TWI614345B

TWI614345B - 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法

Info

Publication number: TWI614345B
Application number: TW101122512A
Authority: TW
Inventors: Guang-Han Shen
Original assignee: Taichung Veterans General Hospital
Priority date: 2012-06-22
Filing date: 2012-06-22
Publication date: 2018-02-11
Also published as: EP2677040A1; US20130345076A1; TW201400621A

Description

檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法

本發明係關於一種病原菌鑑定及其抗藥性檢測的探針，特別是指一種檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針以及應用該探針之晶片、套組與方法

分枝桿菌屬(Mycobacterium genus)包含結核分枝桿菌群(Mycobacterium tuberculosis complex，以下簡稱MTB)與非結核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，以下簡稱NTM)兩大類。其中結核菌群含有結核分枝桿菌(M.tuberculosis)、非洲分枝桿菌(M.africanum)、牛分枝桿菌(M.bovis)等。而同屬為分枝桿菌屬其他種的分枝桿菌，通稱為非結核分枝桿菌，迄今已發現百種以上。

結核分枝桿菌是人類肺結核疾病之主要病原菌，是全世界感染人數最多，死亡人數最多的傳染性疾病，在台灣被列為法定傳染病，一旦病人被診斷為肺結核或健康人被檢查出有結核分枝桿菌，皆必須立刻通報衛生署，並進行抗生素治療。

在肺結核的治療方面，根據世界衛生組織以及我國疾病管制局的統計報告，不論是在我國或是全世界，抗藥性結核分枝桿菌的比率逐漸增加，造成治療上的困難。尤其是對於感染多重抗藥性肺結核以及廣泛性抗藥肺結核的病患，在治療時必須要謹慎小心的調整與規劃給藥策略。

非結核分枝桿菌原是屬於環境中的腐生菌和引起人類伺機性感染的低病原性微生物，傳染途徑為經由環境用水，例如冷氣機冷凝水、醫療器具(如呼吸器)傳染，患者不需通報衛生署，但是臨床醫師必須要先鑑定出患者所感染的非結核分枝桿菌種，再針對不同菌種予以不同的抗生素治療。

綜上所述，檢測與鑑定結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌及其菌種，以及結核分枝桿菌之抗藥性具有臨床上的重要性，若能夠快速檢測出病患所感染的結核分枝桿菌是否具有抗藥性，或者是屬於何種非結核分枝桿菌的菌種時，便能夠作為臨床醫師選擇藥物與擬定治療方針時的重要參考。

一般醫院自呼吸道檢體(主要為痰檢體)分離並鑑定出結核分枝桿菌或非結核分枝桿菌，以傳統的生化方法為之，需耗時1~2個月，並且步驟繁瑣。目前較大型的醫院是使用必帝公司(Becton Dickinson)所發展出的自動偵測結核菌液態快速培養系統(BACTEC MGIT 960 system)以及BD ProbeTec^TM ET Mycobacterium tuberculosis Complex(CTB)Culture Identification Reagent Pack進行檢測分析，可將判斷檢體內是否含有分枝桿菌與結核分枝桿菌的時間縮短至1~2星期左右。但是要將非結核分枝桿菌鑑定至菌種，仍須經過培養後，進行傳統的生化鑑定方法，不僅耗時並且容易受到人為判讀因素的干擾，再者由於上述自動偵測、培養與分析系統的儀器和試劑價格昂貴，因此無法廣泛使用在一般的醫療院所中。

在先前研究中，Telenti等人(1993)曾以分枝桿菌的hsp65基因(65-kilodalton heat shock protein)為標的，利用聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，以下簡稱PCR)限制片段長度多型性(restriction fragment length polymorphism，以下簡稱RFLP)分析或稱限制酵素切割圖譜分析(fragment restriction enzyme analysis，以下簡稱PRA)製備出非結核分枝桿菌限制酶圖譜的資料庫，將未知菌種的限制酶圖譜與資料庫比對，便可鑑定出菌種。

Kim等人(2001；2004)則是以分枝桿菌的rpoB基因(polymerase β-subunit-encoding)，進行限制酶圖譜分析，再搭配菌種的生長特性、型態以及兩種生化試驗(Tween 80和nitrate reduction test)，便可正確地鑑定出分枝桿菌之菌種(G-H.Shen et al.,2009)。但是臨床上發現，鑑定非結核分枝桿菌時，由於數種非結核分枝桿菌鑑別的PCR-RFLP片段大小過於接近，而容易造成誤判。

ITS區域是一段位在16S rRNA基因與23S rRNA基因之間的轉錄區域，又稱作16S-23S rRNA ITS基因(16S-23S rRNA internal transcribed spacer region)，ITS區域兩端具有屬保留性與中間具有種變異性，因此可作為鑑定分枝桿菌的標的。

