TWI670082B

TWI670082B - 超音波前驅物製備方法

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Publication number: TWI670082B
Application number: TW104110368A
Authority: TW
Inventors: 伊格德漢瑞克森; 史芬克菲爾; 歐勒喬漢娜斯托克陸德; 諾德莫奇斯路得馬瑞特史瓦德; 佩桑拓
Original assignee: 挪威商Ｇｅ保健公司
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2015-03-31
Publication date: 2019-09-01
Also published as: EP3125950A1; JP2020059712A; JP2022070903A; US20170080113A1; KR20160137555A; SG10202101831PA; HK1214176A1; JP6949488B2; CN117338958A; KR102350284B1; WO2015150354A1; GB201405735D0; TW201544124A; SG11201607455VA; JP2017514792A; CN104940960A

Abstract

本發明係關於一種製備包含磷脂穩定化全氟丁烷微泡之超音波對比劑前驅物之方法。該方法經得起商業規模製造之考驗，且提供該等微泡之更一致瓶間產量及粒度分佈。亦提供使用本發明方法製備套組及超音波對比劑之方法。

Description

超音波前驅物製備方法

基於全氟化碳(例如全氟丙烷或全氟丁烷)之磷脂穩定化微泡之超音波對比劑已在此項技術中所熟知[參見例如Wheatley等人，J.Drug Del.Sci.Technol.,23(1),57-72(2013)]。

WO 97/29782教示可藉由在選自蔗糖、麥芽糖、海藻糖、棉子糖或水蘇糖，較佳蔗糖之冷凍乾燥穩定劑存在下凍乾全氟化碳微泡製備在室溫下穩定之超音波對比劑前驅物。

WO 99/03558揭示一種選擇形成多分散混合物之超音波對比氣體微泡以得到具有更緊密粒度分佈(亦即單分散)之該等微泡之方法。描述之方法涉及浮選及再懸浮。

WO 99/08715揭示一種製備包含含氣體小泡之水性分散液之醫藥組成物之方法，該等小泡之膜包含兩親媒性成膜材料，該方法包含：(i)自包含兩親媒性成膜材料之混合物產生含氣體小泡之液體分散液； (ii)凍乾該等含氣體小泡之液體分散液；(iii)藉由無菌水性液體對步驟(ii)之凍乾產物進行復水以產生含氣體小泡之水性分散液；及(iv)處理步驟(i)或步驟(iii)之水性分散液產物或步驟(ii)之凍乾產物以產生含氣體小泡之實質上不含聚集體之無菌水性分散液。

WO 99/08715教示步驟(i)與(ii)之間的時間應降至最短以抑制微泡聚結形成非所需較大物質。然而，WO 99/08715未教示含氣體小泡應在凍乾之前經受尺寸控制、必須在凍乾步驟之前使用低溫保護劑/凍乾保護劑或在批量製造方法中分配至多個個別小瓶中。

EP 1228770 A1教示一種製備包含氣體微泡之凍乾超音波對比劑之方法，其中凍乾前驅物小瓶在頂部空間氣體之減壓下密封。據稱減壓幫助控制在前驅物小瓶之復水後形成之水性微泡組成物中之粒度。

WO 2004/069284解決獲得具有規定粒度分佈之磷脂穩定化氣體微泡超音波對比劑之問題。WO 2004/069284教示實質上水不可混溶的有機溶劑應在凍乾之前用於微泡製備乳液。WO 2004/069284教示在凍乾前驅物復水後獲得之微泡具有相對較小直徑及窄粒度分佈。

Solis等人[Int.J.Pharmaceut.,396(1-2),30-38(2010)]研究包括凍乾保護劑之賦形劑對凍乾全氟丙烷微泡前驅物之影響。其推斷葡萄糖為最好凍乾保護劑，緊接著為海藻糖，二者優於蔗糖或甘露糖醇。

Feshitan等人[J.Coll.Interf.Sci.,329,316-324(2009)]報導相比於界面活性劑塗佈微泡，脂質塗佈微泡在離心之後穩定，且脂質殼高度膠黏且對於氣體而言相對不可滲透。Feshitan等人報導在4-5μm尺寸範圍內之全氟丁烷微泡穩定至少2天，但傾向於在2週之後分解為較小尺寸微泡(1-2μm)。

仍需要控制微泡濃度及粒度分佈、產量及對比劑之其他重要特徵之瓶間變化的超音波凍乾前驅物製備方法。該等方法需要經得起商業規模製造考驗，且以滿足管制要求(例如美國藥典(U.S.Pharmacopeia)及ICH指南(ICH Guidelines))之小瓶含量均一性及安全概況傳遞前驅物產物。

