TWI673360B - 促進琥珀酸或乳酸生產的基因改質菌株及方法 - Google Patents
促進琥珀酸或乳酸生產的基因改質菌株及方法 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI673360B TWI673360B TW105136814A TW105136814A TWI673360B TW I673360 B TWI673360 B TW I673360B TW 105136814 A TW105136814 A TW 105136814A TW 105136814 A TW105136814 A TW 105136814A TW I673360 B TWI673360 B TW I673360B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- fruit
- vegetable
- genetically modified
- medium
- modified strain
- Prior art date
Links
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 146
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 76
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 title claims abstract description 72
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 title claims abstract description 38
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title description 3
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims abstract description 67
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims abstract description 64
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims abstract description 57
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 claims abstract description 49
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 claims abstract description 48
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 77
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 34
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 33
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 33
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 31
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 31
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 29
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 26
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 26
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 26
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 24
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 17
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 15
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 15
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 11
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 10
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 claims description 10
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 claims description 10
- 108010092060 Acetate kinase Proteins 0.000 claims description 9
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 claims description 8
- 108700023175 Phosphate acetyltransferases Proteins 0.000 claims description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims 2
- 241000132456 Haplocarpha Species 0.000 claims 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 claims 1
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101150109655 ptsG gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract 1
- 235000013997 pineapple juice Nutrition 0.000 description 41
- 235000015205 orange juice Nutrition 0.000 description 18
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 13
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 12
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 12
- 244000099147 Ananas comosus Species 0.000 description 9
- 235000007119 Ananas comosus Nutrition 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 description 8
- 244000131522 Citrus pyriformis Species 0.000 description 8
