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TWI688392B - 無長循環材料之泊洛沙姆組成物以及其製造方法和用途 - Google Patents

無長循環材料之泊洛沙姆組成物以及其製造方法和用途 Download PDF

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TWI688392B
TWI688392B TW104122001A TW104122001A TWI688392B TW I688392 B TWI688392 B TW I688392B TW 104122001 A TW104122001 A TW 104122001A TW 104122001 A TW104122001 A TW 104122001A TW I688392 B TWI688392 B TW I688392B
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Ｒ 馬汀 埃瑪努埃萊
曼那爾撒米 巴拉蘇布拉曼尼恩
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美商救生筏生物科技公司
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Abstract

本文提供一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆組成物及其用途。詳言之，提供LCMF泊洛沙姆188組成物及其用途。亦提供用於製備泊洛沙姆組成物，特別是該等LCMF泊洛沙姆組成物的超臨界流體萃取(SFE)方法及高壓(亞臨界)方法。

Description

無長循環材料之泊洛沙姆組成物以及其製造方法和用途 相關申請
本案主張R.Martin Emanuele及Mannarsamy Balasubramanian於2014年7月7日提交的題為「A POLOXAMER COMPOSITION FREE OF LONG CIRCULATING MATERIAL AND METHODS FOR PRODUCTION AND USES THEREOF」之美國臨時申請案號62/021,697的優先權益。
本申請案涉及R.Martin Emanuele及Mannarsamy Balasubramanian於同日提交的題為「A POLOXAMER COMPOSITION FREE OF LONG CIRCULATING MATERIAL AND METHODS FOR PRODUCTION AND USES THEREOF」之國際PCT申請案號(代理人案號38645.4003.WO 01/4003PC)及美國申請案號(代理人案號38645.04003.US70/4003)。
本申請案亦涉及R.Martin Emanuele、Santosh Vetticaden及Patrick Keran於2014年7月7日提交的題為「POLOXAMER THERAPY FOR HEART FAILURE」之美國臨時申請案號62/021,691；R.Martin Emanuele、Santosh Vetticaden及Patrick Keran於2015年2月27日提交的題為「POLOXAMER THERAPY FOR HEART FAILURE」之美國臨時申請案號62/126,400；R.Martin Emanuele、Santosh Vetticaden及Patrick Keran於2014年7月7日提交的題為「POLOXAMER THERAPY FOR HEART FAILURE」之國 際PCT申請案號PCT/US14/45627；且本申請案亦涉及國際PCT申請案號(代理人案號38645.04001.WO12/4001BPC)及美國申請案號(代理人案號38645.04001.US70/4001)，各案均屬於R.Martin Emanuele、Santosh Vetticaden及Patrick Keran，各自在同日提交且各自題為「POLOXAMER THERAPY HEART FAILURE」。
在准許的情況下，每一申請案之主題均以全文引用的方式併入本文中。
本文提供一種無長循環材料(long circulating material free，LCMF)之泊洛沙姆組成物及其用途。亦提供用於製備該等LCMF泊洛沙姆組成物之超臨界流體萃取(supercritical fluid extraction，SFE)方法及高壓(亞臨界)方法。
某些聚氧丙烯/聚氧乙烯(polyoxypropylene/polyoxyethylene，POP/POE)共聚物，稱為泊洛沙姆(poloxamer)，當投予人類或動物時具有有益的生物作用。該等共聚物已經單獨或與包括例如抗凝血劑、自由基清除劑、消炎劑、抗生素、膜穩定劑及灌注介質在內之其他化合物組合用於治療循環系統疾病。泊洛沙姆188(P188)(參見例如美國專利號5,696,298)可用於治療人類及動物之血液及其他生物流體中的病理性疏水相互作用。可商購之泊洛沙姆製劑含有高度非均質之分子群，其組成分子之大小及配置變化極大。可商購之泊洛沙姆中所存在之分子的多樣性使得難以預測生物活性且引起不合需要之生物活性。因此，需要替代性泊洛沙姆製劑。
本文提供替代性泊洛沙姆製劑以及其製備及使用方法。提供無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆，詳言之LCMF泊洛沙姆188。LCMF泊洛沙姆當投予受試者，諸如人類受試者時，不會在該受試者體內產生半衰期明顯長於主峰之材料，以使得在向受試者，諸如人類投予LCMF泊洛沙姆後，該共聚物之分佈中所有組分之循環半衰期比該共聚合物之分佈中主要成分之循環半衰期長不超過5.0倍。一般而言，所有組分在人體中之半衰期小於12小時。可商購且先前之泊洛沙姆製劑，諸如泊洛沙姆188具有較長循環材料(longer circulating material，LCM)，以致當投予人類時，其半衰期為該共聚物之分佈中主要成分之循環半衰期的超過5.0倍。亦提供製備該等LCMF泊洛沙姆及其他泊洛沙姆，包括移除低分子量雜質之方法。
在該等LCMF泊洛沙姆中有具有下式之LCMF泊洛沙姆聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物：HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH，其中：a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間或在60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓(Dalton，Da)與2,300道爾頓之間的整數；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量小於4,500Da之低分子量組分；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量大於13,000Da之高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07，諸如等於或小於1.06、1.05、1.04、1.03及1.02；及當投予受試者時，該共聚合物之分佈中所有組分之循環半衰期比該共聚合物之分佈中主要成分之循環半衰期長不超過5.0倍。該LCMF泊洛沙姆之 親水性高於此項技術中已知的含有較長循環材料(LCM)之泊洛沙姆188製劑(諸如美國專利號5,696,298中所描述之泊洛沙姆，及其可商購之製劑)之親水性。
提供一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188，其中：該泊洛沙姆188為具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH之聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量小於4,500道爾頓之低分子量組分；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量大於13,000道爾頓之高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07，諸如為1.06、1.05、1.04或1.03，或小於1.06、1.05、1.04或1.03；及在靜脈內投予人類受試者之後，不構成主峰之任何組分的循環血漿半衰期比該主峰之循環半衰期長不超過5.0倍。
本發明包括在靜脈內投予受試者之後，構成該共聚合物之聚合物分佈的所有組分在諸如人類受試者之受試者的血漿中之循環半衰期比該共聚合物之主要成分之循環半衰期長不超過5.0倍或4.0倍或3.0倍的具體實例。舉例而言，當投予人類受試者時，該共聚合物之分佈中的所有組分在受試者血漿中之循環半衰期比該共聚物之分佈中主要成分之循環半衰期長不超過4倍。本發明包括當投予人類受試者時，該共聚合物之分佈中之所有組分在該受試者之血漿中的半衰期不超過30小時、25小時、20小時、15小時、12小時、10小時、9小時、8小時或7小時，諸如為10小時或12 小時的具體實例。因此，該LCMF泊洛沙姆不包括LCM。
本文提供一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188，其中：該LCMF泊洛沙姆188為具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH之聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量小於4,500道爾頓之低分子量組分；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量大於13,000道爾頓之高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；及該LCMF共聚物之親水性高於含有該長循環材料(LCM)之純化之泊洛沙姆188的親水性，由此該共聚物之分佈中所有組分之循環半衰期比該共聚合物之分佈中主要成分之循環半衰期長不超過5.0倍。
提供一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188，其中：該LCMF泊洛沙姆188為具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH之聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量小於4,500道爾頓之低分子量組分；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量大於13,000道爾頓之高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；及如藉由逆相高效液相層析所評估，該LCMF之 平均滯留時間(tR)比含有LCM之純化之泊洛沙姆188短。在一些具體實例中，例如，RP-HPLC條件使得含LCM之泊洛沙姆188之平均tR為約9.9-10或為9.9-10；且該LCMF泊洛沙姆之平均tR為約8.7-8.8或為8.7-8.8。
提供一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188，其中：該LCMF泊洛沙姆188為具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH之聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量小於4,500道爾頓之低分子量組分；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量大於13,000道爾頓之高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；及如藉由RP-HPLC所評估，容量因數(k')小於在相同條件下含LCM之純化之泊洛沙姆188的k'。舉例而言，RP-HPLC條件使得該LCMF泊洛沙姆之平均k'為約3.2-3.3或為3.2-3.3，且該含LCM之泊洛沙姆188的平均k'為約3.6-3.7或為3.6-3.7。
在本文中之具體實例中，該LCMF泊洛沙姆可為疏水物具有約1,400道爾頓(Da)到2,000道爾頓或1,400Da到2,000Da(諸如1,750Da)之分子量且親水物部分佔該共聚物約70wt%到90wt%或70wt%到90wt%的泊洛沙姆。該LCMF泊洛沙姆之平均分子量可為7,680道爾頓到9,510道爾頓，諸如為8,400道爾頓至8,800道爾頓。
在一些具體實例中，該製劑中大於13,000道爾頓之高分子量組分的百分含量佔該泊洛沙姆製劑之總組分分佈的小於1%。在一些具體 實例中，在靜脈內投予人類受試者之後，該LCMF泊洛沙姆不會產生循環半衰期為主峰之循環血漿半衰期之超過四倍的組分。在一些具體實例中，該製劑中大於13,000道爾頓之高分子量組分的百分含量佔該泊洛沙姆製劑之總組分分佈小於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%或0.5%以下。
LCMF泊洛沙姆與含LCM之泊洛沙姆的不同之處在於，當投予受試者時，所有組分均在比含LCM之泊洛沙姆之組分短的時間內清除，如本文中之整個揭示內容所描述及顯示。當藉由RP-HPLC表徵時，本文提供之LCMF泊洛沙姆使得平均k'及平均tR小於相應含LCM之泊洛沙姆。LCMF泊洛沙姆之親水性高於相應含LCM之泊洛沙姆。
提供藉由超臨界流體萃取方法(包括本文所描述之該等方法)製造的LCMF泊洛沙姆。舉例而言，提供藉由以下方法製造之LCMF泊洛沙姆，該等方法包含：a)將泊洛沙姆溶液引入萃取容器中，其中該泊洛沙姆溶解於第一烷醇中，形成溶液；b)將該泊洛沙姆溶液與包含第二烷醇及超臨界二氧化碳之萃取溶劑在維持該超臨界二氧化碳之溫度及壓力下混合第一規定時間段，其中：該溫度高於二氧化碳之臨界溫度，但不超過40℃；該壓力為220巴至280巴；及該烷醇以佔該總萃取溶劑7wt%至8wt%之烷醇濃度提供；及c)使步驟b)中該萃取溶劑中第二烷醇之濃度在萃取方法之時間內分數梯度步驟增加複數倍；且在每一連續步驟中，該烷醇濃度相較於該第二烷醇之前一濃度增加1%-2%；及d)自該萃取容器移除萃取溶劑，由此自萃餘物泊洛沙姆製劑移除萃取之材料。
在用於製造LCMF泊洛沙姆之一些具體實例中，在a)中，泊洛沙姆與第一烷醇之比率以重量計為約2：1至3：1或為2：1至3：1，包括端 點在內；及/或在步驟c)中之複數倍分兩個、三個、四個或五個梯度步驟發生；及/或步驟c)可分兩個步驟進行，其包含i)將第二烷醇之濃度自約7%至8%增加到約8.2%至9.5%，歷時第二規定時間段；及ii)將第二烷醇之濃度自約8.2%至9.5%增加到約9.6%至11.5%，歷時第三規定時間段。在特定具體實例中，該LCMF泊洛沙姆係藉由一種方法製造，其中：在步驟b)中，該烷醇濃度為約7.4wt%或為7.4wt%；在步驟i)中，該烷醇濃度為約9.1wt%或為9.1wt%；及在步驟ii)中，該烷醇濃度為約10.7wt%或為10.7wt%。
第一規定時間段、第二規定時間段及第三規定時間段各自可進行2小時至12小時；該等規定時間段可相同或不同。舉例而言，第一規定時間段可進行2小時至6小時；第二規定時間段可進行2小時至6小時；且第三規定時間段可進行4小時至10小時。在用於製造LCMF泊洛沙姆之方法中，第一烷醇及第二烷醇各自獨立地選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合。舉例而言，第一烷醇及第二烷醇可相同或不同，諸如第一烷醇為甲醇且第二烷醇為甲醇或不同烷醇。移除萃取之材料之步驟d)可在整個步驟b)及步驟c)中發生。該方法可例如以分批方法或連續方法實施。
在本文中之具體實例中，由該方法製造之LCMF泊洛沙姆為LCMF泊洛沙姆188。亦提供用於製造LCMF泊洛沙姆，包括如上文及整個揭示內容中所描述之LCMF泊洛沙姆188的方法。
提供含有本文提供之LCMF泊洛沙姆之組成物。該等組成物可為在醫藥學上可接受之媒劑中調配之醫藥組成物。詳言之，提供含有或包含本文提供之LCMF泊洛沙姆之組成物及醫藥組成物。提供包含LCMF 泊洛沙姆188之組成物。提供一種包含無長循環(LCMF)泊洛沙姆188之組成物，其中：該組成物經調配用於靜脈內投予；且該組成物包含5gm-50gm LCMF泊洛沙姆。LCMF泊洛沙姆可為包括本文提供之任一種在內的任何LCMF泊洛沙姆。提供該等組成物之用途及治療適於投予該等泊洛沙姆之任何疾病或病症或病況的方法。例示性疾病及病況包括但不限於，心臟衰竭、中風及鐮狀細胞疾病，包括急性心肌梗塞、急性肢體缺血、休克、急性中風、缺血性中風、糖尿病性視網膜病變、神經退化性疾病、黃斑變性、糖尿病性視網膜病變及充血性心臟衰竭。LCMF泊洛沙姆組成物可以用於其他病症、病況、疾病及應用，包括但不限於，治療藉由膜重新密封及修復進行治療之病症；治療組織缺血及再灌注損傷；減少發炎性反應；降低血液黏度；促進血栓溶解；促進或維持止血；作為藥物、核酸或蛋泊質遞送之媒劑；作為使疏水性藥物之懸浮液穩定的乳化劑；清潔皮膚創傷；作為化妝品調配物中之界面活性劑；處理儲存損傷影響之血液或防止血液及血液製品之儲存損傷；控制個人護理產品及肥皂之黏度；作為輕瀉劑，及熟習此項技術者已知之其他應用。
該等含有LCMF泊洛沙姆之組成物可調配於血液、紅血球及/或血液製品(諸如包裝之紅血球)中或含有血液、紅血球及/或血液製品。此類組成物可以用於輸血。使用輸血治療之疾病包括但不限於，鐮狀細胞疾病、急性胸部症候群、外周動脈疾病、心臟衰竭、中風、周邊血管疾病、黃斑變性、急性呼吸窘迫症候群(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、多器官衰竭、局部缺血、出血性休克、敗血性休克、酸中毒、體溫過低、貧血性分解(anemic decomposition)、手術、外傷、急性失血及血液病症； 以及包含輸血之任何治療。因此，亦提供該等組成物用於輸血之用途，及藉由向患有其中治療包含輸血之疾病或病症之受試者投予組成物來進行治療的方法，該疾病或病症選自鐮狀細胞疾病、急性胸部症候群、外周動脈疾病、心臟衰竭、中風、周邊血管疾病、黃斑變性、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、多器官衰竭、局部缺血、出血性休克、敗血性休克、酸中毒、體溫過低、貧血性分解、手術、外傷、急性失血及血液病症。
該等LCMF泊洛沙姆可藉由移除LCM之任何方法製備。該等方法包括所描述之製備方法，包括但不限於，用於製備LCMF泊洛沙姆188或任何所選泊洛沙姆之方法，諸如以下描述，一種方法包括以下步驟：a)將泊洛沙姆188溶液引入萃取容器中，其中泊洛沙姆溶解於第一烷醇中，形成溶液；b)將泊洛沙姆溶液與包含第二烷醇及超臨界液體之萃取溶劑在維持該超臨界液體之溫度及壓力下混合，其中該萃取溶劑中第二烷醇之濃度在該萃取方法之時間內增加；及c)自該萃取容器移除萃取溶劑，由此自該泊洛沙姆製劑移除萃取之材料，從而製造出LCMF泊洛沙姆。
該等方法包括一種製備無長循環(LCMF)泊洛沙姆之方法，其包含：a)將泊洛沙姆188溶液引入萃取容器中，其中泊洛沙姆溶解於第一烷醇中，形成溶液；b)將該泊洛沙姆溶液與包含第二烷醇及超臨界二氧化碳之萃取溶劑在維持該超臨界二氧化碳之溫度及壓力下混合第一規定時間段，其中：該溫度高於二氧化碳之臨界溫度，但不超過40℃；該壓力為220巴至280巴；及該烷醇以佔總萃取溶劑7wt%至8wt%之烷醇濃度提供；c)使步驟b)中該萃取溶劑中之第二烷醇的濃度在該萃取方法之時間內分數個梯度步驟增加複數倍；每一複數倍在另一規定時間段內發生； 及在每一連續步驟中，該烷醇濃度相較於第二烷醇之前一濃度增加1%-2%；及自該萃取容器移除萃取溶劑，由此自該萃餘物泊洛沙姆製劑移除萃取之材料，從而製造出LCMF泊洛沙姆。
在一些具體實例中，移除萃取之材料的步驟d)可在整個步驟b)及步驟c)中進行。如上文所描述，在步驟a)中，泊洛沙姆與第一烷醇之比率以重量計可為約2：1至3：1或為2：1至3：1，包括端點在內；及/或步驟c)中之複數倍分兩個、三個、四個或五個梯度步驟發生。步驟c)可分兩個步驟進行，其包含：i)將第二烷醇之濃度自約7%至8%增加到約8.1%至9.5%，歷時第二規定時間段；及ii)將第二烷醇之濃度自約8.2%至9.5%增加到約9.6%至11.5%，歷時第三規定時間段。在一特定具體實例中，在步驟b)中，該烷醇濃度為約7.4wt%或為7.4wt%；在步驟i)中，該烷醇濃度為約9.1wt%或為9.1wt%；及/或在步驟ii)中，該烷醇濃度為約10.7wt%或為10.7wt%。第一規定時間段、第二規定時間段及第三規定時間段各自可進行2小時至12小時；且該等規定時間段可相同或不同。舉例而言，第一規定時間段可進行2小時至6小時；第二規定時間段可進行2小時6小時；且第三規定時間段可進行4小時至10小時。第一烷醇及第二烷醇各自可獨立地選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合。其各自可相同或不同，例如第一烷醇可為甲醇及/或第二烷醇可為甲醇。
提供用於製備LCMF泊洛沙姆之萃取方法，其包括以下步驟：a)將泊洛沙姆裝入萃取容器中且將該泊洛沙姆溶解於第一烷醇中，形成溶液；b)將包含第二烷醇及超臨界液體之萃取溶劑在一定壓力下與該溶液混合，形成萃取混合物，其中該萃取溶劑中第二烷醇之濃度在該萃取方 法之時間內增加；及c)自該萃取容器移除萃取溶劑，由此自該泊洛沙姆移除低分子量物質。在一些具體實例中，該方法包含a)將泊洛沙姆裝入萃取容器中且將該泊洛沙姆溶解於第一溶劑中，形成溶液，其中第一溶劑選自由以下組成之群：醇、脂族酮、芳族酮、胺及其混合物；b)將萃取溶劑與該溶液混合，形成萃取混合物，其中該萃取溶劑包含高壓二氧化碳及該第一溶劑，其中該萃取溶劑中該溶劑之濃度在萃取方法之時間內增加；及c)自該萃取容器移除萃取溶劑，由此自該泊洛沙姆移除低分子量雜質。在該等方法之具體實例中，在步驟c之後，該方法另外可以包括重複步驟b及步驟c。
用於本文所描述之方法中的泊洛沙姆可為任何泊洛沙姆，包括但不限於，泊洛沙姆188、泊洛沙姆331及泊洛沙姆407。如上文所描述，對於所有該等方法，第一烷醇及第二烷醇各自獨立地選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合。舉例而言，一種或兩種烷醇可為甲醇。在本文提供之所有方法中，處於壓力下之超臨界液體可為任何適合之超臨界液體，諸如但不限於，二氧化碳、甲烷、乙烷、丙烷、氨及氟氯烷(freon)。在特定具體實例中，處於壓力下之超臨界液體為二氧化碳。在用於製備LCMF泊洛沙姆(諸如LCMF泊洛沙姆188)之方法的具體實例中，萃取溶劑包含甲醇及二氧化碳。甲醇與二氧化碳之例示性比率為1：100至約15：100或15：100，諸如為2：100至約10：100或10：100。甲醇與二氧化碳之比率可在進行該方法之過程中增加。本文中之方法包括分批方法及連續方法。在實施該等方法之例示性具體實例中，萃取容器可在125巴至500巴範圍內，諸如在25巴至100巴，或200巴至400巴，或280巴至340巴範圍內加壓。 萃取容器之溫度可為10℃至80℃。在該等方法之具體實例中，提供的第二烷醇佔總萃取溶劑之百分含量(w/w)可為3%至20%或3%至15%。
在上述方法之步驟b)中，步驟b)中萃取溶劑中第二烷醇之濃度可在該萃取方法之時間內分數個梯度步驟增加複數倍，其中：每一複數倍在另一規定時間段內發生；及在每一連續步驟中，烷醇濃度相較於第二烷醇之前一濃度增加例如1%-2%；及自萃取容器移除萃取溶劑，由此自萃餘物泊洛沙姆製劑移除萃取之材料。
在其他具體實例中，用於純化LCMF泊洛沙姆之方法可包括以下步驟：a)將泊洛沙姆溶液引入萃取容器中，其中泊洛沙姆溶解於溶劑中，形成溶液，其中該溶劑選自醇、脂族酮、芳族酮、胺及其混合物；b)將該泊洛沙姆溶液與包含溶劑及高壓二氧化碳之萃取溶劑混合，其中該萃取溶劑中該溶劑之濃度在萃取方法之時間內增加；及c)自萃取容器移除萃取溶劑，由此自該泊洛沙姆移除萃取之材料，從而製造出LCMF泊洛沙姆。步驟a)中之溶劑可為甲醇。萃取溶劑可包含甲醇及二氧化碳。萃取之材料包括小於4,500道爾頓之低分子量雜質。該等方法，包括上文所描述及本文中之例示之該等方法，可製造LCMF泊洛沙姆，特別是具有如本文中之揭示內容通篇所描述之特性的LCMF泊洛沙姆，包括作為具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3 CH2O]b-(CH2CH2O)aH之聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物的泊洛沙姆，其中：a或a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量佔該共聚物之總分子量在約60wt%與90wt%之間的整數；a與a'相同或不同；及b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數。所得泊洛沙姆為不具有如本文中所描述之LCM材料的LCMF泊洛沙 姆，諸如LCMF泊洛沙姆188，其中：該LCMF泊洛沙姆188為具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH之聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量小於4,500道爾頓之低分子量組分；該共聚合物之分佈中總組分之不超過1.5%為平均分子量大於13,000道爾頓之高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；及該泊洛沙姆不包括LCM材料，以使得當投予受試者，諸如人類時，該共聚物之分佈中所有組分之循環半衰期比該共聚合物之分佈中主要成分之循環半衰期長不超過5.0倍。所得LCMF泊洛沙姆(諸如LCMF泊洛沙姆188)之親水性高於相應含LCM之泊洛沙姆(諸如含LCM之純化之泊洛沙姆188)。當在RP-HPLC上以相同適當條件(諸如本文例示及描述之該等條件)評估時，相較於相應含LCM之泊洛沙姆，所得LCMF泊洛沙姆具有較低的平均tR及較低的k'。