諸如音波處理及高剪切乳化作用之習知微泡超音波對比劑製備方法提供良好產量及低成本生產，以及按比例擴大至商業製造之能力。其受難以控制微泡之粒度分佈之缺點困擾。儘管已開發准許製備具有更緊密粒度分佈之該等微泡之其他製備技術，然此等替代方法為產量較低的，涉及高成本設備或就按比例擴大至商業生產方法而言太緩慢。

本發明力圖提供經得起商業規模製造考驗，但亦充分控制微泡濃度、粒度分佈、產量及對比劑之其他重要特徵之瓶間變化之方法。

本發明人已發現在生產批量大小為數千之微泡對比劑小瓶中，兩個關鍵參數對於控制變化性重要：(a)在凍乾之前的微泡尺寸範圍；及(b)分配至給定小瓶中與小瓶內容物於-40至-70℃冷凍時之間的經過時間(「保持時間」)。

本發明提供一種控制兩個參數之方法，其具有以下隨之而來的優勢：(i)各小瓶中之最佳微泡產量及濃度；(ii)控制瓶間之含量均一性。

亦已發現本發明之對比劑前驅物對多價陽離子較不敏感。

不希望受理論束縛，本發明人咸信由於液體基質(例如蔗糖溶液)與充氣微泡之間的高密度增量，微泡傾向於快速分離至液體體積頂部(「結乳皮」)。需要使此結乳皮降到最少且加以控制以提供上文所述之益處(i)及(ii)。咸信可能的是表層中之微泡之高濃度削弱濾餅在凍乾期間之乾燥，及/或過高局部濃度耗盡微泡之存活率，因為其部分截留於最終蔗糖結構外部，亦即作為表面中之孔洞而非完全嵌入之氣孔。

圖1顯示保持時間對前驅物小瓶中之微泡含量之影響-表示為存在於小瓶中之微泡在小於三分鐘之保持時間下之平均位準之百分比。在約20分鐘之保持時間之情況下，每小瓶之微泡產量減少至初始值之約85%，且在60分鐘之保持時間之情況下，減少至初始值之僅約75%。

圖2顯示保持時間對前驅物小瓶之UoC；個別小瓶值佔組平均值之%的影響。保持時間範圍愈長，每小瓶之微泡之相異性愈大。因此，表示為相對標準差(RSD)之微泡含量之跨度自小於3分鐘之保持時間下之15%經由小於20分鐘下之22%增加至小於60分鐘下之高達29%。虛水平線顯示對於UoC之藥典要求，其顯示為個別單元距批次平均值之最大可允許偏差；±25%。如所指出，在小於3分鐘之保持時間範圍下，所有小瓶均在此等要求內。即使在20分鐘之保持時間範圍內，20隻小瓶中有5隻超出藥典中設定之要求。在60分鐘之保持時間範圍下，39隻測試小瓶中有11隻在要求之外。

組合起來，圖1及圖2展示為了使產量達到最佳且為了製造符合關於UoC之法規要求(瓶間差異)的產品，在填充與凍乾之間的短保持時間及窄保持時間差異之重要性。

圖3顯示微泡尺寸(以μm計之直徑)對浮選速率之影響。曲線係基於斯托克斯方程對於1g/ml之密度增量及1mPa s之黏度計算。值得注意的是，凍乾期間之填充高度典型地為1cm且懸浮液中之所有5μm微泡將因此在大致12分鐘內與液體基質頂部隔離。

圖4顯示凍乾之前的微泡損失百分比相對於微泡尺寸之資料。結果來自就27批次中之每一者而言，在凍乾之前及之後的10隻小瓶之分析。圖3及4在一起展示較大微泡結乳皮快得多，且因此導致微泡產量之損失。因此，前驅物小瓶中之UoC對存在大微泡預凍乾比對更小微泡更敏感。圖5亦顯示損失自2.5μm氣泡之情況下之大致40%增加至3.7μm氣泡之情況下之80%。圖3及4在一起展示為何第一態樣之方法之步驟(ii)之尺寸調節預凍乾重要。

在第一態樣中，本發明提供一種製備超音波對比劑前驅物之方法，該前驅物包含藉由蔗糖中之氫化卵磷脂醯絲胺酸穩定化之全氟丁烷微泡之凍乾組成物；其中該方法包含：(i)提供藉由氫化卵磷脂醯絲胺酸穩定化之該等全氟丁烷微泡於水溶液中之水性懸浮液；(ii)將該等微泡之尺寸調節為2至5μm範圍內之中位數尺寸；(iii)藉由無菌蔗糖水溶液稀釋來自步驟(ii)之尺寸調節之懸浮液，得到5-20% w/v之最終蔗糖濃度；(iv)將來自步驟(iii)之組成物之等分試樣分配至小瓶中，得到填充小瓶；(v)在步驟(iv)之分配完成之後的小於5分鐘之保持時段內將各該填充小瓶冷卻至-40℃至-70℃之溫度；(vi)視需要重複步驟(iv)及(v)直至已獲得所需數目之冷卻、填充小瓶；(vii)冷凍乾燥來自步驟(v)及(vi)之冷卻、填充小瓶；(viii)藉由全氟丁烷在來自步驟(viii)之凍乾小瓶中回填頂部空間氣體；(ix)藉由封閉件密封來自步驟(vii)之小瓶。