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 8
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 239000002154 agricultural waste Substances 0.000 description 6
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 6
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 210000002706 plastid Anatomy 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 4
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 235000015203 fruit juice Nutrition 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 4
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000015190 carrot juice Nutrition 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-L oxaloacetate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CC(=O)C([O-])=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 235000004936 Bromus mango Nutrition 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229920002101 Chitin Polymers 0.000 description 1
- 244000241235 Citrullus lanatus Species 0.000 description 1
- 235000012828 Citrullus lanatus var citroides Nutrition 0.000 description 1
- 240000000560 Citrus x paradisi Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 244000070406 Malus silvestris Species 0.000 description 1
- 240000007228 Mangifera indica Species 0.000 description 1
- 235000014826 Mangifera indica Nutrition 0.000 description 1
- 240000008790 Musa x paradisiaca Species 0.000 description 1
- 235000018290 Musa x paradisiaca Nutrition 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000220324 Pyrus Species 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 235000009184 Spondias indica Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- YBCVMFKXIKNREZ-UHFFFAOYSA-N acoh acetic acid Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O YBCVMFKXIKNREZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021016 apples Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000003763 carbonization Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000010903 husk Substances 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000010169 landfilling Methods 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 239000010871 livestock manure Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000004745 nonwoven fabric Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000021017 pears Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010071189 phosphoenolpyruvate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012265 solid product Substances 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000967 suction filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004753 textile Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011514 vinification Methods 0.000 description 1
- 238000003809 water extraction Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/44—Polycarboxylic acids
- C12P7/46—Dicarboxylic acids having four or less carbon atoms, e.g. fumaric acid, maleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/56—Lactic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01001—Alcohol dehydrogenase (1.1.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
- C12Y101/01027—L-Lactate dehydrogenase (1.1.1.27)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
- C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
- C12Y203/01008—Phosphate acetyltransferase (2.3.1.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
