TWI616209B - 聚角蛋白微絲（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）基因表現促進劑 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種促進與皮膚之保濕功能之提高相關之新穎聚角蛋白微絲基因之表現的物質。本發明發現聚角蛋白微絲基因具有週期約為24小時之節律性而增減其之表現，於添加候補物質後，在表現成為最大之時篩選候補物質，而將山椒萃取物、3-(1'-哌啶)-丙酸、香葉油、柏木油、玫瑰油、格蓬油、胡椒油、羅勒油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、鄰甲胺基苯甲酸甲酯鑑定為聚角蛋白微絲基因表現促進劑。

Description

聚角蛋白微絲(Filaggrin)基因表現促進劑

本發明係關於一種化粧料及皮膚外用劑，更具體而言係關於一種與皮膚之保濕功能之提高相關之聚角蛋白微絲(Filaggrin)基因之表現促進劑。

皮膚之角質層係被覆生物體並保持水分或對異物之侵入進行防禦。角質層包含表皮角化細胞所產生之角蛋白(keratin)及聚角蛋白微絲(filaggrin)等蛋白質或脂質等各種物質。聚角蛋白微絲對於將角蛋白纖維收束為層狀而製作被稱為角蛋白圖案之結構發揮重要作用，隨著角化會自作為由聚角蛋白微絲基因(FLG)編碼之前驅物的聚絲蛋白原(profilaggrin)產生聚角蛋白微絲，而使角蛋白纖維凝集。進而，聚角蛋白微絲在角質上層分解，成為被稱為天然保濕因子之低分子肽或胺基酸，參與保濕或紫外線吸收。

如此，聚角蛋白微絲深度地參與皮膚之角質層之保濕或屏障功能，聚角蛋白微絲產生之降低與尋常性魚鱗癬、異位性皮膚炎、老人性乾皮症等乾燥性皮膚疾病之發病有關(非專利文獻1)。為了維持健康且美麗之肌膚狀態，需要適當地產生聚角蛋白微絲，以適當之週期持續進行角化。

於此種背景下，業界對促進聚角蛋白微絲合成之物質進行研究，作為迄今為止具有聚角蛋白微絲合成促進效果之物質，已知有野生麝香草萃取物、丁香萃取物、鼠尾草萃取物等植物萃取物等(專利 文獻1)。又，亦已知有某種細菌為了調節滲透壓所蓄積之依克多因(ectoine)會抑制由乾燥引起之聚角蛋白微絲之減少(專利文獻2)。

[先前技術文獻] [專利文獻]

專利文獻1：日本專利第4768238號公報

專利文獻2：日本專利第4540872號公報

[非專利文獻]

非專利文獻1：Morar N. et. al. Filaggrin mutations in children with severeatopic dermatitis. Journal of Investigative Dermatology, 127, 1667-1672, 2007

非專利文獻2：Akashi, M., et al. Noninvasive method for assessing the humancircadian clock using hair follicle cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (35), 15643-15648, 2010.

如上所述，消費者對於具有更高之聚角蛋白微絲合成促進效果之物質之要求增強，謀求開發出新穎之聚角蛋白微絲合成促進劑。因此，本發明之課題在於提供一種新穎之促進聚角蛋白微絲基因之表現之物質。

本發明者等人對聚角蛋白微絲基因之表現進行了努力研究，結果令人驚訝地首次發現聚角蛋白微絲基因具有週期約為24小時之節律性而增減其之表現。因此，如先前技術中所實施般，為了促進聚角蛋白微絲產生而維持健康之皮膚狀態，業界發現重要的不僅是單純地增加聚角蛋白微絲之產生或抑制由乾燥引起之聚角蛋白微絲產生之降低，考慮節律性而促進聚角蛋白微絲產生亦重要。因此，考慮節律 性，對於聚角蛋白微絲基因表現促進作用對候補物質進行篩選，結果發明出本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑。

作為具有聚角蛋白微絲基因表現促進效果之藥劑，本發明者等人篩選出山椒萃取物、3-(1'-哌啶)-丙酸、香葉(geranium)油、柏木(Cypress)油、玫瑰油、格蓬(galbanum)油、胡椒(Pepper)油、羅勒(basil)油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、及鄰甲胺基苯甲酸甲酯。

