TWI691511B - 抗人類Ｎｏｔｃｈ４抗體 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種對於人類Notch4可具有中和活性之抗人類Notch4抗體或其Notch4結合片段、及含有該等作為有效成分之醫藥組合物。
本發明者等人獲取對於人類Notch4具有高中和活性及結合親和性之小鼠抗人類Notch4抗體，並特定出該小鼠抗人類Notch4抗體之互補決定區(CDR)之序列。藉此，可製作於重鏈及輕鏈之可變區包含上述小鼠抗人類Notch4抗體之CDR序列的人類化抗體。
Description
本發明係關於一種與人類Notch4結合之抗體。
Notch係有助於決定各種組織細胞之命運之分子，揭示有於初期發生時期、胚胎期、出生後之各階段參與分化、增殖、生存等。作為Notch家族，報告有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4之4種受體、及Jagged1、Jagged2、DLL1、DLL3、DLL4之5種配體。藉由在鄰接之細胞上表現之Notch受體與Notch配體結合，將受體之細胞外區域下部所存在之NRR區域藉由TACE切斷，藉由由此所引起之細胞內區域之結構變化，將細胞內區域利用γ分泌酶(secretase)切斷。該結果所形成之Notch胞內結構(NIC)域轉移至核內，與轉錄因子CSL形成異二聚物，表現誘導Hes家族或Hey家族等靶分子。該等下游分子進而表現誘導各種基因，結果Notch訊號有助於幹細胞或前驅細胞之維持、分化、細胞週期停滯、細胞命運決定等(非專利文獻1)。
已知有Notch亦參與腫瘤形成。最初報告有因t(7；9)染色體易位所引起之Notch1變異與前T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)之發病有關。又，報告有作為自然腫瘤發病模型之小鼠乳癌病毒(MMTV)之基因組插入部位為Int3(Notch4細胞內區域)，報告有於使Int3強制表現之轉基因小鼠中引起乳癌或唾液腺癌等上皮細胞癌(非專利文獻2)。報告有Notch4對於人類亦參與乳癌(非專利文獻3)、黑色素瘤(非專利文
獻4)、胃癌(非專利文獻5)、B細胞性急性淋巴性白血病(B-ALL)(非專利文獻6)、慢性淋巴性白血病(CLL)(非專利文獻7)、神經膠質瘤(非專利文獻8)、肝細胞癌(非專利文獻9)、肺癌(非專利文獻10)、腎癌(非專利文獻11)、卡波西氏肉瘤(非專利文獻12)等之致癌、進行或轉移。
Notch訊號亦有助於腫瘤內血管新生。於血管內皮細胞中，表現Notch1、Notch4作為Notch受體，作為配體，確認到DLL4、Jagged1之表現。位於新生血管之前端之尖端細胞(Tip cell)因VEGF刺激而高表現DLL4，使訊號進入鄰接之柄細胞之Notch受體，藉此發生血管伸長。另一方面，Jagged1與DLL4爭奪Notch受體，而抑制DLL4與Notch受體之結合。由於來自Jagged1之訊號與DLL4相比較弱，故而藉由與Jagged1之結合而抑制Notch訊號。藉由該兩種配體之空間上不同之表現模式而調整Notch訊號之強弱，從而控制血管新生(非專利文獻13)。
關於DLL4抑制抗體，已有製作報告，若使用DLL4抑制抗體而抑制來自DLL4之訊號，則於腫瘤內部無血流之未成熟之血管會更新，而誘導腫瘤增殖抑制。其與VEGF抑制劑抑制血管內皮細胞之增殖而抑制血管形成之現象完全不同，Notch訊號作為新的血管新生抑制劑之標靶而備受關注(非專利文獻14)。
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本發明之課題在於提供一種對於人類Notch4可具有中和活性之抗人類Notch4抗體或其Notch4結合片段、及含有該等作為有效成分之醫藥組合物。
本發明者等人為了解決上述問題而反覆進行努力研究，結果成功獲取對於人類Notch4具有較高之中和活性及結合親和性之小鼠抗人類Notch4抗體。並且，本發明者等人藉由特定出該小鼠抗人類Notch4抗體之互補決定區(complementarity determining regions：CDR)之序列，而可製作於重鏈及輕鏈之可變區包含上述小鼠抗人類Notch4抗體之CDR序列之人類化抗體，從而完成本發明。
即，本發明於一實施形態中係關於以下之發明。
(1)一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其包含：(a)包含序列編號15或序列編號16之胺基酸序列之重鏈CDR1；
(b)包含序列編號17或序列編號18之胺基酸序列之重鏈CDR2；(c)包含序列編號19之胺基酸序列之重鏈CDR3；(d)包含序列編號20之胺基酸序列之輕鏈CDR1；(e)包含序列編號21之胺基酸序列之輕鏈CDR2；及(f)包含序列編號22之胺基酸序列之輕鏈CDR3。
(2)如(1)中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，且選自以下之(i)~(vii)之任一者中：(i)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；(ii)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；(iii)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列的抗體；(iv)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號49之胺基酸序列的抗體；(v)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號51之胺基酸序列的抗體；(vi)上述重鏈之可變區包含序列編號39之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；及(vii)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列的抗體。
(3)如(2)中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(4)如(2)中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(5)如(2)中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列。
(6)如(2)中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號49之胺基酸序列。
(7)如(2)中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號51之胺基酸序列。
(8)如(2)中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號39之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(9)如(2)中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列。
(10)如(1)至(9)中任一項所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之恆定區、及上述輕鏈之恆定區包含源自人類抗體之序列。
(11)如(10)中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中重鏈之恆定區包含人類IgG之恆定區。
(12)如(11)中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述人類IgG之恆定區為人類IgG2之恆定區。
(13)如(12)中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述人類IgG2之恆定區具有V234A及/或G237A之變異。
(14)如(10)中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中將上述重鏈之恆定區之羧基末端之離胺酸殘基人工地去除。
(15)如(10)中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述輕鏈之恆定區包含人類Igκ之恆定區。
(16)一種醫藥組合物，其包含如(1)至(15)中任一項所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段。
(17)如(16)中所記載之醫藥組合物，其進而包含製藥學上容許之載體。
(18)如(17)中所記載之醫藥組合物，其用於治療非小細胞肺癌。
(19)如(17)中所記載之醫藥組合物，其用於治療甲狀腺癌。
(20)如(17)中所記載之醫藥組合物，其用於治療攝護腺癌。
(21)如(17)中所記載之醫藥組合物，其用於治療肝細胞癌。
又，本發明於另一實施形態中係關於以下之發明。
(1')一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，且選自以下之(i)~(vii)之任一者中：(i)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；(ii)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；