- C12Y207/02001—Acetate kinase (2.7.2.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/02—Cells for production
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
所描述為一種基因改質菌株，其缺少或是包含數個重要的代
謝酶相關基因，且在以蔬果之副產品或蔬果廢棄物作為培養基的狀態下，可醱酵產生高量的琥珀酸或乳酸。也被描述的是使用此基因改質菌株產生琥珀酸及乳酸的方法。
Description
本發明是有關於一種促進琥珀酸或乳酸生產的基因改質菌株及方法。
當前的生質化學品仍多以玉米澱粉或葡萄糖等食品材料作為碳源，然而，以長期來看，此作法在未來很可能引發與人爭糧、以及與糧爭地的問題，進而衍生能源與糧食之間的生產競爭。
依行政院農委會資料顯示，台灣每年產生超過500萬噸的農業廢棄物，其中農產廢棄物即大於200萬噸。以蔬菜廢棄物而言，其含水量高達90%以上，就地掩埋不僅佔空間，且可能造成掩埋場滲漏問題而引起二次污染，然若採焚化處理又因水分過高而熱值不高，徙增處理費用。
因此，將農業廢棄物有效地循環再利用，並依廢棄物的特性加以能源化(如禽畜糞沼氣發酵)或資源化(如稻殼碳化、魚鱗膠原蛋白、牡蠣殼甲殼素之提煉)，以創造經濟效益，顯然已成為現下農業經營及能源開發的重要手段之一。
為了因應上述綠色產品於市場需求的快速成長，生質琥珀酸與乳酸的生產及開發顯得相形重要。琥珀酸與乳酸的應用範疇皆相當廣泛，琥珀酸可作為塗料、油墨、及染料生產的中間體，並可應用在金屬加工產業、醫藥工業、食品、及高分子聚合物產業等。乳酸除了應用於皮革、紡織品製造等產業外，在醫藥、食品及釀酒等領域中亦扮演重要角色。
因此，研發一種既可使農產廢棄物循環再生，且可促進琥珀酸或乳酸生產的方法，儼然已成為業界當前的重要課題。
本揭露提供一種以蔬果副產品或蔬果廢棄物為代謝基質以生產琥珀酸的基因改質菌株，其中包含：一經剔除之內源性ldhA基因，其不表現乳酸去氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)；一經剔除之內源性adhE基因，其不表現乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)；以及一經剔除之內源性ackA-pta基因，其不表現乙酸激酶(acetate kinase)及磷酸乙醯基轉移酶(phosphotransacetylase,ACK-PTA)；其中，基因改質菌株係培養於一培養基中，且培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物作為菌株之一碳源，以產生琥珀酸。
本揭露亦提供一種以上述基因改質菌株表現琥珀酸的方法，包含以下步驟：首先，提供如上述之基因改質菌株；接著，提供一培養基，培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物作為菌株之一碳源；之後，將菌株培養於培養基中，以培養
溫度為26-40℃、且pH值範圍為6-8進行培養以產生培養液，使菌株以蔬果副產品或蔬果廢棄物為其代謝基質，而於培養液中產生琥珀酸；接著，收取包含琥珀酸的培養液。然後，由包含琥珀酸的培養液分離出琥珀酸。
本揭露另提供一種以蔬果副產品或蔬果廢棄物為代謝基質以生產乳酸的基因改質菌株，其中包含：一經剔除之內源性adhE基因，其不表現乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)；以及一經剔除之內源性ackA-pta基因，其不表現乙酸激酶(acetate kinase)及磷酸乙醯基轉移酶(phosphotransacetylase,ACK-PTA)；其中，基因改質菌株係培養於一培養基中，且培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物作為菌株之一碳源，以產生乳酸。
本揭露再提供一種以上述基因改質菌株表現乳酸的方法，包含以下步驟：首先，提供如上述之菌株；接著，提供一培養基，培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物作為菌株之一碳源；之後，將菌株培養於培養基中，以培養溫度為26-40℃、且pH值範圍為6-8進行培養以產生培養液，使菌株以蔬果副產品或蔬果廢棄物作為代謝基質，而於培養液中產生乳酸；接著，收取包含乳酸的培養液。然後，由包含乳酸的培養液分離出乳酸。
為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖表，作詳細說明如下。
在本文中，所謂的「經剔除(knock out)之內源性基因」是指對該內源性基因進行點突變(point mutation)、缺失(deletion)或嵌入(insertion)等，使得該內源性基因無法產生功能性胜肽(functional peptide)。其中，在將突變株細菌的該內源性基因剔除後，會藉由聚合酶鏈鎖反應(Polymerase chain reaction,PCR)來確認該內源性基因已被完全剔除，因此該突變株細菌無法產生功能性胜肽(functional peptide)。舉例來說，內源性ldhA基因編碼乳酸去氫酶，但經剔除之內源性ldhA基因不表現乳酸去氫酶。
在本揭露之一實施例中，提供一種以蔬果副產品或蔬果廢棄物為代謝基質以生產琥珀酸的基因改質菌株，此基因改質菌株包含：一經剔除之內源性ldhA基因，其不表現乳酸去氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)；一經剔除之內源性adhE基因，其不表現乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)；以及一經剔除之內源性ackA-pta基因，其不表現乙酸激酶(acetate kinase)及磷酸乙醯基轉移酶(phosphotransacetylase,ACK-PTA)；其中，基因改質菌株係培養於一培養基中，且培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物作為菌株之一碳源，以產生琥珀酸。
所述蔬果副產品或廢棄物係指蔬果生產過程中之非經濟產品，包括生產過剩、去除可食用或可利用之果肉後含皮、莖、葉之蔬果廢棄物，或經產品加工後之蔬果廢棄物。蔬果種類可為溫帶水果、亞熱帶水果、熱帶水果、或根莖類蔬菜等。
其中，溫帶水果例如是蘋果或梨子，亞熱帶水果例如是檸檬、柳橙、柚子或西瓜，熱帶水果例如是鳳梨、芒果或香蕉，而根莖類蔬菜例如是胡蘿蔔或洋蔥。前述之蔬果種類僅為例示說明，但不限於此。
所指培養基中所包含之至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物，係指由上述蔬果中至少擇一或任選兩種以上之副產品或廢棄物進行搭配後添加於培養基中，以作為基因改質菌株之碳源。
所述蔬果副產品或蔬果廢棄物經蒐集後測量，約可提供5-210g/L葡萄糖、0.5-50g/L蔗糖、及1-55g/L果糖之碳源範圍，而其蛋白質濃度約為0.03-0.8mg/mL，pH值範圍約是2.5-6，氮源範圍約為470-1740mg/L。
再者，對上述所蒐集之蔬果副產品或蔬果廢棄物進行高溫滅菌等前處理之後，將其調整為包含5-50g/L葡萄糖、0.5-50g/L蔗糖、及2-60g/L果糖之碳源範圍。將具有前述內含物的蔬果副產品或蔬果廢棄物與溶液混合以形成培養基。於培養菌株期間，將培養基的培養溫度調整為26-40℃，而將pH值範圍調整為6-8。
