球蛋白含量將為起始血漿中免疫球蛋白含量之至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少98%，最佳為至少99%。在一個特定具體實例中，I-IV-1部分沉澱物中所含IgG含量為起始血漿中IgG含量之至少98%，較佳為99%。因此，此沉澱物可用作製造醫藥免疫球蛋白組成物之起始物質。在一個具體實例中，使用I-IV-1部分沉 澱物作為製造醫藥IgG組成物之起始物質。在另一個具體實例中，使用I-IV-1部分沉澱物作為製造醫藥用免疫球蛋白組成物之起始物質，該免疫球蛋白組成物含有超過一種免疫球蛋白亞型。

類似地，I-IV-1部分沉澱物中所含A1PI含量將為起始血漿中A1PI含量之至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少97%，最佳為至少98%。因此，此沉澱物可用作製造醫藥用A1PI組成物之起始物質。

I-IV-1部分沉澱物中所含因子H含量亦將為起始血漿中因子H含量之至少70%，較佳為至少80%，更佳為至少90%，最佳為至少95%。因此，此沉澱物可用作製造醫藥用因子H組成物之起始物質。

I-IV-1部分沉澱物中所含間-α-抑制劑(IaIp)含量亦將為起始血漿中間-α-抑制劑含量之至少70%，較佳為至少80%，更佳為至少90%，最佳為至少95%。因此，此沉澱物可用作製造醫藥用IaIp組成物之起始物質。

在一個態樣中，本發明提供一種使在I-IV-1部分沉澱物中發現之免疫球蛋白與A1PI分離之方法。在一個具體實例中，該方法包含使免疫球蛋白溶解於I-IV-1部分沉澱物之懸浮液中，同時使A1PI保留於懸浮液之不可溶部分中且接著例如藉由過濾或離心來分離可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，藉由在分離可溶部分與不可溶部分之前用細粉狀二氧化矽處理I-IV-1部分懸浮液來幫助分離。在不受理論約束之情況下，二氧化矽可結合於A1PI，與免疫球蛋白共溶解，從而增大分配至懸浮液之不可溶部分中之A1PI量。

此外，已知因子H及IaIp在某些條件下結合顆粒狀二氧化矽(參見WO/2011/011753、PCT/US2011/45099及PCT/US2011/038247；其揭示內容以全文引用的方式明確地併入本文中以用於所有目的)。因此，在一個具體實例中，本發明提供一種使在I-IV-1部分沉澱物中發現之免疫球蛋 白與A1PI、因子H及IaIp分離之方法，該方法包含使I-IV-1部分沉澱物懸浮於水或足以溶解免疫球蛋白之低電導率緩衝液中；用二氧化矽處理懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與不可溶部分，其中可溶部分含有免疫球蛋白且不可溶部分含有A1PI、因子H及IaIp。

在上文提供之方法之一個具體實例中，所分離之I-IV-1部分懸浮液之可溶部分中所含IgG含量為起始血漿樣品中IgG含量之至少80%。在一個較佳具體實例中，所分離之I-IV-1部分懸浮液之可溶部分中所含IgG含量為起始血漿樣品中IgG含量之至少90%。在一個更佳的具體實例中，所分離之I-IV-1部分懸浮液之可溶部分中所含IgG含量為起始血漿樣品中IgG含量之至少95%。在其他具體實例中，I-IV-1部分懸浮液之可溶部分中所含IgG含量為起始血漿樣品中IgG含量之至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。

在上文提供之方法之一個具體實例中，所分離之I-IV-1部分懸浮液之不可溶部分中所含A1PI含量為起始血漿樣品中A1PI含量之至少70%。在一個較佳具體實例中，所分離之I-IV-1部分懸浮液之不可溶部分中所含A1PI含量為起始血漿樣品中A1PI含量之至少80%。在一個更佳具體實例中，所分離之I-IV-1部分懸浮液之不可溶部分中所含A1PI含量為起始血漿樣品中A1PI含量之至少90%。在一個更佳具體實例中，所分離之I-IV-1部分懸浮液之不可溶部分中所含A1PI含量為起始血漿樣品中A1PI含量之至少95%。在其他具體實例中，所分離之I-IV-1部分懸浮液之不可溶部分中所含A1PI含量為起始血漿樣品中A1PI含量之至少50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上。

使用初始物質沉澱步驟(例如I-IV-1部分沉澱)分部分離之血液蛋白質可藉由合適程序進一步增濃，例如沉澱(例如醇分部分離或聚乙二醇分部分離)、層析法(離子交換層析、親和層析、免疫親和層析等)、過濾(超濾/滲濾、奈米過濾)、超離心、電泳製備及其類似程序。

A. 製備去低溫沉澱物血漿

用於製備濃縮之IgG組成物之起始物質通常由回收之血漿(亦即，離體自全血分離之血漿)或血漿源(亦即，經由血漿清除術收集之血漿)組成。純化製程典型地由使已經過安全性及品質因素分析的先前冷凍之彙集血漿解凍開始。解凍典型地在不高於6℃之溫度下進行。在冷凍血漿於低溫下完全解凍後，在低溫(例如6℃)下進行離心以分離固體低溫沉澱物與液體上清液。或者，分離步驟可藉由過濾而非離心進行。接著在下一步驟中加工液體上清液(在藉由離心自新鮮解凍之血漿中移除冷的不可溶蛋白質後，亦稱為「去低溫沉澱物血漿」)。此時可進行多個其他步驟以分離因子VIII抑制劑旁路活性(FEIBA)、因子IX複合物、因子VII、抗凝血酶III、凝血酶原複合物等。

B. 第一沉澱事件-I-Ⅳ-1部分沉澱

在一個具體實例中，本發明提供一種分部分離血漿樣品中之血液蛋白質的方法，該方法包含在第一個沉澱步驟中使免疫球蛋白及A1PI在低pH值、高濃度醇條件下自起始血漿沉澱。此低pH值、高濃度醇沉澱步驟引起沉澱物(I-IV-1沉澱物)及上清液(I-IV-1部分上清液)之形成。

在一個具體實例中，第一個沉澱步驟係藉由在介於5.0與6.0之間之pH值下混合乙醇與起始血漿池(科恩池)達到20%至30%(v/v)之最終濃度來進行。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±2%(v/v)之 最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±1%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25%(v/v)之最終濃度。類似地，在一個具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.5下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.4下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.3下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.2下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.1下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5下進行。在其他具體實例中，第一個沉澱步驟中之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。

因此，在一個具體實例中，本發明提供一種分部分離血漿樣品中之血液蛋白質之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使免疫球蛋白及A1PI沉澱，從而形成第一沉澱物及第一上清液；分離第一沉澱物與第一上清液；其中第一上清液中所含白蛋白含量為科恩池中白蛋白含量之至少75%。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。

在本文中提供之方法之一個具體實例中，起始科恩池中至少90%之免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個較佳具體實例中，起始科恩池中至少95%之免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個更佳具體實例中，起始科恩池中至少99%之免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。在某些具體實例中，起始科恩池中至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個更特定的具體實例中，起始科恩池中之免 疫球蛋白內含物係指起始科恩池中之IgG、IgA及IgM內含物。在一個特定具體實例中，起始科恩池中之免疫球蛋白內含物係指起始科恩池中之IgG內含物。

在本文中提供之方法之一個具體實例中，起始科恩池中至少80%之α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個較佳具體實例中，起始科恩池中至少90%之A1PI內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個更佳具體實例中，起始科恩池中至少95%之A1PI內含物在初始沉澱反應中沉澱。在某些具體實例中，起始科恩池中至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之A1PI內含物在初始沉澱反應中沉澱。

在本文中提供之方法之一個具體實例中，起始科恩池中至少70%之因子H內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個較佳具體實例中，起始科恩池中至少80%之因子H內含物在初始沉澱反應中沉澱。在較佳具體實例中，起始科恩池中之至少90%因子H內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個更佳具體實例中，起始科恩池中至少95%之因子H內含物在初始沉澱反應中沉澱。在某些具體實例中，起始科恩池中至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之因子H內含物在初始沉澱反應中沉澱。

在本文中提供之方法之一個具體實例中，起始科恩池中至少70%之間-α-抑制劑(IaIp)內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個較佳具體實例中，起始科恩池中至少80%之IaIp內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個較佳具體實例中，起始科恩池中至少90%之IaIp內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個更佳具體實例中，起始科恩池中至少95%之IaIp內含物 在初始沉澱反應中沉澱。在某些具體實例中，起始科恩池中至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之IaIp內含物在初始沉澱反應中沉澱。