立復黴素(rifampicin，簡稱RIF)的作用機制，是結合在細菌RNA聚合酶的β次單元上，而阻斷其轉錄作用中的延長。rpoB基因則是製造RNA聚合酶β次單元的序列，先前研究指出，絕大多數抗立復黴素的菌株均有rpoB基因的突變，因此rpoB基因可作為鑑定結合分枝桿菌抗藥性的標的。

另外，台灣公開第201002825號、中國第101413031號以及中國第100368559號專利亦分別揭露有針對特定基因設計引子對或探針，進行PCR而加以鑑別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌的檢測技術。然而，前述檢測技術均需要透過許多操作步驟，並且只能初步區分結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌，而無法進一步鑑定出非結核分枝桿菌的菌種。

美國專利第6,025,132號則是揭露有多個特殊設計的核酸探針，藉此鑑定分枝桿菌中具有傳染性以及具有病原性的特定菌種。然而，前述檢測技術無法進一步檢測出結核分枝桿菌之抗藥性。

美國專利第6,329,138號、第6,632,607號以及第7,252,936號另揭露有多個特殊設計的核酸探針，藉此鑑定結核分枝桿菌對於立復黴素的敏感性與抗藥性。然而，前述檢測技術無法同時檢測非結核分枝桿菌及其菌種。

有鑑於此，本發明之主要目的在於提供一種用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之組合物、晶片、套組與方法，可一步完成結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌之篩檢、非結核分枝桿菌菌種之鑑定以及結核分枝桿菌抗藥性之檢測。

為達成上述目的，本發明提供一種用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之組合物，包含：多數探針，各該探針係選自由下列核苷酸分子所組成之群組：SEQ ID NO：4、5、8、9、11~17、21、28、31、36。

前述該非結核分枝桿菌係可選自由下列微生物所組成之群組：M.avium、M.chelonae、M.fortuitum、M.gordonae、M.intracellulare、M.kansasii、M.lentiflavum、M.shimodei。

為達成上述目的，本發明另提供一種用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之晶片，包含：一基質；以及多數探針，設於該基質，其中各該探針係選自由下列核苷酸分子所組成之群組：SEQ ID NO：4、5、8、9、11~17、21、28、31、36。

為達成上述目的，本發明又提供一種用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，包含：多數探針，各該探針係選自由下列核苷酸分子所組成之群組：SEQ ID NO：4、5、8、9、11~17、21、28、31、36。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一基質，該基質係用以設置各該探針。其中該基質係可為聚苯乙烯。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一組引子對SEQ ID NO：1、2。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一組引子對SEQ ID NO：24、25。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一雜合緩衝液，用以提供各該探針進行雜交反應所需的環境。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一洗滌緩衝液，用以洗除未與各該探針結合之聚合酶連鎖反應產物。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一類二次抗體，用以標定各該探針進行反應之後之產物。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一類二次抗體稀釋劑，用以避免非專一性結合。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一呈色原劑，用以與該類二次抗體反應產生顏色。

於本發明另一較佳實施例所提供之用以檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之套組，更包含有一呈色原稀釋劑，用以提供該呈色原劑反應所需的環境。

為達成上述目的，本發明再提供一種檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之方法，包含有下列步驟：(a)從一樣本中增幅出16S-23S rRNA ITS基因以及rpoB基因；(b)提供多數探針與步驟(a)之產物進行雜合反應，各該探針係選自由下列核苷酸分子所組成之群組：SEQ ID NO：4、5、8、9、11~17、21、28、31、36；以及(c)測定雜合反應之結果。

前述步驟(a)係可以二組引子對SEQ ID NO：1、2以及SEQ ID NO：24、25進行增幅。

於本發明另一較佳實施例所提供之檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之方法，更包含有下列步驟：(d)將各該探針設置於一基質。

藉由上述技術特徵，本發明整合對於結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌及其菌種所具有的特定基因序列所設計的專一性探針，以及針對抗藥性結核分枝桿菌所具有的基因變異序列所設計的專一性探針，而可同時達成對於結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌菌種以及結核分枝桿菌抗藥性的檢測。

有關本發明之詳細構造、特點、組裝方式或使用方式，將於後續之詳細說明中予以描述。然而，在本發明領域中具有通常知識者應能瞭解，該等詳細說明以及實施本發明所列舉之特定實施例或實驗例，僅用於說明本發明，並非用以限制本發明之專利申請範圍。

