TWI667479B

TWI667479B - 乳癌生物標記

Info

Publication number: TWI667479B
Application number: TW103133931A
Authority: TW
Inventors: 蔡有光
Original assignee: 豐宥科技股份有限公司
Priority date: 2013-10-01
Filing date: 2014-09-30
Publication date: 2019-08-01
Also published as: TW201608239A; AU2014331435A1; US20150093331A1; WO2015048929A1; EP3052942A1

Abstract

本發明關於一種生物標記、方法及檢驗套組，用於辨識、監控及治療乳癌。

Description

乳癌生物標記

【相關申請案交互參照】

根據35 U.S.C.§ 119(e)，本發明主張美國臨時專利申請案(申請日：2013年10月1日；申請號：61/885,103)之優先權，其全部內容皆被引入本文中以供參閱。

本發明關於生物標記、方法及檢驗套組，用於辨識、監控及治療乳癌。

乳癌為女性最常見之癌症，且對於全球女性已成為癌症死亡之主要原因。無疑地，若能早期偵測乳癌，可提供最好之治癒機會。部分生物標記，像是BRCA1、BRCA2及Her-2/neu，已被證實為乳癌之危險基因，其可被用於預期一生中發生乳癌之風險。此外，乳房攝影術被用於偵測小型之乳房腫瘤。然而，目前仍無診斷早期乳癌之篩選方法，尤其是藉由血液之試驗。

本發明不可預期地發現，於乳癌病患中，其血漿蛋白補體因子H(complement factor H；CFH)之結構上產生變化，藉由蛋白質分解方式移除第341號位置(Arg-341)之胺基酸殘基，導致產生兩種胜肽片段，較小者約為40kDa，較大者約為140kDa，且該種切割型態之CFH可專一地於乳癌病患中測得，即便在早期也可測得，但於沒有乳癌之個體中則無法測得，包含已治癒乳癌之個體，其經治療後已無乳癌。因此，該切割型態之CFH蛋白，源自Arg-341之蛋白質分解移除，可做為專一的分子標記，用於診斷乳癌，甚至是早期診斷，亦可用於監控患有乳癌病患之乳癌之進展，或評估乳癌療法之治療有效性。

於一方面中，本發明提供一種檢驗方法，包含：(a)自個體取得生物樣本；及(b)藉由如質譜分析或免疫分析法，以偵測樣本中切割型態之補體因子H(CFH)蛋白。

於部分具體實施例中，該切割型態之CFH係以一試劑偵測之，該試劑可專一地結合至該切割型態之CFH，如抗體。該等抗體可專一地結合至(i)SEQ ID NO：2之胜肽、或(ii)SEQ ID NO：3之胜肽結合。例如，該抗體可結合至包含SEQ ID NO：2之C端Met殘基之抗原決定基、或包含SEQ ID NO：3之N端Arg殘基之抗原決定基，但該抗體不會結合至完整型態的CFH。

本文所述之方法中，受檢驗之生物樣本可為體液樣本，包含但不限於，源自血液、尿液、唾液、淚液、腦脊髓液、腹水、淋巴或吸入之液體樣本，如乳頭抽取液。典型地，血液樣本可為全血或其片段，如血清或血漿、肝素化或EDTA處理後之樣本，以避免凝血。此外，該生物樣本可為組織樣本或生物檢體。

於部分具體實施例中，於此所述之檢驗方法可進一步包含：如果於該樣本中切割型態之CFH之量，較參考量更高的話，則可判斷該個體患有乳癌或有罹患乳癌之風險。於部份實例中，於樣本中存在有切割型態之CFH，而於對照組樣本中不存在切割型態之CFH(如標準值為0)，即代表乳癌之發生或有發展為此癌症之風險。於其他實例中，相較於標準值(如對照組之切割型態CFH之量)，於樣本中之切割型態之CFH有增加的量時，則代表乳癌之發生或風險。

