TWI669392B - 新穎之短乳桿菌及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種分離之短乳桿菌株Lactobacillus brevis NO.03，該短乳桿菌株NO.03可生產γ-胺基丁酸，使γ-胺基丁酸產量達62.5g/L，並使γ-胺基丁酸之轉換率達93.28%。
Description
本發明係關於一種短乳桿菌株、培養短乳桿菌株的培養基、及乳桿菌株的應用，特別是關於一種可增加γ-胺基丁酸之產量，使γ-胺基丁酸之轉換率達93.28%以上的應用。
γ-胺基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)廣泛存在於微生物、動植物體內。研究發現γ-胺基丁酸之生理功能包括降血壓、促進睡眠、抗憂鬱、調控血糖、改善癲癇、改善阿茲海默症、及調節免疫功能等功能。近年來，γ-胺基丁酸被廣泛應用於食品、生技、醫學各領域，特別是被添加於保健食品中而應用於促進睡眠的領域。因此，以工業化方式量產γ-胺基丁酸是重要的課題。
目前γ-胺基丁酸的工業化生產方式包含化學合成法及微生物發酵法。化學合成法速度快、產率高，但會產生大量有害物質，而且，去除有害物質的技術複雜、成本高、安全性差、難以確保能夠100%去除有害物質，因此，化學合成法產出的γ-胺基丁酸不會被應用於食品工業。
微生物發酵是目前最常用來工業化生產γ-胺基丁酸的方
法，例如以乳酸菌發酵的方法工業化生產γ-胺基丁酸。在乳酸菌發酵生產γ-胺基丁酸的方法中，乳酸菌是利用體內的麩胺酸脫酸酶(glutamate decarboxylase)將麩胺酸(Glutamic acid,Glu)轉換為γ-胺基丁酸，具有成本低、生產步驟簡易等優點。但是，目前利用乳酸菌發酵方式生產γ-胺基丁酸的方法中，所使用的乳酸菌及培養基無法使生產速率及轉換率顯著提升，使得單位時間及單位空間之產量有限。因此，有必要尋找一種更適合用於生產γ-胺基丁酸之乳酸菌菌株，並搭配更適合用於發酵生產γ-胺基丁酸的培養基，進而整體提升γ-胺基丁酸之生產速率及轉換率。
本發明之目的，在於提供一種能夠發酵生產高濃度γ-胺基丁酸的短乳桿菌株。
本發明之目的，在於提供一種能顯著提升麩胺酸轉換為γ-胺基丁酸的轉換率的短乳桿菌株。
本發明之次一目的，在於提供一種用於乳酸菌發酵領域且能夠顯著提升γ-胺基丁酸產量的培養基。
本發明之另一目的，在於提供一種能夠顯著提升γ-胺基丁酸生產速率的生產方法。
本發明之另一目的，在於提供一種能夠顯著提升γ-胺基丁酸轉換率的生產方法。
本發明之另一目的，在於提供一種利用簡易的分批發酵方式即能製備高濃度γ-胺基丁酸之方法。
於一較佳實施例中，本發明提供一種具有一16S核糖體DNA(16S rDNA)的短乳桿菌株(Lactobacillus brevis)，該16S核糖體DNA包含SEQ ID NO：1；該短乳桿菌株具有至少一個麩胺酸脫酸酶(glutamate decarboxylase)，使該短乳桿菌株可在一分批發酵(batch fermentation)條件下將一培養液中的麩胺酸鈉轉換為γ-胺基丁酸(γ-Aminobutyric acid)，進而使γ-胺基丁酸的濃度在該分批發酵過程中至少增加50g/L，而且使麩胺酸鈉轉換為γ-胺基丁酸之轉換率(conversion rate)達90%以上；其中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為25~35度。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌可在該分批發酵條件下將該培養液中的麩胺酸鈉轉換為γ-胺基丁酸，使γ-胺基丁酸的濃度在該分批發酵過程中至少增加60g/L。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌株具有產生一可抑制酪胺酸酶活性的代謝產物的能力。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌株係寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存號碼為BCRC910771。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為大於或等於攝氏28度且小於攝氏32度。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為攝氏25~37度。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為攝氏28~32度。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為攝氏
29~31度。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為攝氏29.5~30.5度。
於一較佳實施例中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為攝氏30度。
於另一較佳實施例中，本發明提供一種培養基在透過一乳酸菌發酵而製備γ-胺基丁酸之用途，該培養基包含：麩胺酸鈉(Monosodium glutamate)；碳源；氮源；碳酸鈣(Calcium carbonate)；以及硫酸錳(Manganese sulfate)。
於另一較佳實施例中，該培養基中更包含聚山梨醇酯80(Tween 80)。
於另一較佳實施例中，該乳酸菌為短乳桿菌。
於另一較佳實施例中，該短乳桿菌之16S核糖體DNA包含SEQ ID NO：1；該短乳桿菌株具有至少一個麩胺酸脫酸酶(glutamate decarboxylase)，使該短乳桿菌株可在一分批發酵(batch fermentation)條件下將一培養液中的麩胺酸鈉轉換為γ-胺基丁酸(γ-Aminobutyric acid)，進而使γ-胺基丁酸的濃度在該分批發酵過程中至少增加50g/L，而且使麩胺酸鈉轉換為γ-胺基丁酸之轉換率(conversion rate)達90%以上；其中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為25~35度。
於另一較佳實施例中，該短乳桿菌係寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存號碼為BCRC910771。
於再一較佳實施例中，本發明提供一種生產γ-胺基丁酸之方法，包含：將短乳桿菌株接種至含有碳酸鈣、硫酸錳、及聚山梨醇酯80的一培養液；培養一預定的時間長度；獲得包含γ-胺基丁酸的發酵液；於再一較佳實施例中，該培養液之pH值為3.5~7.0。
於再一較佳實施例中，該培養液之pH值為4.0~4.5。
於再一較佳實施例中，該培養液中更包含大於0μM且小於等於100μM之磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)。
圖1：係將乳酸菌培養於乳桿菌屬培養基後，發酵液的薄層層析圖譜。
圖2A：係γ-胺基丁酸標準品的高效液相層析圖譜。
圖2B：係將編號為NO.03之乳酸菌培養於乳桿菌屬培養基後，發酵液的高效液相層析圖譜。
圖2C：係將編號為NO.03之乳酸菌培養於含有1%麩氨酸鈉之乳桿菌屬培養基後，發酵液的高效液相層析圖譜。