以下將藉由所列舉之特定實施例或實驗例，配合隨附之圖式，詳細說明本發明之技術內容及特徵。

實驗一：分枝桿菌之收集

分枝桿菌之標準菌株購自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection，以下簡稱ATCC)，菌種及其對應的標準菌株如表一所示。臨床菌株收集自台中榮民總醫院(台灣，台中)、中山醫院(台灣，台中)、彰化基督教醫院(台灣，彰化)、芮弗士檢驗所(台灣，台中)，經過上述醫療院所從臨床病患的呼吸道檢體中，以傳統生化方法與分子生物學方法檢驗並鑑定確定的分枝桿菌菌株，包括：9株M.tuberculosis complex、9株M.abscessus、1株M.asiaticum、3株M.avium、3株M.chelonae、9株M.fortuitum、9株M.gordonae、9株M.intracellulare、9株M.kansasii、2株M.lentiflavum、1株M.malmoense、2株M.marinum、1株M.scrofulaceum、2株M.shimodei、1 株M.szulgai以及2株M.xenopi，菌株名稱及其所屬菌種如表一所示。所使用的呼吸道檢體前處理、菌株培養、抗酸菌鑑定、傳統生化方法與分子生物學方法簡述如下。

1. 呼吸道檢體前處理

將病人的呼吸道檢體，以NALC(N-acety-L-cysyeine)2% NaOH液體消化、去污染離心濃縮(3000 xg)處理後，分別接種於Löwenstein-Jensen medium(以下簡稱L-J培養基)、Middlebrook 7H11培養基(以下簡稱7H11培養基)與BD BACTEC 960 MGIT管(mycobacterial growth indicator tube，以下簡稱MGIT管)中。

2. 菌株培養

L-J培養基以及7H11培養基培養於37℃、5%CO₂培養箱。而MGIT管直接於BACTEC MGIT 960系統掃描試管上的條碼標籤後，放入機器中培養。BD BACTEC MGIT 960系統培養的週期目前為42天。一般而言，若檢體中有分枝桿菌，通常於接種MGIT管7-10天後，機器就會偵測到分枝桿菌的生長，顯示出陽性。

3. 抗酸菌鑑定

當機器顯示出MGIT管為分枝桿菌陽性時，MGIT管需作抗酸性染色。若MGIT管耐酸性染色為陽性時，顯示有分枝桿菌的存在，則觀察紀錄抗酸性染色菌形態。當L-J培養基有菌落生長時，對照MGIT管內的生長情況，若符合則以MGIT管內的結果為主。

3.1 CTB分析

CTB分析是利用必帝公司所開發出來的檢測套組BD ProbeTec^TM ET Mycobacterium tuberculosis complex(CTB)Culture Identification Reagent Pack所進行的檢驗分析方法，運用冷光標記於結核分枝桿菌特有的重複基因序列IS6110，以單股替換放大法(strand displacement amplification，簡稱SDA)偵測，如有冷光釋出即有結核分枝桿菌存在。

將有菌落生長之MGIT管依照原廠所提供之檢測步驟進行測試，偵測結果若為陽性即表示檢體中含有結核分枝桿菌之DNA。

3.2 傳統生化鑑定

若病人有2套以上之呼吸道檢體於MGIT管中培養出分枝桿菌，則會進行傳統生化鑑定以確定分枝桿菌之菌種。生化鑑定包含芳香烷硫酸酯酶試驗(Arylsulfatase)、觸酶試驗(Catalase)、5%氯化鈉耐受性試驗(Tolerance to 5% NaCl)、菸酸累積試驗(Niacin accumulation test)、菸酸還原試驗(Nitrate reduction test)、Tween 80水解試驗(Tween 80 hydrolysis)、尿素酶試驗(Urease)，實驗流程與方法請參照行政院疾病管制局所出版的結核菌檢驗手冊(2004)。

3.3 PCR-RFLP鑑定

取各菌株之染色體DNA進行hsp65 PCR，將PCR產物之後則進一步以BstEII及HaeIII酶切後進行圖譜分析，再將圖譜結果與Telenti et al.(1993)建立的hsp65 RFLP資料庫比對(網址：http：//app.chuv.ch/prasite/index.html)，進而鑑定分枝桿菌的菌種。

實驗二：分枝桿菌16S-23S rRNA ITS區域PCR

利用分枝桿菌共通之Sp1(SEQ ID NO：1)、Sp4(SEQ ID NO：2)引子對增幅出16S-23S rRNA基因ITS區域(Xiong et al.,2006)。以加熱法製備非結核分枝桿菌DNA模板，取單一菌落懸浮於40μL ddH₂O，以98℃加熱10分鐘後，上清液即為DNA模板。而結核分枝桿菌的DNA模板以BD ProbeTec^TM ET的M.tuberculosis Complex(CTB)Culture Identification Reagent Pack純化套組製備。PCR總反應體積為50μL，依序加入ddH₂O 28.75μL、5μL DNA模板、1μL 10μM Sp1(SEQ ID NO：1)、1μL 10μM Sp4(SEQ ID NO：2)(Y為T/C)、4μL 2.5mM dNTP、10μL 5X buffer(Promega)、0.25μL GO Taq polymerase(5000units/mL，Promega)。依菌株的種類不同，預計可增幅出212-300個鹼基對不等的片段(Roth,et al.,2000)，因此將PCR產物以2.0%膠體電泳進行分析，檢測產物片段大小。