(iii)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列的抗體；(iv)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號49之胺基酸序列的抗體；(v)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號51之胺基酸序列的抗體；(vi)上述重鏈之可變區包含序列編號39之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；及(vii)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列的抗體。
(2')如(1')中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(3')如(1')中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(4')如(1')中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列。
(5')如(1')中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號49之胺基酸序列。
(6')如(1')中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號51之胺基酸序列。
(7')如(1')中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號39之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(8')如(1')中所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列。
(9')如(1')至(8')中任一項所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之恆定區、及上述輕鏈之恆定區包含源自人類抗體之序列。
(10')如(9')中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中重鏈之恆定區包含人類IgG之恆定區。
(11')如(10')中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述人類IgG之恆定區為人類IgG2之恆定區。
(12')如(11')中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述人類IgG2之恆定區具有V234A及/或G237A之變異。
(13')如(9')中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中將上述重鏈之恆定區之羧基末端之離胺酸殘基人工地去除。
(14')如(9')中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述輕鏈之恆定區包含人類Igκ之恆定區。
(15')一種醫藥組合物，其包含如(1')至(14')中任一項所記載之抗
Notch4抗體或其Notch4結合片段。
(16')如(15')中所記載之醫藥組合物，其進而包含製藥學上容許之載體。
(17')如(16')中所記載之醫藥組合物，其用於治療非小細胞肺癌。
(18')如(16')中所記載之醫藥組合物，其用於治療甲狀腺癌。
(19')如(16')中所記載之醫藥組合物，其用於治療攝護腺癌。
(20')如(16')中所記載之醫藥組合物，其用於治療肝細胞癌。
進而，本發明於另一實施形態中係關於以下之發明。
(1")一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(2")一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(3")一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列。
(4")一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號49之胺基酸序列。
(5")一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號51之胺基酸序列。
(6")一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號39之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
(7")一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列。
(8")如(1")至(7")中任一項所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之恆定區、及上述輕鏈之恆定區包含源自人類抗體之序列。
(9")如(8")中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中重鏈之恆定區包含人類IgG之恆定區。
(10")如(9")中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述人類IgG之恆定區為人類IgG2之恆定區。
(11")如(10")中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述人類IgG2之恆定區具有V234A及/或G237A之變異。
(12")如(10")中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中將上述重鏈之恆定區之羧基末端之離胺酸殘基人工地去除。
(13")如(8")中所記載之抗體或其Notch4結合片段，其中上述輕鏈之恆定區包含人類Igκ之恆定區。
(14")一種醫藥組合物，其包含如(1")至(13")中任一項所記載之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段。
(15")如(14")中所記載之醫藥組合物，其進而包含製藥學上容許之載體。
(16")如(15")中所記載之醫藥組合物，其用於治療非小細胞肺癌。
(17")如(15")中所記載之醫藥組合物，其用於治療甲狀腺癌。
(18")如(15")中所記載之醫藥組合物，其用於治療攝護腺癌。
(19")如(15")中所記載之醫藥組合物，其用於治療肝細胞癌。
上述所列舉之本發明之特徵之一或將複數個任意組合而成之發
明亦包含於本發明之範圍中。
圖1表示抗體B之濃度與相對發光(%)之值之關係。
圖2表示Calu6皮下移植模型中之抗體B之抗腫瘤效果及血液灌注抑制效果。圖2A表示於Calu6皮下移植模型中以10mg/kg尾靜脈投予有對照IgG、或以1、3或10mg/kg尾靜脈投予有抗體B之各群中之相對腫瘤體積(RTV)之變化(N=8，平均±標準誤差)。圖2B表示對投予試驗結束時(Day 8)所採樣之腫瘤之Hoechst之螢光面積進行定量之結果(N=8平均±標準誤差)(* P<0.05vs對照IgG投予群(Dunnett檢定))。
圖3表示Calu6小鼠皮下移植模型中之藉由抗體B與順鉑之併用所獲得之抗腫瘤效果。對照(未處理)群、抗體B投予群(1週2次尾靜脈投予)、順鉑投予群(尾靜脈投予1次)、抗體B(1週2次尾靜脈投予)+順鉑(尾靜脈投予1次)併用群之相對腫瘤體積(RTV)變化(N=4，平均±標準誤差)(*：P<0.05vs對照群(學生t檢定，Day8，Day24)，#：P<0.05順鉑10mg/kg投予群vs抗體B+順鉑併用群(學生t檢定，Day36))。
圖4表示FTC238人類甲狀腺癌細胞株皮下移植模型中之藉由抗體B與甲磺酸樂伐替尼(Lenvatinib mesilate)之併用所獲得之抗腫瘤效果。對照(未處理)群、抗體B投予群(1週2次尾靜脈投予)、甲磺酸樂伐替尼投予群(1天1次經口投予)、抗體B(1週2次尾靜脈投予)+甲磺酸樂伐替尼(1天1次經口投予)併用群之相對腫瘤體積(RTV)變化(N=5，平均±標準誤差)(*：P<0.05vs對照群(學生t檢定，Day13)，#：P<0.05單劑投予群vs抗體B+甲磺酸樂伐替尼併用群(學生t檢定，Day13))。
圖5表示DU145人類攝護腺癌細胞株皮下移植模型中之藉由抗體B與紫杉醇之併用所獲得之抗腫瘤效果。對照(未處理)群、抗體B投予群(1週2次尾靜脈投予)、紫杉醇投予群(1天1次尾靜脈投予5天)、抗體B(1週2次尾靜脈投予)+紫杉醇(1天1次尾靜脈投予5天)併用群之腫瘤
體積(TV)變化(N=4，平均±標準誤差)(*：P<0.05vs對照群(學生t檢定，Day57)，#：P<0.05單劑投予群vs抗體B+紫杉醇併用群(學生t檢定，Day57)。
圖6表示源自人類患者之肝細胞癌皮下移植模型中之藉由抗體B與甲磺酸樂伐替尼之併用所獲得之抗腫瘤效果。對照(3mM HCl投予)群、甲磺酸樂伐替尼(10mg/kg)投予群、甲苯磺酸索拉非尼(30mg/kg)投予群、抗體B(0.5mg/個體)+甲磺酸樂伐替尼(10mg/kg)併用群之腫瘤體積(TV)變化(N=10，平均±標準誤差)(*：P<0.05vs對照群。非配對t檢定，Day13)。