在本揭露之另一實施例中，培養基可進一步添加有約1-50g/L碳酸氫鈉。再者，上述基因改質菌株可置於厭氧或有
氧狀態下進行培養。其中，有氧是指溶氧0.1-10%。其中，以厭氧狀態培養之培養時間約為12-120小時，而以有氧狀態培養之培養時間約為12-48小時。
在本揭露之另一實施例中，還提供以上述基因改質菌株表現琥珀酸的方法，包含以下步驟：首先，提供一如上述之基因改質菌株；接著，提供一培養基，培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物作為菌株之一碳源；之後，將菌株培養於培養基中，且以培養溫度為26-40℃，而pH值範圍為6-8進行培養，使基因改質菌株以蔬果副產品或蔬果廢棄物為其代謝基質，而於該培養液中產生琥珀酸；接著，收取包含琥珀酸的培養液。而後，由包含琥珀酸的培養液分離出琥珀酸。
在本揭露之又一實施例中，提供一種以蔬果副產品或蔬果廢棄物為代謝基質以生產乳酸的基因改質菌株，其中包含：一經剔除之內源性adhE基因，其不表現乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)；以及一經剔除之內源性ackA-pta基因，其不表現乙酸激酶(acetate kinase)及磷酸乙醯基轉移酶(phosphotransacetylase,ACK-PTA)；其中，基因改質菌株係培養於一培養基中，且培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物作為菌株之一碳源，以產生乳酸。
其中，所述蔬果副產品或蔬果廢棄物之定義、所指蔬果之種類，經蒐集蔬果副產品或蔬果廢棄物所測量之碳源範圍、蛋白質濃度、pH值、及氮源範圍，以至培養階段經處理調整後所供應之碳源範圍、培養溫度、pH值、碳酸氫鈉添加量、以及培養時間，皆已說明於上述段落中，於此不再贅述。
在本揭露之再一實施例中，提供以上述基因改質菌株表現乳酸的方法，包含以下步驟：首先，提供一如上述之基因改質菌株；接著，提供一培養基，培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物作為菌株之一碳源；之後，將菌株培養於培養基中，並以培養溫度為26-40℃，且pH值範圍為6-8進行培養，使基因改質菌株以蔬果副產品或蔬果廢棄物為其代謝基質，而於培養液中產生乳酸；接著，收取包含乳酸的培養液。然後，由包含乳酸的培養液分離出乳酸。
以下例舉特定實施例以具體說明執行方法：
本發明之實施例中所使用的各種菌株與質體，以及各種菌株與質體所分別對應的基因型(Relevant genotype)如下方表一所列示。其中，以BW25113作為野生型(wild-type，WT)，其所對應之基因型為：rrnBT14 △lacZWJ16 hsdR514 △araBADAH33 △rhaBADLD78(參閱文獻DAtsenko and Wanner,2000 One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(12)：6640-5)。
醱酵生產琥珀酸
實驗1：以不同處理方式所產生之鳳梨汁為培養基生產琥珀酸
1.鳳梨汁的來源與前處理
使用鳳梨廢棄物所產生之鳳梨汁(pineapple juice，PAJ)，係指去除可利用之果肉後或生產過剩之含皮、莖、葉之鳳梨廢棄物經處理所獲得的鳳梨汁。其中，鳳梨廢棄物的處理方式包括：(A)將含皮、莖、葉之鳳梨廢棄物經過打碎及離心後去除果渣得到鳳梨汁；(B)將含皮、莖、葉之鳳梨廢棄物經打碎及過濾後去除果渣得到鳳梨汁；(C)將含皮、莖、葉之鳳梨廢棄物透過壓榨方式得到不含果渣的鳳梨汁。3種方式所取
得的鳳梨汁之pH值約介於3.3-4.0之間，所測得的葡萄糖約為20-40g/L、蔗糖約為4-34g/L、而果糖約為28-53g/L。再者，分析其總氮量約為470-880mg/L、蛋白質濃度為0.03-0.66mg/mL，經由高溫滅菌後始可直接作為培養基的基質使用。
2.以上述(A)PAJ為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
首先，提供以(A)方式獲得的PAJ培養基(稱為(A)PAJ培養基)，其包含前述PAJ包括20-40g/L葡萄糖、4-34g/L蔗糖與28-53g/L果糖)、磷酸緩衝溶液、與0.5mM異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiog-galactoside,IPTG)。接著，將菌株PCI 634先以LB培養基(Luria broth，為常用於微生物培養的營養性培養基)隔夜培養在37℃中，再將此菌株接種至含有上述(A)PAJ培養基之醱酵槽中。另外，分別以含0.15-5g/L氯化銨之磷酸緩衝溶液(phosphate buffer,PB)、2.5g/L酵母萃取物以及5g/L酵母萃取物作為對照組，其中各自添加等同實驗組(A)PAJ所具有的碳源(葡萄糖、蔗糖與果糖)，在37℃及pH 7之條件下，於搖瓶中有氧培養48小時，接著分析琥珀酸的濃度，結果如表二所示。
3.以上述(B)PAJ為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
首先，提供以(B)方式獲得的PAJ培養基(稱為(B)PAJ培養基)。接著，將菌株PCI 634先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述(B)PAJ培養基之醱酵槽中。另外，分別以含0.15-5g/L氯化銨之PB、2.5g/L酵母萃取物、5g/L酵母萃取物作為對照組，其中各自添加等同實驗組(B)PAJ所具有的碳源(葡萄糖、蔗糖與果糖)，在37℃及pH 7之條件下，於搖瓶中有氧培養48小時，接著分析琥珀酸的濃度，結果如表三所示。
4.以上述(C)PAJ為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
首先，提供以(C)方式獲得的PAJ培養基(稱為(C)PAJ培養基)。接著，將菌株PCI 634先以LB培養基隔夜培養在
37℃中，再接種至含有上述(C)PAJ培養基之醱酵槽中。另外，分別以含0.15-5g/L氯化銨之PB、2.5g/L酵母萃取物、5g/L酵母萃取物作為對照組，其中各自添加等同實驗組(C)PAJ所具有的碳源(葡萄糖、蔗糖與果糖)，在37℃及pH 7之條件下，於搖瓶中有氧培養48小時，接著分析琥珀酸的濃度，結果如表四所示。
實驗2：不同培養條件下之琥珀酸的表現量
1.菌株
採用菌株PCI 634AS196，其為在菌株634的基礎下，加入可大量表現蔗糖代謝相關基因之質體CSCKAB(如SEQ：2)，以促使果汁中的蔗糖分解為單糖，並可強化代謝檸檬酸基因glta(如SEQ：1)之表現，而有效轉化為琥珀酸。
2.測試不同pH值之培養條件下琥珀酸的表現量
菌株PCI 634AS196先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述(A)PAJ培養基之醱酵槽中。於30℃
及pH值分別為6.4、6.8、7.2、7.6之培養條件下，先以有氧培養7小時，之後加入8g/L碳酸氫鈉，接著以厭氧培養41小時後，分析琥珀酸的濃度，結果如表五所示。
3.測試不同溫度之培養條件下琥珀酸的表現量
菌株PCI 634AS196先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述(A)PAJ培養基之醱酵槽中。於pH 7.2及溫度分別為28、34、37、39℃之培養條件下，先以有氧培養至OD值介於2.5-3，之後加入6g/L碳酸氫鈉，接著以厭氧培養40-43小時後，分析琥珀酸的濃度，結果如表六所示。
4.改變有氧與厭氧之培養時間下琥珀酸的表現量