因此，在一個具體實例中，本發明提供一種分部分離科恩池中之血液蛋白質之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使免疫球蛋白、A1PI、因子H及IaIp沉澱，從而形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物與第一上清液分離；其中第一沉澱物含有i.)起始科恩池中IgG內含物之至少95%、較佳至少97%、更佳至少99%，ii.)起始科恩池中A1PI內含物之至少90%、較佳至少95%、最佳至少97%，iii.)起始科恩池中因子H內含物之至少80%、較佳至少90%、更佳至少95%，及iv.)起始科恩池中IaIp內含物之至少80%、較佳至少90%、更佳至少95%，且另外其中第一上清液中所含白蛋白含量為科恩池中白蛋白含量之至少70%，較佳為至少80%，更佳為至少90%。在一個具體實例中，第一個沉澱步驟係藉由在介於5.0與6.0之間之pH值下混合乙醇與起始血漿池(科恩池)達到22%至28%(v/v)之最終濃度來進行。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±2%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±1%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25%(v/v)之最終濃度。類似地，在一個具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.5下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.4下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.3下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.2下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.1下進行。在另一具體實例中， 第一個沉澱步驟係在pH 5.5下進行。在其他具體實例中，第一個沉澱步驟中之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。

IV.製備免疫球蛋白組成物

通常，根據本發明之免疫球蛋白製劑可由任何合適的起始血漿材料(例如回收血漿或血漿源)製備。在一個典型實例中，血液或血漿係自健康供體收集。通常，血液係自與將投予免疫球蛋白製劑之個體相同的動物物種收集(典型地稱為「同源」免疫球蛋白)。回收血漿或血漿源可經或不經低溫沉澱以提供去低溫沉澱物血漿。此外，亦可藉由吸附、離子交換層析或其他層析法處理血漿或去低溫沉澱物血漿以移除一或多種血液因子。接著使免疫球蛋白在低pH值、高濃度醇條件下自血漿或去低溫沉澱物血漿起始物質(稱為「科恩池」)沉澱以形成I-IV-1部分沉澱。

免疫球蛋白可藉由合適程序，例如沉澱(醇分部分離或聚乙二醇分部分離)、層析法(例如離子交換層析、親和層析、免疫親和層析等)、過濾(超濾/滲濾、奈米過濾)、超離心、電泳製備及其類似方法，自I-IV-1部分沉澱物進一步增濃(參見例如Cohn等人，J.Am.Chem.Soc.68：459-75(1946)；Oncley等人，J.Am.Chem.Soc.71：541-50(1949)；Barundern等人，Vox Sang.7：157-74(1962)；Koblet等人，Vox Sang.13：93-102(1967)；美國專利第5,122,373號及第5,177,194號；PCT/US2010/036470；及PCT/US2011/038247；其揭示內容以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的)。

A. 上游加工

本發明尤其提供藉由進行初始沉澱步驟來分部分離彙集血漿中存在之蛋白質的方法，該初始沉澱步驟使起始血漿中之大部分免疫球蛋白及α-1-抗胰蛋白酶內含物沉澱。為進一步提高在初始沉澱步驟之沉澱物及上清液中發現之個別血漿蛋白質(例如IgG、A1PI、因子H、IaIp等) 之純度，可藉由分部分離(例如藉由醇沉澱、PEG沉澱、鹽析等)、層析、過濾或其他方法使該等組成物進一步增濃。儘管使用該等多種血漿源性蛋白質增濃技術可按任何次序進行，但在特定具體實例中，首先分部分離(例如藉由乙醇沉澱)第一沉澱物及/或上清液且接著使用層析及/或過濾技術進行增濃。在本發明之情形中，初始沉澱反應及後續分部分離係統稱為「上游加工」步驟，而層析及過濾步驟係統稱為「下游加工」步驟。

1. 大量免疫球蛋白沉澱

如本文中所描述，本發明者發現了經改良之用於分部分離人類血漿以純化治療學上有益之血液蛋白質(諸如免疫球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、因子H、間-α-抑制蛋白(IaIp)、白蛋白、纖維蛋白原等)的方法。此方法併入了初始純化步驟，其中起始科恩池(亦即，血液、血漿及/或預處理血漿)中之大部分免疫球蛋白、A1PI、因子H、IaIp及纖維蛋白原內含物沉澱且起始科恩池中之大部分白蛋白內含物保留於上清液中。有利的是，本發明者研究出一種藉由自初始沉澱物提取免疫球蛋白而非其他蛋白質來分離免疫球蛋白與A1PI、因子H及IaIp之方法。詳言之，本發明者已發現，用細粉狀二氧化矽(SiO₂)處理初始沉澱物之懸浮液可改良不可溶部分中A1PI、因子H及IaIp之滯留。在不受理論約束之情況下，本發明者咸信在某些條件下，最初可自沉澱物提取之A1PI、因子H及IaIp結合於細粉狀二氧化矽，該細粉狀二氧化矽接著可與懸浮液之不可溶部分一起移除。分離所得上清液(亦即懸浮液之可溶部分)提供增濃之溶液，其含有起始科恩部分中之大部分免疫球蛋白內含物。

在一個態樣中，本發明提供一種由科恩池製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，使免疫球蛋白與α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)一起自科恩池共沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；自懸浮液移除A1PI； 及回收第一懸浮液之可溶部分，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。通常，可使用任何用於使免疫球蛋白及A1PI沉澱的化學方法，包括(但不限於)醇沉澱(例如使用乙醇或甲醇)、使用水溶性聚合物(例如PEG或聚葡萄糖)進行之沉澱，及鹽析(例如使用磷酸銨、硫酸銨、檸檬酸鈉等)。在一個較佳具體實例中，沉澱為醇沉澱，較佳為乙醇沉澱。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個具體實例中，第一個沉澱步驟係藉由在介於5.0與6.0之間之pH值下混合乙醇與科恩池達到20%至30%(v/v)之最終濃度來進行。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±2%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±1%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25%(v/v)之最終濃度。類似地，在一個具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.5下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.4下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.3下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.2下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5±0.1下進行。在另一具體實例中，第一個沉澱步驟係在pH 5.5下進行。在其他具體實例中，第一個沉澱步驟中之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

與目前先進技術之依賴於初始低濃度醇沉澱步驟(亦即I部分沉澱)之純化程序相比，本文中提供之方法提供顯著較高的最終增濃之產物中之免疫球蛋白回收率，此係歸因於起始科恩池中之大部分免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。

因此，在本文中提供之方法之一個具體實例中，起始科恩池 中至少90%之免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個較佳具體實例中，起始科恩池中至少95%之免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個更佳具體實例中，起始科恩池中至少99%之免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。在某些具體實例中，起始科恩池中至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99%以上之免疫球蛋白內含物在初始沉澱反應中沉澱。在一個特定具體實例中，起始科恩池中之免疫球蛋白內含物係指起始科恩池中之IgG內含物。

如本文中提供之實施例中所示，使用初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟(亦即，I-IV-1部分沉澱)引起起始科恩池中至少99%之IgG內含物沉澱。因此，在一個具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間之最終濃度來使99%至100%之IgG內含物自科恩池沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液；分離第一沉澱物與第一上清液；及自第一沉澱物回收IgG，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，使自第一沉澱物回收之IgG進一步增濃。在某些具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。

如表15及表31中呈現之資料所證明，科恩池中超過97%之α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)內含物亦在初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟中沉澱。因此，在一個具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使 95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；自懸浮液中移除A1PI；及回收第一懸浮液之可溶部分，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第一沉澱物回收之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使自懸浮液移除之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

此外，已發現科恩池中超過90%之白蛋白內含物未在初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟(表33)中沉澱，且因此可自上清液回收。因此，在一個具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到20%至30%之最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；自懸浮液移除A1PI；及回收第一懸浮液之可溶部分，其中科恩池中80%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第一沉澱物回收之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使自懸浮液移除之A1PI進一步增濃。在另一具體實例中，使在第一上清液中發現之白蛋白進一步增濃。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在某些具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中 所列之變化1至2166。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

2. 提取及分離免疫球蛋白

與科恩II+III部分沉澱物或祁斯特勒-尼斯克曼沉澱A相比，由本文中提供之方法形成之初始沉澱物含有實質上較高含量的非免疫球蛋白型蛋白質，包括A1PI及纖維蛋白原。舉例而言，如表30中所示，起始科恩池中接近100%之纖維蛋白原內含物與免疫球蛋白一起在初始低pH值、高濃度醇沉澱反應中共沉澱。此與在初始低濃度醇沉澱步驟(I部分沉澱)中移除大部分纖維蛋白原之科恩-昂科利及祁斯特勒-尼斯克曼純化方案相對。類似地，如表15及表31中所示，起始科恩池中超過97%之α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)內含物與免疫球蛋白一起在初始低pH值、高濃度醇沉澱反應中共沉澱。相比之下，在科恩-昂科利及祁斯特勒-尼斯克曼純化方案中，大部分A1PI不與免疫球蛋白共沉澱。實情為，在II+III部分上清液或上清液A中發現A1PI。