圖3：係於不同溫度培養短乳桿菌株NO.03，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度長條圖。
圖4A：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有不同碳源之培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度、總菌數、及pH值之長條圖暨折線圖。
圖4B：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有不同濃度葡萄糖之培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度、總菌數、及pH值之長條圖暨折線圖。
圖5A：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有不同氮源之培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度、總菌數、及pH值之長條圖暨折線圖。
圖5B：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有不同濃度酵母萃取物之培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度、總菌數、及pH值之長條圖暨折線圖。
圖6：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有不同微量元素之培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度之長條圖。
圖7：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有不同組合的微量元素的培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度、總菌數、及pH值之長條圖暨折線圖。
圖8：係將短乳桿菌株NO.03培養於不同酸鹼值(pH值)的培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度、總菌數、及pH值之長條圖暨折線圖。
圖9：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有不同濃度的磷酸吡哆醛(Pyridoxal phosphate,PLP)的培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸
濃度、總菌數、及pH值之長條圖暨折線圖。
圖10：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有不同濃度之麩氨酸鈉之培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸濃度及麩氨酸鈉殘留量之長條圖暨折線圖。
圖11：係將短乳桿菌株NO.03培養於含有650mM麩氨酸鈉的2公升的培養基中，發酵液中的γ-胺基丁酸產量及麩氨酸鈉殘餘量隨著發酵時間變化的長條圖暨折線圖。
圖12：係短乳桿菌株NO.03發酵液對酪胺酸酶活性之影響之長條圖。
圖13：係短乳桿菌株NO.03發酵液對亞鐵離子螯合能力之影響之長條圖。
圖14：係短乳桿菌株NO.03發酵液對銅離子螯合能力之影響之長條圖。
圖15：係短乳桿菌株NO.03發酵液對還原力之影響之長條圖。
圖16：係短乳桿菌株NO.03發酵液中之總酚含量之長條圖。
圖17：係短乳桿菌株NO.03發酵液對DPPH自由基清除能力之影響之長條圖。
以下係利用本發明之實施例之詳細說明，以及本發明之技術、特點。然本實施例並非用以限定本發明，任何熟悉此技術者，在不脫離本發明之精神和範圍內所作之各種更動、潤飾，均應包含在本發明之申請專利範圍內。
實驗1-1：自水生動物腸道篩選乳酸菌菌株
自高雄楠梓及左營黃昏市場購買大棘大眼鯛(Priacanthus macracanthus)、虱目魚(Chanos chanos)、河鱸(Perca fluviatilis)、太平洋黑鮪(Thunnus thynnus)、刺鯧(Psenopsis anomala)、牡蠣(Ostreoida rafinesque)、圓白鯧(Ephippus orbis)、草魚(Ctenopharyngodon idellus)、及草蝦(Penaeus monodon)。利用無菌袋採集水生動物腸胃道之組織，以鐵胃機(Smasher；廠牌)均質後，將5g樣品與25mL之乳桿菌屬培養基(Lactobacilli MRS broth；BD DifcoTM)混合，於37℃條件下培養24小時。然後，以下列4種實驗進行篩選，共篩選出56株乳酸菌菌株。其中，乳酸菌菌株指的是在下列4種實驗中，同時包括4種特徵之菌株：(1)培養於LAMVAB-A選擇性培養基後，可產生透明環；(2)為革蘭氏陽性菌株；(3)觸媒試驗結果為無氣泡產生；以及(4)氧化酶試驗結果為無顏色變化。
I.利用LAMVAB-A選擇性培養基篩選：將菌液塗抹於LAMVAB-A選擇性培養基上，於37℃厭氧環境下培養48小時，觀察菌落周
圍是否具有透明環。挑選具有透明環的單一菌落，經分離純化得到單一菌落，再以乳桿菌屬瓊脂斜面培養基(Lactobacilli MRS agar slant culture-medium)保存於4℃環境中。
上述LAMVAB-A之配製方法：將52.2g乳桿菌屬培養基粉末(Lactobacilli MRS powder；BD DifcoTM)、0.25g半胱胺酸鹽酸鹽(Cysteine HCL)、2.5g碳酸鈣、及40g瓊脂溶液溶於1L蒸餾水(Distilled Water)中，以高壓殺菌釜於121℃條件下滅菌15分鐘，再以1M鹽酸調整pH值為5.0。待冷卻至50℃後，添加1.5mL鹽酸萬古黴素(Vacomycin hydrochloride)並混合均勻(請參見Hartemink et al.,1997.Journal of Microbiological Methods；29(2)：77-84)。
Ⅱ.利用革蘭氏染色(Gram staining)篩選：進行革蘭氏染色，並以高倍率油鏡鏡檢菌株顏色及型態，觀察菌株是呈現藍紫色之陽性菌株或是粉紅色之陰性菌株。
Ⅲ.利用觸媒試驗(Catalase test)篩選：將單一菌落置於載玻片上，滴幾滴3%過氧化氫溶液，觀察有無氣泡產生。有氣泡產生即為陽性反應；反之則為陰性反應。
Ⅳ.利用氧化酶試驗(Oxidase test)篩選：將濃度為1%的二鹽酸四甲基對苯二胺試劑滴於待測菌株的單一菌落上，觀察顏色變化。若菌落呈深藍色即為陽性反應；若菌落無顏色變化則為陰性反應。
以薄層色層分析法(Thin layer chromatography,TLC)評估上述56株乳酸菌發酵所得的發酵液中是否含有γ-胺基丁酸。結果顯示56株乳酸菌株發酵所得之發酵液中均含有γ-胺基丁酸。由此可知，該56株乳酸菌株具有產生γ-胺基丁酸的能力。該56株乳酸菌株之編號請參見表一。
將上述56株乳酸菌株分別培養在乳桿菌屬培養基中，於37℃條件下培養96小時。然後，利用高效液相層析法(High performance liquid chromatography,HPLC)測定56株乳酸菌株發酵所得的發酵液中之γ-胺基丁酸含量，實驗步驟如下。
