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TWI689519B - 以抗原呈獻細胞為標的之癌症疫苗 - Google Patents

以抗原呈獻細胞為標的之癌症疫苗 Download PDF

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TWI689519B
TWI689519B TW105133908A TW105133908A TWI689519B TW I689519 B TWI689519 B TW I689519B TW 105133908 A TW105133908 A TW 105133908A TW 105133908 A TW105133908 A TW 105133908A TW I689519 B TWI689519 B TW I689519B
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TW105133908A
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杰瑞德 蘇洛斯基
杰克斯Ｆ 班傑勒
安妮 羅倫 弗拉瑪
莫尼卡 蒙特斯
彼得 庫卡
赤川桂子
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貝勒研究協會
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Publication date
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Abstract

本發明包括組合物，及表現、分泌之方法，及新穎組合物用作例如疫苗及抗原傳遞載體以傳遞抗原至抗原呈獻細胞之用途。在一個實施例中，載體為抗CD40抗體或其片段，及一或多種抗原肽連接於該抗CD40抗體或其片段(包括人類化抗體)。

Description

以抗原呈獻細胞為標的之癌症疫苗
本發明一般係關於免疫領域，且更特定言之係關於新穎的基於抗CD40之抗癌疫苗。
在不限制本發明之範疇的情況下，結合抗原呈獻描述本發明之背景。用於抗原呈獻之疫苗及方法的一實例教示於頒予Ledbetter等人的關於編碼與結合CD40之羧基端域連接之胺基端抗原的DNA疫苗之美國專利第7,118,751號中。簡言之，教示使一或多個抗原以細胞表面受體為標的以改良抗原特異性體液及細胞免疫反應的疫苗。將與結合細胞表面受體之域連接的抗原內化，運載抗原至細胞內區隔中，在該細胞內區隔中抗原消化為肽且負載於MHC分子上。對該等肽抗原具有特異性之T細胞受到活化，從而產生增強之免疫反應。疫苗可包含與結合至少一個受體之域連接的抗原，或編碼與結合至少一個受體之域連接之抗原的DNA質體。本發明之一較佳實施例使HIV-1 env抗原以CD40受體為標的，導致向CD40陽性細胞傳遞抗原且選擇性活化向T細胞呈獻HIV-1 env抗原的細胞上之CD40受體。
另一實例見於Li等人申請之關於拮抗劑抗CD40單株抗體及其使用方法的美國專利申請案第20080254026號中。簡言之，揭示用於治療CD40表現細胞上CD40信號傳導之刺激所介導之疾病的療法之組合 物及方法。該等方法包含向有需要之患者投與治療有效量之拮抗劑抗CD40抗體或其抗原結合片段。拮抗劑抗CD40抗體或其抗原結合片段在該抗體結合人類CD40表現細胞上之CD40抗原時不具有顯著促效劑活性，而是展現拮抗劑活性。抗CD40抗體或其抗原結合片段之拮抗劑活性有利地抑制人類CD40表現細胞(諸如B細胞)之增殖及/或分化。
另一實例教示於Delucia申請之關於包含微生物TLR促效劑、CD40或4-1BB促效劑及視情況存在之抗原的佐劑組合及其用於誘發細胞免疫之協同增強的用途之美國專利申請案第20080241139號中。簡言之，據稱此申請案教示包含至少一種微生物TLR促效劑(諸如全病毒、細菌或酵母，或其部分，諸如膜、球形質體、胞質體或血影)、CD40或4-1BB促效劑及視情況存在之抗原的佐劑組合，其中所有3個部分可為獨立的或包含所揭示之同一種重組微生物或病毒。亦提供此等免疫佐劑用於治療諸如癌症及HIV感染之各種慢性疾病之用途。
Bernett等人申請之美國專利申請案第20080199471號係關於最佳化CD40抗體及其使用方法。簡言之，據稱此申請案教示以CD40為標的之抗體，其中該等抗體相對於親本抗體包含至少一個修飾，其中與親本抗體相比，該修飾改變對FcγR之親和力或改變效應功能。亦揭示使用本發明抗體之方法。
最後，Tripp等人申請之美國專利申請案第20080181915號係關於用於呼吸道融合性病毒之CD40配位體佐劑。簡言之，據稱此申請案教示增強宿主對RSV之免疫反應的方法及佐劑，其中該等方法及佐劑包含CD40結合蛋白之來源。較佳地，CD40結合蛋白為CD40L，且來源為包含與CD40L編碼區可操作地連接之啟動子的載體。由本發明之佐劑及方法產生的增強之免疫反應包括Th1細胞激素表現增加及抗體產生增加。
在一實施例中，本發明為包含下式之融合蛋白：Ab-(PL-Ag)x；Ab-(Ag-PL)x；Ab-(PL-Ag-PL)x；Ab-(Ag-PL-Ag)x；Ab-(PL-Ag)x-PL；或Ab-(Ag-PL)x-Ag；其中Ab為抗體或其片段；其中PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；其中Ag為至少一個抗原；且其中x為1至20之整數，該融合蛋白的溶液穩定性大於無糖基化位點之相同融合蛋白。在一態樣中，Ag係選自病毒抗原、腫瘤抗原、傳染病抗原、自體免疫抗原、毒素或其組合。在另一態樣中，Ag為肽串聯體。在另一態樣中，PL為肽串聯體。在另一態樣中，-(PL-Ag)x、-(Ag-PL)x、-(PL-Ag-PL)x或-(Ag-PL-Ag)x位於Ab重鏈或其片段之羧基端。在另一態樣中，Ag引發宿主之體液免疫反應及/或細胞免疫反應。在一態樣中，Ab包含抗CD40_12E12.3F3(ATCC寄存編號PTA-9854)、抗CD40_12B4.2C10(寄存編號HS446，ATCC寄存編號PTA-10653)及抗CD40_11B6.1C3(寄存編號HS440，ATCC寄存編號PTA-10652)之至少可變區。
在一態樣中，Ag係選自與參與自體免疫疾病之抗原相關之自體免疫疾病或病症，該等抗原係選自麩胺酸脫羧酶65(GAD 65)、天然DNA、髓鞘鹼性蛋白、髓鞘蛋白脂質蛋白、乙醯膽鹼受體組份、甲狀腺球蛋白及甲狀腺促素(TSH)受體。在另一態樣中，Ag係選自傳染病抗原，該等抗原係選自細菌、病毒、寄生蟲及真菌抗原。在另一態樣中，x包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在另一態樣中，融合蛋白包含由至少一個PL分隔之兩個或兩個以上來自不同抗原之Ag。在另一態樣中，融合蛋白包含兩個或兩個以上由至少一個包含丙胺酸及絲胺酸之PL分隔的Ag。在另一態樣中，Ab為選自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc或ScFv之抗體片段。
在一態樣中，Ab特異性結合MHC I類、MHC II類、CD1、CD2、 CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受體、朗格素(Langerin)、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受體及IL-2受體、ICAM-1、Fcγ受體、T細胞受體或凝集素。在另一態樣中，Ab為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其同型。在另一態樣中，Ab為人類抗體或人類化抗體。在另一態樣中，PL包含丙胺酸及絲胺酸。在另一態樣中，PL係選自：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.：11)；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)；或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)。
本發明之另一實施例為編碼融合蛋白之核酸表現載體，其包含：編碼抗體輕鏈或其片段之第一聚核苷酸；及編碼抗體重鏈或其片段之第二聚核苷酸；其中該融合蛋白包含下式：Ab-(PL-Ag)x或Ab-(Ag-PL)x；其中Ab為抗體或其片段；其中PL為至少一個包含至少一個糖基化位點的肽連接子；其中Ag為至少一個抗原；且其中x為1至20之整數，該融合蛋白的溶液穩定性大於無糖基化位點之相同融合蛋白。在一態樣中，(PL-Ag)x或(Ag-PL)x位於Ab重鏈或其片段之羧基端。在另一態樣中，第一及第二聚核苷酸在單一表現載體上。在另一態樣中，Ag係選自傳染病抗原，該等抗原係選自細菌、病毒、寄生蟲及真菌抗原。在另一態樣中，x包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在另一態樣中，融合蛋白包含由至少一個PL分隔之兩個或兩個以上來自不同抗原之Ag。在另一態樣中，融合蛋白包含兩個或兩個以上由至少一個包含丙胺酸及絲胺酸之PL分隔的Ag。在另一態樣中，Ab為選自Fv、Fab、Fab'、 F(ab')2、Fc或ScFv之抗體片段。在另一態樣中，Ab特異性結合MHC I類、MHC II類、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受體、朗格素、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受體及IL-2受體、ICAM-1、Fcγ受體、T細胞受體或凝集素。在另一態樣中，Ab為IgA、IgD、IgE、IgG或IgM或其同型。在另一態樣中，Ab為人類抗體或人類化抗體。在另一態樣中，PL包含丙胺酸及絲胺酸，及/或PL係選自：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.：11)；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)；或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)。在另一態樣中，第一及第二聚核苷酸在組成性啟動子之下游。
本發明之另一實施例為穩定、分泌型融合蛋白，其包含下式：NH2-Ab-(PL-Ag)x-COOH或NH2-Ab-(Ag-PL)x-COOH；其中Ab為抗體或其片段；其中PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；其中Ag為至少一個免疫原性抗原；且其中x為1至20之整數，相較於不可溶或不穩定之單獨Ab-Ag蛋白，該融合蛋白為穩定的且可溶於溶液中。
另一實施例為一種使抗原肽穩定之方法，其包含：將一或多個不穩定或不溶性抗原肽併入融合蛋白中，其中融合蛋白具有以下結構：Ab-(PL-Ag)x或Ab-(Ag-PL)x；其中Ab為抗體或其片段；其中PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；其中Ag為至少一個抗原；且其中x為1至20之整數，該融合蛋白為穩定的且可溶於溶液中，其中Ab-Ag為不可溶或不穩定的。
本發明之另一實施例為包含核酸表現載體之宿主細胞，該核酸表現載體包含：編碼抗體輕鏈之第一聚核苷酸；及編碼抗體重鏈融合蛋白之第二聚核苷酸，該融合蛋白包含下式：Ab-(PL-Ag)x或Ab-(Ag-PL)x；其中Ab為抗體或其片段；其中PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；其中Ag為至少一個抗原；且其中x為1至20之整數，該融合蛋白的溶液穩定性大於無糖基化位點之融合蛋白。在另一實施例中，宿主細胞包含產生包含下式之融合蛋白的表現載體：Ab-(PL-Ag)x；Ab-(Ag-PL)x；Ab-(PL-Ag-PL)x；Ab-(Ag-PL-Ag)x；Ab-(PL-Ag)x-PL；或Ab-(Ag-PL)x-Ag；其中Ab為抗體或其片段；其中PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；其中Ag為至少一個抗原；且其中x為1至20之整數，該融合蛋白的溶液穩定性大於無糖基化位點之相同融合蛋白。
本發明亦包括一種醫藥組合物，其包含具有下式之抗體：Ab-(PL-Ag)x；Ab-(Ag-PL)x；Ab-(PL-Ag-PL)x；Ab-(Ag-PL-Ag)x；Ab-(PL-Ag)x-PL；或Ab-(Ag-PL)x-Ag；其中Ab為抗體或其片段；其中PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；其中Ag為至少一個抗原；且其中x為1至20之整數，該融合蛋白的溶液穩定性大於無糖基化位點之相同融合蛋白。
本發明之另一實施例為包含下式之融合蛋白：Ab-(PL-Ag)x-(PLy-Agz)n；或Ab-(Ag-PL)x-(PLy-Agz)n；其中Ab為抗體或其片段；其中PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；其中Ag為至少一個抗原；且其中x為1至20之整數；其中n為0至19；且其中y或z為0至10，其中該融合蛋白的溶液穩定性大於無糖基化位點之相同融合蛋白。
另一實施例為經分離及純化之疫苗，其包含：選自SEQ ID NO.：6、7、8、9、10、16、17、18、19、20、36、37、96、97、98、99、 110、111、112、118、119、134、136、138、146及147中之至少一者的特異性結合CD40之重鏈；及特異性結合CD40之輕鏈。在一態樣中，抗體進一步定義為人類化抗體。
本發明之另一實施例為包含下式之融合蛋白：Ab-(PL-Ag)x；Ab-(Ag-PL)x；Ab-(PL-Ag-PL)x；Ab-(Ag-PL-Ag)x；Ab-(PL-Ag)x-PL；或Ab-(Ag-PL)x-Ag；其中Ab為抗體或其片段；PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；Ag為至少一個病毒抗原；且x為1至20之整數。在一態樣中，融合蛋白之溶液穩定性大於無糖基化位點之PL。在另一態樣中，Ag包含來自腺病毒、反轉錄病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、輪狀病毒、漢坦病毒(hantavirus)、冠狀病毒、披衣病毒、黃病毒、棒狀病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、崩芽病毒(bunyavirus)、沙粒狀病毒、里奧病毒(reovirus)、乳突狀瘤病毒、小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)或海綿狀病毒之肽。在另一態樣中，Ag包含來自以下至少一者的肽：HIV病毒、CMV病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒及C型肝炎病毒、流行性感冒病毒；麻疹病毒、脊髓灰白質炎病毒、天花病毒、風疹病毒、呼吸道融合性病毒、單純疱疹病毒、水痘帶狀皰狀病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、日本腦炎病毒、狂犬病病毒、流行感冒病毒或冷病毒。
在另一態樣中，Ag係選自：Nef(66-97)：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.：1)；Nef(116-145)：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL(SEQ ID NO.：2)；Gag p17(17-35)：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.：3)；Gag p17-p24(253-284)：NPPIPVGEIYKRWIIL GLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.：4)；或Pol 325-355(RT 158-188)為：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.：5)。在另一態樣中，Ag為19至32個殘基。在另一態樣中，Ag係選自在於MHC-I類分子情形下呈獻的HIV-1 Nef、Gag及Env蛋白中鑑別的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定基。在另一態樣中，Ag係選自HIV gp120、gp41、Gag、p17、p24、p2、p7、p1、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、Vpu及Nef。在另一態樣中，x包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在另一態樣中，Ag包含由不同肽連接子分隔之來自不同抗原之病毒肽。在另一態樣中，Ag由至少一個包含丙胺酸及絲胺酸之PL分隔。在另一態樣中，融合蛋白係選自SEQ ID NO.：21、22、23、24、25、26或36。在另一態樣中，融合蛋白自包含編碼該融合蛋白之聚核苷酸載體的細胞分離，該聚核苷酸載體包含SEQ ID NO.：21、22、23、24、25、26或36。在另一態樣中，Ab包含SEQ ID NO.：37及38。
在另一態樣中，融合蛋白自包含表現該融合蛋白之聚核苷酸載體的細胞分離，且Ab部分包含SEQ ID NO.：39及40。在另一態樣中，Ag係選自SEQ ID NO.：52-56、58-60、61-69、70-72或73-77中之至少一者。在另一態樣中，Ag為17至60個殘基。在另一態樣中，Ag為8、10、12、14、15、16、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55至60個殘基長。在另一態樣中，Ag包含至少一個脂肽。在另一態樣中，Ag在羧基端且另外包含羧基端(Palm)-NH2基團。在另一態樣中，PL係選自：SSVSPTTSVHPTPTSVPPT PTKSSP(SEQ ID NO.：11)；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)；或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)。在另一態樣中，PL包含丙胺酸及絲胺酸。
本發明之另一實施例為病毒抗原傳遞載體，其包含：包含抗CD40抗體或其片段及一或多個在該抗CD40抗體的羧基端之病毒肽的融合蛋白，其中當呈獻兩個或兩個以上病毒肽時，該等病毒肽由一或多個包含至少一個潛在糖基化位點之肽連接子分隔。在另一態樣中， 抗原傳遞載體為抗CD40抗體或其片段及兩個或兩個以上在該抗CD40抗體之輕鏈、重鏈或輕鏈及重鏈之羧基端的病毒肽，其中兩個或兩個以上病毒肽由一或多個包含至少一個潛在糖基化位點之肽連接子分隔。
本發明之另一實施例為一種使病毒肽穩定之方法，其包含：將一或多個不穩定或不溶性病毒肽與抗體一起併入融合蛋白中，其中抗體及病毒肽由一或多個包含一或多個糖基化位點之肽連接子分隔。另一實施例為一種增強T細胞反應之方法，其包含：用有效量之包含下式之疫苗使需要疫苗接種之個體免疫：Ab-(PL-Ag)x或Ab-(Ag-PL)x；其中Ab為抗體或其片段；PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；Ag為至少一個病毒抗原；且x為1至20之整數。在一態樣中，融合蛋白之溶液穩定性大於無糖基化位點之相同融合蛋白。在另一態樣中，該至少一個病毒抗原包含來自腺病毒、反轉錄病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、輪狀病毒、漢坦病毒、冠狀病毒、披衣病毒、黃病毒、棒狀病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、崩芽病毒、沙粒狀病毒、里奧病毒、乳突狀瘤病毒、小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海綿狀病毒之肽。在另一態樣中，該至少一個病毒抗原包含來自以下至少一者的肽：HIV病毒、CMV病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒及C型肝炎病毒、流行性感冒病毒；麻疹病毒、脊髓灰白質炎病毒、天花病毒、風疹病毒；呼吸道融合性病毒、單純疱疹病毒、水痘帶狀皰狀病毒、EB病毒、日本腦炎病毒、狂犬病病毒、流行感冒病毒或冷病毒。
在一態樣中，Ag係選自：Nef(66-97)：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.：1)；Nef(116-145)：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL(SEQ ID NO.：2)；Gag p17(17-35)：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.：3)；Gag p17- p24(253-284)：NPPIPVGEIYKRWIIL GLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.：4)；及/或Pol 325-355(RT 158-188)為：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.：5)。在另一態樣中，Ag為19至32個殘基且係選自在於MHC-I類分子情形下呈獻的HIV-1 Nef、Gag及Env蛋白中鑑別的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定基。在另一態樣中，Ag係選自HIV gp120、gp41、Gag、p17、p24、p2、p7、p1、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、Vpu及Nef。在另一態樣中，x包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在另一態樣中，Ag包含兩個或兩個以上來自不同病毒之病毒抗原。在另一態樣中，PL包含丙胺酸及絲胺酸。在另一態樣中，疫苗係選自SEQ ID NO.：21、22、23、24、25、26或36。在另一態樣中，Ab包含SEQ ID NO.：37及38。在另一態樣中，Ag係選自SEQ ID NO.：52-56、58-60、61-69、70-72或73-77中之至少一者。在另一態樣中，Ag為17至60個殘基。在另一態樣中，Ag為8、10、12、14、15、16、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55至60個殘基長。在另一態樣中，Ag為8、10、12、14、15、16、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55至60個殘基長。在另一態樣中，Ag包含脂肽。在另一態樣中，Ag在羧基端且包含羧基端(Palm)-NH2基團。在另一態樣中，PL係選自：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.：11)；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)；或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)。
本發明之另一實施例為一種製備HIV肽特異性產生IFNγ之T細胞的方法，其包含：用包含抗CD40抗體或其片段及一或多個在該抗體的羧基端之HIV肽的融合蛋白使個體免疫；及自個體分離周邊血液單核細胞，其中富集分離之周邊單核細胞以獲得產生IFNγ之抗HIV T細 胞，其中該抗CD40抗體包含SEQ ID NO.：37及38或其片段。在一態樣中，個體為懷疑患有HIV感染之患者。在另一態樣中，融合蛋白包含兩個或兩個以上HIV肽，且該等肽由一或多個肽連接子分隔。在另一態樣中，融合蛋白包含兩個或兩個以上HIV肽，且該等肽由一或多個包含糖基化序列之肽連接子分隔。在另一態樣中，融合蛋白包含兩個或兩個以上HIV肽，且該等肽由一或多個包含丙胺酸及絲胺酸之肽連接子分隔。在另一態樣中，一或多個HIV肽包含至少一個脂肽。在另一態樣中，一或多個HIV肽包含羧基端(Palm)-NH2基團。在另一態樣中，一或多個HIV肽為19至32個胺基酸長，且係選自在不同的MHC-I類分子情形下在HIV-1 Nef、Gag及Env蛋白中鑑別之細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定基。在另一態樣中，一或多個HIV肽係選自HIVgp120、gp41、Gag、p17、p24、p2、p7、p1、p6、Tat、Rev、PR、RT、IN、Vif、Vpr、Vpx、Vpu及Nef。在另一態樣中，一或多個病毒肽係選自以下至少一者：Nef(66-97)：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.：1)；Nef(116-145)：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRY PLTFGWLYKL(SEQ ID NO.：2)；Gag p17(17-35)：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.：3)；Gag p17-p24(253-284)：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.：4)；及/或Pol 325-355(RT 158-188)為：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.：5)。
本發明之另一實施例為包含抗CD40抗體或其片段及一或多個在該抗體之羧基端的由包含至少一個丙胺酸及一個絲胺酸之PL分隔的病毒肽之融合蛋白。在一態樣中，該一或多個病毒肽為HIV肽。在另一態樣中，該一或多個病毒肽係選自以下至少一者：Nef(66-97)：VGFPVTPQVPLRP MTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.：1)；Nef(116-145)：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL(SEQ ID NO.：2)；Gag p17(17-35)：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.：3)；Gag p17-p24(253-284)：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.：4)；及/或Pol 325-355(RT 158-188)為：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.：5)。
