TWI688656B

TWI688656B - 具有增加的基因突變特異性的ｄｎａ聚合酶活性增強用ｐｃｒ緩衝液組合物

Info

Publication number: TWI688656B
Application number: TW107124135A
Authority: TW
Inventors: 李炳哲; 朴日鉉; 李輝皓
Original assignee: 南韓商基因凱斯特有限公司
Priority date: 2017-07-12
Filing date: 2018-07-12
Publication date: 2020-03-21
Also published as: TW201908493A; KR101958660B1; CN109251965B; KR20190007216A; CN109251965A

Abstract

本發明係提供一種具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物及其用途，更具體地說，本發明係提供在特定胺基酸位置誘導突變以增加基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用的PCR緩衝液組合物、包含所述PCR緩衝液組合物及/或具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶之用於檢測基因突變或SNP的PCR試劑盒、以及利用所述試劑盒從一個以上的模板中體外(in vitro)檢測至少一種基因突變或SNP的檢測方法。

Description

具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物

本發明係關於一種具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物及其用途，尤其是一種在特定胺基酸位置誘導突變以增加基因突變特異性的DNA聚合酶活增強性用PCR緩衝液組合物、包含所述PCR緩衝液組合物及/或具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶之用於檢測基因突變或SNP的PCR試劑盒、以及利用所述試劑盒從一個以上的模板中體外(in vitro)檢測至少一種基因突變或SNP的檢測方法。

自從第一個人類基因組序列被發現，研究者的研究主要集中探索單核苷酸突變(單核苷酸多態性，SNPs)等個體間的遺傳差異上。基因組中的單核苷酸突變與各種疾病的不同耐藥性或易感體質相關，這已經越來越明確，因此成為主要關心對象。未來醫學相關核苷酸變異的知識可適用於個體遺傳供應的治療方法，並可防止無效或導致副作用的藥物治療(Shi，Expert Rev.Mol.Diagn.1，363-365(2001))。在時間和成本上有效率的核苷酸變異鑑定技術的開發將帶來藥物遺傳學的進一步發展。

SNPs在人類基因組中佔據主要的遺傳變異，可以誘發個體間差異的90%以上。(Kwok，Annu.Rev.Genomics Hum，Genet.2，235-258(2001)；Kwok and Chen，Curr.Issues Mol.Biol.5，43-60(2003)；Twyman and Primrose，Pharmacogenomics 4，67-79(2003))。為了檢測這些遺傳變異和突變等其他核酸變異，可以使用各種方法。例如，可以通過在適當的雜交條件下將待分析的核酸樣品與對於序列變體具有特異性的雜交引子雜交來實現標靶核酸的變體的鑑定(Guo et al.，Nat.Biotechnol.15，331-335(1997))。

但是，發現這種雜交方法，尤其在測定時必需的靈敏度方面無法滿足臨床需要。因此，PCR已被廣泛使用於分子生物學、SNP及其他等位基因序列變體等突變檢測的診斷檢測方法中(Saiki等人，Science 239，487-490(1988))，其中，考慮到變體的存在，在雜交前通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增待檢測的標靶核酸。用於這種測定的雜交引子，通常使用單股寡核苷酸。所述測定之修改的具體實例包括使用螢光雜交探針(Livak，Genet.73-5 2017-07-12 Anal.14，143-149(1999))。一般而言，已經嘗試使SNP和其他序列變異的測定方法自動化(Gut，Hum.Mutat.17，475-492(2001))。

本領域已知的序列變異特異性雜交的對策係通過所謂的基因突變特異性擴增來提供。在該檢測方法中，已經在擴增過程中，使用變異特異性擴增引子，通常引子的3'-末端具有所謂的差異性末端核苷酸殘基，殘基僅對待檢測標靶核酸的一個特異性變異互補。在該方法中，通過PCR擴增後以DNA產物的存在或不存在來測量核苷酸變體。基因突變特異性擴增的原理基於在基因突變特異性擴增引子末端形成典型(canonical)或非典型引子-模板複合物。在精確配對的3'引子末端，產生DNA聚合酶所引起的擴增，而在錯配之引子末端延伸被抑制。

例如，美國專利第5,595,890號公開了基因突變特異性擴增方法及其應用，如揭示了用於檢測k-ras腫瘤基因中的臨床相關點突變(point mutation)的使用方法。另外，美國專利第5,521,301號公開了用於ABO血型系統的基因型分析的等位基因-特異性擴增方法。相反地，美國專利第5,639,611號公開了與檢測導致鐮刀型貧血症的點突變有關的等位基因-特異性擴增的使用方法。然而，基因突變特異性擴增或等位基因特異性擴增具有低選擇性的問題，因此需要更複雜的、時間和成本密集型之最佳化的步驟。

所述用於檢測序列變異、多態性和集中於點突變的方法，當待檢測的序列變異與相同核酸片段(或相同基因)的顯性變異相比不充分時，尤其需要基因-特異性擴增(或基因突變特異性擴增)。

例如，當通過基因突變特異性擴增在體液如血液、血清或血漿中檢測散發性腫瘤細胞時發生這種情況(美國專利第5,496,699號)。為此，DNA首先從血液、血清或血漿等體液中分離出來，而DNA由不充足的散發性腫瘤細胞和過量的非增殖細胞組成。因此，在過量的野生型DNA存在的情況下，在k-ras基因中的腫瘤DNA之重要突變應該從多個複製中被檢測到。

現有技術中公開的所有用於基因突變特異性擴增的方法，儘管使用3'-差異性核苷酸殘基，但即使標靶核酸不完全與待檢測的序列變體相匹配，在合適的DNA聚合酶存在條件下，具有發生較低水準的引子延伸的缺點。特別地，當特定的序列變體通過包含另一個序列變體的過量的背景核酸而被檢測出來，會導致假陽性結果。已知方法的另一個缺點是需要使用3'-末端差異性寡核苷酸殘基。這種基於PCR的方法所存在的缺點，主要是由於用於充分區分錯配鹼基的方法中使用的聚合酶的不適用性而產生。因此，尚不可能通過PCR直接獲得關於是否存在突變的明確資訊。迄今為止，需要額外的時間和成本密集型的純化和測定方法來明確診斷突變。因此，提高基因突變特異性或等位基因-特異性PCR擴增的選擇性的新方法，會對通過PCR的直接基因突變或SNP分析的可信度和強效性帶來很大影響。

因此，需要持續研究具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶及可使所述DNA聚合酶發揮其功能的、混合多種物質的最佳反應緩衝液。

本發明人致力於開發能夠提高基因突變-特異性PCR擴增選擇性的新型DNA聚合酶及用於提高其活性的反應緩衝液，結果證實對Taq聚合酶特定位置處的胺基酸殘基誘發突變時，基因突變特異性顯著增加，當控制PCR緩衝液組合物中的KCl、(NH₄)₂SO₄和/或TMAC(四甲基氯化銨，Tetra methyl ammonium chloride)的濃度時，所述具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶的活性增強，進而完成本發明。

緣此，本發明的一目的在提供一種具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物。

本發明的又一目的在提供一種包含所述之PCR緩衝液組合物之用於檢測基因突變或SNP的PCR試劑盒。

本發明的另一目的在提供一種利用所述之PCR試劑盒從一個以上的模板中體外(in vitro)檢測至少一種基因突變或SNP的檢測方法。

為了實現所述的目的，本發明提供具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物，其中該組合物包含25至100mM的KCl；1至15mM的(NH₄)₂SO₄；最終pH為8.0至9.0。

在本發明的一實施例中，其中該KCl濃度為60至90mM。

在本發明的又一實施例中，該(NH₄)₂SO₄濃度為2.5至8mM。

在本發明的又一實施例中，其中該KCl濃度為70至80mM，且該(NH₄)₂SO₄濃度為4至6mM。

本發明提供具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物，其中該PCR緩衝液組合物進一步包含5至80mM的TMAC(四甲基氯化銨，Tetra methyl ammonium chloride)。