將56株乳酸菌株發酵後所得之發酵液進行衍生化。茲說明衍生化所需之溶液配製方法如下：將40mg鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde、或OPA)溶解於1mL甲醇中，配製成鄰苯二甲醛溶液。將1mL鄰苯二甲醛溶液、25mL 0.1M TBE緩衝液、及100μL 2-巰基乙醇(β-mercaptoethanol)混合均勻，配製成鄰苯二甲醛標準溶液。然後，將0.5mL鄰苯二甲醛標準溶液及0.1mL之待測樣本(即乳酸菌株發酵所得之發酵液)混合均勻，靜置一分鐘。以0.22μm濾膜(PES Syringe Filter)過濾後，將20μL濾液注入高效液相層析儀的管柱(column)中。使用0.1M醋酸鈉(Sodium acetate；pH6.7)作為移動相A、甲醇(Methanol)作為移動相B，並以UV340nm偵測器進行偵測。
結果顯示，自大棘大眼鯛腸胃道分離之編號為NO.02、及NO.03之乳酸菌株，以及自草魚腸胃道分離之編號為NO.41、及NO.45之乳酸菌株的γ-胺基丁酸產量最高，分別為785mg/L、1024mg/L、730mg/L、及813mg/L，其中又以編號為NO.03之乳酸菌株之γ-胺基丁酸產量最高。
實驗2-1：分析乳酸菌產生γ-胺基丁酸之能力
本實驗利用薄層色層分析(Thin layer chromatography,TLC)分析乳酸菌產生γ-胺基丁酸之能力。實驗組別分為NO.02組、NO.02’組、NO.03組、NO.03’組、NO.41組、NO.41’組、NO.45組、及NO.45’組；另有2組控制組，即γ-胺基丁酸組及麩氨酸鈉組，總共10組。
薄層色層分析實驗步驟中所需之展開液之配製方法：將醋酸(Acetic acid)、正丁醇(1-Butanol)、及蒸餾水(Distilled Water)依3：5：2之比例均勻混合，再加入1%茚三酮(Ninhydrin)呈色劑，即為展開液。然後，以下列方式進行實驗。
NO.02組：將編號為NO.02之乳酸菌接種於乳桿菌屬培養基(Lactobacilli MRS broth；BD DifcoTM)中，於37℃厭氧環境下培養48小時，離心(5,000×g,10分鐘)，將0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
NO.02’組：將編號為NO.02之乳酸菌接種於含有1%麩氨酸鈉(Monosodium Glutamate,MSG)之乳桿菌屬培養基，於37℃厭氧環境下培養48小時，離心(5,000×g,10分鐘)，將0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
NO.03組：將編號為NO.03之乳酸菌接種於乳桿菌屬培養基，於37℃厭氧環境下培養48小時，離心(5,000×g,10分鐘)，將0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
NO.03’組：將編號為NO.03之乳酸菌接種於含有1%麩氨酸
鈉(Monosodium Glutamate,MSG)之乳桿菌屬培養基，於37℃厭氧環境下培養48小時，離心(5,000×g,10分鐘)，將0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
NO.41組：將編號為NO.41之乳酸菌接種於乳桿菌屬培養基，於37℃厭氧環境下培養48小時，離心(5,000×g,10分鐘)，將0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
NO.41’組：將編號為NO.41之乳酸菌接種於含有1%麩氨酸鈉(Monosodium Glutamate,MSG)之乳桿菌屬培養基，於37℃厭氧環境下培養48小時，離心(5,000×g,10分鐘)，將0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
NO.45組：將編號為NO.45之乳酸菌接種於乳桿菌屬培養基，於37℃厭氧環境下培養48小時，離心(5,000×g,10分鐘)，將0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
NO.45’組：將編號為NO.45之乳酸菌接種於含有1%麩氨酸鈉(Monosodium Glutamate,MSG)之乳桿菌屬培養基，於37℃厭氧環境下培養48小時，離心(5,000×g,10分鐘)，將0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
γ-胺基丁酸組：將γ-胺基丁酸標準品(ChromaDex,Inc.；ASB-00001674-025)溶於蒸餾水中，離心(5,000×g,10分鐘)，取0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105℃條件下，利用展開液進行層析。
麩氨酸鈉組：將麩氨酸鈉標準品(台灣味王股份有限公司)溶於蒸餾水中，離心(5,000×g,10分鐘)，取0.7μL上清液滴至薄層色層片，在105
℃條件下，利用展開液進行層析。，
圖1之結果顯示，NO.03’組相較其他7組之發酵液中含有較多之γ-胺基丁酸。
綜合表一及圖1之結果可知，在未添加1%麩胺酸鈉的情況下，編號為NO.03之乳酸菌產生γ-胺基丁酸的能力最佳；與編號為NO.03之乳酸菌於未添加麩胺酸鈉時的γ-胺基丁酸產量相比，編號為NO.03之乳酸菌在添加1%麩胺酸鈉時的γ-胺基丁酸產量似乎會更顯著提升。後續將以定量分析方式確認編號NO.03之乳酸菌在添加1%麩胺酸鈉時的γ-胺基丁酸產量是否確實會更顯著提升。
實驗2-2：分析編號NO.03之乳酸菌在添加1%麩胺酸鈉時的γ-胺基丁酸產量
利用高效液相層析法定量分析實驗2-1組別中NO.03組及NO.03’組發酵液中的γ-胺基丁酸含量，實驗方法與實驗一的高效液相層析方法相同。
圖2A係γ-胺基丁酸標準品的高效液相層析圖譜；圖2B係將編號為NO.03之乳酸菌培養於乳酸菌培養基後，發酵液的高效液相層析圖譜；圖2C係將編號為NO.03之乳酸菌培養於含有1%麩氨酸鈉之乳酸菌培養基後，發酵液的高效液相層析圖譜。由上述實驗結果可知，與編號為NO.03之乳酸菌於未添加麩胺酸鈉時的γ-胺基丁酸產量相比，編號為NO.03之乳酸菌在添加1%麩胺酸鈉時的γ-胺基丁酸產量確實會更顯著提升。
實驗2-3：鑑定編號為NO.03之乳酸菌
委託源資國際生物科技股份有限公司進行編號為NO.03之
乳酸菌之菌種鑑定工作，其中，係利用16S rDNA序列方式進行菌種鑑定。首先，使用套裝材料(Genomic DNA Purification Kit，伯昂公司製造)萃取編號為NO.03之乳酸菌的DNA，然後使用下列引子(primer)進行聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction，簡稱為PCR)，以複製編號為NO.03之乳酸菌的16S rDNA。然後，進行編號為NO.03之乳酸菌的16S rDNA的定序工作。其中，引子中的M的意義為腺嘌呤(adenine；簡稱A)或(胞嘧啶(cytosine；簡稱C)。
27F引子：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
1492R引子：5’-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3’