因此，為提供醫藥級免疫球蛋白組成物，需要自免疫球蛋白組成物中移除存在於初始沉澱物中之污染物，諸如A1PI及纖維蛋白原。此可例如藉由進一步分部分離第一沉澱物(例如藉由使用醇、非離子性親水性聚合物進行之微差沉澱，或鹽析)、層析方法或過濾方法實現。

在一個具體實例中，使第一沉澱物懸浮於注射用水(WFI)或適於自沉澱物提取免疫球蛋白之低離子強度緩衝液中。在某些具體實例中，接著用細粉狀二氧化矽(SiO₂)處理懸浮液，且分離懸浮液中含有免疫球蛋白之可溶部分與懸浮液中含有大部分A1PI及纖維蛋白原之不可溶部分。

適於提取第一沉澱物之溶液之pH值通常將介於4.0與5.5之間。在某些具體實例中，溶液之pH值將介於4.5與5.0之間，在其他具 體實例中，提取溶液之pH值將為約4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4或5.5。在一個較佳具體實例中，提取緩衝液之pH值為4.7±0.1。在另一較佳具體實例中，提取緩衝液之pH值為4.8±0.1。在另一較佳具體實例中，提取緩衝液之pH值為4.9±0.1。通常，該等pH值要求可使用選自例如乙酸鹽、檸檬酸鹽、磷酸二氫鹽、磷酸氫鹽、其混合物及其類似物之緩衝劑滿足。合適的緩衝液濃度典型地在5至100mM，或10至50mM，或5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100mM緩衝劑範圍內。

提取緩衝液之電導率較佳為0.5mS/cm至2.0mS/cm。舉例而言，在某些具體實例中，提取緩衝液之電導率為0.5±0.1mS/cm，或0.6±0.1、0.7±0.1、0.8±0.1、0.9±0.1、1.0±0.1、1.1±0.1、1.2±0.1、1.3±0.1、1.4±0.1、1.5±0.1、1.6±0.1、1.7±0.1、1.8±0.1、1.9±0.1或2.0±0.1mS/cm。一般熟習此項技術者將瞭解如何產生具有合適電導率之提取緩衝液。在一個特定具體實例中，提取緩衝液含有5mM磷酸二氫鈉及5mM乙酸鹽(pH 4.8±0.2)且電導率為0.7mS/cm至0.9mS/cm。

在一個具體實例中，在過濾前混合細粉狀二氧化矽與I-IV-1部分懸浮液。在一個具體實例中，此預處理步驟包含添加細粉狀二氧化矽粒子(例如煙霧狀二氧化矽；Aerosil®)，接著保溫40至80分鐘，其間持續混合懸浮液。在某些具體實例中，保溫期將介於約50分鐘與約70分鐘之間，或為約30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90分鐘或90分鐘以上。通常，處理將在0℃與10℃之間或在2℃與8℃之間進行。在某些具體實例中，處理可在約0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下進行。在一個特定具體實例中，處理係在2℃與10℃之間進行。在一個較佳具體實例中，處理係在5℃與10℃之間進行。

在一個具體實例中，以在每公斤I-IV-1部分沉澱物20公克 與每公斤I-IV-1部分沉澱物100公克之間之濃度添加煙霧狀二氧化矽。在另一具體實例中，以在每公斤I-IV-1部分沉澱物30公克與每公斤I-IV-1部分沉澱物80公克之間之濃度添加煙霧狀二氧化矽。在某些具體實例中，可按每公斤I-IV-1部分沉澱物約20公克，或每公斤I-IV-1部分沉澱物約25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100公克之濃度添加煙霧狀二氧化矽。在一個特定具體實例中，向I-IV-1部分懸浮液中添加煙霧狀二氧化矽(例如Aerosil 380或等效物)達到每公斤I-IV-1部分沉澱物40±20公克之最終濃度。在另一特定具體實例中，向I-IV-1部分懸浮液中添加煙霧狀二氧化矽達到每公斤I-IV-1部分沉澱物40±10公克之最終濃度。混合係在2℃至8℃下進行至少50至70分鐘。

在某些具體實例中，以每公克蛋白質總量().()1公克至每公克蛋白質總量10公克之濃度向免疫球蛋白組成物中添加SiO₂。在另一具體實例中，以每公克蛋白質總量0.01公克至每公克蛋白質總量5公克之濃度向免疫球蛋白組成物中添加SiO₂。在另一具體實例中，以每公克蛋白質總量0.02公克至每公克蛋白質總量4公克之濃度向免疫球蛋白組成物中添加SiO₂。在一個具體實例中，以每公克蛋白質總量至少0.1公克之最終濃度添加SiO₂。在另一特定具體實例中，以每公克蛋白質總量至少0.2公克之濃度添加煙霧狀二氧化矽。在另一特定具體實例中，以每公克蛋白質總量至少0.25公克之濃度添加煙霧狀二氧化矽。在其他特定具體實例中，以每公克蛋白質總量至少1公克之濃度添加煙霧狀二氧化矽。在另一特定具體實例中，以每公克蛋白質總量至少2公克之濃度添加煙霧狀二氧化矽。在另一特定具體實例中，以每公克蛋白質總量至少2.5公克之濃度添加煙霧狀二氧化矽。在其他特定具體實例中，以每公克蛋白質總量至少0.01公克，或每公克蛋白質總量至少0.02公克、0.03公克、0.04公克、0.05公克、0.06公克、0.07公克、0.08公克、0.09公克、0.1公克、0.2公克、0.3公克、0.4公克、 0.5公克、0.6公克、0.7公克、0.8公克、0.9公克、1.0公克、1.5公克、2.0公克、2.5公克、3.0公克、3.5公克、4.0公克、4.5公克、5.0公克、5.5公克、6.0公克、6.5公克、7.0公克、7.5公克、8.0公克、8.5公克、9.0公克、9.5公克、10.0公克或10.0公克以上之濃度添加細粉狀二氧化矽。

因此，在一個具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；用細粉狀二氧化矽處理第一懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分，其中懸浮液之可溶部分含有免疫球蛋白且懸浮液之不可溶部分含有A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第一沉澱物回收之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使自懸浮液移除之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在一個特定具體實例中，藉由過濾來分離第一懸浮液之可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

此外，已發現科恩池中超過90%之白蛋白內含物未在初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟(表33)中沉澱，且因此可自上清液回收。因此，在一個具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到20%至30%之最終濃度來使95%至100%之IgG 及A1PI內含物自科恩池沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；用細粉狀二氧化矽處理第一懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分，其中懸浮液之可溶部分含有免疫球蛋白且懸浮液之不可溶部分含有A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp，且另外其中科恩池中80%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使懸浮液之可溶部分中存在之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之A1PI進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之纖維蛋白原進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之因子H進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之IaIp進一步增濃。在另一具體實例中，使在第一上清液中發現之白蛋白進一步增濃。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在某些具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個特定具體實例中，藉由過濾來分離第一懸浮液之可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

3. 分部分離

在一個具體實例中，藉由分部分離使自第一懸浮液(I-IV-1糊狀懸浮液)之可溶部分回收之免疫球蛋白進一步增濃。通常，可使用任何分部分離方法(例如醇或聚合物沉澱、鹽析等)。在一個較佳具體實例中，藉由乙醇沉澱來分部分離第一懸浮液之可溶部分，由此使免疫球蛋白進一步增濃。在一個具體實例中，藉由以適於使免疫球蛋白沉澱而至少一種污染物不沉澱之最終濃度及pH值向第一懸浮液之可溶部分中添加乙醇來使 免疫球蛋白增濃。在另一具體實例中，藉由以適於使至少一種污染物沉澱而免疫球蛋白不沉澱之最終濃度及pH值向第一懸浮液之可溶部分中添加乙醇來使免疫球蛋白增濃。

視情況對由初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟回收之物質進行另外的分部分離。在某些具體實例中，可使用本文中所描述之多種下游加工步驟中之一或多種使由初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟回收之免疫球蛋白組成物進一步增濃。在其他具體實例中，可經由使用一或多個其他沉澱步驟進一步加工由初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟回收之組成物。在某些具體實例中，可使用其他免疫球蛋白沉澱步驟濃縮免疫球蛋白組成物、製備用於儲存之免疫球蛋白及/或製備用於運輸之免疫球蛋白組成物。