因此，本發明係關於一種聚角蛋白微絲基因表現促進劑，其含有選自由山椒萃取物、3-(1'-哌啶)-丙酸、香葉油、柏木油、玫瑰油、格蓬油、胡椒油、羅勒油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、及鄰甲胺基苯甲酸甲酯所組成之群中之1種以上。

於本發明之另一態樣中，本發明係關於一種促進聚角蛋白微絲基因之表現之方法，其包括：對需要促進聚角蛋白微絲基因之表現之對象，投予選自由山椒萃取物、3-(1'-哌啶)-丙酸、香葉油、柏木油、玫瑰油、格蓬油、胡椒油、羅勒油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、及鄰甲胺基苯甲酸甲酯所組成之群中之1種以上之聚角蛋白微絲基因表現促進劑。

於本發明之另一態樣中，本發明亦關於一種選自由山椒萃取物、3-(1'-哌啶)-丙酸、香葉油、柏木油、玫瑰油、格蓬油、胡椒油、羅勒油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、及鄰甲胺基苯甲酸甲酯所組成之群中之1種以上之用途，其係用以製造聚角蛋白微絲基因之表現促進劑。

進而，本發明亦關於一種聚角蛋白微絲基因之表現促進方法或美容方法，其係基於聚角蛋白微絲基因具有週期約為24小時之節律性而增減其之表現的知識見解，於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律與藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基 因表現量之節律同步之時機投予聚角蛋白微絲基因表現促進劑。進而，本發明亦關於一種聚角蛋白微絲基因表現促進劑，其特徵在於：其係以於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律與藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基因表現量之節律同步之時機投予聚角蛋白微絲基因表現促進劑之方式使用；或者亦關於一種聚角蛋白微絲基因表現促進劑，其特徵在於：其係對於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律發生紊亂之對象，以於藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予而使聚角蛋白微絲基因表現量之節律恢復之時機投予該聚角蛋白微絲基因表現促進劑之方式使用。

本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑具有以下所列舉之效果中之至少1種以上之效果：聚角蛋白微絲基因表現之促進；皮膚屏障功能之亢進；及保濕。

圖1係表示於利用添加有皮質醇(cortisol)之培養基暫時培養之培養角化細胞中，聚角蛋白微絲基因表現係具有24小時之節律而增減的圖。

圖2係表示於利用添加有皮質醇之培養基暫時培養之培養角化細胞中，聚角蛋白微絲基因、及時鐘基因BMAL1與PER3之表現具有24小時之節律而增減的圖。

圖3係表示關於候補藥劑之聚角蛋白微絲基因表現促進作用之結果的圖。

圖4係表示關於使用3-(1'-哌啶)-丙酸、山椒萃取物、及其組合作為候補藥劑之情形時之聚角蛋白微絲基因表現促進作用之結果。

本發明係關於一種聚角蛋白微絲基因表現促進劑，其含有選自由山椒萃取物、3-(1'-哌啶)-丙酸、香葉油、柏木油、玫瑰油、格蓬油、胡椒油、羅勒油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、及鄰甲胺基苯甲酸甲酯所組成之群中之1種以上。作為聚角蛋白微絲基因表現促進劑，可單獨使用上述所列舉之物質，亦可組合使用。更佳為選擇山椒萃取物作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑。進而更佳為選擇山椒萃取物與3-(1'-哌啶)-丙酸之組合作為聚角蛋白微絲基因表現促進劑。

於另一態樣中，本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑亦可進而含有已知之其他具有聚角蛋白微絲基因表現促進效果之藥劑、例如野生麝香草萃取物、丁香萃取物、鼠尾草萃取物或依克多因。

本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑藉由促進聚角蛋白微絲基因之表現，而可促進聚角蛋白微絲之合成。若更詳細地加以記載，則藉由聚角蛋白微絲基因之表現，促進聚絲蛋白原之合成，聚絲蛋白原受到磷酸化，並且於角化時經過脫磷酸化及由胜肽精胺酸去亞胺酶(peptidylarginine deiminase)所引起之水解而合成聚角蛋白微絲。因此，亦存在將聚角蛋白微絲基因表現促進劑稱作聚絲蛋白原基因表現促進劑之情況，且亦可為經由促進聚角蛋白微絲基因表現而促進聚角蛋白微絲之合成的聚角蛋白微絲合成促進劑。