亦提供確定或鑑別所得泊洛沙姆為LCMF泊洛沙姆之方法。該等方法包括例如在RP-HPLC上測試該LCMF泊洛沙姆及將該材料與起始物質及/或與已知含有LCM之標準品相比較，或評估該泊洛沙姆之親水性及將其與起始物質及/或與已知含有LCM材料之標準品相比較。
100:製程
105:步驟
110:步驟
115:步驟
120:步驟
125:步驟
130:步驟
135:步驟
140:步驟
145:步驟
150:步驟
160:步驟
165:步驟
170:步驟
175:步驟
180:步驟
100':製程
105':步驟
110':步驟
115':步驟
120':步驟
125':步驟
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135':步驟
140':步驟
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150':步驟
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100":製程
105":步驟
110":步驟
115":步驟
120":步驟
125":步驟
130":步驟
135":步驟
140":步驟
145":步驟
150":步驟
160":步驟
165":步驟
200:系統
201:聚合物饋料槽
203:預冷卻器
205:閥
207:聚合物饋料泵
208:泵
209:泵
210:熱交換器
211:PGSS槽
212:止回閥
215:萃取器
225:收集器
227:減壓容器
231:旋風分離器
232:冷凝器
242:接收器
243:閥
250:外部二氧化碳供應器
本文中所描述之附圖僅出於說明選定具體實例而非所有可能實施方案之目的，且並不意欲限制本發明之範疇。
圖1為用於超臨界流體萃取(SFE)泊洛沙姆之通用製程100。
圖2為使用本文所描述之方法製備泊洛沙姆，諸如泊洛沙姆188之具體例示性製程100'。
圖3為使用本文所描述之方法製備泊洛沙姆，諸如泊洛沙姆188之具體例示性製程100"。
圖4顯示可用於本文所提供之方法中的萃取設備。
圖5顯示在溶劑分配床中具有不同大小之不鏽鋼球體之截面的一個具體實例。
圖6A-6B顯示可商購之泊洛沙姆188(A圖)與根據本文提供之具體實例純化之材料(B圖)中低分子量物質含量的凝膠滲透層析法(gel permeation chromatography，GPC)比較。
圖7A-7B顯示放大的HPLC-GPC層析圖，描繪了血漿中各組分之分子量分佈隨時間之變化。
圖8A-8B顯示在48小時連續IV輸注純化之泊洛沙姆188期間及之後健康人體內泊洛沙姆188(A圖)及高分子量組分(B圖)之個別血漿濃度，如Grindel等人(2002)(Biopharmaceutics & Disposition,23：87-103)中所描述。
圖9顯示逆相高效液相層析(Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography，RP-HPLC)之層析圖，其將含15%LCMF 188之組成物及含15%P188(可以商標Flocor®購得)之組成物的特徵與其他泊洛沙姆及聚合物(具有不同疏水性/親水性)相比較，顯示LCMF188之親水性比P188強。
圖10顯示RP-HPLC層析圖，其將不同批次之LCMF泊洛沙姆188與純 化之泊洛沙姆188相比較，確定了親水性之差異。
概述
A.定義
B.泊洛沙姆、泊洛沙姆188、含LCM之泊洛沙姆188及LCMF泊洛沙姆之分子多樣性
1.泊洛沙姆
2.泊洛沙姆188
3.泊洛沙姆188之分子多樣性
a.低分子量組分
b.引起長循環半衰期之組分
C.無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆
D.用於純化泊洛沙姆之萃取方法
1.萃取製程
a.超臨界方法
b.高壓法
2.萃取容器及系統
3.萃取及萃取劑之移除
4.用於製備純化之泊洛沙姆的例示性方法
a.低分子量(LMW)組分之移除
b.無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆的製備
5.用於確定LCMF泊洛沙姆之身分的方法
E.醫藥組成物及調配物
1.調配物
2.劑量
3.劑量及投藥
F.泊洛沙姆188及LCMF P188之方法及治療用途
G.實施例
A.定義
除非另外定義，否則本文所用之所有科技術語具有與熟習本發明所屬領域者通常所瞭解相同之含義。除非另外說明，否則本文中整個揭示內容中所提及之所有專利、專利申請案、公開之申請案及出版物、Genbank序列、資料庫、網站及其他公開之材料均以全文引用之方式併入。在本文中之術語存在複數個定義之情況下，以此章節中之定義為準。在提及URL或其他此類標識符或位址時，應瞭解，此類標識符可變化且網際網路上之特定資訊可變來變去，但可藉由搜索網際網路尋找同等資訊。提及此證實此等資訊之可獲得性及公眾傳播。
如本文所使用，泊洛沙姆為環氧乙烷及環氧丙烷之合成嵌段共聚物。「聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物」、「PPC」或「泊洛沙姆」係指含有在兩側上側接聚氧乙烯(polyoxyethylene，POE)嵌段之聚氧丙烯(polyoxypropylene，POP)中央嵌段的嵌段共聚物，其具有以下化學式：HO(C2H4O)a'-[C3H6O]b-(C2H4O)aH
其中：a'與a可相同或不同且各自為使得由(C2H4O)表示之親水物部分(亦即，該共聚物之聚氧乙烯部分)佔該共聚物約60wt%至90wt%，諸如佔該 共聚物70wt%至90wt%的整數；及b為使得由(C3H6O)b表示之疏水物(亦即，該共聚物之聚氧丙烯部分)之分子量為約950道爾頓至4,000道爾頓(Da)，諸如為約1,200Da至3,500Da，例如為1,200Da至2,300Da、1,500Da至2,100Da、1,400Da至2,000Da或1,700Da至1,900Da的整數。舉例而言，親水物部分之分子量可在5,000Da與15,000Da之間。具有上文所描述之通式的例示性泊洛沙姆包括a或a'為整數5-150且b為整數15-75之泊洛沙姆，諸如a為整數70-105且b為整數15-75之泊洛沙姆。泊洛沙姆包括泊洛沙姆188(例如，以商標Pluronic® F-68、Flocor、Kolliphor及Lutrol®出售之該等泊洛沙姆)。
聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物之命名涉及其單體組成。泊洛沙姆編號之前兩位數字乘以100得到疏水性聚氧丙烯嵌段之近似分子量。最後一位數字乘以10得到親水性聚氧乙烯含量之近似重量百分比。舉例而言，泊洛沙姆188描述含有約1,800Da之聚氧丙烯疏水物且親水性聚氧乙烯嵌段含量為總分子量之約80%的聚合物。
泊洛沙姆可分兩個步驟合成，首先構建聚氧丙烯核心，且接著將聚氧乙烯添加至聚氧丙烯核心之末端。由於在兩個步驟期間聚合反應之速率不同，故泊洛沙姆可含有分子量不同之非均質聚合物物質。聚合物物質之分佈可使用標準技術，包括但不限於凝膠滲透層析法(GPC)進行表徵。
如本文所使用，泊洛沙姆188(亦稱為P-188或P188)係指具有以下化學式之聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物：HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH，其中： a'及a可相同或不同且各自為使得由(C2H4O)表示之親水物部分(亦即，該共聚物之聚氧乙烯部分)佔約60%至90%，諸如佔約80%或81%的整數；及b為使得由(C3H6O)表示之疏水物之分子量為約1,300Da至2,300Da，諸如為1400Da至2,000Da，例如為約1,750Da的整數。舉例而言，a為約79且b為約28或為28。化合物之平均總分子量為約7,680Da至9,510Da，諸如一般為8,400Da-8,800Da，例如為約8,400Da或為8,400Da。泊洛沙姆188為可含有聚合物物質之非均質分佈的一種製劑，其主要在該聚合物之總體鏈長方面有所變化，而且亦包括具有不飽和度及某些低分子量二醇之截短之聚合物鏈。泊洛沙姆188分子中包括展現在兩側上含有表示低分子量(LMW)聚合物物質及高分子量(HMW)聚合物物質之主峰及「肩」峰之物質特徵(例如，藉由GPC確定)的該等分子。泊洛沙姆188亦指經純化以移除或減少除主要成分外之物質的材料。
如本文所使用，關於泊洛沙姆188製劑之「主要成分」或「主峰」係指共聚物分子中分子量小於約13,000Da且大於約4,500Da，並且平均分子量在約7,680Da至9,510Da之間，諸如一般為8,400Da至8,800Da，例如為約8,400Da或為8,400Da的物質。主峰物質包括利用凝膠滲透層析法(GPC)，取決於層析條件而在14分鐘與15分鐘之間洗提的該等物質(參見美國專利號5,696,298)。
如本文所使用，關於泊洛沙姆188製劑之物質或組分的「低分子量」或「LMW」係指分子量一般小於4,500Da之組分。LMW物質包括利用凝膠滲透層析法(GPC)，取決於層析條件而在15分鐘之後洗提的該等物質(參見美國專利號5,696,298)。此類雜質可包括低分子量泊洛沙姆、泊 洛沙姆降解產物(包括醇、醛、酮及氫過氧化物)、二嵌段共聚物、不飽和聚合物及包括寡聚(乙二醇)及寡聚(丙二醇)之寡聚二醇。
如本文所使用，關於泊洛沙姆188製劑之物質或組分的「高分子量」或「HMW」係指分子量一般大於13,000Da，諸如大於14,000Da、大於15,000Da、大於16,000Da或更高的組分。HMW物質包括利用凝膠滲透層析法(GPC)，取決於層析條件而在13分鐘與14分鐘之間洗提的該等物質(參見美國專利號5,696,298)。
如本文所使用，「多分散性」或「D」係指聚合物組成物之分子量分佈之寬度。單分散樣品定義為所有分子均相同之樣品。在此情況下，多分散性(Mw/Mn)為1。窄分子量標準品具有接近1之D值且典型聚合物具有2至5之範圍。一些聚合物具有超過20之多分散性。因此，高多分散性值指示給定製劑中分子群之大小變化極大，而較低多分散性值指示較小變化。用於評估多分散性之方法為此項技術中已知的且包括如美國專利號5,696,298中所描述之方法。舉例而言，多分散性可由層析圖確定。應瞭解，多分散性值可取決於特定層析圖狀況、分子量標準及所採用之凝膠滲透層析管柱之尺寸排阻特徵而變化。出於本文之目的，提及之多分散性係如美國專利號5,696,298中所用，如由使用配備有柱狀加熱器模組、410型折射率偵測器、Maxima 820套裝軟體(皆來自Millipore之Waters分公司，Milford,Mass.)、串聯的兩個LiChrogel PS-40管柱及LiChrogel PS-20管柱(EM Science,Gibbstown,N.J.)及聚乙二醇分子量標準品(Polymer Laboratories公司，Amherst,Mass.)之600E型Powerline層析系統獲得的層析圖測定。簡單地藉由在兩種系統上執行單一樣品且接著比較來自每一層析圖之多分散性 值，將使用不同分離方法獲得的任何多分散性值轉換成本文所描述之值係在熟練技術人員之技能範圍內。
如本文所使用，「純化之泊洛沙姆188」或「P188-P」或「純化的含較長循環材料(LCM)之泊洛沙姆188」係指泊洛沙姆之多分散性值小於1.07或為約1.07，諸如小於1.05或為1.05，或小於1.03或為1.03的泊洛沙姆188，且其為具有減少之低分子量組分量，但含有較長循環材料之純化的泊洛沙姆188。「已移除低分子量材料」或「已減少低分子量材料」或其類似變化形式之泊洛沙姆188係指低分子量組分之分佈不超過或小於總組分分佈之3.0%，且一般不超過或小於總組分分佈之2.0%，或不超過或小於總組分分佈之1.5%的純化之泊洛沙姆188。典型地，此類泊洛沙姆188展現比含有較高或較大低分子量組分百分含量之泊洛沙姆188形式低的毒性。該泊洛沙姆188經純化以移除或減少低分子量組分。可商購且先前之泊洛沙姆製劑，諸如泊洛沙姆188，具有較長循環材料(LCM)，以致當投予人類時，其半衰期為該共聚物之分佈中主要成分之循環半衰期的超過5.0倍。
例示性純化的含LCM之泊洛沙姆188為可以商標FLOCOR®購得的泊洛沙姆188(亦參見美國專利號5,696 298，其描述了含LCM之泊洛沙姆188)。當將純化的含LCM之泊洛沙姆188以靜脈內注射投予哺乳動物，詳言之人類時，自經治療受試者獲得的血液之GPC分析展現兩個循環峰：一個稱為主峰之峰，其包含該聚合物分佈之主要成分；及一個較高分子量之峰，相較於該主峰，其展現實質上更慢的自循環之清除速率(比該主峰慢超過5倍，典型地超過30小時且長達70小時，如本文所示)，亦即， 較長循環材料(LCM)。
如本文所使用，長循環材料(LCM)係指先前之泊洛沙姆製劑中在投予受試者時，在受試者(諸如人類)體內之半衰期實質上長於該泊洛沙姆製劑之主要成分之半衰期的材料。當投予人類受試者時，泊洛沙姆製劑中之LCM材料之半衰期為該泊洛沙姆製劑之主要成分之半衰期的超過約5倍或超過5倍。本文提供之LCMF泊洛沙姆不會產生此類較長循環材料。不存在半衰期比該主要成分長5倍的組分。為比較泊洛沙姆，對相應泊洛沙姆之組分進行比較，其中相應泊洛沙姆具有相同化學式。舉例而言，將LCMF泊洛沙姆188與泊洛沙姆188相比較。
如本文所使用，關於泊洛沙姆188之「無長循環材料」或「LCMF」係指如上文關於純化之泊洛沙姆188所描述，具有減少之低分子量組分量，且在靜脈內投予受試者之後，該聚合物分佈之組分以一種更均勻之方式自循環清除，使得任何較長循環材料展現之半衰期(在人類受試者中)比該主峰之循環半衰期(t1/2)長不超過5倍的純化之泊洛沙姆188製劑。因此，LCMF為這樣一種泊洛沙姆188，其不含作為或產生在投予人類受試者時t1/2比主要成分之t1/2高超過5.0倍且一般比該共聚物之分佈中主要成分之半衰期高不超過4.0倍、3.0倍、2.0倍或1.5倍之循環材料的組分，諸如本文中所描述之高分子量組分或低分子量組分。典型地，LCMF泊洛沙姆為該聚合物分佈之所有組分均以較均勻之速率自循環清除的泊洛沙姆。
如本文所使用，「共聚物之分佈」係指泊洛沙姆製劑中聚合物分子之分子量分佈。分子質量之分佈可藉由熟練技術人員已知之各種技術，包括但不限於，依數性量測(colligative property measurement)、光散射 技術、黏度測定法及尺寸排阻層析法測定。詳言之，可採用凝膠滲透層析法(GPC)，基於聚合物之流體動力體積來測定分子量分佈。聚合物之分子量或分子質量之分佈可藉由多分散性概括。舉例而言，泊洛沙姆中分子量分佈之不等性越大，則多分散性越高。
如本文所使用，半衰期、生物半衰期、血漿半衰期、終末半衰期、消除半衰期或t1/2係指活體經由其正常消除通道消除半數量所投予之物質所需的時間。正常消除通道一般包括身體經由腎臟及肝之功能清潔，以及自身體消除某一物質之排泄功能。半衰期可描述為將某一物質之血漿濃度變為其穩定狀態水準之一半所花費之時間，亦即，血漿半衰期。半衰期可藉由給予單次劑量之藥物(通常經靜脈內給予)，且接著以規律時間間隔量測血漿中藥物之濃度來測定。藥物之濃度將在血漿中達到峰值且隨著藥物分解及自血液清除而下降。
如本文所使用，「Cmax」係指在投予之後，藥物之峰值或最大血漿濃度。
如本文所使用，「在穩定狀態下藥物之濃度」或「Css」係指藥物消除速率與藥物投予速率相同時之藥物濃度。其一般在以相同時間間隔給予無限數量之相同劑量中的最後一劑之後實現。達到穩定狀態濃度需要之時間取決於藥物之半衰期。半衰期越短，達到穩定狀態越快。典型地，積聚至最終穩定狀態濃度之超過90%花費3-5個半衰期。
如本文所使用，「雜質」係指泊洛沙姆製劑中不合需要之組分。典型地，雜質包括小於4,500道爾頓之LMW組分及大於13,000道爾頓之高分子量組分。
如本文所使用，關於製劑中泊洛沙姆組分之「移除或減少」係指使泊洛沙姆製劑中該組分之重量百分比相對於該組分之初始百分比降低。一般而言，若泊洛沙姆組分佔總組分分佈之重量百分比降低至少1%且典型地至少2%、3%、4%、5%或超過5%，則該組分經移除或減少。舉例而言，大部分市售泊洛沙姆188製劑含有佔該分佈中總組分約4wt%之LMW組分(小於4,500道爾頓)。若存在小於3wt%，諸如小於2%或1%之LMW組分，則純化產物中該組分減少。
如本文所使用，「溶劑」係指溶解溶質形成溶液之任何液體。
如本文所使用，「極性溶劑」係指分子中存在正電荷與負電荷之持久分離，或正電荷與負電荷之中心不一致的溶劑。該等溶劑具有高介電常數，具有化學活性且形成配位共價鍵。極性溶劑之實例為醇及酮。
如本文所使用，「饋料」係指溶解於溶劑中之溶質。
如本文所使用，「萃取溶劑」係指可用於溶解泊洛沙姆製劑中所含的不合需要之材料的任何液體或超臨界流體。其為可實現溶劑萃取以基於溶解度之變化而分離一種物質與一種或多種其他物質的溶劑。一般而言，萃取溶劑與溶解所關注物質之溶劑不可混溶或可部分混溶。舉例而言，萃取溶劑為不與溶解所關注物質之第一溶劑混合或僅部分混合，以致當不受干擾時形成兩個獨立層的溶劑。例示性萃取溶劑為超臨界液體或高壓液體。
如本文所使用，術語「超臨界液體」及「超臨界流體」包括處於高於其臨界溫度(Tc；亦即，化合物之特徵溫度，高於該溫度，不可能使該化合物液化)及臨界壓力(pc；亦即，足以使化合物在其臨界溫度下液 化之最小壓力)之狀態的任何化合物，諸如氣體。在此狀態下，明顯的液相與氣相典型地不存在。超臨界液體典型地隨壓力、溫度之較小變化或共改質劑溶劑之存在而展現溶劑密度之變化。
如本文所使用，「超臨界二氧化碳」係指保持在臨界溫度(約31℃)及臨界壓力(約74巴)或處於高於臨界溫度及臨界壓力的流體狀態之二氧化碳。低於臨界溫度及臨界壓力，二氧化碳通常表現為空氣中之氣體形式，或當冷凍時表現為固體形式，即乾冰。在高於31℃之溫度及高於74巴之壓力下，二氧化碳呈現介於氣體與液體中間之特性，使得其如同氣體一般膨脹成填滿其容器，但密度類似於液體密度。
如本文所使用，「臨界溫度」或「臨界點」係指表示蒸氣-液體臨界點之溫度，高於該溫度，不存在明顯的液相與氣相。因此，無論施加多少壓力，在該溫度下及高於該溫度均無法使物質之蒸氣液化。舉例而言，二氧化碳之臨界溫度為約31℃。
如本文所使用，「臨界壓力」係指在臨界溫度下使氣體液化所需之壓力。舉例而言，二氧化碳之臨界壓力為約74巴。
如本文所使用，術語「高壓液體」包括藉由在室溫或更高溫度下將可壓縮氣體加壓成液體所形成的液體。
如本文所使用，「共改質劑溶劑(co-modifier solvent)」係指增加萃取溶劑之溶劑強度的極性有機溶劑(例如，超臨界流體二氧化碳)。其可與溶質發生強相互作用且由此實質上增加萃取溶劑中溶質之溶解度。共改質劑溶劑之實例包括烷醇。典型地，可使用在5wt%與15wt%之間的共改質溶劑。
如本文所使用，術語「烷醇」包括簡單的脂族有機醇。一般而言，意欲用於本文提供之方法中的醇包括六個或少於六個碳原子(亦即，C1-C6烷醇)。烷醇之烷烴部分可為分支或未分支的。烷醇之實例包括但不限於，甲醇、乙醇、異丙醇(2-丙醇)及第三丁醇。
如本文所使用，「亞臨界萃取(subcritical extraction)」係指使用在標準溫度及壓力下通常為氣態且在較高壓力及較低溫度下轉變成液體之流體物質的製程。接著對壓力或溫度進行標準化且使萃取材料汽化，留下萃取物。萃取劑可再循環。
如本文所使用，「萃取容器」或「萃取器」係指能夠承受高達10,000psig壓力及高達200℃溫度的高壓容器。容器之體積可在2mL至200L範圍內，且一般為1L至200L，諸如為5L至150L。萃取容器一般由不鏽鋼製造。此類裝置係熟練技術人員熟知的且為可商購的。
如本文所使用，「等度」係指所用溶劑為恆定或接近恆定之濃度的系統。
如本文所使用，「梯度」或「梯度步驟」係指使用的兩種或超過兩種萃取溶劑典型地因一種或多種組分濃度之變化而使得其組分組成不同的系統。舉例而言，烷醇溶劑(例如，甲醇)之濃度在萃取過程期間連續增加。因此，萃取溶劑不保持恆定。
如本文所使用，「複數個」係指製程或步驟之多次迭代。重複次數可為2、3、4、5、6或超過6次。
如本文所使用，「萃取之材料」係指含有經移除之材料的產物。
如本文所使用，「萃餘物」係指已移除一種或多種組分之產物。舉例而言，已移除萃取之材料的純化之泊洛沙姆。
如本文所使用，「分批方法」或「分批萃取」係指藉由振盪溶質層與一個不可混溶層直至達到平衡，隨後在取樣之前使該等層沈降，由此自該不可混溶層中萃取出溶質的製程。舉例而言，分批萃取可藉由將溶質與一批萃取溶劑混合來進行。溶質在兩相之間分配。一旦達到平衡，即停止混合且使萃取物相與萃餘物相分開。在此方法中，用過的溶劑可藉由蒸餾汽提及再循環，或可自儲槽連續地添加新鮮溶劑。
如本文所使用，「連續方法」或「連續萃取」係指有不可混溶之溶劑連續流動穿過溶液或存在兩相之連續逆流流動的製程。舉例而言，將連續萃取溶劑與溶質混合。將混合器中產生之乳液饋送至沈降器單元中，在其中發生相分離且獲得連續萃餘物及萃取物流。
如本文所使用，「醫藥組成物」包括用一種或多種醫藥學上可接受之賦形劑調配的包含本文所描述之聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物(諸如LCMF泊洛沙姆)之組成物。在某些情況下，醫藥組成物包含用適合緩衝液緩衝達到所需pH值(諸如6-7或6或約6)的泊洛沙姆之可注射水溶液。緩衝液之實例為熟習此項技術者已知的具有生物相容性之任何緩衝液，諸如檸檬酸鹽，包括例如檸檬酸鈉/檸檬酸。適合濃度可憑經驗確定，但典型地在諸如生理食鹽水之等滲溶液中在0.005M至0.05M範圍內，詳言之為約0.01M。在某些情況下，可用於本文中之方法中的醫藥組成物為熟習有關調配泊洛沙姆技術者已知的(參見例如，公開之國際PCT申請案號WO 94/008596，及本文所描述之其他此類參考文獻及出版物)。
如本文所使用，「治療」係指改善或減輕疾病或病況相關之症狀。治療意思指改善或以其他方式有利地改變病況、病症或疾病之症狀的任何方式。因此，治療涵蓋預防、療法及/或治癒。治療亦涵蓋本文中之組成物的任何醫藥應用。
如本文所使用，「治療」患有疾病或病狀之受試者意思指，向受試者投予本文所提供或描述之組成物或其他產品，由此實現其治療。
如本文所使用，藉由治療，諸如藉由投予醫藥組成物或其他治療劑改善特定疾病或病症之症狀係指可歸因於組成物或治療劑之投予或與其相關的任何症狀減輕，不論是持久性還是暫時性的，持續還是短暫的。
如本文所使用，「預防」或「防治」係指使疾病或病況發生之風險降低之方法。防治包括降低疾病或病況發生之風險，及/或預防症狀之惡化或疾病之發展，或降低症狀惡化或疾病發展之風險。
如本文所使用，用於治療特定疾病之化合物或組成物的「有效量」為足以改善，或以某種方式減輕症狀以實現所需生理作用的量。此類量可以單次劑量投予或可根據一定方案投予，由此其為有效的。有效量易於由熟習此項技術者遵循常規程序測定，且取決於投予組成物之特定適應症。
如本文所使用，「治療有效量」或「治療有效之劑量」係指藥劑、化合物、材料或含有化合物之組成物至少足以產生治療作用。有效量為足以治療，諸如預防、治癒、改善、停滯或以其他方式治療特定疾病或病症的治療劑之量。
如本文所使用，「疾病」或「病症」係指生物體中由包括但 不限於感染、獲得性病況及遺傳病況之病因或情況引起且以可鑑別之症狀為特徵的病理病況。本文中所關注之疾病及病症包括但不限於，需要膜重新密封及修復之任何疾病及病症、組織缺血及再灌注損傷，減輕發炎性病症，血栓溶解相關性病症及與止血有關之病症。舉例而言，疾病及病症包括急性心肌梗塞、急性肢體缺血、休克、急性中風、心臟衰竭、鐮狀細胞疾病、神經退化性疾病、黃斑變性、糖尿病性視網膜病變及充血性心臟衰竭。
如本文所使用，「受試者」係指動物，詳言之人類或獸醫學動物，包括狗、貓、豬、牛、馬及其他農畜、動物園動物及寵物。因此，欲治療之「患者」或「受試者」包括人類及或非人類動物，包括哺乳動物。哺乳動物包括靈長類動物，諸如人類、黑猩猩、大猩猩及猴；家養動物，諸如狗、馬、貓、豬、山羊、牛；及嚙齒動物，諸如小鼠、大鼠、倉鼠及沙鼠。
如本文所使用，「組合」係指兩個或超過兩個項目之間之任何結合。該結合可為空間上的，諸如在套組中，或指使用兩個或超過兩個項目用於共同目的。
如本文所使用，「組成物」係指兩種或超過兩種產品或化合物(例如，藥劑、調節劑、調控劑等)的任何混合物。其可為溶液、懸浮液、液體、粉末、糊劑、水性或非水性調配物，或其任何組合。
如本文所使用，「製品」為製備且出售之產品。該術語意圖涵蓋包裝之物品中所包含的純化之泊洛沙姆。
如本文所使用，流體係指可流動之任何組成物。因此，流體 涵蓋呈半固體、糊狀物、溶液、水性混合物、凝膠、洗劑、乳膏形式的組成物及其他此類組成物。
如本文所使用，「套組」係指包裝之組合，視情況包括使用該組合之成分實施方法的試劑及其他產品及/或組分。舉例而言，提供的套組含有本文提供之純化之泊洛沙姆及用於包括但不限於投予、診斷及評估生物活性或特性之目的的另一項目。套組視情況包括使用說明書。
如本文所使用，動物包括任何動物，諸如但不限於，靈長類動物，包括人類、大猩猩及猴；嚙齒動物，諸如小鼠及大鼠；家禽，諸如雞；反芻動物，諸如山羊、牛、鹿、綿羊；綿羊科動物，諸如豬及其他動物。非人類動物不包括人類作為所涵蓋之動物。