在一個具體實例中，本發明提供一種自科恩池製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，使免疫球蛋白與α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)一起自科恩池共沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱懸浮以形成第一懸浮液；自懸浮液移除A1PI；在第二個沉澱步驟中使免疫球蛋白自第一懸浮液沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，使自第二沉澱物回收之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使自第一懸浮液移除之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個例示性具體實例中，第二個沉澱步驟係藉由在介於6.5與7.5之間之pH值下將乙醇混合至第二懸浮液之可溶部分(例如在過濾或離心後形成之懸浮液之濾液或上清液)中達到22%至28%(v/v)之最終濃 度來進行。在一個具體實例中，混合乙醇達到25±3%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇達到25±2%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇達到25±1%(v/v)之最終濃度。在另一具體實例中，混合乙醇達到25%(v/v)之最終濃度。類似地，在一個具體實例中，第二個沉澱步驟係在pH 7.0±0.5下進行。在另一具體實例中，第二個沉澱步驟係在pH 7.0±0.4下進行。在另一具體實例中，第二個沉澱步驟係在pH 7.0±0.3下進行。在另一具體實例中，第二個沉澱步驟係在pH 7.0±0.2下進行。在另一具體實例中，第二個沉澱步驟係在pH 7.0±0.1下進行。在另一具體實例中，第二個沉澱步驟係在pH 7.0下進行。在一個特定具體實例中，第二個沉澱步驟係在pH 7.0±0.3下使用25±3%(v/v)之最終乙醇濃度進行。

在一個較佳具體實例中，在進行第二個沉澱步驟之前用清潔劑處理第一懸浮液或其可溶部分。在一個具體實例中，在進行第二個沉澱步驟之前用檸檬酸鹽進一步處理第一懸浮液或其可溶部分。在一個特定具體實例中，向第一懸浮液或其可溶部分中添加聚山梨醇酯-80且將組成物保溫至少30分鐘。在另一特定具體實例中，向第一懸浮液或其可溶部分中進一步添加二水合檸檬酸鈉且將組成物再保溫至少30分鐘。在一個具體實例中，以約0.2%(w/v)之最終濃度添加聚山梨醇酯-80。在一個具體實例中，接著將二水合檸檬酸鈉以約8g/L之最終濃度混合至溶液中。在一個特定具體實例中，保溫係在連續攪拌下於約2℃至8℃之間的溫度下進行。

在一個特定具體實例中，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間之最終濃度來使99%至100%之IgG內含物自科恩池血漿沉澱，以形成第一沉澱物及第一懸浮液；分離第一沉澱物與第一懸浮液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；在第二個沉澱步驟中使免疫球蛋白自第一懸浮液沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之 第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第二沉澱物回收之IgG進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個特定具體實例中，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使99%至100%之IgG內含物自科恩池血漿沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；分離第一沉澱物與第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；在第二個沉澱步驟中，藉由在pH 7.0±0.3下將乙醇混合至第一懸浮液中達到25±3%(v/v)之最終濃度來使免疫球蛋白自第一懸浮液沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第二沉澱物回收之IgG進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個具體實例中，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；自懸浮液移除A1PI；回收第一懸浮液之可溶部分；在第二個沉澱步驟中使免疫球蛋白自第一懸浮液沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至 少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第二沉澱物回收之IgG進一步增濃。在一個具體實例中，使自第一懸浮液分離之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個特定具體實例中，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；自懸浮液移除A1PI；回收第一懸浮液之可溶部分；在第二個沉澱步驟中，藉由在pH 7.0±0.3下混合乙醇與第一懸浮液達到25±3%(v/v)之最終濃度來使免疫球蛋白自第一懸浮液沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第二沉澱物回收之IgG進一步增濃。在一個具體實例中，使自第一懸浮液分離之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在另一具體實例中，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到20%至30%之最 終濃度來使99%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；自懸浮液移除A1PI；回收第一懸浮液之可溶部分；在第二個沉澱步驟中使免疫球蛋白自第一懸浮液之可溶部分沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，其中科恩池中80%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第二沉澱物回收之IgG進一步增濃。在一個具體實例中，使自第一懸浮液分離之A1PI進一步增濃。在另一具體實例中，使第一上清液中存在之白蛋白進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在一個較佳具體實例中，科恩池中90%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在另一具體實例中，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到20%至30%之最終濃度來使99%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；自懸浮液移除A1PI；回收第一懸浮液之可溶部分；在第二個沉澱步驟中，藉由在pH 7.0±0.3下將乙醇混合至第一懸浮液之可溶部分達到25±3%(v/v)之最終濃度來使免疫球蛋白自第一懸浮液之可溶部分沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，其中科恩池中80%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池 達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第二沉澱物回收之IgG進一步增濃。在一個具體實例中，使自第一懸浮液分離之A1PI進一步增濃。在另一具體實例中，使第一上清液中存在之白蛋白進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在一個較佳具體實例中，科恩池中90%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；用細粉狀二氧化矽處理第一懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分，其中懸浮液之可溶部分含有免疫球蛋白且懸浮液之不可溶部分含有A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp；回收第一懸浮液之可溶部分；在第二個沉澱步驟中使免疫球蛋白自第一懸浮液之可溶部分沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第一沉澱物回收之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使自懸浮液移除之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第 一個沉澱步驟中沉澱。在一個特定具體實例中，藉由過濾來分離第一懸浮液之可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；用細粉狀二氧化矽處理第一懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分，其中懸浮液之可溶部分含有免疫球蛋白且懸浮液之不可溶部分含有A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp；回收第一懸浮液之可溶部分；在第二個沉澱步驟中，藉由在pH 7.0±0.3下將乙醇混合至第一懸浮液之可溶部分中達到25±3%(v/v)之最終濃度來使免疫球蛋白自第一懸浮液之可溶部分沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自第一沉澱物回收之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使自懸浮液移除之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在一個特定具體實例中，藉由過濾來分離第一懸浮液之可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0 至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到20%至30%之最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；用細粉狀二氧化矽處理第一懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分，其中懸浮液之可溶部分含有免疫球蛋白且懸浮液之不可溶部分含有A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp；在第二個沉澱步驟中使免疫球蛋白自第一懸浮液之可溶部分沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，其中科恩池中80%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使懸浮液之可溶部分中存在之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之A1PI進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之纖維蛋白原進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之因子H進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之IaIp進一步增濃。在另一具體實例中，使在第一上清液中發現之白蛋白進一步增濃。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個特定具體實例中，藉由過濾來分離第一懸浮液之可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到20%至30%之最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液； 使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；用細粉狀二氧化矽處理第一懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分，其中懸浮液之可溶部分含有免疫球蛋白且懸浮液之不可溶部分含有A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp；在第二個沉澱步驟中，藉由在pH 7.0±0.3下將乙醇混合至第一懸浮液之可溶部分中達到25±3%(v/v)之最終濃度來使免疫球蛋白自第一懸浮液之可溶部分沉澱，以形成包含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；及自第二沉澱物回收免疫球蛋白，其中科恩池中80%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使懸浮液之可溶部分中存在之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之A1PI進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之纖維蛋白原進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之因子H進一步增濃。在另一具體實例中，使懸浮液之不可溶部分中存在之IaIp進一步增濃。在另一具體實例中，使在第一上清液中發現之白蛋白進一步增濃。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在某些具體實例中，第一個沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個特定具體實例中，藉由過濾來分離第一懸浮液之可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個具體實例中，免疫球蛋白係藉由用冷的提取緩衝液使沉澱物懸浮而自第二沉澱物回收。舉例而言，以1份沉澱物：2至15份注射用水(WFI)或低電導率緩衝液之比率使第二沉澱物懸浮。在一個較佳具體實例中，以1份沉澱物：4至5份(較佳3.5份)WFI之比率使第二沉澱物懸 浮。在一個具體實例中，懸浮步驟係在0℃與8℃之間的溫度下進行。在一個具體實例中，將溶液之最終pH值調節到4.5至5.6，較佳調節至5.2±0.2。在一個具體實例中，此pH值調節係用乙酸進行。在一個具體實例中，懸浮液之電導率增加至介於2.5mS/cm與6.0mS/cm之間以提高免疫球蛋白之溶解度。在一個具體實例中，藉由添加氯化鈉來提高電導率。

適於提取第二沉澱物之溶液包括WFI及低電導率緩衝液。在一個具體實例中，低電導率緩衝液之電導率小於約10mS/cm。在其他具體實例中，低電導率緩衝液之電導率小於約9、8、7、6、5、4、3、2或1mS/cm。在一個較佳具體實例中，低電導率緩衝液之電導率小於約6mS/cm。在另一較佳具體實例中，低電導率緩衝液之電導率小於約4mS/cm。在另一較佳具體實例中，低電導率緩衝液之電導率小於約2mS/cm。

在一個具體實例中，使懸浮液中含有免疫球蛋白之可溶部分與不可溶部分分離。在一個具體實例中，此係藉由用標稱孔徑為0.1μm至0.4μm之深層過濾器(depth filter)過濾懸浮液來進行。在一個具體實例中，深層過濾器之標稱孔徑為0.2μm(例如Cuno VR06過濾器或等效物)。在一個具體實例中，在過濾後用WFI或合適緩衝液洗滌過濾器以再回收免疫球蛋白且將後洗滌物質(post-wash)添加至濾液中。在一個較佳具體實例中，過濾器之後洗滌係使用電導率介於約2.5mS/cm與約6.0mS/cm之間的氯化鈉溶液進行。在另一具體實例中，對第二懸浮液進行離心以回收可溶部分。