任何本文所述之方法，可進一步包含，可視需要地，若該個體被診斷出具有乳癌，則於該個體以抗乳癌療法治療之，其中該抗乳癌療法為手術治療、放射線療法、或化學療法。於部分實例中，該個體被診斷為具有乳癌，可被施予化學療法，其可能使用之抗乳癌藥物，係選自由阿伯利斯(Abraxane)、安美達錠(Anastrozole)、安美達錠(Arimidex)、諾曼癌素(Aromasin)、癌思停(Avastin)、多西他賽(Docefrez)、剋癌易(Docelaxel)、艾倫斯(Ellence)、泛艾黴素(Epirubicin)、艾瑞布林(Eribulin)、依西美坦(Exemestane)、法樂通(Fareston)、氟維司群(Faslodex)、復乳納錠(Femara)、氟維司群(Fulvestrant)、吉西他濱(Gemcitabine)、健澤(Gemzar)、賀樂維(Halaven)、賀癌平(Herceptin)、易莎平(Lxabepiline)、伊沙匹隆(Lxempra)、泰嘉錠(Lapatinib)、復乳納膜衣錠(Letrozole)、甲地孕酮(Megestrol)、紫杉醇(Paclitaxel)、泰莫西芬(Tamoxifen)、剋癌易(Taxotere)、托瑞米芬(Toremifene)、賀癌平(Trastuzumab)、及嘉泰錠(Tykerb)所組成之群組。

另一方面或此外，本文所述之方法可進一步包含在此處描述之方法所診斷之個體施用另一乳癌診斷方法，以確認乳癌之發生。

於另一方面，本發明提供一種監控乳癌病患中乳癌發展之方法，該方法包含：(a)於第一時間點，提供源自該病患之第一生物樣本，(b)於第二時間點，提供源自該病患之第二生物樣本，其中該第二時間點係晚於第一時間點，(c)藉由質譜分析或免疫分析法，以測量於第一及第二生物樣本中之切割型態之補體因子H(CFH)蛋白之量；以及(d)基於第一及第二生物樣本中之切割型態之CFH之量，以診斷該病患中之乳癌進程，其中相較於第一生物樣本，若第二生物樣本中之切割型態之CFH的量較為提高的話，則代表乳癌發展中。於部分實例中，該方法可進一步包含評估該病患之抗乳癌療法之有效性，其中若經治療後、或於療程期間後，該切割型態之CFH之量降低的話，則代表該療法對於該病患有效。

於部分具體實施例中，該病患係被施予抗乳癌療法，且該第一及第二生物樣本可取自於治療前後，或治療期間。

於部分具體實施例中，該切割型態之CFH可被一試劑偵測，且該試劑可專一地結合至切割型態之CFH，其可為抗體，例如，一抗體可專一地結合至(i)SEQ ID NO：2之胜肽、或(ii)SEQ ID NO：3之胜肽。於一實例中，該抗體結合至包含SEQ ID NO：2之C端Met殘基之抗原決定基、或包含SEQ ID NO：3之N端Arg殘基之抗原決定基結合。此外，或另外，該抗體不會與完整型態之CFH結合。

於再一方面，本發明提供一單離的抗體，其可專一地結合至切割型態之補體因子H(CFH)蛋白。於部分具體實施例中，該抗體可專一地結合至SEQ ID NO：2或3。例如，該抗體可與SEQ ID NO：2之C端部分專一結合、或與SEQ ID NO：3之N端部分專一結合。於一實例中，該抗體結合至包含SEQ ID NO：2之C端Met殘基之抗原決定基、或包含SEQ ID NO：3之N端Arg殘基之抗原決定基。於另一實例中，該抗體不會與完整型態之CFH結合。

於部分實例中，本文所述之抗體可為單株抗體或多株抗體。於其他實例中，該抗體為嵌合型抗體或人化抗體。

同樣地，於本發明之範疇內，包含多胜肽，或複合物，其中該多胜肽包含胺基酸序列，其具有與切割型態之CFH至少90%(如95%、97%、99%或更多)之相同性。於部分具體實施例中，該切割型態之CFH為SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或其複合體。於一實例中，該多胜肽或其複合體包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3。該等多胜肽或其複合體可被藉由如重組技術來製備。

於另一方面中，本發明提供一種使用任何本文所述之抗體用於治療或體內診斷乳癌之方法。當用於治療乳癌時，該抗體係與抗乳癌藥物(如該等於本文所述者)結合。因此，本發明提供一種抗體在製造治療乳癌之醫藥品之用途，該抗體係與抗乳癌藥物結合。此外，當用於體內診斷目的時，該抗體可與適用於診斷用途之可測得標記結合，其皆為該領域所習知者。為了施行該方法，可施予需治療之個體有效量之組合物(如作為一偵測劑)，該組合物包含共軛之抗體。本發明亦提供一種本發明抗體在製造於有需要之個體施行體內診斷之組合物(如作為一偵測劑)的用途，該抗體係共軛於適用於診斷目的之可測得之標記。