本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑可促進聚角蛋白微絲之合成，進而可使作為聚角蛋白微絲分解產生之天然保濕因子(NMF，Natural Moisturizing Factor)之主成分的胺基酸增加。因此，本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑可為天然保濕因子亢進劑或保濕劑，進而由於使天然保濕因子亢進，故而亦可為皮膚屏障功能亢進劑，從而調配於化粧料中。進而，藉由本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑 或聚角蛋白微絲基因表現促進方法，可治療乾燥肌膚、以及乾燥性之肌膚疾病、例如老人性乾皮症、異位性皮膚炎、尋常性魚鱗癬等皮膚疾病。

於本發明之一態樣中，本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑可藉由任意之途徑而投予，亦可藉由經口或非經口(例如經皮、經黏膜、皮下、靜脈內、腹腔內、經肺、肌肉內)中之任一方式投予。作為經口投予，可將聚角蛋白微絲基因促進劑製成錠劑、膠囊劑等劑型而投予，或亦可以飲料或補充品之方式投予。作為經皮投予，亦可藉由調配於化粧料或皮膚外用劑中並塗佈於皮膚上而投予。作為經肺投予，亦可藉由製成溶解有聚角蛋白微絲基因促進劑之溶液之噴霧、或使其氣化並吸入而投予，例如以芳香療法之方式投予。就促進表皮細胞中之聚角蛋白微絲基因表現之觀點而言，較佳為經皮投予聚角蛋白微絲基因表現促進劑。

本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑不僅可對需要促進聚角蛋白微絲基因之表現的對象、例如期待保濕或皮膚屏障功能之亢進之對象投予，亦可對聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律發生紊亂之對象投予。作為需要促進聚角蛋白微絲基因之表現之對象，例如可列舉患有乾燥肌膚、乾燥性之肌膚疾病、例如老人性乾皮症、異位性皮膚炎、尋常性魚鱗癬等皮膚疾病之對象。

本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑係指化粧料、醫藥品、準藥品、應用於外皮之製品，因此，其劑型亦可為水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、凝膠系、軟膏系、乳霜、水-油二層系、水-油-粉末三層系等廣泛之形態。例如作為化粧料，例如可應用於化粧水、乳霜、乳液、凝膠、美容液、軟膏、面膜、沐浴劑、沐浴乳、洗髮精、潤絲精、粉底等。若為醫藥品或準藥品，則可應用於各種軟膏、乳霜等形態。

於本發明之化粧料及/或皮膚外用劑中，亦可含有通常可用於化粧料及/或皮膚外用劑之製造的有效成分及/或賦形劑，例如亦可含有水、乙醇、甘油、玻尿酸等基劑，界面活性劑、保濕劑、增黏劑、pH值調整劑、紫外線吸收劑、穩定劑、抗菌劑、香料等。

如圖1所示，於角化細胞之培養細胞系中，聚角蛋白微絲基因具有週期約為24小時之節律而增減其之表現，可認為該節律相當於晝夜節律。所謂晝夜節律，是尤其藉由利用CLOCK、BMAL1、CRY、PER等時鐘蛋白質所構成之回饋迴路所控制之週期約為24小時之週期節律，對於生物體，已知會對睡眠/清醒、激素分泌、體溫、細胞週期等各種生理現象產生影響。

可認為聚角蛋白微絲基因即便於活體內(in vivo)亦根據晝夜節律而增減其之表現，因此本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑係根據晝夜節律進行投予，更具體而言係以聚角蛋白微絲表現之最大時期或最小時期同步之方式投予，藉此可更有效地促進聚角蛋白微絲之合成。

於本發明之另一態樣中，本發明亦關於一種美容方法，其係於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律與藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基因表現量之節律同步之時機投予聚角蛋白微絲基因表現促進劑。於本發明中，所謂美容方法不僅係單純為個人所進行之方法，於提供與美容相關之商品時，係提供適合顧客之化粧料之配方，並由醫生以外之化粧料銷售人員或美容師提供。