菌株PCI 634(請確認)先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述(A)PAJ培養基之醱酵槽中。於34℃及pH 7.2之培養條件下，先以有氧培養24小時，之後加入10g/L碳酸氫鈉，接著再以厭氧培養24小時後，分析琥珀酸的含量，另以5g/L酵母萃取物作為對照組，且其中並添加等同實驗組(A)PAJ所含有的碳源(葡萄糖、蔗糖與果糖測量)，測量結果如表七所示。
實驗3：其他改質菌珠之琥珀酸表現量
1.菌株
採用菌株JD645，相較於菌株634，菌株JD645額外剔除了ptsG，並增加pck(如SEQ：3)之表現，可強化磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)往草醯乙酸(oxalacetate，OAA)之代謝流，且減少葡萄糖的消耗。
2.測試其他改質菌株之琥珀酸表現狀況
菌株JD645先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述(B)PAJ及(C)PAJ之培養基的醱酵槽中。於34℃
及pH 7.2之培養條件下，先以有氧培養24小時，之後加入20g/L碳酸氫鈉，接著再以厭氧培養120小時後，分析琥珀酸的含量，結果如表八所示。
實驗4：以濃縮柳橙汁為培養基生產琥珀酸
1.濃縮柳橙汁的來源與前處理
以果汁工廠中過期或過剩的產品為主，將不再提供給消費者的柳橙汁製成無果渣的濃縮柳橙汁(orange juice concentrate,OJC)，其pH值約3-4、所測得的葡萄糖含量約為100-210g/L，蛋白質濃度為0.03-0.1mg/mL，不須經過過濾處理，但同樣需經高溫滅菌後始可直接作為培養基使用。
2.以上述OJC為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
提供以OJC為主的培養基，其包含：OJC(葡萄糖20-25g/L)、磷酸緩衝溶液、與0.5mM IPTG。採用菌株JD652，其係以JD640為基礎，加入能大量表現蔗糖代謝相關基因之質體CSCKAB，以增加果汁中的蔗糖分解為單糖，此外，以菌株JD645作為比較組。
將菌株JD652及JD640先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述10% OJC培養基(葡萄糖20-25g/L)之醱酵槽中。另外，以含0.15-5g/L氯化銨之PB作為對照組，其中並添加等同實驗組10% OJC所具有的碳源，於34℃及pH 7.2之培養條件下，先以有氧培養24小時，之後加入10g/L碳酸氫鈉，接著再以厭氧培養96小時後，分析琥珀酸的含量，結果如表九所示。
實驗5：以廢棄胡蘿蔔綜合果汁為培養基生產琥珀酸
1.胡蘿蔔綜合果汁來源的來源與前處理
由於抽樣後無法再提供給消費者飲用，因此以果汁工廠生產線之品檢抽樣品為主，將其稱之為廢棄胡蘿蔔綜合果汁(carrot fruit juice，CFJ)。其中，以胡蘿蔔為主要成分，加入至少一種以上的其他果汁，且此廢棄胡蘿蔔綜合果汁中並不包含果渣。再者，CFJ之pH值約4-5、所測得的碳源含量約為：5-10g/L葡萄糖、35-50g/L蔗糖與15-30g/L果糖，分析其總氮量約
為470-500mg/L、而蛋白質濃度約是0.03-0.1mg/mL。此CFJ不需經過過濾程序，但需經高溫滅菌後始可直接作為培養基使用。
2.以上述CFJ為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
提供以CFJ為主的培養基，其包含：CFJ(含9g/L葡萄糖、45g/L蔗糖與25g/L果糖)、磷酸緩衝溶液、與0.5mM IPTG。菌株則使用JD654，其係以JD640為基礎，增加pck與CSCKAB，以強化代謝流，並促使果汁內的蔗糖分解為單糖。
菌株JD654先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述CFJ培養基之醱酵槽中。另外，以含0.15-5g/L氯化銨之PB作為對照組，其中並添加等同實驗組CFJ所具有的碳源，於34℃及pH 7.2之培養條件下，加入10g/L碳酸氫鈉，且以厭氧培養72小時後，分析琥珀酸的含量，結果如表十所示。
3.以上述CFJ搭配OJC作為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
提供以CFJ為主的培養基，其包含：CFJ+10% OJC(共含30-35g/L葡萄糖、35-40g/L蔗糖、及40-45g/L果糖)、磷酸緩衝溶液、與0.5mM IPTG。菌株則使用JD654，其係以JD645
為基礎，加入能大量表現蔗糖代謝相關基因之質體CSCKAB，以增加果汁中的蔗糖分解為單糖，促進琥珀酸的生成，同時，亦以菌株JD645作為比較組。
菌株JD645與JD654先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述CFJ+10% OJC培養基之醱酵槽中。於34℃及pH 7.2之培養條件下，先以有氧培養24小時，之後加入10g/L碳酸氫鈉，接著再以厭氧培養96小時後，分析琥珀酸的含量，結果如表十一所示。
實驗6：以非當季柳橙汁作為培養基生產琥珀酸
1.柳橙汁的來源與前處理
以保存於冷凍環境之市售非當季含果肉柳橙汁(orange juice，OJ)為主，其pH值約2.5-4、所測得之碳源含量約為：約15-35g/L葡萄糖、25-55g/L蔗糖、與25-55g/L果糖，而蛋白質濃度約0.03-0.1mg/mL。此OJ不需經過過濾程序，但需經高溫滅菌後始可直接作為培養基使用。
2.以上述OJ為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
提供以OJ為主的培養基，其包含：50% OJ(含10-15g/L葡萄糖、16-20g/L蔗糖、與20-25g/L果糖)、磷酸緩衝溶液、與0.5mM IPTG。菌株JD654先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述50% OJ培養基之醱酵槽中。另外，以含0.15-5g/L氯化銨之PB作為對照組，其中並添加等同實驗組50% OJ所具有的碳源，於34℃及pH 7.2之培養條件下，加入10g/L碳酸氫鈉，且以厭氧培養72小時後，分析琥珀酸的含量，結果如表十二所示。
實驗7：以農業廢棄檸檬皮汁作為培養基生產琥珀酸
1.檸檬皮汁的來源與前處理
農業廢棄物檸檬皮汁(lemon peel juice，LPJ)，係指去除可利用之果肉後所剩之檸檬皮廢棄物。LPJ的處理方式為：將檸檬皮剪碎後，透過高速粉碎機粉碎，並以檸檬皮：RO逆滲透水為3：2之比例進行水萃30分鐘，接著以超高速離心機6000g離心20分鐘，留取上清液，並將上清液經過粗篩與細篩過篩，其後再以不織布作為濾膜進行抽氣過濾，以獲得不含檸檬皮之LPJ固型物。LPJ之pH值約3-3.65，所測得之碳源含量約
為：5-10g/L葡萄糖、1-10g/L蔗糖、及2-10g/L果糖，總氮量約是1500-1740mg/L、蛋白質濃度約0.1-0.2mg/mL，需經高溫滅菌後始可直接作為培養基使用。
2.以上述LPJ搭配OJC為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
提供以LPJ為主的培養基，其包含：LPJ+10% OJC(共含25-35g/L葡萄糖、0.5-2g/L蔗糖、與25-30g/L果糖)、磷酸緩衝溶液、與0.5mM IPTG。菌株JD645與JD654先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述LPJ+10% OJC培養基之醱酵槽中。於34℃及pH 7.2之培養條件下，先以有氧培養24小時，之後加入10g/L碳酸氫鈉，接著再以厭氧培養96小時後，分析琥珀酸的含量，結果如表十三所示。