在本發明的一實施例中，其中該KCl濃度為40至90mM。

在本發明的又一實施例中，其中該(NH₄)₂SO₄濃度為1至7mM。

在本發明的另一實施例中，其中該TMAC(四甲基氯化銨，Tetra methyl ammonium chloride)濃度為15至70mM、該KCl濃度為50至80mM，且該(NH₄)₂SO₄濃度為1.5至6mM。

如在本發明的又一實施例中，其中該PCR緩衝液組合物進一步包含Tris．Cl及MgCl₂。

本發明提供一種包含該PCR緩衝液組合物之用於檢測基因突變或SNP的PCR試劑盒。

在本發明的又一實施例中，其中該PCR試劑盒可進一步包含由SEQ ID NO：1的胺基酸序列(SEQ ID NO：6的鹼基序列)組成的Taq聚合酶的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶可包含(a)SEQ ID NO：1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基的取代；及(b)SEQ ID NO：1的胺基酸序列中的第536個胺基酸殘基的取代、第660個胺基酸殘基的取代或第536個及第660個即兩個胺基酸殘基的取代。

在本發明的又一實施例中，其中該第507個胺基酸殘基的取代是穀胺酸(E)被賴胺酸(K)取代，所述第536個胺基酸殘基的取代是精胺酸(R)被賴胺酸取代(K)，所述第660個胺基酸殘基的取代是精胺酸(R)被纈胺酸(V)取代。

在本發明的又一實施例中，其中該PCR試劑盒進一步包含：(i)三磷酸核苷；(ii)與雙股DNA結合的定量試劑；(iii)聚合酶阻斷抗體；(iv)一個或多個對照值或對照序列；(v)一個或多個模板。

本發明還提供一種利用該PCR試劑盒從一個以上的模板中體外(in vitro)檢測至少一種基因突變或SNP的檢測方法。

與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：本發明提供一種可以使具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶發揮其功能的最佳PCR緩衝液組合物，與具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶一起使用，顯著提高所述DNA聚合酶的活性，可實現可靠的基因突變-特異性擴增。另外，包含本發明的PCR緩衝液組合物和/或具有增加的基因特異性的DNA聚合酶的試劑盒可以有效地檢測基因突變或SNP，因此可以有效地利用於疾病的醫學診斷和重組DNA的研究。

通過以下圖式對非限制性實施例所作的詳細描述，以使本發明的其它特徵、目的及優點變得更加明顯：

圖1是描述分別含有R536K、R660V和R536K/R660V突變的Taq DNA聚合酶的製備過程，其中，(a)是片段PCR及重疊PCR的示意圖，(b)顯示在片段PCR中擴增產物的電泳確認結果，(c)顯示用重疊PCR擴增全長後通過電泳確認擴增產物的結果。

圖2是顯示為了提取凝膠，用限制性酶EcoRI/XbaI分解後進行SAP處理的pUC19載體和純化之圖1(c)的重疊PCR產物的電泳確認結果。

圖3是製備分別包含E507K、E507K/R536K、E507K/R660V及E507K/R536K/R660V突變的Taq DNA聚合酶過程中片段PCR和重疊PCR的示意圖。

圖4是顯示為了提取凝膠，用限制性酶EcoRI/XbaI分解後進行SAP處理的pUC19載體和純化之圖3的重疊PCR產物的電泳確認結果。

圖5是顯示通過收集口腔上皮細胞來製備PCR模板的過程的示意圖。

圖6是顯示使用本發明的E507K/R536K、E507K/R660V和E507K/R536K/R660V Taq聚合酶對rs1408799進行的AS-qPCR的結果；作為對照組，使用包括E507K突變的Taq聚合酶。

圖7是顯示使用本發明的E507K/R536K、E507K/R660V和E507K/R536K/R660V Taq聚合酶對rs1015362進行的AS-qPCR的結果；作為對照組，使用包括E507K突變的Taq聚合酶。

圖8是顯示使用本發明的E507K/R536K、E507K/R660V和E507K/R536K/R660V Taq聚合酶對rs4911414進行的AS-qPCR的結果；作為對照組，使用包括E507K突變的Taq聚合酶。

圖9是顯示使用本發明的E507K、E507K/R536K、E507K/R660V和E507K/R536K/R660V Taq聚合酶，根據反應緩衝液中KCl濃度的變化，確認錯配擴增的延遲效果的圖表。

圖10是顯示為了確定反應緩衝液中最佳的KCl濃度，固定(NH₄)₂SO₄的濃度並變化KCl的濃度進行擴增後，通過電泳確認PCR產物的結果。

圖11是顯示為了確定反應緩衝液中最佳的(NH₄)₂SO₄濃度，固定KCl的濃度並變化(NH₄)₂SO₄的濃度進行擴增後，通過電泳確認PCR產物的結果。

圖12是顯示根據反應緩衝液中(NH₄)₂SO₄濃度的變化，確認錯配擴增的延遲效果的圖表。

圖13是顯示在反應緩衝液中固定KCl和(NH₄)₂SO₄的濃度，根據TMAC濃度的變化，確認錯配擴增的延遲效果的圖表。

圖14是顯示在反應緩衝液中固定TMAC和(NH₄)₂SO₄的濃度，根據KCl濃度的變化，確認錯配擴增的延遲效果的圖表。

以下將對本發明進行詳細說明。

如上所述，為了改善以往技術中揭示的基因突變-特異性擴增方法的缺點，需要持續開發具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶及可使所述DNA聚合酶發揮其功能的混合多種物質的最佳反應緩衝液，這些方法的開發，將對通過PCR的直接的基因突變或SNP分析的可信度和強效性帶來很大影響。本發明人致力於開發能夠提高基因突變-特異性PCR擴增選擇性的新型DNA聚合酶及用於提高其活性的反應緩衝液，結果證實對Taq聚合酶特定位置處的胺基酸殘基誘發突變時，基因突變特異性顯著增加，當控制PCR緩衝液組合物中的KCl、(NH₄)₂SO₄及/或TMAC(四甲基氯化銨，Tetra methyl ammonium chloride)的濃度時，所述具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶的活性增強，從而完成本發明。

本發明提供可使具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶發揮其功能的最佳PCR緩衝液組合物，與具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶一起使用，顯著提高所述DNA聚合酶的活性，可實現可靠的基因突變-特異性擴增。另外，包含本發明的PCR緩衝液組合物及/或具有增加的基因特異性的DNA聚合酶的試劑盒可以有效地檢測基因突變或SNP，因此可以有效地利用於疾病的醫學診斷和重組DNA的研究。

下面將對本文所用術語進行說明。

本文中“胺基酸”是指可以導入到肽、多肽或蛋白質中的任何單體單元。如本文所使用，術語“胺基酸”包括以下20種天然或遺傳編碼的α-胺基酸：丙胺酸(Ala或A)、精胺酸(Arg或R)、天冬醯胺(Asn或N)、天冬胺酸(Asp或D)、半胱胺酸(Cys或C)、穀氨醯胺(Gln或Q)、穀胺酸(Glu或E)、甘胺酸(Gly或G)、組胺酸(His或H)、異亮胺酸(Ile或I)、亮胺酸(Leu或L)、賴胺酸(Lys或K)、甲硫胺酸(Met或M)、苯丙胺酸(Phe或F)、脯胺酸(Pro或P)、絲胺酸(Ser或S)、蘇胺酸(Thr或T)、色胺酸(Trp或W)、酪胺酸(Tyr或Y)、纈胺酸(Val或V)。

胺基酸通常是有機酸，可包含被取代或未被取代胺基、被取代或未被取代的羧基和至少一個側鏈(chain)或基團(group)，或這些基團的任何類似物。示例性的側鏈包括巰基、硒基、磺醯基、烷基、芳基、醯基、酮基、疊氮基、羥基、肼基、氰基、鹵基、醯肼、烯基、炔基、醚基、硼酸酯、硼酸基、二氧磷基、膦磺酸基、膦基、雜環、烯酮、亞胺、醛基、酯基、硫代酸、羥胺或這些基團的任何組合。