於本發明之另一態樣中，本發明係關於一種聚角蛋白微絲基因表現促進劑，其特徵在於：其係以於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律與藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基因表現量之節律同步之時機進行投予之方式使用。

於又一態樣中，本發明係關於一種聚角蛋白微絲基因表現促進 方法，其係對需要促進聚角蛋白微絲基因表現之對象，於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律與藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基因表現量之節律同步之時機投予聚角蛋白微絲基因表現促進劑。該聚角蛋白微絲基因表現促進方法亦為乾燥肌膚、以及乾燥性之肌膚疾病、例如老人性乾皮症、異位性皮膚炎、尋常性魚瞬癬等皮膚疾病之治療方法。

所謂於同步之時機投予係指以聚角蛋白微絲基因之表現量於生物節律中之波峰與藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基因表現量之增減之波峰重疊之方式進行投予，例如於聚角蛋白微絲基因表現量成為最大之16~22小時、更具體而言為17~21小時、進而具體而言為18~20小時之前投予聚角蛋白微絲基因表現促進劑。實際上，推測人之聚角蛋白微絲基因表現之波峰為上午5時~11時左右，更具體而言為上午6~10時，進而具體而言為上午7時~9時，故而認為較佳為例如於該16~22小時、更具體而言為17~21小時、進而具體而言為18~20小時之前投予聚角蛋白微絲基因表現促進劑。認為較佳為例如在相當於16~22小時之前之『上午7時~下午1時左右』至『下午1時~下午7時左右』之間進行投予。

如本發明中所明確般，認為聚角蛋白微絲係依據體內時鐘之節律而表現，若因年齡增大或壓力、熬夜或生活節律紊亂等某種原因而導致體內時鐘之節律發生紊亂，則會相應地導致聚角蛋白微絲之表現節律偏離或表現量減少。因此，藉由於適當之時機投予本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑，可期待促進聚角蛋白微絲之表現節律之恢復或增加表現量。因此，於本發明之另一態樣中，以於適宜之時機進行投予為特徵之本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑亦可用作聚角蛋白微絲之表現節律之改善或恢復劑。關於適當之時機，例如推測人之聚角蛋白微絲基因表現之波峰為上午5時~11時左右，更具體而言 為上午6~10時，進而具體而言為上午7時~9時，故而認為較佳為於該16~22小時、更具體而言為17~21小時、進而具體而言為18~20小時之前投予聚角蛋白微絲基因表現促進劑。

由於聚角蛋白微絲基因具有約24小時之週期性而增減，故而於篩選聚角蛋白微絲基因表現促進劑時，對於培養角化細胞等培養細胞，將候補藥劑之投予後約0~10小時、較佳為2~8小時、更佳為4~6小時之表現最小時期之聚角蛋白微絲基因表現量與16~22小時、較佳為17~21小時、更佳為18~20小時之表現最大時期之聚角蛋白微絲基因表現量進行比較，藉此可更高精度地篩選出聚角蛋白微絲基因表現促進劑。於又一態樣中，可將表現最大時期之聚角蛋白微絲基因表現量作為指標進行聚角蛋白微絲基因表現促進劑之篩選。於又一態樣中，亦可將第2週期後之表現最大時期、例如40~48小時、64~72小時等作為指標，而篩選聚角蛋白微絲基因表現促進劑。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的香葉油係源自香葉(Pelargonium graveolens)等天竺葵屬之全草之精油，例如為將上述天竺葵屬之全草進行水蒸氣蒸餾而獲得之精油。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的柏木油係源自柏木(Cupressus sempervirens)之精油，例如為將柏木之枝葉等進行水蒸氣蒸餾而獲得之精油。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的玫瑰油係源自西洋玫瑰(Rosa centifolia L)或大馬士革玫瑰(Rosa damascena Mill.)等薔薇屬之花瓣之精油，例如為將上述薔薇屬之花瓣進行水蒸氣蒸餾而獲得之精油。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的格蓬油係源自從芹科之白松香(Ferula galbaniflua)及近緣物種之葉或芽浸出之膠狀浸出物的精油，例如為進行水蒸氣蒸餾而獲得之精油。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的胡椒油係源自屬於胡椒科之多年生植物之胡椒(Piper nigrum L.)之漿果的精油，例如為將漿果進行水蒸氣蒸餾而獲得之精油。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的羅勒油係源自唇形花科之一年生草本植物之羅勒(Ocimum basilicum L.)之地上部全草的精油，例如為將地上全草進行水蒸氣蒸餾所採集之精油。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的山椒萃取物係芸香科山椒屬之山椒(Zanthoxylum piperitum)之萃取物。本發明山椒萃取物可藉由常法獲得，例如可將山椒之葉、莖、根、花、果實、果皮、果核、全草、或該等之混合物與萃取溶劑一併進行浸漬或加熱回流後進行過濾、濃縮而獲得。作為萃取溶劑，只要為通常可用於萃取之溶劑，則可任意地使用，例如可分別單獨使用或組合使用水、甲醇、乙醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油等醇類、水合醇類、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等有機溶劑等。又，視需要亦可使用如下者：對利用上述溶劑進行萃取所獲得之萃取液直接、或對其進行濃縮所得之萃取物使用吸附法、例如使用離子交換樹脂而去除雜質者；或者利用多孔性聚合物(例如Amberlite XAD-2)之管柱進行吸附後利用甲醇或乙醇而溶出並濃縮者。又，亦可使用利用分配法、例如利用水/乙酸乙酯所萃取之萃取物等。就於直接對皮膚應用之化粧料或醫藥品、例如皮膚外用劑等中使用之觀點而言，較佳為使用低刺激性之溶劑、例如水、1,3-丁二醇、甘油等所萃取之萃取物。