本實驗利用16種分枝桿菌的臨床菌株以及標準菌株進行增幅，分枝桿菌之菌名、檢測菌株數量以及片段大小如下表所示。

實驗三：分枝桿菌16S-23S rRNA ITS序列定序分析

由於M.fortuitum之16S-23S rRNA ITS的PCR產物，經電泳分析，大多數為二個大小相接近的片段(double band)，故須將此二DNA片段作yT&A選殖(益生生技，台灣)，以便進行DNA定序。首先以DNA回收套組(QIA quick Gel Extraction kit,QIAGEN,Germany)回收電泳膠片上的此二片段，並以莫耳數比約3：1(insert DNA：vector DNA)的比例進行接合作用以及轉形作用。從本實驗欲檢測之16種分枝桿菌的臨床菌株中，挑選M.asiaticum、M.malmoense、M.scrofulaceum和M.szulgai各1株，M.avium和M.chelonae各三株，M.lentiflavum、M.marinum、M.shimodei和M.xenopi各兩株，其餘菌株各4株的16S-23S rRNA ITS的PCR產物，直接送至源資生技公司做定序，定序所用的引子為SP1(SEQ ID NO：1)。M.fortuitum的16S-23S rRNA ITS的PCR產物片段，先經yT&A選殖後，以T7引子做定序。

實驗四：分枝桿菌專一性探針設計

將定序結果用DNAMAN軟體(Version 4.11)相互比對。找出16種分枝桿菌種專一性的探針序列以及分枝桿菌屬通用的探針序列，並將每株菌的專一性探針序列於5’端接上poly(T)，共15個T。探針名稱以及本實驗中欲鑑定的菌種，如表二所示。其中，鑑定Mycobacterium genus、M.fortuitum、M.intracellulare以及M.kansasii會使用到2個探針，其餘欲鑑定之菌種皆使用1個探針。

表二、分枝桿菌屬之通用探針與個別菌種專一性探針序列

實驗五：抗藥性結核分枝桿菌之收集

分枝桿菌之標準菌株(H37Rv)購自ATCC，抗藥性結核分枝桿菌的臨床菌株是收集自芮弗氏檢驗所(台灣，台中)檢驗並鑑定確定的結核分枝桿菌菌株以及具有抗藥性的結核分枝桿菌菌株如表三所示。其中，呼吸道檢體前處理、菌株培養、抗酸菌鑑定、傳統生化方法與分子生物學方法請參照實驗一所述。

透過上述實驗方法與步驟分離到結核分枝桿菌時，需進行藥物敏感性試驗。測試結核菌藥物敏感性的第一線藥物為鏈黴素(streptomycin，簡稱SM)、異煙肼(isoniazid，簡稱INH)、立復黴素(rifampicin，簡稱RIF)、孟表多(ethambutol，簡稱EMB)。藥物敏感性試驗是使用鑫堂公司(台灣，台北)的分枝桿菌藥物敏感試驗培養基，測試藥物的濃度分別為INH 0.2μg/ml、1.0μg/ml；RMP 1.0μg/ml；SM 2.0μg/ml、10μg/ml；EMB 5.0μg/ml、10μg/ml，並依照原廠所提供之檢測步驟進行測試。

實驗六：抗藥性結核分枝桿菌rpoB基因PCR

利用rpoF-1(SEQ ID NO：24)、rpo8-1(SEQ ID NO：25)引子對增幅出rpoB基因。PCR總反應體積為50μL，依序加入ddH₂O 18μL、5μL DNA模板、1μL 10μM rpoF-1(SEQ ID NO：24)、1μL 10μM rpo8-1(SEQ ID NO：25)、25μL 2X GO Taq Colorless Master MIX(Promega)。PCR條件為95℃、5分鐘；95℃、30秒，60℃、30秒，72℃、45秒。進行30個循環；72℃、5分鐘。預計可增幅出196個鹼基對的片段，將PCR產物以2.0%膠體電泳進行分析，檢測產物片段大小，結果如表三所示。

實驗七：抗藥性結核桿菌rpoB基因序列分析

48株抗藥性結核桿菌之rpoB基因增幅後並送定序，再將其定序結果運用美國國家生物科技訊息中心(簡稱NCBI)網站的BLAST系統(網址：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，與結核分枝桿菌標準菌株H37Rv的rpoB基因序列相互比對分析，得到各個抗藥性結核桿菌之突變位置與序列變化，如下表四所示。