3.以上述LPJ搭配OJ作為培養基並利用基因改質菌株生產琥珀酸
培養基包含：LPJ+50% OJ(共含20-25g/L葡萄糖、5-10g/L蔗糖、與25-30g/L果糖)、磷酸緩衝溶液、與0.5mM IPTG。菌株JD654先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述LPJ+50% OJ培養基之醱酵槽中。另外，以含0.15-5
g/L氯化銨之PB作為對照組，其中並添加等同實驗組LPJ+50% OJ所具有的碳源，於34℃及pH 7.2之培養條件下，加入10g/L碳酸氫鈉，且以厭氧培養72小時後，分析琥珀酸的含量，結果如表十四所示。
醱酵生產乳酸
實驗8：以不同處理方式所產生之鳳梨汁為培養基生產乳酸
1.鳳梨汁的來源與前處理
使用鳳梨蔬果廢棄物所產生之鳳梨汁(pineapple juice，PAJ)，係指去除可利用之果肉後或生產過剩之含皮、莖、葉之鳳梨蔬果廢棄物經處理所獲得的鳳梨汁，其處理方式與前述琥珀酸生產製程所使用之(A)、(B)、(C)三種處理方式相同，故於此不再贅述。
2.以上述(A)PAJ為培養基並利用基因改質菌株生產乳酸
提供以PAJ為主的培養基，其包含：PAJ(20-40g/L葡萄糖、4-34g/L蔗糖與28-53g/L果糖)、磷酸緩衝溶液、與0.5mM
IPTG。菌株PCI 627先以LB培養基隔夜培養在37℃中，再接種至含有上述(A)PAJ培養基之醱酵槽中。另外，分別以含0.15-5g/L氯化銨之PB、2.5g/L酵母萃取物、5g/L酵母萃取物作為對照組，其中各自添加等同實驗組(A)PAJ所具有的碳源(葡萄糖、蔗糖與果糖)，在37℃及pH 7之條件下，於搖瓶中以有氧培養48小時，接著分析乳酸的濃度，結果如表十五所示。
經由以上實施例可知，本發明之實施例的基因改質菌株可使用蔬果副產品或蔬果廢棄物作為代謝基質，以生產琥珀酸或乳酸。如此一來，不但能有效地使蔬果副產品或蔬果廢棄物循環再生，且大幅降低琥珀酸或乳酸的生產成本，以及提昇琥珀酸或乳酸的產量。
雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 促進琥珀酸或乳酸生產的基因改質菌株及方法
<150> US 62/254,195
<151> 2015-11-12
<160> 3
<210> 1
<211> 1284
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
<210> 2
<211> 3623
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
<210> 3
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
Claims (20)
- 一種以蔬果副產品或蔬果廢棄物為代謝基質以生產琥珀酸的基因改質菌株，其中與生產琥珀酸相關的經剔除基因由以下組成：一經剔除之內源性ldhA基因，該經剔除之內源性ldhA基因不表現乳酸去氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)；一經剔除之內源性adhE基因，該經剔除之內源性adhE基因不表現乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)；以及一經剔除之內源性ackA-pta基因，該經剔除之內源性ackA-pta基因不表現乙酸激酶(acetate kinase)及磷酸乙醯基轉移酶(phosphotransacetylase,ACK-PTA)；其中，該基因改質菌株係培養於一培養基中，且該培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物，該基因改質菌株同時利用該蔬果副產品或蔬果廢棄物中的葡萄糖、蔗糖以及果糖作為碳源，以產生琥珀酸。
- 如申請專利範圍第1項所述之基因改質菌株，其中該碳源包含5-50g/L葡萄糖、0.5-50g/L蔗糖、及2-60g/L果糖。
- 如申請專利範圍第1項所述之基因改質菌株，其中該培養基進一步添加有約1-50g/L碳酸氫鈉。
- 如申請專利範圍第1項所述之基因改質菌株，其中該培養基的培養溫度為26-40℃，而pH值範圍為6-8。
- 如申請專利範圍第1項所述之基因改質菌株，其中該菌株係以該培養基於一厭氧或有氧狀態下進行培養。
- 如申請專利範圍第5項所述之基因改質菌株，其中該菌株係於該厭氧狀態培養12-120小時。
- 如申請專利範圍第5項所述之基因改質菌株，其中該菌株係於該有氧狀態培養12-48小時。
- 如申請專利範圍第1項所述之基因改質菌株，其中該蔬果副產品或蔬果廢棄物包含溫帶水果、亞熱帶水果、熱帶水果、及根莖類蔬菜之副產品或廢棄物。
- 一種生產琥珀酸的方法，包含以下步驟：提供一如申請專利範圍第1項所述之基因改質菌株；提供一培養基，該培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物，該基因改質菌株同時利用該蔬果副產品或蔬果廢棄物中的葡萄糖、蔗糖以及果糖作為碳源；將該基因改質菌株培養於該培養基中，該培養基以一培養溫度為26-40℃及一pH值範圍為6-8進行培養產生一培養液，使該基因改質菌株以該蔬果副產品或蔬果廢棄物作為代謝基質，而於該培養液中產生琥珀酸；收取包含琥珀酸的該培養液；以及由包含琥珀酸的該培養液分離出琥珀酸。
- 一種以蔬果副產品或蔬果廢棄物為代謝基質以生產乳酸的基因改質菌株，其中與生產乳酸相關的經剔除基因由以下組成： 一經剔除之內源性adhE基因，該經剔除之內源性adhE基因經剔除後不表現乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)；以及一經剔除之內源性ackA-pta基因，該經剔除之內源性ackA-pta基因經剔除後不表現乙酸激酶(acetate kinase)及磷酸乙醯基轉移酶(phosphotransacetylase,ACK-PTA)；其中，該基因改質菌株係培養於一培養基中，且該培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物，該基因改質菌株同時利用該蔬果副產品或蔬果廢棄物中的葡萄糖、蔗糖以及果糖作為碳源，以產生乳酸。
- 如申請專利範圍第10項所述之基因改質菌株，其中該碳源包含5-50g/L葡萄糖、0.5-50g/L蔗糖、及2-60g/L果糖。
- 如申請專利範圍第10項所述之基因改質菌株，其中該培養基進一步添加有約1-50g/L碳酸氫鈉。
- 如申請專利範圍第10項所述之基因改質菌株，其中該培養基的培養溫度為26-40℃，而pH值範圍為6-8。
- 如申請專利範圍第10項所述之基因改質菌株，其中該菌株係以該培養基於一厭氧或有氧狀態下進行培養。
- 如申請專利範圍第14項所述之基因改質菌株，其中該菌株係於該厭氧狀態培養12-120小時。
- 如申請專利範圍第14項所述之基因改質菌株，其中該菌株係於該有氧狀態培養12-48小時。
- 如申請專利範圍第10項所述之基因改質菌株，其中該蔬果副產品或蔬果廢棄物包含溫帶水果、亞熱帶水果、熱帶水果、及根莖類蔬菜之副產品或廢棄物。
- 一種生產乳酸的方法，包含以下步驟：培養一如申請專利範圍第10項所述之菌株；提供一培養基，該培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物，該基因改質菌株同時利用該蔬果副產品或蔬果廢棄物中的葡萄糖、蔗糖以及果糖作為碳源；將該菌株培養於該培養基中，該培養基以一培養溫度為26-40℃及一pH值範圍為6-8進行培養產生一培養液，使該菌株以該蔬果副產品或蔬果廢棄物為其代謝基質，而於該培養液中產生乳酸；收取包含乳酸的該培養液；以及由包含乳酸的該培養液分離出乳酸。