亦包含在本發明之範疇內者為一種本文所述之切割型態之CFH，其可被以重組技術或化學合成方式製備。

本發明之一種或多種具體實施例之詳細說明，皆於以下說明敘述之。本發明之其他特徵或優點將可藉由以下詳細說明各種具體實施例及所附之申請專利範圍得以明晰。

先前發明內容，以及本發明之後詳細說明，可配合所附圖式閱讀，得以更佳理解本發明。為了闡述本發明之目的，於圖式中所示之具體實施例皆為較佳者。應可理解的是，本發明不受限於該等精確組合及所示之物件。

於圖式中：圖1顯示模型，其預測血漿蛋白質體繼蛋白分解過程後之蛋白產物為癌症專一性生物標記。於血漿中，多胜肽鏈(粗黑線)富含雙硫鍵(細線)，其可被分類為鏈內的及鏈間的鍵結，係根據其於連結中所涉含硫基之多胜肽鏈之數量而定。具體而言，鏈間雙硫，連接兩個不同之多胜肽鏈，可幫助穩定蛋白，其可被癌症特定蛋白水解酶(灰三角形)所處理，且使得含有血漿蛋白之蛋白分解足跡(proteolytic footprint)，得以存在於血漿中。藉由量化分析該等蛋白產物，吾人可偵測癌症專一的蛋白水解酶活性之存在，其可做為人類癌症之專一診斷方法。

圖2顯示源自乳癌病患(P)及正常個體(C)之血漿樣本之西方墨點分析，係使用抗補體因子H之抗體。源自受測試個體之血漿樣本中之蛋白，於非還原狀態進行電泳(左圖)、或於還原狀態進行電泳(右圖)。左邊的數字，代表分子量(kDa)，是分子重量標記之位置。完整的圓圈係指完整的補體因子H多胜肽，其經蛋白分解過程後，推測變成較大(大的環形片段)及較小的片段(小的環形片段)。該兩個片段於非還原態下，仍可以雙硫鍵(粗黑線)連接彼此，而於還原態下則無法相連接。

圖3顯示來自40kDa CFH片段之胰蛋白分解Lys-C分解物的雙電荷性之³³²HGGLYHENM³⁴⁰(SEQ ID NO：4)的串聯質譜分析。於胜肽序列上之數字代表於完整因子H中該胜肽之末端位置。辨識的b及y離子係以數字分別表示在胜肽序列上方及下方。序列分析顯示，當串聯質譜分析與該序列相符時，關聯分數為1.40。

圖4顯示來自40kDa CFH片段之Arg-C分解物的三電荷性³²⁰CTLKPCDYPDIKHGGLYHENM³⁴⁰(SEQ ID NO：5)之串連的質譜分析。於胜肽序列上之數字代表於完整因子H中該胜肽之末端位置。辨識的b及y離子係以數字分別表示在胜肽序列上方及下方。VP代表105.0578-Da之乙烯基吡啶基之喪失，同時伴隨著或不伴隨著蛋白之釋放。序列分析顯示，當串聯質譜分析與該序列相符時，關聯分數為3.53。

圖5顯示來自140kDa CFH片段之Lys-C分解物的雙電荷性之³⁴²RPYFPVAVGK³⁵¹(SEQ ID NO：6)的串聯質譜分析。於胜肽序列上之數字代表於完整因子H中該胜肽之末端位置。辨識的b及y離子係以數字分別表示在胜肽序列上方及下方。序列分析顯示，當串聯質譜分析與該序列相符時，關聯分數為3.06。

圖6顯示概要圖式，摘述該質譜分析結果，證實補體因子H之片段可於乳癌病患中被觀察到，係歸因於Arg-341之蛋白分解移除。補體因子H之域結構，顯示於其CCP-6之胺基酸序列上面，CCP-6為該20個蛋白之補體控制蛋白(CCP)模組中之一者。於該結構域下方之數字係指CCP-6模組之起點及終點位置。於CCP-6序列右方之數字，代表完整因子H之殘基位置。Cys殘基涉及第一(實心線箭號)及第二雙硫鍵(點線箭號)係如所示。Arg-341之移除，可藉由觀察於串聯質譜分析結果中之Lys-C(虛線)、Arg-C(點線)及胰蛋白水解胜肽(實線)推測。殘基301-390之胺基酸序列係如SEQ ID NO：7所示。