本發明亦包括一種製備融合蛋白之方法，其包含：將包含編碼具有下式之蛋白質的聚核苷酸之核酸構築體插入表現載體中：Ab-(PL-Ag)x或Ab-(Ag-PL)x；其中Ab為抗體或其片段；PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；Ag為至少一個病毒抗原；且x為1至20之整數；及在足以使得可表現該融合蛋白之條件下培養該載體。在一態樣中，融合蛋白之溶液穩定性大於無糖基化位點之相同融合蛋白。在另一態樣中，該至少一個病毒抗原包含來自腺病毒、反轉錄病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、輪狀病毒、漢坦病毒、冠狀病毒、披衣病毒、黃病毒、棒狀病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、崩芽病毒、沙粒狀病毒、里奧病毒、乳突狀瘤病毒、小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒或海綿狀病毒之肽。在另一態樣中，該至少一個病毒抗原包含來自以下至少一者的肽：HIV病毒、CMV病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎病毒及C型肝炎病毒、流行性感冒病毒；麻疹病毒、脊髓灰白質炎病毒、天花病毒、風疹病毒；呼吸道融合性病毒、單純疱疹病毒、水痘帶狀皰狀病毒、EB病毒、日本腦炎病毒、狂犬病病毒、流行感冒病毒或冷病毒。在另一態樣中，融合蛋白為Ab之輕鏈、Ab之重鏈或Ab之輕鏈與重鏈。在另一態樣中，Ag係選自：Nef(66-97)：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.：1)；Nef(116-145)：HTQGYFPDWQNYTPGP GVRYPLTFGWLYKL(SEQ ID NO.：2)；Gag p17(17-35)：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.：3)；Gag p17-p24(253-284)：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.：4)；及/或Pol 325-355(RT 158-188) 為：AIFQSSMT KILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.：5)。
本發明之另一實施例包括一種活體外擴增抗原特異性T細胞之方法，其包含：自HIV患者分離PBMC；將分離之PBMC與有效量之αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗一起培育；在有效量之IL-2存在下擴增PBMC；收集細胞；及分析由細胞產生之細胞激素以確定抗HIV特異性T細胞之存在。另一實施例為由包含以下之方法製備的HIV抗原特異性T細胞：自HIV患者分離PBMC；將分離之PBMC與有效量之αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗一起培育；在有效量之IL-2存在下擴增PBMC；收集細胞；及分析由細胞產生之細胞激素以確定抗HIV特異性T細胞之存在。另一實施例為一種製備治療性疫苗之方法，其包含：使樹突狀細胞負載αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗，其包含：分離HIV患者單核細胞；用IFNα及GM-CSF使該等單核細胞分化為樹突狀細胞；及使分化的樹突狀細胞暴露於αCD40.LIPO5 HIV肽，其中經負載樹突狀細胞能夠活體外刺激自體HIV肽特異性T細胞。
本發明亦包括由包含以下之方法製備之治療性疫苗：使樹突狀細胞負載αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗，其包含：分離HIV患者單核細胞；用IFNα及GM-CSF使該等單核細胞分化為樹突狀細胞；及使分化的樹突狀細胞暴露於αCD40.LIPO5 HIV肽，其中經負載樹突狀細胞能夠活體外刺激自體HIV肽特異性T細胞。另一實施例為包含多肽之治療性疫苗，該多肽包含SEQ ID NO.：21、22、23、24、25、26或36中之至少一者。另一實施例為包含具有下式之融合蛋白的治療性疫苗：Ab-(PL-Ag)x；Ab-(Ag-PL)x；Ab-(PL-Ag-PL)x；Ab-(Ag-PL-Ag)x；Ab-(PL-Ag)x-PL；或Ab-(Ag-PL)x-Ag；其中Ab為抗體或其片段；PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；Ag為至少一個病毒抗原；且x為1至20之整數。
本發明之另一實施例包括包含下式之融合蛋白：Ab-(PL-Ag)x； Ab-(Ag-PL)x；Ab-(PL-Ag-PL)x；Ab-(Ag-PL-Ag)x；Ab-(PL-Ag)x-PL；或Ab-(Ag-PL)x-Ag；其中Ab為抗體或其片段；PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；Ag為至少一個癌抗原；且x為1至20之整數。在一態樣中，融合蛋白之溶液穩定性大於無糖基化位點之相同融合蛋白。在另一態樣中，Ag係選自腫瘤相關抗原，該等抗原選自CEA、前列腺特異性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、MAGE 6及MAGE 12、MUC相關蛋白(黏蛋白)(MUC-1、MUC-2等)、GM2及GD2神經節苷脂、ras、myc、酪胺酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、MARCO-MART、細胞週期素B1、細胞週期素D、Pmel 17(gp100)、GnT-V內含子V序列(N-乙醯基葡糖胺基轉移酶V內含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-索烴素、MUM-1-B(黑色素瘤普遍存在之突變基因產物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、c-ERB2(Her2/neu)、EBNA(EB病毒細胞核抗原)1-6、gp75、人類乳突狀瘤病毒(HPV)E6及E7、p53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2及Ki-67。在另一態樣中，Ag係選自腫瘤相關抗原，該等抗原包含來自以下之抗原：白血病及淋巴瘤；神經腫瘤，諸如星形細胞瘤或膠質母細胞瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭頸癌；胃腸腫瘤；胃癌；結腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖腫瘤，諸如子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、陰道癌、睪丸癌、前列腺癌或陰莖癌；骨腫瘤；血管腫瘤；或唇、鼻咽、咽及口腔、食道、直腸、膽囊、膽樹、喉、肺及支氣管、膀胱、腎、腦及神經系統其他部分、甲狀腺之癌症；霍奇金氏症(Hodgkin's disease)；非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)；多發性骨髓瘤；及白血病。
在另一態樣中，Ag係選自以下至少一者：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGV LVHPQWV(SEQ ID NO.：74)；LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD(SEQ ID NO.：75)；LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ ID NO.：76)；NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ ID NO.：77)；或SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO.：78)及其片段。在另一態樣中，Ag係選自以下至少一者：IMDQVPFSV(SEQ ID NO.：113)；ITDQVPFSV(SEQ ID NO.：114)；YLEPGPVTV(SEQ ID NO.：115)；YLEPGPVTA(SEQ ID NO.：116)；KTWGQYWQV(SEQ ID NO.：117)；DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ(SEQ ID NO.：122)；PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS(SEQ ID NO.：124)；GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA(SEQ ID NO.：126)；QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ(SEQ ID NO.：128)；及GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ(SEQ ID NO.：130)及其片段。
在另一態樣中，Ag係選自以下至少一者：MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY(SEQ ID NO.：132)；及DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVS IIDRFMQNNCVPKK(SEQ ID NO.：133)。在另一態樣中，Ag係選自以下至少一者：MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV(SEQ ID NO.：141)；QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL(SEQ ID NO.：142)；LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV(SEQ ID NO.：143)；及AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI(SEQ ID NO.：144)及其片段。在另一態樣中，Ag為19至32個胺基酸長。在另一態樣中，Ag為17至60個胺基酸長，且係選自在PSA或細胞週期素1中鑑別之細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定基。在另一態樣中，x包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在另一態樣中，Ag包含由PL分隔之兩個或兩個以上來自不同癌抗原之癌肽。在另一態樣中，Ag由至少一個包含丙胺酸及絲胺酸之PL分隔。在另一態樣中，Ag係選自SEQ ID NO.：74-78、79-86、87-92、93-95、113-117、122-130、132-133及141-144。在另一態樣中，Ab包含SEQ ID NO.：38及39。在另一態樣中，Ab由包含SEQ ID NO.：40及41之核酸表現載體表現。在另一態樣中，PL係選自：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.：11)；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)；或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)。在另一態樣中，PL包含丙胺酸及絲胺酸。
本發明之另一實施例包括表現抗CD40抗體或其片段及兩個或兩個以上在該抗CD40抗體之輕鏈、重鏈或輕鏈與重鏈之羧基端的癌肽 之抗原傳遞載體，其中當呈獻兩個或兩個以上癌肽時，該等癌肽由一或多個包含至少一個糖基化位點之肽連接子分隔。在一態樣中，一或多個肽連接子係選自：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.：11)；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)；或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)。
本發明之另一實施例包括包含抗CD40抗體或其片段及一或多個在該抗CD40抗體之羧基端的癌肽之抗CD40融合蛋白，其中當呈獻兩個或兩個以上癌肽時，該等癌肽由一或多個包含至少一個糖基化位點之連接子肽分隔。在一態樣中，抗體片段係選自Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc或ScFv片段。在另一態樣中，Ag係選自SEQ ID NO.：74-78、79-86、87-92、93-95、113-117、122-130、132-133及141-144。
本發明之另一實施例包括一種使癌肽穩定之方法，其包含：將一或多個不穩定或不溶性癌肽與抗體一起併入融合蛋白中，其中抗體及癌肽由一或多個包含一或多個糖基化位點之肽連接子分隔。在另一態樣中，融合蛋白包含兩個或兩個以上癌肽，且該等癌肽由一或多個肽連接子分隔。在另一態樣中，融合蛋白包含兩個或兩個以上癌肽，且該等肽由一或多個肽連接子分隔。在另一態樣中，融合蛋白包含兩個或兩個以上癌肽，且該等肽由一或多個包含丙胺酸及絲胺酸之連接子分隔。在另一態樣中，癌肽係選自腫瘤相關抗原，該等抗原選自CEA、前列腺特異性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、MAGE 6及MAGE 12、MUC相關蛋白(黏蛋白)(MUC-1、MUC-2等)、GM2及GD2神經節苷脂、ras、myc、酪胺酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、MARCO-MART、細胞週期素B1、細胞週期素D、Pmel 17(gp100)、GnT-V內含子V序列(N-乙醯基葡糖胺基轉移 酶V內含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-索烴素、MUM-1-B(黑色素瘤普遍存在之突變基因產物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、c-ERB2(Her2/neu)、EBNA(EB病毒細胞核抗原)1-6、gp75、人類乳突狀瘤病毒(HPV)E6及E7、p53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2及Ki-67。在另一態樣中，Ag係選自腫瘤相關抗原，該等抗原包含來自以下之抗原：白血病及淋巴瘤；神經腫瘤，諸如星形細胞瘤或膠質母細胞瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭頸癌；胃腸腫瘤；胃癌；結腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖腫瘤，諸如子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、陰道癌、睪丸癌、前列腺癌或陰莖癌；骨腫瘤；血管腫瘤；或唇、鼻咽、咽及口腔、食道、直腸、膽囊、膽樹、喉、肺及支氣管、膀胱、腎、腦及神經系統其他部分、甲狀腺之癌症；霍奇金氏症；非霍奇金氏淋巴瘤；多發性骨髓瘤；及白血病。
在另一態樣中，Ag係選自以下至少一者：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV(SEQ ID NO.：74)；LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD(SEQ ID NO.：75)；LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ ID NO.：76)；NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ ID NO.：77)；或SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO.：78)。
在另一態樣中，Ag係選自以下至少一者：IMDQVPFSV(SEQ ID NO.：113)；ITDQVPFSV(SEQ ID NO.：114)；YLE PGPVTV(SEQ ID NO.：115)；YLEPGPVTA(SEQ ID NO.：116)；KTWGQYWQV(SEQ ID NO.：117)；DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFP GSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ(SEQ ID NO.：122)；PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS(SEQ ID NO.：124)；GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA(SEQ ID NO.：126)；QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ(SEQ ID NO.：128)；及GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ(SEQ ID NO.：130)及其片段。
在另一態樣中，Ag係選自以下至少一者：MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY(SEQ ID NO.：132)；及DWLVQVQMKFRLLQETMY MTVSIIDRFMQNNCVPKK(SEQ ID NO.：133)。
在另一態樣中，Ag係選自以下至少一者：MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV(SEQ ID NO.：141)；QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL(SEQ ID NO.：142)；LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV(SEQ ID NO.：143)；及AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI(SEQ ID NO.：144)及其片段。在另一態樣中，Ag為19至32個胺基酸 長。在另一態樣中，Ag為17至60個胺基酸長，且係選自在PSA或細胞週期素1中鑑別之細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定基。在另一態樣中，x包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19。在另一態樣中，融合蛋白包含由不同肽連接子分隔之來自不同抗原之癌肽。在另一態樣中，融合蛋白包含由一或多個包含丙胺酸及絲胺酸之肽連接子分隔的兩個或兩個以上癌肽。在另一態樣中，抗體包含SEQ ID NO.：38及39。在另一態樣中，融合蛋白由包含SEQ ID NO.：40及41之核酸表現載體表現。在另一態樣中，肽連接子係選自：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.：11)；PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)；或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)。
本發明之另一實施例包括一種增強T細胞反應之方法，其包含：用有效量的包含融合蛋白之疫苗使需要疫苗接種之個體免疫，該融合蛋白包含抗CD40抗體或其部分及一或多個與該抗CD40抗體之羧基端連接之癌肽。在另一態樣中，癌肽係選自腫瘤相關抗原，該等抗原選自CEA、前列腺特異性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、MAGE 6及MAGE 12、MUC(黏蛋白)(例如MUC-1、MUC-2等)、GM2及GD2神經節苷脂、ras、myc、酪胺酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、MARCO-MART、細胞週期素B1、細胞週期素D、Pmel 17(gp100)、GnT-V內含子V序列(N-乙醯基葡糖胺基轉移酶V內含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-索烴素、MUM-1-B(黑色素瘤普遍存在之突變基因產物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、c-ERB2(Her2/neu)、EBNA(EB病毒細胞核抗原)1-6、gp75、人類乳突狀瘤病毒(HPV)E6及E7、p53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2及 Ki-67。在另一態樣中，癌肽係選自腫瘤相關抗原，該等抗原包含來自以下之抗原：白血病及淋巴瘤；神經腫瘤，諸如星形細胞瘤或膠質母細胞瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭頸癌；胃腸腫瘤；胃癌；結腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖腫瘤，諸如子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、陰道癌、睪丸癌、前列腺癌或陰莖癌；骨腫瘤；血管腫瘤；或唇、鼻咽、咽及口腔、食道、直腸、膽囊、膽樹、喉、肺及支氣管、膀胱、腎、腦及神經系統其他部分、甲狀腺之癌症；霍奇金氏症；非霍奇金氏淋巴瘤；多發性骨髓瘤；及白血病。
本發明之另一實施例包括一種製備抗CD40-抗原融合蛋白之方法，其包含：在宿主細胞中表現包含抗CD40抗體或其片段之融合蛋白，該融合蛋白包含一或多個在該抗CD40抗體或其片段之羧基端的癌肽，其中兩個或兩個以上癌肽由一或多個連接子分隔，至少一個連接子包含糖基化位點；及分離該融合蛋白。在另一態樣中，在宿主中表現之融合蛋白經進一步分離及純化。在另一態樣中，宿主為真核細胞。在另一態樣中，癌肽係選自腫瘤相關抗原，該等抗原選自CEA、前列腺特異性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、MAGE 6及MAGE 12、MUC相關蛋白(黏蛋白)(MUC-1、MUC-2等)、GM2及GD2神經節苷脂、ras、myc、酪胺酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、MARCO-MART、細胞週期素B1、細胞週期素D、Pmel 17(gp100)、GnT-V內含子V序列(N-乙醯基葡糖胺基轉移酶V內含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-索烴素、MUM-1-B(黑色素瘤普遍存在之突變基因產物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、c-ERB2(Her2/neu)、EBNA(EB病毒細胞核抗原)1-6、gp75、人類乳突狀瘤病毒(HPV)E6及E7、p53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2及Ki-67。在另一態樣中，癌肽係選自腫瘤相關抗原，該等抗原包含來自以下之抗 原：白血病及淋巴瘤；神經腫瘤，諸如星形細胞瘤或膠質母細胞瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭頸癌；胃腸腫瘤；胃癌；結腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖腫瘤，諸如子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、陰道癌、睪丸癌、前列腺癌或陰莖癌；骨腫瘤；血管腫瘤；或唇、鼻咽、咽及口腔、食道、直腸、膽囊、膽樹、喉、肺及支氣管、膀胱、腎、腦及神經系統其他部分、甲狀腺之癌症；霍奇金氏症；非霍奇金氏淋巴瘤；多發性骨髓瘤；及白血病。在另一態樣中，癌肽係選自以下至少一者：MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV(SEQ ID NO.：74)；LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD(SEQ ID NO.：75)；LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ ID NO.：76)；NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ ID NO.：77)；或SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO.：78)。
在另一態樣中，癌肽係選自以下至少一者：IMDQVPFSV(SEQ ID NO.：113)；ITDQVPFSV(SEQ ID NO.：114)；YLEPGPVTV(SEQ ID NO.：115)；YLEPGPVTA(SEQ ID NO.：116)；KTWGQYWQV(SEQ ID NO.：117)；DTTEPATPTTPVTTPTTTKVPRNQDWLGVSRQLRTKAWNRQLYPEWTEAQRLDCWRGGQVSLKVSNDGPTLIGANASFSIALNFPGSQKVLPDGQVIWVNNTIINGSQVWGGQPVYPQETDDACIFPDGGPCPSGSWSQKRSFVYVWKTWGQYWQVLGGPVSGLSIGTGRAMLGTHTMEVTVYHRRGSQSYVPLAHSSSAFTITDQVPFSVSVSQLRALDGGNKHFLRNQ(SEQ ID NO.：122)；PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS(SEQ ID NO.：124)；GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPT AEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA(SEQ ID NO.：126)；QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ(SEQ ID NO.：128)；及GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ(SEQ ID NO.：130)及其片段。