B. 下游加工

可根據此項技術中熟知的方法將在使用使免疫球蛋白及α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)而非白蛋白沉澱之初始沉澱步驟進行分部分離後獲得之免疫球蛋白部分進一步增濃，包括(但不限於)：層析(例如陰離子交換層析、陽離子交換層析、疏水性相互作用層析(HIC)、羥基磷灰石層析(HAP)、蛋白質A親和層析、免疫親和層析、尺寸排阻層析等)；過濾 (例如超濾及/或滲濾)；及一或多種病毒減少步驟(例如奈米過濾、溶劑及清潔劑處理、UV照射、熱處理、低pH值保溫等)。

在一個具體實例中，本發明提供一種由科恩池製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，其包含初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟及至少一個下游加工步驟(例如層析)。在某些具體實例中，該方法在該至少一個下游加工步驟之前另外包含第二個沉澱步驟(例如PptG沉澱步驟)。第二次沉澱係視情況選用的，因為初始低pH值、高濃度醇沉澱物之懸浮液可直接用於下游純化。

在一個具體實例中，藉由進行至少一個層析步驟來將使用初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟製備之血漿源性組成物中所存在之免疫球蛋白進一步增濃。在一個具體實例中，層析步驟係選自陰離子交換層析、陽離子交換層析、疏水性相互作用層析(HIC)、羥基磷灰石層析(HAP)、蛋白質A親和層析、免疫親和層析及尺寸排阻層析。在一個特定具體實例中，藉由進行陰離子交換層析來使免疫球蛋白增濃。在另一具體實例中，藉由進行陽離子交換層析來使免疫球蛋白進一步增濃。在一個特定具體實例中，藉由進行陽離子交換層析及陰離子交換層析來使免疫球蛋白進一步增濃。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；用細粉狀二氧化矽處理第一懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分，其中懸浮液之可溶部分含有免疫球蛋白且懸浮液之不可溶部分含有A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp；使免疫球蛋白與陽離子交換樹脂結合；自陽離子交換 樹脂洗脫免疫球蛋白以形成陽離子交換洗脫液；使陽離子交換洗脫液與陰離子交換樹脂接觸；及回收未結合於樹脂之免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自陰離子交換層析步驟回收之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使自懸浮液移除之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在另一具體實例中，科恩池中80%至100%，較佳90%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中。在一個特定具體實例中，藉由過濾來分離第一懸浮液之可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，該方法進一步包含至少一個病毒減少/失活步驟。在一個較佳具體實例中，該方法進一步包含至少兩個病毒減少/失活步驟。在一個更佳之具體實例中，該方法進一步包含至少三個病毒減少/失活步驟。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到介於20%與30%之間的最終濃度來使95%至100%之IgG及A1PI內含物自科恩池沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；用細粉狀二氧化矽處理第一懸浮液；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分，其中懸浮液之可溶部分含有免疫球蛋白且懸浮液之不可溶部分含有A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp；回收第一懸浮液之可溶部分；在第二個沉澱步驟中，藉由在pH 7.0±0.3下將乙醇混合至第一懸浮液之可溶部分中達到25±3%(v/v)之最終濃度來使免疫球蛋白自第一懸浮液之可溶部分沉澱，以形成包 含免疫球蛋白之第二沉澱物及包含至少一種污染物之第二上清液；自第二沉澱物回收免疫球蛋白；使免疫球蛋白與陽離子交換樹脂結合；自陽離子交換樹脂洗脫免疫球蛋白以形成陽離子交換洗脫液；使陽離子交換洗脫液與陰離子交換樹脂接觸；及回收未結合於樹脂之免疫球蛋白，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。在一個具體實例中，混合乙醇與科恩池達到25±3%(v/v)之最終濃度。在一個具體實例中，使自陰離子交換層析步驟回收之IgG進一步增濃。在另一具體實例中，使自懸浮液移除之A1PI進一步增濃。在某些具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個較佳具體實例中，科恩池中99%至100%之IgG內含物在第一個沉澱步驟中沉澱。在另一具體實例中，科恩池中80%至100%，較佳90%至100%之白蛋白內含物存在於第一上清液中。在一個特定具體實例中，藉由過濾來分離第一懸浮液之可溶部分與不可溶部分。在一個具體實例中，該方法進一步包含至少一個病毒減少/失活步驟。在一個較佳具體實例中，該方法進一步包含至少兩個病毒減少/失活步驟。在一個更佳之具體實例中，該方法進一步包含至少三個病毒減少/失活步驟。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在一個特定具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在低pH值、高濃度醇沉澱步驟中使免疫球蛋白及A1PI自科恩池沉澱；分離沉澱之免疫球蛋白與A1PI；藉由進行陽離子交換層析來使免疫球蛋白組成物增濃；及藉由進行陰離子交換層析來使免疫球蛋白組成物進一步增濃。在一個具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個具體實例中，該方法進一步包含至少一個病毒減少/失活步驟。在一個較佳具體實例中，該方 法進一步包含至少兩個病毒減少/失活步驟。在一個更佳之具體實例中，該方法進一步包含至少三個病毒減少/失活步驟。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在另一個特定具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在低pH值、高濃度醇沉澱步驟中使免疫球蛋白及A1PI自科恩池沉澱；分離沉澱之免疫球蛋白與A1PI；在第二個沉澱步驟中使分離之免疫球蛋白沉澱；藉由進行陽離子交換層析來使免疫球蛋白組成物增濃；及藉由進行陰離子交換層析來使免疫球蛋白組成物進一步增濃。在一個具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個具體實例中，該方法進一步包含至少一個病毒減少/失活步驟。在一個較佳具體實例中，該方法進一步包含至少兩個病毒減少/失活步驟。在一個更佳之具體實例中，該方法進一步包含至少三個病毒減少/失活步驟。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

在另一個特定具體實例中，本發明提供一種製備增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：在低pH值、高濃度醇沉澱步驟中使免疫球蛋白及A1PI自科恩池沉澱；分離沉澱之免疫球蛋白與A1PI；在第二個沉澱步驟中使分離之免疫球蛋白沉澱；用溶劑及清潔劑處理免疫球蛋白組成物以使病毒失活；藉由進行陽離子交換層析來使免疫球蛋白組成物增濃；藉由進行陰離子交換層析來使免疫球蛋白組成物進一步增濃；及對免疫球蛋白組成物進行奈米過濾以移除病毒。在一個具體實例中，低pH值、高濃度醇沉澱步驟中所用之最終乙醇濃度及pH值係選自如表1、表2、表3、表4、表5、表6及表7中所列之變化1至2166。在一個具體實例中，該方法進一步包含藉由超濾/滲濾將免疫球蛋白組成物濃縮至最終蛋白 質濃度為5g/L至25g/L。在一個特定具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物之最終濃度為5±1%(w/v)。在另一特定具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物之最終濃度為10±1%(w/v)。在另一特定具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物之最終濃度為15±1%(w/v)。在另一特定具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物之最終濃度為20±2%(w/v)。在另一特定具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物之最終濃度為25±1%(w/v)。在一個具體實例中，增濃之免疫球蛋白組成物為IgG組成物。

VII. 治療方法

在一個態樣中，本發明提供藉由投予治療有效劑量的根據本文中提供之方法製備之血漿源性蛋白質來治療有需要個體之與血液蛋白質缺乏或功能障礙有關之疾病或病症的方法。在某些具體實例中，該組成物包含血漿源性蛋白質，該血漿源性蛋白質係選自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間-α-胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。

在一個態樣中，本發明提供根據本文中提供之方法製備之血漿源性蛋白質組成物之用途，其係用於製造用以治療與血液蛋白質缺乏或功能障礙有關之病狀的藥劑。在某些具體實例中，血漿源性蛋白質係選自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間-α-胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。

在一個具體實例中，血漿源性蛋白質組成物係由包含以下步驟之方法製備：在第一個沉澱步驟中使免疫球蛋白與α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)一起自科恩池共沉澱以形成第一沉澱物及第一上清液；使第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；使第一懸浮液中之免疫球蛋白溶解以形成懸浮液中包含免疫球蛋白之可溶部分及懸浮液中包含A1PI、纖維蛋白原、因子H及IaIp之不可溶部分；及分離懸浮液之可溶部分與懸浮液之不可溶部分。 在某些具體實例中，該組成物包含血漿源性蛋白質，該血漿源性蛋白質係選自免疫球蛋白(Ig)、白蛋白、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)、丁醯膽鹼酯酶、因子H、補體系統之蛋白質及間-α-胰蛋白酶抑制劑(IαI)蛋白質。