編號為NO.03之乳酸菌的16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示。經與資料庫中的16S rDNA序列比對可知，編號為NO.03之乳酸菌是短乳桿菌(Lactobacillus brevis)，因此發明人將該株菌稱為短乳桿菌株NO.03。
乳酸菌發酵過程中，應將溫度控制在菌株的最適發酵溫度，使發酵能順利進行。其中，最適發酵溫度是指最適於該菌株生長或最適於發酵產物生成的溫度(請參見2008年出版的《氨基酸發酵生產技術》教科書第7章第2節，鄧毛程主編，中國輕工業出版社出版)。
本實驗分為12組，依所培養之溫度命名為25℃組、25℃’組、30℃組、30℃’組、35℃組、35℃’組、37℃組、37℃’組、40℃組、40℃’組、45℃組、及45℃’組。
將短乳桿菌株NO.03分別接種於乳桿菌屬培養基中，於25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、或45℃之厭氧環境下培養96小時，以獲得25℃組、30℃組、35℃組、37℃組、40℃組、或45℃組之發酵液。
將短乳桿菌株NO.03接種於含有550M麩氨酸鈉(Monosodium Glutamate,MSG)之乳桿菌屬培養基，分別於25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、或45℃之厭氧環境下培養96小時，獲得25℃’組、30℃’組、35℃’組、37℃’組、40℃’組、或45℃’組之發酵液。
利用高效液相層析法定量分析各組發酵液中的γ-胺基丁酸含量。
圖3之結果顯示，25℃組、25℃’組、30℃組、30℃’組、35℃組、35℃’組、37℃組、37℃’組、40℃組、40℃’組、45℃組、及45℃’組發酵液之γ-胺基丁酸含量分別為923±104mg/L、17669±144mg/L、1,203±35mg/L、21,936±134mg/L、781±108mg/L、16840±31mg/L、703±9mg/L、14722±103mg/L、342±7mg/L、10779±111mg/L、113±9mg/L、及311±8mg/L。由此可知，無論是否添加麩氨酸鈉，最適於短乳桿菌株NO.03發酵生產γ-胺基丁酸的溫度為大於等於25℃且小於37℃。而且，由圖3之結果可知，短乳桿菌株NO.03在發酵溫度約為30℃(例如大於或等於攝氏28度且小於攝氏32度)時能生成最大量之γ-胺基丁酸。因此，有別於一般分離自乳製品的乳酸菌具有37~45℃最適發酵溫度的特徵，本案分離自魚體腸道的短乳桿菌株NO.03具有約為30℃最適發酵溫度(例如大於或等於攝氏28度且小於攝氏32度)的新穎特徵，能夠降低發酵過程中所需的能源成本。本案後續實驗將以30℃作為短乳桿菌株NO.03之發酵條件。
實驗4-1：碳源測試
本實驗分為12組，依所添加之碳源命名為葡萄糖組、蔗糖組、乳糖組、半乳糖組、麥芽糖組、甘油組、糖蜜組、砂糖組、黑糖組、糊精1組、糊精2組及澱粉組。
各組之培養基配方都包含1%(w/v)碳源、1%酵母萃取物(Yeast extract)、及1%麩胺酸鈉，培養基之總體積均為9mL。其中，葡萄糖組中添加的碳源為葡萄糖(Glucose)，蔗糖組中添加的碳源為蔗糖(Sucrose)，乳糖組中添加的碳源為乳糖(Lactose)，半乳糖組中添加的碳源為半乳糖(Galactose)，麥芽糖組中添加的碳源為麥芽糖(Maltose)，甘油組中添加的碳源為甘油(Glycerol)，糖蜜組中添加的碳源為糖蜜(Molasses，購自台灣糖業股份有限公司)，砂糖組中添加的碳源為砂糖(Refined golden sugar，購自豐年豐和股份有限公司)，黑糖組中添加的碳源為黑糖(Brown Sugar)，糊精1組中添加的碳源為糊精1(Dextrin 1，產品編號為DE 8-10，購自利閎企業有限公司)，糊精2(Dextrin 2，產品編號為DE 10-12，購自利閎企業有限公司)，澱粉組中添加的碳源為澱粉(Starch)。
將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧環境下培養96小時，獲得各組別之發酵液。將各組發酵液進行連續10倍稀釋後，以平板計數法測定發酵液中的總菌數，並將總菌數轉換為以10為底的總菌數的對數值(Log10總菌數)。利用pH酸鹼度計(Suntex-2200，台灣)檢測各組發酵液之pH值。利用高效液相層析法定量分析各組發酵液中的γ-胺基丁酸含量。
圖4A之結果顯示，葡萄糖組、蔗糖組、乳糖組、半乳糖組、麥芽糖組、甘油組、糖蜜組、砂糖組、黑糖組、糊精1組、糊精2組及澱粉組之發酵液中γ-胺基丁酸含量分別為5,488±122mg/L、3,530±394mg/L、2,776±156mg/L、4,888±224mg/L、5,233±393mg/L、3,454±289mg/L、5,291±231mg/L、4,003±263mg/L、4,254±45mg/L、1,296±19mg/L、2,262±600mg/L、及2,776±237mg/L，其中以葡萄糖組中的γ-胺基丁酸含量最高，故後續實驗將以葡萄糖作為碳源來源，進一步測試其最適之添加濃度。
實驗4-2：碳源最適濃度測試
實驗分為0%組、0.5%組、1.0%組、1.5%組、2.0%組、2.5組、及3.0%組。各組之培養基配方與實驗4-1中的葡萄糖組大致相同，唯一不同之處在於葡萄糖之濃度為0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、或3.0%。將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧環境下培養96小時，獲得各組別之發酵液。
圖4B之結果顯示，0%組、0.5%組、1.0%組、1.5%組、2.0%組、2.5組、及3.0%組發酵液中的γ-胺基丁酸含量分別為5,178±62mg/L、5,081±61mg/L、5,424±127mg/L、4,896±30mg/L、4,596±48mg/L、4,108±8mg/L、及3,935±149mg/L。其中以1%組中的γ-胺基丁酸含量最高，且發現當葡萄糖濃度超過1%時會發生葡萄糖效應(Crabtree effect)而抑制γ-胺基丁酸之產量，故後續實驗將以1%之葡萄糖濃度作為培養基條件。
實驗4-3：氮源測試
本實驗分為12組，依所添加之氮源命名為硫氰酸銨組、硝酸
鋁組、硝酸銨組、鉬酸銨組、過硫酸銨組、磷酸二胺組、尿素組、胰化蛋白組、大豆蛋白腖組、牛肉抽出物組、蛋白腖組、及酵母抽出物組。
各組之培養基配方都包含1%葡萄糖、1%(w/v)氮源、及1%麩胺酸鈉，培養基之總體積均為9mL。其中，硫氰酸銨組中添加的氮源為硫氰酸銨(Ammonium thiocyanate)，硝酸鋁組中添加的氮源為硝酸鋁(Aluminium nitrate)，硝酸銨組中添加的氮源為硝酸銨(Ammonium nitrate)，鉬酸銨組中添加的氮源為鉬酸銨(Ammonium molybdate)，過硫酸銨組中添加的氮源為過硫酸銨(Ammonium persulfate)，磷酸二胺組中添加的氮源為磷酸二胺(Diammonium hydrogen phosphate)，尿素組中添加的氮源為尿素(Urea)，胰化蛋白組中添加的氮源為胰化蛋白(Tryptone)，大豆蛋白腖組中添加的氮源為大豆蛋白腖(Soya peptone)，牛肉抽出物組中添加的氮源為牛肉抽出物(Beef extract)，蛋白腖組中添加的氮源為蛋白腖(Peptone)，酵母抽出物組中添加的氮源為酵母抽出物。