圖7表示抗體B之濃度與相對發光(%)之值之關係。圖表係表示獨立之3次試驗之結果之平均值，誤差杠表示其標準偏差)。
圖8表示覆蓋顯示(overlay display)之抗體B與人類Notch之NRR區域之相互作用之感測圖(sensorgram)。(A)人類Notch1-NRR-SEAP-His，(B)人類Notch2-NRR-SEAP-His，(C)人類Notch3-NRR-SEAP-His，(D)人類Notch4-NRR-SEAP-His。
於本說明書中，抗體可指可經由位於免疫球蛋白分子之可變區之至少1個抗原識別部位與糖質、多核苷酸、脂質、多肽、蛋白質等標靶特異性地結合之免疫球蛋白分子。抗體可指完整體之多株抗體或單株抗體。
抗體可為IgG、IgA或IgM(或該等之亞型)等任意類別，並不限定於特定之類別。根據重鏈(有時亦稱為H鏈)之恆定區之抗體胺基酸序列，將免疫球蛋白分成不同類別。5種主要之免疫球蛋白之類別有IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，該等中之若干例如可進而細分化為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2之亞型(同型)。不同類別之免疫球蛋白所對應之重鏈之恆定區分別稱為α、δ、ε、γ及μ。又，抗體之
輕鏈(有時亦稱為L鏈)之種類中存在λ鏈及κ鏈。
於一態樣中，本發明之抗人類Notch4抗體可為IgG抗體，例如可為IgG1抗體或IgG2抗體等。又，本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可視情形為單體、二聚物或多聚物之形態。
於本說明書中，抗體之抗原結合片段只要為該抗體之功能性、結構性片段且保持該抗體對於可結合之抗原之結合性者，則無特別限定。作為抗體之抗原結合片段之例，並無限定，可列舉：Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、單鏈(ScFv)、其等之變異體、包含抗體部分之融合蛋白、及包含抗原識別部位之免疫球蛋白分子之其他修飾結構體等。
抗體之抗原結合片段例如可經由完整之抗體之蛋白質消化而獲得，或者亦可利用重組宿主細胞(例如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞等真核生物、或大腸桿菌等原核生物)而直接產生。例如可藉由自大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段並以化學方式使其結合而形成F(ab')2片段。又，F(ab')2亦可使用促進F(ab')2分子之組裝之白胺酸拉鏈GCN4而使之形成。又，於利用化學合成技術生產scFv之情形時，可使用自動合成機。於利用基因重組技術生產scFv之情形時，可將包含編碼scFv之多核苷酸之適當之質體導入至適當之宿主細胞(例如酵母細胞、植物細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞等真核生物、或大腸桿菌等原核生物)中。編碼目標scFv之多核苷酸可藉由多核苷酸之連接等眾所周知之操作而製作。結果所產生之scFv可使用該技術領域中公知之標準之蛋白質精製技術進行單離。
抗體之可變區可意指抗體輕鏈之可變區及/或抗體重鏈之可變區，抗體之恆定區可意指抗體輕鏈之恆定區及/或抗體重鏈之恆定區。重鏈及輕鏈之可變區分別包含利用亦作為超可變區而已知之3個CDR進行連結之4個構架區(FR)。各鏈中之CDR係利用FR而保持於附
近，與另一鏈中之CDR一併有助於抗體之抗原結合部位之形成。作為用以決定CDR之技術並無限定，例如可列舉：(1)基於異種間序列可變性之方法(例如Kabat et al,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,1991,National Institutes of Health,Bethesda MD)；及(2)基於抗原-抗體複合體之結晶結構學研究之方法(Al-lazikani et al.,1997 J.Molec.Biol.273：927-948)。亦可將該等方法、或其他方法組合而使用。
「特異性地結合」之用語係該技術領域中從業者眾所周知之用語，用以確定抗體等與抗原或抗原決定基之特異性結合之方法亦眾所周知。例如理解為與Notch4之抗原決定基特異性地結合之抗體或其抗原結合片段可以大於與其他抗原決定基或非抗原決定基部分結合之親和性、結合活性更迅速及/或更長時間持續地與該Notch4抗原決定基結合。然而，並不排除與第1標靶特異性地結合之抗體或其抗原結合片段會與第2標靶特異性地結合之情況。
單株抗體可意指由實質上均一之抗體群體所獲得之抗體。即，該群體中所包含之各個抗體除了若干有可能存在之天然突變體以外均相同。單株抗體係針對單一抗原部位者，極具特異性。進而，與以不同抗原或不同抗原決定基作為標靶之典型之多株抗體相對照，各單株抗體係以抗原之單一抗原決定基作為標靶者。修飾語「單株」表示由實質上均一之抗體群體所獲得之抗體之特性，不應限定性地理解為必須藉由特定方法而生產抗體。
本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可為嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體、非人類哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔、牛、馬、山羊等)之抗體、或其等之抗原結合片段。嵌合抗體例如為將非人類(例如小鼠或大鼠)抗體之可變區導入至人類抗體之恆定區而成之抗體，例如可指可變區源自非人類抗體且恆定區源自人類抗體之抗體。
人類化抗體例如為將非人類抗體之超可變區(亦稱為互補決定區(complementarity-determining region：CDR)))導入至人類抗體中而成之抗體，例如可指CDR源自非人類抗體且除此以外之抗體區源自人類抗體之抗體。但是，於本發明中，嵌合抗體與人類化抗體之界限並非必須明確，亦可為稱為嵌合抗體或人類化抗體之狀態。
當然，對上述所例示之嵌合抗體或人類化抗體於保持該抗體之功能之狀態下(或者為了附加、提高該抗體之功能)進行適當改變(例如抗體之修飾、或抗體之胺基酸序列之部分之置換、加成、缺失)而成之抗體亦包含於本發明之抗體中。更具體而言，為了提高與標靶結合之抗體之抗體依賴性細胞毒殺活性((Antibody-Dependent Cellular Cytotoxity：ADCC)活性))而利用POTELLIGENT(註冊商標)技術進行改變之抗體、或為了提高抗體之補體依賴性細胞毒殺活性((Complement-Dependent Cytotoxicity：CDC)活性)而利用COMPLEGENT(註冊商標)技術進行改變之抗體、或併用該等技術進行改變之抗體亦包含於本發明之範圍中。又，為了減少由抗體產生細胞所產生之抗體之不均一性，而藉由基因改變等人工方法使位於重鏈之羧基末端(C末端)之離胺酸(Lys)缺失之抗體亦包含於本發明之範圍中。進而，同時兼具具有本發明之抗體之CDR序列之抗體結合部位及與不同抗原結合之抗原結合部位的雙特異性抗體(Kontermann(2012),mAbs 4,182-97)亦包含於本發明之範圍中。
本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可視需要進行修飾。本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之修飾可為對(a)例如摺疊或螺旋構象等在修飾區之胺基酸序列之三維結構；(b)於標靶部位之分子之電荷或疏水性狀態；或(c)對於維持側鏈體積之修飾效果進行改變的修飾，或者亦可為不會明顯觀察到該等變化之修飾。
本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之修飾例如可藉由構成
其之胺基酸殘基之置換、缺失、加成等而達成。
於本說明書中，所謂胺基酸係以其最廣泛之含義使用，不僅包括天然胺基酸、例如絲胺酸(Ser)、天冬醯胺(Asn)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、丙胺酸(Ala)、酪胺酸(Tyr)、甘胺酸(Gly)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺(Gln)、蘇胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)，亦包括胺基酸變異體及衍生物等非天然胺基酸。只要為從業者，則當然會考慮到該廣泛之定義而理解為，作為本說明書中之胺基酸，例如可列舉：L-胺基酸；D-胺基酸；胺基酸變異體、胺基酸衍生物等經化學修飾之胺基酸；正白胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸等在生物體內不會成為蛋白質之構成材料的胺基酸；及具有從業者所公知之胺基酸之特性的化學合成之化合物等。作為非天然胺基酸之例，可列舉：α-甲基胺基酸(α-甲基丙胺酸等)、D-胺基酸(D-天冬胺酸、D-麩胺酸等)、組胺酸樣之胺基酸(2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、α-氟甲基-組胺酸、α-甲基-組胺酸等)、於側鏈具有多餘之亞甲基之胺基酸(「高」胺基酸)及側鏈中之羧酸官能基胺基酸被取代為磺酸基之胺基酸(氧化半胱胺酸等)等。