- 一種以蔬果副產品或蔬果廢棄物為代謝基質以生產琥珀酸的基因改質菌株，其中與生產琥珀酸相關的經剔除基因由以下組成：一經剔除之內源性ptsG基因；一經剔除之內源性ldhA基因，該經剔除之內源性ldhA基因不表現乳酸去氫酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)；一經剔除之內源性adhE基因，該經剔除之內源性adhE基因不表現乙醇去氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)；以及一經剔除之內源性ackA-pta基因，該經剔除之內源性ackA-pta基因不表現乙酸激酶(acetate kinase)及磷酸乙醯基 轉移酶(phosphotransacetylase,ACK-PTA)；其中，該基因改質菌株係培養於一培養基中，且該培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物，該基因改質菌株同時利用該蔬果副產品或蔬果廢棄物中的葡萄糖、蔗糖以及果糖作為碳源，以產生琥珀酸。
- 一種生產琥珀酸的方法，包含以下步驟：提供一如申請專利範圍第19項所述之基因改質菌株；提供一培養基，該培養基包含至少一蔬果副產品或蔬果廢棄物，該基因改質菌株同時利用該蔬果副產品或蔬果廢棄物中的葡萄糖、蔗糖以及果糖作為碳源；將該基因改質菌株培養於該培養基中，該培養基以一培養溫度為26-40℃及一pH值範圍為6-8進行培養產生一培養液，使該基因改質菌株以該蔬果副產品或蔬果廢棄物作為代謝基質，而於該培養液中產生琥珀酸；收取包含琥珀酸的該培養液；以及由包含琥珀酸的該培養液分離出琥珀酸。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201562254195P | 2015-11-12 | 2015-11-12 | |
| US62/254,195 | 2015-11-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TW201716568A TW201716568A (zh) | 2017-05-16 |
| TWI673360B true TWI673360B (zh) | 2019-10-01 |
Family
ID=58692088
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TW105136814A TWI673360B (zh) | 2015-11-12 | 2016-11-11 | 促進琥珀酸或乳酸生產的基因改質菌株及方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9970016B2 (zh) |
| TW (1) | TWI673360B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109439683B (zh) * | 2018-11-14 | 2022-05-06 | 天津大学 | 抑制、敲除和/或表达基因在提高丙酮酸代谢路径产物及提高单克隆抗体表达量中的应用 |
| CN116710559A (zh) | 2020-12-18 | 2023-09-05 | 因比奥斯公司 | 变体蔗糖渗透酶多肽 |
| PL448420A1 (pl) | 2024-04-26 | 2025-10-27 | Politechnika Poznańska | Sposób biochemicznego wytwarzania kwasu bursztynowego z substratu organicznego |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286415A (zh) * | 2011-09-07 | 2011-12-21 | 天津工业生物技术研究所 | 琥珀酸高产菌株及其应用 |
| CN105483166A (zh) * | 2014-10-09 | 2016-04-13 | 天水绿健生物技术有限责任公司 | 一种琥珀酸的生物制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7244610B2 (en) | 2003-11-14 | 2007-07-17 | Rice University | Aerobic succinate production in bacteria |
| US7262046B2 (en) | 2004-08-09 | 2007-08-28 | Rice University | Aerobic succinate production in bacteria |
| US7223567B2 (en) | 2004-08-27 | 2007-05-29 | Rice University | Mutant E. coli strain with increased succinic acid production |
| EP1789569A2 (en) | 2004-09-17 | 2007-05-30 | Rice University | High succinate producing bacteria |
| CN101215582B (zh) | 2007-12-28 | 2010-12-15 | 江南大学 | 利用秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法 |
| CN102803470A (zh) | 2009-04-02 | 2012-11-28 | 佛罗里达大学研究基金会公司 | 针对生产琥珀酸路径的工程方法 |
| CN101608192B (zh) | 2009-07-22 | 2012-04-04 | 安徽丰原发酵技术工程研究有限公司 | 一种利用玉米芯生产丁二酸的方法 |
| WO2011111693A1 (ja) | 2010-03-09 | 2011-09-15 | 三菱化学株式会社 | コハク酸の製造方法 |
| WO2011163128A1 (en) * | 2010-06-21 | 2011-12-29 | William Marsh Rice University | Engineered bacteria produce succinate from sucrose |
-
2016
- 2016-11-11 US US15/348,984 patent/US9970016B2/en active Active
- 2016-11-11 TW TW105136814A patent/TWI673360B/zh active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102286415A (zh) * | 2011-09-07 | 2011-12-21 | 天津工业生物技术研究所 | 琥珀酸高产菌株及其应用 |
| CN105483166A (zh) * | 2014-10-09 | 2016-04-13 | 天水绿健生物技术有限责任公司 | 一种琥珀酸的生物制备方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US9970016B2 (en) | 2018-05-15 |
| US20170137829A1 (en) | 2017-05-18 |