其他示例性胺基酸包括但不限於：含有可光活化交聯劑的胺基酸、金屬結合胺基酸、自旋標記胺基酸、螢光胺基酸、含金屬的胺基酸、具有新型官能團的胺基酸、與其他分子共價或非共價相互作用的胺基酸、可光籠化和/或可光異構化胺基酸、放射性胺基酸、含有生物素或生物素類似物的胺基酸、糖基化胺基酸、其他碳水化合物修飾的胺基酸、含有聚乙二醇或聚醚的胺基酸、重原子取代胺基酸、可化學分解和/或可光分解的胺基酸、碳連接的含糖胺基酸、氧化還原活性胺基酸、含硫羧酸的胺基酸及含有至少一個毒性部分的胺基酸。

在本發明的DNA聚合酶中，術語“突變體”指相對於天然存在的或未修飾的DNA聚合酶包含一個或多個胺基酸取代的重組多肽。

術語“熱穩定性聚合酶”(指對熱穩定的酶)指具有足夠的熱抵抗性，保持足夠的活性以實現隨後的多核苷酸延伸反應，並且在實現雙股核酸變性所需的時間過程中升溫處理時不會不可逆地變性(失活)。如本文所用，它適用於PCR等反應中的循環溫度。這裡的不可逆變性是指永久性的酶活性的完全喪失。對於熱穩定性聚合酶，酶活性是指用合適的方式催化核苷酸組合以在模板核酸鏈上形成互補的多核苷酸延伸產物。嗜熱性細菌衍生的熱穩定性DNA聚合酶包括例如：來自海棲熱袍菌(Thermatoga maritime)、水生棲熱菌(Thermus acquaticus)、嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)、黃棲熱菌(Thermusflavus)、絲狀棲熱菌(Thermus filiformus)、栖热菌種Sps17、栖热菌種Z05、熱堅棲熱菌(Thermus caldophilus)、熱堅芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)、新阿波羅棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)、非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)的DNA聚合酶。

術語“熱活性”是指在RT-PCR及/或PCR反應中的逆轉錄或黏合/延伸階段通常使用的溫度(即，45-80℃)下保持其催化性能的酶。熱穩定性酶是當用核酸變性所需的高溫處理時不會不可逆地失活或變性的酶。而熱活性酶可能是熱穩定的或可能不是熱穩定的。熱活性DNA聚合酶可以包括但不限於依賴於嗜熱性物種或嗜溫性物種的DNA或RNA。

術語“宿主細胞”是指用於細胞培養基中培養的來自高等植物或動物的單細胞原核生物和真核生物有機體(例如細菌、酵母和放線菌)以及單細胞。

術語“載體(vector)”是能夠被複製，並能夠將基因等將外源DNA傳遞到受體細胞的DNA分子如質體、噬菌體和人工染色體等。“質體”、“載體”或“質體載體”在本文中可互換使用。

術語“核苷酸(nucleotide)”是指以單股(single strand)或雙股(double strand)形式存在的去氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid；DNA)或核糖核酸(ribonucleic acid；RNA)，並且除非另有特別說明，可以包括天然核苷酸的類似物。

術語“核酸”或“多核苷酸”是指DNA或RNA聚合物，或其類似物的聚合物。核酸可以是例如染色體或染色體片段、載體(例如表達載體)、表達盒、裸露的DNA或RNA聚合物、聚合酶鏈式反應(PCR)產物、寡核苷酸、探針或引子，或包含所述物質。核酸可以是例如單股、雙股或三股，但不限於任何特定的長度。除非另有說明，特定的核酸序列除了包含指定的任何序列之外還包括互補序列或可以對其進行編碼。

術語“引子”是指當多核苷酸在延伸啟動條件下時可以充當模板方向上的核酸合成起始點的多核苷酸。引子也可用於多種其他寡核苷酸介導的合成過程，包括從頭合成(de novo)RNA和作為試管內轉錄相關過程的啟動子。引子通常是單股寡核苷酸(例如，寡去氧核糖核苷酸)。引子的適當長度通常在6至40個核苷酸範圍內，更典型的長度在15至35個核苷酸範圍內並取決於預期用途。短引子分子通常需要較低的溫度以與模板形成足夠穩定的雜交複合物。引子不需要反映模板的正確序列，但引子必須有足夠的互補性才能與需延長的模板進行雜交。在特定實施方案中，術語“引子對”是指包括與待擴增的核酸序列的5'末端互補雜交的5'正義引子，與待擴增序列的3'末端雜交的3'-反義引子的引子組。如有必要，可以通過摻入可通過光譜、光化學、生物化學、免疫化學或化學手段檢測到的標籤來標記引子。例如，有用的標記包括：32P、螢光染料、電子密度試劑、酶(通常用於ELISA分析)、生物素或半抗原、以及可以使用抗血清或單株抗體的蛋白質。

術語“5'-核酸水解酶(核酸酶，nuclease)探針”是指包含至少一個用於進行5'-核酸水解酶反應的發光標記物部分以檢測標靶核酸的寡核苷酸。在一些實施方案中，例如，5'-核酸水解酶探針僅包含單個發光部分(例如螢光染料等)。在某些實施方案中，5'-核酸水解酶探針包含自我互補區域，使得探針可以在選擇條件下形成髮夾結構。在一些實施方案中，5'-核酸水解酶探針包含兩個或更多個標記部分，兩個標記中的一個從寡核苷酸分離或分解，輻射強度增加而被釋放。在某些實施方案中，5'-核酸水解酶探針用兩種不同的螢光染料標記，例如5'-末端報導染料和3'-末端淬滅染料或部分標記。在一些實施方案中，5'-核酸酶探針在末端上再加標記或在除末端以外的一個或多個位置加標記。當探針完好時，能量轉移通常發生在兩種螢光材料之間，使得來自報導染料的螢光發射被淬滅一定部分以上。在聚合酶鏈式反應的延伸步驟期間，例如，與模板核酸結合的5'-核酸水解酶探針具有使得報導染料的螢光發射不再被淬滅的活性，例如被Taq聚合酶或其他聚合酶的5'至3'-核酸水解酶活性分解。在一些實施方案中，5'-核酸水解酶探針可以用兩種或更多種不同的報導染料和3'-末端淬滅染料或部分標記。

術語“FRET”或“螢光共振能量轉移”或“forester共振能量轉移”是指兩個或更多個發色團，供體發色團和受體發色團(稱為淬滅劑)之間的能量轉移。供體通常通過發射適當波長的光而激發，將能量轉移給受體。受體通常以重新發射不同波長的光的形式將移動的能量再發射出去。當受體是“暗”淬滅劑時，以光以外的形式將移動的能量進行分散。一個特定的螢光物質是否充當供體或受體取決於FRET對其他成員的性質。常用的供體-受體對包括FAM-TAMRA對。常用的淬滅劑是DABCYL和TAMRA。常用的暗淬滅劑包括：BlackHole Quenchers^TM(BHQ)，(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.)，Iowa Black^TM(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)，BlackBerry^TM Quencher 650(BBQ-650)(Berry& Assoc.，Dexter，Mich.)。

當提及核酸鹼基、三磷酸核苷或核苷酸時，術語“常規的”或“天然的”是指天然發生於所述多核苷酸(即，對於DNA是dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，而且dITP和7-deaza-dGTP經常用來代替dGTP，在定序等試管內DNA合成反應中可以用來代替dATP。