圖7顯示源自乳癌病患(P)及正常個體(C)之血漿樣本之西方墨點分析，係使用抗BCPM1(左圖)或抗BCPM2。該40kDa蛋白水解片段之C端係作為乳癌蛋白水解標記1(BCPM1)，及該140kDa片段之N端係稱作乳癌蛋白水解標記2(BCPM2)。源自受試個體之血漿樣本中之血漿蛋白，係於還原態下進行電泳。左邊之數字代表分子量(kDa)，係指於相同膠體中分子重量標記移動之位置。

以下說明僅用於闡述本發明之各種具體實施例。因此，該等特定之具體實施例或本文所討論之修飾，不應被認為用於限制本發明之範疇。應明瞭的是，對於該領域具有通常技藝者而言，該等不同改變或等同物皆可被應用，且不背離本發明之範疇。

為了提供一清晰且便於瞭解本發明之方式，部分術語係首先進行定義。其他定義亦於詳細說明中有說明。除非另有定義，本文中所有技術及科學性術語，具有與屬於本發明領域具有技藝者所習知之相同意義。

本文所用之術語「一(a)」及「一(an)」係指一種或一種以上(即至少一種)符合文義之物體。舉例，「一種元件」意旨一種元件或多於一種元件。

本文所用之「多胜肽」乙詞係指透過胜肽鍵相連之由胺基酸殘基所組成之聚合物。「蛋白」乙詞一般係指相對較大之多胜肽(如含有高於300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、或1200個胺基酸殘基)。「胜肽」乙詞一般係指相對較短之多胜肽(如含有多達150、125、100、80、 60、50、30、或20個胺基酸殘基)。胺基酸可以該領域所習知之三個字母或一個字母表示。

本文所用者，生物性標記(或稱生物標記或標記)是一種特徵，其可藉由客觀地測量及評估，以作為正常或不正常生物性反應、疾病、治病過程、或對於治療之反應、或介入治療之指標。標記可包含該特徵、或該特徵之模式、或集合之存在與否，該特徵可為一特定生物反應之指標。該生物標記之測量，可為增加或減少，以代表特定生物性事件或過程。標記主要用於診斷及預後之目的。然而，其亦可用於治療、監控、藥物篩選及其他本文所述之目的，包含評估癌症療法之有效性。

本文所述之「約」或「近似」乙詞係指對於該領域具有通常技藝者，可接受之變動程度，其根據所述之內容有可能會有不同程度之不同。一般而言，「約」或「近似」可能係指一數值具有所述數值±10%之範圍。

本文所述之「對象」、「個體」、及「病患」等詞，於此可交換替用，係指任何哺乳動物個體，其適用於診斷、預後、治療或療程，具體而言係指人類。其他個體可包含牛、狗、貓、天竺鼠、兔子、大鼠、小鼠、馬等。

本文所述之「診斷」乙詞，一般包含判定一個體是否有可能被疾病、疾患或喪失功能所影響。該具有技藝者通常基於一種或多於一種診斷指標(如一種標記，出現與否、或其的含量，可做為疾病、疾患或喪失功能之有無的指標)以做出診斷。

本文所述之「不正常之量」乙詞意旨相較於沒有癌症之個體或一參考或一對照量，具有增加之量。對於檢驗者，一個不正常的量，可高於參考或對照量，高於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。或對照量可為健康個體或樣本類型(如不含有疾病之組織或細胞)中所測得之量。

本文所述之生物樣本可藉由任何本文所述之方法分析，所分析之樣本類型可為任何從受診斷之個體中所取得之樣本，包含源自血液、尿液、唾液、淚液、腦脊髓液、腹水、淋巴或吸入之液體樣本，如乳頭抽取液。典型地，血液樣本可為全血或其片段，如血清或血漿、肝素化或EDTA處理後之樣本，以避免凝血。此外，該生物樣本可為組織樣本或生物檢體。

本發明主要(其中至少一部分)發現一種新穎之可信賴的乳癌生物標記，即切割型態之CFH。經以下實例證實，該生物標記，不可預期地，可使用血液樣本篩檢早期之乳癌病患(如第0期之病患)。因此，本文所述之快速且準確之可用的篩檢方法，可辨識個體具有、疑似患有、或有罹患乳癌之風險。本文所述之診斷方法可供任何個體(如女性人類個體)，進行初期、常規篩檢，以診斷出該等患有早期乳癌之病患，或該等可能有發展中乳癌風險之病患。