結果顯示，48株抗藥性結核桿菌其rpoB基因突變位置皆在胺基酸511到533之位置，且為點突變。而531位置突變共有31株(31/48)，其中有27株為TCG→TTG，4株為TCG→TGG。526位置突變共有5株(5/48)，其中有3株為CAC→TAC，1株為CAC→GAC，1株為CAC→CTC。516位置突變共有5株(5/48)，其中有3株為雙核苷酸突變GAC→TTC，2株為GAC→TAC。而511位置突變有1株，序列變化為CTG→CCG。1株為513位置突變，其序列變化為CAA→CTA。1株為522位置突變，其序列變化為TCG→TTG。1株為529位置突變，其序列變化為CGA→CTA。1株為533位置突變，其序列變化為CTG→CCG。另外有2株呈現兩處胺基酸位置突變，包含1株為526位置CAC→CGC以及529位置CGA→CAA，另1株為511位置CTG→CCG以及526位置CAC→CAG。

實驗八：抗藥性結核分枝桿菌探針設計

依各抗藥性結核桿菌之突變位置與序列，並將每一rpoB抗藥性探針序列於5’端接上poly(T)，共15個T。探針名稱如表五所示。

RW1-1探針為針對結核分枝桿菌標準菌株H37Rv之胺基酸510至514位置所設計之探針。RW2-1探針為針對結核分枝桿菌標準菌株H37Rv之胺基酸513至518位置所設計之探針；另根據表四中MDR TB 6、32、34定序結果，針對胺基酸516位置突變設計RM2-3探針，且位置涵蓋胺基酸513至518位置。

RW3-4探針為針對結核分枝桿菌標準菌株H37Rv之胺基酸520至525位置所設計之探針。RW4-3探針為針對結核分枝桿菌標準菌株H37Rv之胺基酸524至528位置所設計之探針；另根據表四中MDR TB 13定序結果，針對胺基酸526位置突變設計RM4-3探針，且位置涵蓋胺基酸524至528位置；另根據表四中MDR TB 1、3、19定序結果，針對胺基酸526位置突變設計RM4-3a探針，且位置涵蓋胺基酸523至528位置；另根據表四中MDR TB 25定序結果，針對胺基酸526位置突變設計RM4-2b探針，且位置涵蓋胺基酸524至528位置。

RW5-3探針為針對結核分枝桿菌標準菌株H37Rv之胺基酸529至533位置所設計之探針；另根據表四中MDR TB 2、4、5、7~10、12、14~18、22~24、26、29~31、33、37、38、43、46~48定序結果，針對胺基酸531位置突變設計RM5-2a探針，且位置涵蓋胺基酸529至533位置；另根據表四中MDR TB 11、20、28、42定序結果，針對胺基酸531位置突變設計RM5-2b探針，且位置涵蓋胺基酸529至533位置。

實驗九：16S-23S rRNA ITS與rpoB雙重PCR

利用16S-23S rRNA ITS的引子對Sp1(SEQ ID NO：1)與Sp4(SEQ ID NO：2)以及rpoB基因的引子對rpoF-1(SEQ ID NO：24)與rpo8-1(SEQ ID NO：25)，分別在Sp4(SEQ ID NO：2)以及rpo8-1(SEQ ID NO：25)標示有生物素(biotin)，以雙重PCR方式來各別增幅出其中的16S-23S rRNA ITS片段和rpoB基因。

以1：1之rpoF-1(SEQ ID NO：24)與rpo8-1(SEQ ID NO：25)引子對和SP1(SEQ ID NO：1)與SP4(SEQ ID NO：2)引子對比例進行雙重PCR。PCR總反應體積為25μL，內容有DNA、rpoF-1與rpo8-1引子對各0.4μM、SP1與SP4引子對各0.4μM、0.2mM dNTP、1.5mM MgCl₂、1X PCR緩衝液、2 x 102copies/μL PCR控制組模版，再加入0.3μL的DNA聚合酶。反應條件為95℃、5分鐘；95℃、30秒，60℃、30秒，72℃、1分鐘。進行35個循環；72℃、10分鐘。預計可增幅出212-300個鹼基對不等的片段(16S-23S rRNA ITS基因)，若樣本為結核分枝桿菌則另有196個鹼基對(rpoB基因)的片段。

實驗十：晶片製備

首先製備探針液，將100μM探針加入1X探針溶液(晶宇生技，台灣，苗栗)中，使探針液中探針的最終濃度為10μM。並利用自動點片機(晶宇生技)將各探針點至聚苯乙烯盤(polystyrene plates)的特定位置。

晶片上各探針的排列位置如第一圖所示，每個晶片共有36個探針點。包含28個探針點，4個雜合正控制點，1個雜合負控制點，與1個PCR正控制點。

將完成點片之晶片以UV光照射，使探針固定在晶片上。再用ddH₂O清洗，乾燥後於4℃存放。

實驗十一：雜合反應

自雙重PCR所得有生物素標記的PCR產物共25μL，運用PCR儀器以95℃加熱5分鐘，使其變性後立即置於冰上2分鐘。取點好的晶片，每一孔注入200μL雜合緩衝液(DR.Hyb^TM buffer，晶宇生技)，再各別加入5μL PCR產物。貼上膠膜以防止樣本間污染，放置於55℃雜合反應箱(晶宇生技)內，振動反應40分鐘。