提及核酸鹼基、核苷、或核苷酸時，術語“非常規”或“修飾”包含在特定多核苷酸中天然發生的常規的鹼基、核苷、或核苷酸的修飾、衍生物或類似物。與常規的dNTP相比，特定的非常規的核苷酸在核糖的2'位置被修飾。因此，RNA的天然發生的核苷酸即使為核糖核苷酸(即，ATP、GTP、CTP、UTP、統稱rNTP)，核苷酸在糖2’位置具有羥基基團，相對來說dNTP不存在，因此如本文所用，核糖核苷酸是非常規的作為DNA聚合酶底物的核苷酸。如本文所用，非常規核苷酸包括但不限於用作核酸定序終止子的化合物。示例性終止子化合物包括但不限於具有2'，3'-二去氧結構的化合物，被稱為雙去氧核苷三磷酸。雙去氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP，被統稱為ddNTP。終止子化合物的其他例子包括核糖核苷酸的2'-PO4類似物。其他非常規核苷酸包括但不限於硫代dNTP([[α]-S]dNTP)、5'-[α]-硼(borano)-dNTP、[α]-甲基-膦酸dNTP、核糖核苷三磷酸(rNTP)。非常規的鹼基可用放射性同位素如32P、33P或35S；螢光標記；化學發光標記；生物發光標記；半抗原標籤如生物素；或酶標籤如鏈黴抗生物素蛋白或抗生物素蛋白來標記。螢光標記可以包括帶負電荷的染料如螢光素家族的染料、或帶中性電荷的染料如羅丹明家族的染料、或帶正電荷的染料如花青家族。螢光素家族的染料包括例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN及ZOE。羅丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G及TAMRA。用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、Texas Red和TAMRA標記的各種染料或核苷酸通過Perkin-Elmer(波士頓，麻塞諸塞州)、Applied Biosystems(福斯特市，加州)、Invitrogen/Molecular Probes(尤金，俄勒岡州)市場銷售。花青家族染料包括Cy2、Cy3、Cy5、及Cy7，通過GE Healthcare UK Limited(Amersham Place，Little Chalfont，白金漢郡，英格蘭)市場銷售。

術語“錯配的區分”是指通過在核酸上將一個或多個核苷酸黏附(例如共價地)，以模板依賴性方式延伸核酸(例如引子或其它寡核苷酸)時，用於從錯配-包含序列區分完全互補的序列的生物催化(例如聚合酶、連接酶等酶)的能力。術語“錯配的區分”，是指延伸的核酸(如引子或其它寡核苷酸)與核酸雜交的模板相比，從3'末端核酸具有錯配的錯配-包含(約互補)序列區分完全互補的序列的生物催化能力。在一些實施方案中，延伸的核酸對於完全互補序列在3'末端包含錯配。在一些實施方案中，延伸的核酸對於完全互補序列在末端第二個(N-1)3'-位置及/或N-2位置上包含錯配。

除非另有說明，本說明書中使用的所有技術及科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解的相同的含義。

本發明涉及具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物，所述組合物包含25至100mM的KCI；1至15mM的(NH₄)₂SO₄；最終pH為8.0至9.0。

PCR中使用的聚合酶應使用混合各種物質的最佳反應緩衝液，以發揮其功能。反應緩衝液通常含有穩定pH的因子，作為輔助因子(cofactor)的金屬離子和防止聚合酶變性的穩定化成分。

所述KCl可作為穩定酶的必要因子，幫助引子與靶DNA配對(pairing)。在本發明中，通過調節反應緩衝液中KCl的濃度來確定最佳濃度，以確認最大程度延遲由錯配引起的擴增，同時不降低由匹配引起的擴增效率的高陽離子濃度。

分別使用E507K、E507K/R536K、E507K/R660V及E507K/R536K/R660V Taq聚合酶，確認根據反應緩衝液中KCl濃度變化產生的錯配擴增延遲效果，結果如圖9所示，對於E507K/R536K/R660V Taq聚合酶，即使反應緩衝液中沒有KCl，其錯配擴增延遲效果也很優秀；對於E507K/R536和E507K/R660V，在50mM；作為對照組E507K，在100mM時，錯配擴增延遲效果優秀。結果來看，對於KCl濃度的閾值，E507K/R536K/R660V Taq聚合酶最低，E507K/R536K和E507K/R660V比E507K低。

為了進一步推導適當的KCI濃度，使用E507K/R536K/R660V Taq聚合酶，將反應緩衝液中的(NH₄)₂SO₄濃度固定在一定數值，採用多種KCl濃度進行擴增。通過電泳確認擴增產物的結果，如圖10所示，可以確認適當的KCI濃度為75mM。

因此，本發明的PCR反應緩衝液組合物中KCl濃度可以是25-100mM，較佳為60-90mM，更佳為70-80mM，最佳為75mM。

當KCl濃度低於25mM時，對於一般標靶的擴增沒有影響，但可使由匹配引子產生的擴增與由錯配引子產生的擴增差異減小，當濃度高於100mM時，產生一般標靶的擴增效率下降的問題。

對於PCR反應緩衝液組合物，所述(NH₄)₂SO₄為酶活性的必要輔助因子，與Tris一同用於提高聚合酶的活性。本發明的一個實施例中，以上述推導結果作為基礎，將反應緩衝液中KCl濃度固定在75mM，將(NH₄)₂SO₄的濃度從2.5mM到25mM進行各種變化，以確認適當的(NH₄)₂SO₄的濃度。

其結果如圖11所示，在2.5mM到15mM的(NH₄)₂SO₄的濃度下，確認擴增產物，且適當的(NH₄)₂SO₄的濃度為5mM。

進一步在(NH₄)₂SO₄的的濃度接近5mM(分別用2.5mM、5mM、10mM)的情況下，進行AS-qPCR，結果如圖12所示，雖然在10mM下Ct值差異最大，但確認匹配擴增中Ct稍微延遲，峰向下傾倒，因此確定適當的(NH₄)₂SO₄的濃度為5mM。

因此，本發明的PCR反應緩衝液組合物中(NH₄)₂SO₄的濃度可以是1-15mM，較佳為2.5-8mM，更佳為4-6mM，最佳為5mM。

當(NH₄)₂SO₄濃度低於1mM時，對於一般標靶的擴增沒有影響，但可使由匹配引子產生的擴增與由錯配引子產生的擴增差異減小，當濃度高於15mM時，產生一般標靶的擴增效率下降的問題。

因此，本發明的最佳PCR緩衝液組合物可以包含70至80mM的KCl；4至6mM的(NH₄)₂SO₄；最終pH為8.0至9.0。

本發明的PCR緩衝液組合物可以進一步包含5至80mM的TMAC(四甲基氯化銨，Tetra methyl ammonium chloride)。

TMAC通常用於減少由錯配引起的擴增或提高雜交反應的嚴謹性(stringency)。本發明的一個實施例中，以上述推導結果作為基礎，將反應緩衝液中KCl濃度固定在75mM，(NH₄)₂SO₄的濃度固定在5mM，將TMAC濃度從0mM到80mM進行各種變化，以確認適當的TMAC濃度。

其結果如圖13所示，確認了適當的TMAC濃度，對於E507K/R536K Taq聚合酶為70mM；對於E507K/R536K/R660V Taq聚合酶為25mM。進一步將TMAC濃度固定在25mM，(NH₄)₂SO₄的濃度固定在2.5mM，將KCl濃度分別調整為20、40、60、80mM，進行擴增，結果如圖14所示，確認對於SNP rs1015362及rs4911414，適當的KCl濃度為60mM。

當TMAC濃度超過80mM時，擴增效率降低，因此較佳在所述範圍內使用TMAC。

因此，當本發明的PCR緩衝液組合物包含5-80mM的TMAC時，KCl的濃度可以是40-90mM，較佳是50-80mM，(NH₄)₂SO₄的濃度可以是1-7mM，較佳是1.5-6mM。

因此，當包含TMAC時，本發明的最佳PCR緩衝液組合物可以包含15至70mM的TMAC；50至80mM的KCl；1.5至6mM的(NH₄)₂SO₄；最終pH為8.0至9.0。