除非上下文另外明確規定，否則如本文所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參照物。
如本文所使用，範圍及量可表示為「約」或「近似地」特定值或範圍。約亦包括準確量。因此，「約0.05mg/mL」意思指「約0.05mg/mL」以及「0.05mg/mL」。
如本文所使用，「視情況的(optional)」或「視情況(optionally)」意謂隨後描述之事件或情形可能發生或不發生，且該描述包括該事件或情形發生之情況及該事件或情形不發生之情況。舉例而言，視情況經取代之基團意謂該基團未經取代或經取代。
如本文所使用，「滯留時間」或「tR」意思指在將樣品(諸如LCMF泊洛沙姆188樣品)注射至逆相管柱上進行逆相高效液相層析與蒸發光散射偵測器偵測到峰反應之間經過的時間。疏水性較強之樣品的滯 留時間比疏水性較弱之樣品的滯留時間長。
如本文所使用，「容量因數」或k'係藉由以下等式確定，其中t0等於死時間或無保持之物質穿過逆相HPLC管柱之時間(參見以下實施例7)：
Figure 104122001-A0202-12-0031-1
含LCM之純化之泊洛沙姆188，諸如以商標FLOCOR®出售之泊洛沙姆具有9.883之平均滯留時間(tR)及3.697之k'；而LCMF泊洛沙姆188具有8.897之平均滯留時間(tR)及3.202之平均k'(參見實施例7)。
除非另外指明，否則如本文所使用，關於任何保護基、胺基酸及其他化合物之縮寫均與其常見用法、公認之縮寫或IUPAC-IUB生物化學命名委員會一致(參見(1972)Biochem.11：1726)。
B.泊洛沙姆、泊洛沙姆188、含LCM之泊洛沙姆188及LCMF泊洛沙姆之分子多樣性
1.泊洛沙姆
泊洛沙姆係一系列由聚氧丙烯(PO或POP)重複單元核心側接聚氧乙烯(EO或POE)重複單元鏈構成的合成、線性三嵌段共聚物。所有泊洛沙姆均由此EO-PO-EO結構基元定義。特定泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)係藉由重複EO及PO單元之數量進一步定義，其提供具有不同化學特徵及物理特徵，以及獨特藥效學特性之特定泊洛沙姆。
某些聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，包括泊洛沙姆188在內，當投予人類或動物時對若干病症具有有益的生物作用。該等活性已經描述於例如眾多出版物及專利中(參見例如美國專利號4,801,452、4,837,014、 4,873,083、4,879,109、4,897,263、4,937,070、4,997,644、5,017,370、5,028,599、5,030,448、5,032,394、5,039,520、5,041,288、5,047,236、5,064,643、5,071,649、5,078,995、5,080,894、5,089,260、RE 36,665(再頒專利5,523,492)、5,605,687、5,696,298、6,359,014、6,747,064、8,372,387、8,580,245，美國專利公開案號2011/0044935、2011/0212047、2013/0177524，及國際申請案WO2006/037031(以PCT/US2005/034790申請)、WO2009/023177(以PCT/US2005/037157申請)及WO2006/091941(以PCT/US2006/006862申請)，及PCT/US2014/45627，美國臨時申請案號62/021,691及62/021,676)。在使其適用作治療劑的泊洛沙姆(諸如泊洛沙姆188)之活性中有其併入細胞膜中且由此修復破壞之細胞膜的能力。
泊洛沙姆包括具有下式之POP/POE嵌段共聚物：HO(C2H4O)a'-(C3H6O)b-(C2H4O)aH，其中「a'」及「a」可相同或不同且各自為使得由(C2H4O)表示之親水物部分佔該化合物約50wt%至95wt%，諸如佔該化合物60wt%至90wt%，例如佔70wt%至90wt%的整數；及「b」為使得由(C3H6O)表示之疏水物之分子量為約950Da至4,000Da，諸如為1,200Da至3,500Da的整數。舉例而言，該疏水物之分子量為1,200Da至2,300Da，諸如一般為1,500Da至2,100Da。該共聚物之平均分子量為5,000Da至15,000Da，諸如為5,000Da至12,000Da，例如為5,000Da至9,000Da。
在某些情況下，b為約15至約70，諸如約15至約60，或約15至約30，或為其間任何數字之整數。在一些情況下，b為約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30。在某些態樣中， 具有下標「a'」及「a」之側接單元的整數可為不同或相同的。在一些情況下，a或a'為約45至約910之整數，諸如為90、100、200、300、400、500、600、700、800或900。在一些其他情況下，a或a'為約10至約215之整數，諸如為10、20、30、40、50、60、70、80、100、125、150、175、200或215。在又其他情況下，a或a'為約30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70。熟練技術人員應瞭解，該等值為平均值。a'、a及b之值表示平均值；聚合物分子一般為分子之分佈或分子群。因此，在該群體內之a、a'及b之實際值構成值之範圍。
泊洛沙姆之命名涉及各種聚合物成員之組成。泊洛沙姆編號之前兩個數字乘以100，得到疏水物之近似分子量。最後一個數字乘以10，得到界面活性劑之親水物(聚氧乙烯)含量之近似重量百分比。舉例而言，泊洛沙姆407描述含有約4,000Da之聚氧丙烯疏水物且聚氧乙烯親水物佔總分子量約70%之聚合物。泊洛沙姆188(P188)具有分子量為約1,800Da之疏水物且具有佔該共聚物之總分子量約80%的親水物。
泊洛沙姆係以商品名及商標出售及提及，包括但不限於，ADEKA NOL、SynperonicTM、Pluronic®及Lutrol®。例示性泊洛沙姆包括但不限於，泊洛沙姆188(P188；以商標Pluronic®F-68、Kolliphor®P 188出售；80%POE)、泊洛沙姆407(P407；以商標Lutrol F-127、Kolliphor®P 188、Pluronic® F-127出售；70%POE)、泊洛沙姆237(P237；以商標Pluronic® F87、Kolliphor® P 237出售；70%POE)、泊洛沙姆338(P338；以商標Kolliphor® P 338、Pluronic® F-108出售；80%POE)及泊洛沙姆331(Pluronic® L101；10%POE)。
因此，未純化之P188為以如上文所描述之各種名稱可商購的或為人所知的。儘管以下論述提及使用本文中之方法製造更均勻之(LCMF)泊洛沙姆188，但可使用本文中之方法製造更均勻的任何已知之泊洛沙姆之製劑。
泊洛沙姆可使用標準聚合物合成技術合成。舉例而言，使用一般熟習此項技術者已知之標準技術，藉由環氧乙烷-環氧丙烷縮合形成泊洛沙姆(參見例如，美國專利號RE 36,665、RE 37,285、RE 38,558、6,747,064、6,761,824及6,977,045；亦參見Reeve,L.E.,The Poloxamers：Their Chemistry and Medical Applications,Handbook of Biodegradable Polymers,Domb,AJ.等人(編),Hardwood Publishers,1997)。泊洛沙姆可藉由在諸如氫氧化鈉或氫氧化鉀之鹼性催化劑存在下，連續添加POP及POE單體來合成(參見例如，Schmolka,J.Am.Oil Chem.Soc.54(1977)110-116)。該反應係藉由POP嵌段之聚合反應起始，隨後在POP嵌段端兩端生長POE鏈。合成聚合物之方法亦描述於美國專利號5,696,298中。
2.泊洛沙姆188
泊洛沙姆188(P188)共聚物具有以下化學式：HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH， 其中由(C3H6O)表示之疏水物之分子量為約1,750道爾頓且該泊洛沙姆188之平均分子量為7,680Da至9,510Da，諸如一般為約8,400道爾頓至8,800道爾頓。聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯重量比為約4：2：4。根據說明書，P188具有81.8±1.9%之氧化乙烯重量百分比及0.026±0.008mEq/g之不飽和水準。
各種泊洛沙姆，且特別是P188被用於治療因黏附疏水性蛋白質或受損膜之存在引起之損傷導致血流阻力病理性增加的疾病及病況。該黏附係由病理性疏水相互作用引起且不需要特定配體與其受體之相互作用。此類蛋白質及/或受損膜藉由增加摩擦及降低血管之有效半徑而使微血管中之阻力增加。舉例而言，咸信泊洛沙姆188充當增加穿過受損組織之血流的潤滑劑。有利的是，此阻止疏水性表面彼此之黏附且由此降低摩擦並增加流動。
P188結合至受損細胞及變性蛋白質上產生之疏水性區域，由此使水合作用晶格復原。此類結合有助於受損膜之密封且中止會破壞細胞之發炎性介體之級聯。該聚合物亦抑制引起血液中所形成之成分之有害聚集的疏水性黏附相互作用。P188之抗黏附作用及消炎作用係藉由降低摩擦，防止血液中所形成之成分之黏附及聚集，維持紅血球之變形性、血小板及粒細胞之非黏附性以及血液正常黏度，減少細胞凋亡，及利用包括VEGF、各種趨化因子及介白素在內之多種炎症標記物增加受損組織中之血流來展現。
3.泊洛沙姆188之分子多樣性
據悉，可商購之泊洛沙姆188製劑之分子量為約8,400道爾頓。然而，此類泊洛沙姆188係由分子量小於3,000道爾頓至超過20,000道爾頓之分子構成。市售泊洛沙姆188之分子多樣性及分子分佈可見於使用凝膠滲透層析法偵測之較寬主峰及副峰中(參見例如，國際PCT公開之申請案號WO 94/08596)。
結構之多樣性意味著，存在生物活性之多樣性。舉例而言， 約8,400道爾頓至9,400道爾頓之P188分子觀察到最佳的流變性、細胞保護作用、抗黏附作用及抗血栓作用。可使用基於大小分離組分之方法，諸如凝膠滲透層析法(GPC)，將該等組分鑑別為泊洛沙姆製劑中之主要或優勢組分。然而，各組分之分佈亦典型地顯示較小百分率之低分子量組分(LMW，亦即，一般低於4,500道爾頓)或高分子量組分(HMW，亦即，一般高於13,000道爾頓)。高於15,000道爾頓及低於4,500道爾頓之P188組分為不太有效之流變或細胞保護劑且展現不合需要之副作用。泊洛沙姆製劑(諸如P188製劑)中之其他物質或組分來源於兩種不同來源、合成及降解。
促成分子多樣性之主要機制為用於合成泊洛沙姆之製程。在典型製造製程期間，第一步驟為形成POP嵌段。該等嵌段係藉由使丙二醇引發劑與環氧丙烷單體反應來形成。隨後，在兩端添加環氧乙烷單體以形成嵌段共聚物。泊洛沙姆之合成可引起在構建PO核心及EO末端之步驟期間聚合反應速率之變化。
在POP之合成期間，兩種不同之反應機制限制了POP鏈之生長且產生不希望的二嵌段聚合物。該等物質典型地具有低分子量(相對於P188之聚合物分佈)。在一種機制中，不飽和度係由環氧丙烷藉由在鹼催化劑存在下反應而直接形成。鹼催化環氧丙烷重排成烯丙醇，接著引發具有末端不飽和度之單官能鏈。該等類型之副反應將在整個反應時間內產生低分子量(LMW)物質。在凝膠滲透層析法(GPC)中，該等雜質之分佈位於主峰以及LMW肩部中。在第二機制中，生長之聚合物鏈中之負氧原子將位於六個碳原子中之氫原子提取掉可使該鏈封端及轉移，從而產生烯 丙基端基。該等反咬反應(backbiting reaction)以高分子量(HMW)POP嵌段佔主導。該等物質之分佈主要在LMW肩部中。
此外，亦可由於在典型工業製造操作期間泊洛沙姆188批次之間聚合反應器之清洗不充分而形成高分子量物質(相對於P188之聚合物分佈)。若在製造泊洛沙姆(諸如P188)之典型批次之後未完全清潔反應器以移除殘餘產物，則該殘餘產物將在隨後批次中充當引發劑並形成「類二聚體」泊洛沙姆分子。該物質具有較高分子量且將成為在GPC上觀察為HMW肩部的聚合物分佈之一部分。
泊洛沙姆之降解路徑包括過氧化，產生低分子醛及酸；以及熱降解，產生LMW聚乙二醇。氧化降解為影響泊洛沙姆之穩定性的主要降解路徑。該製程產生該聚合物鏈之結構變化且產生過氧化物及羧基。過氧化物為暫時性的且與丁基化羥基甲苯(butylated hydroxytoluene，BHT)迅速組合，該BHT典型地作為抗氧化劑添加至市售製劑中。熱降解為產生其他物質之另一路徑。各種鏈長度之二醇為熱降解之主要降解產物。強迫熱降解研究已顯示，形成乙二醇、丙二醇、二乙二醇及三乙二醇。
因此，特定泊洛沙姆係由具有EO-PO-EO結構基元但重複EO及PO單元之數量不同之多種化學實體構成。具有EO-PO基元及多種其他物質的各種截短之聚合物可因預定泊洛沙姆化合物之合成期間發生的副反應而形成。該等其他物質可存在且見於總體泊洛沙姆分佈內。結果為不均勻材料(亦即，多分散性材料)。
舉例而言，由於P188之合成，可引起在構建PO核心及EO末端之步驟期間聚合反應速率之變化。因此，大部分未純化形式之P188含 有聚合物物質之鐘形分佈，其主要在總鏈長方面存在不同。此外，可存在藉由不完全聚合反應形成之各種低分子量(LMW)組分(例如，二醇及截短之聚合物)，及高分子量(HMW)組分(例如，二聚合之聚合物)。典型地，藉由凝膠滲透層析法(GPC)表徵P188鑑別出P188之主峰，及表示不希望的LMW及HMW組分之「肩」峰(Emanuele及Balasubramaniam(2014)Drugs R D,14：73-83)。舉例而言，購自BASF(Parsippany,NJ)之P188製劑具有一種公開之結構，其以分子量為約1,750Da之疏水性嵌段、佔該聚合物重量80%之POE嵌段及約8,400Da之總分子量為特徵。實際化合物係由預定之POE-POP-POE共聚物構成，而且亦含有分子量範圍為小於1,000Da至高於30,000Da之其他分子。市售泊洛沙姆188之分子多樣性及分子分佈藉由使用凝膠滲透層析法偵測之較寬主峰及副峰說明。
未純化之泊洛沙姆製劑(包括可商購之泊洛沙姆)中所存在之分子多樣性可引起不同生物活性。許多觀察到的生物活性為非所需的或/及可引起限制泊洛沙姆作為藥物之治療功效的不合需要之副作用。在投予人工血液製劑後觀察到的補體活化、吞噬細胞遷移停頓及細胞毒性部分歸因於該等製劑之泊洛沙姆188組分中的雜質。此外，在毒理學動物研究中顯示，輸注泊洛沙姆188會引起肌酸酐升高，指示腎臟損害；及器官重量(腎臟)增加。腎臟之組織學評價表明近端小管上皮細胞之劑量相關性細胞質空泡形成。
經純化以移除低分子量組分之泊洛沙姆188(參見例如，Grindel等人(2002)Journal of Pharmaceutical Sciences,90：1936-1947(Grindel等人2002a)或Grindel等人(2002)Biopharmaceutics & Drug Disposition,23：87-103 (Grindel等人2002b))含有當投予受試者時展現不同藥物動力學特徵之組分。該主要組分在血漿中展現之半衰期(t1/2)為約7小時且較高分子量組分(亦即，較長滯留時間物質)展現之半衰期增加約10倍或超過10倍，其t1/2為約70小時或超過70小時，且因此相較於主要組分，具有實質上更長之血漿滯留時間且更慢自循環清除。此展示於本文中(參見例如圖8A及圖8B)。
a.低分子量組分
已經鑑別出泊洛沙姆188中對腎臟有毒之物質為具有比主要組分低之分子量。有關P188治療潛力之研究使得可以商標RheothRx®購得的泊洛沙姆部分因在臨床試驗評價期間觀察到的由血清肌酸酐升高證實之急性腎功能不全而中斷用於治療應用。已發現，該等作用歸因於在合成製程期間形成的各種低分子量(LMW)物質之存在(Emanuele及Balasubramaniam(2014)Drugs R D,14：73-83)。LMW物質經腎臟中近端小管上皮細胞積聚。
LMW物質之分子量可在數百道爾頓至數千道爾頓範圍內。具有廣泛溶解度特徵之該等雜質之複雜性質使得難以將其自母分子選擇性移除。習知純化製程，諸如蒸餾、結晶、超過濾及類似製程，無法有效地將低分子量(LMW)物質與主要組分分離。使用層析技術進行純化，諸如製備型GPC，相當昂貴且實際上難以按比例擴大。精細調諧混合溶劑系統以有差異地溶解及移除各種物質亦具有挑戰性且需要使用大量再循環很昂貴之溶劑。
已報導超臨界流體層析，其降低P188中所存在之該等低分子量物質之含量(參見例如，美國專利號5,567,859)。超臨界流體萃取係使 用二氧化碳純化共聚物以將多分散性減小至小於1.17來進行。然而，該方法無法充分地移除或減少LMW組分，如本文所示。
如下文更詳細地描述，本文所提供之方法製造出實質上不含該等LMW組分之泊洛沙姆製劑。舉例而言，具有減少之LMW組分的純化之P188具有小於約5%、4%、3%、2%或1%之LMW組分。因此，本文提供之泊洛沙姆製劑且詳言之P188泊洛沙姆製劑當投予時一般展現較低毒性且不會引起肌酸酐含量升高。此外，如本文中所描述，所得LCMF P188泊洛沙姆製劑具有其他有利的特性，包括在投予時減少之較長循環材料。
b.引起長循環半衰期之組分
已鑑別出P188中作為或產生在血漿或血液中具有比主要或優勢泊洛沙姆物質長之循環半衰期之材料的組分。在非臨床研究及臨床研究中觀察到該具有較長循環半衰期之材料。藉由高效液相層析-凝膠滲透層析法(HPLC-GPC)分析在靜脈內投予純化之P188之後獲得的血漿顯示，在循環中存在兩個明顯的峰(Grindel等人2002)Journal of Pharmaceutical Sciences,90：1936-1947(Grindel等人2002a)或Grindel等人(2002)Biopharmaceutics & Drug Disposition,23：87-103(Grindel等人2002b)。存在一個平均峰分子量為約8,600道爾頓之主峰及一個平均分子量為約16,000道爾頓之較小峰。該兩個峰展現明顯不同之藥物動力學特徵，其中較高分子量峰展現明顯較長之血漿滯留時間且更慢地自循環清除(參見圖8A及圖8B)。在大鼠及狗中報導類似觀察結果。用天然或未純化之泊洛沙姆188觀察到類似的較長循環組分(參見國際PCT公開之申請案號WO 94/008596)。
舉例而言，如圖8A中所示，在向健康志願者靜脈內投予100 mg/kg/hr起始劑量的純化之P188達一小時，隨後投予30mg/kg/hr維持劑量達47小時之後，主峰或優勢峰在一小時負載輸注結束時達到0.9mg/mL之平均最大濃度(Cmax)。達到的平均穩態濃度(Css)0.5mg/mL與維持輸注開始時基本上一致。在停止維持輸注時，血漿濃度迅速地下降，且消除半衰期(t1/2)為約7小時。
如圖8B中所示，鑑別出展現0.2mg/mL之Cmax的HMW組分，該Cmax在維持輸注結束之前未達到。由於濃度在輸注期間持續積聚，故未達到穩定狀態。在停止維持輸注之後，高分子量峰之血漿含量緩慢下降，使得血漿含量在24小時的輸注後監測時間段期間僅下降約33%。該消除速率為主峰消除速率之約1/10且t1/2為約70小時。亦參見Grindel等人(2002)Journal of Pharmaceutical Sciences,90：1936-1947(Grindel等人，2002a)及Grindel等人(2002)Biopharmaceutics & Drug Disposition,23：87-103(Grindel等人，2002b)。在P188分佈之HMW部分中鑑別出較長循環材料(或較長滯留時間材料)(Grindel等人，2002a)。如藉由MALDI-TOF質譜法所鑑別，測定HMW組分為約16,000Da，且片段化模式與嵌段共聚物一致(參見例如Grindel等人，2002a)。
由於P188流變性、細胞保護作用、抗黏附作用及抗血栓作用在該分佈之優勢或主要共聚物內最佳，其為約8,400道爾頓至9400道爾頓且具有約7小時之半衰期，故展現長循環半衰期之其他組分的存在係不合需要的。舉例而言，在P188之所需活性中有其用以減小血液黏度且抑制紅血球(red blood cell，RBC)聚集之流變作用，由此解釋了其改善受損組織中之血流的能力。相比之下，較高分子量之泊洛沙姆，諸如P338(亦稱 為Pluronic® F108)及P308(Pluronic® F98)，增加血液黏度及RBC聚集(Armstrong等人(2001)Biorheology,38：239-247)。此為P188之相反作用且指示較高分子量泊洛沙姆物質可具有不合需要的生物作用。
如下文更詳細地描述，提供作為或產生長循環材料之組分實質上減少之泊洛沙姆製劑，亦即，其為無長循環材料(LCMF)的。亦提供用於製造LCMF泊洛沙姆之例示性方法(參見例如實施例7)。
因此，本文提供之LCMF泊洛沙姆製劑，且詳言之LCMF泊洛沙姆188製劑展現更均一之藥物動力學特徵且因此展現更一致之治療作用。在以下部分中更詳細地描述LCMF泊洛沙姆。
C.無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆
本文提供一種無長循環材料(LCMF)之P188，亦即，純化之P-188，其具有小於1.07之多分散性值；具有不超過1.5%的小於4,500道爾頓之低分子量(LMW)組分；不超過1.5%的大於13,000道爾頓之高分子量組分；當投予受試者時共聚物之分佈中所有組分在血液或血漿中之半衰期比共聚物之分佈中主要組分之半衰期長不超過5.0倍。因此，LCMF泊洛沙姆188當投予時，不產生半衰期明顯長於主要組分之組分。LCMF P-188具有以下化學式： HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH， 其中a'與a可相同或不同且各自為使得由(C2H4O)表示之親水物部分(亦即，共聚物之聚氧乙烯部分)佔約60%至90%，諸如佔約80%或81%的整數；及b為使得由(C3H6O)表示之疏水物之分子量為約1,300Da至2,300Da，諸如為約1,750Da的整數；且該化合物之平均總分子量為約7,680Da至9,510 Da，諸如一般為8,400Da至8,800Da，例如為約8,400Da或為8,400Da，其中該共聚物已經純化以移除雜質，包括低分子量雜質或其他雜質，使得多分散性值小於1.07。
研究證實，當投予人類受試者時，純化(含LCM)之P-188製劑之主峰組分在(人類)血漿中之半衰期(t1/2)為約7小時(Grindel等人(2002)Journal of Pharmaceutical Sciences,90：1936-1947(Grindel等人，2002a)或Grindel等人(2002)Biopharmaceutics & Drug Disposition,23：87-103(Grindel等人，2002b))。純化之泊洛沙姆亦產生含有平均分子量為約16,000道爾頓之較高分子量組分的較長循環材料(LCM)，該等組分展現半衰期之約10倍或超過10倍之增加且t1/2為約70小時。
相比例如在Grindel等人(2002a及2002b)之研究中表徵的純化之P-188(含LCM)，稱為LCMF P-188的純化之泊洛沙姆，為當投予受試者時聚合物分佈之所有組分均以近似相同之速率自循環清除的純化之泊洛沙姆。因此，LCMF P-188不同於先前含LCM之p188泊洛沙姆。與含有LCM之泊洛沙姆相同，LCMF泊洛沙姆含有小於1.07且一般小於1.05或1.03的實質上較低之多分散性組成，但其中當投予人類受試者時，共聚物之分佈中任何組分的血液或血漿半衰期比共聚物之分佈中主要組分之半衰期長不超過5.0倍且一般不超過4.0倍、3.0倍、2.0倍、1.5倍。典型地，LCMF不含當投予受試者時展現之血液或血漿半衰期實質上長於(超過5倍)或長於共聚物之分佈中之主要組分的任何組分。
在一些實施例中，當投予人類受試者時，LCMF中所有組分之血液或血漿半衰期使得沒有組分之半衰期超過30小時，且一般不超過25 小時、20小時、15小時、10小時、9小時、8小時或7小時。
不受理論束縛，泊洛沙姆聚合物分佈之較高分子量組分，諸如大於13,000道爾頓之組分可產生較長循環半衰期材料。不帶電分子，如泊洛沙姆188及純化之泊洛沙姆188的腎絲球濾過率在很大程度上取決於分子大小。對於泊洛沙姆188聚合物分佈中分子量大於5,000道爾頓之組分觀察到此情形，因為高於該大小臨限值，腎絲球濾過率變得愈來愈受限制(Chang等人(1975)Biophysic.J.15：887-906)。相應地，泊洛沙姆188聚合物分佈之較高分子量組分(諸如大於13,000道爾頓之組分)將更可能以比大小較小之組分慢的速率自循環清除。
然而，對於LCMF製劑，該分佈中HMW組分之存在不會產生較長循環物質(亦即，半衰期比主峰長超過5倍的物質)。舉例而言，LCMF製劑中大於13,000道爾頓之HMW雜質一般佔總組分不超過1.5wt%。當將該LCMF製劑投予受試者時，該等HMW雜質不會產生比該分佈中主要組分之半衰期長超過5.0倍且一般不超過4.0倍、3.0倍、2.0倍、1.5倍的循環半衰期。當將該LCMF製劑投予受試者時，其不會產生循環半衰期實質上長於(亦即，超過5倍)或長於該分佈中之主要組分的任何組分(參見例如圖7A及圖7B)。