在另一態樣中，癌肽係選自以下至少一者：MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY(SEQ ID NO.：132)；及DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK(SEQ ID NO.：133)。
在另一態樣中，癌肽係選自以下至少一者：MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV(SEQ ID NO.：141)；QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL(SEQ ID NO.：142)；LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV(SEQ ID NO.：143)；及AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI(SEQ ID NO.：144)及其片段。
本發明之另一實施例包括一種活體外擴增抗原特異性T細胞之方法，其包含：自癌症患者分離周邊血液單核細胞(PBMC)；將分離的PBMC與免疫原性量之αCD40-(PL-Ag)x或αCD40-(Ag-PL)x疫苗一起培育，其中Ag為腫瘤相關抗原，且x為1至20之整數；在有效量之IL-2存在下擴增PBMC；收集細胞；及分析由細胞產生之細胞激素以確定抗癌特異性T細胞之存在。
本發明之另一實施例包括由包含以下之方法製備的腫瘤相關抗原特異性T細胞：自癌症患者分離周邊血液單核細胞(PBMC)；將分離的PBMC與免疫原性量之αCD40-(PL-Ag)x或αCD40-(Ag-PL)x疫苗一起培育，其中Ag為腫瘤相關抗原，且x為1至20之整數；在有效量之IL-2存在下擴增PBMC；收集細胞；及分析由細胞產生之細胞激素以確定腫瘤相關抗原特異性T細胞之存在。
本發明之另一實施例包括包含融合蛋白之治療性疫苗，該融合蛋白包含下式：Ab-(PL-Ag)x；Ab-(Ag-PL)x；Ab-(PL-Ag-PL)x；Ab-(Ag-PL-Ag)x；Ab-(PL-Ag)x-PL；或Ab-(Ag-PL)x-Ag；其中Ab為抗體或其片段；PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；Ag為至少一個癌抗原；且x為1至20之整數。
圖1展示由經轉染293F細胞分泌、藉由還原SDS.PAGE及庫馬斯亮藍染色分析之與各種HIV肽融合的蛋白質A親和性重組抗體(泳道1至5)。
圖2展示由經轉染293F細胞分泌、隨後藉由還原SDS.PAGE及庫馬斯亮藍染色分析之與各種HIV肽融合的蛋白質A親和純化重組抗體(泳道1及2)。
圖3展示由經轉染293F細胞分泌、隨後藉由還原SDS.PAGE及庫馬斯亮藍染色分析之與各種HIV肽串融合的蛋白質A親和純化重組抗體(泳道1至5)。
圖4展示由經轉染293F細胞分泌、隨後藉由還原SDS.PAGE及庫馬斯亮藍染色分析之與各種HIV肽串融合的蛋白質A親和純化重組抗體(泳道1至6)。
圖5描述用於活體外檢驗αCD40.LIPO5 HIV肽融合重組抗體(αCD40.LIPO5 rAb)在PBMC培養物情形下引發抗原特異性T細胞擴增 之效能的方案。
圖6展示與各種濃度之抗CD40.LIPO5肽串疫苗一起培育之來自HIV患者之PBMC中的HIV肽特異性IFNγ產生。C為對照組，其未接受疫苗，且定義培養物對各肽之基線反應。
圖7為針對8位HIV患者之5個肽區的αCD40.LIPO5肽疫苗反應之概述。
圖8展示αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗引發能夠分泌多種細胞激素之HIV肽特異性T細胞之擴增-此為疫苗中需要之特徵。圖8亦展示αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗引發gag253、nef66、nef116及pol325肽特異性反應，該等反應之特徵為產生多種細胞激素(患者A5)。
圖9展示測試αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗引導由於DC之標的吸收而產生的抗原特異性T細胞擴增及於DC表面MHC複合物上呈獻肽抗原決定基之能力的方案。
圖10展示回應來自DC-T細胞共培養物之HIV肽的細胞激素分泌，其中該等共培養物經各種劑量之αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗處理(患者A10)。
圖11展示來自經αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗處理之患者A4的PBMC引發對gag253區而非對可撓性連接序列具有特異性之抗原特異性T細胞之擴增。
圖12A為αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗重鏈序列，其展示呈粗體之可撓性連接區，加下劃線之接合序列及呈灰色陰影之HIV肽區。圖12A展示來自經αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗處理之患者A3的PBMC引發對gag253、nef66及nef116區而非對可撓性連接序列具有特異性之抗原特異性T細胞之擴增。圖12B展示由與30nM以三種不同HIV5肽DC為標的之疫苗一起培育之HIV患者A17 PBMC誘發的HIV抗原特異性T細胞反應。圖12C為類似於圖12B所示之研究，例外在於PBMC來自不同的 HIV患者(A2)。圖12D展示15種不同的HIV肽反應[5個肽區，在3位患者中取樣]，發現對於引發各種HIV肽特異性CD8+及CD4+ T反應，抗CD40.HIV5pep疫苗優於抗DCIR.HIV5pep、抗LOX-1.HIV5pep及非LIPO5混合物。
圖13展示抗CD40 mAb：IL-4DC之內化。用500ng/ml抗CD40-亞歷山大568處理IL-4DC。
圖14展示由作為抗CD40-HA1標的之DC達成的CD4及CD8 T細胞增殖。將5×10e3個負載有2μg/ml抗CD40-HA或對照Ig-HA1之IFNDC與經CFSE標記之自體CD4+或CD8+ T細胞(2×10e5個)共培養7天。隨後用抗CD4或抗CD8抗體對細胞染色。藉由測量CFSE稀釋測試細胞增殖。
圖15展示針對CD4+ T增殖所進行之HA1融合蛋白滴定。將負載有融合蛋白之IFNDC(5K)與經CFSE標記之CD4+ T細胞(200K)共培養7天。
圖16展示作為抗CD40-HA1標的之IFNDC活化HA1特異性CD4+ T細胞。用負載有5μM指定肽之DC再刺激CD4+ T細胞，且隨後對細胞內IFNγ染色。
圖17展示作為抗CD40-HA1標的之IFNDC活化HAI特異性CD4+ T細胞。用負載有指定肽之DC再刺激CD4+ T細胞歷時36小時，隨後分析培養物上清液以測量IFNγ。
圖18展示以CD40為標的會使MART-1特異性CD8+ T細胞之交叉激發增強。將負載有融合蛋白之IFNDC(每孔5K個)與經純化CD8+ T細胞共培養10天。用抗CD8及四聚物對細胞染色。細胞係來自健康供體(HLA-A*0201+)。
圖19展示以CD40為標的會使MART-1特異性CD8+ T細胞之交叉激發增強(使用來自不同健康供體之細胞進行的8個重複實驗之概 述)。
圖20展示由作為抗CD40-MART-1標的之IFNDC誘發的CD8+ CTL具有功能性。將與作為融合蛋白標的之IFNDC共培養之CD8+ T細胞與負載有10μM肽抗原決定基之T2細胞混合。
圖21展示由作為抗CD40-Flu M1標的之IFNDC誘發的CD8+ CTL具有功能性。將與作為融合蛋白標的之IFNDC共培養之CD8+ T細胞與負載有1.0nM肽抗原決定基之T2細胞混合。
圖22展示測試由與PSA(前列腺特異性抗原)連接之抗CD4012E12構成的疫苗引發天然T細胞群體擴增之能力的方案之概述。PSA特異性CD4+ T細胞對應於多種PSA抗原決定基。簡言之，將藉由與來自健康供體的單核細胞之IFNα及GM-CSF一起培養而衍生之DC與疫苗一起培育。次日，將細胞置於新鮮培養基中，且添加來自同一供體之純CD4+ T細胞。數天後，添加PSA肽且在4小時之後測定培養物上清液中所分泌之γ-IFN的含量。
圖23展示諸多PSA肽引發有效γ-IFN產生反應，表明抗CD4012E12及類似抗CD40劑可向DC有效傳遞抗原，使得可激發針對抗原之多個抗原決定基的免疫反應。
圖24展示作為抗CD40-PSA標的之DC誘發PSA特異性CD8+ T細胞反應。IFNDC為1μg mAb與PSA之融合蛋白的標的。將經純化自體CD8+ T細胞共培養10天。用抗CD8及PSA(KLQCVDLHV)-四聚物對細胞染色。細胞係來自HLA-A*0201陽性健康供體。結果證實抗CD40向DC有效傳遞PSA，該等DC又引發PSA特異性CD8+ T細胞擴增。
圖25為方案(左)，及供體2的具有肽池之T細胞及對照組之IFNγ產生。將5×10e3個負載有2μg/ml抗CD40-細胞週期素D1之IFNDC與經純化自體CD4+ T細胞(2×10e5個)共培養8天。隨後在布雷菲德菌素A存在下用5μM源自細胞週期素D1之個別肽再刺激細胞歷時5小時。對細 胞染色以測量細胞內IFNγ表現。
圖26展示肽掃描，及供體2的獲自圖25所示之肽池之T細胞及對照組之IFNγ產生。將5×10e3個負載有2μg/ml抗CD40-細胞週期素D1之IFNDC與經純化自體CD4+ T細胞(2×10e5個)共培養8天。隨後在布雷菲德菌素A存在下用5μM源自細胞週期素D1之個別肽再刺激細胞歷時5小時。對細胞染色以測量細胞內IFNγ表現。
圖27展示抗CD40-MART-1肽抗體之表現及構築體設計。
圖28為MART-1之CD4+及CD8+免疫優勢抗原決定基的概述。
圖29展示抗CD40-gp100肽抗體之表現及構築體設計。
圖30展示其他抗CD40-gp100肽抗體之設計。
圖31展示其他抗CD40-gp100肽抗體之表現及構築體設計。
圖32為gp100之CD4+及CD8+免疫優勢抗原決定基的概述。
圖33展示其他抗CD40-gp100肽抗體之表現及構築體設計。
圖34A展示未能自哺乳動物293F細胞分泌的與抗體H鏈或黏結蛋白之C端融合之全長細胞週期素B1。圖34B展示未能自哺乳動物293F細胞分泌的與抗體H鏈或黏結蛋白之C端融合之全長細胞週期素B1。
圖35展示基於已知或預期結構域區之細胞週期素B1分段策略。
圖36展示與H鏈C端形成直接融合物之細胞週期素D1區段p1、p3及p4而非p2充分表現。
圖37展示以與可撓性連接序列之各種組合與H鏈C端形成直接融合物的各種細胞週期素D1區段之相對表現量。
圖38展示各種H鏈-細胞週期素D1區段構築體及其作為疫苗之相對表現能力之概述。
圖39上圖展示與以DC為標的之抗體H鏈之C端融合的全長細胞週期素D1極不良地表現為分泌之重組抗體。
為更完全地瞭解本發明之特徵及優勢，現參考實施方式以及隨附圖式。
雖然下文詳細論述本發明之各種實施例的製備及使用，但應瞭解本發明提供可在多種特定情形中實施之諸多可用發明概念。本文所論述之特定實施例僅說明製備及使用本發明之特定方式，且並不限定本發明之範疇。
為便於理解本發明，諸多術語定義如下。本文所定義之術語具有一般熟習本發明相關領域之技術者通常所瞭解之意義。諸如「一」及「該」之術語不欲僅指單數實體，而是包括廣泛類別，可使用其中特定實例進行說明。本文之術語係用於描述本發明之特定實施例，但其使用並不限定本發明，除非申請專利範圍中如此概述。
本發明亦包括抗體(或「Ab」)或其片段的變異體及其他修飾，例如抗CD40融合蛋白(抗體與術語「免疫球蛋白」可互換使用)。如本文所用之術語「抗體或其片段」包括全抗體或抗體之片段，例如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc及單鏈Fv片段(ScFv)或任何特異性結合例如CD40的生物學有效免疫球蛋白片段。來自人類來源之抗體或人類化抗體在人類中具有較低之免疫原性或無免疫原性，且與非人類抗體相比具有較低數目之免疫原性抗原決定基或無免疫原性抗原決定基。抗體及其片段一般應經選擇以在人類中具有較低水準之抗原性或無抗原性。
如本文所用之術語「Ag」或「抗原」係指能夠結合免疫球蛋白分子之抗原結合區或能夠引發免疫反應的物質，該免疫反應例如藉由在主要組織相容性抗原(MHC)細胞蛋白上呈獻該抗原而達成的T細胞介導之免疫反應。如本文所用之「抗原」包括(但不限於)抗原決定子、半抗原及免疫原，其可為肽、小分子、碳水化合物、脂質、核酸或其組合。熟練之免疫學者應認識到，當論述經處理以向T細胞呈獻 之抗原時，術語「抗原」係指抗原中作為由MHC向T細胞受體呈獻之T細胞抗原決定基的部分(例如肽片段)。當以對「抗原」具有特異性之抗體形式用於B細胞介導之免疫反應情形中時，抗原中結合抗體(輕鏈及重鏈)可變域之互補決定區的部分(結合部分)可為線性或三維抗原決定基。在本發明之上下文中，術語抗原用於此兩種情形，亦即抗體對蛋白質抗原(CD40)具有特異性，且攜帶一或多個由MHC向T細胞呈獻的肽抗原決定基。在某些情況下，由本發明之疫苗或融合蛋白傳遞之抗原由抗原呈獻細胞內化且處理，隨後例如藉由裂解抗體或融合蛋白之一或多個部分來呈獻。
如本文所用之術語「抗原肽」係指多肽抗原中由B細胞或T細胞特異性識別的部分。B細胞經由抗體產生對外來抗原決定子起反應，而T-淋巴細胞介導細胞免疫。因此，抗原肽為抗原中由抗體或在MHC情形下由T細胞受體識別之部分。
如本文所用之術語「抗原決定基」係指任何能夠特異性結合免疫球蛋白或能夠由主要組織相容性複合體(MHC)蛋白(例如I類或II類)向T細胞受體呈獻的蛋白質決定子。抗原決定子(Epitopic determinant)一般為裝配於MHC分子之凹槽內的5-30個胺基酸長之短肽，MHC分子向T細胞受體呈獻特定胺基酸側基且例如因凹槽、肽側基及T細胞受體之荷質比特徵而在凹槽中具有某些其他殘基。一般而言，當解離常數為1mM、100nM或甚至10nM時，抗體特異性結合抗原。
如本文所用之術語「載體」用於兩種不同情形。當關於疫苗使用術語「載體」時，載體用於描述用於引導或傳遞疫苗之抗原部分的非抗原部分。舉例而言，抗體或其片段可結合引發免疫反應之抗原或與該抗原形成融合蛋白。對於細胞疫苗，用於傳遞及/或呈獻抗原之載體為抗原呈獻細胞，該抗原由負載有抗原之細胞傳遞。在某些情況下，細胞載體自身亦可處理抗原及向T細胞呈獻抗原，且活化抗原特 異性免疫反應。當用於核酸之情形中時，「載體」係指構築體，其能夠在宿主細胞中傳遞且較佳表現一或多個所關注基因或聚核苷酸序列。載體之實例包括(但不限於)病毒載體、裸DNA或RNA表現載體、與陽離子縮合劑結合之DNA或RNA表現載體、囊封於脂質體中之DNA或RNA表現載體及某些真核細胞(諸如生產細胞)。
本發明之組合物及方法可用於多種肽及/或蛋白質，其中抗體或其片段及肽連接子或「PL」產生穩定及/或可溶性蛋白質。
如本文所用之組合物及方法使用包含下式之抗原傳遞載體：Ab-(PL-Ag)x或Ab-(Ag-PL)x；其中Ab為抗體或其片段；PL為至少一個包含至少一個糖基化位點之肽連接子；Ag為至少一個病毒抗原；且x為1至20之整數。用於本發明之抗體之一實例包含抗CD40_12E12.3F3(ATCC寄存編號PTA-9854)、抗CD40_12B4.2C10(寄存編號HS446，ATCC寄存編號PTA-10653)及抗CD40_11B6.1C3(寄存編號HS440，ATCC寄存編號PTA-10652)之至少可變區。
當提及蛋白質時，如本文所用之術語「穩定」及「不穩定」用於描述肽或蛋白質保持其三維結構及/或活性(穩定)，或立即或隨時間喪失其三維結構及/或活性(不穩定)。如本文所用之術語「不溶性」係指當於細胞中產生(例如於真核或原核細胞中或活體外表現之重組蛋白質)時在未使用變性條件或試劑(例如分別為加熱或化學變性劑)之情況下不可溶於溶液中的蛋白質。已發現本文所教示之抗體或其片段及連接子將具有該等肽之抗體融合蛋白自不溶性及/或不穩定性蛋白質轉化為穩定及/或可溶性蛋白質。穩定性與不穩定性比較之另一實例為當在同一溶液中測量時，蛋白質中具有穩定構形之域的熔融溫度(Tm)高於蛋白質之不穩定域。若在同一溶液中測量時，Tm差異為至少約2℃，更佳約4℃，更佳約7℃，更佳約10℃，甚至更佳約15℃，更佳約20℃，甚至更佳約25℃且最佳約30℃，則一個域相較於另一域為 穩定的。
如本文所用之「聚核苷酸」或「核酸」係指一股呈單股或雙股形式之去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(包括天然核苷酸之已知類似物)。雙股核酸序列應包括互補序列。聚核苷酸序列可編碼用一或多個連接子形成融合蛋白之免疫球蛋白可變區域及/或恆定區域。為用於本發明，可將多選殖位點(MCS)工程改造至抗體重鏈及/或輕鏈之羧基末端位置中以使得可同框插入肽以使其在連接子之間表現。如本文所用之術語「分離之聚核苷酸」係指基因組、cDNA或合成來源之聚核苷酸，或其某一組合。「分離之聚核苷酸」由於其來源而(1)不與自然界中發現該等「分離之聚核苷酸」的聚核苷酸中之所有部分或一部分結合，(2)與自然界中未連接之聚核苷酸可操作地連接，或(3)不以較大序列之一部分存在於自然界中。熟練技術人員應認識到，具有式Ab-(PL-Ag)x或Ab-(Ag-PL)x之載體之設計及建構可在核酸層面上使用此項技術中已知之技術來操作，該等技術諸如教示於Current Protocols in Molecular Biology,2007,John Wiley and Sons中之技術，該文獻之相關部分以引用的方式併入本文中。簡言之，可使用聚合酶鏈反應，在可為表現載體之載體中酶促插入寡核苷酸或聚合酶鏈反應片段，藉此插入編碼Ab、Ag及PL之核酸序列。為便於在抗體輕鏈、重鏈或兩者之羧基端插入(PL-Ag)x或(Ag-PL)x，抗體序列可在序列中工程改造多選殖位點(MCS)。
如本文所用之術語「多肽」係指胺基酸之聚合物，且並非指特定長度之產物；因此，肽、寡肽及蛋白質包括於多肽之定義內。此術語亦非指或未排除多肽之表現後修飾，例如糖基化、乙醯化、磷酸化及其類似修飾。該定義中包括例如含有一或多種胺基酸類似物(包括例如非天然胺基酸等)之多肽、具有經取代之鍵以及此項技術中已知之其他修飾的多肽，其為天然存在的以及非天然存在的。術語「域」 或「多肽域」係指多肽中摺疊成呈天然構形之單一球狀區且可展現不連續的結合或功能特性之序列。
「源自」指定核酸序列之多肽或胺基酸序列係指胺基酸序列與該序列中所編碼之多肽的胺基酸序列或其一部分一致之多肽，其中該部分由至少3-5個胺基酸、較佳至少4-7個胺基酸、更佳至少8-10個胺基酸且甚至更佳至少11-15個胺基酸組成；或可用該序列中所編碼之多肽免疫鑑別的多肽。此術語亦包括由指定核酸序列表現之多肽。
如本文所用之「醫藥學上可接受之載劑」係指任何在與本發明之免疫球蛋白(Ig)融合蛋白組合時使得Ig保持生物活性且一般不與個體之免疫系統發生反應的物質。實例包括(但不限於)標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝生理食鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水乳液)及各種類型之濕潤劑。特定稀釋劑可用於本發明，例如對於氣霧劑或非經腸投藥，稀釋劑可為磷酸鹽緩衝生理食鹽水或標準(0.85%)生理食鹽水。
本發明提供一種CD40結合分子，其包含至少一個免疫球蛋白輕鏈可變域(VL)，該輕鏈可變域依次包含高變區CDR1L、CDR2L及CDR3L，該CDR1L具有胺基酸序列SASQGISNYLN(SEQ ID NO.：41)，該CDR2L具有胺基酸序列YTSILHS(SEQ ID NO.：42)，且該CDR3L具有胺基酸序列QQFNKLPPT(SEQ ID NO.：43)，該等高變區之胺基酸序列展示於SEQ ID NO.37中；及其直接等效物。
因此，本發明提供一種CD40結合分子，其包含含有至少一個免疫球蛋白重鏈可變域(VH)之抗原結合位點，該重鏈可變域依次包含高變區CDR1H、CDR2H及CDR3H，該CDR1H具有胺基酸序列GFTFSDYYMY(SEQ ID NO.：44)，該CDR2H具有胺基酸序列YINSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO.：45)，且該CDR3H具有胺基酸序列RGLPFHAMDY(SEQ ID NO.：46)，該等高變區之胺基酸序列展示於SEQ ID NO.38中；及其直接等效物。
在一態樣中，本發明提供一種單域CD40結合分子，其包含分離之免疫球蛋白輕鏈，該輕鏈包含如上文所定義之重鏈可變域(VL)。在另一態樣中，本發明提供一種單域CD40結合分子，其包含分離之免疫球蛋白重鏈，該重鏈包含如上文所定義之重鏈可變域(VH)。
在另一態樣中，本發明亦提供一種包含重鏈(VH)及輕鏈(VL)可變域之CD40結合分子，其中該CD40結合分子包含至少一個包含以下之抗原結合位點：a)免疫球蛋白重鏈可變域(VL)，其依次包含高變區CDR1L、CDR2L及CDR3L，該CDR1L具有胺基酸序列SASQGISNYLN(SEQ ID NO.：41)，該CDR2L具有胺基酸序列YTSILHS(SEQ ID NO.：42)，且該CDR3L具有胺基酸序列QQFNKLPPT(SEQ ID NO.：43)，該等高變區之胺基酸序列展示於SEQ ID NO.1中，及b)免疫球蛋白輕鏈可變域(VH)，其依次包含高變區CDR1H、CDR2H及CDR3H，該CDR1H具有胺基酸序列GFTFSDYYMY(SEQ ID NO.：44)，該CDR2H具有胺基酸序列YINSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO.：45)，且該CDR3H具有胺基酸序列RGLPFHAMDY(SEQ ID NO.：46)，該等高變區之胺基酸序列展示於SEQ ID NO.38中；及其直接等效物。
除非另外指明，否則本文中任何多肽鏈均描述為具有以N末端起始且以C末端終止之胺基酸序列。當抗原結合位點包含VH與VL域時，該等域可位於同一多肽分子上，或較佳地，各域可在不同鏈上，VH域為免疫球蛋白重鏈或其片段之一部分，且VL為免疫球蛋白輕鏈或其片段之一部分。
作為本發明抗體之標的之抗原的非限制性實例包括(但不限於)選自以下之細胞表面標記：MHC I類、MHC II類、CD1、CD2、CD3、CD4、CD8、CD11b、CD14、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD29、CD31、CD40、CD43、CD44、CD45、CD54、CD56、CD57、CD58、 CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR、DC-ASPGR、CLEC-6、CD40、BDCA-2、MARCO、DEC-205、甘露糖受體、朗格素、DECTIN-1、B7-1、B7-2、IFN-γ受體及IL-2受體、ICAM-1、Fcγ受體、T細胞受體、凝集素或其他免疫細胞受體。在一特定實例中，作為本發明之抗體部分的標的之抗原由抗原呈獻細胞(例如樹突狀細胞、朗氏細胞(Langerhans cell)、巨噬細胞及B細胞)特異性表現。
本文所用之術語「CD40結合分子」係指任何能夠單獨地或聯合其他分子來結合CD40抗原之分子，該分子具有一或多個本文所教示之VL及VH CDR，在一些情況下具有2個、3個、4個、5個或所有6個CDR。結合反應可由標準方法(定性檢驗)展示，該等標準方法包括例如一種藉由阻斷其他分子與CD40結合來測定的生物檢驗，或各種結合或活性檢驗(例如活化、減少或調節免疫反應)，參考陰性對照試驗，其中使用不相關特異性但相同同型之抗體(例如抗CD25或抗CD80抗體)。
本發明亦可製成具有抗體重鏈及輕鏈之可變域由通常包括10至30個胺基酸、較佳15至25個胺基酸之肽連接子共價結合的單鏈抗體。因此，此類結構不包括重鏈及輕鏈之恆定部分，且咸信該小肽間隔基之抗原性應比完整恆定部分小。
本文所用之術語「嵌合抗體」係指抗體之重鏈或輕鏈或兩者之恆定區來源於人類，而重鏈與輕鏈之可變域來源於非人類(例如小鼠、倉鼠或大鼠)或來源於人類但源自不同人類抗體。
本文所用之術語「CDR移植抗體」係指抗體之高變互補決定區(CDRs)源自供體抗體，諸如非人類(例如小鼠)抗體或不同人類抗體，而免疫球蛋白之所有或實質上所有其他部分(例如可變域之保守區，亦即構架區)均源自接受體抗體(在人類化抗體之情況下-人類來源之抗體)。CDR移植抗體可包括供體序列的構架區(例如與高變區相鄰之構 架區部分)之少許胺基酸。
本文所用之術語「人類抗體」係指抗體之重鏈與輕鏈之恆定區及可變區均來源於人類或實質上與人類來源之序列一致但未必來自同一抗體，且包括由小鼠產生之抗體，其中小鼠、倉鼠或大鼠免疫球蛋白可變及恆定部分基因已經人類對應物置換，例如EP 0546073 B1、美國專利第5,545,806號、美國專利第5,569,825號、美國專利第5,625,126號、美國專利第5,633,425號、美國專利第5,661,016號、美國專利第5,770,429號、EP 0 438474 B1及EP 0 463151 B1中之一般術語所述，各案之相關部分以引用的方式併入本文中。
本發明之CD40結合分子可為人類化抗體，其包含獲自抗CD40_12E12.3F3、抗CD40_11B6.1C3或抗CD40_12B4.2C10抗體之CDRs。嵌合抗體之一個實例包括來源於人類之重鏈與輕鏈可變域，例如抗CD40_12E12.3F3抗體之可變域，其為SEQ ID NO.：148及SEQ ID NO.：149之一部分；抗CD40_12B4.2C10之可變域，其在SEQ ID NO.：150及SEQ ID NO.：151或SEQ ID NO.：152中；及/或抗CD40_11B6.1C3之可變域，其在SEQ ID NO.：153及SEQ ID NO.：154中；或其組合。恆定區域較佳亦包含適合之人類恆定區域，例如「Sequences of Proteins of Immunological Interest」,Kabat E.A.等人，美國衛生及公共服務部(US Department of Health and Human Services)，公共衛生署(Public Health Service)，美國國立衛生研究院(National Institute of Health)所述。核酸序列可見於例如SEQ ID NO.：8及9中。
高變區可與各種構架區(例如人類來源之構架區)結合。適合之構架區由Kabat E.A描述。一重鏈構架為如下重鏈構架，例如抗CD40_12E12.3F3抗體之重鏈構架，其為SEQ ID NO.：149之一部分；抗CD40_12B4.2C10之重鏈構架-SEQ ID NO.：151或SEQ ID NO.：152；及/或抗CD40_11B6.1C3之重鏈構架-SEQ ID NO.：154；或其組 合，例如FR1L、FR2L、FR3L及FR4L區。以類似方式，SEQ ID NO.148展示抗CD40_12E12.3F3(或抗CD40_12B4.2C10及抗CD40_11B6.1C3之等效物，分別為SEQ ID NO.：150及153)重鏈構架，該構架包括FR1H、FR2H、FR3H及FR4H區之序列。CDR可添加至人類抗體構架中，諸如頒予Rybak等人之7,456,260中所述，該案教示新穎人類可變鏈構架區及包含該等構架區之人類化抗體，該案之相關部分及構架序列以引用的方式併入本文中。為實現在遺傳層面上移植，本發明亦包括VL及VH區以及完整抗體及其人類化型式的潛在核酸序列。本發明之核酸序列包括分別為抗CD40抗體輕鏈及重鏈的SEQ ID NO.：155及156，以及包括用於相同胺基酸序列及其在核酸或胺基酸層面上具有85、90、95或100%序列一致性的保守變化形式之可變密碼子之核酸序列。同樣，CDR可在核酸或胺基酸層面上個別地、成群地或2個、3個、4個或5個或所有CDR同時具有85、90、95或100%序列一致性。