本發明的PCR緩衝液組合物還可以進一步包括Tris．Cl及MgCl₂，還可以進一步包括Tween 20及牛血清白蛋白(BSA)。

本發明提供包含所述PCR緩衝液組合物之用於檢測基因突變或SNP的PCR試劑盒。

本發明的PCR試劑盒可進一步包含由SEQ ID NO：1的胺基酸序列組成的Taq聚合酶的DNA聚合酶，所述DNA聚合酶可包含(a)SEQ ID NO：1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基的取代；以及(b)SEQ ID NO：1的胺基酸序列中的第536個胺基酸殘基的取代、第660個胺基酸殘基的取代或第536個及第660個即兩個胺基酸殘基的取代。

根據本發明的另一個較佳實施例，所述第507個胺基酸殘基的取代是穀胺酸(E)被賴胺酸(K)取代，所述第536個胺基酸殘基的取代是精胺酸(R)被賴胺酸取代(K)，所述第660個胺基酸殘基的取代是精胺酸(R)被纈胺酸(V)取代。

本發明的PCR試劑盒可包括一般技術人員在引子延伸過程中使用的已知任意試劑或其他要素。

根據本發明的另一個較佳實施例，所述PCR試劑盒包括一個以上的匹配引子、一個以上的錯配引子或同時包含一個以上的匹配引子和一個以上的錯配引子，所述一個以上的匹配引子及一個以上的錯配引子與標靶序列雜交，所述錯配引子，對於雜交標靶序列，在其3'末端至第7個鹼基位置包含非典型(non-canonical)核苷酸。

本發明的PCR試劑盒還可進一步包含：(i)三磷酸核苷；(ii)與雙股DNA結合的定量試劑；(iii)聚合酶阻斷抗體；(iv)一個或多個對照值或對照序列；(v)一個或多個模板。

所述“Taq聚合酶”是根據嗜熱性細菌水生棲熱菌(Thermus aquaticus)的名字來命名的耐熱性DNA聚合酶，最初從所述細菌中被分離出來。水生棲熱菌是棲息在溫泉和熱水噴出口中的細菌，Taq聚合酶被確認為是能夠承受在PCR過程中所需的蛋白變性條件(高溫)的酶。Taq聚合酶的最佳活性溫度是75-80℃，半衰期在92.5℃條件下為2小時以上，在95℃條件下為40分鐘，97.5℃條件下為9分鐘，在72℃條件下10秒內可複製1000個鹼基對DNA。這缺乏3→'5'核酸外切酶(exonuclease)校正活性，並且在9000個核苷酸中，約在1個中測量出錯誤率。例如，當使用耐熱Taq時，PCR可以在高溫(60℃或更高)下進行。對於Taq聚合酶，使用SEQ ID NO：1中所示的胺基酸序列作為基準序列。

在本發明中，SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第507個胺基酸殘基的穀胺酸(E)被取代為賴胺酸(K)的Taq聚合酶被命名為“E507K”(SEQ ID NO：2，鹼基序列為SEQ ID NO：7)；SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第507個胺基酸殘基的穀胺酸(E)被取代為賴胺酸(K)，第536個胺基酸殘基的精胺酸(R)被取代為賴胺酸(K)的Taq聚合酶被命名為“E507K/R536K”(SEQ ID NO：3，鹼基序列為SEQ ID NO：8)；SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第507個胺基酸殘基的穀胺酸(E)被取代為賴胺酸(K)，第660個胺基酸殘基的精胺酸(R)被取代為纈胺酸(V)的Taq聚合酶被命名為“E507K/R660V”(SEQ ID NO：4，鹼基序列為SEQ ID NO：9)；最後，SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第507個胺基酸殘基的穀胺酸(E)被取代為賴胺酸(K)，第536個胺基酸殘基的精胺酸(R)被取代為賴胺酸(K)，第660個胺基酸殘基的精胺酸(R)被取代為纈胺酸(V)的Taq聚合酶被命名為“E507K/R536K/R660V”(SEQ ID NO：5，鹼基序列為SEQ ID NO：10)。

根據本發明的一個實施例，所述DNA聚合酶區分匹配引子和錯配引子，所述匹配引子和錯配引子與標靶序列雜交，所述錯配引子，對於雜交標靶序列，在其3'末端可包含非典型核苷酸。

所述錯配引子是雜交寡核苷酸，必須充分互補以與標靶序列雜交，但不反映標靶序列的確切序列。

所述“典型核苷酸(canonical nucleotide)”或“互補核苷酸”是指標準華生-克里克(Watson-Crick)鹼基對、A-U、A-T和G-C。

所述“非典型核苷酸(non-canonical nucleotide)”或“非互補核苷酸”是指除華生-克里克(Watson-Crick)鹼基對以外的A-C、A-G、G-U、G-T、T-C、T-U、A、G-G、T-T、U-U、C-C、C-U。

根據本發明的一個較佳實施例，包含匹配引子的標靶序列的擴增，與包含錯配引子的標靶序列的擴增相比，所述DNA聚合酶可表現出比更低的Ct值。

例如，通過將一個或多個核苷酸共價連接至引子，DNA聚合酶可以比以標靶序列依賴性方式錯配的引子更高效率地延伸匹配的引子。在這裡，更高的效率可通過以下例子觀察到，如RT-PCR中與錯配引子相比，匹配引子的Ct值更低。匹配引子和錯配引子之間的Ct值的差異為10或更高，較佳是10-20，或者不存在由錯配引子引起的擴增子合成。

例如，第一反應中使用匹配的正向引子和反向引子，第二反應中，以相同的實驗設置，使用錯配的正向引子和匹配的反向引子，通過標準PCR形成的產物，第一個反應比第二個反應更大。

Ct(閾值交叉循環)值表示定量PCR的DNA定量方法，取決於繪製對數相循環數量上的螢光。基於DNA的螢光檢測的閾值設置為至少比背景稍高。螢光超過閾值的循環數稱為Ct或根據MIQE準則稱為Cq(定量循環， quantification cycle)。給定反應的Ct值定義為螢光發射交叉固定極限值的循環次數。例如，SYBR Green I和螢光探針可用於模板DNA定量的即時PCR。在PCR期間每個循環收集來自樣品的螢光，並對照循環次數繪圖。起始模板濃度與螢光訊號的螢光訊號最初顯示時間成反比。模板濃度越高，訊號越早出現(在較低的循環數出現)。

本發明還涉及編碼上述DNA聚合酶的核酸序列和包含該核酸序列的載體和宿主細胞。使用編碼本發明的DNA聚合酶的核酸可以製備各種載體。可以使用包括來源於可與宿主細胞互換的物種的複製子和控制序列的任何載體。本發明的載體可以是表達載體並且包括與編碼本發明的DNA聚合酶的核酸序列可操作地連接的控制轉錄和翻譯的核酸區域。調控序列是指在特定宿主生物體中表達可操作地連接的編碼序列所需的DNA序列。例如，適用於原核生物的調控序列包括啟動子、任何操作序列和alc核糖體結合位點。另外，載體可以含有“正調節因子(Positive Retroregulatory Element，PRE)”以增強轉錄的mRNA的半衰期。控制轉錄和翻譯核酸區域通常適用於用於表達聚合酶的宿主細胞。本領域已知用於各種宿主細胞之各種類型的合適的表達載體和合適的調控序列。通常，轉錄和翻譯調控序列可以包括例如啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或啟動序列。在典型的實施方案中，調控序列包括啟動子和轉錄起始及終止序列。載體通常還包含含有幾個用於插入外源DNA的限制性位點的多位元點轉接子區域。在某些實施方案中，使用“融合標記”來促進純化，並且如果需要，隨後去除標籤/標誌(例如“組胺酸標籤(His-tag)”)。然而，當從使用“加熱步驟”的嗜溫宿主(例如大腸桿菌)純化熱活性和/或熱穩定性蛋白時，這些通常是不必要的。使用標準重組DNA技術製備含有編碼DNA複製序列、調控序列、表型選擇基因的合適載體和關注的突變聚合酶。如本領域已知，分離的質體、病毒載體和DNA片段被分解並剪切並以特定順序連接在一起以產生期望的載體。