相較於其他現有的純化之P-188製劑，在該LCMF製劑中，HMW組分可增加或減少。舉例而言，本文提供之LCMF泊洛沙姆包括的P-188泊洛沙姆中存在不超過1.3%，諸如不超過1.2%、1.1%、1.0%或小於1.0%的大於13,000道爾頓之高分子量組分。在本文提供之特定實施例中，本文提供之LCMF泊洛沙姆包括的P-188泊洛沙姆中存在小於1.0wt%，且 一般小於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%或小於0.5%的大於13,000道爾頓之高分子量組分。
本文提供之LCMF泊洛沙姆可藉由下文D部分中，且詳言之D.1.b部分中所描述之方法製備(參見例如圖3)。鑒於該LCMF泊洛沙姆之特性的說明及例證，熟習此項技術者可設想用於製造LCMF泊洛沙姆之其他方法。舉例而言，藉由以下方法製備本文提供之LCMF泊洛沙姆，該方法包括：a)將泊洛沙姆溶液引入萃取容器中，其中該泊洛沙姆溶解於第一烷醇中，形成溶液；b)使該泊洛沙姆溶液與包含第二烷醇及超臨界二氧化碳之萃取溶劑在維持該超臨界二氧化碳之溫度及壓力下接觸第一規定時間段，其中：該溫度高於二氧化碳之臨界溫度且可典型地在35℃至45℃之間的範圍內；該壓力為220巴至280巴；及該烷醇以佔總萃取溶劑7wt%至8wt%之烷醇濃度提供；及c)使步驟b)中萃取溶劑中之第二烷醇的濃度在該萃取方法之時間內分數個梯度步驟增加複數倍，其中：每一複數倍發生另一規定時間段；且在每一連續步驟中，該烷醇濃度相較於該第二烷醇之前一濃度增加1%-2%；及d)自該萃取容器移除萃取溶劑，由此自萃餘物泊洛沙姆製劑移除萃取之材料。
D.用於純化泊洛沙姆之萃取方法
本文提供用於純化泊洛沙姆，以使得該純化之聚合物在結構(二嵌段、三嵌段等)、不含不飽和度之分子之百分含量、分子量分佈及疏水性/親水性(hydrophobic/hydrophilic，HLB)分佈比率方面更均勻的超臨界流體萃取(SFE)及高壓程序。可利用該製程之可調諧性有效地移除額外的組分且可隨時間進行調整，由此可增加純化產物之產率。本文提供之方法使用了溶劑化特徵不同之溶劑系統，以便選擇性移除各種物質。該等方法提供了一種製造具有以上特性之LCMF泊洛沙姆188產物的例示性方式。
本文中之方法提供了不同於藉由先前方法製造之泊洛沙姆製劑的泊洛沙姆製劑。該等製劑包括當投予時，不會產生關於純化之泊洛沙姆188(諸如美國專利號5,696,298中所描述之泊洛沙姆製劑)所觀察到的較長循環材料的LCMF泊洛沙姆188製劑。LCMF泊洛沙姆188具有類似於純化之泊洛沙姆188的分子大小分佈，但組分分子使製劑之親水性高於純化之泊洛沙姆。
較長循環材料(LCM)之不存在使泊洛沙姆之特性得以改善，包括更快的清除率及其他此類由較長循環材料之消除引起的藥理學特性改善。本文所提供之方法除去了泊洛沙姆製劑中不合需要之組分且由此製備出展現所需治療活性，同時使非所需活性減到最小或降低的更均勻或更均一之泊洛沙姆製劑。由於已報導可商購之泊洛沙姆展現毒性以及生物活性之變化，故更均一且更均勻之泊洛沙姆製劑具有減少之毒性，但仍保持主要共聚物組分之治療功效。
本文提供用於製備此類泊洛沙姆之方法，且提供所得到的泊洛沙姆，包括LCMF泊洛沙姆188。本文所提供之方法除產生減少或移除了 低分子量(LMW)組分之泊洛沙姆製劑以外，亦產生減少或移除了作為或產生如本文中所描述血漿或血液中之循環材料之任何組分的無長循環材料(LCMF)之製劑。因此，本文亦提供LCMF泊洛沙姆製劑且詳言之LCMF泊洛沙姆188。本文提供之LCMF泊洛沙姆188可以用於關於泊洛沙姆188已知之所有應用。
本文提供用於純化泊洛沙姆，諸如P188，以便移除或減少除主要組分外之組分且由此降低該製劑之分子多樣性的萃取方法。舉例而言，本文所提供之方法可移除或減少泊洛沙姆中之LMW物質。本文中亦發現，除移除或減少LMW物質以外，本文提供之特定方法亦可移除或減少泊洛沙姆製劑中作為或產生半衰期實質上長於分佈中主要組分之半衰期之較長循環材料的組分。萃取程度及萃取之組分受如本文中所描述方法中採用的特定溫度、壓力及烷醇濃度控制。
本文所提供之方法採用了超臨界或亞臨界萃取溶劑，其中該溶劑能力在共溶劑改質劑存在下受溫度、壓力之操作控制。已發現，二氧化碳並非泊洛沙姆(諸如P188)之特別高效的萃取溶劑，不過作為改質劑之極性共溶劑(諸如烷醇)之存在使CO2在萃取溶劑中之溶解效率增加。詳言之，本文所提供之方法係在極性共溶劑(諸如烷醇)存在下進行，該極性共溶劑之濃度隨著萃取製程之進展以一種梯度方式(例如，逐步梯度或連續遞增之梯度)增加。已發現，藉由採用濃度以此方式增加之烷醇共溶劑，雜質之移除可增加且達到比單獨使用二氧化碳時高得多的程度。舉例而言，僅使用二氧化碳之萃取方法不能夠移除不合需要之組分，諸如本文中所描述的LMW組分及HMW組分，達到與所提供之方法所達到相同的 程度。
在本文提供的使用超臨界流體萃取來純化泊洛沙姆之方法中，相較於該分佈中之其他HMW組分，泊洛沙姆分佈之LMW組分或雜質可在更低烷醇濃度(例如，甲醇)及更高壓力下選擇性移除。如下文進一步描述，藉由例如小心地控制極性溶劑(諸如烷醇，例如甲醇)之壓力及濃度來增加萃取溶劑之溶解能力，亦可能移除其他雜質。詳言之，提供一種採用單獨或結合壓力降低的較高烷醇(諸如甲醇)濃度之梯度的方法，該方法引起泊洛沙姆分佈中組分(例如，HMW組分)之移除，以使得當將所得產物投予受試者時，其不會產生利用先前P-188產物所觀察到的在血漿中具有較長循環之材料。
然而，可關於泊洛沙姆之產率進行權衡。一般而言，當烷醇(例如，甲醇)共溶劑之濃度增加時，萃取溶劑之溶劑化能力增加，使得更多化合物溶解且萃取程度增加。藉由以梯度方式增加萃取溶劑之濃度，使泊洛沙姆產率之減少降到最低，同時使最終產物之純度達到最大。典型地，本文所提供之方法達到的產率使得藉由該方法獲得的萃取或純化之聚合物之量為該方法進行之前該泊洛沙姆之起始量的至少55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%或超過90%。然而，所得泊洛沙姆展現實質上更高的純度，其中該分佈中主要組分之百分含量高於起始物質，且不含展現毒副作用或當投予時會產生在血漿中具有較長循環之材料的雜質。
該等方法可對希望例如藉由降低或減少聚合物分佈中非所需之組分來增加純度的任何泊洛沙姆進行。選擇以此方式純化之特定泊洛沙姆在熟練技術人員之技能範圍內。非所需組分包括作為或產生有毒或生 物活性與所需活性相反或相對之材料的任何組分。舉例而言，該泊洛沙姆可為希望減少或移除泊洛沙姆中之LMW組分，例如當投予時引起急性腎副作用，諸如肌酸酐升高之任何組分的泊洛沙姆。該泊洛沙姆亦可為含有當投予時作為或產生血液半衰期不同於(例如，長於)聚合物分佈中主要組分之半衰期之材料的任何組分(諸如HMW組分)之泊洛沙姆。此類組分可增加血液黏度及紅血球聚集，且因此為非所需的。
用於該等方法中之例示性泊洛沙姆包括但不限於，泊洛沙姆188、泊洛沙姆331及泊洛沙姆407。典型地，泊洛沙姆為主要組分之平均分子量在或在約4,700Da至12,800Da內，諸如一般為7,680Da至9,510Da，例如一般為8,400Da至8,800Da的泊洛沙姆。詳言之，該泊洛沙姆為P188。
舉例而言，可採用本文提供之萃取方法來純化P188製劑，其中P188製劑具有以下化學式：HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH，其中：由(C3H6O)表示之疏水物具有約1,750道爾頓之分子量，及7,680Da至9,510Da，諸如一般為約8,400道爾頓至8,800道爾頓之平均分子量。P188之聚氧乙烯：聚氧丙烯：聚氧乙烯重量比為約4：2：4。P188具有81.8±1.9%之氧化乙烯重量百分比及0.026±0.008mEq/g之不飽和水準。用於本文中之萃取方法中的P188製劑包括可商購之製劑。該等製劑包括但不限於，Pluronic® F68(BASF,Florham Park,N.J.)及RheothRx®(由Glaxo Wellcome公司開發)。
在實施本文提供之萃取方法時，該等方法包括：a)將泊洛沙姆(例如，P188)溶液提供至萃取容器中，其中該泊洛沙姆溶液係藉由將泊洛沙姆溶解於第一溶劑中形成該溶液來製備；b)將含有超臨界液體(例 如，超臨界二氧化碳)或亞臨界流體(例如，高壓二氧化碳)及共改質劑溶劑之萃取溶劑與該溶液混合以形成萃取混合物，其中該萃取溶劑中共改質劑溶劑之濃度在萃取方法之時間內增加；及c)自該萃取容器移除萃取溶劑，由此自泊洛沙姆移除雜質(例如，LMW及/或其他組分)。在該方法中，將泊洛沙姆溶液溶解於第一溶劑中之步驟可在將該溶液裝入萃取容器中之前或在將該溶液裝入萃取容器中之時發生。舉例而言，將該泊洛沙姆溶解於獨立容器中，且接著將該溶液添加至萃取容器中。
該方法可為高壓或超臨界流體萃取方法。典型地，該方法係使用超臨界流體萃取(SFE)，在萃取溶劑中使用超臨界液體進行。超臨界液體為經加熱至高於臨界溫度且經壓縮至高於臨界壓力的任何液體。
舉例而言，二氧化碳具有31.1℃之臨界溫度及73.8巴之臨界壓力。因此，超臨界二氧化碳之萃取條件係高於約31℃之臨界溫度及約74巴之臨界壓力。相比之下，可在亞臨界條件下實現高壓力萃取，其中該壓力超出臨界壓力，但溫度未超過該臨界溫度。
1.萃取製程
a.超臨界方法
在某些情況下，本文提供之方法中採用的超臨界流體萃取製程基本上為使用超臨界流體作為溶劑之溶劑萃取製程。在超臨界流體存在下，可藉由採用組分揮發性之差異及組分混合物與超臨界流體溶劑(溶劑萃取)之間特異性相互作用之差異來分離多組分混合物。在相圖之超臨界區域中，可壓縮流體，諸如二氧化碳，展現類似液體之密度及大幅增加之壓力依賴性溶劑容量。
超臨界流體展現許多非常有利的特徵，使其成為優良溶劑。舉例而言，超臨界流體之可調諧的溶劑能力在一定範圍內關於臨界條件迅速變化。超臨界流體溶劑能力且因此可在萃取期間選擇性移除之組分的性質可藉由改變超臨界流體溶劑之溫度及壓力精細調諧。
各種超臨界流體之另一有益特性為其臨界溫度及壓力之差異。每一超臨界流體具有一定溶劑能力範圍。可調諧的溶劑能力範圍可藉由選擇適當超臨界流體進行選擇。
除獨特的溶解性特徵以外，超臨界流體亦展現某些物理化學特性，使其更有用。舉例而言，超臨界流體展現類似液體之密度且具有類似氣體之輸送特性，諸如擴散率及黏度。該等特徵亦關於臨界區域迅速地變化。超臨界流體亦具有零表面張力。由於大部分有用之超臨界流體之沸點為約環境溫度或低於環境溫度，故在純化之後進行的溶劑移除步驟很簡單，具有能量效益且不會留下任何殘餘溶劑。
在萃取期間使用固體基質為部分分離參數提供另外的方向。適合的固體基質除溶質-溶劑相互作用以外，亦提供溶劑-基質及溶質-基質相互作用，以增加部分分離之解析度。所需的超臨界流體之輸送特性使該製程容易地可縮放用於製造。利用超臨界流體萃取製程，在製程按比例放大時，熱傳遞及質量傳遞特徵不會明顯變化。由於可精確地控制該萃取製程條件，諸如壓力、溫度及流動速率，故該純化製程除高度可調諧外，亦為可再現的。
在此類方法中，萃取溶劑可含有超臨界液體(例如，超臨界二氧化碳)，以及在萃取時間內增加的另一共改質劑溶劑，一般為烷醇。如 上文所描述，共改質劑溶劑之存在可改善溶質(諸如較高分子量或更具非極性之溶質)之溶解度，且由此增進其在該方法中之萃取。
舉例而言，本文提供之方法可包括：a)將泊洛沙姆(例如，泊洛沙姆188)溶液提供或引入至萃取容器中，其中該泊洛沙姆溶液係藉由將泊洛沙姆溶解於第一烷醇中形成該溶液來製備；b)將含有第二烷醇及超臨界液體之萃取溶劑與該溶液在足以建立超臨界液體條件之高壓及高溫下混合以形成萃取混合物，其中該萃取溶劑中第二烷醇之濃度在萃取方法之時間內增加；及c)自該萃取容器移除萃取溶劑，由此自泊洛沙姆製劑移除雜質(例如，LMW組分或其他組分)。第一烷醇與第二烷醇可相同或不同。在該方法中，將泊洛沙姆溶液溶解於第一溶劑中之步驟可在將該溶液裝入萃取容器中之前或在將該溶液裝入萃取容器中之時發生。舉例而言，將該泊洛沙姆溶解於獨立容器中，且接著將該溶液添加至萃取容器中。
例示性製程於圖1中詳述。圖1描繪了自泊洛沙姆製劑移除雜質(例如，LMW組分或其他組分)之製程(100)。如步驟105中所示對萃取系統進行加壓，隨後如步驟110中所示，典型地將第一烷醇施配至饋料混合槽中。將該系統加熱至適合於萃取製程之溫度。該溫度典型地為高於超臨界液體(例如，二氧化碳)之臨界溫度的溫度。一般而言，該溫度為約40℃。
任何適合之烷醇或烷醇組合均可用於本文所提供之方法中。適合烷醇之實例包括但不限於，甲醇、乙醇、丙醇及丁醇。舉例而言，本文提供之方法包括如上文所描述之萃取方法，其中第一烷醇及第二烷醇各自獨立地選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合。在一些具體實 例中，第一烷醇為甲醇。在某些情況下，在實施該方法時，選擇甲醇作為純化溶劑且為第二烷醇。熟練技術人員應瞭解，甲醇具有相對較低的毒性特徵。此外，甲醇對於泊洛沙姆188具有良好溶解性。
在製程100中，根據步驟115，使用第一烷醇(例如，甲醇)形成泊洛沙姆溶液。將泊洛沙姆，諸如P188製劑施配於饋料槽中並攪拌，直至與第一烷醇混合。添加至饋料槽中的泊洛沙姆之量隨該萃取方法之可縮放性、萃取容器之大小、所達到的純度及在熟練技術人員技能範圍內之其他因素而變化。舉例而言，每毫升萃取容器中泊洛沙姆(例如，P188)之非限制性量可為0.1kg至0.5kg或0.2kg至0.4kg。在一些實施例中，在使用3L萃取容器之萃取方法中，泊洛沙姆(例如，P188)之非限制性量可為0.6kg至1.2kg，諸如為0.8kg至1.0kg。在另一實施例中，在使用12L萃取容器之萃取方法中，泊洛沙姆(例如，P188)之非限制性量可為1.5kg至5kg，諸如為2kg至4kg。在另一實施例中，在使用50L萃取容器之萃取方法中，泊洛沙姆(例如，P188)之非限制性量可為8kg至20kg，諸如為10kg至16kg或12kg至15kg。取決於特定應用、萃取容器、起始物質之純度及在熟練技術人員技能範圍內之其他考慮因素，預期該等量之變化。
預期任何適合的泊洛沙姆與烷醇比率均可用於本文所提供之方法中。泊洛沙姆與烷醇之比率以重量計可為例如約4：1至約1：4，諸如為約3：1至約1：3、2：1至約1：2、1：1至4：1或1：2至14。舉例而言，泊洛沙姆與烷醇之比率以重量計可為約4比1，或約3比1，或約2比1，或約1比1，或約1比2，或約1比3，或約1比4。舉例而言，可將一定量的泊洛沙姆(諸如P188)與以重量計相同量之烷醇(例如，甲醇)混合。可將一 定量的泊洛沙姆(諸如P188)與以重量計較少量之烷醇，諸如以重量計半數該量之烷醇(例如，甲醇)混合。熟習此項技術者應瞭解，適當的泊洛沙姆與烷醇比率將取決於泊洛沙姆特性，諸如在給定烷醇中之溶解度。
在形成泊洛沙姆/烷醇混合物之後，如步驟120中所示，將該混合物之全部或部分抽吸至萃取器中。在該等實施例中，製備泊洛沙姆溶液之製程係在與該萃取器分開之容器中進行。熟練技術人員應瞭解，在與第一烷醇混合之前，亦可將泊洛沙姆以固體形式引入萃取器中。因此，製備泊洛沙姆溶液之製程可直接在萃取容器中進行。
接著，如製程100之步驟125中所示，對萃取器加壓且將萃取溶劑引入萃取器中。萃取溶劑含有超臨界液體。超臨界液體之實例包括但不限於，二氧化碳、甲烷、乙烷、丙烷、氨、Freon®、水、乙烯、丙烯、甲醇、乙醇、丙酮及其組合。在一些具體實例中，處於壓力下之超臨界液體選自二氧化碳、甲烷、乙烷、丙烷、氨及以freons出售之致冷劑的成員。在一些具體實例中，處於壓力下之超臨界液體為二氧化碳(CO2)。
萃取係在高壓及高溫下發生以維持超臨界液體條件(例如，超臨界二氧化碳)。典型地，該等條件保持恆定。在該壓力及溫度下，超臨界液體(例如，超臨界二氧化碳)係以實質上恆定之流動速率提供。流動速率可在0.5kg/h至600kg/h之間，諸如在1kg/h至400kg/h之間，在1kg/h至250kg/h之間，在1kg/h至100kg/h之間，在1kg/h至50kg/h之間，在1kg/h至20kg/h之間，在1kg/h至10kg/h之間，在10kg/h至400kg/h之間，在10kg/h至250kg/h之間，在10kg/h至100kg/h之間，在10kg/h至50kg/h之間，在10kg/h至20kg/h之間，在20kg/h至400kg/h之間，在20kg/h至 250kg/h之間，在20kg/h至100kg/h之間，在20kg/h至50kg/h之間，在50kg/h至400kg/h之間，在50kg/h至250kg/h之間，在50kg/h至100kg/h之間，在100kg/h至400kg/h之間，在100kg/h至200kg/h或在200kg/h至400kg/h之間變化，各自包括端點在內。舉例而言，流動速率為20kg/h至100kg/h，包括端點在內，諸如一般為約100kg/h或為100kg/h。
使超臨界液體維持超臨界狀態之任何適合溫度均可用於進行該萃取製程。舉例而言，二氧化碳之臨界溫度為約31℃。因此，萃取容器保持在大於31℃之溫度。在一些具體實例中，萃取容器之溫度為32℃至80℃且一般為約32℃至60℃或32℃至60℃，各自包括端點在內。舉例而言，該溫度可為不超過35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃或60℃之溫度。一般而言，該溫度大於31℃，但不超過40℃。熟習此項技術者應瞭解，該溫度可部分取決於萃取溶劑之組成以及給定泊洛沙姆在該製程中所採用之溶劑中的溶解度而變化。
該方法中可使用任何適合之壓力。當採用超臨界流體萃取時，將系統加壓至一定水準以確保該超臨界液體保持在高於臨界壓力之壓力。舉例而言，二氧化碳之臨界壓力為約74巴。因此，將萃取容器加壓至大於74巴。特定壓力程度可改變超臨界液體之溶解性特徵。因此，所選特定壓力可影響雜質萃取之產率及程度。典型地，萃取容器在125巴至500巴範圍內加壓。在一些具體實例中，萃取容器在200巴至400巴、200巴至340巴、200巴至300巴、200巴至280巴、200巴至260巴、200巴至240巴、200巴至220巴、220巴至400巴、220巴至340巴、220巴至300巴、220巴至280巴、220巴至260巴、220巴至240巴、240巴至400巴、240 巴至340巴、240巴至300巴、240巴至280巴、240巴至260巴、260巴至400巴、260巴至340巴、260巴至300巴、260巴至280巴、280巴至400巴、280巴至340巴、280巴至300巴或300巴至340巴範圍內加壓。舉例而言，萃取容器可加壓至約或至少225巴、230巴、235巴、240巴、245巴、250巴、255巴、260巴、265巴、270巴、275巴、280巴、285巴、290巴、295巴、300巴、305巴、310巴、315巴、320巴、325巴、330巴、335巴、340巴、345巴、350巴、355巴、360巴、365巴、370巴、375巴、380巴、385巴、390巴、395巴或400巴，但一般不超過500巴。萃取容器可加壓至例如310±15巴。
典型地，在本文提供之方法中，引入萃取容器中之萃取溶劑亦含有烷醇。因此，萃取溶劑包括第二烷醇及處於高壓及高溫下之超臨界液體。第二烷醇充當超臨界液體之共溶劑改質劑以改變超臨界液體之溶劑特徵且改善該方法中溶質之可萃取性。如上文所描述，任何適合之烷醇或烷醇組合均可在本文提供之方法中用作第二烷醇。如上文所描述，在特定實施例中，第二烷醇為甲醇。
任何適合的第二烷醇與超臨界液體之組合，諸如上文所描述之任何組合，均可用於本文提供之方法中之萃取溶劑中。在一些具體實例中，萃取溶劑包括甲醇及二氧化碳。第二烷醇典型地以佔總萃取溶劑之百分含量(w/w)提供，該百分含量為3%至20%，且一般為3%至15%，例如為5%至12%、5%至10%、5%至9%、5%至8%、5%至7%、7%至15%、7%至12%、7%至10%、7%至9%、7%至8%、8%至15%、8%至12%、8%至10%、8%至9%、9%至15%、9%至12%、9%至10%、10%至15%或10%至12%， 各自包括端點在內。該烷醇之流動速率(kg/h)隨引入萃取器中之烷醇之量而變化。
舉例而言，適合的烷醇(例如，甲醇)與超臨界液體(例如，二氧化碳)之比率可基於泊洛沙姆起始物質之特性及純度，或基於諸如溫度或壓力之其他萃取參數選擇。舉例而言，烷醇(例如，甲醇)與超臨界液體(例如，二氧化碳)之比率可為約1：100至約20：100。在一些具體實例中，烷醇(例如，甲醇)與超臨界液體(例如，二氧化碳)之比率為約1：100至約15：100。在一些具體實例中，烷醇(例如，甲醇)與超臨界液體(例如，二氧化碳)之比率為約2：100至約14：100。烷醇(例如，甲醇)與超臨界液體(例如，二氧化碳)之比率可為約3：100，或約4：100，或約5：100，或約6：100，或約7：100，或約8：100，或約9：100，或約10：100，或約11：100，或約12：100，或約13：100，或約14：100。
在某些態樣中，萃取可以等度方式進行，其中萃取溶劑之組成在整個萃取程序中保持恆定。舉例而言，例如藉由維持各自的恆定流動速率，使超臨界液體(例如，二氧化碳)及烷醇(例如，甲醇)之量在萃取時間內恆定。或者，萃取溶劑之組成可隨時間變化，典型地藉由改變(例如，增加或減少)構成萃取溶劑之超臨界液體及/或烷醇組分之量。一般而言，超臨界液體(例如，二氧化碳)保持恆定，而該萃取溶劑中烷醇(例如，甲醇)之濃度在萃取時間內改變(例如，增加或減小)。可藉由調整流動速率來改變各組分之濃度。
在萃取溶劑之組成可隨時間變化之態樣中，隨萃取製程之進展以逐步梯度或連續遞增之梯度增加第二烷醇的方法對該方法有益。在某 些情況下，商品級泊洛沙姆同時具有高分子量組分及低分子量組分以及主要產物或組分。在高壓二氧化碳萃取流體中較低的烷醇(例如，甲醇)濃度可選擇性移除低分子量組分。然而，富含雜質之可萃取物的溶解度較低且需要花費時間來顯著減少低分子量組分，使其不太高效。藉由以梯度方式(以逐步梯度或連續遞增之梯度)增加萃取溶劑之烷醇濃度，使萃取的低分子量雜質之量增加。
此外，較高烷醇(例如，甲醇)濃度使溶解性增加，且因此增進較高分子量組分之萃取。因此，萃取溶劑中連續較高烷醇(例如，甲醇)濃度之梯度可逐漸地萃取低分子量組分，且最終萃取較高分子量組分或不太易溶之組分。作為說明此之非限制性實施例，咸信約6.6%(w/w)之較低烷醇(例如，甲醇)濃度可移除低分子量組分。使烷醇之濃度增加1%至3%將繼續實現低分子量組分之萃取，而且亦引起較高分子量組分之移除。使烷醇之濃度進一步增加1%至3%將進一步移除該等組分以及具有較高分子量及/或不太易溶於先前萃取溶劑中之其他組分。
然而，具有較高烷醇(例如，甲醇)濃度之萃取溶劑不具有此選擇性，因為其提供對低分子量組分之較高溶解性，而且亦增加包括主要組分在內之其他組分的溶解性。因此，純化產物之產率在高甲醇濃度下降低。藉由如本文中之方法中所提供，以梯度方式增加萃取溶劑之濃度，使泊洛沙姆產率之減小降到最低且使最終產物之純度最大。
已發現，逐步增加甲醇濃度使萃取器之負載能力增加，由此使給定萃取系統之輸貫量增加。在萃取器內部形成兩相系統。下部相主要由泊洛沙姆以及溶解有一些二氧化碳之甲醇的混合物組成。萃取溶劑(二 氧化碳及較少的甲醇共溶劑部分)滲透穿過下部相。上部相主要由萃取溶劑及自泊洛沙姆萃取之組分組成。兩相之相對量取決於溶劑流中之甲醇濃度。在典型萃取系統中，存在適當頂部空間供上部相之相分離。在萃取製程期間逐步增加甲醇共溶劑濃度使較多饋料裝入萃取器中。
舉例而言，返回到製程100，如步驟130-140中所示，萃取溶劑之組成可變化。在一些具體實例中，以萃取溶劑之重量計的烷醇(例如，甲醇)之百分含量在該方法之過程內增加。隨著萃取製程之進展，甲醇/二氧化碳混合物中之甲醇含量可以逐步方式或以連續方式增加。在一些具體實例中，例如，泊洛沙姆(例如，P188)之萃取製程在含超臨界液體(例如，二氧化碳)之萃取溶劑中使用約3wt%至約10wt%(w/w)，諸如約5%至約10%，諸如6%至8%(例如，約6.6%或7.4%)之烷醇(例如，甲醇)開始。在規定時間段之後，萃取溶劑中之烷醇(例如，甲醇)含量升高約1%-3%，諸如1%-2%(例如，分別達到7.6%或9.1%)。在最終時間段期間，烷醇(例如，甲醇)含量隨後再次升高約1%-3%，諸如1%-2%(例如，分別達到8.6%或10.7%)。
任何適合之溶劑梯度均可用於該方法中。舉例而言，超臨界液體(例如，二氧化碳)中之烷醇(例如，甲醇)濃度可在萃取程序之過程內增加約5%至約20%。超臨界液體(例如，二氧化碳)中之烷醇(例如，甲醇)濃度可增加約5%至約20%，或約5%至約15%，或約5%至約10%。超臨界液體(例如，二氧化碳)中之烷醇(例如，甲醇)濃度可增加約6%至約18%，或約6%至約12%，或約6%至約10%。超臨界液體(例如，二氧化碳)中之烷醇(例如，甲醇)濃度可增加約7%至約18%，或約7%至 約12%，或約7%至約10%。烷醇(例如，甲醇)濃度可分任何適合數量之步驟增加。舉例而言，烷醇(例如，甲醇)濃度可在萃取程序之過程內經兩個步驟，或三個步驟，或四個步驟，或五個步驟增加。熟練技術人員應瞭解，其他溶劑比率及溶劑梯度亦可用於該萃取製程中。
本文提供之製程之萃取時間可持續引起製劑中材料之適合萃取，同時使泊洛沙姆產率之減小降到最低且使純度最大的任何規定時間段。該時間隨壓力、溫度、第二烷醇濃度及提供萃取溶劑之製程(例如，等度或以如本文中所描述的遞增烷醇濃度之梯度)的選擇而變化。一般而言，該萃取進行5小時至50小時，且一般為10小時至30小時，或15小時至25小時，各自包括端點在內，諸如為或為約15小時或24小時。該方法中採用的烷醇(例如，甲醇)濃度越高，則典型地萃取時間越短。亦應理解，在該方法中採用烷醇梯度之實施例中，萃取之總時間隨該程序中梯度步驟之數量而劃分。在每一梯度步驟中之萃取可持續相同時間量或不同時間。憑經驗確定擬採用之萃取時間在熟練技術人員之技能範圍內。
可在萃取製程期間收集樣品以監測物質之移除或確定是否有必要調整萃取參數，諸如溫度或萃取溶劑之組成。
特定言之，該等方法可以用於純化P188。該製程亦可應用於其他聚合物。舉例而言，在一些具體實例中，本文所提供之方法提供一種用於製備純化之聚氧丙烯/聚氧乙烯組成物之方法。該方法包括：