VIII. 實施例

實施例1-NG2 C91

工業上藉由經一系列沉澱反應分部分離血漿來製造免疫球蛋白G(IgG)組成物。在一種常用方法中，在第一個醇沉澱步驟中使雜質自含有免疫球蛋白之去低溫沉澱物血漿沉澱析出。接著使IgG免疫球蛋白自所得上清液沉澱且隨後進一步增濃。為提高在醇分部分離期間自人類血漿回收之IgG之產率，在IgG沉澱反應中測試5.5至7.0之pH值及20%至25%之乙醇濃度。

簡言之，I部分上清液(工業上用於製造血漿源性型免疫球蛋白G(IgG)、α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)及白蛋白產品之中間物)係藉由在pH 7.2±0.2下將乙醇以8%(v/v)之最終濃度混合至去低溫沉澱物血漿中，在0℃下保溫混合物且分離所形成之沉澱(I部分)與上清液(I部分上清液)來形成。接著將所得I部分上清液等分為600g樣品。將個別樣品之pH值調節到5.5至7.0且混合乙醇達到20%至25%之最終濃度，如表9中所示。

如表9中所報導，由於不完全沉澱，與用於製備傳統科恩II+III部分沉澱物(25%乙醇；pH 6.8)及經改質之II+III部分沉澱物(用於製造GAMMAGARD LIQUID^®(Baxter International；Deerfield,IL))類似之條件引起上清液中總IgG之損失達2.9%及6.7%。然而，已發現藉由將反應之pH值降低至6.0或6.0以下且使用至少22.5%之最終乙醇濃度，顯著降低IgG損失。舉例而言，在pH 5.5下使用22.5%醇引起的上清液中總IgG損失僅為0.4%。類似地，在pH 6.0或pH 5.5下使用25%醇引起的上清液中之總IgG損失僅為0.5%及0.1%。如表10中所報導，此等同於與傳統II+III部分沉澱 物及經改質之II+III部分沉澱物相比在沉澱物中每公升血漿分別超過300毫克IgG及125毫克IgG之增加。

實施例2-NG2 C96

對在存在與不存在初始8%乙醇沉澱之情況下進行之IgG純化方案採取實驗性比較以確定使用低pH值(5.5)、高濃度乙醇(25%)沉澱(如實施例1中概述)是否能進一步增加IgG之回收率。

簡言之，在pH 7.4及0℃下，在存在(NG2C96/1)或不存在(NG2C96/2)使用8%(v/v)最終濃度之乙醇進行之初始沉澱步驟(部分I)的情況下加工100kg去低溫沉澱物血漿。將去低溫沉澱物血漿(NG2C96/1)或I部分上清液(NG2C96/2)之pH值調節至pH 5.5±0.1且混合乙醇達到25%(v/v)之最終濃度。接著混合物在-5±2℃下保溫5小時以使蛋白質沉澱。藉由離心來分離所得沉澱物(沉澱物(I)+II+III)與上清液(上清液(I)+II+III)。歸因於沉澱反應之規模，每次反應需要進行兩次離心。將由每次離心得到的沉澱物分開加工。

將沉澱物以每15份緩衝液1份沉澱物之比率懸浮於含有5mM磷酸二氫鈉、5mM乙酸鈉及600mg/L冰乙酸之緩衝液中，將pH值調節至4.8±0.2且在4℃至8℃下攪拌2小時以提取蛋白質。在提取物保溫後，將每公斤沉澱物(I)+II+III達40公克之煙霧狀二氧化矽(SiO₂)混合至反應物中且在4℃至8℃下攪拌50分鐘。接著混合每公斤沉澱物(I)+II+III達400公克之Cellpure助濾劑且反應物經Cuno 50SA膜過濾以移除不可溶物質，由此形成(I)+II+III濾液及濾餅。濾餅用含有5mM磷酸二氫鈉、5mM乙酸鈉及150mg/L冰乙酸之緩衝液洗滌，其濾液添加至(I)+II+III濾液中。

將聚山梨醇酯80添加至濾液中達到0.2%(w/w)之最終濃度且將溶液保溫30分鐘。接著向溶液中添加二水合檸檬酸鈉達到0.8%(w/w)之最終濃度且再將溶液保溫30分鐘。在第二次保溫後，使用氫氧化鈉將溶液之pH值調節至7.0且混合乙醇達到25%之最終濃度。將溫度降低至介於0℃與-10℃之間以進行沉澱。藉由離心來分離沉澱物(PptG)與上清液(PptG 上清液)。

測定純化反應各子步驟中之IgG、IgA及IgM免疫球蛋白含量。如表11中所示，移除初始I部分沉澱步驟使最終組成物中的IgG產率顯著較大(比較PptG溶解之NG2C96/2(無I部分沉澱反應)與NG2C96/1(具有I部分沉澱反應))。類似地，測定在無初始I部分沉澱步驟下形成之經溶解PptG部分中之IgA(表12)及IgM(表13)含量。

應注意，部分地使用I部分沉澱步驟以自含有免疫球蛋白之組成物中移除纖維蛋白原。儘管在無初始I部分沉澱步驟下形成之經溶解PptG部分中之最終纖維蛋白原含量為在存在初始I部分沉澱步驟下形成之PptG部分中之含量之大約6倍，但分部分離方案移除了去低溫沉澱物血漿起始物質中超過99%的纖維蛋白原內含物(表14)。

表14. 在存在及不存在初始8%乙醇I部分沉澱步驟下使用低pH值、高濃度醇沉澱反應進行血漿分部分離期間所形成之各部分中之纖維蛋白原 含量，表示為g/L起始血漿。

實施例3-NG2 C99

為進一步研究使用低pH值、高濃度醇沉澱替代傳統上游科恩-昂科利及祁斯特勒-尼斯克曼醇分部分離步驟(亦即，科恩I部分及II部分；科恩I部分及II+III部分；或祁斯特勒-尼斯克曼8%至10%乙醇、沉澱物A及沉澱物B)，合併NG2C96/2與NG2C96/2B PptG沉澱物且使IgG免疫球蛋白進一步增濃。

簡言之，使合併之NG2C96/2及NG2C96/2B PptG沉澱物懸浮於注射用水(WFI)中，該注射用水已用乙酸調節至pH 4.75±0.75且用氯化鈉將電導率調節至4.5±1.5mS/cm。添加助濾劑且懸浮液經Cuno VR06膜過濾以形成澄清PptG濾液(VR06)。接著根據標準程序用溶劑及清潔劑(S/D處理)處理澄清濾液。

將經S/D處理之濾液裝載至用含有10 mM乙酸鈉之緩衝液(pH 5.0)平衡之CM瓊脂糖凝膠管柱上且收集流過物(CM D/N)。接著用含有10mM乙酸鈉之緩衝液(pH 5.5)洗滌管柱且收集洗滌液(CM W)。使 用含有55mM磷酸二氫鈉及10 mM TRIS之洗脫緩衝液(pH 8.5)自管柱洗脫出免疫球蛋白。分三個部分收集洗脫液：部分1(CM E-VL)，包括第一份洗脫液(OD₂₈₀小於100mAU)；部分2(CM E)，包括洗脫峰(在洗脫峰前緣上OD₂₈₀大於100mAU且在洗脫峰後沿上OD₂₈₀大於400mAU)；及部分3(CM E-NL)，包括在洗脫峰滯後側上之洗脫液部分(OD₂₈₀小於400mAU)。

分別使用冰乙酸及注射用水(WFI)將部分2洗脫液之pH值及電導率調節至6.4及2.3mS/cm。接著將部分2洗脫液以100毫克蛋白質/毫升樹脂之裝載濃度裝載至用含有15mM磷酸二氫鈉之緩衝液(pH 6.4)平衡之ANX瓊脂糖凝膠快速流動(Sepharose fast flow)陰離子交換樹脂上。收集含有大部分IgG之陰離子交換流過物(ANXD/N)。使用含有2M氯化鈉之溶液自管柱洗脫出結合於陰離子交換樹脂之蛋白質(ANX 2M NaCl)。

向陰離子交換流過物部分中添加甘胺酸且使用Pellicon^® 2Mini(Millipore)針對含有0.25M甘胺酸之溶液(pH 5.2)對樣品進行超濾及滲濾(UF/DF)直至蛋白質濃度達到5%。將免疫球蛋白溶液進一步濃縮至10%之最終蛋白質濃度且將pH值調節至4.5(滲濾濃縮物(dia-concentrate))。接著使用Millipak 20(Millipore)對10%免疫球蛋白溶液進行無菌過濾以形成最終免疫球蛋白組成物(最終包裝物(container))。