術語「對比劑」具有其於活體內醫學成像領域中之習知含義，且係指呈適合於哺乳動物投藥之形式的藥劑，其幫助提供比藉由單獨對哺乳動物個體成像可獲得之影像更清晰的相關區域或器官中之影像。術語「個體」意謂活體內哺乳動物，較佳為活體內完整哺乳動物身體，且更佳為活的人類個體。片語「呈適合於哺乳動物投藥之形式」意謂無菌、無熱原質、不具有產生毒性或副作用之化合物且在生物相容性pH(大致pH 4.0至10.5)下調配之組成物。該等組成物不具有可能有引起活體內栓塞之風險的微粒，且經調配以使得不在與生物流體(例如血液)接觸時出現沈澱。該等組成物亦僅含有生物學相容之賦形劑，且較佳為等張的。

如同其他活體內顯影劑，對比劑經設計以對待成像之哺乳動物個體具有最小藥理學效應。較佳地，對比劑可以侵襲性最小，亦即當在專業醫學專門知識下進行時對哺乳動物個體無實質性健康風險之方式向哺乳動物身體投予。該等侵襲性最小之投予較佳為在不需要局部或全身麻醉的情況下靜脈內投予至該個體之外周靜脈。

術語「微泡」具有其於活體內超音波成像領域中之習知含義，且係指直徑典型地在0.5與10μm之間的氣體微泡。在大於7μm之尺寸下，存在肺毛細管中之滯留(栓塞)之實質性風險。該等微泡與紅血球尺寸類似，其允許該等微泡在整個哺乳動物身體中之微血管及毛細管中顯示類似特徵[Sirsi等人，Bubble Sci.Eng.Technol.,1(1-2),3-17(2009)]。

適合之本發明之微泡藉由如Sirsi等人(上文)描述之磷脂殼或包衣，特定言之存在於氫化卵磷脂醯絲胺酸(H-EPS)中之磷脂穩定化。存在於H-EPS中之磷脂主要為磷脂醯絲胺酸及磷脂酸[Hvattum等人，J.Pharm.Biomed.Anal,42,506-512(2006)]。

全氟丁烷(「PFB」)具有其標準化學含義，且亦在醫療使用的情況下稱為全氟正丁烷(perflubutane)。全氟正丁烷之化學式為CF₃CF₂CF₂CF₃或C₄F₁₀，具有-2.2℃之沸點。商業全氟正丁烷含有少量(典型地2-4%)全氟異丁烷異構物，亦即CF₃CF(CF₃)CF₃。

術語「水性懸浮液」係指微泡於水性溶劑中之懸浮液，其包含水及/或水可混溶性溶劑。水性溶劑較佳為生物相容性載劑。術語「生物相容性載劑」意謂流體，尤其為液體，使得組成物為生理學上可容許的，亦即可在無毒性或不當不適感的情況下向哺乳動物身體投予。生物相容性載劑宜為可注射載劑液體，諸如無菌、無熱原質注射用水；水溶液，諸如生理鹽水(其可有利地經平衡以使得用於注射之最終產物為等張的)；包含生物相容性緩衝劑之水性緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝液)；一或多種調節張力之物質(例如具有生物相容性相對離子之電漿陽離子之鹽)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇或甘露糖醇)、二醇(例如甘油)或其他非離子多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇及其類似物)之水溶液。較佳地，生物相容性載劑為無熱原質注射用水、等張生理鹽水或磷酸鹽緩衝液。因此，水性懸浮液適當地不包括水不可混溶有機溶劑。

術語「前驅物」係指一種方便或套組形式之對比劑，其經設計以使得當復水時易於形成所需超音波對比劑。

術語「填充小瓶」係指裝填小瓶，已向其中分配組成物之等分試樣之小瓶，亦即經分配之小瓶。小瓶並非實體上充滿，因為小瓶體積將典型地為10mL，且分配體積為約2mL-在組成物上方留下頂部空間氣體。術語『頂部空間氣體』具有其習知含義，且係指小瓶內凍乾組成物上方之氣體。

片語「保持時間」係指在填充，亦即在步驟(iv)中分配個別小瓶之後及開始將填充小瓶冷卻至-40至-70℃之前的時間延遲。

第一態樣之方法之步驟(i)之微泡製備可藉由此項技術中已知之多種方法進行，該等方法包括：(i)音波處理；(ii)高剪切乳化作用；(iii)膜乳化作用；(iv)同軸電流體動力學粉化作用(CEHDA)；及(v)微流體元件； (vi)噴墨印刷。