在本發明的一個較佳實施例中，表達載體含有用於選擇轉化宿主細胞的選擇標記基因。選擇基因在本領域中是已知的，並且根據所使用的宿主細胞會有所不同。合適的選擇基因可以包括編碼安比西林及/或四環素抗性的基因，由此可以在存在這些抗生素的情況下轉化培養這些載體的細胞。

在本發明的一個較佳實施例中，編碼本發明的DNA聚合酶的核酸序列單獨或與載體組合導入細胞中。導入或其等同表達是指核酸以適於隨後的整合、擴增和/或表達的方式進入細胞。導入方法包括例如CaPO₄沉澱、脂質體融合、LIPOFECTIN^®、電泳、病毒感染等。

原核生物用作本發明初始轉植步驟的宿主細胞。為了快速製備大量的DNA，為了製備用於生成位點-取向突變的單股DNA模板，為了同時篩選許多突變體，為了對所產生的突變體進行DNA定序，這是特別有用的。原核細胞的合適的宿主細胞包括大腸桿菌E.coli K12菌株94(ATCC No.31，446)、大腸桿菌E.coli菌株W3110(ATCC No.27，325)、大腸桿菌E.coli K12菌株DG116(ATCC No.53，606)、大腸桿菌E.coli X1776(ATCC No.31，537)和大腸桿菌E.coli B；大腸桿菌E.coli的許多不同的菌株如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539，以及其他物種，包括芽孢桿菌科如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、其他腸桿菌科如鼠傷寒沙門氏桿菌(Salmonella typhimurium)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcesans)、以及各種假單胞菌種(假單胞菌屬，Pseudomonas sp.)的原核生物屬可被作為宿主。典型地，用於轉化大腸桿菌(E.coli)的質體包括pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCI18、pUC 119及Bluescript M13。然而，也可以使用許多其他合適的載體。

本發明還提供製備DNA聚合酶的方法，包括以下步驟：培養所述宿主細胞的步驟；從培養物及其培養上清液中分離DNA聚合酶的步驟。

本發明的DNA聚合酶通過在誘導或引起DNA聚合酶表達的適當條件下，培養通過含有編碼DNA聚合酶的核酸序列的表達載體轉化的宿主細胞來製備。在適合於蛋白質表達的條件下培養轉化的宿主細胞的方法是本領域已知的。用於以含有λ pL啟動子的質體載體製備聚合酶的合適宿主細胞是大腸桿菌菌株DG116(ATCC No.53606)。根據表達情況，可以收集並分離聚合酶。

一旦純化，就可以測定本發明DNA聚合酶的錯配區分。例如，通過比較引子完全匹配的標靶序列的擴增與引子3’末端的單鹼基錯配的標靶序列的擴增來測量錯配區別活性。擴增可以即時被檢測，例如通過使用TaqManTM探針。可以通過比較兩種反應的Ct來估計聚合酶區分兩種標靶序列的能力。

本發明提供利用所述PCR試劑盒從一個以上的模板中體外(in vitro)檢測至少一種基因突變或SNP的檢測方法。

術語“SNP(單核苷酸多態性，Single Nucleotide Polymorphisms)”是指在DNA核苷酸序列中顯示一個核苷酸序列(A、T、G或C)的差異的遺傳變化或突變。

在本發明的體外(in vitro)SNP檢測方法中，標靶序列可以存在於測試樣品中並包括DNA、cDNA或RNA，較佳包括基因組DNA。測試樣品可以是從細菌、細菌培養物或細胞培養物製備的一種細胞裂解物。另外，測試樣品可以包含在動物中，較佳包含在脊椎動物中，更佳包含在人受試者中。標靶序列可以包含在基因組DNA中，較佳包含在個體的基因組DNA中，更佳包含在細菌或脊椎動物，最佳包含在人受試者的基因組DNA中。

本發明的SNP檢測方法可以包括利用雙股特異性染料如SYBR Green I的熔解溫度分析。

熔解溫度曲線分析可以在包含軟體(onboard software SDS 2.1)的ABI 5700/7000(96孔格式)或ABI 7900(384孔格式)等即時PCR設備中進行。或者，熔解溫度曲線分析可以以終點分析來執行。

“結合雙股DNA的染料”或“雙股特異性染料”，和未與雙股DNA結合時相比，與雙股DNA結合時具有高螢光的情況下可以被使用。這種染料的實例包括SOYTO-9、SOYTO-13、SOYTO-16、SOYTO-60、SOYTO-64、SYTO-82、溴乙烷(EtBr)、SYTOX Orange、TO-PRO-1、SYBR Green I、TO-PRO-3或EvaGreen。除了EtBr和EvaGreen(Quiagen)，這些染料已用於即時應用測試。

本發明的體外(in vitro)SNP檢測方法可通過即時PCR、標準PCR後的瓊脂糖凝膠分析、通過即時PCR的基因突變特異性擴增或等位基因特異性擴增、四引子擴增受阻突變系統PCR或等溫擴增來進行。

所謂“標準PCR”是一般技術人員已知之用於擴增DNA或cDNA的單拷貝或多拷貝的技術。幾乎所有的PCR都使用Taq聚合酶或熱穩定DNA聚合酶如Klen Taq。DNA聚合酶通過使用單股DNA作為模板並使用寡核苷酸(引子)從核苷酸酶促裝配新的DNA股。通過PCR產生的擴增子，可以在瓊脂糖凝膠上分析。

所述“即時PCR”可以在執行PCR時即時監控其過程。因此，在整個PCR過程中收集資料，而不是在PCR結束時收集。在即時PCR中，反應的特徵是循環中首次檢測到擴增的時間點，而不是固定循環次數後累積的目標量。主要使用基於染料的檢測和基於探針的檢測兩種方法來執行定量PCR。

所述“等位基因特異性擴增(Allele Specific Amplification，ASA)”是一種擴增技術，其PCR引子被設計為單個核苷酸殘基可以區分其他模板。

所述“通過即時PCR的基因突變特異性擴增或等位基因特異性擴增”可以以高效方式檢測基因突變或SNP。與大多數檢測基因突變或SNP的其他方法不同，目標基因材料的預擴增不是必需的。ASA根據匹配和錯配的引子/標靶序列複合物之間的區別，在單個反應中結合擴增和檢測。反應過程中擴增DNA的增加可以通過由諸如SYBR Green I的染料引起的螢光訊號的增加來即時監測，所述染料在與雙股DNA結合時發光。通過即時PCR的遺傳突變特異性擴增或等位基因特異性擴增，發生錯配時出現螢光訊號的延遲或訊號不存在。在基因突變或SNP檢測中，這提供了關於是否存在基因突變或SNP的資訊。

所述“四引子擴增受阻突變系統PCR”在單管PCR反應中與對照片段一同擴增野生型和突變型等位基因。非等位基因特異性對照擴增子通過突變區側面的兩個通用(外部)引子擴增。兩個等位基因特異性(內部)引子的設計方向與通用引子相反，與通用引子一同擴增野生型和突變型擴增子。結果，兩個等位基因特異性擴增子由於突變的位置相對於通用(外部)引子是不對稱的，因此具有不同的長度，可以通過標準凝膠電泳容易地分離。所述對照擴增子提供了假陰性和擴增失敗的內部對照，並且兩個等位基因特異性擴增子中的至少一個始終存在於四引子擴增受阻突變系統PCR中。

所述“等溫擴增”是指核酸的擴增在較低溫度下進行，而不依賴於熱循環儀，較佳溫度不需要在擴增期間改變。等溫擴增中使用的溫度可以在室溫(22-24℃)至約65℃之間，或者在約60-65℃、45-50℃、37℃-42℃或22-24℃的常溫。等溫擴增產物可通過凝膠電泳、ELISA、ELOSA(酶聯寡核苷酸試驗，Enzyme linked oligosorbent assay)、即時PCR、ECL(改進的化學發光)、分析RNA、DNA和蛋白質或濁度之基於晶片的毛細管電泳裝置生物分析儀(bioanalyzer)來檢測。