針對天然存在於所有人類中之蛋白質所產生的單株抗體通常產生於非人類系統(例如小鼠)中，且因此通常為非人類蛋白質。作為此情形之直接後果，由融合瘤產生之異種抗體在投與人類時會引發不當免疫反應，該反應主要由異種免疫球蛋白之恆定部分介導。異種抗體趨向於引發宿主免疫反應，從而限制此等抗體之使用，因為其不能長期投與。因此，使用在投與人類時不太可能引發實質上同種異體反應之單鏈抗體、單域抗體、嵌合抗體、CDR移植抗體或尤其人類抗體尤其有用。本發明包括胺基酸序列具有微小變化(諸如缺失、添加或取代一個、數個或甚至若干個胺基酸)之抗體，其僅為初始蛋白質之具有實質上相同特性之對偶基因形式。
CD40與其受體結合之抑制作用宜在各種檢驗中進行測試，該等檢驗包括以下正文中所述之此等檢驗。術語「在相同程度上」意謂在 一種上述檢驗中，基於統計學，參考分子及等效分子展現基本上相同之CD40結合抑制曲線。舉例而言，所用檢驗可為利用本發明之結合分子競爭性抑制CD40結合的檢驗。
一般而言，人類抗CD40抗體包含至少：(a)一輕鏈，其包含胺基酸序列實質上與SEQ ID NO：1所示之胺基酸序列一致、以位置1之胺基酸起始且以位置107之胺基酸終止的可變域、及人類輕鏈之恆定部分；及(b)一重鏈，其包含胺基酸序列實質上與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列一致的可變域及人類重鏈之恆定部分。人類重鏈之恆定部分可為γ1、γ2、γ3、γ4、μ、β2或δ或ε型，較佳為γ型，而人類輕鏈之恆定部分可為κ或λ型(其包括λ1、λ2及λ3亞型)，但較佳為κ型。可變域及恆定域之一般位置之胺基酸序列為此項技術中所熟知且一般遵循Kabat命名法。
本發明之CD40結合分子可由重組DNA技術產生。鑒於此，必須建構一或多個編碼該結合分子之DNA分子，置於適當控制序列下，且轉移至適合的宿主生物體中進行表現。
因此，以極一般方式提供：(i)編碼本發明之單域CD40結合分子、本發明之單鏈CD40結合分子、本發明之CD40結合分子之重鏈或輕鏈或其片段的DNA分子；及(ii)本發明之DNA分子藉由重組方法產生本發明之CD40結合分子的用途。
本發明之目前最佳狀態使得熟習此項技術之工作人員可在給予本文所提供之資訊(亦即高變區之胺基酸序列及編碼其之DNA序列)的情況下合成本發明之DNA分子。建構可變域基因之方法例如描述於EPA 239 400中，該案之相關部分以引用的方式併入本文中。簡言之，選殖編碼MAb之可變域的基因。確定編碼構架區及高變區之DNA區段，且移除編碼高變區之DNA區段，使得編碼構架區之DNA區段與適合的限制位點在接合點融合在一起。限制位點可藉由用標準程序 突變誘發DNA分子而在適當位置產生。雙股合成CDR卡匣係藉由DNA合成根據SEQ ID NO：1及3或2及4之序列(分別為胺基酸及核酸序列)來製備。該等卡匣通常具有黏性末端，使得其可在構架之接合點接合。
無需使用來自生產融合瘤細胞株之mRNA來獲得編碼本發明之CD40結合分子的DNA構築體。舉例而言，PCT申請案WO 90/07861為在僅給予關於基因之核苷酸序列的書面資訊之情況下由重組DNA技術產生抗體提供完整說明，該案之相關部分以引用的方式併入本文中。簡言之，該方法包含合成多個寡核苷酸，由PCR方法使其擴增及對其進行剪接以得到所需DNA序列。
包含適合啟動子或編碼重鏈及輕鏈恆定部分之基因的表現載體為公開可獲得的。因此，本發明之DNA分子在製備之後宜轉移至適當表現載體中。編碼單鏈抗體之DNA分子亦可由例如WO 88/1649所述之標準方法製備。鑒於以上情況，無需遵照充分描述之準則寄存融合瘤或細胞株。
舉例而言，製備特異性結合CD40之第一及第二DNA構築體。簡言之，第一DNA構築體編碼輕鏈或其片段且包含a)編碼交替地包含構架區及高變區之可變域的第一部分，該等高變區依次為CDR1L、CDR2L及CDR3L，其胺基酸序列展示於SEQ ID NO：1中；此第一部分以編碼可變域之第一胺基酸的密碼子起始，且以編碼可變域之最後一個胺基酸的密碼子終止，及b)編碼輕鏈恆定部分或其片段之第二部分，其以編碼重鏈恆定部分之第一胺基酸的密碼子起始，且以編碼恆定部分或其片段之最後一個胺基酸的密碼子終止，繼之為終止密碼子。
第一部分編碼胺基酸序列實質上與SEQ ID NO.1所示之胺基酸序列一致的可變域。第二部分編碼人類重鏈之恆定部分，更佳人類γ1鏈 之恆定部分。此第二部分可為基因組來源之DNA片段(包含內含子)或cDNA片段(無內含子)。
第二DNA構築體編碼重鏈或其片段，且包含a)編碼交替地包含構架區及高變區之可變域的第一部分；該等高變區為CDR1H及視情況存在之CDR2H及CDR3H，其胺基酸序列展示於SEQ ID NO：2中；此第一部分以編碼可變域之第一胺基酸的密碼子起始，且以編碼可變域之最後一個胺基酸的密碼子終止，及b)編碼重鏈恆定部分或其片段之第二部分，其以編碼輕鏈恆定部分之第一胺基酸的密碼子起始，且以編碼恆定部分或其片段之最後一個胺基酸的密碼子終止，繼之為終止密碼子。
第一部分編碼胺基酸序列實質上與SEQ ID NO：2所示之胺基酸序列一致的可變域。第一部分具有如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列，該序列以位置1之核苷酸起始，且以位置321之核苷酸終止。亦較佳地，第二部分編碼人類輕鏈之恆定部分，更佳人類κ鏈之恆定部分。
本發明亦包括CD40結合分子，其中CDR1L、CDR2L、CDR3L、CDR1H、CDR2H或CDR3H或構架(通常僅少數，例如FR1-4L或FR1-4H)之一或多個殘基藉由例如相應DNA序列之定點突變誘發而自SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38所示之殘基發生變化。本發明包括編碼此等變化之CD40結合分子的DNA序列。詳言之，本發明包括如下CD40結合分子，其中CDR1L、CDR2L及/或CDR3L之一或多個殘基自SEQ ID NO.37所示之殘基發生變化且CDR1H、CDR2H及/或CDR3H之一或多個殘基自SEQ ID NO.38所示之殘基發生變化。
各DNA構築體均置於適合控制序列之控制下，詳言之置於適合啟動子之控制下。可使用各種啟動子，其限制條件為其適合於宿主生物體，DNA構築體將轉移至該宿主生物體中進行表現。然而，若在哺乳動物細胞中進行表現，則可在B細胞中使用免疫球蛋白基因啟動 子。第一及第二部分可由內含子分隔，且增強子宜定位於第一與第二部分之間的內含子中。此類經轉錄但未經轉譯之增強子之存在可輔助有效轉錄。在特定實施例中，第一及第二DNA構築體包含例如重鏈人類基因之增強子。
所需抗體可在細胞培養物中或在轉殖基因動物中產生。適合之轉殖基因動物可根據標準方法獲得，該等標準方法包括在卵中顯微注入置於適合控制序列下之第一及第二DNA構築體，轉移如此製備之卵至適當假孕雌性動物中，及選擇表現所需抗體之後代。
本發明亦提供能夠在原核或真核細胞株中複製之表現載體，其包含至少一種上述DNA構築體。隨後轉移各含DNA構築體之表現載體至適合之宿主生物體中。當DNA構築體分別插入兩個表現載體上時，其可分別轉移，亦即每個細胞轉移一類載體，或共同轉移，此後一可能性為較佳的。適合之宿主生物體可為細菌、酵母或哺乳動物細胞株，此最後一種情形為較佳的。哺乳動物細胞株更佳來源於淋巴，例如骨髓瘤、融合瘤或正常永生化B細胞，其不宜表現任何內源抗體重鏈或輕鏈。
當在細胞培養物中產生抗體鏈時，DNA構築體必須首先插入單一表現載體中或兩個獨立但相容之表現載體中，後一可能性為較佳的。為在哺乳動物細胞中表現，CD40結合分子之編碼序列較佳整合於宿主細胞DNA中之基因座內，此使得可大量表現或有利於大量表現CD40結合分子。
在本發明之另一態樣中，提供一種產生CD40結合分子之方法，其包含：(i)培養用如上文所定義之表現載體轉型之生物體；及(ii)自培養物回收CD40結合分子。
根據本發明，已發現抗CD40_12E12.3F3、抗CD40_12B4.2C10及/或抗CD40_11B6.1C3抗體顯現出對人類CD40之抗原決定基(antigenic epitope)具有結合特異性。因此，最令人驚訝的是，針對此抗原決定基之抗體(例如抗CD40_12E12.3F3抗體)能夠將抗原有效傳遞至樹突狀細胞(DC)中。對成熟人類CD40之抗原決定基具有結合特異性之抗體，詳言之嵌合抗體及CDR移植抗體及尤其人類抗體；及此等抗體用於DC抗原負載之用途為新穎的且包括在本發明之範疇內。
為使用本發明之抗CD40抗體治療適應症，適當劑量當然應視例如欲使用之本文所揭示抗體、宿主、投藥模式及所治療病狀之性質及嚴重性而變化。然而，在預防性使用時，在每公斤體重約0.05mg至約10mg、更通常每公斤體重約0.1mg至約5mg之劑量下一般會發現令人滿意之結果。用於預防性使用之給藥頻率通常在每週約一次至每3個月約一次之範圍內，更通常在每2週約一次至每10週約一次之範圍內，例如每4至8週一次。本發明之抗CD40抗體可非經腸投與、靜脈內投與(例如至肘前或其他周邊靜脈中)、肌肉內投與或皮下投與。
本發明之醫藥組合物可以習知方式例如以凍乾形式製備。為即刻投藥，將其溶解於適合之水性載劑中，該載劑例如無菌注射用水或無菌緩衝生理食鹽水。若認為需要配置較大體積之溶液以藉由輸注而非快速注射投與，則宜在調配時於生理食鹽水中併入人類血清白蛋白或患者自身之肝素化血液。過量此生理學惰性蛋白質之存在會防止抗體因吸附於用於輸注溶液之容器及管之壁上而損失。若使用白蛋白，則適合濃度為生理食鹽水溶液之0.5至4.5重量%。
本發明之一實施例提供一種免疫結合物，其包含本發明之人類化抗體(例如人類化抗CD40抗體)與一或多個效應分子、抗原及/或可偵測標記連接。較佳地，效應分子為治療性分子，諸如一或多種包含一或多個T細胞抗原決定基之肽、毒素、小分子、細胞激素或趨化因子、酶或放射性標記。
例示性毒素包括(但不限於)綠膿桿菌(Pseudomonas)外毒素或白喉 毒素。小分子之實例包括(但不限於)化學治療化合物，諸如紫杉醇(taxol)、小紅莓(doxorubicin)、依託泊苷(etoposide)及博來黴素(bleiomycin)。例示性細胞激素包括(但不限於)IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6及IL-12、IL-17及IL-25。例示性酶包括(但不限於)核糖核酸酶、去氧核糖核酸酶、蛋白酶、激酶及卡斯蛋白酶。例示性放射性同位素包括(但不限於)32P及125I。
如本文所用之術語「抗原決定基」係指能夠刺激免疫反應之分子或物質。在一實例中，抗原決定基包括(但不限於)多肽及編碼多肽之核酸，其中在多肽經處理且在主要組織相容性複合體(MHC)分子上呈獻時核酸在多肽中表現能夠刺激免疫反應。抗原決定基一般包括呈獻於細胞表面上與I類或II類MHC之結合凹槽非共價結合之肽，使得其可與T細胞受體及各別T細胞輔助分子相互作用。
蛋白水解處理抗原。由MHC呈現於抗原呈獻細胞上之抗原決定基為較大肽或蛋白質抗原前驅體之裂解肽或產物。對於MHC I抗原決定基，蛋白質抗原通常由細胞中存在之蛋白酶體消化。細胞內蛋白酶體消化產生長度為約3至23個胺基酸之肽片段，該等片段隨後負載於MHC蛋白上。細胞內或在細胞外環境中之其他蛋白水解活性可進一步修整及處理此等片段。MHC II類抗原決定基一般經由來自溶酶體/內體區隔之細胞內蛋白酶進行處理。在一實施例中，本發明包括預處理肽，該等肽與直接引導其至抗原呈獻細胞之抗CD40抗體(或其片段)連接，其中針對該等肽探求增強之免疫反應。
為鑑別可能有效作為免疫原性化合物的抗原決定基，僅預測MHC結合為適用但通常並不足夠的。本發明包括特異性鑑別抗原內很可能產生針對特定來源之抗原呈獻細胞及反應T細胞所探求之免疫反應的抗原決定基之方法。
本發明使得可進行快速且簡易之檢驗以鑑別很可能使用患者自 身之抗原呈獻細胞及T細胞譜系產生所需免疫反應的抗原決定基。本發明之組合物及方法適用於任何蛋白質序列，使得使用者可鑑別能夠結合MHC且適當地向對該抗原起反應之T細胞呈獻的抗原決定基。因此，本發明不限於任何特定標的或醫學病狀，而是涵蓋來自任何有用來源之MHC抗原決定基。
如本文所用之術語「切接(veneered)」係指人類化抗體構架，在該構架上將由非人類抗體(例如小鼠、大鼠或倉鼠)獲得之抗原結合位點或CDR置於人類重鏈及輕鏈保守結構構架區(FR)中，例如置於輕鏈或重鏈聚核苷酸中，以將非人類抗體之特異性「移植」於人類構架中。表現經切接抗體之聚核苷酸表現載體可轉染至哺乳動物細胞中以表現展現非人類抗體之抗原特異性的重組人類抗體，且將經歷會提高其表現、穩定性、溶解性或其組合的轉譯後修飾。
抗原。
用於本發明之病毒抗原之實例包括(但不限於)例如HIV、HCV、CMV、腺病毒、反轉錄病毒、小核糖核酸病毒等。反轉錄病毒抗原之非限制性實例諸如來自人類免疫缺乏病毒(HIV)抗原的反轉錄病毒抗原，諸如gag、pol及env基因之基因產物、Nef蛋白、反轉錄酶及其他HIV組份；肝炎病毒抗原，諸如B型肝炎病毒之S、M及L蛋白、B型肝炎病毒之前S抗原，及其他肝炎(例如A型肝炎、B型肝炎及C型肝炎)病毒組份(諸如C型肝炎病毒RNA)；流行性感冒病毒抗原，諸如血球凝集素及神經胺酸酶及其他流行性感冒病毒組份；麻疹病毒抗原，諸如麻疹病毒融合蛋白及其他麻疹病毒組份；風疹病毒抗原，諸如蛋白質E1及E2及其他風疹病毒組份；輪狀病毒抗原，諸如VP7sc及其他輪狀病毒組份；細胞巨大病毒抗原，諸如包膜醣蛋白B及其他細胞巨大病毒抗原組份；呼吸道融合性病毒抗原，諸如RSV融合蛋白、M2蛋白及其他呼吸道融合性病毒抗原組份；單純疱疹病毒抗原，諸如即 刻早期蛋白、醣蛋白D及其他單純疱疹病毒抗原組份；水痘帶狀皰狀病毒抗原，諸如gpI、gpII及其他水痘帶狀皰狀病毒抗原組份；日本腦炎病毒抗原，諸如蛋白質E、M-E、M-E-NS1、NS1、NS1-NS2A、80% E及其他日本腦炎病毒抗原組份；狂犬病病毒抗原，諸如狂犬病醣蛋白、狂犬病核蛋白及其他狂犬病病毒抗原組份。對於病毒抗原之其他實例，參見Fundamental Virology，第2版，Fields,B.N.及Knipe,D.M.編(Raven Press,New York,1991)。至少一種病毒抗原可為來自腺病毒、反轉錄病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、輪狀病毒、漢坦病毒(hantavirus)、冠狀病毒、披衣病毒、黃病毒、棒狀病毒、副黏液病毒、正黏液病毒、崩芽病毒(bunyavirus)、沙粒狀病毒、里奧病毒(reovirus)、乳突狀瘤病毒、小病毒、痘病毒、嗜肝DNA病毒(hepadnavirus)或海綿狀病毒之肽。在某些特定非限制性實例中，至少一種病毒抗原為獲自HIV病毒、CMV病毒、A型肝炎病毒、B型肝炎及C型肝炎病毒、流行性感冒病毒、麻疹病毒、脊髓灰白質炎病毒、天花病毒、風疹病毒、呼吸道融合性病毒、單純疱疹病毒、水痘帶狀皰狀病毒、EB病毒、日本腦炎病毒、狂犬病病毒、流行感冒病毒及/或冷病毒中之至少一者之肽。
在一態樣中，一或多種抗原肽係選自以下至少一者：Nef(66-97)：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.：1)；Nef(116-145)：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKL(SEQ ID NO.：2)；Gag p17(17-35)：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.：3)；Gag p17-p24(253-284)：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.：4)；或Pol 325-355(RT 158-188)：AIFQSSMTKILE PFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.：5)。在一態樣中，融合蛋白肽由一或多個選自以下之連接子分隔：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.：11)；PTSTPADSSTI TPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)；TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)；或TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)。
可使用本發明之抗CD40-抗原疫苗傳遞之抗原標的包括編碼諸如病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原或寄生蟲抗原之抗原的基因。病原體包括錐體蟲(trypanosome)、條蟲(tapeworm)、蛔蟲(roundworm)、蠕蟲(helminth)、瘧疾。諸如胚胎抗原或前列腺特異性抗原之腫瘤標記可以此方式作為標的。其他實例包括：HIV env蛋白及B型肝炎表面抗原。出於疫苗接種目的而投與本發明之載體應需要載體所結合之抗原具有足夠非免疫原性以使得可長期表現轉殖基因，此長期表現需要強烈免疫反應。在一些情況下，個體可能僅偶爾需要接種疫苗，諸如一年一次或兩年一次接種疫苗，且提供針對感染劑之長期免疫保護。在本發明中用於載體中且最終用作抗原之生物體、過敏原及核酸及胺基酸序列之特定實例可見於美國專利第6,541,011號中，該專利之相關部分、詳言之可用於本發明之使生物體與特定序列匹配之表以引用的方式併入本文中。
用於本文所揭示之抗CD40-抗原疫苗之細菌抗原包括(但不限於)：例如，細菌抗原，諸如百日咳毒素、絲狀血球凝集素、百日咳菌黏附素、FIM2、FIM3、腺苷酸環化酶及其他百日咳細菌抗原組份；白喉細菌抗原，諸如白喉毒素或類毒素及其他白喉細菌抗原組份；破傷風細菌抗原，諸如破傷風毒素或類毒素及其他破傷風細菌抗原組份；鏈球菌細菌抗原(streptococcal bacterial antigen)，諸如M蛋白質及其他鏈球菌細菌抗原組份；革蘭氏陰性芽孢桿菌(bacilli)細菌抗原，諸如脂多醣及其他革蘭氏陰性細菌抗原組份；結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)細菌抗原，諸如黴菌酸、熱休克蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白、抗原85A及其他分枝桿菌抗原組 份；幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)細菌抗原組份；肺炎球菌細菌抗原(pneumococcal bacterial antigen)，諸如肺炎球菌溶血素(pneumolysin)、肺炎球菌莢膜多醣(pneumococcal capsular polysaccharide)及其他肺炎球菌細菌抗原組份；流行性感冒桿菌(haemophilus influenza)細菌抗原，諸如莢膜多醣及其他流行性感冒桿菌細菌抗原組份；炭疽細菌抗原，諸如炭疽保護性抗原及其他炭疽細菌抗原組份；立克次體(rickettsiae)細菌抗原，諸如rompA及其他立克次體細菌抗原組份。本文所述之細菌抗原亦包括任何其他細菌抗原、分枝桿菌抗原(mycobacterial antigen)、支原體抗原(mycoplasmal antigen)、立克次體抗原(rickettsial antigen)或衣原體抗原(chlamydial antigen)。部分或整個病原體亦可為：流行性感冒桿菌；惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)；腦膜炎球菌(neisseria meningitidis)；肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae)；淋病雙球菌(neisseria gonorrhoeae)；沙氏桿菌(salmonella)血清型typhi；志賀桿菌(shigella)；霍亂弧菌(vibrio cholerae)；登革熱(Dengue Fever)；腦炎；日本腦炎；萊姆病(lyme disease)；鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)；西方尼耳病毒(west nile virus)；黃熱病；兔熱病；肝炎(病毒；細菌)；RSV(呼吸道融合性病毒)；HPIV 1及HPIV 3；腺病毒；天花；過敏症；及癌症。
用於本發明之組合物及方法的真菌抗原包括(但不限於)：例如，念珠菌(candida)真菌抗原組份；組織漿菌(histoplasma)真菌抗原，諸如熱休克蛋白60(HSP60)及其他組織漿菌真菌抗原組份；隱球菌真菌抗原(cryptococcal fungal antigen)，諸如莢膜多醣及其他隱球菌真菌抗原組份；球黴菌(coccidiodes)真菌抗原，諸如小球抗原及其他球黴菌真菌抗原組份；及癬真菌抗原(tinea fungal antigen)，諸如髮癬菌素及其他球黴菌真菌抗原組份。
原蟲及其他寄生蟲抗原之實例包括(但不限於)：例如，惡性瘧原蟲抗原，諸如裂殖子表面抗原、子孢子表面抗原、環子孢子抗原、配子細胞/配子表面抗原、血內期(blood-stage)抗原pf 155/RESA及其他瘧原蟲抗原組份；弓蟲(toxoplasma)抗原，諸如SAG-1、p30及其他弓蟲抗原組份；血吸蟲(schistosomae)抗原，諸如麩胱甘肽-S-轉移酶、副肌球蛋白及其他血吸蟲抗原組份；利什曼原蟲(leishmania)主要抗原及其他利什曼原蟲抗原，諸如gp63、脂磷酸聚糖及其相關蛋白質及其他利什曼原蟲抗原組份；及克氏錐蟲(trypanosoma cruzi)抗原，諸如75-77kDa抗原、56kDa抗原及其他錐蟲抗原(trypanosomal antigen)組份。
可在使用本發明之抗CD40-抗原疫苗時作為標的之抗原一般應基於多種因素加以選擇，該等因素包括：內化可能性、免疫細胞特異性程度、作為標的之免疫細胞類型、免疫細胞成熟及/或活化程度及其類似因素。在此實施例中，抗體可為單特異性抗體或包括一個抗CD40結合域及一個針對第二抗原之結合域的雙特異性抗體，該第二抗原例如樹突狀細胞之細胞表面標記，諸如MHC I類、MHC II類、B7-2、CD18、CD29、CD31、CD43、CD44、CD45、CD54、CD58、CD83、CD86、CMRF-44、CMRF-56、DCIR及/或Dectin-1及其類似物；而在一些情況下亦不存在CD2、CD3、CD4、CD8、CD14、CD15、CD16、CD 19、CD20、CD56及/或CD57。抗原呈獻細胞之細胞表面標記的實例包括(但不限於)MHC I類、MHC II類、CD45、B7-1、B7-2、IFN-γ受體及IL-2受體、ICAM-1及/或Fcγ受體。T細胞之細胞表面標記的實例包括(但不限於)CD3、CD4、CD8、CD 14、CD20、CD11b、CD16、CD45及HLA-DR。
細胞表面上用於傳遞之標的抗原包括腫瘤抗原之通常源自腫瘤組織細胞之細胞表面、細胞質、細胞核、細胞器及其類似物之特徵。 本發明抗體部分之腫瘤標的之實例包括(但不限於)血液科癌症，諸如白血病及淋巴瘤；神經腫瘤，諸如星形細胞瘤或膠質母細胞瘤；黑色素瘤；乳癌；肺癌；頭頸癌；胃腸腫瘤，諸如胃癌或結腸癌；肝癌；胰腺癌；泌尿生殖腫瘤，諸如子宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、陰道癌、睪丸癌、前列腺癌或陰莖癌；骨腫瘤；血管腫瘤；或唇、鼻咽、咽及口腔、食道、直腸、膽囊、膽樹、喉、肺及支氣管、膀胱、腎、腦及神經系統其他部分、甲狀腺之癌症；霍奇金氏症(Hodgkin's disease)；非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)；多發性骨髓瘤；及白血病。
可使用本發明單獨或組合向免疫細胞傳遞以進行抗原呈獻之抗原的實例包括腫瘤蛋白，例如突變之致癌基因；與腫瘤相關之病毒蛋白；及腫瘤黏蛋白及醣脂。抗原可為與腫瘤相關之病毒蛋白，應為來自上述病毒類別之抗原。某些抗原可為腫瘤之特徵(為腫瘤前驅細胞通常不表現之蛋白質的一個亞群)，或可為通常在腫瘤前驅細胞中表現但具有腫瘤之突變特徵的蛋白質。其他抗原包括正常蛋白質之具有改變之活性或亞細胞分布(例如產生腫瘤抗原之基因突變)的突變變異體。
用於抗CD40-融合蛋白疫苗之腫瘤抗原的特定非限制性實例包括例如CEA、前列腺特異性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、MAGE 6及MAGE 12、MUC(黏蛋白)(例如MUC-1、MUC-2等)、GM2及GD2神經節苷脂、ras、myc、酪胺酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、Pmel 17(gp100)、GnT-V內含子V序列(N-乙醯基葡糖胺基轉移酶V內含子V序列)、前列腺Ca psm、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-索烴素、MUM-1-B(黑色素瘤普遍存在之突變基因產物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、MAGE、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、c-ERB2(Her2/neu)、DAGE、EBNA(EB病毒細胞核抗原)1-6、gp75、 人類乳突狀瘤病毒(HPV)E6及E7、p53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2、Ki-67、細胞週期素B1、gp100、存活素及NYESO-1。
另外，免疫原性分子可為參與自體免疫疾病之起始及/或傳播的自體抗原，自體免疫疾病之病理學主要歸因於對相關標的器官、組織或細胞所表現之分子具有特異性之抗體的活性，例如SLE或MG。在此等疾病中，可需要將正在進行之抗體介導之(亦即Th2型)對相關自體抗原之免疫反應朝向細胞(亦即Th1型)免疫反應引導。或者，可需要藉由預防性誘發對適當自體抗原之Th1反應來預防尚未罹患但懷疑易患相關自體免疫疾病的個體中對自體抗原之Th2反應之發作或降低該Th2反應之水準。所關注之自體抗原包括(但不限於)(a)對於SLE，史密斯蛋白(Smith protein)、RNP核糖核蛋白及SS-A及SS-B蛋白；及(b)對於MG，乙醯膽鹼受體。參與一或多種類型的自體免疫反應之其他各種抗原之實例包括例如內源激素，諸如黃體促素、濾泡促素、睪固酮、生長激素、促乳素及其他激素。