| TW201716568A (zh) | 2017-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bajić et al. | Biotechnological production of sustainable microbial proteins from agro-industrial residues and by-products | |
| Peng et al. | Indole-3-acetic acid from Azosprillum brasilense promotes growth in green algae at the expense of energy storage products | |
| Techaparin et al. | High-temperature ethanol production using thermotolerant yeast newly isolated from Greater Mekong Subregion | |
| Vinzelj et al. | Employing anaerobic fungi in biogas production: challenges & opportunities | |
| Dos Santos et al. | Cultivation of Spirulina maxima in medium supplemented with sugarcane vinasse | |
| Dhandayuthapani et al. | Bioethanol from hydrolysate of ultrasonic processed robust microalgal biomass cultivated in dairy wastewater under optimal strategy | |
| CN108220169B (zh) | 一种降解聚苯乙烯菌种的分离筛选及其鉴定方法 | |
| TWI673360B (zh) | 促進琥珀酸或乳酸生產的基因改質菌株及方法 | |
| Schroeder et al. | Enrichment of anaerobic microbial communities from midgut and hindgut of sun beetle larvae (Pachnoda marginata) on wheat straw: effect of inoculum preparation | |
| Camargo et al. | Biochemical evaluation, molecular characterization and identification of novel yeast strains isolated from Brazilian savannah fruits, chicken litter and a sugar and alcohol mill with biotechnological potential for biofuel and food industries | |
| Li et al. | pH shifting adaptive evolution stimulates the low pH tolerance of Pediococcus acidilactici and high L-lactic acid fermentation efficiency | |
| Sunish et al. | Microbial biomass | |
| Sagar et al. | Enhanced productivity of nutrient-rich single cell protein from Paradendryphiella arenariae PG1 through valorization of agro-industrial waste: A Green symphony from Waste-to-Protein Approach | |
| Lappe-Oliveras et al. | Genotypic and phenotypic diversity of Kluyveromyces marxianus isolates obtained from the elaboration process of two traditional Mexican alcoholic beverages derived from agave: pulque and henequen (Agave fourcroydes) mezcal | |
| Guo et al. | Co-production of plant-and microbial-proteins from waste tobacco leaves by optimizing alkaline extraction and strengthening pectin bioconversion | |
| CN108699569B (zh) | 繁殖能够发酵葡萄糖和木糖的酵母的方法 | |
| JP5051727B2 (ja) | 耐熱性エタノール生産酵母及びこれを用いたエタノール生産方法 | |
| Xu et al. | Adaptive evolution and mechanism elucidation for ethanol tolerant Saccharomyces cerevisiae used in starch based biorefinery | |
| Kim et al. | Cellulose degrading basidiomycetes yeast isolated from the gut of grasshopper in Korea | |
| dos Santos Nascimento et al. | Single cell protein production by Candida robusta isolated from sugar cane (Saccharum sp.) for animal feed | |
| Antai | Protein enrichment of Irish potato (Solanium tuberosium) peels through solid substrate fermentation by Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus niger | |
| Liu et al. | The effect of Lactobacillus planturum YQM48 inoculation on the quality and microbial community structure of alfalfa silage cultured in Saline-alkali soil | |
| CN116948833A (zh) | 一种宛氏拟青霉及其应用 | |
| Pongcharoen et al. | Physiological responses contributing to multiple stress tolerance in Pichia kudriavzevii with potential enhancement for ethanol fermentation | |
| Alam et al. | Solid state bioconversion of oil palm empty fruit bunches for production of citric acid by wild strains of Aspergillus niger |