此等方法藉由Stride等人[Soft Matter,4,2350-2359(2008)]及其中之參考文獻描述。微泡製備方法之其他細節由Unnikrishnan等人[Am.J.Roentgenol.,199(2),292-299(2012)]提供。

噴墨印刷由Stride等人(上文)報導為更適合於液體填充粒子，因此不太適合於本發明之PFB微泡。音波處理為次佳的，因為其傾向於得到廣泛範圍之鼓泡尺寸，且微流體技術受不適合於商業製造之緩慢生產率的問題困擾[Wang等人，Ultraso.Med.Biol.,39(5),882-892(2013)]。

本發明之較佳生產方法為高剪切乳化作用，較佳使用轉子定子混合器-因為其賦予較大程度之尺寸控制、經得起大批量生產且提供靜態粒度分佈。微泡由在全氟化碳(此處為PFB)存在下攪拌無菌、無熱原質脂質懸浮液數秒形成。實施例1提供轉子定子微泡製備方法。轉子-定子混合器描述於Rodgers等人[Chem.Eng.Res.Rev.,90(3),323-327(2012)及Emulsion Formation and Stability[T.F.Tadros(編)，Wiley VCH(2013)]中-尤其參見Pacek等人第5章Emulsification in Rotor-Stator Mixers，第127-167頁。

第一態樣之方法之步驟(ii)之微泡尺寸調節可藉由此項技術中已知之多種方法進行，該等方法包括：(a)浮選及再懸浮之一或多個循環；或(b)差速離心；或(c)在大孔隙之情況下之交叉流過濾；或(d)場流份化。

浮選及再懸浮係藉由Kvale等人[Separat.Technol.,6,219-226 (1996)]且在本發明實施例2中描述。將脂質塗佈之全氟丁烷微泡之亞群分離及隔離於1-2μm及4-5μm之尺寸範圍內之差速離心係藉由Feshitan等人[J.Coll.Interf.Sci.,329,316-324(2009)]描述。

磷脂穩定化全氟丁烷微泡，諸如藥劑Sonazoid^TM為可撓且穩定的。其因此能夠在不顯著改變粒度分佈的情況下穿過5μm過濾器[Sontum,Ultraso.Med.Biol.,34(5),824-833(2008)]。此以及該過濾無法移除太小之微泡之事實意謂穿過過濾器本身並非用於本發明之步驟(ii)之尺寸調節之適合之方法。

某些製備技術旨在提供規定、更緊密粒度分佈之微泡。在該等情況下，第一態樣之方法之步驟(i)及(ii)實際上同時進行。彼等製備技術為CEHDA及微流體元件。因此，在一替代具體實例中，第一態樣包括與依序相反地同時進行步驟(i)及(ii)之選項。

片語「將各該填充小瓶冷卻至-40℃至-70℃之溫度」係指冷卻小瓶及內容物。將進行小瓶內容物之冷凍，但伴以一定程度之變化，因為一些小瓶可能在冷凍乾燥器架上為超冷的且因此需要較長時間以使小瓶內容物冷凍。

本發明方法尤其適用於商業規模生產，例如在一個生產批次中至多100,000，典型地約35,000至40,000之小瓶數目。在該大規模商業製造中，瓶間一致性，亦即使瓶間變化最小化為重要的。因此，步驟(iv)中分配之等分試樣較佳具有相同體積，且更佳控制在±3%之公差內。

在該等大數目之小瓶之情況下，本發明人已發現控制微泡之粒度分佈及凍乾之前的保持時間為重要的。已發現根據步驟(v)在蔗糖水溶液中之快速冷凍對於控制瓶間的內容物均一性，尤其微泡濃度為重要的。該快速冷卻可藉由此項技術中已知之方法進行，諸如：浸沒於液氮浴中；浸沒於有機溶劑/乾冰冷浴中；或冷凍乾燥器裝置內之冷架或環境。

在商業批量大小之該等情況下，已發現以逐步方式進行且等到所有小瓶經填充，隨後將該等分配/填充小瓶冷凍不可行。此與脂質塗佈PFB微泡一旦分離便持續超過2天保持穩定之習知觀點相抵觸[Feshitan等人，J.Coll.Interf.Sci.,329,316-324(2009)]。本發明人因此已發現為了控制批料之均一性，以下關鍵參數均必須加以控制：(i)在凍乾之前的中位數微泡尺寸；及(ii)『保持時間』-其必須降到最短至小於5分鐘，較佳小於3分鐘之時段。