參與自體免疫疾病、過敏症及移植排斥之抗原可用於本發明之組合物及方法中。舉例而言，參與任何一或多種以下自體免疫疾病或病症之抗原均可用於本發明：糖尿病(diabetes/diabetes mellitus)、關節炎(包括類風濕性關節炎、青少年類風濕性關節炎、骨關節炎、牛皮癬性關節炎)、多發性硬化症、重症肌無力、全身性紅斑狼瘡、自體免疫甲狀腺炎、皮炎(包括異位性皮炎及濕疹性皮炎)、牛皮癬、修格蘭氏症候群(Sjogren's Syndrome)(包括修格蘭氏症候群繼發性乾燥性角膜結膜炎)、斑形脫髮、歸因於節肢動物咬傷反應之過敏反應、克羅恩氏症(Crohn's disease)、口瘡性潰瘍、虹膜炎、結膜炎、角膜結膜炎、潰瘍性結腸炎、哮喘、過敏性哮喘、皮膚紅斑狼瘡、硬皮病、陰道炎、直腸炎、藥物性紅疹、麻風逆向反應、麻風結節性紅斑、自體免疫性葡萄膜炎、過敏性腦脊髓炎、急性壞死性出血性腦病、特發 性兩側進行性感覺神經性聽覺損失、再生不全性貧血、純紅血球性貧血、特發性血小板減少症、多軟骨炎、韋格納氏肉芽腫(Wegener's granulomatosis)、慢性活動性肝炎、史蒂芬-瓊森症候群(Stevens-Johnson syndrome)、特發性脂肪瀉、扁平苔癬、克羅恩氏症、葛瑞夫茲氏眼病(Graves ophthalmopathy)、類肉瘤病、原發性膽汁性肝硬化、後葡萄膜炎及肺間質纖維化。參與自體免疫疾病之抗原之實例包括麩胺酸脫羧酶65(GAD 65)、天然DNA、髓鞘鹼性蛋白、髓鞘蛋白脂質蛋白、乙醯膽鹼受體組份、甲狀腺球蛋白及甲狀腺促素(TSH)受體。
參與過敏症之抗原之實例包括花粉抗原，諸如日本扁柏(Japanese cedar)花粉抗原、豚草花粉(ragweed pollen)抗原、黑麥草(rye grass)花粉抗原；動物衍生之抗原，諸如塵蟎(dust mite)抗原及貓(feline)抗原；組織相容性抗原；及青黴素；及其他治療藥物。參與移植排斥之抗原之實例包括欲移植至移植接受者中之移植物的抗原組份，諸如心臟、肺、肝、胰臟、腎及神經移植物組份。抗原可為適用於治療自體免疫疾病之改變的肽配位體。
熟習此項技術者應瞭解，任何蛋白質效應分子之序列均可以不會實質上影響效應蛋白之功能優勢的方式改變。舉例而言，通常認為甘胺酸及丙胺酸可互換，天冬胺酸及麩胺酸以及天冬醯胺及麩醯胺酸亦如此。熟習此項技術者應認識到，效應序列之諸多不同變化形式將編碼與天然效應子具有大致相同活性之效應子。效應分子與抗體可如上所述藉由化學方式或藉由重組方式結合。化學修飾包括例如出於使效應分子與抗體彼此直接連接或經由連接化合物連接之目的由蛋白質化學技術中熟知之方法進行衍生。共價與非共價連接方式均可用於本發明之人類化抗體。
使效應分子與抗體連接之程序應根據欲連接於抗體之部分的化 學結構變化。多肽通常含有多種官能基；例如羧酸基(COOH)、游離胺基(--NH2)或硫氫基(--SH)，其可用於與抗體上適合之官能基反應以使效應分子進行結合。或者，抗體可例如藉由連接多種連接分子中之任一者(諸如購自Pierce Chemical Company,Rockford Ill之分子)而衍生化以暴露於或連接其他反應性官能基。
連接子能夠與抗體及效應分子均形成共價鍵。適合之連接子為熟習此項技術者所熟知，且包括(但不限於)直鏈或分支鏈碳連接子、雜環碳連接子或肽連接子。若抗體及效應分子為多肽，則連接子可經由組份胺基酸之側基(例如經由半胱胺酸之二硫鍵)與該等胺基酸接合。然而，在一較佳實施例中，連接子應與末端胺基酸之α碳胺基及羧基接合。
在一些情況下，當免疫結合物到達其標的位點時，可需要自抗體釋放效應分子。因此，在此等情況下，免疫結合物應包含可在標的位點附近裂解之鍵。免疫結合物在標的細胞內或標的位點附近所經受之酶活性或條件可加速連接子裂解以自抗體釋放效應分子。當標的位點為腫瘤時，可使用可在腫瘤位點處所存在之條件下(例如當暴露於腫瘤結合酶或酸性pH值時)裂解的連接子。
本發明之效應分子及抗體的例示性化學修飾亦包括根據熟知方法用聚乙二醇(PEG)衍生化以延長存在於循環系統中之時間且降低免疫原性(參見例如Lisi等人，Applied Biochem.4：19(1982)；Beauchamp等人，Anal Biochem.131：25(1982)；及Goodson等人，Bio/Technology 8：343(1990))。
本發明涵蓋用於主動與被動免疫實施例中之疫苗。經建議適用作疫苗之免疫原性組合物可能最易於直接由以本文所揭示方式製備之免疫原性T細胞刺激肽製備。最終疫苗接種物質經充分透析以移除不當小分子量分子，且/或經凍乾以更易於調配為所需運載體(vehicle)。 在本發明之特定實施例中，使用本發明之組合物及方法來製備細胞疫苗，例如使用抗體之傳遞抗原的抗CD40結合部分向抗原呈獻細胞引導抗原，隨後該抗原呈獻細胞將抗原「負載」於MHC蛋白上進行呈獻。因此，細胞疫苗為以下抗原呈獻細胞，其已使用本發明之組合物經負載以產生負載抗原之抗原呈獻細胞。
當疫苗自身為抗CD40結合蛋白(例如完整抗體或其片段)時，則此等「活性成份」可使用此項技術中瞭解之方法製成疫苗，該等方法例如美國專利第4,608,251號、第4,601,903號、第4,599,231號、第4,599,230號及第4.578,770號中之方法，該等專利之相關部分以引用的方式併入本文中。此等疫苗通常製備為可注射形式，例如液體溶液或懸浮液形式或適用於在注射之前再懸浮於液體中之固體形式。該製劑亦可經乳化。活性免疫原性成份通常與醫藥學上可接受且與活性成份相容之賦形劑混合。適合之賦形劑為例如水、生理食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇或其類似物，及其組合。另外，疫苗必要時可含有少量助劑，諸如濕潤劑或乳化劑、pH緩衝劑或提高疫苗有效性之佐劑。
疫苗以與劑量調配物相容之方式且以治療有效且具有免疫原性之量投與。欲投與之量取決於欲治療之個體，包括例如個體免疫系統產生免疫反應之能力。需要投與之細胞或活性成份之精確量取決於醫師之判斷。然而，細胞疫苗之適合劑量範圍為大約數千個細胞(至數百萬個細胞)。對於標準抗原決定基或抗原決定基傳遞疫苗，則疫苗可為每次疫苗接種存在數百微克活性成份。初始投藥及後續疫苗注射(booster shot)之適合方案亦可變，但典型方案為初始投藥、隨後接種或其他投藥。
然而，應用方式可廣泛變化，本文中之某些實施例將很可能經靜脈內傳遞或在腫瘤或感染位點直接傳遞。無論如何，任何投與疫苗 之習知方法均為適用的。疫苗之劑量將取決於投藥途徑且將視宿主之大小而變化。
在許多情況下，將需要多次投與疫苗，例如每週或每隔一週提供4至6次疫苗接種。正常疫苗接種方案通常應間隔2至12週或間隔3至6週進行。週期性後續疫苗可能需要間隔1-5年，通常間隔3年以維持免疫反應之保護水準或在可能緩解或再感染之後維持保護水準。免疫過程之後可進行例如T細胞活化、細胞激素分泌或甚至抗體產生之檢驗，該等檢驗最常在活體外進行。此等免疫反應檢驗為吾人所熟知且可見於多種專利中且如本文所教示。
本發明之疫苗可視核酸載體是否使用、最終純化之蛋白質或所用之最終疫苗形式而以一或多個「單位劑量」形式提供。單位劑量係定義為含有經計算產生所需反應之預定量的治療性組合物，該量與治療性組合物之投藥(亦即合適途徑及治療方案)有關。欲投與之量及特定途徑及調配物在臨床技術人員之技能範疇內。亦可評估欲治療之個體，詳言之個體免疫系統之狀況及所需保護。單位劑量無需以單次注射形式投與，而可包括經固定時間段連續輸注。本發明之單位劑量宜以DNA/公斤(或蛋白質/公斤)體重為單位進行描述，投與範圍為約0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.5、1、10、50、100、1,000或更多毫克DNA或蛋白質/公斤體重。
同樣，所傳遞之抗CD40-抗原疫苗之量可自約0.2毫克/公斤體重至約8.0毫克/公斤體重變化。因此，在特定實施例中，可活體內傳遞0.4mg、0.5mg、0.8mg、1.0mg、1.5mg、2.0mg、2.5mg、3.0mg、4.0mg、5.0mg、5.5mg、6.0mg、6.5mg、7.0mg及7.5mg疫苗至個體。欲投與之疫苗之劑量在很大程度上取決於所治療個體之體重及身體情況以及投藥途徑及治療頻率。包括預結合至脂質體或病毒傳遞載體之裸聚核苷酸的醫藥組合物可以介於1μg至1mg聚核苷酸或1 μg至100mg蛋白質之範圍內的量投與。因此，特定組合物可包括約1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、100μg、150μg、200μg、250μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg或1,000μg聚核苷酸或蛋白質，該聚核苷酸或蛋白質獨立地結合1μg、5μg、10μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、100μg、150μg、200μg、250μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1mg、1.5mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg或100mg載體。
本發明之抗體可視情況與可偵測標記共價或非共價連接。適用於此用途之可偵測標記包括任何可由光譜、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學方法偵測之組合物。本發明之適用標記包括磁性珠粒(例如DYNABEADS®)、螢光染料(例如異硫氰酸螢光素、德克薩斯紅(Texas red)、若丹明(rhodamine)、綠色螢光蛋白及其類似物)、放射性標記(例如3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酶及ELISA中常用之其他酶)及比色標記(諸如膠體金或有色玻璃或塑膠(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠粒)。
偵測此等標記之方法為熟習此項技術者所熟知。因此，例如，放射性標記可使用感光膠片或閃爍計數器進行偵測，螢光標記可藉由使用光偵測器偵測所發射之照度來進行偵測。酶標記通常藉由提供酶以及受質且偵測藉由酶對受質之作用而產生的反應產物來進行偵測，且比色標記藉由簡單地觀測有色標記來進行偵測。
本發明之抗體及/或免疫結合物組合物尤其適用於非經腸投藥，諸如靜脈內投藥或投與至體腔中。用於投藥之組合物通常應包含抗體及/或免疫結合物溶解於醫藥學上可接受之載劑、較佳為水性載劑中之溶液。可使用多種水性載劑，例如緩衝生理食鹽水及其類似物。此 等溶液為無菌的且一般不含不當物質。此等組合物可利用習知、熟知滅菌技術滅菌。組合物可視需要含有醫藥學上可接受之助劑以接近生理條件，該等助劑諸如pH調節劑及緩衝劑、毒性調節劑及其類似物，例如乙酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、乳酸鈉及其類似物。融合蛋白在此等調配物中之濃度可廣泛變化，且主要應依據流體體積、黏度、體重及其類似因素，根據所選特定投藥模式及患者之需要進行選擇。
因此，本發明之用於靜脈內投與之典型醫藥免疫結合物組合物應為每位患者每天約0.1mg至10mg。可使用每位患者每天0.1mg至約100mg之劑量。製備可投與組合物之實際方法為熟習此項技術者已知或對於熟習此項技術者顯而易見，且較詳細描述於諸如REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE，第19版，Mack Publishing Company,Easton,Pa.(1995)之出版物中。
可投與本發明組合物以進行治療性處理。在治療性應用下，向罹患疾病之患者投與足以治癒或至少部分遏止該疾病及其併發症之量的組合物。適於實現此目的之量係定義為「治療有效劑量」。有效用於此用途之量應取決於疾病之嚴重性及患者之一般健康狀況。化合物之有效量為提供症狀之主觀緩解或由臨床醫師或其他有資格之觀察者注意到的客觀可鑑別之改良的量。
組合物之單次或多次投與視患者需要且耐受之劑量及頻率而投與。在任何情況下，組合物均應提供足量之本發明蛋白質以有效治療患者。較佳地，該劑量係投與一次，但可週期性應用直至達成治療結果或直至副作用成為療法停止之理由。一般而言，該劑量足以治療或改善疾病之症狀或徵兆而不會對患者產生不可接受之毒性。
本發明之免疫結合物組合物之控制釋放非經腸調配物可製成植入物、油性注射液或微粒系統形式。對於蛋白質傳遞系統之廣泛概 述，參見Banga,A.J.,THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS：FORMULATION,PROCESSING,AND DELIVERY SYSTEMS,Technomic Publishing Company,Inc.,Lancaster,Pa.,(1995)，其以引用的方式併入本文中。微粒系統包括微球體、微粒、微囊、奈米膠囊、奈米球及奈米粒子。微囊含有治療性蛋白質作為中心核。在微球體中，治療劑分散在整個粒子中。小於約1μm之粒子、微球體及微囊一般分別稱作奈米粒子、奈米球及奈米膠囊。毛細管之直徑為約5μm，使得僅奈米粒子經靜脈內投與。微粒之直徑通常為約100μm，且其經皮下或肌肉內投與。
聚合物可用於本發明之免疫結合物組合物之離子控制釋放。用於控制藥物傳遞之各種可降解及不可降解聚合基質為此項技術中已知的(Langer,R.,Accounts Chem.Res.26：537-542(1993))。舉例而言，嵌段共聚物泊洛沙姆(poloxamer)407®在低溫下以黏性但可移動之液體形式存在，但在體溫下形成半固體凝膠，羥基磷灰石已用作蛋白質控制釋放之微載體，且/或脂質體可用於脂質包裹之藥物的控制釋放以及藥物標的確定。已知用於控制傳遞治療性蛋白質之諸多其他系統。
參見例如美國專利第5,055,303號、第5,188,837號、第4,235,871號、第4,501,728號、第4,837,028號、第4,957,735號及第5,019,369號、第5,055,303號、第5,514,670號、第5,413,797號、第5,268,164號、第5,004,697號、第4,902,505號、第5,506,206號、第5,271,961號、第5,254,342號及第5,534,496號，該等專利各自之相關部分以引用的方式併入本文中。
本發明之免疫結合物的各種用途中包括由特定人類細胞所致之各種疾病病狀，該等細胞可藉由融合蛋白之毒性作用而去除。舉例而言，對於人類化抗CD40_12E12.3F3(ATCC寄存編號PTA-9854)、抗CD40_12B4.2C10(ATCC寄存編號PTA-10653，提交編號 AB13-22.12B4.2C10(HS446))及抗CD40_11B6.1C3(ATCC寄存編號PTA-10652，提交編號AB13-22.11B6.1C3(HS440))、本文所揭示之抗體，免疫結合物之一較佳應用為治療表現CD40之惡性細胞。
在另一實施例中，本發明提供用於傳遞與一或多個T細胞或B細胞抗原決定基結合或呈由一或多個T細胞或B細胞抗原決定基形成之融合蛋白形式之抗原的套組，該等抗原例如CD40或其免疫反應性片段。如本文所用之「生物樣品」為含有抗原之生物組織或流體之樣品。此等樣品包括(但不限於)來自生物檢體、血液及血球(例如白血球)之組織。細胞較佳為淋巴細胞，例如樹突狀細胞。生物樣品亦包括組織切片，諸如用於組織學目的之冷凍切片。生物樣品通常自多細胞真核生物、較佳哺乳動物(諸如大鼠、小鼠、母牛、狗、天竺鼠或兔)且更佳靈長類動物(諸如獼猴、黑猩猩或人類)獲得。樣品最佳來自人類。本發明抗體亦可在活體內使用，例如用作活體內成像之診斷工具。
套組通常應包含編碼本發明抗體(或其片段)之核酸序列，該抗體具有一或多個構架部分或在羧基端之多選殖位點，該等部分或位點中可插入一或多種抗原之編碼序列。在一些實施例中，抗體應為人類化抗CD40 Fv片段，諸如scFv或dsFv片段。另外，套組通常應包括說明性材料，該等材料揭示本發明抗體之使用方法(例如負載於樹突狀細胞中，隨後用樹突狀細胞免疫，該等樹突狀細胞可為自體樹突狀細胞)。該等套組亦可包括其他有利於該套組所欲之特定應用的組份。因此，例如，套組可另外含有偵測標記之方法(例如用於酶標記之酶受質，偵測螢光標記之濾光片組，諸如綿羊抗小鼠-HRP之適當第二標記或其類似方法)。套組可另外包括緩衝劑及常規用於實踐特定方法之其他試劑。此等套組及適當內容物為熟習此項技術者所熟知。
在本發明之另一組應用中，作為本發明抗體之標的之免疫結合 物可用於自培養物中之細胞群體清除標的細胞。舉例而言，若特定T細胞群體為較佳的，則本發明之免疫結合物可用於富集具有正在進行之免疫反應的相對作用之T細胞群體。因此，例如，在患有癌症之患者中培養的細胞可藉由向患者提供使用本發明抗體作為抗原之標的部分而負載抗原之樹突狀細胞來清除癌細胞，該等抗原將觸發針對癌症、病毒或其他病原體之免疫反應。同樣，免疫結合物可用於增加調節T細胞群體，或驅動免疫反應朝向細胞毒性T細胞反應或遠離細胞毒性T細胞反應，或甚至驅動B細胞反應。
實例1：抗CD40-HIV肽疫苗
在不同MHC-I類分子之情形下，自在HIV-1 Nef、Gag及Env蛋白質中鑑別之多個細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原決定基選擇五個19至32個胺基酸長之序列。已報導CTL反應可由脂肽疫苗在小鼠、靈長類動物及人類中有效誘發。該五個HIV肽隨後由(Palm)-NH2基團修飾C端位置，且該五個HIV肽序列已明確描述於科學文獻[例如Characterization of a multi-lipopeptides mixture used as an HIV-1 vaccine candidate(1999),Klinguer等人，Vaccine，第18卷，259-267]中及專利申請案[Cytotoxic T lymphocyte-inducing lipopeptides and use as vaccines.Gras-Masse H.等人，專利第EP0491628號(1992-06-24)；US 5871746(1999-02-16)]中。
極適宜之HIV疫苗應由與上述HIV肽融合之重組抗樹突狀細胞受體抗體構成。本發明包括有效產生蛋白質及HIV疫苗之組合物及方法。
如下所示之序列為五個所選HIV肽之胺基酸序列，且各HIV蛋白內之胺基酸位置在括號中。
Nef(66-97)為：VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL(SEQ ID NO.：1)
Nef(116-145)為：HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFG WLYKL(SEQ ID NO.：2)
Gag p17(17-35)為：EKIRLRPGGKKKYKLKHIV(SEQ ID NO.：3)
Gag p17-p24(253-284)為：NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILD(SEQ ID NO.：4)
Pol 325-355(RT 158-188)為：AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY(SEQ ID NO.：5)
以下序列為hIgG4重鏈(H)-HIV gag17融合蛋白，其中Gag p17(17-35)區以粗體展示。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-gag17]C655為：
Figure 105133908-A0101-12-0060-1
Figure 105133908-A0101-12-0060-3
(SEQ ID NO.：6)
以下序列為H鏈-HIV gag253融合蛋白，其中Gag p17-p24(253-284)區以粗體展示。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-gag253]C656為：
Figure 105133908-A0101-12-0060-4
Figure 105133908-A0101-12-0060-474
(SEQ ID NO.：7)
以下序列為H鏈-HIV nef116融合蛋白，其中Nef(116-145)區以粗體展示。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef116]C680為：
Figure 105133908-A0101-12-0061-6
Figure 105133908-A0101-12-0061-7
(SEQ ID NO.：8)
以下序列為H鏈-HIV nef66融合蛋白，其中Nef(66-97)區以粗體陰影展示。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef66]C679為：
Figure 105133908-A0101-12-0061-9
Figure 105133908-A0101-12-0061-10
(SEQ ID NO.：9)
以下序列為H鏈-HIV pol158融合蛋白，其中Pol 325-355(RT 158-188)區以粗體展示。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-pol158]C667為：
Figure 105133908-A0101-12-0061-11
Figure 105133908-A0101-12-0061-12
(SEQ ID NO.：10)
圖1展示由經轉染293F細胞分泌、藉由還原SDS.PAGE及庫馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue)染色分析之與各種HIV肽融合的蛋白質 A親和純化重組抗體(泳道1至5)。將與各種C端HIV肽編碼區融合之H鏈的表現載體與匹配輕鏈(L)質體一起共轉染於短暫293F細胞中並保持3天，隨後收集上清液以供後續純化。各轉染之間，細胞數目及DNA量為恆定的。因為使用過量蛋白質A親和基質，故SDS.PAGE分析確定各種疫苗構築體之生產產量及H鏈完整性。泳道1、4及5(上部條帶)展示與HIV gag17、nef66及pol158肽直接融合之H鏈可充分分泌。泳道2展示與HIV gag253肽直接融合之H鏈表現不良。泳道3展示與HIV nef116肽直接融合之H鏈完全不表現。
意外地，發現使用可撓性潛在糖基化之肽編碼區間連接序列會改良完整重組抗體-HIV肽融合蛋白之分泌。
所用之可撓性連接序列源自纖維素體錨定骨架蛋白B前驅體[溶纖維素擬桿菌(Bacteroides cellulosolvens)]且已由本發明者描述於同在申請中之美國專利申請案第61/081,234號中，該案之相關部分以引用的方式併入本文中。
如下所示之序列為四個所選肽連接序列之25個胺基酸長的序列。加下劃線之序列為預期N連接之糖基化位點。
Flex1為：SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(SEQ ID NO.：11)
Flex2為：PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(SEQ ID NO.：12)
Flex3為：TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)
Flex4為：TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)
此等序列[以粗體展示之連接子及由黏結蛋白獲得之加下劃線區]源自細菌蛋白>gi|50656899|gb|AAT79550.1|纖維素體錨定骨架蛋白B前驅體[溶纖維素擬桿菌]之黏結蛋白域間間隔子：
Figure 105133908-A0101-12-0062-13
Figure 105133908-A0101-12-0063-14
Figure 105133908-A0101-12-0063-15
(SEQ ID NO.：15).
以下序列為重鏈(H)-HIV gag17-nef66-nef116肽融合蛋白，其中HIV gag17、nef66、nef116肽序列呈粗體。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-gag17-nef66-nef116]C694為：
Figure 105133908-A0101-12-0063-16
Figure 105133908-A0101-12-0064-19
Figure 105133908-A0101-12-0064-21
(SEQ ID NO.：16).
以下序列為H鏈-HIV gag17-nef116肽融合蛋白，其中HIV gag17及nef116肽序列[斜體]經由間隔子f1[以粗體展示]連接。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-gag17-f1-nef116]C692為：
Figure 105133908-A0101-12-0064-22
Figure 105133908-A0101-12-0064-475
(SEQ ID NO.：17).
圖2展示由經轉染293F細胞分泌、隨後藉由還原SDS.PAGE及庫馬斯亮藍染色分析之與各種HIV肽融合的蛋白質A親和純化重組抗體(泳道1及2)。將與各種C端HIV肽編碼區融合之H鏈的表現載體與匹配L鏈質體一起共轉染於短暫293F細胞中並保持3天，隨後收集上清液以供後續純化。泳道1及2(上部條帶)展示與gag17-nef66-nef116之HIV肽串直接融合之H鏈可充分分泌。含有由可撓性間隔子f1分隔之gag17及nef116之HIV肽串的H鏈產物(泳道2)亦充分表現。因此，僅與H鏈直接融合時未表現為分泌產物之HIV nef116肽在附接於某些其他肽及可撓性串情形中時可充分表現。應注意，與gag17-f1-nef116[82個殘基]直接融合之H鏈的遷移慢於與gag17-nef66-nef116[89個殘基]直接融合之H鏈，此表明可撓性連接子f1經糖基化，相較於gag17-nef66- nef116融合抗體，分泌之gag17-f1-nef116融合抗體之產量亦可能提高。
以下序列為H鏈-gag17-gag253-nef66之HIV肽串融合蛋白，其中各HIV肽序列[呈斜體陰影]由肽間間隔子f[以粗體展示]分隔。在此情況下，將源自纖維素體錨定骨架蛋白B前驅體[呈加下劃線之粗斜體的溶纖維素擬桿菌區]的27個胺基酸長之連接子flex-v1(v1)[以粗斜體展示]插入H鏈C端與HIV肽-可撓性間隔子串之間。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef66]C711為：
Figure 105133908-A0101-12-0065-25
Figure 105133908-A0101-12-0065-476
(SEQ ID NO.：18).
以下序列為H鏈-pol158-gag17-nef66-nef116-gag253之HIV肽串融合蛋白，其中肽序列呈灰色陰影。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-pol158-gag17-nef66-nef116-gag253]C713為：
Figure 105133908-A0101-12-0065-28
Figure 105133908-A0101-12-0066-29
Figure 105133908-A0101-12-0066-30
(SEQ ID NO.：19).