天然存在之胺基酸殘基例如可根據一般之側鏈特性而分為以下群組：(1)疏水性：Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；(5)對鏈配向產生影響之殘基：Gly、Pro；及(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
構成抗體或其抗原結合片段之胺基酸序列之非保存性置換可藉由將屬於該等群組之一之胺基酸與屬於其他群組之胺基酸交換而進行。更保存性之置換可藉由將屬於該等群組之一之胺基酸與同一群組之其他胺基酸交換而進行。同樣地，亦可適當進行胺基酸序列之缺失或置換。
作為構成抗體或其抗原結合片段之胺基酸之修飾，例如可為利用糖之糖基化、乙醯化或磷酸化等轉譯後修飾。抗體可於其恆定區中之保存位置進行糖基化。抗體之糖基化通常為N-結合型或O-結合型之任一者。N-結合型意指對於天冬醯胺殘基之側鏈之糖質部分之結合。作為三肽序列之天冬醯胺-X-絲胺酸、天冬醯胺-X-蘇胺酸、及天冬醯胺-X-半胱胺酸(式中，X為除脯胺酸以外之任意胺基酸)為用於以酶方式加成對於天冬醯胺側鏈之糖質部分之識別序列。藉由該等三肽序列之任一者存在於抗體或其抗原結合片段中，而存在潛在性之糖基化部位。O-結合型糖基化可為N-乙醯基半乳胺糖、半乳糖、或木糖之任一者與羥基胺基酸(例如絲胺酸或蘇胺酸)之結合，視情形亦可為與5-羥基脯胺酸或5-羥基離胺酸之結合。從業者可根據目的而適當選擇糖基化之條件(於使用生物學方法進行糖基化之情形時，例如為宿主細胞或細胞培養基之種類、pH值等)。
本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可進而基於從業者所公知之技術常識，藉由其他修飾方法單獨或組合進行修飾。
本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可藉由從業者眾所周知之方法而產生。例如可使用產生本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之融合瘤而產生抗體，或者，亦可藉由將編碼本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之基因組人至表現載體中並將該表現載體導入至大腸桿菌細胞、猴COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞等中而產生抗體。
本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可為依據從業者所公知之方法進行單離或精製而成者。此處，「單離」或「精製」意指從自然之狀態人工地進行單離或精製。於分子或組合物為自然產生者之情形時，其發生變化或自原本之環境中被去除、或為該兩者時為「單離」或「精製」。作為單離或精製之方法之例，可列舉：電泳、分子生物學、免疫學或層析之方法等，具體而言，可列舉：離子交換層析、疏水性層析、或逆相HPLC層析、或等電點電泳等，但並不限定於該等。
測定抗體或其抗原結合片段與抗原之結合特性(例如結合親和性及種交叉反應性)之方法可使用該技術領域中從業者所公知之方法。例如結合親和性可使用Biacore(註冊商標)生物感測器、KinExA生物感測器、閃爍接近分析法、ELISA、ORIGEN免疫測定法(IGEN公司)、流式細胞儀、螢光消光、螢光轉移、酵母顯示及/或免疫染色進行測定，但並不限定於該等。抗體或其抗原結合片段對於Notch4與其配體之結合的中和活性可使用Biacore(註冊商標)生物感測器、ELISA及/或流式細胞儀進行測定，但並不限定於該等。抗體或其抗原結合片段對於Notch4藉由其配體之結合而於人類生物體內誘導之訊號傳遞、或細胞之分子表現應答或功能性變化的中和活性例如可藉由如下所述之方法進行測定，但並不限定於該等：(i)藉由報導分析所進行之Notch訊號下游分子之表現變動之檢測；(ii)藉由西方墨點法所進行之利用TNF-α轉化酶(TACE)或γ分泌酶之Notch4之切斷之檢測；(iii)藉由免疫細胞染色所進行之Notch細胞內區域(NIC)之核內轉移之檢測；(iv)使用表現Notch4之血管內皮細胞等正常細胞或癌細胞之細胞功能性評價。
於一態樣中，本發明可為一種醫藥組合物，其包含本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段。
包含本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物可以水性或乾燥製劑之形式進而包含製藥學上容許之載體、賦形劑及/或穩定劑。於所容許之載體、賦形劑、或穩定劑中，例如包含生理鹽水；如磷酸、檸檬酸、及其他有機酸之緩衝液；包含抗壞血酸之抗氧化劑；低分子量多肽；蛋白質(例如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白)；如聚乙烯吡咯啶酮之親水性聚合物；胺基酸；包含葡萄糖、甘露糖、或糊精類之單糖類、二糖類、及其他碳水化合物；如EDTA之螯合劑；如甘露糖醇或山梨糖醇之糖醇類；如鈉般之形成鹽之抗衡離子；或如TWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、或PEG之非離子性界面活性劑。
包含本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物例如可封入至微膠囊內、膠體性藥物傳遞體系(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子、或奈米膠囊)內、或巨乳液內。於對於具有適於需要投予抗體之任一疾病之釋出特性之製劑期待抗體之持續釋出投予之情形時，可實現抗體之微膠囊化。持續釋出基質之例包括：聚酯、水凝膠(例如聚(甲基丙烯酸2-羥基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸類、L-麩胺酸與γ乙基-L-麩胺酸鹽之共聚物、非分解性乙烯-乙酸乙烯酯、如LUPRON DEPOT(商標)之分解性乳酸-乙醇酸共聚物(包含乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林之注射用微球體)、及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。
用於活體內(in vivo)投予之製劑必須為無菌。其係藉由通過無菌過濾膜之過濾而容易地達成。
包含本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物有對非小細胞肺癌、甲狀腺癌、攝護腺癌或肝細胞癌之治療有用之可能性。即，於另一態樣中，本發明可為一種非小細胞肺癌、甲狀腺癌、攝護腺癌或肝細胞癌之治療方法，其包括將治療上有效量之本發明之
抗Notch4抗體或其抗原結合片段投予對象之步驟。又，於另一態樣中，本發明亦可為一種本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製造非小細胞肺癌、甲狀腺癌、攝護腺癌或肝細胞癌之治療藥。
用於治療非小細胞肺癌、甲狀腺癌、攝護腺癌或肝細胞癌之本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段較佳為識別Notch4之細胞外區域之抗體。例如本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可為與序列編號1所表示之人類Notch4之胺基酸序列中之24~1447位之任一部位特異性地結合之抗體或其抗原結合片段。再者，於序列編號1所表示之人類Notch4之胺基酸序列中，1~23位為訊號序列，1448~2003位為跨膜區域及細胞內區域。
本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可於治療法中單獨使用，或與其他藥劑或組合物併用。例如本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段可與其他抗癌劑同時或異時投予。於此種併用療法中，包含併用投予(於相同或不同之製劑中包含2種以上之藥劑)及分離投予(例如同時或連續地)。於分別投予2種以上之藥劑之情形時，本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之投予可於附隨之治療法之前進行，或繼而進行。可與本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段併用之抗癌劑例如可為對非小細胞肺癌、甲狀腺癌、攝護腺癌或肝細胞癌之治療有效之抗癌劑。作為此種抗癌劑，例如可列舉：順鉑、樂伐替尼、紫杉醇，但並不限定於該等。作為用於併用療法之醫藥組合物之例，可列舉：含有本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段及順鉑之醫藥組合物、含有本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段及樂伐替尼之醫藥組合物、以及含有本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段及紫杉醇之醫藥組合物，但並不限定於該等。
投予包含本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物
之對象並無限定，例如可對哺乳動物(人類、豬、牛、猴、狒狒、狗、貓、大鼠、小鼠等)使用本發明。但是，於人類不宜作為對象之情形時，亦可將其自對象中去除。