其他細節提供於支撐實施例及圖式(下文)中。

在步驟(vi)中，「所需數目」係指對比劑前驅物之特定生產批次中之小瓶之總數。因此，步驟(vi)意欲涵蓋如下情況：滿足步驟(v)之保持時間限制之需要意謂對於給定批量大小之小瓶，可能需要分配及冷凍之多次重複循環直至整個批次之小瓶已經填充及冷卻，且準備好根據步驟(vii)凍乾。

術語「包含(comprising/comprises)」在整個本申請案中具有其習知含義且暗示藥劑或組成物必須具有所列之必需特徵或組分，但可另外存在其他特徵或組分。術語『包含』包括「主要由……組成」作為較佳子集，其意謂組成物在不存在其他特徵或組分之情況下具有所列組分。

在回填步驟(viii)中，將頂部空間氣體填充至大致大氣壓力，較佳剛好低於大氣壓力以促進小瓶之加塞，如此項技術中已知。

較佳具體實例

第一態樣之方法提供在14-18μl/mL範圍內之微球濃度，及在2.7-3.5μm範圍內之微泡粒度分佈(中位數尺寸)。

在第一態樣之方法中，步驟(v)之保持時段較佳小於3分鐘。步驟(v)之保持時段較佳經控制以使各填充小瓶之保持時段屬於1.0至2.75分鐘之時間範圍內。

在第一態樣之方法中，凍乾前驅物組成物較佳為無菌的。

在第一態樣之方法中，批量大小較佳在待經對比劑前驅物填充之500至80,000、更佳1,000至50,000、最佳5,000至45,000小瓶範圍內。約35,000至40,000小瓶之批量大小為理想的。

填充小瓶在步驟(v)中冷卻至之溫度較佳為約-60℃。較佳藉由負載至冷凍乾燥器裝置中，其中架子預先冷卻至-60℃來達成快速冷卻。

在第一態樣之方法中，步驟(iii)之蔗糖濃度較佳為8-12% w/v，更佳約10% w/v，最佳92mg/mL。蔗糖充當凍乾保護劑/低溫保護劑，且已顯示形成基質，其中脂質穩定化PFB微泡截留於前驅物之凍乾蔗糖內，使得微泡尺寸及濃度為預定義的-且不受最終用戶採用之復水程序影響。因此，在藉由適合之水性介質使前驅物小瓶復水時，蔗糖溶解，釋放磷脂穩定化PFB微泡[Sontum,Ultraso.Med.Biol.,34(5),824-833(2008)]。使用糖作為凍乾保護劑或低溫保護劑為在此項技術中熟知的，且描述於例如Solis等人[Int.J.Pharmaceut.,396,30-38(2010)]及其中之參考文獻中。

在第一態樣之方法中，步驟(ii)之尺寸調節較佳藉由以下進行：(a)浮選及再懸浮之一或多個循環；或(b)差速離心；或(c)其組合。

在第一態樣之方法中，在步驟(iii)之後，較佳檢查粒度分佈及微泡濃度為適合的，隨後進行分配步驟(iv)及後續凍乾。因此，合格/不合格標準在彼階段為重要的，用以避免分配及凍乾不適合材料之時間及費用。

在第一態樣之方法之步驟(iv)中，較佳並行地-亦即同時分配多個小瓶。在步驟(v)中，較佳並行地-亦即同時冷卻多個填充小瓶。一般熟習此項技術者可基於可用之分配裝置(特定言之可用於同時分配之分配器臂數目)、冷凍乾燥器裝置之尺寸及每小瓶之分配時間選擇在此處適合之數目。因此，知曉根據本發明申請專利範圍之每小瓶之分配時間及最大保持時間，熟習此項技術者可易於算出在必須對批次內之小瓶之子組進行步驟(v)之冷卻之前可填充多少小瓶。較佳地，各組之填充小瓶逐漸負載至維持於所需溫度(例如-60℃)下之冷凍乾燥器裝置(例如冷凍乾燥器內之架子)中，且維持於該溫度下直至整個批次已負載至冷凍乾燥器裝置中。在一較佳具體實例中，使用來自分配器之4根填充針以使得同時填充4個小瓶。以此方式填充70小瓶之子組，隨後負載至預先冷卻至-60℃之冷凍乾燥器中。

本發明之較佳超音波對比劑及前驅物為Sonazoid^TM(GE Healthcare AS)，先前稱為NC100100，如藉由Sontum[Ultraso.Med.Biol.,34(5), 824-833(2008)]描述。

用於第一態樣之方法中之適合之小瓶及閉合件為醫藥級的，且適合於凍乾，且為廣泛市售的。較佳使用平底小瓶，因為其增加小瓶與冷凍乾燥器之架子之間的熱傳遞。閉合件較佳經選擇以適合於凍乾，且經設計以准許蒸氣逸出小瓶-使得可能在冷凍乾燥器打開及未負載之前塞緊小瓶。