將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧環境下培養96小時，獲得各組之發酵液。將各組發酵液進行連續10倍稀釋後，以平板計數法測定發酵液中的總菌數，並將總菌數轉換為以10為底的總菌數的對數值(Log10總菌數)。利用pH酸鹼度計(Suntex-2200，台灣)檢測各組發酵液之pH值。利用高效液相層析法定量分析各組發酵液中的γ-胺基丁酸含量。
圖5A之結果顯示，硫氰酸銨組、硝酸鋁組、硝酸銨組、鉬酸銨組、過硫酸銨組、磷酸二胺組、尿素組、胰化蛋白組、大豆蛋白腖組、牛肉抽出物組、蛋白腖組、及酵母抽出物組發酵液中之γ-胺基丁酸含量分
別為300±14mg/L、181±35mg/L、214±12mg/L、172±31mg/L、204±22mg/L、197±5mg/L、197±3mg/L、3,948±104mg/L、2,318±383mg/L、4,690±125mg/L、5,148±212mg/L、及4,778±31mg/L。其中，胰化蛋白組、大豆蛋白腖組、牛肉抽出物組、蛋白腖組、及酵母抽出物組發酵液中的γ-胺基丁酸含量較高，且又以蛋白腖組發酵液中的γ-胺基丁酸含量為最高。然而，蛋白腖成本高，酵母抽出物價格較低廉，基於工業化生產中之成本及食品工業領域之可應用性考量，後續實驗將以酵母抽出物為氮源，進一步探討其最適濃度。
實驗4-4：氮源最適濃度測試
實驗分為0.5%組、1.0%組、1.5%組、2.0%組、2.5組、3.0%組、及3.5%組。各組之培養基配方與實驗4-3中的酵母抽出物組大致相同，唯一不同之處在於酵母抽出物之濃度為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、或3.5%。將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧環境下培養96小時，獲得各組之發酵液。
圖5B之結果顯示，0.5%組、1.0%組、1.5%組、2.0%組、2.5%組、3.0%組、及3.5%組發酵液之γ-胺基丁酸含量分別為5,267±308mg/L、5,305±168mg/L、5,624±198mg/L、5,962±60mg/L、6,464±24mg/L、6,298±282mg/L、及6,692±22mg/L。其中以2.5%組發酵液中的γ-胺基丁酸含量最高，故後續實驗將以2.5%酵母抽出物作為生產γ-胺基丁酸之最適培養基條件。
實驗4-5：不同單一微量元素對γ-胺基丁酸產量之影響
本實驗分為19組，依所添加的單一微量元素命名為碳酸鈣組、氯化鈣組、氯化鉻組、三氯化鉻組、氯化鈷組、磷酸氫二鉀組、硫酸
鐵銨組、硫酸亞鐵組、硫酸鎂組、氯化錳組、硫酸錳組、碳酸鉀組、氯化鉀組、碘化鉀組、硫酸鉀組、醋酸鈉組、聚山梨醇酯20組、聚山梨醇酯80組、及硫酸鋅組。
各組之培養基配方都包含1%葡萄糖、2.5%酵母萃取物、1%麩胺酸鈉、及2ppm的微量元素，培養基之總體積均為9mL。其中，碳酸鈣組中添加的微量元素為碳酸鈣(Calcium carbonate)，氯化鈣組中添加的微量元素為氯化鈣(Calcium chloride)，氯化鉻組中添加的微量元素為氯化鉻(Chromium chloride)，三氯化鉻組中添加的微量元素為三氯化鉻(Chromium trichloride)，氯化鈷組中添加的微量元素為氯化鈷(Cobalt chloride)，磷酸氫二鉀組中添加的微量元素為磷酸氫二鉀(Dipotassium hydrogen phosphate)，硫酸鐵銨組中添加的微量元素為硫酸鐵銨(Ferric ammonium sulfate)，硫酸亞鐵組中添加的微量元素為硫酸亞鐵(Ferrous sulfate)，硫酸鎂組中添加的微量元素為硫酸鎂(Magnesium sulfate)，氯化錳組中添加的微量元素為氯化錳(Manganese chloride)，硫酸錳組中添加的微量元素為硫酸錳(Manganese sulfate)，碳酸鉀組中添加的微量元素為碳酸鉀(Potassium carbonate)，氯化鉀組中添加的微量元素為氯化鉀(Potassium chloride)，碘化鉀組中添加的微量元素為碘化鉀(Potassium iodide)，硫酸鉀組中添加的微量元素為硫酸鉀(Potassium sulfate)，醋酸鈉組中添加的微量元素為醋酸鈉(Sodium acetate)，聚山梨醇酯20組中添加的微量元素為聚山梨醇酯20(Tween 20)，聚山梨醇酯80組中添加的微量元素為聚山梨醇酯80(Tween 80)，硫酸鋅組中添加的微量元素為硫酸鋅(Zinc sulfate)。
將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧
環境下培養96小時，獲得各組之發酵液。將各組發酵液進行連續10倍稀釋後，以平板計數法測定發酵液中的總菌數，並將總菌數轉換為以10為底的總菌數的對數值(Log10總菌數)。利用pH酸鹼度計(Suntex-2200，台灣)檢測各組發酵液之pH值。利用高效液相層析法定量分析各組發酵液中的γ-胺基丁酸含量。
圖6之結果顯示，碳酸鈣組、氯化鈣組、氯化鉻組、三氯化鉻組、氯化鈷組、磷酸氫二鉀組、硫酸鐵銨組、硫酸亞鐵組、硫酸鎂組、氯化錳組、硫酸錳組、碳酸鉀組、氯化鉀組、碘化鉀組、硫酸鉀組、醋酸鈉組、聚山梨醇酯20組、聚山梨醇酯80組、或硫酸鋅組發酵液中之γ-胺基丁酸含量分別為8,556±28mg/L、8,412±294mg/L、7,508±272mg/L、7,715±316mg/L、7,079±178mg/L、6,443±202mg/L、6,763±6mg/L、6,138±43mg/L、7,688±95mg/L、7,367±170mg/L、8,943±68mg/L、7,192±225mg/L、5,738±727mg/L、6,756±265mg/L、6,985±572mg/L、7,144±25mg/L、8,033±66mg/L、8,571±16mg/L、或7,533±28mg/L。由此可知，碳酸鈣組、氯化鈣組、硫酸錳組、及聚山梨醇酯80組發酵液中的γ-胺基丁酸含量最高。後續將先探討碳酸鈣、硫酸錳、聚山梨醇酯80及其組合對γ-胺基丁酸含量之影響。
實驗4-6：不同微量元素組合對γ-胺基丁酸產量之影響
本實驗分為7組，依添加之微量元素組合命名為碳酸鈣組、硫酸錳組、聚山梨醇酯80組、碳酸鈣及硫酸錳組、碳酸鈣及聚山梨醇酯80組、硫酸錳及聚山梨醇酯80組、以及碳酸鈣、硫酸錳及聚山梨醇酯80組。
各組之培養基配方都包含1%葡萄糖、2.5%酵母萃取物、1%麩胺酸鈉、及至少一種微量元素，培養基之總體積均為9mL。其中，碳酸鈣
組中添加的微量元素為2ppm的碳酸鈣，硫酸錳組中添加的微量元素為2ppm的硫酸錳，聚山梨醇酯組中添加的微量元素為2ppm的聚山梨醇酯80，碳酸鈣及硫酸錳組中添加的微量元素為2ppm的碳酸鈣及2ppm的硫酸錳，碳酸鈣及聚山梨醇酯80組中添加的微量元素為2ppm的碳酸鈣及2ppm的聚山梨醇酯80，硫酸錳及聚山梨醇酯80組中添加的微量元素為2ppm的硫酸錳及2ppm的聚山梨醇酯80，碳酸鈣、硫酸錳及聚山梨醇酯80組中添加的微量元素為2ppm的碳酸鈣、2ppm的硫酸錳及2ppm的聚山梨醇酯80。