在本發明的一個實施例中，使用E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V Taq聚合酶，確認對於包含SNP(rs1408799、rs1015362和/或rs4911414)的模板，其錯配引子延伸能力是否減少。

結果，如圖6至圖8所示，與E507K Taq聚合酶相比，可以證實E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V Taq聚合酶的由錯配引子引起的擴增延遲，其效果在E507K/R536K/R660V Taq聚合酶中最為明顯。

這證實了與常規Taq聚合酶(E507K)相比，本發明的DNA聚合酶具有更高的錯配延伸選擇性。因此，預計本發明的DNA聚合酶可有效應用於疾病的醫學診斷和重組DNA的研究。

本發明的PCR試劑盒可以進一步包含三磷酸核苷。

本發明的PCR試劑盒還包括(i)一種或多種緩衝液；(ii)與雙股DNA結合的定量試劑；(iii)聚合酶阻斷抗體；(iv)一個或多個對照值或對照序列；(v)一個或多個模板；如圖所示。

下面將通過實施例對本發明進行詳細說明。這些實施例是對本發明的示例性說明，本領域具有一般知識的人應理解，本發明的申請專利範圍並不侷限於所述實施例。

實施例1 誘發Taq聚合酶突變

1-1.片段PCR

在本實施例中，按照以下方法製備SEQ ID NO：1的胺基酸序列中第536個胺基酸殘基的精胺酸被賴胺酸取代的Taq DNA聚合酶(以下稱為“R536K”)、第660個胺基酸殘基的精胺酸被纈胺酸取代的Taq DNA聚合酶(以下稱為“R660V”)、和第536個胺基酸殘基的精胺酸被賴胺酸取代以及第660個胺基酸殘基的精胺酸被纈胺酸取代的Taq DNA聚合酶(以下稱為“R536K/R660V”)。

首先，使用表1所示的突變特異性引子通過PCR擴增Taq DNA聚合酶片段(F1至F5)，如圖1(a)所示。反應條件如表2所示。

通過電泳確認PCR產物，結果如圖1(b)所示，確認了各片段的條帶，以此確認標靶片段已被擴增。

1-2.重疊(overlap)PCR

將所述1-1中擴增的各片段作為模板，兩端使用引子(Eco-F和Xba-R引子)擴增全長。反應條件如表3和表4所示。

結果，如圖1(c)所示，確認了“R536K”、“R660V”、“R536K/R660V”Tag聚合酶被擴增。

1-3.連接(ligation)

在表5所示的條件下，用限制性酶EcoRI/XbaI將pUC19在37℃下分解4小時並純化DNA，在表6所示的條件下，將純化的DNA在37℃用SAP處理1小時以製備載體。

對於插入物(insert)，將所述實施例1-2的重疊PCR產物純化，並在表7所示條件下，用限制性酶EcoRI/XbaI在37℃下分解3小時，然後與製備的載體一同進行凝膠提取(圖2)。

在表8所示的條件下，在室溫(RT)下連接2小時後，轉化大腸桿菌E.coli DH5α並在含有安比西林的培養基上篩選。從獲得的菌落製備的質體進行定序，獲得引入了所需突變的Taq DNA聚合酶突變體(“R536K”、“R660V”和“R536K/R660V”)。

實施例2 引入E507K突變

2-1.片段PCR

對所述實施例1中製備的“R536K”、“R660V”及“R536K/R660V”Taq DNA聚合酶的活性進行測試，結果確認活性下降(數據未顯示)，分別對“R536K”、“R660V”及“R536K/R660V”引入E507K突變(SEQ ID NO：1的胺基酸序列中，第507個胺基酸殘基的穀胺酸被賴胺酸取代)，作為對照組，在野生型(WT)Taq DNA聚合酶中也引入E507K突變。引入E507K突變的Taq DNA聚合酶製備方法與實施例1相同。

使用表9所示的突變特異性引子通過PCR擴增Taq DNA聚合酶片段(F6至F7)，如圖3所示。反應條件如表10所示。

2-2.重疊(overlap)PCR

將所述2-1中擴增的各片段作為模板，兩端使用引子(Eco-F和Xba-R引子)擴增全長。反應條件如表11所示。

2-3.連接(ligation)

對於插入物(insert)，將所述實施例2-2的重疊PCR產物純化，並在表7所示條件下，用限制性酶EcoRI/XbaI在37℃下分解3小時，然後與製備的載體一同進行凝膠提取(圖4)。

在表8所示的條件下，在室溫(RT)下連接2小時後，轉化大腸桿菌E.coli DH5α或DH10β並在含有安比西林的培養基上篩選。從獲得的菌落製備的質體進行定序，獲得引入了所需突變的Taq DNA聚合酶突變體(“E507K/R536K”、“E507K/R660V”和“E507K/R536K/R660V”)。

實施例3 使用本發明的DNA聚合酶進行qPCR

使用各自含有所述實施例2中獲得的“E507K/R536K”、“E507K/R660V”和“E507K/R536K/R660V”突變的Taq聚合酶，確認對於含有SNP的模板其延伸錯配引子能力是否減少。作為對照組，使用含有E507K突變的“E507K”Taq聚合酶。

在本發明中使用的包含SNP的模板為rs1408799、rs1015362和rs4911414，各模板的基因型和其特異性引子(IDT，美國)的序列資訊如表12和表13所示。

PCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)如下表14所示。

探針進行雙重標記，如下表15所示。

使用購自Noble Bio的口腔上皮細胞收集試劑盒收集口腔上皮細胞，將其溶解於500μl裂解液(lysis solution)中，並以12,000×g離心3分鐘。將上清液轉移到新管中，每次使用1μl(圖5)。

反應條件如表16表示，反應緩衝液的組成如表17表示。

除了表13所示的特異性引子以外，其他反應液以同樣方式在兩個試管中製備，通過添加各等位基因特異性引子進行qPCR。此時，合併各試管中檢測到的螢光訊號以在AB 7500軟體(v 2.0.6)上計算和分析達到閾值(threshold)螢光值的循環(Ct)值的差異。由錯配引子引起的擴增中的Ct值延遲的時間越長，可判斷為基因突變特異性或等位基因特異性良好。

在rs1408799、rs1015362及rs4911414上進行AS-qPCR的結果，如圖6至圖8所示，與對照組E507K相比，可以證實包含E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V突變的Taq聚合酶的情況下，錯配引子引起的擴增延遲，其效果在E507K/R536K/R660V突變中最為明顯。

這證實了與包含E507K突變的Taq聚合酶相比，本發明包含E507K/R536K、E507K/R660V或E507K/R536K/R660V突變的Taq DNA聚合酶具有更優秀的錯配延伸選擇性。因此，預計本發明的Taq DNA聚合酶可有效應用於疾病的醫學診斷和重組DNA的研究。

實施例4 反應緩衝液的KCl濃度最佳化

在本實施例中，為了尋找使由匹配引起的擴增效率不降低而由錯配引起的擴增最大限度地延遲的高陽離子濃度，調整PCR反應緩衝液中的KCl濃度來確定KCl的最佳濃度。

使用實施例2中獲得的分別包含“E507K/R536K”、“E507K/R660V”或“E507K/R536K/R660V”突變的Taq聚合酶，並與包括E507K突變的Taq聚合酶比較KCl濃度閾值。

包含SNP的模板使用rs1408799，模板的基因型為TT，引子使用表12中記載的rs1408799引子。qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)以表14的條件進行，雙重標記探針使用表15的1408799-FAM，反應條件如表18所示，反應緩衝液組成如表19。

結果如圖9所示，E507K/R536K/R660V Taq聚合酶的KCI濃度閾值最低，E507K/R536K、E507K/R660V的KCl濃度閾值比E507K低。