圖3展示由經轉染293F細胞分泌、隨後藉由還原SDS.PAGE及庫馬斯亮藍染色分析之與各種HIV肽串融合的蛋白質A親和純化重組抗體(泳道1至5)。將與各種C端HIV肽編碼區融合之H鏈的表現載體與匹配L鏈質體一起共轉染於短暫293F細胞中並保持3天，隨後收集上清液以供後續純化。泳道1、2及3(上部條帶)展示與H鏈經由可撓性連接子flex-v1融合之4個HIV肽-可撓性間隔子可充分分泌。然而，與H鏈直接融合之4個HIV肽的串完全不能表現(泳道4，上部條帶)。泳道5(上部條帶)展示與H鏈直接融合之5個HIV肽的串亦完全不表現。此結果表明可撓性連接子及HIV肽編碼序列之某些組合及情形可提高重組抗體-HIV肽融合蛋白之分泌(泳道1、2及3)。
以下序列為H鏈-gag17-gag253-nef66-nef116-pol158之HIV肽串融合蛋白，其中各HIV肽序列[呈斜體陰影]由肽間間隔子f[以粗體展示]分隔。將可撓性連接子flex-v1(v1)[以粗斜體展示]插入H鏈C端與HIV肽-可撓性間隔子串之間。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-hIgG4H-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]C825為：
Figure 105133908-A0101-12-0066-31
Figure 105133908-A0101-12-0066-32
(SEQ ID NO.：20)
圖4展示由經轉染293F細胞分泌、隨後藉由還原SDS.PAGE及庫馬斯亮藍染色分析之與各種HIV肽串融合的蛋白質A親和純化重組抗體(泳道1至6)。將與各種C端HIV肽編碼區融合之H鏈的表現載體與匹配L鏈質體一起共轉染於短暫293F細胞中並保持3天，隨後收集上清液以供後續純化。泳道1、3及5(上部條帶)展示與H鏈經由可撓性連接子flex-v1融合之4個HIV肽-可撓性間隔子串可充分分泌。泳道2及6(上部條帶)展示與H鏈經由可撓性連接子flex-v1融合之5個HIV肽-可撓性間隔子串表現不良。然而，HIV肽編碼序列之某些組合及情形會提高重組抗體-HIV肽融合蛋白之分泌(泳道3及4)。因此，與5個HIV肽-可撓性間隔子串經由可撓性連接子flex-v1融合之H鏈在附接於某些其他肽及可撓性串情形中時可充分表現(泳道4)。
本發明包括尤其有利於有效分泌重組抗DC受體抗體-HIV肽融合疫苗的可撓性潛在糖基化之肽編碼區間連接序列及此等HIV肽編碼區之組合的組合物及方法。
使用源自降解纖維素之細菌的結構域間連接序列作為蛋白質工程改造中之較佳域間連接序列-尤其具有高度預期糖基化位點之序列。此等序列之適宜特性為i)固有可撓性，從而有利於分隔連接域，此將極大地有助於其合適摺疊及使B細胞受體保持接近構形依賴性抗原決定基；ii)糖基化，從而有助於所產生之完整融合蛋白之分泌及溶解性，且亦保護連接序列免受培養基蛋白酶影響。
HIV肽編碼區之某些組合有利於分泌，且插入HIV肽編碼序列之間的特定可撓性連接序列亦可有助於分泌完整HIV肽串疫苗-此為亦可用於解決其他較佳肽抗原之類似問題的原理。
較佳連接子之DNA序列及抗原編碼序列。接合序列密碼子及終止密碼子呈粗體：[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-gag17]C655為： GCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTGGCTAGCTGA(SEQ ID NO.：21)
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-nef66]C679為：GCTAGTGTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGCCGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTGGCTAGCTGA(SEQ ID NO.：22)
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Pep-pol158]C667為：GCTAGTGCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGCTGA(SEQ ID NO.：23)
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag253]C681為：
Figure 105133908-A0101-12-0068-33
Figure 105133908-A0101-12-0068-37
(SEQ ID NO.：24)
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-Flex-v1-Pep-gag17-nef116]C686為：
Figure 105133908-A0101-12-0068-35
Figure 105133908-A0101-12-0068-477
(SEQ ID NO.：25)
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-hIgG4H-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]C825為：
Figure 105133908-A0101-12-0068-38
Figure 105133908-A0101-12-0069-39
Figure 105133908-A0101-12-0069-40
(SEQ ID NO.：26)
較佳連接子之DNA序列及抗原編碼序列。接合序列密碼子呈粗體：Nef(66-97)為：GCTAGTGTGGGCTTCCCCGTGACCCCCCAGGTGCCCCTGCGGCCCATGACCTACAAGGCCGCCGTGGACCTGAGCCACTTCCTGAAGGAGAAGGGCGGCCTGGCTAGC(SEQ ID NO.：27)
Nef(116-145)為：GCTAGTCACACCCAGGGCTACTTCCCCGACTGGCAGAACTACACCCCCGGCCCCGGCGTGCGGTACCCCCTGACCTTCGGCTGGCTGTACAAGCTGGCTAGC(SEQ ID NO.：28)
Gag p17(17-35)為：GCTAGTGAGAAGATCCGGCTGCGGCCCGGCGGCAAGAAGAAGTACAAGCTGAAGCACATCGTGGCTAGC(SEQ ID NO.：29)
Gag p17-p24(253-284)為：GCTAGTAACCCCCCCATCCCCGTGGGCGAGATCTACAAGCGGTGGATCATCCTGGGCCTGAACAAGATCGTGCGGATGTACAGCCCCACCAGCATCCTGGACGCTAGC(SEQ ID NO.：30)
Pol 325-355(RT 158-188)為：GCTAGTGCCATCTTCCAGAGCAGCATGACCAAGATCCTGGAGCCCTTCCGGAAGCAGAACCCCGACATCGTGATCTACCAGTACATGGACGACCTGTACGCTAGC(SEQ ID NO.：31)
Flex1為：GCTAGTAGCAGCGTGAGCCCCACCACCAGCGTGCACCCCACCCCCACCAGCGTGCCCCCCACCCCCACCAAGAGCAGCCCCGCTAGC(SEQ ID NO.：32)
Flex2為：GCTAGTCCCACCAGCACCCCCGCCGACAGCAGCACCATCACCCCCACCGCCACCCCCACCGCCACCCCCACCATCAAGGGCGCTAGC(SEQ ID NO.：33)
Flex3為：GCTAGTACCGTGACCCCCACCGCCACCGCCACCCCCAGCGCCATCGTGACCACCATCACCCCCACCGCCACCACCAAGCCCGCTAGC(SEQ ID NO.：34)
Flex4為： GCTAGTACCAACGGCAGCATCACCGTGGCCGCCACCGCCCCCACCGTGACCCCCACCGTGAACGCCACCCCCAGCGCCGCCGCTAGC(SEQ ID NO.：35)
本發明包括組裝編碼HIV肽之構築體及可撓性連接子序列的組合物及方法。H鏈表現載體通常具有Nhe I位點[g|ctagc]附接於H鏈C端殘基密碼子或[對於flex-v1載體]flex-v1序列之C端密碼子。可撓性連接子序列或HIV肽序列具有Spe I位點[a|ctagt]在N端可撓性連接子或HIV肽密碼子前、Nhe I位點附接於C端可撓性連接子或HIV肽密碼子，繼之為TGA終止密碼子，繼之為Eco RI位點，繼之為Not I位點。此等可撓性連接子或HIV肽Spe I-Not I片段插入經Nhe I-Not I消化製備之H鏈載體中。Nhe I及Spe I為相容位點，但當接合時，[g|ctagt]不再為Nhe I或Spe I位點。因此，其他Spe I-Not I可撓性連接子或HIV肽片段可插入該初始可撓性連接子或HIV肽遠端之新Nhe I-Not I間隔中。以此方式，HIV肽及/或可撓性連接子編碼區各串可附接於表現載體H鏈編碼區。
實例2：HIV肽疫苗--活體外抗原標靶生物學
活體外HIV患者之抗CD40.LIPO5 HIV肽疫苗測試。為研究αCD40.LIPO5 HIV肽融合重組抗體(αCD40.LIPO5 rAb)介導抗原呈獻之能力，將融合rAb加入感染HIV之個體的血球中，且測量周邊血液單核細胞(PBMCs)之細胞激素產生。
圖5描述用於活體外檢驗αCD40.LIPO5 HIV肽融合重組抗體(αCD40.LIPO5 rAb)在PBMCs培養物中引發抗原特異性T細胞擴增之效能的方案。簡言之，將HIV患者血漿析離(apheresis)之PBMCs(2×106個細胞/毫升)與一劑量範圍之αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗一起培育。在第2天，將100U/ml IL-2添加至培養物中，隨後每2天用100U/ml IL-2更新培養基。在第10天，用對應於併入αCD40.LIPO5 HIV肽融合rAb中之5個HIV肽序列的個別長肽攻擊擴增之細胞48小時。隨後，收集培 養物上清液，且使用多珠粒檢驗(Luminex)分析細胞激素之產生(由具有針對肽序列之T細胞受體[TCR]特異性的T細胞產生)。此類檢驗中所偵測之抗原特異性細胞激素之產生，若依賴抗CD40.LIPO5 HIV肽疫苗之存在，反映疫苗由培養物中抗原呈獻細胞[APC]吸收，處理[蛋白水解降解]及於MHC上呈獻肽。該抗原-MHC複合物由具有僅識別特定HIV抗原-MHC複合物之TCR的T細胞識別。在HIV患者中，此等細胞可能為該患者對HIV感染反應所擴增之記憶T細胞。
疫苗之所有5個HIV肽區之抗原決定基均可由APCs呈獻。使用圖5之方案來檢驗活體外HIV肽特異性T細胞對於抗CD40.LIPO5肽疫苗反應之擴增。7個個體之結果展示於圖6中，表明αCD40.LIPO5 HIV肽融合rAb在所研究之所有患者中均引發HIV肽特異性IFNγ反應。因此，α-CD40.LIPO5 HIV肽融合rAb使得DCs可向各個體之T細胞交叉呈獻疫苗內5個肽中至少1或2個不同肽。然而，對於各患者，刺激IFNγ產生之HIV肽組不同--很可能反映HIV特異性之記憶T細胞池不同。
圖6展示與各種濃度之抗CD40.LIPO5肽串疫苗一起培育之來自HIV患者之PBMC中的HIV肽特異性IFNγ產生。C為對照組，其未接受疫苗，且定義培養物對各肽之基線反應。
圖7為針對8位HIV患者之5個肽區的αCD40.LIPO5肽疫苗反應之概述。該等資料係基於肽特異性IFNγ產生。圖7展示在8位HIV患者中觀察到之抗原特異性反應。該等資料證實疫苗上之所有HIV肽區均能經處理且向T細胞呈獻-假定以下可能情況：對此等肽之反應僅在具有適當TCR之細胞存在時觀察到。因此，各患者具有此等細胞之特徵光譜。
αCD40.LIPO5肽疫苗可誘發能夠分泌多種細胞激素之抗原特異性T細胞之增殖。
圖8展示αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗引發能夠分泌多種細胞激素之 HIV肽特異性T細胞之擴增-此為疫苗中需要之特徵。在圖8中，αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗引發gag253、nef66、nef116及pol325肽特異性反應，該等反應之特徵為產生多種細胞激素。此為患者A5。
離體DC之抗CD40.LIPO5 HIV肽疫苗接種。
圖9展示測試αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗引導由於DC之標的吸收而產生的抗原特異性T細胞擴增及於DC表面MHC複合物上呈獻肽抗原決定基之能力的方案。簡言之，HIV患者單核細胞藉由與IFNα及GM-CSF一起培養2天而分化為DC。隨後添加不同劑量之αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗或5個肽之混合物歷時18小時。在第3天，將自體T細胞添加至共培養物中(比率為1：20)。在第5天，將100U/ml IL-2添加至培養物中，隨後每2天用100U/ml IL-2更新培養基。在第10天，用對應於併入αCD40.LIPO5 HIV肽融合rAb中之5個HIV肽序列的個別長肽對擴增之細胞再攻擊48小時。隨後，收集培養物上清液且使用Luminex分析細胞激素產生。
圖10展示回應來自DC-T細胞共培養物之HIV肽的細胞激素分泌，其中該等共培養物經各種劑量之αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗處理。此為患者A10。圖10所示之患者A10的結果證實對應於gag17、gag253及pol325 HIV肽區中之抗原決定基之抗原特異性T細胞的擴增。在大多數情況下，αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗與非LIPO5疫苗[5個未脂質化HIV肽與對應於αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗中之HIV肽的序列之混合物]之間存在一致反應。因此，αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗在此活體外環境中充分發揮功能，其中所培養之DC有效處理HIV抗原且向T細胞呈獻該等HIV抗原。此例示使用αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗進行離體疫苗接種，其中『接種疫苗之DC』應低溫保存以供將來再注射於同一患者中。
αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗-可撓性連接區之可能的免疫作用。 αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗內與HIV肽序列交替之可撓性連接序列有可能自身含有T細胞抗原決定基。圖11展示患者A4未顯現出對αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗內之5個可撓性連接序列具有特異性之顯著記憶T細胞池。在圖11中，來自經αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗處理之患者A4的PBMC引發對gag253區而非對可撓性連接序列具有特異性之抗原特異性T細胞之擴增。使用圖9所述之方案，如以下序列所示，其中可撓性連接子長肽依次對應於粗體區，HIV肽呈粗斜體。
αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗重鏈序列，其展示呈粗體之可撓性連接區，加下劃線之接合序列及呈粗斜體陰影之HIV肽區。
Figure 105133908-A0101-12-0073-41
Figure 105133908-A0101-12-0073-42
(SEQ ID NO.：36).
在圖12A中，來自經αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗處理之患者A3的PBMC引發對gag253、nef66及nef116區而非對可撓性連接序列具有特異性之抗原特異性T細胞之擴增。使用圖1所述之方案，其中可撓性連接子長肽依次對應於圖8所示之粗體區。
圖12B展示由與30nM以三種不同HIV5肽DC為標的之疫苗一起培育之HIV患者A17 PBMC誘發的HIV抗原特異性T細胞反應。將細胞與IL-2一起培養10天，隨後用對應於以DC為標的之疫苗中所涵蓋的5個HIV肽序列之個別長肽刺激。1小時之後，添加布雷菲德菌素A(brefeldin A)，且再繼續培育5小時，隨後染色以供FACS分析。 FACS圖展示對CD3+ T細胞上之IFNγ及CD8染色。圓圈表明相較於來自未與疫苗一起培養之PBMC的IFNg+細胞，疫苗誘發的IFNγ+細胞顯著擴增。CD8-細胞為CD4+ T細胞。資料展示抗CD40.HIV5pep疫苗誘發nef66(N66)特異性CD8+ T細胞強烈擴增，用其他以DC為標的之運載體未見此結果。
此等資料為基於LIPO5 HIV肽串之資料。舉例而言，抗CD40 H鏈為具有以下序列之抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-Pep-gag17-f1-gag253-f2-nef116-f3-nef66-f4-pol158]：
Figure 105133908-A0101-12-0074-45
Figure 105133908-A0101-12-0074-44
(SEQ ID NO.：37).
圖12C為類似於圖12B所示之研究，例外在於PBMC來自不同的HIV患者(A2)。資料展示抗原特異性CD4+及CD8+ T細胞反應由抗CD40.HIV5pep而非其他以DC為標的之疫苗誘發，或由肽自身之混合物誘發。
圖12D展示基於對15種不同的HIV肽反應[5個肽區，在3位患者中取樣]之分析，對於引發各種HIV肽特異性CD8+及CD4+ T反應，抗CD40.HIV5pep疫苗明顯優於抗DCIR.HIV5pep、抗LOX-1.HIV5pep及非LIPO5混合物。
可撓性連接序列之免疫原性對於αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗設計具有意義。上文所示之有限資料集測試對可撓性連接序列中之抗原決定 基具有特異性之T細胞的回憶(recall)，表明針對此等序列之人類譜系為可變的。此外，未測試此等序列重新激發反應之能力。可使用本發明測試猴中對αCD40.LIPO5 HIV肽疫苗之反應。必要時，可由預測性計算方式及肽刺激掃描之組合鑑別此等區內某些較不適宜之抗原決定基，且隨後藉由引入去除TCR相互作用之突變來去除該等抗原決定基。
抗CD40結合分子包括具有以下胺基酸序列(SEQ ID NO.38)之輕鏈。抗體輕鏈之可變區加下劃線且CDR呈粗體(分別為SEQ ID NO.：42、43及44)。
Figure 105133908-A0101-12-0075-49
Figure 105133908-A0101-12-0075-47
(SEQ ID NO.：38).
抗CD40結合分子包括具有以下序列之重鏈。抗體輕鏈之可變區加下劃線且CDR呈粗體(分別為SEQ ID NO.：45、46及47)。
Figure 105133908-A0101-12-0075-52
Figure 105133908-A0101-12-0075-51
(SEQ ID NO.：39).
在一態樣中，編碼輕鏈之核酸包含SEQ ID NO.：。抗體輕鏈可變區之核酸序列加下劃線且CDR呈粗體。
Figure 105133908-A0101-12-0075-53
Figure 105133908-A0101-12-0076-54
Figure 105133908-A0101-12-0076-56
(SEQ ID NO.：40).
在一態樣中，編碼重鏈之核酸包含SEQ ID NO.：40。抗體重鏈可變區之核酸序列加下劃線且CDR呈粗體。
Figure 105133908-A0101-12-0076-57
(SEQ ID NO.：41).
人類化抗體包括重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)，其中重鏈及輕鏈可變區之構架區來自供體人類抗體，且其中輕鏈互補決定區(CDR)與具有胺基酸序列SASQGISNYLN(SEQ ID NO.：41)之CDR1L、具有胺基酸序列YTSILHS(SEQ ID NO.：42)之CDR2L及具有胺基酸序列QQFNKLPPT(SEQ ID NO.：43)之CDR3L具有至少80%、90%、95% 或更高一致性；且其中重鏈互補決定區與CDR1H、CDR2H及CDR3H包含至少80%、90%、95%或更高一致性，其中CDR1H具有胺基酸序列GFTFSDYYMY(SEQ ID NO.：45)，CDR2H具有胺基酸序列YINSGGGSTYYPDTVKG(SEQ ID NO.：46)，且CDR3H具有胺基酸序列RGLPFHAMDY(SEQ ID NO.：47)。舉例而言，人類化抗體可包含與SEQ ID NO.：38之構架具有至少95%一致性的VL構架及與SEQ ID NO.：39之構架具有至少95%一致性的VH構架。在另一態樣中，供體CDR序列來自抗CD40_12E12.3F3及其他，其中抗體或其片段特異性結合CD40。
實例3：前列腺特異性抗原(PSA)、細胞週期素D1、MART-1、流行性感冒病毒核蛋白(NP)及流行性感冒病毒血球凝集素HA1次單位(H1N1、PR8)及肽篩選。
抗CD40 mAb之內化。將1×106個IL-4DC與3mg/ml於含3% BSA之PBS中的人類γ球蛋白一起在冰中培育1小時以阻斷非特異性結合。用經亞歷山大(Alexa)568標記之抗CD40 mAb(在非特異性阻斷時，最終濃度均為20ng/ml)脈衝處理細胞歷時30分鐘。隨後洗滌細胞，且在37℃下內化表面結合抗體歷時不同時間，在0分鐘與90分鐘之間。內化之後，用含1% BSA及0.05%疊氮化鈉之冰冷PBS(PBA)洗滌細胞兩次，且在4℃下於冰冷1%不含甲醇的甲醛(MFF)之PBS溶液中固定隔夜。在4℃下使細胞在含0.5%皂苷之PBS-3% BSA(PBAS)中透性化(permeablize)歷時20分鐘，且轉移至96孔圓底聚丙烯微量滴定板。用冰冷PBAS洗滌兩次之後，將細胞與3mg/ml人類γ球蛋白之PBAS溶液一起在冰上培育1小時。用PBAS稀釋BODIPY-鬼筆環肽(phalloidin)且與細胞一起於冰中培育1小時。再用TOPRO-II對細胞染色，作為細胞核對比染色。於Leica SP1共焦顯微鏡上獲得載片上之影像。
細胞。用於細胞表面染色之單株抗體購自BD Biosciences(CA)。 於含有GM-CSF(100ng/ml)及IL-4(50ng/ml)或GM-CSF(100ng/ml)及IFNα(500單位/毫升)(R&D,CA)之Cellgenics培養基(France)中培養來自健康供體之單核細胞(1×106個/毫升)。對於IFNDC，在第1天，用IFNα及GM-CSF餵養細胞。對於IL-4DC，在第1天及第3天，在培養基中補充等量細胞激素。藉由密度梯度離心使用PercollTM梯度(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)使PBMC與白血球層分離。使用幹細胞套組(CA)純化總的CD4+及CD8+ T細胞。
肽。合成前列腺特異性抗原(PSA)、細胞週期素D1、MART-1、流行性感冒病毒核蛋白(NP)及流行性感冒病毒血球凝集素HA1次單位(H1N1、PR8)之15聚體(11個胺基酸重疊)。
DC與T細胞共培養及細胞激素表現。將5×103個負載有重組融合蛋白(抗CD40-HA1、對照Ig-HA1、抗CD40-PSA、抗CD40-細胞週期素D1、抗CD40-MART-1、抗MARCO-MART-1及對照Ig-MART-1)之DC與2×105個經CFSE標記之CD4+ T細胞共培養8天。藉由測量用經APC標記之抗CD4抗體對細胞染色之後的CFSE稀釋來測試增殖。
為測量細胞內IFNγ之表現，在布雷菲德菌素A存在下用1-5μM指定肽再刺激CD4+ T細胞歷時5小時。在各別實驗中，用指定肽再刺激CD4+ T細胞歷時36小時，且隨後藉由Luminex測量CD4+ T細胞所分泌之細胞激素。
在20單位/毫升之IL-2及20單位/毫升之IL-7存在下，將CD8+ T細胞與DC共培養10天。在培養之第10天，用抗CD8及指定四聚物對CD8+ T細胞染色。
CTL檢驗。在培養之第10天，執行5小時51Cr釋放檢驗。首先用51Cr脈衝處理T2細胞，且隨後用10μM MART-1之HLA-A2抗原決定基或1nM流行性感冒病毒M1之抗原決定基標記。使用無肽之T2細胞作為對照組。計算三個重複樣品之平均值，使用下式確定比溶解百分 比：比溶解百分比=100×(實驗組51Cr釋放-對照組51Cr釋放)/(最大51Cr釋放-對照組51Cr釋放)。最大釋放係指2.5%曲通(Triton)X-100中之標的計數。
對人類CD40具有特異性之mAb的製備。產生受體胞外域.hIgG(人類IgG1Fc)及AP(人類胎盤鹼性磷酸酶)融合蛋白以分別用於使小鼠免疫及篩選mAb。如所述工程改造人類IgFc融合蛋白之哺乳動物載體[J.Immunol.163：1973-1983(1999)]。使用PCR來擴增AP殘基133-1581(gb|BC009647|)之cDNA，同時相繼添加近端同框Xho I位點及遠端6C端His殘基、TGA終止密碼子及Not I位點，藉此產生受體胞外域.AP蛋白之哺乳動物表現載體。此Xho I-Not I片段置換以上胞外域.IgG載體中之人類IgG Fc編碼序列。使用FreeStyleTM 293表現系統(Invitrogen,CA)，根據製造商之方案(每公升轉染劑使用1mg總質體DNA及1.3ml 293Fectin試劑)產生融合蛋白。藉由1ml HiTrap蛋白質A親和層析(GE Healthcare,CA)，用0.1M甘胺酸(pH 2.7)溶離來純化受體胞外域.hIgG。用2M Tris中和溶離份，且隨後用PBS透析。
由習知技術產生小鼠mAb。簡言之，用20μg受體胞外域.hIgGFc融合蛋白以及Ribi佐劑腹膜內使6週齡BALB/c小鼠免疫，隨後在10天及15天之後用20μg抗原增強免疫。3個月之後，再次使小鼠增強免疫，3天後取出脾。最終增強免疫之後3至4天，收集排出之淋巴結(LN)。使來自脾或LN細胞之B細胞與SP2/O-Ag 14細胞(ATCC)融合。篩選融合瘤上清液，以分析相較於單獨融合搭配物對受體胞外域融合蛋白具有特異性之mAb，或分析對與鹼性磷酸酶融合之受體胞外域具有特異性的mAb[J.Immunol.163：1973-1983(1999)]。隨後使用短暫轉染編碼全長受體cDNA之表現質體的293F細胞在FACS中篩選陽性孔。所選融合瘤為在CELLine燒瓶(Integra,CA)中選殖且擴增之單細胞。將融合瘤上清液與等體積之1.5M甘胺酸、3M NaCl、1×PBS(pH 7.8，結合緩衝液)混合，且與MabSelect樹脂(GE Healthcare,CA)(每5ml上清液800μl)一起翻轉。用結合緩衝液洗滌樹脂且用0.1M甘胺酸(pH 2.7)溶離。用2M Tris中和之後，用PBS透析mAb。
重組mAb之表現及純化。使用RNeasy套組(Qiagen,CA)自融合瘤細胞製備總RNA，且使用所提供之5'引子及基因特異性3'引子(mIgGκ，5'ggatggtgggaagatggatacagttggtgcagcatc3'(SEQ ID NO.：48)；mIgG2a，5'ccaggcatcctagagtcaccgaggagccagt3'(SEQ ID NO.：49))將總RNA用於cDNA合成及PCR(SMART RACE套組，BD Biosciences)。隨後選殖PCR產物(pCR2.1 TA套組，Invitrogen)且藉由DNA測序(MC Lab,CA)進行表徵。使用源自小鼠重(H)鏈及輕(L)鏈可變(V)區cDNA之序列，使用特異性引子對信號肽及V區進行PCR擴增，同時併入側接限制位點以選殖於編碼下游人類IgGκ或IgG4H區之表現載體中。藉由擴增側接Xho I及Not I位點之殘基401-731(gi|63101937|)且將其插入pIRES2-DsRed2(BD Biosciences)之Xho I-Not I間隔中來構建嵌合mVκ-hIgκ之表現載體。使用PCR自起始密碼子擴增mAb Vκ區，附接Nhe I或Spe I位點、隨後CACC至編碼區(例如gi|76779294|之殘基126)，附接遠端Xho I位點。隨後將PCR片段選殖於上述載體之Nhe I-Not I間隔中。控制人類IgGκ序列對應於gi|49257887|殘基26-85及gi|21669402|殘基67-709。控制人類IgG4H載體對應於gi|19684072]之殘基12-1473，其中穩定二硫鍵且去除殘餘FcR相互作用[J.Immunol.164：1925-1933(2000)]之S229P及L236E取代插入pIRES2-DsRed2之Bgl II及Not I sites之間，同時添加序列5' gctagctgattaattaa 3'替代終止密碼子。使用PCR自起始密碼子擴增mAb VH區，附接CACC、隨後Bgl II位點至編碼gi|19684072|之殘基473的區。隨後將PCR片段選殖於上述載體之Bgl II-Apa I間隔中。
Flu HA1融合蛋白之表現及純化。Flu HA1抗原編碼序列為在血 球凝集素[A型流行性感冒病毒(A/Puerto Rico/8/34(H1N1))]gi|126599271|殘基18-331之前的CipA蛋白[熱纖維素梭菌(Clostridium.thermocellum)]gi|479126|殘基147-160，其具有P321L變化且6 C端His殘基插入H鏈載體Nhe I及Not I位點之間以編碼重組抗體-HA1融合蛋白(rAb.HA1)。類似地，藉由將具有近端序列GCTAGCGATACAACAGAACCTGCAACACCTACAACACCTGTAACAACACCGACAACAACACTTCTAGCGC(SEQ ID NO.：50)(Nhe I位點及CipA間隔子)及遠端Not I位點之gi|34784812|前列腺特異性抗原殘基101-832插入相同H鏈載體中來編碼重組抗體-PSA融合蛋白(rAb.PSA)。如上文對於hFc融合蛋白所述來表現及純化重組抗體蛋白。在一些情況下，將rAb.抗原編碼區及相應L鏈編碼區轉移至各別cetHS-puro UCOE載體(Millipore,CA)中。使用UCOE載體以及預先適應之無血清懸浮細胞株使得可快速產生大量蛋白質[Cytotechnology 38,43-46(2002)]。每毫升接種5×105個在具有GlutaMAX及HT培養基補充劑之CD-CHO(Invitrogen)中生長之CHO-S細胞，24小時之後轉染於500ml Corning Ehrlenmyer燒瓶中且在8% CO2中在125rpm下培育。轉染當天，將存活率為至少95%之1.2×107個細胞添加至125ml燒瓶中具有GlutaMAX之CD-CHO中，最終體積為30ml。將48μl含0.6ml OptiPRO SFM(Invitrogen)之FreeStyle Max試劑(Invitrogen)在輕柔混合下添加至混合之24μg Sce I線性化輕鏈載體及24μg Sce I線性化H鏈載體中，且無菌過濾於0.6ml OptiPRO SFM中。20分鐘之後，將DNA-脂質複合物在渦旋下緩慢添加至125ml CHO-S培養燒瓶中。培育細胞24小時，隨後添加30ml含有5μg/ml嘌呤黴素(A.G.Scientific,CA)、2×GlutaMAX及0.25×Pen/Strep(Invitrogen)之CD-CHO與CHO-M5(Sigma，CHO套組1之C0363組份)的經合併培養基溶液。在第2天，再向培養物中直接添加5μg/ml嘌呤黴素，且根據轉染後6天之細胞存活率進行選擇歷時約 10-14天。活細胞計數下降，且當存活密度為約2-3×106個/毫升時，將細胞以1E6個/毫升轉移至新鮮選擇培養基(具有2×GlutaMAX、0.25×Pen/Strep、10μg/ml嘌呤黴素之CD CHO-S+CHO M5)中。當存活率大於90%時，製備冷凍細胞儲備液。當細胞密度超過2×106個/毫升時，分離細胞於選擇培養基中，直至均分至4個500ml燒瓶中各250ml。當細胞存活率降至低於80%且最大最終細胞密度為約7×106個/毫升時，收集上清液。內毒素含量小於0.2單位/毫升。
重組Flu M1及MART-1蛋白之表現及純化。使用PCR擴增A型流行性感冒/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)M1基因之ORF，同時在起始密碼子遠端併入Nhe I位點且在終止密碼子遠端併入Not I位點。將經消化片段選殖於pET-28b(+)(Novagen)中，使M1 ORF與His6標籤處於同框，從而編碼His.Flu M1蛋白。插入Nco I與Nhe I位點之間的編碼熱纖維素梭菌之N端169殘基黏結蛋白域之pET28b(+)衍生物(未公開)表現Coh.His。為表現黏結蛋白-Flex-hMART-1-肽A-His，將序列GACACCACCGAGGCCCGCCACCCCCACCCCCCCGTGACCACCCCCACCACCACCGACCGGAAGGGCACCACCGCCGAGGAGCTGGCCGGCATCGGCATCCTGACCGTGATCCTGGGCGGCAAGCGGACCAACAACAGCACCCCCACCAAGGGCGAATTCTGCAGATATCCATCACACTGGCGGCCG(SEQ ID NO.：51)(編碼DTTEARHPHPPVTTPTTDRKGTTAE ELAGIGILTV ILGGKRTNNSTPTKGEFCRYPSHWRP(SEQ ID NO.：52)-斜體殘基為免疫優勢HLA-A2-限制肽，且該肽周圍加下劃線之殘基來自MART-1)插入上述載體之Nhe I與Xho I位點之間。當添加120mg/L IPTG時，蛋白質表現於在37℃下於LB中在進行卡那黴素(kanamycin)(40μg/ml)抗性選擇且以200圈/分鐘震盪的情況下生長至對數生長中期之大腸桿菌菌株BL21(DE3)(Novagen)或T7 Express(NEB)中。3小時之後，藉由離心收集細胞且儲存在-80℃下。 使來自各1L醱酵液之大腸桿菌細胞再懸浮於30ml含0.1ml蛋白酶抑制劑混合液II(Calbiochem,CA)之冰冷50mM Tris、1mM EDTA(pH 8.0)(緩衝液B)中。在冰上以設置18(費雪音波破碎儀60(Fisher Sonic Dismembrator 60))音波處理細胞歷時2×5分鐘，其中存在5分鐘中止期，且隨後在4℃下在17,000r.p.m.(Sorvall SA-600)下離心20分鐘。為進行His.Flu M1純化，使50ml細胞溶解物上清液部分穿過5ml Q瓊脂糖珠粒，且將6.25ml 160mM Tris、40mM咪唑、4M NaCl(pH 7.9)添加至流經之Q瓊脂糖中。將其以4ml/min負載於5ml以Ni++填充之HiTrap螯合HP管柱上。用20mM NaPO4、300mM NaCl(pH 7.6)(緩衝液D)洗滌管柱結合之蛋白質，繼而再用100mM H3COONa(pH 4.0)洗滌。用100mM H3COONa(pH 4.0)溶離結合蛋白質。彙集峰溶離份，且以4ml/min負載於用100mM H3COONa(pH 5.5)平衡之5mlHiTrap S管柱上，且用平衡緩衝液洗滌，繼而用50mM NaPO4(pH 5.5)中之0-1M NaCl梯度溶離。彙集在約500mM NaCl下溶離之峰溶離份。為進行Coh.Flu M1.His純化，如上溶解來自2L培養物之細胞。離心之後，將2.5ml曲通X114添加至上清液中，且於冰上培育5分鐘。在25℃下再培育5分鐘之後，於25℃下離心，隨後使上清液與曲通X114分離。重複萃取，且使上清液穿過5ml Q瓊脂糖珠粒，且將6.25ml 160mM Tris、40mM咪唑、4M NaCl(pH 7.9)添加至流經之Q瓊脂糖中。隨後藉由如上所述之Ni++螯合層析且用緩衝液D中之0-500mM咪唑溶離來純化蛋白質。