所謂精油係指對於植物所含之水為不溶~難溶性之有機化合物之混合物，通常含有揮發性之有機化合物，且根據原料而具有芳香性。由於精油係對植物所含之水為不溶~難溶性之有機化合物之混合 物，故而通常可藉由水蒸氣蒸餾而生成。然而，於本發明中，並未意在將精油限定於藉由水蒸氣蒸餾所生成之混合物，而意在包括以植物體之一部分作為原料並利用有機溶劑所萃取之對水為不溶~難溶性之萃取物。即，於本發明中，所謂「精油」係指由用作原料之植物(及視情況為其之部位)所特定之有機化合物之混合物，且具有本發明所需之效果、即聚角蛋白微絲基因表現促進作用之有機化合物之混合物。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的鄰甲苯甲酸甲酯(Methyl o-toluate，英文別名METHYL 2-METHYLBENZOATE)係分子式為C₉H₁₀O₂、分子量為150.17之常溫下為液體之化合物。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的鄰胺基苯甲酸甲酯(Methyl anthranilate，英文別名METHYL 2-AMINOBENZOATE)係分子式為C₈H₉O₂N、分子量為151.17之常溫下為液體之化合物。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的鄰甲胺基苯甲酸甲酯(Methyl N-METHYL ANTHRANILATE，英文別名2-Methyl AMINO METHYL BENZOATE)係分子式為C₉H₁₁O₂N、分子量為165.20之常溫下為液體之化合物。

作為本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之效果藥劑之一的3-(1'-哌啶)-丙酸(3-(1'-piperidine)-propionic acid：1PP)係分子式為C₈H₁₅NO₂、分子量為157.21之常溫下為固體之化合物。

[實施例] 實施例1：源自人皮膚之角化細胞中之聚角蛋白微絲基因表現之研究

將市售之源自正常成人皮膚之角化細胞(Cellntec公司)以成為3×10³個/cm²之方式接種於培養皿中，於上皮細胞用培養基(CnT- BM.1，Cellntec公司)中於37℃、5%CO₂環境下進行培養。3天後，換成含有皮質醇50 ng/mL之培養基，並於37℃、5%CO₂中進行同步培養。2小時後，換成通常之培養基並繼續進行培養，隨時間經過採集細胞。使用市售之RNA提取-cDNA合成套組(FastLane Cell cDNA Kit，Qiagen公司)，自所採集之細胞中提取RNA，製備cDNA。使用該cDNA，並藉由定量PCR(QPCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction，定量聚合酶鏈反應))法測定聚角蛋白微絲基因之表現量。同時測定時鐘基因PER3與BMAL1之表現量，並與聚角蛋白微絲基因之表現節律進行比較。QPCR法係使用市售之QPCR試劑套組(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Kit，Agilent公司)與QPCR測定裝置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System，Asilent公司)。定量作為管家基因之RPLP0基因之表現量作為內部標準，算出相對於RPLP0之相對表現量，設為聚角蛋白微絲基因表現量。PCR用引子係使用市售之聚角蛋白微絲、PER3、BMAL1、RPLP0用引子(Perfect Real Time Primer，Takarabio公司)。表1中揭示所使用之引子序列。