測定純化反應各子步驟之生物化學特徵(表15及表16)。如資料中所示，最終組成物僅含有在醫藥學投藥可接受之參數範圍內的少量非IgG蛋白質。

實施例4-NG2 C100

為驗證在無初始低濃度醇沉澱步驟下使用低pH值、高濃度醇沉澱來移除纖維蛋白原之情況，如實施例2及3中關於樣品NG2C96/2所描述，對200kg去低溫沉澱物血漿進行分部分離及增濃，但在該製程中存在幾處變化。首先，低pH值、高濃度醇沉澱步驟(I-IV1沉澱)係使用25%乙醇在pH 5.1而非pH 5.5下進行。其次，懸浮之I-IV1沉澱物係用每公斤I-IV1沉澱物33公克煙霧狀二氧化矽(SiO₂)而非每公斤沉澱物40公克SiO₂處理。再次，CM陽離子交換洗脫液係以每毫升ANX樹脂150毫克蛋白質而非每毫升ANX樹脂100毫克蛋白質之濃度裝載至ANX陰離子交換樹脂上。最後，在超濾/滲濾之前使經Cuno VR06過濾之陰離子交換流過物通過PLANOVA^® 35N(Asahi Kasei Medical有限公司；Tokyo,Japan)以進行奈米過濾步驟。

測定純化之各步驟中之IgG含量且結果提供於表17中。與GAMMAGARD LIQUID^®製造製程之平均IgG產率(每公升血漿源3.7公克IgG)相比，此實施例中所用純化方法產生顯著較高的IgG產率，即每公升血漿源4.4公克IgG。此表示IgG產率提高約20%。最終IgG組成物之生物 化學特性報導於表10中。如該表中所示，最終IgG組成物之純度超過99%且IgG單體/二聚體含量超過99.8%。最終包裝物僅含微量雜質，其含量在管理標準之範圍內。

實施例5-P02910NG2

為比較在每毫升ANX樹脂100公克蛋白質與每毫升ANX樹脂150公克蛋白質之裝載濃度下CM陽離子交換洗脫液通過ANX陰離子交換管柱之作用，如實施例2及3中關於樣品NG2C96/2所描述，將200L去低溫沉澱物血漿經由初始低pH值(5.4)、高濃度醇(25%)沉澱步驟分部分離且加工以形成PptG沉澱物。測定所形成之上游部分中之IgG、IgA及 IgM含量且分別報導於表19、表20及表21中。

將所得PptG沉澱物分為兩份1.8kg之樣品，如實施例2及3中關於樣品NG2C96/2所描述使其增濃為最終包裝物，但使一份樣品以每毫升ANX樹脂100毫克蛋白質之裝載濃度通過ANX陰離子交換樹脂(P03010NG2)且另一份樣品以每毫升ANX樹脂150毫克蛋白質之裝載濃度通過ANX陰離子交換樹脂(P03110NG2)。

測定純化之各下游增濃步驟中之IgG含量且結果提供於表22及表23中。與GAMMAGARD LIQUID^®製造製程之平均IgG產率(每公升血漿源3.7公克IgG)相比，此實施例中所用純化方法產生顯著較高的IgG產率，即每公升血漿源4.3公克IgG。此表示IgG產率提高16%。最終IgG組成物之生物化學特性報導於表16及表17中。如該等表中所示，最終IgG組成物之純度超過99%且IgG單體/二聚體含量超過99.8%。最終包裝物僅含微量雜質，其含量在管理標準之範圍內。

表22. 使用初始低pH值(5.4)、高濃度醇(25%乙醇)沉澱反應及每毫升ANX樹脂100毫克之ANX陰離子交換裝載濃度(P03010NG2)進行血 漿分部分離期間所形成之下游部分中之IgG含量。

實施例6-NG2C107B

研究自用於製造IgG免疫球蛋白之低pH值、高濃度醇沉澱物之不可溶部分提取α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)之可行性。簡言之，首先在7±2℃下，將在提取之I-IV-1部分沉澱物之過濾期間所形成的不可溶濾餅之兩份500kg樣品(#1及#3)懸浮於2.8份水(w/w)中且將樣品之pH值調節至5.5±0.1。懸浮液經CUNO 10CP膜過濾，形成濾液(濾液1)及第二濾餅。接著將第二濾餅懸浮於5份水(w/w)中，將懸浮液之溫度調節至17±2℃，將樣品之pH值調節至8.8±0.2，且接著在保持溫度及pH值之同時，攪拌樣品8小時以自不可溶物質中提取A1PI。

在保溫後，向樣品中添加每公斤懸浮液10mmol Tris及150mmol氯化鈉且將pH值調節至8.0±0.1。向樣品中添加每公斤懸浮液176g PEG 3350，在17±2℃下保溫1小時。接著過濾懸浮液以自含有提取之A1PI的上清液(濾液2)中移除不可溶物質。

接著藉由添加每公斤濾液0.35g氯化鋅(2.5mM ZnCl；樣品#1)或每公斤濾液0.54公克氯化鋅(4.0mM ZnCl；樣品#3)，將pH值調節至7.5±0.2且樣品在7±2℃下保溫3小時，來使粗A1PI自第二濾液沉澱。藉由離心來回收氯化鋅沉澱物(ZnCl₂離心物)。用50mM乙二胺四乙酸鈉自氯化鋅沉澱物中提取A1PI(Zn-EDTA濃縮物)。

測定在增濃製程各步驟中之A1PI(a1A)含量及活性且提供於表26中。在EDTA提取步驟中回收到約400毫克活性A1PI/公升血漿源。應注意，當在38±2℃及約pH 9.2下提取A1PI時，回收到約600毫克活性A1PI/公升血漿源。

實施例7-P03410NG2A及P03410NG2B

研究pH對自去低溫沉澱物血漿之低pH值、高濃度醇沉澱來回收IgG之影響。簡言之，藉由使用25%乙醇在pH 5.4(樣品A；P03410NG2A)或pH 5.6(樣品B；P03410NG2B)下沉澱來分部分離100L去低溫沉澱物血漿，該血漿已藉由吸附進行處理，移除了因子IX、因子VII及抗凝血酶III(ATIII)。接著如實施例2中所描述，但將每公斤I-IV-1沉澱物50公克SiO₂而非每公斤沉澱物40公克SiO₂與I-IV-1沉澱物懸浮液混合，來對樣品進行加工以形成沉澱G沉澱物(PptG沉澱物)及上清液(PptG上清液)。

測定所形成之部分中之IgG、IgA及IgM含量且分別報導於表27、表28及表29中。應注意，當在pH 5.4(93.8%)或pH 5.6(88.8%)下進行初始沉澱時，在I-IV-1部分之CUNO濾液中回收到血漿源中約90%之IgG內含物。類似地，在I-IV-1部分之懸浮液中回收到血漿源中幾乎所有的IgA及IgM內含物。

為進一步特性化分部分離方案，測定各上游部分中纖維蛋白原(表30)、A1PI(表31)、α-2-巨球蛋白(表32)、白蛋白(表33)、運鐵蛋白(表34)及C3(表35)之含量。

表32. 使用低pH值(A=5.4；B=5.6)、高濃度醇(25%)初始沉澱步驟進行血漿分部分離期間所形成之上游部分中之α-2-巨球蛋白含量。

實施例8-P03510NG2及P03610NG2

進一步研究在使用初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟形成之PptG沉澱物之下游加工期間使CM陽離子交換洗脫液以每毫升ANX樹脂100公克蛋白質及每毫升ANX樹脂150公克蛋白質之裝載濃度通過ANX陰離子交換管柱之作用。簡言之，如實施例4中所描述對2kg P03410NG2A PptG沉澱物進行加工，其中第一樣品(P03510NG2)以每毫升ANX樹脂157毫克蛋白質之濃度裝載至ANX陰離子交換樹脂上且第二樣品(P03610NG2)以每毫升ANX樹脂106毫克蛋白質之濃度裝載至ANX陰離子交換樹脂上。

測定純化之各下游步驟中之IgG含量且結果提供於表22及表23中。與GAMMAGARD LIQUID^®製造製程之平均IgG產率(每公升血漿源3.7公克IgG)相比，此實施例中所用之純化方法產生顯著較高的產率，即每公升血漿源4.72公克IgG及4.67公克IgG。此表示IgG產率提高超過25%。最終IgG組成物之生物化學特性報導於表38及表39中。如該等表中所示，最終IgG組成物之純度超過99%且IgG單體/二聚體含量超過99.8%。最終包裝物僅含微量雜質，其含量在管理標準之範圍內。

表36. 使用初始低pH值(5.4)、高濃度醇(25%)初始沉澱步驟及每毫升ANX樹脂157毫克之陰離子交換裝載濃度(P03510NG2)進行血漿分部分離期間所形成之上游部分中之IgG含量。

表39. 使用初始低pH值(5.4)、高濃度醇(25%)初始沉澱步驟及每毫升ANX樹脂106毫克之陰離子交換裝載濃度(P03610NG2)自去低溫沉澱物血漿增濃之最終IgG組成物之生物化學特性化。