圖13展示抗CD40 mAb：IL-4DC之內化。用500ng/ml抗CD40-亞歷山大568處理IL-4DC。
圖14展示由作為抗CD40-HA1標的之DC達成的CD4及CD8 T細胞增殖。將5×10e3個負載有2μg/ml抗CD40-HA或對照Ig-HA1之IFNDC與經CFSE標記之自體CD4+或CD8+ T細胞(2×10e5個)共培養7天。隨 後用抗CD4或抗CD8抗體對細胞染色。藉由測量CFSE稀釋測試細胞增殖。
圖15展示針對CD4+ T增殖所進行之HA1融合蛋白滴定。將負載有融合蛋白之IFNDC(5K)與經CFSE標記之CD4+ T細胞(200K)共培養7天。
圖16展示作為抗CD40-HA1標的之IFNDC活化HA1特異性CD4+ T細胞。用負載有5μM指定肽之DC再刺激CD4+ T細胞，且隨後對細胞內IFNγ染色。
圖17展示作為抗CD40-HA1標的之IFNDC活化HA1特異性CD4+ T細胞。用負載有指定肽之DC再刺激CD4+ T細胞歷時36小時，隨後分析培養物上清液以測量IFNγ。
圖18展示以CD40為標的會使MART-1特異性CD8+ T細胞之交叉激發增強。將負載有融合蛋白之IFNDC(每孔5K個)與經純化CD8+ T細胞共培養10天。用抗CD8及四聚物對細胞染色。細胞係來自健康供體(HLA-A*0201+)。
圖19展示以CD40為標的會使MART-1特異性CD8+ T細胞之交叉激發增強(使用來自不同健康供體之細胞進行的8個重複實驗之概述)。
圖20展示由作為抗CD40-MART-1標的之IFNDC誘發的CD8+ CTL具有功能性。將與作為融合蛋白標的之IFNDC共培養之CD8+ T細胞與負載有10μM肽抗原決定基之T2細胞混合。
圖21展示由作為抗CD40-Flu M1標的之IFNDC誘發的CD8+ CTL具有功能性。將與作為融合蛋白標的之IFNDC共培養之CD8+ T細胞與負載有1.0nM肽抗原決定基之T2細胞混合。
圖22展示測試由與PSA(前列腺特異性抗原)連接之抗CD4012E12構成的疫苗引發天然T細胞群體擴增之能力的方案之概述。PSA特異 性CD4+ T細胞對應於多種PSA抗原決定基。簡言之，將藉由與來自健康供體的單核細胞之IFNα及GM-CSF一起培養而衍生之DC與疫苗一起培育。次日，將細胞置於新鮮培養基中，且添加來自同一供體之純CD4+ T細胞。數天後，添加PSA肽且在4小時之後測定培養物上清液中所分泌之γ-IFN的含量。
圖23展示諸多PSA肽引發有效γ-IFN產生反應，表明抗CD4012E12及類似抗CD40劑可向DC有效傳遞抗原，使得可激發針對抗原之多個抗原決定基的免疫反應。PSA抗原之肽圖譜。將5×10e3個負載有2μg/ml抗CD40-PSA之IFNDC與經純化自體CD4+ T細胞(2×10e5個)共培養8天。隨後用5μM源自PSA之個別肽再刺激細胞歷時36小時。藉由Luminex測量IFNγ之量。細胞係來自健康供體。
圖24展示作為抗CD40-PSA標的之DC誘發PSA特異性CD8+ T細胞反應。IFNDC為1μg mAb與PSA之融合蛋白的標的。將經純化自體CD8+ T細胞共培養10天。用抗CD8及PSA(KLQCVDLHV)-四聚物對細胞染色。細胞係來自HLA-A*0201陽性健康供體。結果證實抗CD40向DC有效傳遞PSA，該等DC又引發PSA特異性CD8+ T細胞擴增。簡言之，將5×10e3個負載有2μg/ml抗CD40-PSA之IFNDC與經純化自體CD8+ T細胞(2×10e5個)共培養10天。隨後用四聚物對細胞染色。細胞係來自HLA-0*201陽性健康供體。
圖25為方案(左)，及供體2的具有肽池之T細胞及對照組之IFNγ產生。將5×10e3個負載有2μg/ml抗CD40-細胞週期素D1之IFNDC與經純化自體CD4+ T細胞(2×10e5個)共培養8天。隨後在布雷菲德菌素A存在下用5μM源自細胞週期素D1之個別肽再刺激細胞歷時5小時。對細胞染色以測量細胞內IFNγ表現。
圖26展示肽掃描，及供體2的獲自圖25所示之肽池之T細胞及對照組之IFNγ產生。將5×10e3個負載有2μg/ml抗CD40-細胞週期素D1之 IFNDC與經純化自體CD4+ T細胞(2×10e5個)共培養8天。隨後在布雷菲德菌素A存在下用5μM源自細胞週期素D1之個別肽再刺激細胞歷時5小時。對細胞染色以測量細胞內IFNγ表現。
總之，經由CD40向最有效之抗原呈獻細胞DC傳遞抗原為誘發及活化抗原特異性CD4+與CD8+ T細胞介導之免疫性的有效方法。因此，由抗CD40 mAb製成之疫苗將誘發針對癌症及感染之有效免疫。
肽資訊：HA1序列：MKANLLVLLCALAAADADTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVTHSVNLLEDSHNGKLCR(SEQ ID NO.：53)
LKGIAPLQLGKCNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVETPNSENGICYPGDFIDYEELRE(SEQ ID NO.：54)
QLSSVSSFERFEIFPKESSWPNHNTNGVTAACSHEGKSSFYRNLLWLTEKEGSYPKLKNS(SEQ ID NO.：55)
YVNKKGKEVLVLWGIHHPPNSKEQQNLYQNENAYVSVVTSNYNRRFTPEIAERPKVRDQA(SEQ ID NO.：56)
GRMNYYWTLLKPGDTIIFEANGNLIAPMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQTPLG(SEQ ID NO.：57)
AINSSLPYQNIHPVTIGECPKYVRSAKLRMVTGLRNIPSI(SEQ ID NO.：58)
圖17中肽之序列
肽22：SSFERFEIFPKESSWPN(SEQ ID NO.：59)
肽45：GNLIAPWYAFALSRGFG(SEQ ID NO.：60)
肽46：WYAFALSRGFGSGIITS(SEQ ID NO.：61)
NP序列：MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGKMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNS(SEQ ID NO.：62)
LTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVNGKWMRELILYDKEEIRRIW(SEQ ID NO.：63)
RQANNGDDATAGLTHMMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAG(SEQ ID NO.：64)
AAVKGVGTMVMELVRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMD(SEQ ID NO.：65)
QVRESRNPGNAEFEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEREGYSLVG(SEQ ID NO.：66)
IDPFRLLQNSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVLSFIKGTKVLPRGKLST(SEQ ID NO.：67)
RGVQIASNENMETMESSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISIQPTFSVQRNLPF(SEQ ID NO.：68)
DRTTIMAAFNGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKAASPIVPSFD(SEQ ID NO.：69)
MSNEGSYFFGDNAEEYDN(SEQ ID NO.：70)
圖23中肽之序列
肽22：GKWVRELVLYDKEEIRR(SEQ ID NO.：71)
肽33：RTGMDPRMCSLMQGSTL(SEQ ID NO.：72)
肽46：MCNILKGKFQTAAQKAM(SEQ ID NO.：73)
前列腺特異性抗原(PSA)序列
MWVPVVFLTLSVTWIGAAPLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWV(SEQ ID NO.：74)
LTAAHCIRNKSVILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHD(SEQ ID NO.：75)
LMLLRLSEPAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVIS(SEQ ID NO.：76)
NDVCAQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPERP(SEQ ID NO.：77)
SLYTKVVHYRKWIKDTIVANP(SEQ ID NO.：78)
圖23中肽之序列
肽1：APLILSRIVGGWECE(SEQ ID NO.：79)
肽4：ECEKHSQPWQVLVAS(SEQ ID NO.：80)
肽25：GDDSSHDLMLLRLSE(SEQ ID NO.：81)
肽26：SHDLMLLRLSEPAEL(SEQ ID NO.：82)
肽49：SGDSGGPLVCNGVLQ(SEQ ID NO.：83)
肽54：GSEPCALPERPSLYT(SEQ ID NO.：84)
肽56：ERPSLYTKVVHYRKW(SEQ ID NO.：85)
肽58：VVHYRKWIKDTIVAN(SEQ ID NO.：86)
細胞週期素D1序列
MRSYRFSDYLHMSVSFSNDMDLFCGEDSGVFSGESTVDFSSSEVDSWPGDSIACFIEDER(SEQ ID NO.：87)
HFVPGHDYLSRFQTRSLDASAREDSVAWILKVQAYYNFQPLTAYLAVNYMDRFLYARRLP(SEQ ID NO.：88)
ETSGWPMQLLAVACLSLAAKMEEILVPSLFDFQVAGVKYLFEAKTIKRMELLVLSVLDWR(SEQ ID NO.：89)
LRSVTPFDFISFFAYKIDPSGTFLGFFISHATEIILSNIKEASFLEYWPSSIAAAAILCV(SEQ ID NO.：90)
ANELPSLSSVVNPHESPETWCDGLSKEKIVRCYRLMKAMAIENNRLNTPKVIAKLRVSVR(SEQ ID NO.：91)
ASSTLTRPSDESSFSSSSPCKRRKLSGYSWVGDETSTSN(SEQ ID NO.：92)
圖26中肽之序列。
肽7：DRVLRAMLKAEETCA(SEQ ID NO.：93)
肽8：RAMLKAEETCAPSVS(SEQ ID NO.：94)
肽10：TCAPSVSYFKCVQKE(SEQ ID NO.：95)
MART-1抗原。MART-1為腫瘤相關黑色素細胞分化抗原。用MART-1抗原進行疫苗接種可刺激針對表現黑色素細胞分化抗原之腫瘤細胞的宿主細胞毒性T細胞反應，使得腫瘤細胞溶解。
圖27展示抗CD40-MART-1肽抗體之表現及構築體設計。圖28為MART-1之CD4+及CD8+免疫優勢抗原決定基的概述。圖27及28展示使用可撓性連接子技術以成功表現與人類MART-1之顯著(約2/3)部分融合之重組抗DC受體標的性抗體。哺乳動物生產細胞完全不分泌在H鏈C端與整個MART-1編碼區融合之重組抗體[未示]。Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1加合物尤其充分表現且為MART-1標的性疫苗之一較佳 實施例，具有MART-1抗原決定基之最大負載的Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1-f3-Pep-2亦如此。MART-1powerpoint演示文稿之幻燈片2展現此等加合物可成功附接於多個抗DC受體運載體。
以下序列為H鏈-pep3-pep1-pep2之hMART-1肽串融合蛋白，其中各hMART1肽序列[粗斜體]由肽間間隔子f[以粗體展示]分隔。在此情況下，將源自纖維素體錨定骨架蛋白B前驅體[溶纖維素擬桿菌(Bacteroides cellulosolvens)-描述於gag-nef疫苗本發明揭示內容中]的27個胺基酸長之連接子flex-v1(v1)[斜體]插入H鏈C端與hMARTl肽-可撓性間隔子串之間。加下劃線之AS殘基為接合序列。
[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1]C981為：
Figure 105133908-A0101-12-0089-60
Figure 105133908-A0101-12-0089-61
(SEQ ID NO.：96)
[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1-f3-Pep-2]C978為：
Figure 105133908-A0101-12-0089-481
Figure 105133908-A0101-12-0090-66
Figure 105133908-A0101-12-0090-68
(SEQ ID NO.：97)
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1]C1012為：
Figure 105133908-A0101-12-0090-69
Figure 105133908-A0101-12-0090-70
(SEQ ID NO.：98)
[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3-f4-Pep-1-f3-Pep-2]C1013為：
Figure 105133908-A0101-12-0090-71
Figure 105133908-A0101-12-0090-72
(SEQ ID NO.：99)
MART-1 DNA序列：MART-1構築體具有3個肽，起始/終止位點加下劃線，肽1呈粗體，肽2呈粗斜體且肽3呈加下劃線之粗體：
Figure 105133908-A0101-12-0090-73
Figure 105133908-A0101-12-0091-76
Figure 105133908-A0101-12-0091-77
(SEQ ID NO.：100)
肽3呈粗體，繼之為加下劃線之Flex-4胺基酸序列。
GFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSP ASTNGSITVAATAPTVTPT(SEQ ID NO.：101)
肽1呈粗體，繼之為加下劃線之Flex-3胺基酸序列。
VNATPSAAASMPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILG ASTVTPTATATP(SEQ ID NO.：102)
肽3呈粗體。
SAIVTTTTPTATTKPASVLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEG(SEQ ID NO.：103)
MART1-肽3，斜體部分為CD4+免疫優勢抗原決定基。
GFDHRDSKVSLQEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEQSPPPYSP(SEQ ID NO.：104)
Flex-4
ASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS(SEQ ID NO.：105)
MART1-肽1，斜體部分為CD4+免疫優勢抗原決定基，且加下劃線之斜體部分為CD8+免疫優勢抗原決定基
MPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTT AEEAAGIGILTVILG (SEQ ID NO.：106)
Flex-3：ASTVTPTATATPSAIVTTITPTATTKPAS(SEQ ID NO.：107)
MART1-肽2，斜體部分為CD4+免疫優勢抗原決定基。
VLLLIGCWYCRRRNGYRALMDKSLHVGTQCALTRRCPQEG(SEQ ID NO.：108)
MART1構築體具有2個肽：肽3呈加下劃線之粗斜體，flex-4呈粗體且肽1呈加下劃線之粗斜 體： GFDHRDSKVSLOEKNCEPVVPNAPPAYEKLSAEOSPPPYSP ASTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAAAS MPREDAHFIYGYPKKGHGHSYTTAEEAAGIGILTVILG AS(SEQ ID NO.：109)
蛋白質序列：C978.rAB-cetHS-puro[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3(加下劃線之粗斜體)-f4(粗體)-Pep-1(粗斜體)-f3(斜體)-Pep-2(加下劃線之粗體)]
Figure 105133908-A0101-12-0092-78
Figure 105133908-A0101-12-0092-80
(SEQ ID NO.：110)
蛋白質序列：C981.rAB-cetHS-puro[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1-hMART-1-Pep-3(加下劃線之粗斜體)-f4-(粗體)-Pep-1](加下劃線之粗體)
Figure 105133908-A0101-12-0092-81
Figure 105133908-A0101-12-0092-82
(SEQ ID NO.：111)
GP100抗原。GP100抗原為黑色素瘤相關抗原。當以疫苗調配物形式投與時，gp100抗原可刺激針對表現此抗原之腫瘤的細胞毒性T細胞HLA-A2.1限制性免疫反應，該免疫反應可使腫瘤尺寸減小。
哺乳動物生產細胞完全不分泌與重組抗體H鏈編碼區融合之GP100胞外域編碼區[未示]。以下展示總序列-斜體殘基為前導序列及跨膜域，肽呈粗斜體且跨膜域呈加下劃線之斜體。
Figure 105133908-A0101-12-0093-83
Figure 105133908-A0101-12-0093-84
(SEQ ID NO.：112)
已知之HLA-A0201限制性肽序列為：GP100 M：209-217(2M)：IMDQVPFSV(SEQ ID NO.：113)；209-217 WT：ITDQVPFSV(SEQ ID NO.：114)；GP100 M：280-288(9V)：YLEPGPVTV(SEQ ID NO.：115)；280-288 WT：YLEPGPVTA(SEQ ID NO.：116)；GP100 WT：154-162：KTWGQYWQV(SEQ ID NO.：117)。
圖29-33展示成功表現為分泌型抗DC受體標的性疫苗之gp100加合物。此等加合物採用可撓性連接序列、及gp100胞外域編碼區之斷裂及改組。描述gp100疫苗加合物之較佳實施例。
圖29展示抗CD40-gp100肽抗體之表現及構築體設計。圖30展示其他抗CD40-gp100肽抗體之設計。圖31展示其他抗CD40-gp100肽抗體之表現及構築體設計。圖32為gp100之CD4+及CD8+免疫優勢抗原決定基的概述。圖33展示其他抗CD40-gp100肽抗體之表現及構築體設計。
rAB-cetHS-puro[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-hgp100-Pep-1-f4-Pep-3-f3-Pep-4-f4-Pep-5-f3-Pep-2]C1285，肽呈粗斜 體，可撓性連接子呈粗體且加下劃線之AS殘基為接合序列：
Figure 105133908-A0101-12-0094-85
Figure 105133908-A0101-12-0094-86
(SEQ ID NO.：118)
rAB-cetHS-puro[hIgG4H-C-Flex-hgp100-Pep-1-f4-Pep-3-f3-Pep-4-f4-Pep-5-f3-Pep-2]C1286：
Figure 105133908-A0101-12-0094-87
Figure 105133908-A0101-12-0095-88
Figure 105133908-A0101-12-0095-89
(SEQ ID NO.：119)
gp100：-核酸序列。肽1-加下劃線，肽2-斜體，肽3-粗體，肽4-加下劃線之粗體，肽5-粗斜體。
Figure 105133908-A0101-12-0095-90
Figure 105133908-A0101-12-0096-91
Figure 105133908-A0101-12-0096-92
(SEQ ID NO.：120)
GP100-肽1-核酸序列。
Figure 105133908-A0101-12-0096-93
Figure 105133908-A0101-12-0096-94
(SEQ ID NO.：121)
蛋白質序列：
Figure 105133908-A0101-12-0096-95
Figure 105133908-A0101-12-0096-96
(SEQ ID NO.：122)
GP100-肽3
Figure 105133908-A0101-12-0096-97
Figure 105133908-A0101-12-0096-98
(SEQ ID NO.：123)
蛋白質序列：GTTDGHRPTAEAPNTTAGQVPTTEVVGTTPGQAPTAEPSGTTSVQVPTTEVISTAPVQMPTAESTGMTPEKVPVSEVMGTTLAEMSTPEATGMTPAEVSIVVLSGTTAA(SEQ ID NO.：124)
GP100-肽4：
Figure 105133908-A0101-12-0096-100
Figure 105133908-A0101-12-0096-101
(SEQ ID NO.：125)
蛋白質序列：QVTTTEWVETTARELPIPEPEGPDASSIMSTESITGSLGPLLDGTATLRLVKRQVPLDCVLYRYGSFSVTLDIVQ(SEQ ID NO.：126)
GP100-肽5
Figure 105133908-A0101-12-0097-106
Figure 105133908-A0101-12-0097-104
(SEQ ID NO.：127)
蛋白質序列：GIESAEILQAVPSGEGDAFELTVSCQGGLPKEACMEISSPGCQPPAQRLCQPVLPSPACQLVLHQILKGGSGTYCLNVSLADTNSLAVVSTQLIVPGILLTGQEAGLGQ(SEQ ID NO.：128)
GP100-肽2
Figure 105133908-A0101-12-0097-107
Figure 105133908-A0101-12-0097-108
(SEQ ID NO.：129)
蛋白質序列：PLTFALQLHDPSGYLAEADLSYTWDFGDSSGTLISRAXVVTHTYLEPGPVTAQVVLQAAIPLTSCGSSPVPAS(SEQ ID NO.：130)
細胞週期素B1抗原。細胞週期素B1亦稱作CCNB1，為編碼參與有絲分裂之調節蛋白的人類基因。細胞週期素B1與p34(cdc2)複合形成成熟促進因子(MPF)。已知由於替代性轉錄起始位點而存在兩種替代性轉錄物。第一轉錄物編碼組成性表現之轉錄物。第二轉錄物為調節細胞週期之轉錄物，其主要表現於G2/M期中。
圖34A展示未能自哺乳動物293F細胞分泌的與抗體H鏈或黏結蛋白之C端融合之全長細胞週期素B1。圖34B展示未能自哺乳動物293F細胞分泌的與抗體H鏈或黏結蛋白之C端融合之全長細胞週期素B1。
該等資料為對轉染上清液之連續稀釋液進行的抗人類Fc及抗黏結蛋白ELISA。rAb.細胞週期素B1及Coh.細胞週期素B1蛋白不良地表現為自哺乳動物細胞分泌之產物。
以下胺基酸序列為人類細胞週期素B1。兩個已知含有T細胞抗原決定基之肽區以加下劃線之粗體及加下劃線之斜體形式突顯。
Figure 105133908-A0101-12-0098-109
Figure 105133908-A0101-12-0098-110
(SEQ ID NO.：131)
肽-1
MEMKILRALNFGLGRPLPLHFLRRASKIGEVDVEQHTLAKYLMELTMLDY(SEQ ID NO.：132)
肽-2
DWLVQVQMKFRLLQETMYMTVSIIDRFMQNNCVPKK(SEQ ID NO.：133)
圖35展示由經轉染哺乳動物293F細胞分泌之原型細胞週期素B1疫苗的相對表現量之概述。可撓性連接序列有利於分泌。
C1189 rAB-cetHS-puro[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1(粗體)-h細胞週期素B1-肽-2(斜體)-肽-1(粗斜體)-f4(粗體)][AS連接子-加下劃線]
Figure 105133908-A0101-12-0098-111
Figure 105133908-A0101-12-0099-112
Figure 105133908-A0101-12-0099-113
(SEQ ID NO.：134)
以上為一種抗CD4012E12-細胞週期素B1疫苗形式之成熟分泌H鏈的序列。AS殘基係來自接合限制位點。DNA編碼序列如下所示，且其包括信號肽。
Figure 105133908-A0101-12-0099-114
(SEQ ID NO.：135)
C1143 rAB-cetHS-puro[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C- Flex-v1(粗體)-h細胞週期素B1-肽-2(斜體)-f3(粗體)][AS連接子-加下劃線]。
Figure 105133908-A0101-12-0100-115
Figure 105133908-A0101-12-0100-116
(SEQ ID NO.：136)
以上為一種抗CD4012E12-細胞週期素B1疫苗形式之成熟分泌H鏈的序列。AS殘基係來自接合限制位點。DNA編碼序列如下所示，且其包括信號肽。
Figure 105133908-A0101-12-0100-117
Figure 105133908-A0101-12-0101-118
Figure 105133908-A0101-12-0101-119
(SEQ ID NO.：137)
C911 rAB-cetHS-puro[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1(粗體)-h細胞週期素B1-肽-1(斜體)-f4(粗體)]
Figure 105133908-A0101-12-0101-121
Figure 105133908-A0101-12-0101-122
(SEQ ID NO.：138)
C911 rAB-cetHS-puro[m抗CD40_12E12.3F3_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1(粗體)-h細胞週期素B1-肽-1(斜體)-f4(粗體)]核酸序列。
Figure 105133908-A0101-12-0101-123
Figure 105133908-A0101-12-0102-482
Figure 105133908-A0101-12-0102-125
(SEQ ID NO.：139)
D型細胞週期素抗原。D型細胞週期素主要表現於細胞週期之G1期中。已在某些癌症類型中充分研究細胞週期素D1之表現模式，該等癌症類型包括淋巴瘤及非小細胞肺癌。約30%乳癌為細胞週期素D1陽性。現今過度表現細胞週期素D1為診斷套細胞淋巴瘤之明確標準，該套細胞淋巴瘤為一種惡性非霍奇金氏淋巴瘤，其特徵在於獨特的染色體易位t(11；14)。
細胞週期素D1-肽1-黑體，肽2-加下劃線之黑體，肽-3-斜體，肽4-加下劃線。
Figure 105133908-A0101-12-0102-126
Figure 105133908-A0101-12-0102-127
(SEQ ID NO.：140)
Pep-1
MEHQLLCCEVETIRRAYPDANLLNDRVLRAMLKAEETCAPSVSYFKCV(SEQ ID NO.：141)
Pep-2
QKEVLPSMRKIVATWMLEVCEEQKCEEEVFPLAMNYLDRFLSLEPVKKSRLQLLGATCMFVASKMKETIPLTAEKLCIYTDNSIRPEELLQMELL(SEQ ID NO.：142)
Pep-3
LVNKLKWNLAAMTPHDFIEHFLSKMPEAEENKQIIRKHAQTFVALCATDVKFISNPPSMV(SEQ ID NO.：143)
Pep-4
AAGSVVAAVQGLNLRSPNNFLSYYRLTRFLSRVIKCDPDCLRACQEQIEALLESSLRQAQQNMDPKAAEEEEEEEEEVDLACTPTDVRDVDI(SEQ ID NO.：144)
Flex-4序列
TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(SEQ ID NO.：14)
Flex-3序列
TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(SEQ ID NO.：13)
Flex-var1
QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP(SEQ ID NO.：145)
圖35展示基於已知或預期結構域區之細胞週期素B1分段策略。
圖36展示與H鏈C端形成直接融合物之細胞週期素D1區段p1、p3及p4而非p2充分表現。此等表現情況為H鏈載體與L鏈表現載體一起共轉染於293F細胞中且48-72小時表現之後收集上清液之短暫轉染結果。在H鏈C端接合在一起之細胞週期素D1 p3+p4區段亦充分表現，但各種其他組合(具有及不具有交替flex區段)未表現或表現極不良。
圖37展示以與可撓性連接序列之各種組合與H鏈C端形成直接融合物的各種細胞週期素D1區段之相對表現量。此等表現情況為H鏈載體與L鏈表現載體一起共轉染於293F細胞中且48-72小時表現之後收集上清液之短暫轉染結果。在H鏈C端接合在一起之細胞週期素D1 p2+p3+p4+f4區段亦足夠充分地表現以用於疫苗製備。
適用之抗DCIR 9E8-細胞週期素D1H鏈融合蛋白之序列如下。
1082為rAB-pIRES2[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1(粗體)-h細胞週期素D1-Pep-1(斜體)-f4(粗體)--]
Figure 105133908-A0101-12-0103-128
Figure 105133908-A0101-12-0104-129
Figure 105133908-A0101-12-0104-133
(SEQ ID NO.：146)
C1086為rAB-pIRES2[m抗DCIR_9E8_H-LV-hIgG4H-C-Flex-v1(粗體)-h細胞週期素D1-Pep-2-(粗體)-Pep-3(加下劃線之粗體)-Pep-4(斜體)-f4)(粗體)]
Figure 105133908-A0101-12-0104-134
Figure 105133908-A0101-12-0104-136
(SEQ ID NO.：147)
圖38展示各種H鏈-細胞週期素D1區段構築體及其作為疫苗之相對表現能力之概述。
圖39上圖展示與以DC為標的之抗體H鏈之C端融合的全長細胞週期素D1極不良地表現為分泌之重組抗體。
抗CD40_12E12.3F3
抗CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C-加下劃線之區展示重鏈V區胺基酸序列：
Figure 105133908-A0101-12-0104-137
Figure 105133908-A0101-12-0105-139
(SEQ ID NO.：148)
抗CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C-加下劃線之區展示輕鏈V區胺基酸序列
Figure 105133908-A0101-12-0105-140
Figure 105133908-A0101-12-0105-141
(SEQ ID NO.：149)
抗CD40_12B4.2C10
抗CD40_12B4.2C10重鏈：
Figure 105133908-A0101-12-0105-142
Figure 105133908-A0101-12-0105-143
(SEQ ID No.：150)
抗CD40_12B4.2C10輕鏈：
Figure 105133908-A0101-12-0105-144
Figure 105133908-A0101-12-0105-145
(SEQ ID No.：151)
抗CD40_12B4.2C10輕鏈-替代性純系(17K6)
Figure 105133908-A0101-12-0105-146
Figure 105133908-A0101-12-0105-148
(SEQ ID No.：152)
抗CD40_11B6.1C3
抗CD40_11B6.1C3重鏈：
Figure 105133908-A0101-12-0105-150
Figure 105133908-A0101-12-0105-151
(SEQ ID No.：153)
抗CD40_11B6.1C3輕鏈：
Figure 105133908-A0101-12-0106-152
Figure 105133908-A0101-12-0106-153
(SEQ ID No.：154)
[抗CD40_12E12.3F3_K-V-hIgGK-C]-加下劃線之區展示輕鏈V區序列
Figure 105133908-A0101-12-0106-154
Figure 105133908-A0101-12-0106-155
(SEQ ID NO.：155)
[抗CD40_12E12.3F3_H-V-hIgG4H-C]-加下劃線之區展示重鏈V區序列：
Figure 105133908-A0101-12-0106-156
Figure 105133908-A0101-12-0107-159
Figure 105133908-A0101-12-0107-158
(SEQ ID NO.：156)
抗CD40_12B4.2C10_H-V-hIgG4H-C重鏈
Figure 105133908-A0101-12-0107-160
(SEQ ID NO.：157)
抗CD40_12B4.2C10_K-V-hIgGK-C(變異體1)輕鏈
Figure 105133908-A0101-12-0107-161
Figure 105133908-A0101-12-0108-169
Figure 105133908-A0101-12-0108-165
(SEQ ID NO.：158)