將結果示於圖1與圖2。於角化細胞之培養細胞系中，發現聚角蛋白微絲基因具有週期約為24小時之節律而增減其之表現，培養角化細胞自開始利用皮質醇之同步培養起約18小時後聚角蛋白微絲基因之 表現量成為最大。可認為該節律相當於晝夜節律。又，聚角蛋白微絲基因之表現節律與時鐘基因PER3之表現節律同相位，與BMAL1反相位。實際上，報告有人之PER3之表現波峰為上午5~11時，更具體而言為上午6~10時，進而具體而言為上午7~9時左右(非專利文獻2)。由圖2中所記載之PER3之表現波峰時間與聚角蛋白微絲基因之表現波峰時間之比較中推測出人之聚角蛋白微絲基因之表現波峰與PER3之表現波峰大致相同。

實施例2：促進聚角蛋白微絲基因表現之藥劑之篩選

將市售之源自正常成人皮膚之角化細胞(Cellntec公司)以成為3×10³個/cm²之方式接種於培養皿中，於上皮細胞用培養基(CnT-BM.1，Cellntec公司)中於37℃、5%CO₂下進行培養。3天後，換成以成為1%濃度之方式添加有各種候補藥劑之培養基，於37℃、5%CO₂下繼續進行培養，於2小時後與18小時後採集細胞。作為候補藥劑，添加有山椒萃取物(丸善製藥公司)、香葉油(香榮興業公司)、柏木油(Bioland公司)、玫瑰油(Bioland公司)、格蓬油(Bioland公司)、胡椒油(Bioland公司)、羅勒油(Bioland公司)、鄰甲苯甲酸甲酯(Aldrich公司)、鄰胺基苯甲酸甲酯(東京化成工業公司)、鄰甲胺基苯甲酸甲酯(東京化成工業公司)、丁香苞-丁香油(Bioland公司)、山金車(arnica)(香榮興業公司)。將未添加藥劑設為對照，並將皮質醇(培養基中濃度50 nB/mL)設為陽性對照。

使用市售之RNA提取-cDNA合成套組(FastLane Cell cDNA Kit，Qiagen公司)，自所採集之細胞中提取RNA，製備cDNA。使用該cDNA，並藉由定量PCR(QPCR)法測定聚角蛋白微絲基因之表現量。QPCR法係使用市售之QPCR試劑套組(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Kit，Agilent公司)與QPCR測定裝置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System，Agilent公司)。定量作為管家基因之RPLP0 基因之表現量作為內部標準，算出相對於RPLP0之相對表現量，設為聚角蛋白微絲基因表現量。PCR用引子序列係使用表1所示者。

圖3中表示添加各種候補藥劑2小時後、18小時後之聚角蛋白微絲基因之表現量。顯示出山椒萃取物、香葉油、柏木油、玫瑰油、格蓬油、胡椒油、羅勒油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、鄰甲胺基苯甲酸甲酯與對照相比，促進18小時後之聚角蛋白微絲基因之表現。另一方面，丁香苞、及山金車雖然18小時後之聚角蛋白微絲基因增加，但其增加量與對照組無有意義差。

實施例3：促進聚角蛋白微絲基因之表現之藥劑

將市售之源自正常成人皮膚之角化細胞(Cellntec公司)以成為3×10³個/cm²之方式接種於培養皿中，於上皮細胞用培養基(CnT-BM.1，Cellntec公司)中於37℃、5%CO₂下進行培養。3天後，換成以3-(1'-哌啶)-丙酸(1PP：有機合成工業公司)成為0.1%、山椒萃取物成為0.1%、及1PP成為0.1%以及山椒萃取物成為0.1%之濃度之方式進行添加之培養基，於37℃、5%CO₂下繼續進行培養，18小時後採集細胞。使用未添加藥劑作為對照。