a)將溶解於第一溶劑中形成共聚物溶液之聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段共聚物溶液提供或引入萃取容器中，其中該第一溶劑為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或其組合，且該組成物包含： i)聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段共聚物，其具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH，該共聚物之中間或平均分子量為約4,000Da至約10,000Da；及ii)複數種低分子量物質具有小於4,500Da之分子量，其中該複數種低分子量物質佔該組成物之總重量超過4%；b)添加第二溶劑，形成萃取混合物，其中該第二溶劑含有處於高壓及高溫下之超臨界液體及烷醇，該烷醇為甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或其組合，且萃取溶劑中第二溶劑之濃度在萃取方法之時間內增加；及c)使萃取混合物分離以形成複數個相，該等相包含萃餘物相及萃取物相，其中該萃餘物相與該萃取物相係分開移除或分離。
在上述方法之一些情形中，該共聚物之中間或平均分子量為約7680Da至9,510Da，諸如一般為8,400Da至8800Da，例如為約8,400Da或為8,400Da。在該方法中，可在萃取容器中藉由添加該共聚物且藉由添加第一溶劑形成該共聚物之溶液或懸浮液來形成共聚物溶液，其中第一溶劑包含選自由甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合組成之群的烷醇。或者，將第一溶劑添加至共聚物中形成共聚物溶液可在獨立容器中進行，且將溶解於第一溶劑中之共聚物溶液提供或引入(亦即，裝入)萃取容器中。在一些情況下，在步驟c)之前，該方法包括在高壓及高溫下攪拌萃取混合物以自共聚物組成物中萃取雜質(例如，低分子量可萃取組分及其他組分)。
b.高壓法
本文提供的純化泊洛沙姆(例如，P188)之方法可為利用混合溶劑系統之高壓流體萃取方法。該混合系統中之一種溶劑為可在中等壓 力下壓縮成液體之氣態溶劑，諸如二氧化碳。舉例而言，可用高壓二氧化碳(不過不必為超臨界二氧化碳，亦即，亞臨界)改進甲醇或乙醇溶劑能力以得到選擇性移除泊洛沙姆之不同部分所需的精確溶劑化能力。
在此類方法中，萃取溶劑含有在亞臨界條件下提供之二氧化碳，以及在萃取中隨時間增加的另一溶劑。因此，本文提供之方法的一些具體實例提供一種用於移除泊洛沙姆製劑中之雜質(例如，低分子量組分)的萃取方法，其中該方法包括：a)將泊洛沙姆提供或引入萃取容器中，該泊洛沙姆溶解於第一溶劑中形成溶液，其中該第一溶劑選自醇、脂族酮、芳族酮、胺及其混合物；b)將萃取溶劑與該溶液混合以形成萃取混合物，其中該萃取溶劑包含高壓二氧化碳及溶劑，且萃取溶劑中溶劑之濃度在萃取方法之時間內增加；及c)萃取容器移除萃取溶劑，由此自該泊洛沙姆移除低分子量雜質。
第一溶劑與第二溶劑可相同或不同。在該方法中，將該泊洛沙姆溶液溶解於第一溶劑中之步驟可在將該溶液提供或引入萃取容器中之前或在將該溶液提供或引入萃取容器中之時發生。舉例而言，將該泊洛沙姆溶解於獨立容器中，且接著將該溶液添加至萃取容器中。
在該方法之態樣中，萃取溶劑係在亞臨界條件下。在此製程中，一種溶劑較佳在室溫(或接近室溫)下為氣體，其可在高壓下壓縮成液體。可壓縮成液體之適合氣體為二氧化碳、甲烷、乙烷、丙烷、氨及以Freon®出售之致冷劑。典型溶劑對係以使得一種溶劑為藉由萃取移除組分之溶劑，而另一液體為非溶劑之方式選擇，或反之亦然。溶劑對之溶劑化 能力主要受該混合物中溶劑之比率控制。藉由使溶劑對穿過含有該等物質之產物，可萃取出溶解性相對較高之組分。氣態溶劑可在任何適合之亞臨界壓力下加壓。舉例而言，所用二氧化碳可為約25巴至約100巴之壓力。該壓力可為約25巴、30巴、35巴、40巴、45巴、50巴、55巴、60巴、65巴、70巴、75巴、80巴、85巴、90巴、95巴或100巴。在一些具體實例中，該壓力為約60巴至約85巴。在一些具體實例中，該壓力為約75巴。
任何適合之溫度均可用於進行該萃取製程。在一些具體實例中，萃取容器之溫度為10℃至80℃。該溫度可例如為約10℃，或約15℃，或約20℃，或約25℃，或約30℃，或約35℃，或約40℃，或約45℃，或約50℃，或約55℃，或約60℃，或約65℃，或約70℃，或約75℃，或約80℃。在一些具體實例中，萃取容器之溫度為約20℃至約50℃。當純化泊洛沙姆188時，例如萃取容器可具有約20℃至約60℃(例如，約40℃)之溫度。取決於萃取設備及所選萃取參數，其他溫度亦適合於純化泊洛沙姆188。熟習此項技術者應瞭解，該溫度可部分取決於萃取溶劑之組成以及給定泊洛沙姆在該製程中所採用之溶劑中的溶解度而變化。
類似於上文所論述之超臨界流體萃取方法，萃取可以等度方式進行，其中萃取溶劑之組成在整個萃取程序中保持恆定。舉例而言，藉由例如維持各自的恆定流動速率使萃取溶劑中二氧化碳及溶劑(例如，甲醇)之量在萃取時間內恆定。或者，可典型地藉由改變(例如，增加或減少)構成萃取溶劑之二氧化碳及/或其他溶劑(例如，甲醇)之量，隨時間改變萃取溶劑之組成。一般而言，二氧化碳保持恆定，而萃取溶劑中另一溶劑(例如，甲醇)之濃度在萃取時間內改變(例如，增加或減小)。可藉 由調整流動速率來改變各組分之濃度。溶劑之特定濃度及所採用的濃度梯度可類似於以上關於超臨界萃取方法所論述。適當地調整濃度及萃取時間以達到所需純度或產率在熟練技術人員之技能範圍內。
可在萃取製程期間收集樣品以監測物質之移除或確定是否有必要調整萃取參數，諸如溫度或萃取溶劑之組成。
特定言之，該等方法可以用於純化P188。該製程亦可應用於其他聚合物。混合溶劑系統之益處包括使用混合系統有效移除高分子量(HMW)物質及/或低分子量(LMW)物質。
在某些具體實例中，提供的方法提供一種用於製備純化之聚氧丙烯/組成物之方法。該方法包括：a)將溶解於第一溶劑中形成共聚物溶液之聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段共聚物組成物提供或引入萃取容器中，其中該第一溶劑為醇、脂肪酮、芳族酮、胺及其混合物，且該組成物含有：i)聚氧丙烯/聚氧乙烯嵌段共聚物，其中該共聚物之中間或平均分子量為約4,000Da至約10,000Da；及ii)複數種低分子量物質具有小於4,000Da之分子量，其中該複數種低分子量物質佔該組成物之總重量超過4%；b)添加第二溶劑，形成萃取混合物，其中該第二溶劑包含高壓二氧化碳及第一溶劑，且萃取溶劑中第一溶劑之濃度在萃取方法之時間內增加；及c)使萃取混合物分離以形成複數相，該等相包括萃餘物相及萃取物相，且萃餘物相及萃取物相係分開移除或分離。
當泊洛沙姆為純化之泊洛沙姆188時，該共聚物之中間或平均分子量為約7,680Da至9,510Da，諸如一般為8,400Da至8,800Da，例如為約8,400Da或為8,400Da。在該方法中，可在萃取容器中藉由添加該共聚物且藉由添加第一溶劑形成該共聚物之溶液或懸浮液來形成共聚物溶液，其中第一溶劑包含選自由甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合組成之群的烷醇。或者，將第一溶劑添加至共聚物中形成共聚物溶液可在獨立容器中進行，且將溶解於第一溶劑中之共聚物溶液提供或引入(亦即，裝入)萃取容器中。在一些情況下，在步驟c)之前，該方法包括在高壓及高溫下攪拌萃取混合物以自共聚物組成物中萃取雜質(例如，低分子量可萃取組分及其他組分)。
在某些態樣中，該方法不具有超臨界流體萃取製程之密度變化及滲透性特徵。溶劑再循環很容易且具有能量效益。在典型高壓萃取中，含有萃取之組分的出口物流經歷較低壓力，引起相分離且使更易揮發之溶劑以氣體形式分離。由此留下富含萃取之組分的另一溶劑。繼續萃取製程，直至該混合物中實質上耗盡可萃取之組分。氣態溶劑經壓縮回到液體狀態且可用於繼續萃取。該溶劑再循環製程為高效的，因為所選可壓縮溶劑在最小壓力變化下自溶劑混合物完全分離。
2.萃取容器及系統
對於本文所提供之任何方法，圖4中之系統200表示用於實施所提供之方法的一個具體實例。系統200為可用於使用超臨界流體或亞超臨界方法自泊洛沙姆萃取雜質(例如，LMW物質及/或其他組分)的一種系統。聚合物饋料泵201裝入待純化之泊洛沙姆(例如，P188)。泊洛沙姆 經由閥205輸送至聚合物饋料槽207中。使用萃取容器215自樣品移除萃取之雜質，諸如泊洛沙姆中之LMW物質或其他組分。二氧化碳(或其他超臨界液體或亞超臨界液體)泵208將經由閥243及預冷卻器203自外部二氧化碳供應器250裝入二氧化碳。二氧化碳自泵208抽吸至熱交換器210中且接著進入萃取器215中。甲醇(或其他適合溶劑)經由泵209抽吸至萃取器215中。在該等具體實例中，甲醇及二氧化碳在萃取器215中自泊洛沙姆萃取雜質，諸如LMW物質或其他組分。萃取之後，經由快速降壓處理排出且收集純化之泊洛沙姆混合物。使用收集器225、減壓容器227及旋風分離器231自溶劑流中分離萃取之組分。在收集器225中收集期間釋放的二氧化碳蒸氣可使用冷凝器232液化及再循環。
在一些具體實例中，萃取設備可包括溶劑分配系統，其含有某些形狀之粒子，在萃取容器之底部處形成「流體化」床。該床可藉由篩網或濾網或燒結之金屬盤支撐。用於該床之粒子可為完美形狀之球體或為具有不規則形狀(諸如卵石形)之粒子。為便於清潔，較佳具有光滑表面以及較小孔隙度或較小表面粗糙度。該等益處可在醫藥製造製程中得到證實。
所選擇的形成該床之粒子之密度應高於溶劑密度，由此使該床在萃取製程期間保持不受輸入溶劑流之干擾。粒子之大小可為均一的或可具有不同大小之分佈以控制該床之填充密度及孔隙度。填充分佈佈置經設計以提供均衡、最佳之萃取及隨後在離開萃取容器之前溶劑粒子之聚結。此有助於在裝入泊洛沙姆情況下萃取器之最大負載。此亦可使萃取效率最大，使萃取時間減到最少且使萃取容器外純化產物之不合需要的殘留 減到最少。
該床中球體之大小係基於一種或多種系統特性選擇，包括萃取容器之尺寸、溶劑液滴在萃取容器中之滯留時間及溶劑液滴聚結之能力。球體之直徑可在約5mm至約25mm範圍內。該直徑可為平均直徑，其中該床含有不同大小之球體。或者，該床中之所有球體可具有相同直徑。溶劑分佈床中具有不同大小之不鏽鋼球體之截面的實施例示於圖5中。
因此，提供高效溶劑萃取設備。該設備包括：a)在萃取器底部處之分配系統，其中該分配系統包含複數個球體；及b)在萃取器頂部處之粒子聚結系統。
在一些具體實例中，該複數個球體包括金屬球體、陶瓷球體或其混合物。在一些具體實例中，該複數個球體為相同大小。在一些具體實例中，該複數個球體包括具有不同大小之球體。在一些具體實例中，該粒子聚結系統包括選自除霧墊、靜態噴霧器及溫度區之一個或多個成員。
3.萃取及萃取劑之移除
本文所提供之任何方法均可以分批方法或以連續方法進行。在一些具體實例中，該方法為分批方法。分批方法可用如上文所描述的具有各種尺寸及大小之萃取容器進行。舉例而言，該設備系列可含有120L之高壓萃取器。將泊洛沙姆(例如，P188)溶液提供或引入萃取容器中，該泊洛沙姆溶液為溶解於適當溶劑(例如，烷醇溶劑，諸如甲醇)中之泊洛沙姆。將萃取溶劑，諸如以上方法中所描述之任何溶劑(例如，超臨界或高壓二氧化碳及甲醇)獨立地且連續地抽吸至維持在受控溫度、流量及壓力之萃取容器中。如本文中所描述，藉由改變萃取溶劑組成來移除各物 質。或者，亦可獨立地或組合改變萃取製程條件，諸如溫度及壓力。如下所述，在移除各物質之後，將純化之產物排至適宜設計之旋風分離器中以將純化之產物與二氧化碳氣體分離。乾燥該產物以移除殘餘烷醇溶劑。
在一些具體實例中，該萃取方法為連續方法。在典型連續萃取中，在填充有適合填充材料之高壓萃取管柱之中點處裝載泊洛沙姆(例如，P188)溶液，該泊洛沙姆溶液為溶解於適當溶劑(例如，烷醇溶劑，諸如甲醇)中之泊洛沙姆。以逆流方式將萃取溶劑自底部抽吸穿過萃取管柱。萃取之材料(諸如LMW物質或其他組分)在該管柱之頂部處移除，且純化之產物自該管柱之底部移出。在萃取器管柱之底部處連續地收集純化之產物且定期移出並排至專門設計之旋風分離器中。隨後在真空下乾燥含有殘餘甲醇的純化之聚合物粒子。
取決於所需的純化之泊洛沙姆產物之純度，可對給定批料反覆進行萃取步驟。亦即，可將萃取溶劑之額外部分引入萃取容器中且移除，直至獲得足夠的泊洛沙姆純度。因此，本文提供之方法的一些具體實例提供如上文所描述之萃取方法，其中在步驟c)之後，該方法進一步包括重複步驟b)及步驟c)。可重複步驟b)及步驟c)，直至泊洛沙姆足夠純。舉例而言，步驟b)及步驟c)可重複一次，或兩次，或三次，或四次，或五次，或以迭代方式重複。
當泊洛沙姆材料足夠純時，準備該產物用於進一步處理。在一些具體實例中，該產物係根據圖1中概述之製程100進行處理。如步驟145中所示，該產物可自萃取容器排出且收集於適當接收器中。如步驟150中所示，可對潮濕產物進行取樣以測試純度、化學穩定性或其他特性。可 藉由在真空下移除殘餘溶劑來乾燥產物。可調整真空度以控制乾燥速率。必要時，可在環境溫度下或在高溫下進行乾燥。一般而言，保持乾燥溫度低於泊洛沙姆之熔點。潮濕產物可以單一批次或分數個較小部分以子批形式乾燥。如步驟160至步驟170中所示，產物之乾燥可例如在真空下，在環境溫度下子批起始。隨著該製程之進展，接著可繼續在較高溫度及較低壓力下乾燥。必要時，例如若子批進行收集，則如製程100之步驟175中所示，可以類似方式處理潮濕產物之任何殘留部分。如步驟180中所示，在適合容器中混合所得產物，諸如已經合併之各個子批，且所得產物可經表徵、儲存、輸送或調配。
有利地，本文所揭示之方法有效地再循環二氧化碳。詳言之，可藉由使萃取物相經歷溫度及壓力變化來回收超臨界二氧化碳或高壓二氧化碳。在某些具體實例中，本文中採用之方法具有大於80%，較佳大於90%且最佳大於95%之再循環效率。
在本文提供之方法(參見例如以上步驟a)至步驟c))中，萃取物相可經進一步處理。該等方法可進一步包括：使萃取物相穿過由若干分離容器組成之系統；分離雜質(例如，低分子量雜質)；處理純化之材料或萃餘物；及回收壓縮之二氧化碳供再次使用。
在本文所提供之任何方法中，可評估各種參數以評價該等方法及所得產物。舉例而言，可評估諸如甲醇濃度、梯度特徵、溫度及壓力之參數以進行製程優化。亦可評估用於乾燥潮濕萃餘物之製程及適合條件，諸如真空度、混合模式、時間及溫度。
4.用於製備純化之泊洛沙姆的例示性方法
上文所提供之方法使得產生特定純化之泊洛沙姆製劑且詳言之LCMF P188製劑。詳言之，本文所提供之方法可用於純化如本文中所描述之P188共聚物，其具有式：HO(CH2CH2O)a'-(CH2CH(CH3)O)b-(CH2CH2O)aH，且該共聚物中間或平均分子量為7,680Da至9,510Da，諸如一般為8,400Da至8,800Da，例如為約8,400Da或為8,400Da，且其含有分子量小於4,000Da之複數種低分子量物質，其中該複數種低分子量物質佔組成物總重量超過4%。
在一些具體實例中，本發明方法產生具有小於約4%，諸如小於約3%、2%或1%之低分子量組分的純化之泊洛沙姆。典型地，該等低分子量組分包括二醇及易揮發之降解雜質，諸如甲醛、乙醛、丙醛、丙酮、甲醇及過氧化物。在某些情況下，本文中之製程製造出實質上不含低分子量組分，亦即小於4%、3%、2%或1%之前述組分的泊洛沙姆。該等方法亦可製造出實質上不含長循環材料之泊洛沙姆，使得當將純化之泊洛沙姆投予受試者時，泊洛沙姆中不存在作為或產生血液血漿半衰期比泊洛沙姆分佈中主要組分之半衰期長超過5.0倍，諸如一般不超過4.0倍、3.0倍、2.0倍或1.5倍之材料的組分。以下論述詳細描述製造此類純化之泊洛沙姆的例示性方法。
a.低分子量(LMW)組分之移除
圖2描繪了可用於移除泊洛沙姆中之LMW物質的本文中之方法的某些具體實例，其提供製程100'。如步驟105'中所示，對萃取系統進行加壓，隨後如步驟110'中所示，將第一烷醇(例如，甲醇)施配至饋料混合槽中。將系統加熱至適合於萃取製程之溫度，該溫度為高於該製程中所 使用之二氧化碳之臨界溫度的溫度，即約31℃。典型地，該溫度不超過40℃。在製程中，該溫度一般保持恆定。
在製程100'中，根據步驟115'，使用第一烷醇(例如，甲醇)形成泊洛沙姆溶液。在此製程中，將P188泊洛沙姆施配至含烷醇(例如，甲醇)之饋料槽中產生溶解於該烷醇(例如，甲醇)中之P188泊洛沙姆溶液。用於該方法中之泊洛沙姆的量可為任何量，諸如上文所描述之任何量。在形成泊洛沙姆/烷醇混合物之後，如步驟120'中所示，將該混合物之全部或部分抽吸至萃取器中。在一些情況下，可藉由將固體狀之泊洛沙姆引入萃取器中，隨後與烷醇混合，在萃取容器中形成泊洛沙姆溶液。
接著，如製程100'之步驟125'中所示，對萃取器加壓且將萃取溶劑引入萃取器中。萃取溶劑典型地含有二氧化碳且萃取係在大於如上文所描述的31℃之臨界溫度的溫度及大於74巴之臨界壓力的高壓下進行。舉例而言，在例示性方法中，萃取容器加壓至約310±15巴，且二氧化碳以20kg/h至50kg/h，諸如一般約或近似24kg/h(亦即，390g/min)之流動速率提供。
接著，在充當二氧化碳之共溶劑改質劑之第二烷醇存在下進行萃取。第二烷醇(諸如甲醇)係以逐步梯度方式添加，使得萃取溶劑中第二烷醇之濃度在萃取方法之時間內增加。舉例而言，如步驟130'至步驟140'中所示，萃取溶劑之組成可變化。舉例而言，如步驟130'中所示，泊洛沙姆(例如，P188)之萃取製程在含超臨界液體(例如，二氧化碳)之萃取溶劑中使用約5wt%至7wt%(w/w)(例如，約6.6%)之烷醇(例如，甲醇)起始。在規定時間段之後，萃取溶劑中之烷醇(例如，甲醇)含量升 高約1%-3%，諸如1%(例如，達到7.6%)。在最終時間段期間，烷醇(例如，甲醇)含量再次隨後升高約1%-3%，諸如1%(例如，達到8.6%)。萃取方法之總時間可為15小時至25小時。每一梯度執行總時間之一部分。
對於商業上高效之純化製程，需要連續增加甲醇濃度，其中該特徵經適當地改進以選擇性移除大部分低分子量組分。殘餘的低分子量組分隨後可在高甲醇濃度下以短時間移除。因此，使用了逐步甲醇濃度分佈以高產率製造純化之產物，同時不會明顯地降低總產率且不會富集高分子量組分，其中約5%-10%(例如，6.6%)甲醇使用12小時，較高甲醇濃度使用10小時且最後，甚至更高甲醇濃度使用4小時。
如製程100'中所示，當泊洛沙姆材料足夠純時，準備該產物用於進一步處理。如步驟145'中所示，該產物可自萃取容器排出且收集於適當接收器中。如步驟150'中所示，可對潮濕產物進行取樣以測試純度、化學穩定性或其他特性。如本文中所描述，可藉由在真空下移除殘餘溶劑來乾燥產物。在例示性方法中，如步驟160'至步驟170'中所示，乾燥可在真空下，在環境溫度下子批起始，且隨著該製程之進展，接著可在較高溫度及較低壓力下乾燥。如製程100之步驟175'中所示，可以類似方式處理殘留的子批。如步驟180'中所示，可在適合容器中合併及混合各子批，且所得產物可經表徵、儲存、輸送或調配。
b.無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆的製備
圖3描繪用於製備LCMF泊洛沙姆之具體實例。本文中之方法的某些具體實例提供製程100"，其產生不含在投予受試者之後在血漿或血液中產生長循環材料(如本文中所描述)之任何組分的泊洛沙姆。如步 驟105"中所示，將泊洛沙姆及第一烷醇(例如，甲醇)施配至萃取容器中且形成泊洛沙姆溶液。在此製程中，將P188泊洛沙姆施配至含烷醇(例如，甲醇)之萃取容器中產生溶解於該烷醇(例如，甲醇)中之P188泊洛沙姆溶液。用於該方法中之泊洛沙姆的量可為如本文中所描述的任何量。在一些情況下，泊洛沙姆溶液可在獨立容器中形成，且將該泊洛沙姆溶液轉移至萃取容器中。
在施配第一烷醇(例如，甲醇)及泊洛沙姆之後，如步驟110"中所示，對萃取系統進行加壓。如步驟115"中所示，將系統加熱至適合於萃取製程之溫度，該溫度為高於該製程中所使用之二氧化碳之臨界溫度的溫度，即約31℃。典型地，該溫度在35℃與45℃之間。在製程中，該溫度一般保持恆定。泊洛沙姆溶液係在約49巴之加壓二氧化碳及介於35℃至約45℃或45℃之間的溫度下，在規定時間段內，一般不到數小時內形成。
接著，如製程100"之步驟120"中所示，對萃取器加壓且將萃取溶劑引入萃取器中。萃取溶劑典型地含有二氧化碳及第二烷醇，且萃取在大於31℃之臨界溫度的溫度(如上文所描述)及大於74巴之臨界壓力的高壓下進行。舉例而言，在例示性方法中，萃取容器加壓至約247±15atm bar(範圍在240巴至260巴之間)，且二氧化碳以50kg/h至120kg/h(包括端點在內)，諸如一般約或近似地100kg/h之流動速率提供。
萃取在充當二氧化碳之共溶劑改質劑之第二烷醇存在下進行。如步驟125"至步驟135"中所示，第二烷醇(諸如甲醇)係以逐步梯度方式添加，使得萃取溶劑中第二烷醇之該在萃取方法之時間內增加。舉例而言，如步驟125"至步驟135"中所示，萃取溶劑之組成可變化。舉例而言， 如步驟125"中所示，泊洛沙姆(例如，P188)之萃取製程在含超臨界液體(例如，二氧化碳)之萃取溶劑中使用約7wt%至8wt%(例如，為約7.4wt%或為7.4wt%)(w/w)之烷醇(例如，甲醇)起始。在規定時間段之後，萃取溶劑中之烷醇(例如，甲醇)含量升高約1%-3%，諸如最多2%(例如，達到9.1%)。在最終時間段期間，烷醇(例如，甲醇)含量再次隨後升高約1%-3%，諸如最多2%(例如，達到10.7%)。萃取方法之總時間可為15小時至25小時，包括端點在內。每一梯度執行總時間之一部分。
對於移除除低分子量組分外之組分(包括當投予時產生較長循環形式之組分)的萃取製程，需要具有一種使純度及該等組分之移除最大化，同時使產率降低減到最小的製程。已發現，當以比其他方法中高的烷醇濃度起始時，連續增加烷醇(例如，甲醇)濃度一般以7wt%至8wt%起始，該特徵經適當地改進以選擇性移除該等組分及低分子量組分，同時使產率降低減到最小。舉例而言，此類例示性方法可產生大於55%且一般大於60%或65%之產率。殘餘的低分子量組分隨後可在高甲醇濃度下以短時間移除。因此，逐步的甲醇濃度分佈以高產率製造純化之產物，同時不會明顯減少總產率，其中約7%-8%(例如，7.4%)之甲醇使用約3小時，較高甲醇濃度(例如，9.1%)使用約4小時且最後，甚至更高之甲醇濃度(例如，10.7%)使用約8小時。
如製程100"中所示，當泊洛沙姆材料足夠純時，準備該產物用於進一步處理。如步驟140"所示，該產物可自萃取容器排出且收集於適當接收器中。如步驟145"中所示，產物可經由氣體飽和溶液造粒(particles from gas saturated solution，PGSS)技術在減壓下沈澱。如本文中所描述，可 藉由在真空下移除殘餘溶劑來乾燥產物。在例示性方法中，如步驟150"至步驟165"中所示，乾燥可在真空下，在介於35℃至45℃之間的高溫下起始。如步驟160"中所示，可收集乾燥產物。如步驟165"中所示，所得產物可經表徵、儲存、輸送或調配。
5.用於確定LCMF泊洛沙姆之身分的方法
為了確定由本文中之方法或其他方法製備的泊洛沙姆188製劑為LCMF泊洛沙姆188，可對該泊洛沙姆之特性進行評估。該等特性包括但不限於，當投予人類或動物模型時不存在較長循環材料；在逆相(reverse phase，RP)-HPLC中該泊洛沙姆之行為與含有LCM材料之泊洛沙姆製劑(諸如美國專利號5,696,298中所描述之泊洛沙姆，及可商購之泊洛沙姆188，例如以商標Pluroruc®F-68、Flocor®、Kolliphor及Lutrol®出售的該等泊洛沙姆)的比較；及在RP-HPLC中於本文中之例示之條件下的行為(亦即，參見實施例7)。確定該製劑不含LCM材料之任何方法均可使用。
E.醫藥組成物及調配物
提供含有泊洛沙姆P188，諸如藉由本文提供之方法製備之任何泊洛沙姆的組成物。詳言之，本文提供含有LCMF泊洛沙姆，詳言之LCMF泊洛沙姆P188之組成物。該等組成物用於治療P188已知或能夠治療之任何疾病或病況(裝入F部分中所描述之任何疾病或病況)且用於該治療方法中。
1.調配物
含有P188(諸如LCMF P188)之醫藥組成物可以任何習知方式，藉由將選定量之泊洛沙姆與一種或多種生理上可接受之載劑或賦形 劑混合來調配。載劑或賦形劑之選擇在投藥專業人員之技能範圍內且可取決於多種參數。該等參數包括例如投藥模式(亦即全身、經口、鼻、肺、局部、表面或任何其他模式))及欲治療之症狀、病症或疾病。
將有效濃度之P188(諸如LCMF P188)與適合醫藥載劑或媒劑混合以用於全身、表面或局部投予。適合於投予共聚物之醫藥載劑或媒劑包括熟習此項技術者已知適合於特定投予模式的任何此類載劑。包括治療有效量之P188(諸如LCMF P188)之醫藥組成物亦可以在即將投予之前諸如用無菌水復水之凍乾粉末形式提供。
該化合物可以微粉化或其他適合形式懸浮或可經衍生化以產生更易溶之活性產物。所得混合物之形式取決於多種因素，包括預定投予模式及P188(諸如LCMF P188)在選定載劑或媒劑中之溶解度。所得混合物為溶液、懸浮液、乳液及其他此類混合物，且可調配為非水性或水性混合物、乳膏、凝膠、軟膏、乳液、溶液、酏劑、洗劑、懸浮液、酊劑、糊劑、泡沫劑、氣霧劑、沖洗劑、噴霧劑、栓劑、繃帶，或適合於全身、表面或局部投予之任何其他調配物。對於局部內部投予，諸如肌肉內、非經腸或關節內投予，泊洛沙姆可調配為於諸如等滲緩衝生理食鹽水之含水介質中之溶液懸浮液，或可與意欲用於內部投予之生物相容性載體或生物黏附劑組合。