反應後自雜合反應箱中取出，並小心撕下膠膜，倒掉雜合緩衝液，每一孔加入200μL洗滌緩衝液(wash buffer，晶宇生技)，靜置3分鐘後，將洗滌緩衝液倒出，重複三次。最後一次則儘量倒乾洗滌緩衝液。

每一孔加入含有0.2μL類二次抗體(Strep-AP，晶宇生技)的200μL類二次抗體稀釋劑(blocking reagent，晶宇生技)，於室溫反應20分鐘。反應後倒掉液體，每一孔加入200μL洗滌緩衝液，靜置3分鐘後，再將洗滌緩衝液倒出，重複清洗步驟三次。最後一次則儘量例乾洗滌緩衝液。接著每一孔以200μL呈色原稀釋劑(detection buffer，晶宇生技)潤濕晶片表面後倒掉。每一孔再加入含有4μL呈色原劑(NBT/BCIP，晶宇生技)的200μL呈色原稀釋劑，室溫下避光靜置7分鐘。之後，倒掉呈色液，以ddH₂O沖洗乾淨，並倒乾水分，即可由肉眼直接判讀結果或是利用讀片機(DR.AiM reader，晶宇生技)掃描分析。

實驗十二：臨床檢體測試晶片

共測試216株臨床樣品，有209株被正確鑑定，1株無培養出菌株但有晶片鑑定結果，6株有培養出菌株但與晶片鑑定結果不一致。整體的敏感度為97.2%，特異性為96.8%。TB的部份敏感度為100%，特異性為98.9%，測試結果如表六所示。

表六、晶片測試結果與培養結果對照

其中有21株以晶片偵測為M.abscessus，探針雜合結果如第二圖(A)中M.abscessus結果所示，對照培養結果有15株為M.abscessus、2株為快速生長分枝桿菌(Rapid Growing Mycobacteria，簡稱RGM)和4株非結核分枝桿菌。

6株以晶片偵測為M.avium，探針雜合結果如第二圖(A)中M.avium結果所示，對照培養結果有1株為M.avium、1株為鳥型結核菌(Mycobacterium avium complex，簡稱MAC)和4株非結核分枝桿菌。

7株以晶片偵測為M.chelonae，探針雜合結果如第二圖(A)中M.chelonae結果所示，對照培養結果有1株為M.chelonae以及6株非結核分枝桿菌。

9株以晶片偵測為M.fortuitum，探針雜合結果如第二圖(A)中M.fortuitum結果所示，並與培養結果符合。

9株以晶片偵測為M.gordonae，探針雜合結果如第二圖(A)中M.gordonae結果所示，對照培養結果有7株為M.gordonae、1株為M.haemophilum以及1株非結核分枝桿菌。其中M.haemophilum結果與晶片結果不一致。

7株以晶片偵測為M.intracellulare，探針雜合結果如第二圖(A)中M.intracellulare結果所示，對照培養結果有2株為M.intracellulare、1株為MAC以及4株非結核分枝桿菌。

11株以晶片偵測為M.kansasii，探針雜合結果如第二圖(A)中M.kansasii結果所示，對照培養結果有8株為M.kansasii以及3株非結核分枝桿菌。

1株以晶片偵測為M.lentiflavum，探針雜合結果如第二圖(A)中M.lentiflavum結果所示，對照培養結果為M.gordonae。此培養結果與晶片結果不一致。

1株以晶片偵測為M.malmoense，探針雜合結果如第二圖(B)中M.malmoense結果所示，對照培養結果為M.malmoense。

1株以晶片偵測為M.marinum，探針雜合結果如第二圖(B)中M.marinum結果所示，對照培養結果為M.marinum。

2株以晶片偵測為M.scrofulaceum，探針雜合結果如第二圖(B)中M.scrofulaceum結果所示，對照培養結果有1株為M.scrofulaceum以及1株非結核分枝桿菌。

4株以晶片偵測為M.szulgai，探針雜合結果如第二圖(B)中M.szulgai結果所示，對照培養結果有2株為M.kansasii以及2株非結核分枝桿菌。其中培養結果與晶片結果不一致。

1株以晶片偵測為M.xenopi，探針雜合結果如第二圖(B)中M.xenopi結果所示，對照培養結果有1株為M.xenopi以及2株非結核分枝桿菌。

109株以晶片偵測為結核分枝桿菌群(M.tuberculosis complex)，探針雜合結果如第三圖(B)中結果所示，且晶片結果與培養結果符合。

4株以晶片偵測同時呈現出M.tuberculosis complex以及 M.intracellulare的雜合結果，對照培養結果4株皆為結核分枝桿菌群(M.tuberculosis complex)。

2株以晶片偵測同時呈現出M.tuberculosis complex以及M.lentiflavum的雜合結果，對照培養結果1株為M.tuberculosis complex以及非結核分枝桿菌(NTM)混生，另1株為無菌落生長。