使用市售之RNA提取-cDNA合成套組(FastLane Cell cDNA Kit，Qiagen公司)，自所採集之細胞中提取RNA，製備cDNA。使用該cDNA，並藉由定量PCR(QPCR)法測定聚角蛋白微絲基因之表現量。QPCR法係使用市售之QPCR試劑套組(Brilliant III Ultra-Fast SYBR Green QPCR Kit，Agilent公司)與QPCR測定裝置(MX-3000P Real-time Quantitative PCR System，Agilent公司)。定量作為管家基因之RPLP0基因之表現量作為內部標準，算出相對於RPLP0之相對表現量，設為聚角蛋白微絲基因表現量。PCR用引子係使用表1所示者。將結果示於圖4。1PP以0.1%具有與山椒萃取物0.1%同等之聚角蛋白微絲基因之表現促進效果，進而藉由併用山椒萃取物與1PP，進一步促進聚角 蛋白微絲基因之表現。

調配例

以下，揭示本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之調配例，但本發明之實施並不限定於以下內容。

香氛

(1)乙醇 75.0

(2)純化水 剩餘量

(3)二丙二醇 5.0

(4)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：玫瑰油 10.0

(5)抗氧化劑 8.0

(6)色素 適量

(7)紫外線吸收劑 適量

室內香氛

(1)乙醇 80.0

(2)純化水 剩餘量

(3)抗氧化劑 5.0

(4)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：柏木油 3.0

(5)3-甲基-3-甲氧基丁醇 5.0

(6)二亞苄基山梨糖醇 5.0

熏香

(1)楠仔粉 75.5

(2)苯甲酸鈉 15.5

(3)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：格蓬油 5.0

(4)尤加利油 1.0

(5)純化水 剩餘量

沐浴劑

(1)硫酸鈉 45.0

(2)碳酸氫鈉 45.0

(3)薰衣草油 9.0

(4)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：鄰胺基苯甲酸甲酯 1.0

按摩用凝膠

(1)赤藻糖醇 2.0

(2)咖啡因 5.0

(3)黃柏萃取物 3.0

(4)甘油 50.0

(5)羧基乙烯基聚合物 0.4

(6)聚乙二醇400 30.0

(7)乙二胺四乙酸三鈉 0.1

(8)聚氧化烯(10)甲基聚矽氧烷共聚物 2.0

(9)角鯊烷 1.0

(10)氫氧化鉀 0.15

(11)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：香葉油 1.0

按摩乳霜

(1)固體石蠟 5.0

(2)蜂蠟 10.0

(3)凡士林 15.0

(4)液態石蠟 41.0

(5)1,3-丁二醇 4.0

(6)單硬脂酸甘油酯 2.0

(7)POE(20)去水山梨醇單月桂酸酯 2.0

(8)硼砂 0.2

(9)咖啡因 2.0

(10)防腐劑 適量

(11)抗氧化劑 適量

(12)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：山椒萃取物 1.0

(13)純化水 剩餘量

芳香性纖維

於銅銨纖維素溶液(纖維素濃度10重量%，銨濃度7重量%，銅濃度3.6重量%)中，以相對於纖維素重量為0.1~20重量%之範圍內添加、混合內包有本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之微膠囊(粒徑50 μm以下，劑於微膠囊中所占之比率為50重量%)後，依據通常之濕式紡絲方法進行紡絲，經過精煉步驟、乾燥步驟，獲得芳香性纖維。

顆粒

(1)蔗糖素 0.1

(2)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：山椒萃取物 0.1

(3)香味料 5.0

(4)賦形劑(Ceolus) 10.0

(5)麥芽糖醇 剩餘量

錠劑(咀嚼型)