將包含本發明之抗Notch4抗體或其抗原結合片段之醫藥組合物投予對象之方法(投予途徑、投予量、1天之投予次數、投予之時序等)並無限定，從業者(例如醫生)可根據對象之健康狀態、疾病之程度、所併用之藥劑之種類等而適當決定。
從業者理解，只要於技術上不矛盾，則可實施本說明書中所記載之所有態樣之任意一個或將複數個適當組合而實施本發明。進而，從業者理解，只要於技術上不矛盾，則較佳為將本說明書中所記載之較佳或有利之所有態樣適當組合而實施本發明。
本說明書中所引用之文獻應視為藉由參照而將其等之全部揭示內容明確地援用於本說明書中，可理解從業者可依據本說明書之上下文，於不脫離本發明之精神及範圍之情況下將其等文獻中之相關揭示內容作為本說明書之一部分加以援用。
本說明書中所引用之文獻僅係為了揭示本申請案之申請日前之相關技術而提供，不得解釋為本發明者等人根據先前發明或任意其他理由而自認不具有先行於該揭示之權利。該等文獻之全部記述係基於本申請人可獲取之資訊，絲毫不構成本申請人認為該等記述內容正確。
本說明書中所使用之用語係用於說明特定之實施態樣，並非意在限定發明。
本說明書中所使用之「包含(comprise)」之用語除上下文上應作明顯不同之理解之情形以外，意指存在所記載之事項(構件、步驟、要素或數字等)，不排除存在其以外之事項(構件、步驟、要素或數字等)。「包含(consist of)」之用語包括以「包含(consist of)」及/或「實
質上包含(consist essentially of)」之用語所記載之態樣。
本說明書中所使用之「中和活性」之用語意指抑制Notch4與其配體之結合之活性及/或抑制Notch4藉由其配體之結合而於人類生物體內誘導之訊號傳遞、或細胞之分子表現應答或功能性變化的活性。
只要無不同之定義，則本文中所使用之全部用語(包括技術用語及科學用語)具有與本發明所屬之技術之從業者廣泛理解之含義相同之含義。本文中所使用之用語只要未明示不同之定義，則應解釋為具有與本說明書及相關技術領域中之含義一致之含義，不應理想化，或過度地以形式含義加以解釋。
第1、第2等用語係用以表述各種要素，可理解該等要素不應受該等用語本身所限定。該等用語僅用於將一種要素與其他要素區分，例如可於不脫離本發明之範圍之情況下將第1要素記為第2要素，同樣地，將第2要素記為第1要素。
於本說明書中，用以表示成分含量或數值範圍等之數值只要未特別明示，則應理解為以用語「約」修飾。例如所謂「4℃」，只要未特別明示，則理解為意指「約4℃」，當然從業者可根據技術常識及本說明書之文意而合理地理解其程度。
除上下文上明確地表示其他含義之情形以外，於在本說明書及申請專利範圍中使用之情形時，可理解以單數形式表示之各態樣只要於技術上不矛盾，則亦可以複數形式表示，反之亦然。
以下，參照實施例更詳細地說明本發明。但是，本發明可藉由各種態樣而具體化，不得解釋為限定於本文中所記載之實施例。相關技術領域之從業者可於不變更本發明之精神或範圍之情況下伴隨各種改變、附加、缺失、置換等而實施本發明。
實施例1：抗人類Notch4單株抗體之製作
小鼠抗人類Notch4單株抗體之製作
為了製作針對人類Notch4(Genbank Accession No.NP_004548.3)(序列編號1)之單株抗體，將使分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)及組胺酸標籤融合而成之人類Notch4之3個EGF重複序列及陰性控制區(negative regulatory region：NRR)(序列編號1之1046~1445位)(以下稱為「人類Notch4 3EGF-NRR-SEAP-His」)免疫Balb/c小鼠。
人類Notch4 3EGF-NRR-SEAP-His蛋白質係藉由以下步驟而製備：首先，構建pcDNA3.1-人類Notch4 3EGF-NRR-SEAP-His表現載體。人類Notch4之3個EGF重複序列及NRR係藉由PCR而擴增，次選殖至具有Igκ訊號序列、編碼SEAP及組胺酸標籤之DNA序列之pcDNA3.1(Invitrogen/LifeTechnologies)之SfiI/NotI部位。其次，將pcDNA3.1-人類Notch4 3EGF-NRR-SEAP-His表現載體藉由TransIT-LT1(TAKARA)轉染至HEK293EBNA細胞(Invitrogen/LifeTechnologies)。培養(5%CO2，37℃)6天後，回收培養上清液。使用Protino管柱(MACHEREY-NAGEL)將人類Notch4 3EGF-NRR-SEAP-His蛋白質進行精製。
將20μg之上述人類Notch4 3EGF-NRR-SEAP-His蛋白質與同量之GERBU佐劑(GERBU Biotechnik GmbH)混合，皮下注射至Balb/c小鼠之足蹠。於第3天、第7天、及第10天追加3次注射投予。次日，將小鼠處死(sacrificed)，並回收末梢淋巴結。然後，將各末梢淋巴結之一半移植至SCID小鼠。淋巴結細胞係由各淋巴結之剩餘一半所製備，於GenomeONE-CF(Ishihara Sangyo Kaisha,Ltd.)之存在下以5：1之比率與P3U1骨髓瘤細胞融合。上述融合細胞係於96孔塑膠板上進行培養。培養(5%CO2，37℃)7天後，回收培養上清液。
於移植當天及移植6天後將10μg之人類Notch4 3EGF-NRR-SEAP-
His蛋白質靜脈內投予至被移植上述淋巴結之SCID小鼠。於最終免疫之3天後，回收末梢淋巴結細胞，如上所述般融合並培養。
藉由上述步驟而獲得8個純系之小鼠單株抗體。自該等中，以Notch4特異性訊號抑制活性、與小鼠Notch4及人類Notch4之結合活性為基準，選擇最佳之前導抗體(6-3-A6)。
小鼠抗人類Notch4單株抗體(6-3-A6)之序列解析
藉由5'-RACE(5'-rapid amplification of cDNA ends)法使編碼純系6-3-A6之重鏈及輕鏈之DNA序列擴增。使用TRIZOL(Invitrogen/LifeTechnologies)由上述融合瘤製備總RNA，並利用DNase(QIAGEN，RNase free DNase set)進行處理。使用cDNA合成套組(TAKARA)，由上述總RNA製備雙鏈cDNA。對上述cDNA加成藉由ad29S(ACATCACTCCGT(序列編號2))及ad29AS(ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT(序列編號3))之退火所獲得之5'銜接子(adaptor)。藉由5'正向引子(5'-PCR4 primer，AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG(序列編號4))及3'反向引子(小鼠IgG1重鏈之擴增係使用GCCAGTGGATAGACTGATGG(序列編號5)，小鼠Igκ輕鏈之擴增係使用GATGGATACAGTTGGTGCAGC(序列編號6))使所獲得之cDNA擴增。將上述擴增後之cDNA插入至pCR2.1載體(Invitrogen/LifeTechnologies)中。使用ABI3130XL對基因序列進行解析。將藉由該解析而鑑定之基因序列所編碼之胺基酸序列示於以下之表。
嵌合抗人類Notch4抗體及人類化抗人類Notch4抗體之製備
藉由重疊延伸PCR(overlapping extension PCR)，作為重鏈，使6-3-A6之重鏈可變區之基因序列及具有V234A及G237A變異之人類IgG2之恆定區之基因序列結合，作為輕鏈，使6-3-A6之輕鏈可變區之基因序列及人類Igκ之恆定區之基因序列結合，而製備編碼嵌合抗體之DNA序列。此處所謂「V234A」表示將234位之纈胺酸置換為丙胺酸之變異，所謂「G237A」表示將237位之甘胺酸置換為丙胺酸之變異。將結果所獲得之序列插入至表現載體(重鏈為pEE6.4，輕鏈為pEE12.4,Lonza)中。將嵌合抗體之胺基酸序列及核苷酸序列示於以下之表。
藉由將小鼠抗體6-3-A6之CDR移植至人類抗體之可變區，而將抗體人類化。對於上述CDR，首先依據Kabat之編號系統(Kabat numbering system)，使用Abysis軟體(來自UCL之許可)對小鼠抗體6-3-A6之胺基酸序列進行編號，根據該編號，依據用以鑑定CDR之Kabat之定義(Kabat definition)、或AbM之定義法(AbM definition method)而確定。將6-3-A6之CDR之胺基酸序列及核苷酸序列示於以下之表。
根據對於6-3-A6之構架區(Framework region：FR)之較高之同源性，關於人類抗體之FR，對輕鏈選擇IGKV1-27* 1或IGKV3-15* 1、及JK1且對重鏈選擇IGHV3-64* 01及JH4作為人類化抗體之FR。其後，使用小鼠6-3-A6之3D結構預測模型，預測與CDR之胺基酸相互作用之FR中之胺基酸，與CDR一併進行移植。分別使用具有V234A及G237A變異且具有C末端離胺酸殘基或不具有C末端離胺酸殘基之人類IgG2之恆定區、及人類Igκ作為重鏈及輕鏈之恆定區。HK1、HK2、及HK3係作為移植有藉由Kabat之定義方法所決定之CDR之人類化抗體之重鏈而設計，HA1及HA2係作為移植有藉由AbM之定義方法所決定之CDR之人類化抗體之重鏈而設計，L1、L2、及L5係作為使用IGKV1-27* 1及JK1之人類化抗體之輕鏈而設計，L3、L4、及L6係作為使用IGKV3-15* 1及JK1之人類化抗體之輕鏈而設計。以下之
表係表示人類化抗體之可變區、具有V234A及G237A變異且具有C末端離胺酸殘基或不具有C末端離胺酸殘基之人類IgG2之恆定區、及人類Igκ之胺基酸序列及核苷酸序列。