以上述結果為基礎，為了確定適當的KCl濃度，使用E507K/R536K/R660V Taq聚合酶進行進一步實驗，引子使用表13中記載的rs1408799-T特異性引子。qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)以表14的條件進行35個循環，反應條件如表20所示。

對照組的反應緩衝液組成與表21相同，實驗組的反應緩衝液的組成如表8，將(NH₄)₂SO₄濃度固定在2.5mM，對KCl濃度進行各種變化。

用所述條件擴增後通過電泳確認PCR產物的結果，如圖10所示，可以確認既可使由錯配引起的擴增最大限度地延遲而又使由匹配引起的擴增效率不降低的適當的KCl濃度為75mM。

實施例5 反應緩衝液的(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 濃度最佳化

本實施例以所述實施例4的結果為基礎，將反應緩衝液內KCl濃度固定在75mM，對(NH₄)₂SO₄濃度進行各種變化，以此確認最佳的(NH₄)₂SO₄濃度。引子使用表13中記載的rs1408799-T特異性引子，qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)以表14的條件進行35個循環，反應條件如表20所示，對照組的反應緩衝液組成與表21相同。

其結果如圖11所示，適當的(NH₄)₂SO₄濃度為5mM。

以所述結果作為基礎，將反應緩衝液中KCl濃度固定在75mM，將(NH₄)₂SO₄的濃度設定在5mM左右(分別為2.5mM、5mM及10mM)，進一步確認由錯配引起的擴增延遲效果。

引子使用表13中記載的rs1408799引子，雙重標記探針使用表15的1408799-FAM，反應條件如表22所示。

其結果，如圖12所示，(NH₄)₂SO₄的濃度在10mM下Ct值差異最大，但確認由匹配引起的擴增Ct稍微延遲，峰向下傾倒，因此確定適當的(NH₄)₂SO₄的濃度為5mM。

綜合實施例4及實施例5的結果，確認最佳反應緩衝液組合包含50mM的Tris．Cl、2.5mM的MgCl₂、75mM的KCl、5mM的(NH₄)₂SO₄、0.1% Tween 20及0.01% BSA。

實施例6 反應緩衝液中添加TMAC及其濃度最佳化

在本實施例中，在反應緩衝液中添加TMAC，並確認其最佳濃度。以所述實施例4及實施例5的結果為基礎，將反應緩衝液中KCl濃度固定在75mM，(NH₄)₂SO₄濃度固定在5mM，對TMAC的濃度進行各種變化，以此確認最佳的TMAC濃度。

使用E507K/R536K或E507K/R536K/R660V Taq聚合酶，包含SNP的模板使用rs1408799，模板的基因型為TT，引子使用表12中記載的rs1408799 引子。qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)以表14的條件進行，雙重標記探針使用表15的1408799-FAM，反應條件如表22所示。

實驗結果如圖13所示，確認了適當的TMAC濃度，對於E507K/R536K Taq聚合酶為60mM；對於E507K/R536K/R660V Taq聚合酶為25mM，並確認若TMAC濃度過高，擴增效率降低。

實施例7 反應緩衝液的KCl、(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 及TMAC濃度最佳化

在本實施例中，基於所述實施例6確認的結果，使用E507K/R536K/R660V Taq聚合酶確認反應緩衝液中最佳的KCl、(NH₄)₂SO₄及TMAC濃度。

具體而言，將反應緩衝液中TMAC濃度固定在25mM，(NH₄)₂SO₄濃度固定在2.5mM，將KCl濃度分別調整為20、40、60、80mM。對於兩個SNP即rs1015362及rs4911414進行實驗，模板的基因型如表12所述，引子使用表13中記載的rs1015362及rs4911414引子，qPCR條件(Applied Biosystems 7500 Fast)以表14的條件進行，雙重標記探針使用表15的1408799-FAM，反應條件如表22所示。

實驗結果，如圖14所示，對於兩個SNP，適當的KCl濃度為60mM，濃度為80mM時，可以觀察到擴增效率降低。

通過以上結果，確認反應緩衝液中最佳的KCl濃度為60mM，(NH₄)₂SO₄濃度為2.5mM，TMAC濃度為25mM。更具體來說，確認對於E507K/R536K聚合酶，使用濃度為75mM的KCl、5mM的(NH₄)₂SO₄、60mM的TMAC最有效；對於E507K/R536K/R660V聚合酶，使用濃度為60mM的KCl、2.5mM的(NH₄)₂SO₄濃度、25mM的TMAC最有效。

<110> 基因凱斯特有限公司

<120> 具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物

<130> 107E0252

<150> KR 10-2017-0088376

<151> 2017-07-12

<160> 30

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> PRT

<213> 人工序列

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Claims

一種具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物，其中該組合物包含：60至90mM的KCl；及2.5至8mM的(NH₄)₂SO₄；最終pH為8.0至9.0，其中，該具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物中，該具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶係具有由SEQ ID NO：1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基即谷胺酸(E)被賴胺酸(K)取代、第536個胺基酸殘基即精胺酸(R)被賴胺酸取代(K)、及第660個胺基酸殘基即精胺酸(R)被纈胺酸(V)取代的胺基酸序列組成的Taq聚合酶的DNA聚合酶。
如申請專利範圍第1項所述之具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物，其中該KCl濃度為70至80mM，且該(NH₄)₂SO₄濃度為4至6mM。
一種具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物，其中該組合物包含：50至80mM的KCl；1.5至6mM的(NH₄)₂SO₄；以及5至30mM的四甲基氯化銨(Tetra methyl ammonium chloride,TMAC)；最終pH為8.0至9.0，其中，該具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物中，該具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶係具有由SEQ ID NO：1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基即谷胺酸(E)被賴胺酸(K)取代、第536個胺基酸殘基即精胺酸(R)被賴胺酸取代(K)、及第660個胺基酸殘基即精胺酸(R)被纈胺酸(V)取代的胺基酸序列組成的Taq聚合酶的DNA聚合酶。
如申請專利範圍第3項所述之具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物，其中該TMAC濃度為25mM、該KCl濃度為60mM、且該(NH₄)₂SO₄濃度為2.5mM。
如申請專利範圍第1項或第3項所述之具有增加的基因突變特異性的DNA聚合酶活性增強用PCR緩衝液組合物，其中該PCR緩衝液組合物進一步包含Tris．Cl及MgCl₂。
一種包含申請專利範圍第1項或第3項所述的PCR緩衝液組合物的用於檢測基因突變或SNP的PCR試劑盒。
如申請專利範圍第6項所述之用於檢測基因突變或SNP的PCR試劑盒，其中該PCR試劑盒進一步包含一DNA聚合酶，且該DNA聚合酶具有由SEQ ID NO：1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基即谷胺酸(E)被賴胺酸(K)取代、第536個胺基酸殘基即精胺酸(R)被賴胺酸(K)取代、及第660個胺基酸殘基即精胺酸(R)被纈胺酸(V)取代的胺基酸序列組成的Taq聚合酶。
如申請專利範圍第6項所述之用於檢測基因突變或SNP的PCR試劑盒，其中該PCR試劑盒進一步包含：(i)三磷酸核苷；(ii)與雙股DNA結合的定量試劑；(iii)聚合酶阻斷抗體；(iv)一個或多個對照值或對照序列；以及(v)一個或多個模板。
一種使用申請專利範圍第6項所述之PCR試劑盒從一個以上的模板中體外檢測至少一種基因突變或SNP的檢測方法。
如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該PCR試劑盒進一步包含一DNA聚合酶，且該DNA聚合酶具有由SEQ ID NO：1的胺基酸序列中第507個胺基酸殘基即谷胺酸(E)被賴胺酸(K)取代、第536個胺基酸殘基即精胺酸(R)被賴胺酸(K)取代、及第660個胺基酸殘基即精胺酸(R)被纈胺酸(V)取代的胺基酸序列組成的Taq聚合酶。