將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧環境下培養96小時，獲得各組別之發酵液。將各組發酵液進行連續10倍稀釋後，以平板計數法測定發酵液中的總菌數，並將總菌數轉換為以10為底的總菌數的對數值(Log10總菌數)。利用pH酸鹼度計(Suntex-2200，台灣)檢測各組發酵液之pH值。利用高效液相層析法定量分析各組發酵液中的γ-胺基丁酸含量。
圖7之結果顯示，碳酸鈣組、硫酸錳組、聚山梨醇酯80組、碳酸鈣及硫酸錳組、碳酸鈣及聚山梨醇酯80組、硫酸錳及聚山梨醇酯80組、以及碳酸鈣、硫酸錳及聚山梨醇酯80組發酵液中γ-胺基丁酸之增加量分別為2,540±187mg/L、1,918±166mg/L、1,395±69mg/L、6,014±374mg/L、1,889±59mg/L、4,335±92mg/L、及7,089±19mg/L。其中以碳酸鈣、硫酸錳及聚山梨醇酯80組發酵液中的γ-胺基丁酸增加量最高，碳酸鈣及硫酸錳組發酵液中的γ-胺基丁酸增加量次之。而且，圖7之結果顯示，碳酸鈣及硫酸錳在透過短乳桿菌株NO.03發酵增加γ-胺基丁酸含量的功能上具有協同效應，具有無法預期的功效。
實驗4-7：培養基的起始pH值對γ-胺基丁酸產量的影響
分為8組，依培養基的起始pH值命名為3.5組、4.0組、4.5組、5.0組、5.5組、6.0組、6.5組、及7.0組。
各組之培養基配方都包含1%葡萄糖、2.5%酵母萃取物、1%麩胺酸鈉、2ppm碳酸鈣、2ppm硫酸錳、及2ppm聚山梨醇酯80，且總體積都為9mL，不同之處在於發明人利用硫酸或氫氧化鈉調整3.5組、4.0組、4.5組、5.0組、5.5組、6.0組、6.5組、及7.0組的培養基的起始pH值，使各組培養基的起始pH值依序為3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、及7.0。
將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧環境下培養96小時，獲得各組別之發酵液。將各組發酵液進行連續10倍稀釋後，以平板計數法測定發酵液中的總菌數，並將總菌數轉換為以10為底的總菌數的對數值(Log10總菌數)。利用pH酸鹼度計(Suntex-2200，台灣)檢測各組發酵液之pH值。利用高效液相層析法定量分析各組發酵液中的γ-胺基丁酸含量。
圖8之結果顯示，3.5組、4.0組、4.5組、5.0組、5.5組、6.0組、6.5組、及7.0組發酵液中之γ-胺基丁酸含量分別為764±20mg/L、22,839±280mg/L、23,407±519mg/L、18,230±122mg/L、14,554±619mg/L、12,903±458mg/L、12,608±106mg/L、及12,401±606mg/L；pH值分別為3.2、6.2、6.65、6.94、7.03、7.08、7.15、及7.2。其中，4.0組及4.5組發酵液中之γ-胺基丁酸含量顯著高於其他組別，由此可知，培養液的起始pH值為4.0~4.5時，可顯著提高發酵液中之γ-胺基丁酸含量。
實驗4-8：磷酸比哆醛對γ-胺基丁酸產量之影響
本實驗分為7組，依磷酸比哆醛(pyridoxal-5-phosphate)之添加量將組別命名為0組、10組、20組、30組、40組、50組及100組。各組之培養基配方都包含1%葡萄糖、2.5%酵母萃取物、1%麩胺酸鈉、2ppm碳酸鈣、2ppm硫酸錳、2ppm聚山梨醇酯80、及磷酸比哆醛，起始pH值都為4.5，且總體積都為9mL。其中，0組、10組、20組、30組、40組、50組及100組培養基中的磷酸比哆醛濃度依序為0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、及100μM。
將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧環境下培養96小時，獲得各組之發酵液。將各組發酵液進行連續10倍稀釋後，以平板計數法測定發酵液中的總菌數，並將總菌數轉換為以10為底的總菌數的對數值(Log10總菌數)。利用pH酸鹼度計(Suntex-2200，台灣)檢測各組發酵液之pH值。利用高效液相層析法定量分析各組發酵液中的γ-胺基丁酸含量。
圖9之結果顯示，0組、10組、20組、30組、40組、50組及100組發酵液中之γ-胺基丁酸含量分別為23,147±183mg/L、26,688±157mg/L、26,316±633mg/L、25,708±451mg/L、24,750±311mg/L、23,481±277mg/L、及22,437±570mg/L。其中以10組、20組、及30組發酵液中的γ-胺基丁酸含量較高，且以添加10μM磷酸比哆醛之組別之發酵液中之γ-胺基丁酸含量為最高。後續將以10μM磷酸比哆醛作為工業化生產γ-胺基丁酸的培養基條件。
實驗4-9：麩胺酸鈉對γ-胺基丁酸產量之影響
本實驗分為13組，依麩胺酸鈉添加量將各組命名為250組、
300組、350組、400組、450組、500組、550組、600組、650組、700組、750組、800組、及850組。各組之培養基配方都包含1%葡萄糖、2.5%酵母萃取物、麩胺酸鈉、2ppm碳酸鈣、2ppm硫酸錳、2ppm聚山梨醇酯80、及10μM磷酸吡哆醛，培養基的起始pH值為4.5，且各組培養基的體積都為2LmL，於3L錐形瓶中進行培養。其中，250組、300組、350組、400組、450組、500組、550組、600組、650組、700組、750組、800組、及850組培養基中的麩胺酸鈉濃度依序為250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、及850mM。
將短乳桿菌株NO.03分別接種於各組培養基中，於30℃厭氧環境下培養96小時，獲得各組之發酵液。利用高效液相層析法定量分析各組發酵液中的γ-胺基丁酸含量及麩胺酸鈉殘留量。
圖10之結果顯示，250組、300組、350組、400組、450組、500組、550組、600組、650組、700組、750組、800組、及850組發酵液中之γ-胺基丁酸含量為22,927±2,653mg/L、25,858±1,374mg/L、30,006±1,149mg/L、32,222±1,356mg/L、36,311±1,762mg/L、38,395±1,234mg/L、43,457±1,398mg/L、45,094±1,385mg/L、48,802±2,873mg/L、47,266±746mg/L、46,037±1,005mg/L、45,983±2,033mg/L、及45,185±3,385mg/L；麩胺酸鈉之殘留量為495±16mg/L、501±8mg/L、555±39mg/L、966±82mg/L、1,092±41mg/L、1,704±102mg/L、1,072±4mg/L、1,914±61mg/L、2,008±63mg/L、6,528±749mg/L、10,705±108mg/L、12,770±121mg/L、及17,798±1,302mg/L。實驗結果顯示，將短乳酸桿菌NO.03培養於添加650mM麩胺酸鈉之
培養基中，其發酵液中之γ-胺基丁酸含量最高。
實驗4-10：利用分批發酵方式大量生產γ-胺基丁酸
本實驗培養基配方中包含1%葡萄糖、2.5%酵母萃取物、650mM麩胺酸鈉、2ppm碳酸鈣、2ppm硫酸錳、2ppm聚山梨醇酯80、及10μM磷酸吡哆醛，培養基的起始pH值為4.5，且各組培養基的體積都為2L，於3L錐形瓶中進行培養。