利用GenScript USA Inc.而合成該等人類化抗體之可變區之基因序列，並插入至包含編碼具有C末端離胺酸或不具有C末端離胺酸之人類IgG2之恆定區、或人類Igκ之恆定區之DNA序列之pcDNA3.3(Invitrogen)中。為了產生抗體，使用FreeStyle 293表現系統(Invitrogen)，將上述表現載體轉染至FreeStyle 293-F細胞(Invitrogen)。回收上清液，並使用Protein A(GE Healthcare)進行精製。
將人類化抗體之全長(可變區+恆定區)之基因序列同樣地最佳化，利用GenScript USA Inc.而完全地合成，將重鏈插入至pEE6.4，
將輕鏈插人至pEE12.4(Lonza)。為了產生抗體，藉由上述方式使用該等表現載體。將人類化抗體之最佳化之核苷酸序列示於以下之表。
表22人類化抗人類Notch4抗體重鏈之最佳化之核酸序列(HK3可變區、及具有V234A及G237A變異且不具有C末端離胺酸之人類IgG2恆定區)
表25
於以下之實施例中，於實施例1中使用包含特定之抗體6-3-A6之CDR之胺基酸序列之抗體進行實驗。
為方便起見，將以下之實施例中所使用之特定之抗體稱為「抗體A(Antibody A)」、「抗體B(Antibody B)」、「抗體C(Antibody C)」、「抗體D(Antibody D)」、「抗體E(Antibody E)」、「抗體F(Antibody F)」及「抗體G(Antibody G)」。
關於抗體A，重鏈可變區包含實施例1中所記載之HK2之重鏈可變區，且輕鏈可變區包含實施例1中所記載之L3之輕鏈可變區。
關於抗體B，重鏈可變區包含實施例1中所記載之HK3之重鏈可變區，且輕鏈可變區包含實施例1中所記載之L3之輕鏈可變區。
關於抗體C，重鏈可變區包含實施例1中所記載之HK2之重鏈可變區，且輕鏈可變區包含實施例1中所記載之L4之輕鏈可變區。
關於抗體D，重鏈可變區包含實施例1中所記載之HK3之重鏈可變區，且輕鏈可變區包含實施例1中所記載之L5之輕鏈可變區。
關於抗體E，重鏈可變區包含實施例1中所記載之HK2之重鏈可變區，且輕鏈可變區包含實施例1中所記載之L6之輕鏈可變區。
關於抗體F，重鏈可變區包含實施例1中所記載之HA2之重鏈可變區，且輕鏈可變區包含實施例1中所記載之L3之輕鏈可變區。
關於抗體G，重鏈可變區包含實施例1中所記載之HK3之重鏈可
變區，且輕鏈可變區包含實施例1中所記載之L4之輕鏈可變區。
再者，於抗體A~G中，位於一般之人類抗體之重鏈之C末端之離胺酸(Lys)缺失。
實施例2：抗人類Notch4抗體之中和活性
使用Notch4-GAL4螢光素酶報導分析對抗人類Notch4抗體(抗體B)之中和活性進行評價。本實驗係如下實驗系統：對於導入有將Notch4之細胞內區域之一部分置換為GAL4 DNA結合區域之改變基因及GAL4 UAS與Luciferase2CP之融合基因表現載體之b.end3細胞株(以下稱為「報導細胞」)，利用作為Notch配體之DLL4施加刺激，對此時之螢光素酶活性進行評價，藉此評價Notch4特異性之訊號傳遞。
利用PBS溶解重組人類DLL4(R&D Systems，1506-D4-050/CF)，而製備10μg/mL之溶液(以下為DLL4溶液)。對平底96孔白板(Greiner，655083)以50μL/well(500ng/well)分注DLL4溶液，對無刺激孔以50μL/well分注PBS，並於4℃下靜置一晚，藉此將DLL4固相化於96孔白板上。使報導細胞懸浮於含有10%胎牛血清(FBS)、青黴素/鏈黴素之D-MEM培養液中，而製備1×105/mL之細胞懸浮液。將固相化有DLL4之各孔利用PBS清洗3次，以50μL/well(5,000個/well)接種細胞懸浮液。分別添加抗人類Notch4抗體稀釋液(最終濃度：0、0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10μg/mL)或人類IgG2 κ(SIGMA，I5404，最終濃度：10μg/mL)各50μL，並於37℃下培養22小時。使用Steady-Glo分析系統(Promega，E2510)如下所述般評價報導細胞之螢光素酶活性。
向培養後之各孔中添加Steady-Glo溶液各100μL並攪拌後，於室溫下靜置30分鐘，使用多功能酶標儀(Envision 2102-0020，Perkin Elmer)測定發光。根據以下之式，由所測得之發光值算出相對發光(%)。
相對發光(%)=(檢體孔之發光強度-無刺激孔之發光強度平均值)/(對照孔之發光強度平均值-無刺激孔之發光強度平均值)
將抗體B之濃度與相對發光(%)之值之關係示於圖1。圖1之圖表係表示獨立之3次試驗之結果之平均值，誤差杠表示其標準偏差)。IC50為0.011μg/mL(95%CI；0.0036-0.034)。
其次，對於包含抗體B之複數個抗人類Notch4抗體(抗體A、抗體B、抗體C、抗體D、抗體E、抗體F及抗體G)進行相同之實驗，測定抗體之中和活性。
利用PBS溶解重組人類DLL4(R&D Systems，1506-D4-050/CF)，而製備10μg/mL之溶液(以下為DLL4溶液)。對平底96孔白板(Greiner，655083)以50μL/well(500ng/well)分注DLL4溶液，對無刺激孔以50μL/well分注PBS，並於4℃下靜置一晚，藉此將DLL4固相化於96孔白板上。使報導細胞懸浮於含有10%胎牛血清(FBS)、青黴素/鏈黴素之D-MEM培養液中，而製備1×105/mL之細胞懸浮液。將固相化有DLL4之各孔利用PBS清洗3次，以50μL/well(5,000個/well)接種細胞懸浮液。分別添加各抗人類Notch4抗體稀釋液(最終濃度：0、10μg/mL)或人類IgG2 κ(SIGMA，I5404，最終濃度：10μg/mL)各50μL，並於37℃下培養22小時。使用Dual luc-Glo分析系統(Promega，E2940)如下所述般評價報導細胞之螢光素酶活性。
向培養後之各孔中添加Dual-Glo螢光酵素受質溶液各100μL並攪拌後，於室溫下靜置20分鐘，使用多功能酶標儀(Envision 2102-0020，Perkin Elmer)測定螢火蟲螢光素酶之發光。又，其次向各孔中添加Dual-Glo Stop & Glo受質溶液各100μL並攪拌後，於室溫下靜置20分鐘，使用多功能酶標儀(Envision 2102-0020，Perkin Elmer)測定海紫羅蘭科螢光素酶發光。由發光值之比算出各孔之相對發光(螢火蟲螢光素酶/海紫羅蘭科螢光素酶)。進而，使用下述之式，由各算
出值算出相對發光(%)，對各抗體之Notch4訊號抑制活性進行評價。
相對發光(%)=(檢體孔之相對發光之平均值-無刺激孔之相對發光之平均值)/(對照孔之相對發光之平均值-無刺激孔之相對發光之平均值)
將各抗體之Notch4訊號抑制活性(以10μg/ml濃度實施試驗)記載於下述表28。
於下述表中，例如「HK2L3(Lys-)」之記載意指用於實驗之人類化抗人類Notch4抗體之重鏈可變區為實施例1中之人類化抗人類Notch4抗體重鏈HK2之重鏈可變區，輕鏈可變區為實施例1中之人類化抗人類Notch4抗體輕鏈L3之輕鏈可變區，且位於一般之人類抗體之重鏈之C末端之離胺酸(Lys)於本抗體中缺失。
實施例3：人類化抗Notch4抗體與重組Notch4-NRR區域蛋白質之結合之動態解析
使用BIACORE實施人類、食蟹猴、小鼠及大鼠之Notch4-NRR區域與抗體B之相互作用之動態解析。抗體B係使用蛋白質A親和層析法自轉染有抗體B之穩定CHO細胞株之培養上清液進行精製。人類、猴、小鼠及大鼠之Notch4-NRR區域係作為分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)與10x組胺酸標籤之融合蛋白而製備。該等蛋白質之基因係於Opti-MEM(INVITROGEN)中使用ExpiFectamine293而轉染至Expi293F細
胞。該等細胞係於Expi293表現培養基(INVITROGEN)中進行培養。簡言之，將細胞稀釋為7.5×107細胞/25.5mL，於第0天利用ExpiFectamine293試劑進行轉染。轉染約16小時後，將150μL之ExpiFectamine293轉染增強劑1及1.5mL之ExpiFectamine293轉染增強劑2添加至各燒瓶中。於第4天回收上清液。該等抗原係使用Ni-NTA Superflow管柱(QIAGEN)進行精製。相互作用係如下所述般進行分析。所精製之抗體B係利用固定於CM5感測片(GE healthcare)上之抗人類IgG Fc抗體進行捕捉。將所精製之Notch4-NRR融合蛋白以8種不同濃度注入至感測片，依據製造業者之說明書而觀察其等之相互作用及解離。
如下所述般實施進一步之抗Notch4抑制人類化抗體之動態解析。使用CHO細胞株使人類Notch4-NRR區域Fc融合蛋白表現。利用固定於CM5感測片上之識別人類Notch4之不同之抗原決定基之抗人類Notch4抗體而捕捉培養上清液中之抗原。然後，將人類化抗人類Notch4抗體以各種濃度注入至感測片。依據製造業者之說明書而算出其相互作用及解離常數。將其結果示於表30。
於下述表中，例如「HK2L3(Lys-)」之記載意指用於實驗之人類化抗人類Notch4抗體之重鏈可變區為實施例1中之人類化抗人類Notch4抗體重鏈HK2之重鏈可變區，輕鏈可變區為實施例1中之人類化抗人類Notch4抗體輕鏈L3之輕鏈可變區，且位於一般之人類抗體之重鏈之C末端之離胺酸(Lys)於本抗體中缺失。無「(Lys-)」之記載者