蔗糖亦為市售的-應使用醫藥級的。醫藥GMP級之全氟丁烷可獲自F2 Chemicals有限公司。H-EPS可商購自NOF公司，Amagasaki-Shi,Hyogo,Japan。

在第二態樣中，本發明提供一種製備用於製備超音波對比劑之套組之方法，該對比劑包含藉由氫化卵磷脂醯絲胺酸穩定化之全氟丁烷微泡於無菌水性介質中之懸浮液，該方法包含：(i)進行第一態樣之方法以得到含有如第一態樣中所定義之對比劑前驅物之小瓶；及(ii)提供適合於對該來自步驟(i)之前驅物小瓶復水之無菌水溶液之容器以得到該對比劑。

第一態樣之方法及第二態樣之套組製備方法中之前驅物之較佳具體實例為如第一態樣(上文)中所述。

此處之術語「套組」具有其於活體內成像領域中之習知含義，且係指顯影劑本身，或其前驅物，供應有所有所需組分以製備呈適合於哺乳動物投予之形式(如上文所定義)的相關對比劑。該等套組經設計以具有數週或數月之可用存放期，使得臨床醫師可在適合於對相關哺乳動物個體進行成像之時刻及時間製備顯影劑。此典型地對於臨床醫師更方便，因為對比劑一經製備，其本身將具有短得多的可用存放期。具有大量套組意謂臨床醫師可24小時，7天在每當需要對比劑時獲得對比劑。套組將適當地包括「包裝說明書」，其定義套組及其組分，提供如何使用套組之細節，以及患者安全資訊，及商業供應商之細節。該等套組典型地代表經設計以提供超音波對比劑之商品之較佳形式。

第二態樣之步驟(ii)之無菌水溶液較佳為如上文所定義之「生物相容性載劑」。更佳地，其為無菌注射用水。最佳地，無菌水溶液具有小於100μM，理想地小於50μM之自由(亦即非螯合)鋁、鋇、鎂、鈣及鋅離子之總濃度。

第二態樣之套組較佳進一步包含通氣過濾器(5μm)尖端，諸如Chemoprotect^®尖端(Codan有限公司，Germany)。套組經由尖端藉由水溶液復水，接著手動混合約一分鐘，得到乳白色、均質分散液。用於對個體成像之對比劑之劑量隨後經由過濾器尖端吸入至注射器中。「尖端」之作用為移除任何外來粒子或聚結物-其否則將難以藉由目視檢查偵測，因為小瓶內之分散液為不透明的。

在第三態樣中，本發明提供一種製備超音波對比劑之方法，該超音波對比劑包含藉由氫化卵磷脂醯絲胺酸穩定化之全氟丁烷之微泡於無菌水性介質中之懸浮液，該方法包含：(i)進行第一態樣之方法以得到含有如第一態樣中所定義之對比劑前驅物之小瓶；及(ii)藉由無菌水溶液對該來自步驟(i)之前驅物小瓶進行復水。

第一態樣之方法及第二態樣之對比劑製備方法中之前驅物之較佳具體實例為如第一態樣(上文)中所述。第三態樣之方法較佳包含製備第二態樣之套組之方法。

本發明藉由在下文中詳述之非限制性實施例說明。實施例1提供使用轉子定子混合製備藉由H-EPS穩定化之PEB微泡。實施例2提供一種使用浮選對實施例1之微泡進行尺寸調節之方法。實施例3提供保持時間對PFB微泡之產量及UoC之影響的細節。微泡濃度相對於保持時間之結果顯示於圖1中，且UoC相對於保持時間範圍之結果顯示於圖2中。組合起來，圖1及圖2展示為了使產量達到最佳且為了製造符合關於UoC之法規要求(瓶間差異)的產品，在填充與凍乾之間的短保持時間及窄保持時間差異之重要性。

實施例4顯示微泡尺寸對凍乾期間之損失的影響。微泡浮選速率相對於直徑之結果顯示於圖3中且凍乾期間之損失相對於微泡直徑之結果顯示於圖4中。組合起來，圖3及4展示微泡尺寸對浮選速率及隨後在凍乾期間隨著微泡尺寸增加而增加之損失的影響且因此展示在凍乾之前的尺寸調節步驟對於使損失最小化及滿足關於UoC之要求的重要性。

縮寫.

FD：冷凍乾燥.

GMP：良好生產規範；H-EPS：氫化卵磷脂醯絲胺酸；ICH：國際協調會議；iv.：靜脈內； Min：分鐘；PA：磷脂酸；PFB：全氟丁烷；PS：磷脂醯絲胺酸；Rpm：轉/分鐘；UoC：含量均一性；WFI：注射用水.

實施例1：藉由轉子定子混合製備全氟丁烷微泡分散液.