一般而言，醫藥學上可接受之組成物係鑒於管理機構或其他機構之批准製備，或根據一般用於動物及人類中之公認藥典來製備。醫藥組成物可包括載劑，諸如稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒劑，在該等載劑存在下，投予同功異型物。此類醫藥載劑可為無菌液體，諸如水及油，包括石 油、動物、蔬菜或合成來源之油，諸如花生油、大豆油、礦物油及芝麻油。當醫藥組成物經靜脈內投予時，水為典型載劑。亦可採用生理食鹽水溶液及右旋糖水溶液以及甘油溶液作為液體載劑，尤其用於可注射溶液。組成物除活性成分外，可含有：稀釋劑，諸如乳糖、蔗糖、磷酸二鈣或羧基甲基纖維素；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂、硬脂酸鈣及滑石；及黏合劑，諸如澱粉、天然樹膠(諸如阿拉伯膠明膠)、葡萄糖、糖蜜、聚乙烯吡咯啶酮、纖維素及其衍生物、聚維酮(povidone)、交聯普維酮(crospovidone)，及熟習此項技術者已知的其他此類黏合劑。適合之醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、稻穀、麵粉、白堊、矽膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水及乙醇。必要時，組成物亦可含有少量潤濕劑或乳化劑，或pH緩衝劑，例如乙酸鹽、檸檬酸鈉、環糊精衍生物、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、三乙醇胺乙酸鈉、三乙醇胺油酸鹽及其他此類試劑。該等組成物可呈溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、散劑及持續釋放調配物之形式。可調配含有治療化合物與諸如乳糖或澱粉之適合粉末基質之粉末混合物的膠囊及藥包(由例如明膠構成)用於吸入器或吹入器中。此類組成物將含有呈本文所描述之形式(包括LCMF形式)的治療有效量之P188，以及適合量之載劑，以便提供適當投予受試者或患者之形式。
所選調配物應適合投藥模式。舉例而言，可調配含有P188(諸如LCMF P188)之組成物以藉由注射(例如，藉由快速注射或連續輸注)非經腸投予。可注射組成物可呈如於油性或水性媒劑中之懸浮液、溶液或乳液的形式。視需要，可併入緩衝劑、防腐劑、抗氧化劑及適合成分， 或者其可構成該調配物。
適合於非經腸投予之調配物包括但不限於，水性及非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使該調配物與預定投予途徑相容之溶質。該等調配物可提供於單位劑量或多劑量容器中，例如密封安瓿及小瓶、預填充注射器或其他遞送裝置，且可在水溶液、乾燥或冷凍乾燥(凍乾)條件中儲存，只需在即將使用之前添加無菌液體載劑，例如注射用水。
P188，諸如LCMF P188可調配作為組成物中之唯一醫藥活性成分，或可與其他活性成分組合。
脂質體懸浮液，包括組織靶向之脂質體，亦適合作為醫藥學上可接受之載劑。此等載劑可根據熟習此項技術者已知之方法來製備。舉例而言，脂質體調配物可如美國專利第4,522,811號中所述來製備。脂質體遞送亦可包括緩慢釋放調配物，包括醫藥基質(諸如膠原蛋白凝膠)及用纖維結合蛋白改質之脂質體(參見例如，韋納等人(1985)J Pharm Sci.74(9)：922-925)。本文提供之組成物可另外含有促進遞送之一種或多種佐劑，諸如但不限於，惰性載劑或膠態分散系統。此類惰性載劑之代表性及非限制性實例可選自水、異丙醇、氣態碳氟化合物、乙醇、聚乙烯吡咯啶酮、丙二醇、凝膠製造材料、硬脂醇、硬脂酸、鯨蠟、脫水山梨糖醇單油酸酯、甲基纖維素以及其中兩種或超過兩種之適合組合。
醫藥學上可接受之載劑中包括足以發揮治療有用之作用且對所治療之受試者無不合需要之副作用之量的P188，諸如LCMF P188。治療有效濃度可藉由在已知之試管內及活體內系統(諸如本文提供之分析) 中測試該等化合物，憑經驗確定。
2.劑量
本文提供的含有P188(諸如LCMF P188)之醫藥組成物可調配用於單次劑量(直接)投予、多劑量投予或用於稀釋或其他改進。該等調配物中化合物之濃度可有效遞送當投予時有效用於預定治療之量。熟習此項技術者可容易地調配根據本文中之方法投予的組成物。舉例而言，為了調配組成物，將一定重量分率之化合物或其混合物以有效濃度溶解、懸浮、分散或以其他方式混合於選定媒劑中，以使得觀察到預定作用。
所投予之治療劑的精確量或劑量取決於所治療之病況、投予途徑，及其他考慮因素，諸如受試者之體重及生理狀態以及該受試者。
必要時，可憑經驗確定或外推具體劑量及持續時間以及治療方案。舉例而言，必要時，可使用P188(諸如本文提供之LCMF P188)之例示性劑量作為起始點來確定特定受試者及病況之適當劑量。治療持續時間及注射之間的時間間隔將隨疾病或病況之嚴重程度及受試者對治療之反應而變化，且可作相應地調整。當確定劑量時，可考慮諸如P188(諸如LCMF P188)之活性程度及半衰期之因素。具體劑量及方案可由熟習此項技術者憑經驗確定。
詳言之，所調配的供投予之泊洛沙姆的濃度範圍可為約10.0mg/mL至約300.0mg/mL，諸如為或為至少10.0mg/mL、15.0mg/mL、20.0mg/mL、25.0mg/mL、30.0mg/mL、35.0mg/mL、40.0mg/mL、45.0mg/mL、50.0mg/mL、55.0mg/mL、60.0mg/mL、65.0mg/mL、70.0mg/mL、75.0mg/mL、80.0mg/mL、85.0mg/mL、90.0mg/mL、95.0mg/mL、100.0mg/mL、105.0 mg/mL、110.0mg/mL、115.0mg/mL、120.0mg/mL、125.0mg/mL、130.0mg/mL、135.0mg/mL、140.0mg/mL、145.0mg/mL、150.0mg/mL、155.0mg/mL、160.0mg/mL、165.0mg/mL、170.0mg/mL、175.0mg/mL、180.0mg/mL、185.0mg/mL、190.0mg/mL、195.0mg/mL、200.0mg/mL、205.0mg/mL、210.0mg/mL、215.0mg/mL、220.0mg/mL、225.0mg/mL、230.0mg/mL、235.0mg/mL、240.0mg/mL、245.0mg/mL、250.0mg/mL、255.0mg/mL、260.0mg/mL、265.0mg/mL、270.0mg/mL、275.0mg/mL、280.0mg/mL、285.0mg/mL、290.0mg/mL、295.0mg/mL或300.0mg/mL。典型地，該濃度不超過22.5%，亦即225mg/mL。
舉例而言，當分開或作為本文所描述之醫藥組成物之一種組分投予時，泊洛沙姆一般以介於約0.5%至25.0%之間，諸如0.5%至20%或25%之濃度投予，不過亦可使用更稀或更高濃度。舉例而言，投予的泊洛沙姆之濃度以重量/體積計可介於約0.5%至約25%之間，諸如以重量/體積計為至少0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10.0%、10.5%、11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%、15%、15.5%、16%、16.5%、17%、17.5%、18%、18.5%、19%、19.5%、20%、20.5%、21.0%、21.5%、22.0%、22.5%、23.0%、23.5%、24.0%、24.5%或25.0%。在其他具體實例中，投予的泊洛沙姆之濃度以重量/體積計介於約0.5%至約10%之間，諸如以重量/體積計為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10.0%。在又其他具體實例中，投予的泊洛沙姆之濃度以重量/體積計介於約5%至約15%之間，諸如以重量/體積計為5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、10.0%、10.5%、 11%、11.5%、12%、12.5%、13%、13.5%、14%、14.5%或15%。在其他具體實例中，投予的泊洛沙姆之濃度介於16%至25%之間，諸如以重量/體積計為22.5%。舉例而言，該濃度為10%至22.5%，諸如為10%至20%或15%至20%。
在一個實施例中，泊洛沙姆可調配為意欲在稀釋或不稀釋情況下投予的無菌、非致熱溶液。最終劑型可在100mL小瓶中製備，其中該100mL含有15g(150mg/mL)純化之泊洛沙姆188(諸如LCMF P188)、308mg氯化鈉USP、238mg檸檬酸鈉USP、36.6mg檸檬酸USP及補足至100mL之USP級注射用水。該溶液之pH值為約6.0且容積滲透濃度為約312mOsm/L。對於其他應用，製備至少500ml，其濃度為10%至20%，諸如為約15wt%或為15wt%之泊洛沙姆製劑/體積組成物。舉例而言，對於靜脈內投予，該組成物經調配以在使用100mg/kg起始劑量輸注該組成物1小時，隨後使用30mg/kg/h之維持輸注達48小時之時達到目標Css。熟練的醫師或藥劑師或其他熟習此項技術者可針對特定受試者、所治療病況及目標循環濃度選擇適當濃度。
3.劑量及投藥
在本文中之方法中，泊洛沙姆188，諸如本文所描述之LCMF P188可投予受試者以治療疾病或病況，包括如F部分中所描述之疾病或病況。詳言之，泊洛沙姆188，諸如本文所描述之純化之泊洛沙姆188意欲用於可使用或已使用其他P188組成物進行治療之治療方法中。
用泊洛沙姆188(諸如本文所描述之純化之泊洛沙姆188)治療疾病及病況(諸如F部分中所描述之任何疾病及病況)可使用如本文 中所描述之適合調配物，藉由任何適合之投予途徑實現，包括但不限於，非經腸投予，包括靜脈內及動脈內(經由導管引導之投予或其他途徑)投予；肺內投予；經口投予；或透皮投予。治療典型地由靜脈內投予實現。
所包括的活性劑，例如泊洛沙姆188，諸如P188的量足以使其發揮治療有用之作用，且對所治療之患者無不合需要的副作用。欲投予用於任何疾病或病況之P188(諸如LCMF P188)之量可藉由標準臨床技術確定。此外，可採用試管內分析及動物模型幫助鑑別最佳劑量範圍。精確劑量可憑經驗確定，此可取決於具體組成物、投予途徑、所需的投予持續時間、欲治療之疾病之類型及疾病之嚴重性。
由於參加早期臨床試驗中之一小組患者出現腎功能不全，實際限制已限制根據國家處方集規範(National Formulary specifications)(P188-NF)(Emanuele及Balasubramaniam,Drugs RD 14(2)：73-83(2014))製造的泊洛沙姆188之臨床使用。此外，動物研究揭示，P188-NF使血清肌酸酐含量增加且在藥物輸注結束時，肌酸酐無法自腎臟有效清除。本文所描述之純化之泊洛沙姆188已經改進而解決了P188-NF之缺點。為防止肌酸酐含量升高及腎毒性，對泊洛沙姆188進行純化以移除低分子量及高分子量物質污染物。在臨床研究中，例如在C97-1248研究中，研究人員發現，靜脈內投予P188-P不會誘導血清肌酸酐明顯增加超過安慰劑之水準。基於藉由高效液相層析法進行之評估，減少低分子量及高分子量物質降低或消除了與未純化之(P188-NF)治療有關之腎風險。因此，純化之泊洛沙姆188，諸如本文所描述之LCMF泊洛沙姆188不會展現先前評估之未純化形式中所存在之實際限制。
必要時，可憑經驗確定或外推具體劑量及持續時間以及治療方案。先前投予人類受試者及用於臨床試驗中之泊洛沙姆188的劑量可用作確定泊洛沙姆188，諸如本文所描述之純化之泊洛沙姆188之劑量的指導。亦可由相關動物研究確定或外推泊洛沙姆188之劑量。可使用諸如泊洛沙姆188之活性程度及半衰期之因素進行此類確定。可基於多種因素，憑經驗確定具體劑量及方案。此類因素包括個體之體重、一般健康狀況、年齡、所用特定化合物之活性、性別、飲食、投藥時間、排泄速率、藥物組合、疾病之嚴重程度及病程、患者對疾病之處置及治療醫師之判斷。活性成分泊洛沙姆188典型地與醫藥學上有效之載劑組合。可與載劑材料組合以製造單一劑型或多劑型的活性成分之量可取決於所治療之主體及具體投予模式而變化。
在具體實施例中，取決於欲治療之病況，泊洛沙姆，諸如P188(例如，P188)經調配用於以約100mg/kg或100mg/kg及最多2000mg/kg劑量向患者投予。劑量包括例如每千克患者體重100mg至500mg，例如每千克患者體重100mg至450mg，100mg至400mg，100mg至300mg，100mg至200mg，200mg至500mg，200mg至450mg，200mg至400mg，200mg至300mg，300mg至500mg，300mg至450mg，300mg至400mg，400mg至500mg，400mg至450mg，或450mg至500mg，諸如為至少或為至少約每千克患者體重100mg、125mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1000mg、1100mg、1200mg、1300mg、1400mg、1500mg、1600mg、1700mg、1800mg、1900mg及2000mg。
泊洛沙姆劑量係以適合投藥模式及患者之生理需要的濃度及流體體積投予。一般而言，對於長期輸注(諸如12小時、24小時或48小時連續輸注)，投予的體積典型地不超過約5.0mL/kg/h，諸如為4.5ml/kg/h、4.0ml/kg/h、3.5ml/kg/h、3.0ml/kg/h、2.5ml/kg/h、2.0ml/kg/h、1.5ml/kg/h、1.0ml/kg/h、0.5ml/kg/h、0.25ml/kg/h或0.125ml/kg/h。對於短期投藥(諸如快速注射投藥或短期輸注)，取決於患者之需要，泊洛沙姆之劑量可以大於5.0ml/kg/h，諸如7.5ml/kg/h，或10.0ml/kg/h，或12.5ml/kg/h，或15ml/kg/h，或甚至更高體積投予。泊洛沙姆可以單次劑量或經各種時間間隔，諸如每小時、每日、每週、每月或更長時間間隔重複之多次劑量投予。對於輸注，輸注可在一定時間段內向受試者提供適當劑量，該時間段典型地為1小時至72小時，諸如為12小時、24小時或48小時。
用於本文所提供之方法中的調配物可藉由任何適當途徑，例如經口、經鼻、肺、非經腸、靜脈內、皮內、皮下、關節內、腦池內、眼內、室內、鞘內、肌肉內、腹膜內、氣管內或表面，以及其中任何兩種或超過兩種之任何組合以液體、半液體或固體形式投予且以適合於每一投藥途徑之方式調配。多次投藥諸如本文所描述之重複投藥，可經由任何途徑或途徑組合實現。最適合的投藥途徑將取決於欲治療之疾病狀態而變化。典型地，該等組成物經調配用於靜脈內輸注。
有效量的泊洛沙姆，諸如P188且詳言之本文提供之LCMF P188，可單獨或與用於治療疾病或病況之其他藥劑組合遞送。選擇另一額外治療以與採用LCMF P188之治療方案一起投予在熟練技術人員之技能範圍內。該決定將取決於所治療之具體疾病或病況、所治療之特定受試者、 受試者之年齡、疾病或病況之嚴重程度及其他因素。
F.泊洛沙姆188及LCMF P188之方法及治療用途
泊洛沙姆188(P188)及其組成物，諸如LCMF P188及其組成物可用於多種應用，包括細胞保護、血液流變學(hemorheologic)、消炎、抗血栓/促纖維蛋白溶解應用，在多種疾病中具有臨床效用，包括但不限於，急性心肌梗塞、急性肢體缺血、休克、急性中風、心臟衰竭、鐮狀細胞疾病及神經退化性疾病。本文提供之P188，諸如藉由本文提供之方法製造的LCMF P188或任何P188可用於治療先前已使用P188或已知P188將有效的任何疾病或病況或應用。有關P188之若干應用已評述於例如Moloughney等人(2012)Recent Pat Biotechnol.6(3)：200-211及Karmarker,「Poloxamers and their applications」Pharmainfo.net,2008年10月27日公開，其中URL為pharmainfo.net/pharma-student-magazine/poloxamers-and-their-applications-0。P188之例示性應用包括但不限於，用於需要膜重新密封及修復之應用；治療組織缺血及再灌注損傷；減少發炎性反應；降低血液黏度；促進血栓溶解；促進止血；用作藥物、核酸或蛋白質遞送之媒劑；用作乳化劑；用於疏水性藥物之液體懸浮液穩定劑；清潔皮膚創傷；用作化妝品調配物中之界面活性劑；用於控制個人護理產品及肥皂之黏度；及作為輕瀉劑之醫藥應用(參見例如歐洲公開案號EP 0682946)。
P188，諸如LCMF P188可用於需要膜重新密封、穩定性及/或修復之應用中。此類應用藉由保護細胞免於凋亡及壞死性死亡來防止組織(諸如受損組織)中之細胞損失。舉例而言，P188可用於在電損傷或自由基損傷之後修復細胞膜(參見例如美國專利號5,605,687、美國專利公開 案號2006/0121016，及Lee等人(1992)Proc.Natl.Acad.Set USA 89：4524-4528)。P188亦可用於在軟骨損傷之後，諸如在創傷性關節損傷之後減少細胞死亡(參見例如，Isaac等人(2010)J Orthop Res.(4)：553-558)，例如以幫助預防骨關節炎。亦已使用P188響應於興奮性毒性，諸如麩胺酸毒性進行神經保護(Frim等人(2004)Neuro Repo1t.15：171-174)。亦已使用P188，藉由修復由錯誤摺疊之蛋白質破壞之膜，而作為治療退化性疾病，諸如阿茲海默氏病(Alzheimer's disease)的試劑(參見例如，美國專利公開案號20100316590)。
P188亦已用於治療及預防與肌縮蛋白表現減少有關之心肌病及心臟病(參見例如美國專利號7,846,426及8,580,245)且治療由除肌縮蛋白損失外之機制引起的慢性心臟衰竭(參見例如美國專利公開案號2009/0246162)。含有P188之組成物亦可用於抑制血栓形成，減小心肌梗塞大小，降低血液黏度及改善心肌梗塞之後受損組織之灌注(Justicz等人(1991)Am Heart J.122(3 Pt l)：671-680；O'Keefe等人(1996)Am.J.Cardiol.78：747-750)。
P188亦可用於細胞移植方法中以在該程序期間使經移植細胞質細胞膜的損害降到最低。舉例而言，含有P188之組成物可用於在脂肪組織、脂肪細胞、幹細胞及其他來源於脂肪組織之細胞之移植期間改善脂肪細胞之存活(參見例如美國專利號8,512,695及美國專利公開案號2010/0104542)，諸如軟組織重建或加強之應用。P188亦已用於改善帕金森氏病(Parkinson's disease)療法中經移植多巴胺激導性細胞之存活及神經再支配(Quinn等人(2008)Eur J Neurosci.27(1)：43-52)。
P188亦可用作治療劑以治療慢性微血管疾病，諸如但不限於，黃斑變性、糖尿病性視網膜病變及充血性心臟衰竭(參見例如美國專 利公開案號US2011/0212047)。亦已經描述使用P188諸如在腸系膜上動脈閉塞(superior mesenteric artery occlusion，SMAO)模型中治療組織缺血及再灌注損傷(參見例如Hunter等人(2010)Ann Clin Lab Sci.40(2)：115-125)。含有P188之組成物亦已用於治療骨胳肌病症，諸如杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)及相關病症(參見例如美國專利公開案號2011/0033412)。
亦已使用P188，藉由降低血液黏度，例如藉由防止血液中之黏附相互作用，來增加血流(參見例如美國公開案號2010/0183519)。此類應用可減少與血流減少相關，諸如與脂肪栓塞之產生(參見例如Adams等人(1960)Surg.Forum 10：585，及Danielson等人(1970)J Thorac Cardiovasc Surg.59(2)：178-184)及紅血球沈降(Hoppensteadt等人(2014)FASEB J.28(l)：增刊1139.6)相關之問題。P188亦已用於治療出血性休克(Mayer等人(1994)Ann Clin Lab Sci.24(4)：302-311)。
P188亦已用於治療鐮狀細胞疾病(sickle cell disease，SD)，該疾病係指純合型鐮狀細胞貧血(SS)以及混合雜合型狀態，諸如SC、及S-p地中海貧血(參見例如Adams-Graves等人(1997)Blood 90：2041-2046；Ballas等人，Hemoglobin 2004,28(2)：85-102；Gibbs及Hagemann,(2004)Ann.Pharmacother.38：320-324；Orringer JAMA.2001；286(17)：2099-2106)。
亦可藉由使用P188，例如藉由抑制吞噬細胞遷移及例如減少嗜中性白血球之流入及黏著性，來減少發炎性反應(參見例如Lane等人(1984)Blood.64：400-405；Schaer等人(1994)Circulation.90(6)：2964-2975)。
P188亦可用於創傷癒合及密封之療法中(參見例如美國臨 時專利申請號62/021,676、美國專利號8,758,738及美國專利公開案號20140056839)。
P188之其他應用包括其用作組織培養基添加劑，包括作為低溫儲存介質之補充劑(參見例如Kerleta等人(2010)ALTEX.27(3)：191-197)，以及血液及血液製品(諸如包裝之紅血球)之添加劑，以防止或減少儲存損傷影響之血液。
P188亦已用於各種化妝品及藥劑之調配物中。P188可用於增加醫藥組成物(參見例如美國專利公開案號20040258718、20090214685、20100087501、20100249240、20110008266、20120277199，美國專利號8,133,918、8,460,644及8,709,385)、核酸(參見例如美國專利公開案號20030206910及20060013883)、抗微生物劑(參見例如美國專利公開案號20060078616)及蛋白質(參見例如美國專利公開案號20100310669及2012/0141619，美國專利號8,137,677，及Jeong B.等人(2002)Adv Drug Del Rev,54(1)；37-51)之溶解性及生物利用率。P188可用作藥劑遞送，例如眼遞送(Qi等人(2007)Int.J.Pharm.337：178-187)、黏膜黏附遞送(Chang等人(2002)J.Controlled Rel.82：39-50)、直腸遞送(Choi等人(1998)Int.J.Pharm.165：23-32；Yong等人(2006)Int.J.Pharm.321：56-61；ElHady等人(2003)Saudi Pharmaceutical Journal.11：159-171；Yong等人(2004)Eur.J.Pharm.Sci.23：347-353；Yun等人(1999)Int.J.Pharm.189：137-145；及Paek等人(2006)Biological & Pharmaceutical Bulletin.29：1060-1063)及透皮遞送(Cappel等人(1991)Int.J.Pharm.69：155-167)之醫藥載劑。P188亦可用作液體口服劑、非經腸及表面劑型中之乳化劑、懸浮穩定劑，以及疏水性藥物之增溶劑。在
固體劑型中，P188可用作潤濕劑、塑化劑或錠劑潤滑劑，且由於熱可逆性膠凝行為而廣泛應用於凝膠之調配中(參見例如Desai等人(2007)Drug Deliv.14(7)：413-426；及Muzikova等人(2013)Acta Pol Pharm.70(6)：1087-1096)。
G.實施例
以下實施例係僅出於說明之目的而包括，且並不意欲限制本文中之發明之範疇。
實施例1 藉由用甲醇/超臨界CO 2 共溶劑萃取來純化泊洛沙姆188之連續製程
對藉由用甲醇/超臨界CO2共溶劑萃取來純化泊洛沙姆188之連續製程進行評價。該連續製程實現高輸貫量。在填充適合填充材料之高壓萃取管柱之中點處，抽吸泊洛沙姆188(Asahi Denka Kogyo,Japan)於甲醇中之饋料溶液。將超臨界CO2(Carboxyque,France)與甲醇之混合物以逆流方式自底部抽吸穿過萃取管柱(流動速率=30kg/h至40kg/h)。甲醇之平均濃度為13%且以9重量%至13.2重量%之梯度提供。藉由控制在管柱中間之饋料端口處甲醇、CO2及泊洛沙姆之流動速率及在管柱底部處引入之CO2/甲醇之流動速率來控制梯度。管柱壓力為200±15巴。饋料溶液及超臨界CO2/甲醇溶劑之溫度為36℃至44℃之梯度。管柱夾套溫度及萃取溫度為36℃至54℃之梯度。
在管柱之頂部處移除低分子量(LMW)聚合物，而含有甲醇之純化產物自萃取管柱之底部移出。每小時收集純化產物且經由氣體飽和溶液造粒(PGSS)技術使其在減壓下沈澱。在不超過40℃下真空乾燥純化產物以移除殘餘甲醇。
每批饋料經純化泊洛沙姆之近似產率為約60%。峰平均分子量為約9,000道爾頓。低分子量組分(小於4,500道爾頓)為約1.0%。多分散性為約1.0。
實施例2 評估甲醇之平衡濃度及對產物排出之影響
為了使純化之後在開放式環境中對純化之泊洛沙姆188的處置減到最少，測定純化之泊洛沙姆188產物中適合於在不打開蓋子情況下自萃取器平穩擠出產物的甲醇濃度。評估兩批泊洛沙姆188(約8,000Da及9,000Da)以鑑別萃取容器中泊洛沙姆188/甲醇/CO2之平衡濃度。在3,000psig(208巴)及4,500psig(311巴)下，向萃取容器中裝入每毫升萃取單元容量0.25公克泊洛沙姆188。在指定實驗中且在26小時操作期間，量測在萃取容器內裝入之聚合物188產物中甲醇之平衡濃度。結果顯示，在6.6%至8.6%甲醇/CO2下，在萃取容器中裝入之泊洛沙姆188產物中甲醇之平衡濃度為約25%至35%甲醇。