將短乳桿菌株NO.03接種於培養基中，於30℃厭氧環境下培養，並於不同時間點取樣。利用高效液相層析法定量分析時間點發酵液樣本中的γ-胺基丁酸含量及麩胺酸鈉殘留量。
圖11之結果顯示，在發酵8、16、24、32、40、48、56、64、72、80、88、96、104、及112小時後，發酵液中之γ-胺基丁酸含量分別為141±101mg/L、370±55mg/L、7,897±212mg/L、31,317±4,484mg/L、40,468±262mg/L、38,605±851mg/L、53,854±1,007mg/L、48,301±721mg/L、51,793±309mg/L、57,771±1,095mg/L、62,523±3,088mg/L、57,592±1,303mg/L、59,230±628mg/L、及58,800±1,515mg/L，且麩胺酸鈉之殘留量分別為75,290±1,011mg/L、67,077±600mg/L、61,103±2,595mg/L、31,450±435mg/L、13,991±479mg/L、10,025±655mg/L、7,875±113mg/L、5,045±113mg/L、2,853±73mg/L、1,081±19mg/L、1,006±73mg/L、982±84mg/L、945±24mg/L、及901±46mg/L。
將上述mg/L單位轉換為mM單位，並依據下列公式計算γ-胺基丁酸轉換率：轉換率=(γ-胺基丁酸產量/添加麩胺酸鈉量)*100%
上述γ-胺基丁酸轉換率公式係引用2012年的公開文獻(Zhang,Y.；Song,L.；Gao,Q.；Yu,S.M.；Li,L.；Gao,N.F.,The two-step biotransformation of monosodium glutamate to GABA by Lactobacillus brevis growing and resting cells.Applied microbiology and biotechnology 2012,94,(6),1619-1627.)。
由表二可知，短乳桿菌株NO.03在添加650mM麩胺酸鈉之2L培養液中培養88小時後，發酵液中的γ-胺基丁酸含量高達606.3mM，且麩胺酸鈉(MSG)殘留量僅為5.4mM，轉換率高達93.28%。不同組別之轉換率如表二所示。
實驗5-1：短乳桿菌株NO.03抑制酪胺酸酶之能力
本實驗分為控制組及發酵液組，控制組以磷酸緩衝溶液進行測試，以測得酪胺酸酶未受抑制時的活性，發酵液組則以實驗4-10發酵72小時之發酵液進行測試。
其中，磷酸緩衝溶液之配製方法為：將14.34g磷酸氫二鈉溶於200mL蒸餾水，獲得磷酸氫二鈉溶液；將5.52g磷酸二氫鈉溶於200mL蒸餾水，獲得磷酸二氫鈉溶液。分別取122.5mL磷酸氫二鈉溶液，及127.5mL磷酸二氫鈉溶液，均勻混合後定容至500mL，再利用pH酸鹼度計調整pH值為6.8，即為磷酸緩衝溶液。
將待測液(磷酸緩衝溶液、或實驗4-10發酵72小時之發酵液)、pH6.8之磷酸緩衝溶液、及酪胺酸溶液混合均勻，再加入酪胺酸酶反應20分鐘，以產生酵素性褐變中間產物o-dopachrome。由於該酵素性褐變中間產物o-dopachrome的最大吸收光的波長為475nm，因此以紫外光/可見光光譜儀檢測475nm的吸光值，以分別測得控制組及發酵液組的酵素性褐變中間產物o-dopachrome含量。
酪胺酸酶相對活性計算公式：酪胺酸酶相對活性(%)=(B/A)*100%
A：控制組的酵素性褐變中間產物o-dopachrome含量
B：發酵液組的酵素性褐變中間產物o-dopachrome含量
圖12之結果顯示，短乳桿菌株NO.03發酵後所得之發酵液
(原液)使酪胺酸酶相對活性降低至36%，具有美白的功效。
實驗5-2：短乳桿菌株NO.03發酵液之抗氧化力功效
本實驗將以下列5種試驗方法，即亞鐵離子螯合能力試驗、銅離子螯合能力試驗、還原力測定、總酚含量測定、及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力試驗，分析短乳桿菌株NO.03發酵液之抗氧化力功效。
亞鐵離子螯合能力試驗：本實驗分為控制組、發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組。控制組以乙二胺四乙酸(EDTA)溶液進行測試，發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組則分別以1倍、1/10倍、及1/100倍實驗4-10發酵72小時之發酵液進行測試。
其中，乙二胺四乙酸溶液之配製方法為：將5mg乙二胺四乙酸溶於10mL蒸餾水中，獲得濃度為500ppm乙二胺四乙酸溶液。
將待測液(乙二胺四乙酸溶液、或實驗4-10發酵72小時之發酵液)、2mM氯化鐵、及甲醇混合均勻，再加入5mM菲洛嗪(Ferrozine)，待完全反應後，以3000rpm離心5分鐘，取上清液，利用紫外光/可見光光譜儀測562nm之吸光值，以測得各組中亞鐵離子與菲洛嗪螯合所產生的紅色錯化合物的含量，其中，紅色錯化合物的含量越少(即吸光值越低)，表示該試樣具有越優越的亞鐵離子螯合能力。
利用吸光值減少百分比，判斷各組待測液螯合亞鐵離子之能力，其計算方式如下：亞鐵離子螯合率(%)=[1-(實驗組或控制組的吸光值/空白對照組的吸光
值)]*100%
圖13之結果顯示，控制組、發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組之亞鐵離子螯合率分別為99.67%、97%、97.67%、及76.67%，顯示短乳桿菌株NO.03之發酵液具有良好的亞鐵離子螯合能力。
銅離子螯合能力試驗：本實驗分為控制組、發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組。控制組以乙二胺四乙酸溶液進行測試，發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組則分別以1倍、1/10倍、及1/100倍實驗4-10發酵72小時之發酵液進行測試。
其中，乙二胺四乙酸溶液之配製方法為：將5mg乙二胺四乙酸溶於10mL蒸餾水中，獲得濃度為500ppm乙二胺四乙酸溶液。
將待測液(乙二胺四乙酸溶液、或實驗4-10發酵72小時之發酵液)及硫酸銅溶液混合均勻，再加入鄰苯二酚紫(pyrocatechol violet)，待完全反應後，以紫外光/可見光光譜儀測632nm之吸光值。
利用吸光值減少百分比，判斷各組待測液之銅離子螯合能力，其計算方式如下：銅離子螯合率(%)=[1-(實驗組或控制組的吸光值/空白對照組的吸光值)]*100%
圖14之結果顯示，控制組、發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組之銅離子螯合能力，分別為98%、92.33%、74.67%、及33%，顯示短乳桿菌株NO.03之發酵液具有良好的銅離子螯合能力。
還原力測定：本實驗分為控制組、發酵液組、1/10倍發酵液
組、及1/100倍發酵液組。控制組以維生素C溶液進行測試，發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組則分別以1倍、1/10倍、及1/100倍實驗4-10發酵72小時之發酵液進行測試。
其中，維生素C溶液之配製方法為：取1mg維生素C溶於1mL甲醇溶液中，即為1mg/mL之維生素C溶液。