將H-EPS(500.4mg)添加至含有5.4%(w/w)之丙二醇及甘油(3：10w/w)之混合物的5至100mL水中。震盪混合物且加熱至80℃後維持5min，使得冷卻至室溫，再次震盪且保持靜置隔夜，隨後使用。

將一部分(50mL)所得溶液轉移至具有錐形頸之圓底燒瓶中。燒瓶裝備有玻璃夾套，其具有連接至維持在25℃下之水浴之溫度控制入口及出口。將轉子定子混合軸引入至溶液中且為了避免氣體洩漏，頸壁與混合軸之間的空間經專門設計之金屬栓塞密封，該栓塞裝備有用於調節氣體含量及壓力控制之氣體入口/出口接頭。將氣體出口連接至真空泵且對溶液脫氣一分鐘。隨後經由氣體入口施加全氟正丁烷氣體之氛圍。溶液在23,000rpm下均質化10min，保持轉子定子混合軸以使得開口略微高於液體表面。獲得白色乳油狀分散液，將其轉移至可密封容器中且藉由全氟正丁烷沖洗。隨後將分散液轉移至分液漏斗中且在12,000rpm下離心30min，產生位於頂部之微泡之乳油狀層及渾濁下層物。移除下層物且藉由水置換。隨後重複離心兩次，但現於12,000rpm下持續15min。在最後離心之後，以 10%(w/w)蔗糖置換上清液。

實施例2：藉由浮選對全氟丁烷微泡進行尺寸調節.

具有80cm之總高度及82cm之內徑的圓筒形平底玻璃分離室裝備有機械攪拌槳葉。藉由根據實施例1製備之微泡懸浮液(32公升)將該室填充至6cm之高度。沿交替方向緩慢攪拌懸浮液2min以獲得完全混合，其中速度自0變化至15rpm。使懸浮液沈降200min，且經由底部之3個出口將底部5cm層排出至儲存槽中。連接之雷射尺寸測定裝置顯示何時出現特定粒度，及出口經閉合。將注射用水(WFI)填充至分離室中直至6cm高度，且重複攪拌、沈降及排放循環。

藉由庫爾特計數器(Coulter Counter)量測來測試在各循環之後保留之粒子懸浮液之等分試樣的粒度分佈。在11次循環之後，當保留2μm以上之粒子時，進行其他循環以藉由將下層收集至接收槽中及棄置上層移除尺寸大於4μm之大粒子。此階段之此等循環之沈降時間為120min。在各循環之後，接收槽之內容物返回至分離室中，且將WFI添加至6cm高度。

在總共11次循環以移除尺寸過小粒子及後續8次循環以移除過大粒子之後，庫爾特計數器量測顯示89%之粒子具有介於2與4μm之間的尺寸。

使用相同裝置及材料，但藉由5次200min分離循環以移除小於所需尺寸限度之粒子，隨後藉由8次150min分離循環以移除小於所需尺寸限度之粒子，接著藉由8次100min分離循環以移除大於所需尺寸限度之粒子，獲得具有按數目計92%之介於2.5與4.5μm之間及72%之介於3.0 與4.0μm之間的粒子之窄粒度級。

實施例3：保持時間對產量及UoC之影響-凍乾及尺寸調節PFB微泡之製造.

藉由將1.5%(w/w)丙二醇及5.1%(w/w)甘油85%於WFI中之溶液添加至2.5g H-EPSNa，接著在80℃水浴中之加熱期間震盪5min來製備500ml H-EPSNa分散液部分。混合物在不攪拌的情況下保持於室溫下隔夜。將體積調節至5mg/ml H-EPSNa之最終濃度。磷脂懸浮液經熱壓處理(F015)且儲存在4℃下。

藉由在以下條件下經由連續音波處理方法系統泵送H-EPSNa懸浮液連同PFB氣體製備穩定PFB微泡：PFB流45ml/min，H-EPSNa分散液之流15ml/min，頻率20.000Hz，及溫度33℃。將所得穩定PFB微泡之分散液收集於設計用於下文所述之尺寸調節步驟之槽中。

將WFI(1kg)添加至分散液(2.2kg)中。震盪分散液且允許微泡漂浮3h 20min，隨後自底部小心地移除1830g下層物(廢物)且經1830克WFI置換。震盪分散液且再保持3h 20min之時段，隨後移除1830g廢物。重複此程序直至已移除總共8×1830g廢物。藉由添加20%蔗糖及WFI將微泡尺寸最佳化分散液調節至3.04%(v/v)微泡及100mg/ml蔗糖之最終濃度。在整個填充中在200rpm下連續攪拌分散液，且使用100rpm之泵速將2g(1.9-2.1g)填充至10ml小瓶中。每隔15-20min記錄填充重量。盤負載有小瓶(130-140小瓶/盤)，運送至冷凍乾燥器且置放至預先冷卻之架子(實際溫度-58℃)上。