為了評估純化產物中之何種濃度適合於在不打開蓋子的情況下自萃取器排出產物，將12L萃取容器中留下的萃餘物之濃度調整至介於25%與35%之間的各種水準。經由快速降壓系統排出產物。評價乾燥特徵與排出條件之相關性。結果顯示，在較高甲醇濃度下，在25%至35%濃度範圍之較高端值下，約2600公克潮濕產物在不到10分鐘內排出，得到精細、自由流動之粉末。產物外觀不隨排出壓力在4500psi至1000psi(311巴至70巴)間變化而改變。較慢之排出速率及較低之甲醇濃度產生粗糙的粒子。
實施例3 溶劑分配系統對超臨界流體萃取(SFE)之影響
確定溶劑分配系統對使用甲醇/超臨界CO2共溶劑進行之超臨界流體萃取(SFE)之影響。該等分配系統可包括在底部填充的各種大小之金屬或陶瓷球體。可藉由選擇不同大小之球體或使用不同大小球體之混合物來精確控制該床之孔隙度。該系統之孔隙度控制氣泡大小及萃取效率。該等球體可容易地移除及清潔。比較各種分配系統對SFE製程之影響，及其在相較於總萃取材料萃取低分子量(LMW)材料方面之效率。效率典型地藉由指定目標低分子量物質之產率及輸貫量測定(%LMW組分<4,500道爾頓)。
A.方法
用3.08L單元，在以下條件下進行SFE製程：T=40℃，壓力=300巴，甲醇流動速率=總流動速率之6.6%(對於95g/min至100g/min之CO2流動速率，甲醇流動速率為6.5g/min至7g/min；對於140g/min至148g/min之CO2流動速率，甲醇流動速率為10g/min至10.5g/min)，單元長度=5'且ID=2"。藉由使用如下所示之不同溶劑分配系統進行該製程來進行一系列實驗：無系統；在單元底部處之不鏽鋼(stainless steel，SS)球體；帶有SS球體之鋁製抽吸濾網；帶有SS球體之抽吸篩網(40目)；具有6個孔(1/16"直徑)之曲管；或具有12個孔(1/16"直徑)之曲管。
藉由GPC及重力分析，對第一小時、第二小時第三小時及第四小時萃取所收集之萃取物樣品進行分析。計算重量平均分子量(Mw)、最高峰之分子量(Mp)及多分散指數(PD)(定義為Mw/數量平均分子量)。
B.結果
對於所測試的每一分配系統，彙總每一實驗之操作條件及參數，以及GPC及重力分析結果。
1.分配系統-無
Figure 104122001-A0202-12-0092-2
Figure 104122001-A0202-12-0092-3
2.分配系統-在單元底部處之1000個不鏽鋼球體
Figure 104122001-A0202-12-0092-4
Figure 104122001-A0202-12-0093-5
結果顯示，在單元底部處添加1000個SS球體用於較佳的CO2及甲醇分配使主要產物殘留減少且使製程效率增加59%。因此，結果顯示，該系統在萃取器底部處使用不鏽鋼SS球體提供高效的CO2/MeOH溶劑分配。
3.分配系統-在單元底部處之1000個不鏽鋼球體及較高CO 2 流動速率及線速度
Figure 104122001-A0202-12-0093-6
Figure 104122001-A0202-12-0093-7
結果顯示，該製程不如使用較低CO2流動速率及線速度之先前實驗中所描述之製程那麼高效。
4.分配系統-帶有SS球體之鋁製抽吸濾網
Figure 104122001-A0202-12-0094-8
Figure 104122001-A0202-12-0094-11
結果顯示，使用其中帶有SS球體之鋁製抽吸濾網代替僅在底部處使用1000個SS球體作為分配系統即使在較高線速度下亦使得該製程之效率增加4倍。舉例而言，該方法使得較少經萃取材料被移除，同時亦移除類似水準之LMW部分，亦即，在此實施例中，31.09公克經萃取材料相對於先前實驗中之120.88公克，且分別為17.1公克之經萃取LMW部分相對於23.09公克。因此，結果顯示，該系統在萃取器底部處使用鋁製抽吸濾網提供高效的CO2/MeOH溶劑分配。
5.分配系統-帶有SS球體之40目抽吸篩網
Figure 104122001-A0202-12-0095-12
Figure 104122001-A0202-12-0095-13
結果顯示，在使用40目抽吸篩網之分配系統中的萃取效率類似於如前一實施例中所描述的帶有SS球體之鋁製抽吸濾網。
6.分配系統-具有6個1/16"孔之曲管
Figure 104122001-A0202-12-0095-14
Figure 104122001-A0202-12-0096-17
結果顯示，具有6個1/16"直徑之孔的曲管不如先前之分配系統高效。
7.分配系統-具有12個1/16"直徑之孔的曲管
Figure 104122001-A0202-12-0096-15
Figure 104122001-A0202-12-0096-16
結果顯示，具有12個1/16"直徑之孔之曲管的效率略高於使用具有6個孔之分配系統之先前實驗，但不如抽吸篩網及不鏽鋼高效。
C.概述
在分配系統為帶有不鏽鋼球體之鋁製抽吸濾網或帶有不鏽鋼球體之抽吸篩網(參見例如實驗4及實驗5)的方法中觀察到最高純化效率。增加曲管分配系統中孔之數量在一定程度上亦增加純化效率(參見例如實驗7)。因此，結果顯示，分配系統在SFE設備中起作用且其設計使該製程之效率更高或更低。適合設計為帶有不鏽鋼球體之抽吸篩網或抽吸濾網。亦可使用曲管作為分配系統，但具有儘可能多的孔。對於所描述的大部分其他實驗，實驗係用抽吸篩網分配系統進行的。
實施例4 泊洛沙姆188之12L規模的雙步驟萃取分批純化製程
製程經設計以富集高分子量組分(>13,000道爾頓)。在典型萃取特徵中，在純化之後高分子量組分之增加不顯著。泊洛沙姆188之雙步驟分批純化製程係藉由控制甲醇濃度以12L規模進行。如藉由凝膠滲透層析法(GPC)所量測，泊洛沙姆188在萃取之前含有約1%之高分子量組分及5%之低分子量組分。
對含有帶攪拌之萃取容器、旋風分離器、CO2溶劑循環及甲醇共溶劑系統之12L萃取系統的滲漏情況進行測試。在操作開始時，該萃取系統用CO2加壓至310±15巴。將甲醇(2kg)施配至帶有內襯之饋料混合槽中且升溫至40℃。將約3700公克泊洛沙姆188添加至該饋料槽中且攪拌直至完全混合。將5100公克混合溶液抽吸至萃取器中。CO2流動速率維持在390gm/min。藉由調整甲醇濃度進行兩(2)次連續萃取。萃取在7.6%MeOH/CO2及27.6±1.0gm/min甲醇流動速率下進行12小時±30分鐘。萃取在8.6%MeOH/CO2下，以36.6±1.0gm/min之甲醇流動速率繼續進行12小時±15 分鐘。
在24小時純化之後，萃取器經由快速降壓系統(氣體飽和溶液造粒(PGSS))進行排放且潮濕產物收集在內襯中。將潮濕產物之樣品(約600gm)轉移至燒瓶中且使用旋轉蒸發器在室溫及中等真空下乾燥約3小時，隨後在室溫及高真空下乾燥30分鐘，且在35℃下再乾燥30分鐘。收集乾燥產物且藉由凝膠滲透層析法(GPC)測試其分子量分佈。在純化產物中未偵測到低分子量(LMW)組分。純化產物含有約4.5%之高分子量(HMW)組分。
實施例5 藉由用甲醇/超臨界CO 2 共溶劑萃取來純化泊洛沙姆188之分批製程
對藉由用甲醇/超臨界CO2共溶劑萃取來純化泊洛沙姆188之分批製程進行評價。藉由控制萃取溶劑溫度、壓力及甲醇共溶劑含量調整溶劑特徵來純化泊洛沙姆188(Asahi Denka Kogyo,Japan)。該等製程之壓力及共溶劑含量不同。
將泊洛沙姆188(13-14kg)與甲醇溶劑混合於高壓萃取容器中。混合甲醇及超臨界CO2(BOC gases,USA)共溶劑且抽吸穿過萃取容器。萃取在較低甲醇濃度下開始，連續增加甲醇濃度，同時監測在萃取期間移除之部分的組成。平均甲醇濃度為7.3%(以重量計)。濃度自6.6%至7.6%，再到8.6%逐步地增加。萃取容器壓力為300±15巴。甲醇/超臨界CO2溶劑溫度及萃取器夾套溫度為40±5℃。萃取溫度調整至35℃至45℃。藉由凝膠滲透層析法(GPC)分析洗提之部分。自萃取容器回收之純化之泊洛沙姆188的分子量分佈比起始物質窄。
所得產率為約75%。峰平均分子量為約9,000道爾頓。低分子量組分(小於4,500道爾頓)為約1.0%。多分散性為約1.0。
實施例6 泊洛沙姆188之12L規模的多步驟萃取分批純化製程及藉由凝膠滲透層析法(GPC)進行之分析
A.超臨界流體萃取(SFE)方法
在12公升萃取容器中，藉由SFE分批製程純化四批泊洛沙姆188。如下所述對每一批次進行純化。該系統用CO2加壓並且各批次間維持高於900psig(63巴)的壓力。將甲醇(2000±20gm)施配至帶有內襯之饋料混合槽中並升溫至40℃。將泊洛沙姆188(3696±20gm)施配至該饋料槽中並攪拌直至混合。將百分之九十(90%)泊洛沙姆188溶液抽吸至萃取器中，且將該系統加壓至310±15巴。CO2流動速率維持在390gm/min。藉由經6.6重量%、1.6重量%或8.6重量%逐步地控制性增加來調整甲醇濃度，進行三(3)次連續萃取。在每一甲醇濃度下，進行萃取規定時間段，如表15中所描述。在每次萃取期間，在指定時間之後自萃取器之底部收集製程中的樣品。
Figure 104122001-A0202-12-0099-19
在26小時之純化製程結束時，萃取器經由快速降壓系統排出，且將潮濕產物收集於內襯中。將一小批潮濕產物之樣品(約600g)轉 移至燒瓶中且使用旋轉蒸發器在室溫及中等真空下乾燥約3小時，隨後在室溫及高真空下乾燥30分鐘，且在35℃及高真空下再乾燥30分鐘。乾燥產物作為子批收集。用殘留的潮濕產物重複該乾燥製程，得到3個子批之乾燥產物。將該3個子批合併於10L轉鼓中且混合30分鐘以製造純化之泊洛沙姆188。每一饋料之產率為約55%。
B.純化產物之特性化
藉由凝膠滲透層析法(GPC)評估起始物質及純化之泊洛沙姆188產物。結果陳述於圖6A至圖6B中。
圖6A顯示起始泊洛沙姆188之GPC曲線。在GPC跡線中，將滯留時間針對不同分子量物質之相對量作圖。在x軸上滯留時間的增加對應於分子量降低。起始泊洛沙姆188之GPC跡線顯示狹窄的分子量分佈，其中在低分子量側具有一個較小的額外峰。
低分子量組分之曲線下面積為約4%-7%，且平均分子量小於4,500道爾頓。
圖6B顯示純化之泊洛沙姆188之GPC曲線。相較於可商購之泊洛沙姆188，純化之泊洛沙姆188具有更窄的分子量分佈。比較起來，純化之泊洛沙姆188的GPC跡線顯示較窄的分子量分佈且具有明顯較少量的低分子量峰(小於主峰面積之1.5%)。
實施例7 無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188之製備及投予
A.超臨界流體萃取(SFE)製程
藉由在247±15atm(約200巴至260巴)壓力及7.4重量%、 9.1重量%及10.7重量%甲醇之逐步控制性增加甲醇下進行萃取，來進行泊洛沙姆188之多步驟萃取分批製程。在純化之前，藉由凝膠滲透層析法(GPC)表徵泊洛沙姆188原材料(BASF公司，Washington,New Jersey)。分子量分析證實，原材料具有約8,500±750Da的主峰之平均分子量、不超過6.0%的小於4,500Da之低分子量(LMW)物質及不超過1%的大於13,000Da之高分子量物質(HMW)。此外，多分散性不超過1.2。
在50L的高壓不鏽鋼萃取容器中裝入14kg商品級泊洛沙姆188(BASF公司，Washington,New Jersey)及7kg甲醇，用CO2加壓(49±10atm，亦即，720±147psi)(Messer France,S.A.S.,Lavera,France)且加熱至35℃至50℃，保持40至80分鐘，直至獲得均質溶液。在熱交換器中冷卻CO2(由主供應槽或經由經萃取系統再循環來供應)且將其饋送至溫控、高壓不鏽鋼溶劑儲槽中。高壓泵將液體CO2之壓力增加至所需之萃取壓力。高壓CO2流藉由第二熱交換器加熱至製程溫度。將甲醇(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)自主供應槽饋送至CO2溶劑流中，以製造甲醇/CO2萃取共溶劑，在247±15atm(3600±psi)或240巴至260巴壓力及40℃溫度下，將其經進口系統以薄霧形式饋送至萃取容器中。
典型地在8kg/h(範圍為6.8kg/h至9.2kg/h；108kg/h總流動速率)之甲醇流動速率下，使7.4%甲醇/CO2萃取共溶劑滲透穿過泊洛沙姆溶液，持續3小時。用9.1%甲醇/CO2共溶劑，典型地在10kg/h(範圍為8.5kg/h至11.5kg/h；110kg/h總流動速率)之甲醇流動速率下，再繼續萃取4小時。用10.7%甲醇/CO2共溶劑，典型地在12kg/h(範圍為10.2kg/h至13.8kg/h；112kg/h總流動速率)之甲醇流動速率下，再繼續進行萃取8小時。 在整個萃取製程中，自萃取器之頂部連續地萃取可溶性物質。自萃取器之頂部移除萃取溶劑且使其通過串聯佈置的兩個高壓不鏽鋼旋風分離器以將系統壓力自247atm(3600psi)減小至59atm(870psi)且接著自59atm減小至49atm(720psi)，並將CO2與甲醇流分離。使分離的CO2冷凝，通過熱交換器且儲存於溶劑儲槽中。甲醇廢料流之壓力藉由通過另一旋風分離器而進一步減小。純化之泊洛沙姆188保留在萃取器中。
在萃取之後，純化之泊洛沙姆188溶液自萃取器底部排至配備有攪拌器之混合器/乾燥器單元中。經由氣體飽和溶液造粒(PGSS)技術，在減壓下沈澱泊洛沙姆188產物。沈澱物含有約20%至35%甲醇。在不超過40℃或45℃下真空乾燥純化之泊洛沙姆188以移除殘餘甲醇。產物之饋料產率為65%之平均產率。
藉由GPC測定的純化產物之分子量分析證實，該純化產物滿足接收規格。存在約8,500±750Da的主峰平均分子量及平均8,500±750Da之平均分子量。不超過1.5%的小於4,500Da之低分子量(LMW)物質及不超過1.5%的大於13,000Da之高分子量物質(HMW)。此外，多分散性不超過1.05。因此，結果顯示，該程序引起可量測的LMW物質減少，及純化產物多分散性之改善。
在150mg/mL純化之泊洛沙姆、3.08mg/mL氯化鈉、2.38mg/mL檸檬酸鈉(二水合物)及0.366mg/mL無水檸檬酸於注射用水中的澄清、無色、無菌非致熱性水溶液中調配所得純化之泊洛沙姆188。該溶液經無菌過濾且填充至100ml玻璃瓶中，用氮氣層覆蓋且用丁基橡膠塞及鋁製頂封密封。所得溶液之重量莫耳滲透濃度為約312mOsm/L。LCMF泊洛沙 姆188組成物不含任何抑菌劑或防腐劑。
B.在靜脈內投予純化之(LCMF)泊洛沙姆188之後使用HPLC-GPC表徵血漿濃度時程(方法1)
將如上文所描述產生的純化之泊洛沙姆188靜脈內投予62位健康志願者作為評估之一部分，以確定其對QT/QTc間期之影響。隨機選出該62位受試者中之八位，使用HPLC-GPC方法定量分析血漿泊洛沙姆含量。在投予之後，在基線、藥物投予期間(第1、2、3、4、5及6小時)及在投予後第1、1.5、2、2.5、5、6及18小時，藉由靜脈穿刺獲得血液樣品，放入肝素抗凝血管中。藉由離心分離血漿且冷凍儲存直至分析。純化之泊洛沙姆188以300mg/kg/h之較高起始劑量投予，持續一小時，隨後以200mg/kg/h之維持劑量投予，持續5小時，或以100mg/kg之較低劑量投予，持續1小時，隨後以30mg/kg/h投予，持續5小時。到一小時負載輸注結束時，投予的純化之泊洛沙姆188達到0.9mg/mL之平均最大濃度(Cmax)。在維持輸注期間達到約0.4mg/mL之穩定狀態平均濃度(Css)。在停止維持輸注之後，血漿濃度迅速地下降。如上文所描述純化的LCMF產物在血漿中未展示用先前之泊洛沙姆188觀察到的且如本文所定義的較長循環之較高分子量材料。
為了確定血漿中不存在此類較長循環材料，使用HPLC-GPC以類似方式研究來自接受較高劑量之受試者的血漿。圖7A及圖7B顯示在對單一受試者投予純化之LCMF泊洛沙姆188之後的各個時間點獲得的血漿之一系列HPLC-GPC。圖7A顯示在所有時間點之層析圖，而圖7B顯示選定時間點供比較。在兩個圖中，層析圖經放大以顯示聚合物分佈之高分 子量部分(19.8K道爾頓至12.4K道爾頓)。亦顯示出主峰部分(12.8K Da至4.7K Da)及低分子量部分(4.7K Da至2.5K Da)。HPLC-GPC方法基於洗提峰相對於已知濃度標準品之高度對血漿含量進行定量(亦即，洗提峰越高，則血漿含量越高)。GPC方法藉由將樣品洗提時間與已知分子量之標準品的洗提時間相比較，亦鑑別出分子量範圍。
層析圖顯示，隨時間推移，泊洛沙姆188聚合物分佈之高分子量部分與主峰及低分子量組分相對成比例下降。因此，聚合物分佈顯示，高分子量部分以實質上均一之方式自循環中清除。結果亦顯示，在靜脈內投予之後，較高分子量物質並不展現較長循環半衰期(相對於其他聚合物組分)且不會積聚在循環中。
C.在靜脈內投予之後藉由HPLC-GPC比較純化之LCMF泊洛沙姆188與純化之含LCM泊洛沙姆188之血漿濃度時程
1.投予含較長循環材料(LCM)之泊洛沙姆188
將(含LCM)純化之泊洛沙姆188以100mg/kg/h之靜脈內起始劑量投予6位健康志願者，持續一小時，隨後以30mg/kg/h投予，持續48小時，作為安全性及藥物動力學研究之一部分(Grindel等人)。在藥物投予之前(基線)、投予期間(在1小時、6小時、12小時、18小時、24小時、36小時及48小時)，以及藥物投予之後30分鐘、1小時、1.5小時、2小時、4小時、6小時、8小時、12小時、14小時、20小時及24小時，藉由靜脈穿刺獲得血液樣品放入EDTA抗凝血管中。分離血漿且冷凍儲存，直至使用HPLC-GPC方法進行分析。有關血漿樣品之分析揭示該(含LCM)純化之泊洛沙姆188之主峰及HMW峰的清除動力學。
HMW峰(較長循環材料)
遵循上述投藥劑量，HMW組分(在HPLC-GPC分析中偵測為約16,000道爾頓之峰)在藥物投予時間段期間積聚且未達到225μg/ml之其平均Cmax濃度(n=6)，直至藥物投予結束之後2小時。在停止輸注之後6小時，平均血漿含量保持在202μg/ml，該濃度僅自Cmax值下降約10%。在24小時的輸注後血液收集時間段內，平均血漿含量僅下降22.5%，達到165μg/ml之血漿濃度。基於血漿濃度時程之該等變化，估計消除半衰期>48小時。
主峰
在投予以上劑量之後，主峰達到522μg/ml之表觀平均穩態濃度(n=6)，該濃度在藥物輸注期間維持。停止輸注之後一小時，血漿含量自穩態濃度下降52%，達到255μg/ml。停止之後6小時，血漿含量下降85%，達到81μg/ml。輸注後24小時，血漿含量下降96%，達到約19μg/ml之血漿濃度(n=6)。基於血漿濃度時程之該等變化，估計半衰期為約5小時。
2. LCMF泊洛沙姆188(如上文所描述製備)
如先前所描述，將LCMF泊洛沙姆以300mg/kg劑量投予62位健康志願者，持續一小時，隨後以200mg/kg/h投予，持續5小時，作為評估之一部分，以確定其對QT/QTc間期之影響。隨機選出該62位受試者中之八位，使用與以上部分(B)中所描述類似但在較低血漿含量下具有改善之線性的HPLC-GPC方法，對血漿泊洛沙姆含量進行定量分析。
HMW峰
在投予以上劑量之後，HMW組分(在HPLC-GPC分析中偵測為約16,000道爾頓之峰)在藥物投予期間積聚達到較小程度，且到輸注結束時達到其Cmax(平均值為117μg/ml，n=8)。停止藥物投予之後1小時，血漿含量自Cmax值下降27%，達到86μg/ml。藥物投予結束之後6小時，平均血漿含量自Cmax值下降71%，達到34μg/ml。輸注結束之後18小時，平均血漿含量下降82%，達到19μg/ml濃度(n=8)。基於血漿濃度隨時間之該等變化，估計HMW組分之消除半衰期在6-9小時之間。
主峰
在投予以上劑量之後，主峰達到2,637μg/ml之表觀平均穩態濃度，該濃度在6小時輸注時間段期間維持(n=8)。停止輸注之後一小時，平均血漿含量自穩定狀態降低67%，達到872μg/ml，且停止之後6小時，平均血漿含量下降93%(自穩定狀態)，達到184μg/ml。停止輸注之後18小時，平均血漿含量下降超過98%(自穩定狀態)，達到約34μg/ml之血漿濃度(n=6)。基於血漿濃度時程之該等變化，估計消除半衰期為約3小時。
c.彙總比較表
下表1中顯示了在投予之後類似時間點時自血漿之相對清除速率之比較。資料展示，(含LCM)純化之泊洛沙姆188與LCMF泊洛沙姆188在血漿濃度之降低速率方面存在明顯差異，表明LCMF泊洛沙姆188清除更快。該差異對於HMW峰及主峰很明顯。該差異對於HMW峰最明顯。由此顯示LCMF泊洛沙姆不同於現有技術的含LCM之泊洛沙姆。
Figure 104122001-A0202-12-0107-20
D.確定純化之LCMF泊洛沙姆188不同於含有LCM之純化之泊洛沙姆188的分析資料
1.比較各種泊洛沙姆之分析測試(RP-HPLC分析)
在逆相層析法中，存在疏水性固定相(管柱)及極性較高之移動相。歸因於此「逆」相條件，常使用RP-HPLC，基於相對疏水性分離化合物。相較於親水性較強之化合物，疏水性較強之化合物展現較長的管柱滯留時間。
使用以下HPLC條件比較已知親水性/親脂性平衡(HLB)差異之各種泊洛沙姆，以及含有LCM之純化之泊洛沙姆188及LCMF泊洛沙姆188的管柱滯留時間：
Figure 104122001-A0202-12-0107-21
結果
結果顯示，LCMF泊洛沙姆188不同於現有技術的純化之泊洛沙姆188。其具有不同的藥物動力學特性，反映了其親水性比含有較長循環材料之現有技術材料強。
圖9顯示以下各物之RP-HPLC層析圖：高親水性聚合物(PEG 8000)、LCMF泊洛沙姆188、含LCM之純化之泊洛沙姆188，及具有降低之HLB值(增加之疏水性)的兩種泊洛沙姆，分別為泊洛沙姆338及泊洛沙姆407。親水性最高之聚合物PEG 8000在管柱上展現極少滯留，符合其高親水性。根據已知HLB值，泊洛沙姆338(HLB>24)及泊洛沙姆407(HLB 18-23)展現長得多的滯留時間(增加tR及k'值)。純化之LCMF泊洛沙姆188比含LCM之純化之泊洛沙姆188更快洗提(純化之LCMF泊洛沙姆之平均tR及k'分別為約8.8(8.807)及約3.2(3.202)，與含有LCM之純化之泊洛沙姆的約10.0(9.883)及3.7(3.697)形成比較)，表明相較於含有LCM之純化之泊洛沙姆188，LCMF泊洛沙姆188之親水性相對較高。
圖10顯示3個不同批次的純化之LCMF泊洛沙姆188及兩(2)個不同批次的純化之(含LCM)泊洛沙姆188的層析圖。該等結果展示不同批次材料之穩定再現性且顯示兩種材料之間之差異無法藉由分析變化性解釋。該等結果展示，LCMF泊洛沙姆188之聚合物分佈的親水性比純化之泊洛沙姆188高。
2.純化之LCMF泊洛沙姆及含LCM之泊洛沙姆的不同藥物動力學特性與其親水性差異相關
如本文中所描述(參見例如以上實施例7B及圖9至圖10，以及表1)，當與含有較長循環材料(LCM)的純化之泊洛沙姆188在活體內投予之後的情形相比較，LCMF泊洛沙姆188在投予人類受試者之後展現明顯不同之藥物動力學特性。本實施例中提供之資料指示，LCMF泊洛沙姆188之親水性高於產生較長循環材料的純化之泊洛沙姆188。
如藉由HPLC-GPC所示，泊洛沙姆188之經純化變化形式，即含LCM之純化之泊洛沙姆188及LCMF泊洛沙姆188的聚合物大小分佈在大小方面係類似的。兩種均符合以下標準：
Figure 104122001-A0202-12-0109-22
儘管如藉由HPLC-GPC所示，兩種純化之泊洛沙姆的聚合物大小分佈為類似的，但如藉由本文中之RP-HPLC所證實，包含LCMF泊洛沙姆188之聚合物分佈的分子親水性更高。當注射到動物體內時，親水性較高之聚合物分佈以較快的速率自循環清除。由此說明了在LCMF泊洛沙姆188製劑中存在較少的較長循環材料。結果亦指示，如所觀察的及上文所描述，聚合物分佈之主峰清除更快。舉例而言，由臨床試驗得到的血漿濃度時程資料顯示，相較於含有LCM之純化之泊洛沙姆188，LCMF泊洛沙姆188之主峰及高分子量峰的消除半衰期較短。
由於P188之流變性、細胞保護作用、抗黏附作用及抗血栓形成作用在該分佈之優勢或主要共聚物內，即約8,400道爾頓至9,400道爾 頓內(其具有約4-7小時之循環半衰期)最佳，故泊洛沙姆188中較大、疏水性更高、較長循環半衰期之組分的存在係不合需要的。舉例而言，在P188之所需活性中有其用以減小血液黏度且抑制紅血球(RBC)聚集之流變作用，由此解釋了其改善受損組織中之血流的能力。相比之下，疏水性較高、較高分子量之泊洛沙姆，諸如P338(亦稱為Pluronic® F108)及P308(Pluronic® F98)，增加血液黏度及RBC聚集(Armstrong等人(2001)Biorheology,38：239-247)。此為P188之相反作用且指示較高分子量之疏水性泊洛沙姆物質可具有不合需要的生物作用。因此，結果指示，純化之(含LCM)泊洛沙姆188之高分子量峰中所包含的疏水性組分為不合需要之雜質。因此，具有教少量該等組分之泊洛沙姆188，諸如LCMF泊洛沙姆為合乎需要的。
實施例8 在多步驟萃取分批製程中採用控制性逐步增加甲醇調整甲醇濃度之作用
實質上如以上實施例中所描述進行該方法，不過泊洛沙姆188之多步驟萃取分批製程係藉由如下以控制性逐步地增加甲醇改變甲醇濃度進行的萃取來進行。可行的最大壓力典型地為250atm。因此，可採用調整甲醇濃度及萃取時間之製程來適應壓力限制。
A.控制性逐步增加：6.3重量%、7.1重量%及8.1重量%甲醇
如實施例8中所描述純化泊洛沙姆188(14kg)，不過在107kg/h之甲醇流動速率下，使6.3%甲醇/CO2萃取共溶劑滲透穿過泊洛沙姆溶液，保持3小時。用7.1%甲醇/CO2共溶劑，在108kg/h甲醇流動速率下，再繼續進行萃取8小時。用8.1%甲醇/CO2共溶劑，在109kg/h之甲醇流動速率下，再進一步繼續萃取7小時。如部分A中所描述，在該製程結束時， 排出萃取器內含物且乾燥以移除殘餘甲醇。純化之泊洛沙姆188之產率為66%。結果亦證實，該製程引起LMW物質之可量測之減少。