意指位於人類抗體之重鏈之C末端之Lys未缺失。
利用更多之抗體進行與上述表30相同之實驗，將所獲得之實驗結果示於表31。
實施例4：使用抗人類Notch4抗體之活體內藥理試驗(Calu6皮下移植模型中之抗體B之抗腫瘤效果及血液灌注抑制效果)
將利用含有10%FBS、MEM非必需胺基酸、丙酮酸鈉、青黴素/鏈黴素之EMEM培養液培養之人類非小細胞肺癌細胞株Calu6(ATCC number HTB-56)利用EMEM培養液製備為1.6×108cells/mL濃度，以1：1與Matrigel(商標)(CORNING Cat#354234)混合而製備8.0×107cells/mL之細胞懸浮液。以0.1mL之用量移植至6週齡之裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，雌，Japan Charles River)之右後背部皮下。自移植起28天後使用電子數位游標卡尺(Digimatic TM Caliper，Mitutoyo股份有限公司)測量腫瘤之短徑、長徑，並根據以下之計算式算出腫瘤體積TV(Tumor volume)。
TV(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)/2
根據投予初日之腫瘤體積以腫瘤體積之平均值變得大致相等之方式進行分群。抗體B係於即將投予前以載體液(25mM組胺酸，250mM蔗糖，0.05% Tween80(pH值5.3))與生理鹽水成為1：9之方式進行稀釋，而獲得0.1、0.3、1.0mg/mL之評價檢體(分別為1、3、10mg/kg投予群)。評價檢體係以0.2mL/20g小鼠體重之投予量1週2次(將分群之日設為day1於day1、day4)藉由尾靜脈注射進行投予。對照群係利用PBS將對照IgG(ChromPure人類IgG，完整分子，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Cat# 009-000-003)11.6mg/mL稀釋為1.0mg/mL，並以0.2mL/20g小鼠體重藉由尾靜脈注射進行投予(投予
體積10mg/kg)。實驗係以1群8隻進行。對於對照IgG群、抗體B投予群各者，根據以下之式算出相對腫瘤體積RTV(Relative tumor volume)，並示於圖2A。
RTV=測定日之腫瘤體積/投予開始日之腫瘤體積
於Calu6皮下移植模型中，抗體B於所有用量下顯示出顯著之抗腫瘤效果。
腫瘤之血液灌注係藉由對利用尾靜脈注射之螢光色素(Hoechst)之血管周邊之細胞之核染色所產生之螢光進行定量而評價(Funahashi et al.(2014),Cancer Sci.,105(10),1334-42.)。測定試驗最終日之腫瘤直徑後，利用PBS將Hoechst 33342 10mg/mL(Life technologies Cat#H3570)稀釋2倍，以0.1mL/head尾靜脈注射稀釋後之Hoechst 33342 5.0mg/mL。注射Hoechst 5分鐘後，藉由頸椎脫臼使小鼠安樂死，將所採取之腫瘤包埋於OCT複合物(Sakura Finetek Japan Cat#4583)中，而製作冷凍塊。
將冷凍切片之腫瘤血管利用抗CD31抗體(FITC conjugated，BD Pharmingen Cat#553372)進行免疫螢光染色，並利用BIOREVO螢光顯微鏡(KEYENCE，BZ-9000)對每1腫瘤片拍攝5處腫瘤血管之熱點之Hoechst螢光。利用圖像解析軟體(Lumina Vision ver 2.2.2，三谷商事)對Hoechst陽性面積進行定量，算出各腫瘤片之平均值，並示於圖2B。
於Calu6皮下移植模型中，抗體B於所有用量下顯示出顯著之血液灌注抑制作用。
實施例5：Calu6皮下移植模型中之抗體B與順鉑之併用
將利用含有10%FBS、青黴素/鏈黴素之EMEM培養液培養之人類非小細胞肺癌細胞株Calu6(ATCC number HTB-56)利用EMEM培養液製備為1.2×108cells/mL濃度，以1：1與Matrigel(註冊商標)(CORNING Cat#354234)混合而製備6.0×107cells/mL之細胞懸浮液。以0.1mL之
用量移植至7週齡之裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，雌，Japan Charles River)之右後背部皮下。自移植起27天後使用電子數位游標卡尺(Digimatic TM Caliper，Mitutoyo股份有限公司)測量腫瘤之短徑、長徑，並根據以下之計算式算出腫瘤體積TV(Tumor volume)。
腫瘤體積TV(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)/2
根據投予初日之腫瘤體積以腫瘤體積之平均值變得大致相等之方式進行分群。抗體B係於即將投予前利用PBS將10.34mg/mL溶液(載體：25mM磷酸鹽，200mM海藻糖，0.05% Tween80(pH值5.5))進行稀釋而製備2.5mg/mL溶液，並以0.2mL(500μg)/head之投予量1週2次藉由靜脈注射而投予5週。順鉑係以10mg/kg之用量於投予初日尾靜脈投予1次。實驗係以1群4隻進行。對於對照(未處理)群、抗體B投予群、順鉑投予群、抗體B+順鉑併用群各者，根據以下之式算出相對腫瘤體積RTV(Relative tumor volume)，並示於圖3。
RTV=測定日之腫瘤體積/投予開始日之腫瘤體積
於Calu6皮下移植模型中，抗體B與順鉑之併用與順鉑單劑相比，顯示出顯著優異之抗腫瘤效果。
實施例6：FTC238皮下移植模型中之抗體B與甲磺酸樂伐替尼之併用
將利用含有10%FBS、青黴素/鏈黴素之DMEM/HAM's F12(1：1)培養液培養之人類甲狀腺癌細胞株FTC238(自大日本住友製藥購買)利用DMEM/HAM's F12(1：1)培養液製備為1.2×108cells/mL濃度，以1：1與Matrigel(註冊商標)(CORNING Cat#354234)混合而製備6.0×107cells/mL之細胞懸浮液。以0.1mL之用量移植至7週齡之裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，雌，Japan Charles River)之右側腹皮下。自移植起8天後使用電子數位游標卡尺(Digimatic TM Caliper，Mitutoyo股份有限公司)測量腫瘤之短徑、長徑，並根據以下之計算式
算出腫瘤體積TV(Tumor volume)。
腫瘤體積TV(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)/2
根據投予初日之腫瘤體積以腫瘤體積之平均值變得大致相等之方式進行分群。抗體B係於即將投予前利用載體液將10.8mg/mL抗體B(載體：25mM組胺酸，250mM蔗糖(pH值5.3))進行稀釋而製備2.5mg/mL抗體B，並以0.2mL(500μg)/head之投予量1週2次藉由尾靜脈注射而投予2週。甲磺酸樂伐替尼係以10mg/kg之用量1天1次經口投予12天。實驗係以1群5隻進行。對於對照(未處理)群、抗體B投予群、甲磺酸樂伐替尼投予群、抗體B+甲磺酸樂伐替尼併用群各者，根據以下之式算出相對腫瘤體積RTV(Relative tumor volume)，並示於圖4。
RTV=測定日之腫瘤體積/投予開始日之腫瘤體積
於FTC238皮下移植模型中，抗體B與甲磺酸樂伐替尼之併用與投予抗體B單劑、或甲磺酸樂伐替尼單劑相比，顯示出顯著優異之抗腫瘤效果。
實施例7：DU145皮下移植模型中之小鼠抗體6-3-A6與紫杉醇之併用
將利用含有10%FBS、丙酮酸鈉、2-巰基乙醇、青黴素/鏈黴素之RPMI1640培養液培養之人類攝護腺癌細胞株DU145(ATCC number HTB-81)利用RPMI1640培養液製備為6.0×107cells/mL濃度。以0.1mL之用量移植至6週齡之裸小鼠(CAnN.Cg-Foxnlnu/CrlCrlj，雌，Japan Charles River)之右側腹皮下。自移植起24天後使用電子數位游標卡尺(Digimatic TM Caliper，Mitutoyo股份有限公司)測量腫瘤之短徑、長徑，並根據以下之計算式算出腫瘤體積TV(Tumor volume)。
腫瘤體積TV(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)/2
根據投予初日之腫瘤體積以腫瘤體積之平均值成為大致相等之
方式進行分群。6-3-A6係於即將投予前利用PBS將5.11mg/mL 6-3-A6(載體：PBS)進行稀釋而製備2.5mg/mL 6-3-A6，並以0.2mL(500μg)/head之投予量1週2次藉由尾靜脈注射而投予4週。紫杉醇係以20mg/kg之用量1天1次尾靜脈投予5天。實驗係以1群4隻進行。將對照(未處理)群、6-3-A6投予群、紫杉醇投予群、6-3-A6+紫杉醇併用群各者之腫瘤體積TV示於圖5。
於DU145皮下移植模型中，6-3-A6與紫杉醇之併用與6-3-A6單劑或紫杉醇單劑相比，顯示出顯著優異之抗腫瘤效果。
實施例8：源自人類患者之肝細胞癌皮下移植模型中之抗體B與甲磺酸樂伐替尼之併用
為了調查抗體B對於肝細胞癌(HCC)之抗腫瘤效果，使用作為HuPrime(註冊商標。Crown Bioscience Inc.)源自患者之皮下移植模型之LI0050。LI0050係移植有女性HCC患者之癌組織之模型小鼠，報告有索拉非尼耐性(國際公開公報WO2015/031604)。