將待測液(維生素C溶液、或實驗4-10發酵72小時之發酵液)、0.2M磷酸緩衝溶液、及1%赤血鹽溶液(即鐵氰化鉀溶液)混合，在50℃下反應20分鐘後急速冷卻至室溫，然後加入10%三氯醋酸溶液，混合均勻並作用10分鐘。將混合液、蒸餾水、及0.1%氯化鐵溶液混合均勻，利用紫外光/可見光光譜儀測700nm之吸光值，以測得亞鐵氰化鐵(即普魯士藍)的含量，其中亞鐵氰化鐵的含量越多(吸光值越高)，表示樣品的還原力越強。
利用吸光值判斷各組還原力。
圖15之結果顯示，控制組、發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組樣品以上述方式配製後的吸光值分別為2.2462±0.1425、2.516±0.0671、0.521±0.0683、及0.1017±0.001，由此可知短乳桿菌株NO.03之發酵液具有良好的還原力功效。
總酚含量測定：本實驗分為控制組、發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組。控制組以沒食子酸(Gallic acid)溶液進行測試，發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組則分別以1倍、1/10倍、及1/100倍實驗4-10發酵72小時之發酵液進行測試。
其中，沒食子酸溶液之配製方法為：秤取5mg沒食子酸加入5mL蒸餾水，混合均勻。
將待測液(沒食子酸溶液、或實驗4-10發酵72小時之發酵液)、1N鄰鉬酸酚指示劑(Folin-Ciocalteau’s Phenol Reagent)、及7.5%碳酸鈉溶液混合均勻後，靜置2小時，以紫外光/可見光光譜儀測760nm之吸光值。
利用吸光值減少百分比，判斷各組總酚含量。
圖16之結果顯示，控制組、發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組之吸光值分別為0.457±0.0035、0.5463±0.0123、0.140±0.0025、及0.0857±0.0004，顯示短乳桿菌株NO.03之發酵液中具有高濃度的總酚化合物。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力試驗：本實驗分為控制組、發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組。控制組以維生素C溶液進行測試，發酵液組、1/10倍發酵液組、及1/100倍發酵液組則分別以1倍、1/10倍、及1/100倍實驗4-10發酵72小時之發酵液進行測試。
其中，維生素C溶液之配製方法為：取1mg維生素C溶於1mL甲醇溶液中，即為1mg/mL維生素C溶液。
將待測液(維生素C溶液、或實驗4-10發酵72小時之發酵液)、及0.25mM DPPH乙醇溶液混合均勻，於室溫下避光靜置20分鐘，使用紫外光/可見光光譜儀測517nm之吸光值。其中，DPPH是一種安定性佳的自由基，在517nm附近有很強的吸光值，因此吸光值越低，表示反應物對DPPH自由基的清除效應越強。
抗氧化能力以清除能力百分比(Scavenging Activity,%)呈現，計算公式如下：
DPPH自由基清除率=(1-實驗組或控制組吸光值/空白對照組吸光值)*100%
圖17之結果顯示，控制組及1/100倍發酵液組之DPPH自由基清除能力分別為100%及99%，顯示短乳桿菌株NO.03之發酵液具有良好的自由基清除能力。
綜合上述圖13~圖17之實驗結果可知，短乳桿菌株NO.03的發酵液能夠(1)有效螯合亞鐵離子和銅離子，減緩氧化發生、(2)將已產生的自由基進行氧化還原，轉變成毒性較小或無毒的物質、(3)利用總酚化合物(屬抗氧化成分)幫助自由基進行氧化還原，轉變成毒性較小或無毒的物質、以及(4)清除自由基，顯示短乳桿菌株NO.03經發酵後所得之發酵液具有好的抗氧化能力。
以上所述僅為本發明之較佳實施例，並非用以限定本發明之申請專利範圍，因此凡其它未脫離本發明所揭示之精神下所完成之各種更動或潤飾等，均應包含於本案之申請專利範圍內。
國內寄存資訊【請依寄存機構、日期、號碼順序註記】
財團法人食品工業發展研究所、106/02/14、寄存號碼為BCRC910771
國外寄存資訊【請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記】
無。
以下序列由左到右以5’端到3’端的方項表示。
<110> 國立高雄海洋科技大學
<120> 新穎之短乳桿菌及其應用
<160> 1
<210> 1
<211> 1438
<212> 去氧核醣核酸
<213> Lactobacillus brevis
<400> 1
Claims (9)
- 一種具有一16S核糖體DNA(16S rDNA)的短乳桿菌株(Lactobacillus brevis)，該16S核糖體DNA包含SEQ ID NO：1；該短乳桿菌株係分離自一水生動物的腸胃道，該水生動物選自大棘大眼鯛(Priacanthus macracanthus)、河鱸(Perca fluviatilis)、太平洋黑鮪(Thunnus thynnus)、刺鯧(Psenopsis anomala)、及草魚(Ctenopharyngodon idellus)；該短乳桿菌株具有在一分批發酵(batch fermentation)條件下將一培養液中的麩胺酸鈉轉換為γ-胺基丁酸(γ-Aminobutyric acid)，進而使γ-胺基丁酸的濃度在該分批發酵過程中至少增加50g/L，而且使麩胺酸鈉轉換為γ-胺基丁酸之轉換率(conversion rate)達90%以上的能力，並且具有在該分批發酵條件下使發酵液中之生菌數至少達108CFU/毫升的能力；其中，該短乳桿菌株的最適發酵溫度為25~35度，且該短乳桿菌株最適發酵起始pH值為4.0~4.5。
- 如申請專利範圍第1項所述之短乳桿菌株，其具有在該分批發酵條件下將該培養液中的麩胺酸鈉轉換為γ-胺基丁酸，使γ-胺基丁酸的濃度在該分批發酵過程中至少增加60g/L的能力。
- 如申請專利範圍第1項所述之短乳桿菌株，其具有產生一可抑制酪胺酸酶活性的代謝產物的能力。
- 如申請專利範圍第1項所述之短乳桿菌株，其係寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存號碼為BCRC910771。
- 一種培養基在透過如申請專利範圍第1項所述之短乳桿菌株發酵而製備γ-胺基丁酸之用途，該培養基包含：麩胺酸鈉(Monosodium glutamate)；碳源；氮源；碳酸鈣(Calcium carbonate)；以及硫酸錳(Manganese sulfate)。
- 如申請專利範圍第5項所述之培養基之用途，該培養基中更包含聚山梨醇酯80(Tween 80)。
- 如申請專利範圍第5項所述之用途，該短乳桿菌係寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存號碼為BCRC910771。
- 一種生產γ-胺基丁酸之方法，包含：將如申請專利範圍第1項所述之短乳桿菌株接種至含有碳酸鈣、硫酸錳、及聚山梨醇酯80的一培養液；培養一預定的時間長度；以及獲得包含γ-胺基丁酸的發酵液。
- 一種短乳桿菌株，係寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存號碼為BCRC910771。
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