B.控制性逐步增加：3.8重量%、9.1重量%及10.7重量%甲醇
如實施例8中所描述純化泊洛沙姆188(14kg)，不過在104kg/h之甲醇流動速率下，使3.8%甲醇/CO2萃取共溶劑滲透穿過泊洛沙姆溶液，保持4小時。用9.1甲醇/CO2共溶劑，在108kg/h甲醇流動速率下，再繼續進行萃取3小時。用10.7%甲醇/CO2共溶劑，在112kg/h甲醇流動速率下，再進一步繼續進行萃取8小時。如部分A中所描述，在該製程結束時，排出萃取器內含物且乾燥以移除殘餘甲醇。純化之泊洛沙姆188之產率為57%。結果亦證實，該製程引起LMW物質之可量測之減少。
實施例9
藉由用甲醇/高壓CO 2 共溶劑萃取來純化泊洛沙姆188之分批製程
對藉由用甲醇/高壓CO2共溶劑萃取來純化泊洛沙姆188之分批製程進行評價。藉由用methanol/高壓CO2溶劑萃取來純化泊洛沙姆188(13-14kg)。在高壓萃取容器中，在甲醇存在下攪拌泊洛沙姆188，直至混合。將甲醇與高壓CO2之共溶劑抽吸穿過萃取容器。藉由控制萃取溶劑溫度、壓力及甲醇共溶劑之量來調整萃取溶劑之溶劑特徵。具體言之，該三個參數之組合經選擇以自商品級泊洛沙姆188移除低分子量(LMW)組分及高分子量(HMW)組分。甲醇之起始濃度為約2.5wt%且以最多25wt%之增量連續增加。萃取容器壓力為75±10巴且萃取溫度、甲醇/CO2共溶劑溫度及萃取器夾套溫度為20℃-25℃。萃取製程以連續方式進行以自萃取器連續移除各種組分。
移除萃取溶劑且藉由凝膠滲透層析法(GPC)分析洗提份。純化之後，自萃取容器回收純化之泊洛沙姆188且藉由GPC分析。最初，在萃取期間移除低分子量(LMW)組分且在較高甲醇濃度下移除主要部分。在萃取製程之後續階段，移除高分子量組分。純化之泊洛沙姆188的分子量分佈比起始物質窄。
估計該聚合物之產率為60%至80%，其中具有小於1.5%的低分子量組分(小於4,500道爾頓)。峰平均分子量為約8,500±750道爾頓。
因為修改將為熟習此項技術者顯而易見，所以希望本發明僅受到隨附申請專利範圍之範疇限制。
100:製程
105:步驟
110:步驟
115:步驟
120:步驟
125:步驟
130:步驟
135:步驟
140:步驟
145:步驟
150:步驟
160:步驟
165:步驟
170:步驟
175:步驟
180:步驟

Claims (79)

  1. 一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188，其中：該LCMF泊洛沙姆188為聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，其具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓(Dalton)與2,300道爾頓之間的整數；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有小於4,500道爾頓之平均分子量的低分子量組分；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有大於13,000道爾頓之平均分子量的高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；及在靜脈內投予人類受試者之後，該共聚物分佈中不構成主峰之任何組分的循環血漿半衰期不超過該共聚物分佈中主要組分之循環半衰期的5.0倍。
  2. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其中在靜脈內投予人類受試者之後，構成該共聚物之聚合物分佈之所有組分在該受試者之血漿中的循環半衰期比該共聚物之該主要組分之循環半衰期長不超過4.0倍。
  3. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其中當投予人類受試者時， 該共聚物之分佈中之所有組分在該受試者之血漿中的循環半衰期比該共聚物之分佈中該主要組分之循環半衰期長不超過3倍。
  4. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其中當投予人類受試者時，該共聚合物之分佈中之所有組分在該受試者之血漿中的半衰期不超過30小時、25小時、20小時、15小時、10小時、9小時、8小時或7小時。
  5. 如申請專利範圍第4項之LCMF泊洛沙姆，其中當投予人類受試者時，該共聚物之分佈中之所有組分在該受試者之血漿中的半衰期不超過10小時或12小時。
  6. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其中該聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物為疏水物具有約1,400Da至2,000Da或1,400Da至2,000Da之分子量且親水物部分以重量計佔該共聚物約70%至90%或70%至90%的泊洛沙姆。
  7. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其中該疏水物(C3H6O)之分子量為約1,750Da或為1,750Da。
  8. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其中該聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物之平均分子量為7,680道爾頓至9,510道爾頓或8,400道爾頓至8,800道爾頓。
  9. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其中：該製劑中大於13,000道爾頓之高分子量組分之百分含量佔該泊洛沙姆製劑之總組分分佈小於1%；及在靜脈內投予人類受試者之後，不會產生循環半衰期為該共聚物之分佈 中該主要組分之循環血漿半衰期的超過4倍之組分。
  10. 如申請專利範圍第9項之LCMF泊洛沙姆，其中該製劑中大於13,000道爾頓之高分子量組分之百分含量佔該泊洛沙姆製劑之總組分分佈小於0.9%、0.8%、0.7%、0.6%、0.5%或0.5%以下。
  11. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其中該多分散性值小於1.06、1.05、1.04或1.03。
  12. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其係藉由包含以下之方法製造：a)將泊洛沙姆溶液引入萃取容器中，其中該泊洛沙姆溶解於第一烷醇中，形成溶液；b)將該泊洛沙姆溶液與包含第二烷醇及超臨界二氧化碳之萃取溶劑在維持該超臨界二氧化碳之溫度及壓力下混合第一規定時間段，其中：該溫度高於二氧化碳之臨界溫度，但不超過40℃；該壓力為220巴至280巴；及該烷醇以佔該總萃取溶劑7wt%至8wt%之烷醇濃度提供；及c)使步驟b)中該萃取溶劑中之該第二烷醇的濃度在該萃取方法之時間內分數個梯度步驟增加複數倍，其中：每一複數倍發生另一規定時間段；及在每一連續步驟中，該烷醇濃度相較於該第二烷醇之前一濃度增加1%-2%；及d)自該萃取容器移除該萃取溶劑，由此自該萃餘物泊洛沙姆製劑移除萃取之材料。
  13. 如申請專利範圍第12項之LCMF泊洛沙姆，其中在步驟a)中，泊洛沙姆與第一烷醇之比率以重量計為約2：1至3：1或為2：1至3：1，包括端點在內。
  14. 如申請專利範圍第12項之LCMF泊洛沙姆，其中在步驟c)中，該複數倍分兩個、三個、四個或五個梯度步驟發生。
  15. 如申請專利範圍第14項之LCMF泊洛沙姆，其中步驟c)分兩個步驟發生，其包含：i)使該第二烷醇之濃度自約7%至8%增加到約8.2%至9.5%，歷時第二規定時間段；及ii)使該第二烷醇之濃度自約8.2%至9.5%增加到約9.6%至11.5%，歷時第三規定時間段。
  16. 如申請專利範圍第15項之LCMF泊洛沙姆，其中：在步驟b)中，該烷醇濃度為約7.4wt%或為7.4wt%；在步驟i)中，該烷醇濃度為約9.1wt%或為9.1wt%；及在步驟ii)中，該烷醇濃度為約10.7wt%或為10.7wt%。
  17. 如申請專利範圍第15項之LCMF泊洛沙姆，其中該第一規定時間段、該第二規定時間段及該第三規定時間段各自進行2小時至12小時。
  18. 如申請專利範圍第17項之LCMF泊洛沙姆，其中該等規定時間段相同或不同。
  19. 如申請專利範圍第17項之LCMF泊洛沙姆，其中：該第一規定時間段進行2小時至6小時；該第二規定時間段進行2小時至6小時；及 該第三規定時間段進行4小時至10小時。
  20. 如申請專利範圍第12項之LCMF泊洛沙姆，其中該第一烷醇及該第二烷醇各自獨立地選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合。
  21. 如申請專利範圍第第20項之LCMF泊洛沙姆，其中該第一烷醇與該第二烷醇相同或不同。
  22. 如申請專利範圍第20項之LCMF泊洛沙姆，其中該第一烷醇為甲醇。
  23. 如申請專利範圍第20項之LCMF泊洛沙姆，其中該第二烷醇為甲醇。
  24. 如申請專利範圍第20項之LCMF泊洛沙姆，其中該第一烷醇為甲醇且該第二烷醇為甲醇。
  25. 如申請專利範圍第12項之LCMF泊洛沙姆，其中移除該萃取之材料的步驟d)在整個步驟b)及步驟c)中發生。
  26. 如申請專利範圍第12項之LCMF泊洛沙姆，其中該方法為分批方法。
  27. 如申請專利範圍第12項之LCMF泊洛沙姆，其中該方法為連續方法。
  28. 如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆，其係由包含用CO2加壓之超臨界流體萃取的方法製造。
  29. 一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188，其中：該LCMF泊洛沙姆188為聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，其具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之 間的整數；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有小於4,500道爾頓之平均分子量的低分子量組分；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有大於13,000道爾頓之平均分子量的高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；及相較於含有該長循環材料(LCM)之純化之泊洛沙姆188或相較於標準品，該LCMF泊洛沙姆具有較高親水性，其中當投予人類受試者時，該泊洛沙姆中之LCM材料的半衰期為該泊洛沙姆製劑之主要組分的超過約5倍或超過5倍。
  30. 一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188，其中：該LCMF泊洛沙姆188為聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，其具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有小於4,500道爾頓之平均分子量的低分子量組分；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有大於13,000道爾頓之平均分子量的高分子量組分； 該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；及如藉由逆相高效液相層析(RP-HPLC)所評估，該LCMF泊洛沙姆具有比純化之泊洛沙姆188短的平均滯留時間(tR)。
  31. 如申請專利範圍第30項之LCMF泊洛沙姆，其中：該等RP-HPLC條件使得該含LCM之泊洛沙姆188之平均tR為約9.9-10或為9.9-10；且該LCMF泊洛沙姆之平均tR為約8.7-8.8或為8.7-8.8。
  32. 如申請專利範圍第30項之LCMF泊洛沙姆，其中RP-HPLC條件使得該LCMF泊洛沙姆188之平均k'為約3.2-3.3或為3.2-3.3，且該含LCM之泊洛沙姆188之平均k'為約3.6-3.7或為3.6-3.7。
  33. 一種無長循環材料(LCMF)之泊洛沙姆188，其中；該LCMF泊洛沙姆188為聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，其具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH，其中：a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有小於4,500道爾頓之平均分子量的低分子量組分；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有大於13,000道爾頓之平均分子量的高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；及 如藉由RP-HPLC所評估，該LCMF泊洛沙姆188之容量因數(k')小於純化之含LCM之泊洛沙姆188的k'。
  34. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項之LCMF泊洛沙姆。
  35. 如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  36. 如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其用於治療急性心肌梗塞、急性胺體缺血、休克、急性中風、缺血性中風、心臟衰竭、鐮狀細胞疾病、神經退化性疾病、黃斑變性、糖尿病性視網膜病變及充血性心臟衰竭。
  37. 如申請專利範圍第34項之醫藥組成物，其用於治療選自以下之疾病或病況之用途：治療藉由膜重新密封及修復進行治療之病症；治療組織缺血及再灌注損傷；減少發炎性反應；降低血液黏度；促進血栓溶解；促進止血；作為藥物、核酸或蛋白質遞送之媒劑；作為使疏水性藥物之懸浮液穩定的乳化劑；清潔皮膚創傷；作為化妝品調配物中之界面活性劑；治療儲存損傷影響之血液； 控制個人護理產品及肥皂之黏度；及作為輕瀉劑。
  38. 一種製備無長循環(LCMF)之泊洛沙姆的方法，其包含：a)將泊洛沙姆188溶液引入萃取容器中，其中該泊洛沙姆溶解於第一烷醇中，形成溶液；b)將該泊洛沙姆溶液與包含第二烷醇及超臨界二氧化碳之萃取溶劑在維持該超臨界二氧化碳之溫度及壓力下混合第一規定時間段，其中：該溫度高於二氧化碳之臨界溫度，但不超過40℃；該壓力為220巴至280巴；及該烷醇以佔該總萃取溶劑7wt%至8wt%之烷醇濃度提供；c)使步驟8)中該萃取溶劑中之該第二烷醇的濃度在該萃取方法之時間內分數個梯度步驟增加複數倍，其中：每一複數倍發生另一規定時間段；及在每一連續步驟中，該烷醇濃度相較於該第二烷醇之前一濃度增加1%-2%；及d)自該萃取容器移除該萃取溶劑，由此自該萃餘物泊洛沙姆製劑移除萃取之材料，從而製造出該LCMF泊洛沙姆。
  39. 如申請專利範圍第38項之方法，其中在步驟a)中，泊洛沙姆與第一烷醇之比率以重量計為約2：1至3：1或為2：1至3：1，包括端點在內。
  40. 如申請專利範圍第38項之方法，其中在步驟c)中，該複數倍分兩個、三個、四個或五個梯度步驟發生。
  41. 如申請專利範圍第38項之方法，其中步驟c)分兩個步驟發生，其包 含：i)使該第二烷醇之濃度自約7%至8%增加到約8.1%至9.5%，歷時第二規定時間段；及ii)使該第二烷醇之濃度自約8.2%至9.5%增加到約9.6%至11.5%，歷時第三規定時間段。
  42. 如申請專利範圍第41項之方法，其中：在步驟b)中，該烷醇濃度為約7.4wt%或為7.4wt%；在步驟i)中，該烷醇濃度為約9.1wt%或為9.1wt%；及在步驟ii)中，該烷醇濃度為約10.7wt%或為10.7wt%。
  43. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該第一規定時間段、該第二規定時間段及該第三規定時間段各自進行2小時至12小時。
  44. 如申請專利範圍第43項之方法，其中該等規定時間段相同或不同。
  45. 如申請專利範圍第43項之方法，其中：該第一規定時間段進行2小時至6小時；該第二規定時間段進行2小時至6小時；及該第三規定時間段進行4小時至10小時。
  46. 如申請專利範圍第38項之方法，其中該第一烷醇及該第二烷醇各自獨立地選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合。
  47. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該第一烷醇與該第二烷醇相同或不同。
  48. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該第一烷醇為甲醇。
  49. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該第二烷醇為甲醇。
  50. 如申請專利範圍第46項之方法，其中該第一烷醇為甲醇且該第二烷醇為甲醇。
  51. 如申請專利範圍第38項之方法，其中移除該萃取之材料的步驟d1)在整個步驟b)及步驟c)中發生。
  52. 一種用於製備純化之LCMF泊洛沙姆之方法，其包含：a)將泊洛沙姆188溶液引入萃取容器中，其中該泊洛沙姆溶解於第一烷醇中，形成溶液；b)將該泊洛沙姆溶液與包含第二烷醇及超臨界液體之萃取溶劑在維持該超臨界液體之溫度及壓力下混合，其中該萃取溶劑中該第二烷醇之濃度在該萃取方法之時間內增加；及c)自該萃取容器移除該萃取溶劑，由此自該泊洛沙姆製劑移除萃取之材料，從而製造出LCMF泊洛沙姆。
  53. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該第一烷醇及該第二烷醇各自獨立地選自甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇及其組合。
  54. 如申請專利範圍第53項之方法，其中該第一烷醇為甲醇。
  55. 如申請專利範圍第53項之方法，其中該第二烷醇為甲醇。
  56. 如申請專利範圍第52項之方法，其中處於高溫及壓力下之該超臨界液體選自二氧化碳、甲烷、乙烷、丙烷、氨及氟氯烷(freon)。
  57. 如申請專利範圍第56項之方法，其中處於高溫及壓力下之該超臨界液體為二氧化碳。
  58. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該萃取溶劑包含甲醇及二氧化碳。
  59. 如申請專利範圍第52項之方法，其中提供的該第二烷醇佔該總萃取溶 劑之百分含量(w/w)為3%至20%或3%至15%。
  60. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該方法包含使步驟b)中該萃取溶劑中該第二烷醇之濃度在該萃取方法之時間內分數個梯度步驟增加複數倍，其中：每一複數倍發生另一規定時間段；及在每一連續步驟中，該烷醇濃度相較於該第二烷醇之前一濃度增加1%-2%；及自該萃取容器移除該萃取溶劑，由此自該萃餘物泊洛沙姆製劑移除該萃取之材料。
  61. 如申請專利範圍第52項之方法，其中該壓力為或為約125巴至500巴。
  62. 如申請專利範圍第61項之方法，其中該壓力為或為約200巴至400巴或280巴至340巴。
  63. 一種用於純化LCMF泊洛沙姆之萃取方法，其包含：a)將泊洛沙姆溶液引入萃取容器中，其中該泊洛沙姆溶解於溶劑中，形成溶液，其中該溶劑選自醇、脂族酮、芳族酮、胺及其混合物；b)將該泊洛沙姆溶液與包含溶劑及高壓二氧化碳之萃取溶劑混合，其中該萃取溶劑中該溶劑之濃度在萃取方法之時間內增加；及c)自該萃取容器移除該萃取溶劑，由此自該泊洛沙姆移除萃取之材料，製造出該LCMF泊洛沙姆。
  64. 如申請專利範圍第63項之方法，其中在步驟a)中，該溶劑為甲醇。
  65. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該萃取溶劑包含甲醇及二氧化碳。
  66. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該萃取之材料包含小於4,500道 爾頓之低分子量雜質。
  67. 如申請專利範圍第63項之方法，其中：該純化之泊洛沙姆為LCMF聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，其具有下式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH，a或a'為使得該親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得該疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有大於13,000道爾頓之平均分子量的高分子量組分；及該共聚物之多分散性值小於1.07。
  68. 如申請專利範圍第67項之方法，其中該泊洛沙姆為泊洛沙姆188(P188)。
  69. 如申請專利範圍第63項之方法，其中：該LCMF泊洛沙姆具有下式：HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH，其中：a及a'各自為使得該親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得該疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓與2,300道爾頓之間的整數； 該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有小於4,500道爾頓之平均分子量的低分子量組分；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有大於13,000道爾頓之平均分子量的高分子量組分；及該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07。
  70. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該方法為分批方法。
  71. 如申請專利範圍第63項之方法，其中該方法為連續方法。
  72. 一種無長循環(LCMF)之泊洛沙姆，其由如申請專利範圍第63項之方法製造。
  73. 一種組成物，其包含無長循環(LCMF)之泊洛沙姆188，其中：該組成物經調配用於靜脈內投予；及該組成物包含5gm至50gm該LCMF泊洛沙姆，其中：該LCMF泊洛沙姆188為聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物，其具有式HO(CH2CH2O)a'-[CH(CH3)CH2O]b-(CH2CH2O)aH；a及a'各自為使得親水物(C2H4O)之百分含量以重量計在該共聚物之總分子量之約60%與90%之間的整數；a與a'相同或不同；b為使得疏水物(C3H6O)之分子量在約1,300道爾頓(Dalton)與2,300道爾頓之間的整數；該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有小於4,500道爾頓之平均分子量的低分子量組分； 該共聚物之分佈中總組分之不超過1.5%為具有大於13,000道爾頓之平均分子量的高分子量組分；該共聚物之多分散性值小於約1.07或小於1.07；且其中該LCMF泊洛沙姆188具有以下所述者之一的特徵：(i)在靜脈內投予人類受試者之後，不構成主峰之任何組分的循環血漿半衰期比該主峰之循環半衰期長不超過5.0倍；(ii)該LCMF泊洛沙姆188之親水性高於含有長循環材料(LCM)之純化之泊洛沙姆188的親水性，由此該共聚物之分佈中所有組分之循環半衰期比該共聚合物之分佈中主要成分之循環半衰期長不超過5.0倍；(iii)如藉由逆相高效液相層析(RP-HPLC)所評估，該LCMF泊洛沙姆188具有比純化之泊洛沙姆188短的平均滯留時間(tR)；及(iv)如藉由RP-HPLC所評估，該LCMF泊洛沙姆188之容量因數(k')小於純化之含LCM之泊洛沙姆188的k'。
  74. 一種組成物，其包含如申請專利範圍第28項之LCMF泊洛沙姆，其中：該組成物經調配用於靜脈內投予；及該組成物包含5gm至50gm該LCMF泊洛沙姆。
  75. 如申請專利範圍第74項之組成物，其用於治療心臟衰竭或鐮狀細胞疾病。
  76. 一種組成物，其包含血液或血液製品及如申請專利範圍第28項之LCMF泊洛沙姆。
  77. 如申請專利範圍第76項之組成物，其中該血液或血液製品為包裝之紅血球或血小板。
  78. 如申請專利範圍第77項之組成物，其用於輸血以治療其中治療包括輸血之病症。
  79. 如申請專利範圍第78項之組成物，其中該病症選自鐮狀細胞疾病、急性胸部症候群、外周動脈疾病、心臟衰竭、中風、周邊血管疾病、黃斑變性、急性呼吸窘迫症候群(ARDS)、多器官衰竭、局部缺血、出血性休克、敗血性休克、酸中毒、體溫過低、貧血性分解、手術、外傷、急性失血及血液病症。
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