(1)肌醇 11.0

(2)麥芽糖醇 21.0

(3)蔗糖 0.5

(4)鮭魚白萃取物(DNA Na) 0.1

(5)酵母萃取物 0.1

(6)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：羅勒油 0.1

(7)香味料 5.0

(8)賦形劑 剩餘量

錠劑

(1)潤滑劑(蔗糖脂肪酸酯等) 1.0

(2)阿拉伯膠水溶液(5%) 2.0

(3)酸味料 1.0

(4)著色料 適量

(5)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：胡椒油 0.1

(6)糖質(粉糖或山梨糖醇等) 剩餘量

糖果

(1)砂糖 50.0

(2)飴糖 47.95

(3)有機酸 2.0

(4)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：玫瑰油 0.05

香口膠

(1)砂糖 43.0

(2)膠質 30.95

(3)葡萄糖 10.0

(4)飴糖 16.0

(5)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：羅勒油 0.05

化粧水

(1)1,3-丁二醇 6.0

(2)甘油 4.0

(3)油醇 0.1

(4)POE(20)去水山梨醇單月桂酸酯 0.5

(5)POE(15)月桂醇酯 0.5

(6)乙醇 10.0

(7)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：3-(1'-哌啶)-丙酸 1.0

(8)純化水 剩餘量

乳液

(1)微晶蠟 1.0

(2)蜂蠟 2.0

(3)羊毛脂 20.0

(4)液態石蠟 10.0

(5)角鯊烷 5.0

(6)POE(20)去水山梨醇單油酸酯 1.0

(7)丙二醇 7.0

(8)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：3-(1'-哌啶)-丙酸 0.5

(9)本發明之聚角蛋白微絲基因表現促進劑：山椒萃取物 0.1

(10)亞硫酸氫鈉 0.01

(11)對羥基苯甲酸乙酯 0.3

(12)香料 適量

(13)純化水 剩餘量

<110> 日商資生堂股份有限公司

<120> 聚角蛋白微絲(Filaggrin)基因表現促進劑

<130> AB592

<150> JP 2012-178486

<151> 2012-08-10

<160> 8

<170> PatentIn第3.5版

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 7

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 8

Claims (11)

1. 一種聚角蛋白微絲基因表現促進劑，其含有山椒萃取物及3-(1'-哌啶)-丙酸。
2. 如請求項1之聚角蛋白微絲基因表現促進劑，其特徵在於：其係以於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律與藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基因表現量之節律同步之時機投予該聚角蛋白微絲基因表現促進劑之方式使用。
3. 如請求項1之聚角蛋白微絲基因表現促進劑，其特徵在於：其係對於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律紊亂之對象，以於藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予而使聚角蛋白微絲基因表現量之節律恢復之時機投予該聚角蛋白微絲基因表現促進劑之方式使用。
4. 一種對於具有正常皮膚之人達成保濕效果之美容方法，其係於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律與藉由含有選自由山椒萃取物、3-(1'-哌啶)-丙酸、香葉油、柏木油、格蓬油、胡椒油、羅勒油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、及鄰甲胺基苯甲酸甲酯所組成之群中之1種以上之聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基因表現量之節律同步之時機，投予該聚角蛋白微絲基因表現促進劑。
5. 如請求項4之美容方法，其中上述聚角蛋白微絲基因表現促進劑含有山椒萃取物。
6. 如請求項5之美容方法，其中上述聚角蛋白微絲基因表現促進劑含有山椒萃取物及3-(1'-哌啶)-丙酸。
7. 一種選自由山椒萃取物、3-(1'-哌啶)-丙酸、香葉油、柏木油、格 蓬油、胡椒油、羅勒油、鄰甲苯甲酸甲酯、鄰胺基苯甲酸甲酯、及鄰甲胺基苯甲酸甲酯所組成之群中之1種以上之用途，其係用以製造聚角蛋白微絲基因之表現促進劑。
8. 一種選自由山椒萃取物及3-(1'-哌啶)-丙酸所組成之群中之1種以上之用途，其係用以製造聚角蛋白微絲基因之表現促進劑。
9. 一種山椒萃取物及3-(1'-哌啶)-丙酸之用途，其係用以製造聚角蛋白微絲基因之表現促進劑。
10. 如請求項7至9中任一項之用途，其中上述聚角蛋白微絲基因表現促進劑係於聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律與藉由聚角蛋白微絲基因表現促進劑之投予所產生之聚角蛋白微絲基因表現量之節律同步之時機投予。
11. 如請求項7至9中任一項之用途，其中上述聚角蛋白微絲基因表現促進劑係對聚角蛋白微絲基因表現量之生物節律發生紊亂之對象，於使聚角蛋白微絲基因表現量之節律恢復之時機投予。