1株以晶片偵測同時呈現出M.avium以及M.chelonae的雜合結果，而對照培養結果為非結核分枝桿菌(NTM)。

1株以晶片偵測同時呈現出M.abscessus以及M.chelonae的雜合結果，而對照培養結果為非結核分枝桿菌(NTM)。

1株以晶片偵測同時呈現出M.intracellulare以及M.fortuitum的雜合結果，而對照培養結果為非結核分枝桿菌(NTM)。

1株以晶片偵測同時呈現出M.intracellulare以及M.szulgai的雜合結果，而對照培養結果為非結核分枝桿菌(NTM)。

1株以晶片偵測為同時呈現出M.avium以及M.kansasii的雜合結果，而對照培養結果為M.kansasii。

12株以晶片偵測為非結核分枝桿菌，照生化鑑定培養結果有2株為M.fortuitum、M.mucogenicum與M.peregrinum各1株、8株為非結核分枝桿菌(NTM)。其中M.fortuitum結果與晶片結果不一致。

有2株以晶片偵測結果為無訊號，對照培養結果1株為Tsukamurella，另1株為Nocardia。由於兩者皆為細菌，而本晶片並無針對細菌設計專一性探針，故無任何訊號產生。

另以M.mucogenicum臨床菌株、M.flavescens標準菌株ATCC 14474、M.senegalense標準菌株ATCC 35796以及M.terrae標準菌株ATCC 15755運用晶片測試，探針雜合結果如第二圖(B)所示。由於本實驗並無設計上述菌種之專一性探針，故晶片測試結果僅顯示分枝桿菌屬之通用探針有雜合反應。即為如待測菌株非本研究所設計的16種分枝桿菌菌種之中，但亦可藉由分枝桿菌屬之通用探針判斷該菌株為分枝桿菌屬之菌種。

另外表六中的109株M.tuberculosis complex亦運用晶片同時測試是否為立復黴素抗藥菌株，探針雜合結果如第四圖(A)與(B)中所示，晶片結果與藥物敏感性測試結果比對如表七所示，其中15株以晶片測試為立復黴素抗藥菌株，並比對藥物敏感性測試結果有14株為立復黴素抗藥菌株(MTB-RIF resistance)以及1株為異煙肼抗藥菌株(MTB-INH resistance)，其餘94株之晶片測試與培養結果皆為無抗藥性之結核分枝桿菌。

運用分子檢測可快速提供菌種鑑定與抗藥性之分析。而本晶片可快速鑑別16種分枝桿菌，且在鑑定為結核分枝桿菌的同時更可提供是否為立復黴素(RIF)抗藥菌株。對立復黴素(RIF)抗藥則很有可能對異煙肼(INH)也有抗藥反應，若兩者藥物皆抗藥則為多重性抗藥。然而這些訊息將有助於臨床上醫師對於治療病患做適度地調整與規畫。

在此必須說明者為，以上配合圖式所為之詳細描述，僅係為了說明本發明之技術內容及特徵而提供之一實施方式，凡在本發明領域中具有一般通常知識之人，在瞭解本發明之技術內容及特徵之後，於不違背本發明之精神下，所為之種種簡單之修飾、替換或構件之減省，皆應屬於以下所揭示之申請專利範圍之內。

第一圖為非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性晶片之探針排列示意圖。

A1、A6、F1以及F6為雜合控制點，以確認晶片進行雜合反應流程中所用之各項試劑是否有達成其作用。A4為PCR正控制點，以確認PCR流程中所用之各項試劑是否有達成其作用。C6為負控制點，以確認在探針製備時所使用之各項試劑是否有汙染。

B1為偵測M.abscessus之探針位置ABS，此位置點有ABS探針。C1為偵測M.asiaticum之探針位置ASI，此位置點有ASI探針。D1為偵測M.avium spp.avium之探針位置AVI，此位置點有AVI2探針。E1為偵測M.intracellulare之探針位置INT，此位置點有INT4與INT5探針。

A2為偵測M.chelonae之探針位置CHE，此位置點有CHE4探針。B2為偵測M.fortuitum之探針位置FOR，此位置點有FOR2與FOR7探針。C2為偵測M.gordonae之探針位置GOR，此位置點有GOR探針。D2為偵測M.kansasii之探針位置KAN，此位置點有KAN1-1與KAN4探針。E2為偵測M.lentiflavum之探針位置LEN，此位置點有LEN2探針。F2為偵測M.malmoense之探針位置MAL，此位置點有MAL探針。

A3為偵測M.marinum之探針位置MAR，此位置點有MAR探針。B3為偵測M.scrofulaceum之探針位置SCR，此位置點有SCR探針。C3為偵測M.shimodei之探針位置SHI，此位置點有SHI2探針。D3為偵測M.szulgai之探針位置SZU，此位置點有SZU探針。E3為偵測M.xenopi之探針位置XEN，此位置點有XEN探針。F3為偵測Mycobacterium genus之探針位置MYC，此位置點有MYC-a與MYC-c探針。