實施例9-分部分離產物之其他特性

將使用包括初始低pH值、高濃度醇沉澱之純化方法達到之免疫球蛋白G產率及純度與使用傳統科恩I沉澱及II+III沉澱中間物達到之產率及純度相比較。

將使用初始低pH值、高濃度醇沉澱進行之三次大規模IgG純化(批料3010，如實施例5中所描述(「P03010NG2」)；批料3610，如實施例8中所描述(「P03610NG2」)；及第三批料1111，以與批料3010及3610類似地方式製備)之產率及純度與在2010年於單一製造廠製備之GAMMAGARD LIQUID(10%免疫球蛋白輸注物(人類)，Baxter International)之平均產率相比較。GAMMAGARD LIQUID之純化製程與用於製備批料3010、3610及1111之製程實質上類似，不同之處在於GAMMAGARD LIQUID製程係經由科恩I部分及科恩II+III部分中間物而非初始低pH值、高濃度醇沉澱進行。在製備實驗批料期間形成之沉澱物G產品之特性化及GAMMAGARD LIQUID之平均值展示於表40中。

表40. 在經由初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟製備實驗性IgG批料3010、3610及1111期間所形成之沉澱物G(PptG)中間物之生物化學特性化，及在2010年於單一製造廠經由科恩I及II+III部分沉澱步驟製備之GAMMAGARD LIQUID製劑之平均值。

如表40中所示，與經由科恩I及II+III部分沉澱步驟進行之GAMMAGARD LIQUID純化方法相比，使用初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟引起沉澱物G中間步驟之IgG回收率顯著增加(初始高濃度醇、低pH值沉澱步驟之IgG回收率88.9%至96.6%對科恩I及II+III部分沉澱步驟之IgG回收率82.9%)。

如由較高之補體組分3(C3)及纖維蛋白原含量所證明，實驗批料3010、3610及1111中所形成之IgG沉澱物G中間物之純度略低於平均GAMMAGARD LIQUID沉澱物G中間物之純度，但該等中間物中之纖維蛋白原含量仍在關於GAMMAGARD LIQUID製造所觀測之值的範圍內。然而，當如上文所描述進一步加工該等實驗批料時，最終IgG產物滿足所有所測試之製造規格，如表41中所示。

實施例10-白蛋白組成物之特性化

為進一步驗證本文中所描述之新穎免疫球蛋白G製造製程(例如經由初始低pH值、高濃度醇沉澱步驟進行之製造製程)可支持血漿蛋白質副產物之製造，自低pH值、高濃度醇上清液中純化白蛋白。

用於自科恩IV-1及IV-4部分上清液中純化白蛋白之方法在此項技術中為熟知的。典型地，在經由中間物醇沉澱步驟(諸如科恩I部分及科恩II+III部分沉澱)進行之製程中形成科恩IV-1及IV-4部分上清液。在本實施例中，根據標準方法製備白蛋白，但使用來自初始低pH值、高濃度醇沉澱之上清液替代IV-1部分上清液。如表42中所示，自低pH值、高濃度醇上清液進行純化產生了較高的白蛋白產率(每公升血漿18.92公克)，其滿足所有所測試之品質控制要求。

應理解，本文中所描述之實施例及具體實例僅用於說明目的 且熟習此項技術者將據其提出各種改變或變化，且該等改變或變化將包括在本申請案之精神及範圍以及隨附申請專利範圍之範疇內。本文中引用之所有出版物、專利及專利申請案均以全文引用的方式併入本文中以用於所有目的。

Claims (33)

1. 一種用於由科恩池(Cohn pool)製造增濃之免疫球蛋白組成物之方法，該方法包含以下步驟：(a)在第一個沉澱步驟中，藉由在pH 5.0至pH 6.0下向科恩池中添加乙醇達到20%至30%(v/v)之最終濃度來使免疫球蛋白與α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)一起自該科恩池共沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液，其中該第一沉澱物含有該科恩池中的免疫球蛋白的至少90%以及該科恩池中的A1PI的至少80%；(b)使該第一沉澱物中之免疫球蛋白溶解以形成第一懸浮液，該第一懸浮液具有包含免疫球蛋白之可溶部分及包含A1PI之不可溶部分；(c)分離該第一懸浮液之可溶部分與該第一懸浮液之不可溶部分；及(d)回收該第一懸浮液之可溶部分，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物，其中在步驟(a)之前未進行醇沉澱。
2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中：(a)該乙醇之最終濃度為25±4%；(b)該乙醇之最終濃度為25±3%；(c)該乙醇之最終濃度為25±2%；或(d)該乙醇之最終濃度為25±1%。
3. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該乙醇之最終濃度為25%。
4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中：(a)該pH值為5.5±0.4；(b)該pH值為5.5±0.3；(c)該pH值為5.5±0.2；或(d)該pH值為5.5±0.1。
5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中該pH值為5.5。
6. 如申請專利範圍第2項之方法，其中：(a)該pH值為5.5±0.4；(b)該pH值為5.5±0.3；(c)該pH值為5.5±0.2；或(d)該pH值為5.5±0.1。
7. 如申請專利範圍第2項之方法，其中該pH值為5.5。
8. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中在該第一個沉澱步驟期間保持該pH值。
9. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該第一個沉澱步驟係在-5℃至-9℃之溫度下進行。
10. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該第一懸浮液之pH值為4.7至5.1。
11. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該第一懸浮液之電導率為0.5mS/cm至2mS/cm。
12. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該第一沉澱物係懸浮於包含乙酸鹽及/或磷酸鹽之緩衝液中。
13. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該分離該第一懸浮液之可溶部分與該第一懸浮液之不可溶部分的步驟包含：(i)混合細粉狀二氧化矽(SiO₂)與該第一懸浮液；及(ii)將該SiO₂自該懸浮液分離。
14. 如申請專利範圍第13項之方法，其中該細粉狀二氧化矽(SiO₂)之平均表面積為350m²/g至410m²/g。
15. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中以每公斤第一沉澱物15公克至每公斤第一沉澱物80公克之最終濃度向該第一懸浮液中添加該細粉狀二氧化矽(SiO₂)。
16. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該方法包含以下步驟：(a)在第一個沉澱步驟中，在介於5.3與5.7之間之pH值及介於-6℃與-8℃之間的溫度下用介於24%與26%之間之醇使免疫球蛋白自科恩池沉澱，以形成第一沉澱物及第一上清液；(b)使該第一沉澱物懸浮以形成第一懸浮液；(c)用細粉狀二氧化矽(SiO₂)處理該第一懸浮液；(d)分離該第一懸浮液之可溶部分與該第一懸浮液之不可溶部分；及(e)回收該第一懸浮液之可溶部分，從而形成增濃之免疫球蛋白組成物。
17. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該增濃之免疫球蛋白組成物含有存在於步驟(a)中所用的科恩池中之至少一種免疫球蛋白類別的免疫球蛋白含量之至少95%。
18. 如申請專利範圍第17項之方法，其中該免疫球蛋白類別為IgG。
19. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該方法進一步包含以下步驟(f)在第二個沉澱步驟中使免疫球蛋白自該第一懸浮液之可溶部分沉澱以獲得第二沉澱物及第二上清液；(g)使該第二沉澱物懸浮以形成第二懸浮液；及(h)回收該第二懸浮液之可溶部分，從而形成進一步增濃之免疫球蛋白組成物。
20. 如申請專利範圍第19項之方法，其中該第二個沉澱步驟為醇沉澱步驟，包含在介於6.5與7.5之間之pH值下向該第一懸浮液之可溶部分中添加乙醇達到介於22%與28%之間之乙醇最終濃度。
21. 如申請專利範圍第20項之方法，其中該第二個沉澱步驟係在介於-3℃與-10℃之間的溫度下進行。
22. 如申請專利範圍第21項之方法，其中該增濃之免疫球蛋白組成物含有存在於步驟(a)中所用之科恩池中的免疫球蛋白G含量之至少95%。
23. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該方法進一步包含陽離子交換層析增濃步驟。
24. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該方法進一步包含陰離子交換層析增濃步驟。
25. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該方法進一步包含病毒失活及/或移除步驟。
26. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中：(a)該方法產生每公升步驟(a)中所用科恩池至少4公克IgG；(b)該方法產生每公升步驟(a)中所用科恩池至少4.25公克IgG；或(c)該方法產生每公升步驟(a)中所用科恩池至少4.5公克IgG。
27. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中自該第一懸浮液之不可溶部分進一步純化α-1-抗胰蛋白酶(A1PI)。
28. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中自該第一懸浮液之不可溶部分進一步純化纖維蛋白原。
29. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中自該第一懸浮液之不可溶部分進一步純化因子H。
30. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中自該第一懸浮液之不可溶部分進一步純化間-α-胰蛋白酶抑制蛋白(I α Ip)。
31. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中自該第一上清液進一步純化白蛋白。
32. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，其中該科恩池為去低溫沉澱物血漿(cryo-poor plasma)。
33. 如申請專利範圍第1項至第7項中任一項之方法，，其中該第一沉澱物含有該科恩池中的免疫球蛋白的至少95%以及該科恩池中的A1PI的至少90%。