自LI0050儲備小鼠採取腫瘤片段，將直徑2-4mm之片段移植至BALB/c裸小鼠之右側腹部之皮下，使腫瘤成長。使用游標卡尺測量腫瘤之短徑、長徑，並根據以下之計算式算出腫瘤體積TV(Tumor volume)。
腫瘤體積TV(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)/2
於平均腫瘤體積達到約192mm3之時點開始治療。根據投予初日之腫瘤體積以腫瘤體積之平均值成為大致相等之方式進行分群。各群包含10隻小鼠，將分群之日設為Day0。自Day0至Day13，各群之小鼠1天1次接受治療。將(i)對照(3mM HCl投予)群、(ii)甲磺酸樂伐替尼(10mg/kg)投予群、(iii)甲苯磺酸索拉非尼(30mg/kg)投予群、及(iv)甲磺酸樂伐替尼(10mg/kg)+抗體B(0.5mg/個體)併用群各者之腫瘤體積TV示於圖6。
抗體B與甲磺酸樂伐替尼之併用與對照群相比，顯示出顯著優異之抗腫瘤效果。
實施例9：抗人類Notch4多株抗體與抗體B之訊號抑制活性之比較
其次，使用Notch4-GAL4螢光素酶報導分析系統，比較多株抗人類Notch4抗體(Santa Cruz，SC8643，以下為N-17)與抗體B之訊號抑制活性。
為了去除N-17中所含有之迭氮化鈉，使用Slide-A-Lyzer(Thermo scientific，66333)，於4℃下利用PBS透析8小時。使用Amicon Ultra(Millipore，UFC503096)將透析後之N-17溶液濃縮後，使用微量分光光度計(Nano Drop，Thermo)測定濃度。
利用PBS溶解重組人類DLL4(R&D Systems，1506-D4-050/CF)，而製備10μg/mL之溶液(以下為DLL4溶液)。對平底96孔白板(Greiner，655083)以50μL/well(500ng/well)分注DLL4溶液，對無刺激孔以50μL/well分注PBS，並於4℃下靜置一晚，藉此將DLL4固相化於96孔白板上。使報導細胞懸浮於含有10%胎牛血清(FBS)、青黴素/鏈黴素之D-MEM培養液中，而製備1×105/mL之細胞懸浮液。將固相化有DLL4之各孔利用PBS清洗3次，以50μL/well(5,000個/well)接種細胞懸浮液。分別添加於透析、濃縮後利用培養液稀釋而成之N-17稀釋液、或抗體B之稀釋液(最終濃度：0、0.01、0.1、1、10μg/mL)各50μL，並於37℃下培養22小時。使用Steady-Glo分析系統(Promega，E2510)如下所述般評價報導細胞之螢光素酶活性。
向培養後之各孔中添加Steady-Glo溶液各100μL並攪拌後，於室溫下靜置30分鐘，使用多功能酶標儀(Envision 2102-0020，Perkin Elmer)測定發光。根據以下之式，由所測得之發光值算出相對發光。
相對發光(%)=(檢體孔之發光強度-無刺激孔之發光強度平均值)/(對照孔之發光強度平均值-無刺激孔之發光強度平均值)
將抗體B之濃度與相對發光(%)之值之關係示於圖7。圖7之圖表係表示獨立之3次試驗之結果之平均值，誤差枉表示其標準偏差)。對於抗體B，確認到訊號抑制活性，對於N-17，未見所研究之濃度範圍內之N-17之Notch4訊號抑制活性。
實施例10：抗體B與重組可溶型人類NotchNRR區域之結合之動力學解析
關於人類Notch之同型(Notch1、Notch2、Notch3及Notch4)之NRR區域與抗體B之相互作用，進行使用BIAcoreT100之動力學解析。抗體B係依序使用蛋白質A親和層析法、CaptoQ陰離子交換層析法及UNOsphereS陽離子交換層析法自抗體B之CHO穩定表現細胞株之培養上清液進行精製。對於人類Notch1NRR區域(Genbank Accession No.017617；序列1307-1733位)、人類Notch2NRR區域(Genbank Accession No.024408；序列1239-1650位)、人類Notch3NRR區域(Genbank Accession No.000435；序列1246-1641位)及人類Notch4NRR區域(Genbank Accession No.NP_004548.3；序列1046-1445位)，製作分泌型鹼性磷酸酶(SEAP)與血凝素(HA)標籤及組胺酸標籤(x10)之融合蛋白後，使用HisTrapTM快速管柱(GE Healthcare)進行精製。藉由以下方法測定抗體B與人類Notch之各同型之NRR區域之相互作用。利用固定於CM5感測片(GE Healthcare)上之抗人類IgG Fc抗體而捕捉所精製之抗體B，將所精製之人類Notch之各同型之NRR區域分別以6種不同濃度注入至感測片，依據操作說明書之指示而測定與抗體之相互作用及解離。
將覆蓋顯示之相互作用感測圖及所算出之動態參數分別示於圖8及表32。
表32所算出之抗體B與人類Notch4-NRR融合蛋白之相互作用之動態參數
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- 一種抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，上述抗體或其Notch4結合片段包含重鏈及輕鏈，且選自以下之(i)~(vii)之任一者中：(i)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；(ii)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；(iii)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列的抗體；(iv)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號49之胺基酸序列的抗體；(v)上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號51之胺基酸序列的抗體；(vi)上述重鏈之可變區包含序列編號39之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列的抗體；及(vii)上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列且上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列的抗體。
- 如請求項1之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中 上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號49之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之可變區包含序列編號33之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號51之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之可變區包含序列編號39之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號45之胺基酸序列。
- 如請求項1之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之可變區包含序列編號35之胺基酸序列，上述輕鏈之可變區包含序列編號47之胺基酸序列。
- 如請求項1至8中任一項之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之恆定區、及上述輕鏈之恆定區包含源自人類抗體之序列。
- 如請求項9之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述重鏈之恆定區包含人類IgG之恆定區。
- 如請求項10之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述人類IgG之恆定區為人類IgG2之恆定區。
- 如請求項11之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述人類IgG2之恆定區具有V234A及/或G237A之變異。
- 如請求項12之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中將上述重鏈之恆定區之羧基末端之離胺酸殘基人工地去除。
- 如請求項13之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段，其中上述輕鏈之恆定區包含人類Igκ之恆定區。
- 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至14中任一項之抗Notch4抗體或其Notch4結合片段。
- 如請求項15之醫藥組合物，其進而包含製藥學上容許之載體。
- 如請求項15或16之醫藥組合物，其用於治療非小細胞肺癌。
- 如請求項15或16之醫藥組合物，其用於治療甲狀腺癌。
- 如請求項15或16之醫藥組合物，其用於治療攝護腺癌。
- 如請求項15或16之醫藥組合物，其用於治療肝細胞癌。
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