對於各小瓶，記錄填充與負載至冷凍乾燥器中之間的時間 (保持時間)。將樣品組保持<3min、20min及60min，隨後負載至冷凍乾燥器中之預先冷卻之架子(-58℃)上。各組取樣10隻小瓶。在結束冷凍乾燥之後，將PFB添加至小瓶頂部空間中，隨後加塞。

藉由庫爾特計數量測微泡粒度分佈及體積濃度。

實施例4：微泡尺寸對凍乾期間之損失(產量)之影響

使用轉子定子混合及經由浮選原理之尺寸調節(如詳述於實施例1及2中，僅設備及生產設定略微不同)，隨後凍乾來進行27批凍乾及尺寸調節PFB微泡之製造。對於所有此等批次，在將填充小瓶負載至凍乾器中之前的保持時間為至多20min。

用於分析之樣品.

對於27批次中之每一者，藉由庫爾特計數分析凍乾之前的10個小瓶及凍乾之後的10個小瓶之微泡含量及粒度分佈。因此，計算出相對於凍乾之前的含量之凍乾期間之微泡濃度損失。

計算浮選速率.

基於斯托克斯方程(Stokes equation)計算微泡相對於直徑之於水中之浮選速率： v=6＊10 ⁴ ＊(2＊ρ＊g＊r ² )/(9＊η)

其中v為以mm/min計之浮選速率，ρ為密度增量(設定為1000kg/m³)，g為重力常數(9.8m/s²)，r為以公尺計之氣泡半徑且η為黏度(設定為1mPa s)。

Claims

一種製備超音波對比劑前驅物的小瓶之商業規模批量之方法，該前驅物包含藉由蔗糖中之氫化卵磷脂醯絲胺酸(egg phosphatidylserine)穩定化之全氟丁烷之微泡之凍乾組成物；其中該方法包含：(i)提供藉由氫化卵磷脂醯絲胺酸穩定化之該等全氟丁烷微泡於水溶液中之水性懸浮液；(ii)將該等微泡之尺寸調節為2至5μm範圍內之中位數尺寸；(iii)以無菌蔗糖水溶液稀釋該來自步驟(ii)之尺寸調節之懸浮液，以得到5-20% w/v之最終蔗糖濃度；(iv)將來自步驟(iii)之組成物之等分試樣分配至小瓶中，以得到填充小瓶；(v)在該步驟(iv)之分配完成之後的小於5分鐘之保持時段內將各該填充小瓶冷卻至-40℃至-70℃之溫度；(vi)必要的話重複步驟(iv)及(v)直至已獲得所需數目之冷卻、填充小瓶；(vii)冷凍乾燥該等來自步驟(v)及(vi)之冷卻、填充小瓶；(viii)以全氟丁烷回填該等來自步驟(vii)之凍乾小瓶中的頂部空間氣體；(ix)藉由封閉件(closure)密封該等來自步驟(viii)之小瓶。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該凍乾前驅物組成物為無菌的。
如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該步驟(iii)之蔗糖濃度為8-12% w/v。
如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該步驟(ii)之尺寸調節係藉由以下進行：(a)浮選及再懸浮之一或多個循環；或(b)差速離心；或(c)其組合。
如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟(iii)之後，在進行分配步驟(iv)之前檢查尺寸分佈及微泡濃度。
如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟(iv)中，多個小瓶經並行(in parallel)分配。
如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中在步驟(v)中，多個填充小瓶經並行冷卻。
如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該步驟(v)之保持時段小於3分鐘。
如申請專利範圍第1項或第2項之方法，其中該步驟(v)之保持時段對於各填充小瓶是相同的。
一種製備用於製備超音波對比劑之套組之方法，該對比劑包含藉由氫化卵磷脂醯絲胺酸穩定化之全氟丁烷之微泡於無菌水性介質中之懸浮液，該方法包含：(i)進行如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之方法以得到含有如申請專利範圍第1項至第3項中任一項定義之對比劑前驅物的小瓶之商業規模批量；及(ii)對各個小瓶提供適合用於對該等來自步驟(i)之前驅物小瓶進行復水(reconstitute)之無菌水溶液之容器以得到該對比劑。
如申請專利範圍第10項之方法，其中該無菌水溶液為含有小於100μM總濃度之自由鋁、鋇、鎂、鈣及鋅離子之注射用水。
一種製備超音波對比劑之方法，該超音波對比劑包含藉由氫化卵磷脂醯絲胺酸穩定化之全氟丁烷之微泡於無菌水性介質中之懸浮液，該方法包含：(i)進行如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之方法以得到含有如申請專利範圍第1項至第3項中任一項定義之對比劑前驅物的小瓶之商業規模批量；及(ii)以無菌水溶液對該等來自步驟(i)之前驅物小瓶進行復水。