F5為偵測M.tuberculosis complex之探針位置MTBC，此位置點有MTBC探針。

A5、B5、C5、D5以及E5為M.tuberculosis complex之rpoB野生型(wild type)探針位置RW1-1、RW2-1、RW3-4、RW4-3以及RW5-3，各別點有RW1-1、RW2-1、RW3-4、RW4-3以及RW5-3探針。

C4、D4、E4、B6、D6以及E6為具抗藥性之M.tuberculosis complex之rpoB突變型(mutant)探針位置 RM4-3、RM4-3a、RM5-2a、RM2-3、RM4-2b以及RM5-2b，各別點有RM4-3、RM4-3a、RM5-2a、RM2-3、RM4-2b以及RM5-2b探針。

第二圖(A)為M.abscessus、M.asiaticum、M.avium、M.intracellulare、M.chelonae、M.fortuitum、M.gordonae、M.kansasii以及M.lentiflavum菌種之專一性探針以及分枝桿菌屬通用探針雜合反應結果。

第二圖(B)為M.malmoense、M.marinum、M.scrofulaceum、M.shimoidei、M.szulgai、M.xenopi、M.mucogenicum、M.flavescens M.senegalense以及M.terrae菌種之專一性探針以及分枝桿菌屬通用探針雜合反應結果。

第三圖為M.tuberculosis complex菌種之專一性探針、分枝桿菌屬通用探針以及抗藥性結核分枝桿菌探針雜合反應結果。

第四圖(A)為rpoB基因中胺基酸511與526位置突變之M.tuberculosis complex、rpoB基因中胺基酸516位置突變之M.tuberculosis complex、rpoB基因中胺基酸526位置突變之M.tuberculosis complex專一性探針、分枝桿菌屬通用探針以及抗藥性結核分枝桿菌探針雜合反應結果。

第四圖(B)為rpoB基因中胺基酸526與529位置突變之M.tuberculosis complex、rpoB基因中胺基酸531位置突變之M.tuberculosis complex專一性探針、分枝桿菌屬通用探針以及抗藥性結核分枝桿菌探針雜合反應結果。

<110> 行政院退除役官兵輔導委員會臺中榮民總醫院

<120> 檢測數種非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌及其抗藥性之探針、晶片、套組與方法

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<170> PatentIn version 3.5

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Claims

一種用以檢測分枝桿菌屬(Mycobacterium genus)之探針，係由SEQ ID NO：5所示之核苷酸分子所組成。
一種用以檢測M.avium之專一性探針，係由SEQ ID NO：8所示之核苷酸分子所組成。
一種用以檢測M.fortuitum之專一性探針，係由SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：11所示之核苷酸分子對所組成。
一種用以檢測M.gordonae之專一性探針，係由SEQ ID NO：12所示之核苷酸分子所組成。
一種用以檢測M.intracellulare之專一性探針，係由SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：14所示之核苷酸分子對所組成。
一種用以檢測M.kansasii之專一性探針，係由SEQ ID NO：15以及SEQ ID NO：16所示之核苷酸分子對所組成。
一種用以檢測M.lentiflacum之專一性探針，係由SEQ ID NO：17所示之核苷酸分子所組成。
一種用以檢測M.shimodei之專一性探針，係由SEQ ID NO：21所示之核苷酸分子所組成。
一種用以檢測分枝桿菌之方法，包含有下列步驟： (a)從一樣本中增幅出16S-23S rRNA ITS基因；(b)提供一探針與步驟(a)之產物進行雜合反應，該探針係選自由下列核甘酸分子所組成之群組：SEQ ID NO：5、8、10、11、12、13、14、15、16、17、及21；以及(c)測定雜合反應之結果；其中，由SEQ ID NO：5所示之核苷酸分子所組成之該探針係用以檢測分枝桿菌屬(Mycobacterium genus)；由SEQ ID NO：8所示之核苷酸分子所組成之該探針係用以檢測M.avium；由SEQ ID NO：10以及SEQ ID NO：11所示之核苷酸分子對所組成之該探針係用以檢測M.fortuitum；由SEQ ID NO：12所示之核苷酸分子所組成之該探針係用以檢測M.gordonae；由SEQ ID NO：13以及SEQ ID NO：14所示之核苷酸分子對所組成之該探針係用以檢測M.intracellulare；由SEQ ID NO：15以及SEQ ID NO：16所示之核苷酸分子對所組成之該探針係用以檢測M.kansasii；由SEQ ID NO：17所示之核苷酸分子所組成之該探針係用以檢測M.lentiflavum；以及由SEQ ID NO：21所示之核苷酸分子所組成之該探針係用以檢測M.shimodei。