抗CD40_12B4.2C10_K-V-hIgGK-C(變異體2)輕鏈
Figure 105133908-A0101-12-0108-166
Figure 105133908-A0101-12-0108-170
(SEQ ID NO.：159)
抗CD40_11B6.1C3_H-V-hIgG4H-C重鏈
Figure 105133908-A0101-12-0108-171
Figure 105133908-A0101-12-0109-172
Figure 105133908-A0101-12-0109-173
(SEQ ID NO.：160)
抗CD40_11B6.1C3_K-V-hIgGK-C輕鏈
Figure 105133908-A0101-12-0109-175
Figure 105133908-A0101-12-0109-176
(SEQ ID NO：161)
預期就本發明之任何方法、套組、試劑或組合物而言，可執行本說明書中所述之任何實施例，且反之亦然。此外，本發明組合物可用於達成本發明方法。
應瞭解，本文所述之特定實施例以說明之方式展示，且不限制本發明。在不背離本發明範疇之情況下，本發明之主要特徵可用於多種實施例。熟習此項技術者應識別或能夠僅使用常規實驗確定本文所述之特定程序的諸多等效物。認為該等等效物屬於本發明之範疇內，且由申請專利範圍覆蓋。
本說明書中所提及之所有公開案及專利申請案均表明熟習本發明所屬領域之技術者的技術水準。所有公開案及專利申請案均以引用的方式併入本文中，其引用的程度如同特定且個別地將各個別公開案或專利申請案以引用的方式併入一般。
當在申請專利範圍及/或說明書中與術語「包含」結合使用時， 使用措詞「一個(種)」可意謂「一個(種)」，但其亦符合「一或多個(種)」、「至少一個(種)」及「一個(種)或一個(種)以上」之意義。除非明確地表明僅指替代物或替代物相互排斥，否則在申請專利範圍中使用術語「或」意謂「及/或」，但本發明支持僅指替代物及「及/或」之定義。在本申請案中，術語「約」用於表明某一值包括測定該值所用之裝置、方法的固有誤差變異(variation of error)，或研究標的中所存在之變異。
如本說明書及申請專利範圍中所用之措詞「包含」、「具有」、「包括」或「含有」為廣泛或開放性的，且不排除其他未說明要素或方法步驟。
如本文所用之術語「或其組合」係指該術語之前所列各項之所有排列及組合。舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若在特定情形下次序很重要，則亦包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。對於此實例，亦明確包括含有一或多個項或術語之重複的組合，諸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟練技術人員應瞭解，除非本文另外顯而易見，否則任何組合中之項或術語數目通常均無限制。
本文所揭示且主張之所有組合物及/或方法均可根據本發明不經過度實驗進行及執行。雖然本發明之組合物及方法已就較佳實施例進行描述，但熟習此項技術者應顯而易見，在不背離本發明之概念、精神及範疇的情況下，變化形式亦可用於本文所述之組合物及/或方法及方法之步驟或步驟系列。認為所有該等對於熟習此項技術者顯而易見之類似替代物及修改均屬於如隨附申請專利範圍所界定之本發明精神、範疇及概念內。
<110> 美商貝勒研究協會
<120> 以抗原呈獻細胞為標的之癌症疫苗
<130> BHCS：2286
<140> 099106975
<141> 2010-03-10
<150> 12/717,778
<151> 2010-03-04
<150> 61/159,059
<151> 2009-03-10
<150> 61/159,055
<151> 2009-03-10
<150> 61/159,062
<151> 2009-03-10
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<170> PatentIn version 3.5
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Figure 105133908-A0101-12-0127-208
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<213> 人工序列
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 45
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 46
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<210> 47
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<213> 人工序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 58
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 59
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 60
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<211> 60
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 62
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
<400> 63
Figure 105133908-A0101-12-0160-260
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<211> 58
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 64
Figure 105133908-A0101-12-0160-263
Figure 105133908-A0101-12-0161-264
<210> 65
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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Figure 105133908-A0101-12-0161-266
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Figure 105133908-A0101-12-0162-268
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 70
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成肽
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<211> 17
<212> PRT
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<220>
<223> 合成肽
<400> 72
Figure 105133908-A0101-12-0163-274
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 73
Figure 105133908-A0101-12-0163-275
<210> 74
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 74
Figure 105133908-A0101-12-0163-276
Figure 105133908-A0101-12-0164-278
<210> 75
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 75
Figure 105133908-A0101-12-0164-279
<210> 76
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 76
Figure 105133908-A0101-12-0164-280
<210> 77
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 77
Figure 105133908-A0101-12-0164-281
Figure 105133908-A0101-12-0165-282
<210> 78
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 78
Figure 105133908-A0101-12-0165-283
<210> 79
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 79
Figure 105133908-A0101-12-0165-284
<210> 80
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 80
Figure 105133908-A0101-12-0165-285
<210> 81
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> 合成肽
<400> 81
Figure 105133908-A0101-12-0165-286
<210> 82
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 82
Figure 105133908-A0101-12-0166-287
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 83
Figure 105133908-A0101-12-0166-288
<210> 84
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 84
Figure 105133908-A0101-12-0166-289
<210> 85
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 85
Figure 105133908-A0101-12-0166-290
<210> 86
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 86
Figure 105133908-A0101-12-0166-291
<210> 87
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 87
Figure 105133908-A0101-12-0167-292
<210> 88
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 88
Figure 105133908-A0101-12-0167-293
<210> 89
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 89
Figure 105133908-A0101-12-0167-294
<210> 90
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 90
Figure 105133908-A0101-12-0168-295
<210> 91
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 91
Figure 105133908-A0101-12-0168-296
<210> 92
<211> 39
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 92
Figure 105133908-A0101-12-0168-297
<210> 93
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 93
Figure 105133908-A0101-12-0169-298
<210> 94
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 94
Figure 105133908-A0101-12-0169-299
<210> 95
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 95
Figure 105133908-A0101-12-0169-300
<210> 96
<211> 587
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 96
Figure 105133908-A0101-12-0169-301
Figure 105133908-A0101-12-0170-302
Figure 105133908-A0101-12-0171-303
<210> 97
<211> 656
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 97
Figure 105133908-A0101-12-0171-304
Figure 105133908-A0101-12-0172-305
Figure 105133908-A0101-12-0173-306
<210> 98
<211> 593
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 98
Figure 105133908-A0101-12-0174-307
Figure 105133908-A0101-12-0175-308
<210> 99
<211> 660
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 99
Figure 105133908-A0101-12-0176-309
Figure 105133908-A0101-12-0177-310
Figure 105133908-A0101-12-0178-312
<210> 100
<211> 630
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 100
Figure 105133908-A0101-12-0178-509
<210> 101
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 101
Figure 105133908-A0101-12-0178-313
Figure 105133908-A0101-12-0179-314
<210> 102
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 102
Figure 105133908-A0101-12-0179-315
<210> 103
<211> 57
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 103
Figure 105133908-A0101-12-0179-316
<210> 104
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 104
Figure 105133908-A0101-12-0180-317
<210> 105
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 105
Figure 105133908-A0101-12-0180-319
<210> 106
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 106
Figure 105133908-A0101-12-0180-320
<210> 107
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 107
Figure 105133908-A0101-12-0180-321
<210> 108
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 108
Figure 105133908-A0101-12-0181-322
<210> 109
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 109
Figure 105133908-A0101-12-0181-323
<210> 110
<211> 675
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 110
Figure 105133908-A0101-12-0181-324
Figure 105133908-A0101-12-0182-325
Figure 105133908-A0101-12-0183-326
Figure 105133908-A0101-12-0184-329
<210> 111
<211> 606
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 111
Figure 105133908-A0101-12-0184-330
Figure 105133908-A0101-12-0185-331
Figure 105133908-A0101-12-0186-334
<210> 112
<211> 661
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 112
Figure 105133908-A0101-12-0186-335
Figure 105133908-A0101-12-0187-336
Figure 105133908-A0101-12-0188-337
<210> 113
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 113
Figure 105133908-A0101-12-0188-338
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 114
Figure 105133908-A0101-12-0189-339
<210> 115
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 115
Figure 105133908-A0101-12-0189-340
<210> 116
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 116
Figure 105133908-A0101-12-0189-341
<210> 117
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 117
Figure 105133908-A0101-12-0189-342
<210> 118
<211> 1160
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 118
Figure 105133908-A0101-12-0189-344
Figure 105133908-A0101-12-0190-345
Figure 105133908-A0101-12-0191-346
Figure 105133908-A0101-12-0192-347
Figure 105133908-A0101-12-0193-349
<210> 119
<211> 1161
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 119
Figure 105133908-A0101-12-0193-350
Figure 105133908-A0101-12-0194-351
Figure 105133908-A0101-12-0195-352
Figure 105133908-A0101-12-0196-353
Figure 105133908-A0101-12-0197-354
<210> 120
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 120
Figure 105133908-A0101-12-0197-510
Figure 105133908-A0101-12-0198-355
<210> 121
<211> 690
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 121
Figure 105133908-A0101-12-0199-511
<210> 122
<211> 230
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 122
Figure 105133908-A0101-12-0199-356
Figure 105133908-A0101-12-0200-357
<210> 123
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 123
Figure 105133908-A0101-12-0200-512
<210> 124
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 124
Figure 105133908-A0101-12-0200-358
Figure 105133908-A0101-12-0201-359
<210> 125
<211> 225
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 125
Figure 105133908-A0101-12-0201-513
<210> 126
<211> 75
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 126
Figure 105133908-A0101-12-0201-360
<210> 127
<211> 327
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 127
Figure 105133908-A0101-12-0201-514
<210> 128
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 128
Figure 105133908-A0101-12-0202-361
<210> 129
<211> 219
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 129
Figure 105133908-A0101-12-0202-516
<210> 130
<211> 73
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 130
Figure 105133908-A0101-12-0202-362
Figure 105133908-A0101-12-0203-363
<210> 131
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 131
Figure 105133908-A0101-12-0203-364
Figure 105133908-A0101-12-0204-366
<210> 132
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 132
Figure 105133908-A0101-12-0205-367
<210> 133
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 133
Figure 105133908-A0101-12-0205-368
<210> 134
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 134
Figure 105133908-A0101-12-0205-369
Figure 105133908-A0101-12-0206-370
Figure 105133908-A0101-12-0207-371
<210> 135
<211> 1842
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 135
Figure 105133908-A0101-12-0207-517
Figure 105133908-A0101-12-0208-372
<210> 136
<211> 542
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 136
Figure 105133908-A0101-12-0208-373
Figure 105133908-A0101-12-0209-374
Figure 105133908-A0101-12-0210-375
<210> 137
<211> 1686
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 137
Figure 105133908-A0101-12-0210-518
Figure 105133908-A0101-12-0211-376
<210> 138
<211> 556
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 138
Figure 105133908-A0101-12-0211-377
Figure 105133908-A0101-12-0212-378
Figure 105133908-A0101-12-0213-379
<210> 139
<211> 1728
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 139
Figure 105133908-A0101-12-0213-519
Figure 105133908-A0101-12-0214-380
<210> 140
<211> 294
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 140
Figure 105133908-A0101-12-0214-381
Figure 105133908-A0101-12-0215-382
<210> 141
<211> 48
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 141
Figure 105133908-A0101-12-0215-383
<210> 142
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 142
Figure 105133908-A0101-12-0215-384
Figure 105133908-A0101-12-0216-385
<210> 143
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 143
Figure 105133908-A0101-12-0216-388
<210> 144
<211> 92
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 144
Figure 105133908-A0101-12-0216-389
Figure 105133908-A0101-12-0217-390
<210> 145
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 145
Figure 105133908-A0101-12-0217-391
<210> 146
<211> 560
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 146
Figure 105133908-A0101-12-0217-392
Figure 105133908-A0101-12-0218-393
Figure 105133908-A0101-12-0219-394
<210> 147
<211> 759
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 147
Figure 105133908-A0101-12-0219-395
Figure 105133908-A0101-12-0220-397
Figure 105133908-A0101-12-0221-398
<210> 148
<211> 468
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 148
Figure 105133908-A0101-12-0222-399
Figure 105133908-A0101-12-0223-400
<210> 149
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 149
Figure 105133908-A0101-12-0223-401
Figure 105133908-A0101-12-0224-403
<210> 150
<211> 203
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 150
Figure 105133908-A0101-12-0224-404
Figure 105133908-A0101-12-0225-405
<210> 151
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 151
Figure 105133908-A0101-12-0225-406
Figure 105133908-A0101-12-0226-407
<210> 152
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 152
Figure 105133908-A0101-12-0226-408
Figure 105133908-A0101-12-0227-412
<210> 153
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 153
Figure 105133908-A0101-12-0227-413
Figure 105133908-A0101-12-0228-414
<210> 154
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 154
Figure 105133908-A0101-12-0228-415
Figure 105133908-A0101-12-0229-416
<210> 155
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 155
Figure 105133908-A0101-12-0229-521
<210> 156
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 156
Figure 105133908-A0101-12-0229-522
Figure 105133908-A0101-12-0230-418
<210> 157
<211> 1410
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 157
Figure 105133908-A0101-12-0230-523
Figure 105133908-A0101-12-0231-419
<210> 158
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 158
Figure 105133908-A0101-12-0231-524
<210> 159
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 159
Figure 105133908-A0101-12-0231-525
Figure 105133908-A0101-12-0232-420
<210> 160
<211> 1389
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 160
Figure 105133908-A0101-12-0232-529
<210> 161
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 161
Figure 105133908-A0101-12-0232-531
Figure 105133908-A0101-12-0233-421

Claims (9)

  1. 一種融合蛋白之用途，其係用以製備用於增強T細胞反應之疫苗，其中該融合蛋白包含抗CD40抗體及一或多個與該抗CD40抗體連接之癌抗原，其中該一或多個癌抗原與該抗CD40抗體之羧基端連接。
  2. 如請求項1之用途，其中該T細胞反應為CD8+ T細胞反應。
  3. 如請求項1之用途，其中該疫苗為抗癌之治療性疫苗。
  4. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該等癌抗原係選自腫瘤相關抗原，選自CEA、前列腺特異性抗原(PSA)、HER-2/neu、BAGE、GAGE、MAGE 1-4、MAGE 6及MAGE 12、MUC(黏蛋白)、GM2及GD2神經節苷脂、ras、myc、酪胺酸酶、MART(黑色素瘤抗原)、MARCO-MART、細胞週期素B1、細胞週期素D、Pmel 17(gp100)、GnT-V內含子V序列(N-乙醯基葡糖胺基轉移酶V內含子V序列)、前列腺Ca psm、前列腺血清抗原(PSA)、PRAME(黑色素瘤抗原)、β-索烴素、MUM-1-B(黑色素瘤普遍存在之突變基因產物)、GAGE(黑色素瘤抗原)1、BAGE(黑色素瘤抗原)2-10、c-ERB2(Her2/neu)、EBNA(EB病毒細胞核抗原)1-6、gp75、人類乳突狀瘤病毒(HPV)E6及E7、p53、肺抗性蛋白(LRP)、Bcl-2及Ki-67。
  5. 如請求項4之用途，其中MUC為MUC-1或MUC-2。
  6. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該融合蛋白包含兩個或兩個以上癌抗原，且該等癌抗原由一或多個肽連接子分隔。
  7. 如請求項6之用途，其中該一或多個連接子包含丙胺酸及絲胺酸。
  8. 如請求項1至3中任一項之用途，其中該一或多個癌抗原包含HPV E6及/或E7癌抗原。
  9. 如請求項8之用途，其中該癌症包含E6及/或E7陽性腫瘤。
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