I.切割型態之CFH可作為一新穎的乳癌生物標記

補體因子H(CFH)，亦稱補體控制蛋白(CCP)，為單股之血清醣蛋白，其具有約155kDa之分子量，其可調節補體C3及C5轉化酶酵素之形成及功能。補體因子H係由20個短的同源重複(short consensus repeat；SCR)模組所組成，每一個模組含有約60個胺基酸。於每一個SCR中之胺基酸序列為高度地保留性，包含四個半胱胺酸殘基，其供雙硫鍵之形成。圖6顯示CFH 蛋白之示例性域結構，包含20個SCR模組，CCP-1至CCP-20。該CFH蛋白之胺基酸序列及結構皆為該領域所習知者。例如，一示例性之人類CFH蛋白之序列如SEQ ID NO：1所示。請參閱以下實例。

如本文所用，本發明基於不可預期之發現，切割型態之CFH之存在及量與乳癌之出現及發展有關連。本文所用之「切割型態之CFH」或「切割之CFH」乙詞係指任何源自CFH蛋白水解之CFH片段或其多胜肽複合物。例如，切割之CFH可藉由將位於SEQ ID NO：1中對應Arg-341之位置之胺基酸殘基移除以產生，導致產生兩種CFH片段，較小者具有SCR模組1至5，其具有位於第340位置(Met-340)之甲硫胺酸作為C端殘基(如SEQ ID NO：2)，以及較大者具有SCR模組6至20，其具有位於第342位置(Arg-342)之精胺酸作為N端殘基(如SEQ ID NO：3)。於部分具體實施例中，該較小的片段具有之分子量約為40kDa，以及較大片段具有約140kDa之分子量。於部分實例中，該切割型態之CFH為具有SEQ ID NO：2之多胜肽。於其他實例中，該切割型態之CFH為具有SEQ ID NO：3之多胜肽。於另一實例中，該切割型態之CFH為以SEQ ID NO：2、及SEQ ID NO：3形成之複合體。

任何切割型態之CFH、或其複合型態，亦屬於本發明之範疇。該切割型態之CFH可藉由傳統方法製備，如重組技術，使用適用之宿主細胞(如大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物、昆蟲或無細胞之宿主系統)或合成方式。於部分實例中，該切割的CFH多胜肽與天然存在者，於至少轉譯後修飾(像是醣化)部分不同。該切割型態之CFH可與一醫藥可接受載劑(如：自然界中不會與切割的CFH共同存在之載劑或非自然存在之載劑)混合，以形成一組合物，用於如醫藥用途。

II.偵測及測量切割的CFH量之方法

可藉由任何常規技術以測定生物樣本中切割型態之CFH之存在及量。於部分具體實施例中，切割型態CFH之存在及/或量，可藉由質譜分析測定，其可以高敏感性及再現性之直接測量該分析物。許多不同之質譜分析方法可被使用。質譜分析的例子包含，但不限於，介質輔助雷射脫附離子化/時差測距(MALDI-TOF)、表面增強鐳射脫附離子化/時差測距(SELDI-TOF)、液相色譜法-質譜聯用(LC-MS)、液相色譜法串聯式質譜儀(LC-MS-MS)、及電噴灑離子化質譜(ESI-MS)。一部分之該方法之實例為串聯式質譜儀(MS/MS)，其牽涉多個步驟以進行質量選擇或分析，通常藉由部分片段化型態分開。

於其他具體實施例中，切割型態CFH的存在及/或量可藉由免疫分析方法判定。免疫分析法之實例包含，但不限於西方墨點分析、酵素連結免疫吸附法(ELISA)、放射免疫法(RIA)、放射免疫沉澱法(RIPA)、免疫螢光法(IFA)及電化學螢光法(ECL)。

於部分實例中，切割型態之CFH之存在及/或量，可藉由使用一物質以測定，該物質可專一地辨識切割的CFH，像是一種可專一與切割的CFH結合之抗體。

(i)專一地與切割的CFH結合之抗體

本文所述之「抗體」乙詞係指一種完整的免疫球蛋白，或其片段，以及包含一種含有抗原結合域或抗原結合片段之多胜肽，其可專一地與特定抗原結合。該術語包含但不限於單株的、單專一性的、多株的、多專一性的、人化的、人類的、單股的、嵌合的、合成的、重組的、突變的及雜合的抗體。可根據該領域所習知方法以製備適用的抗體。該抗體可能非自然存在者(如不經過人工方式，即不會於自然界中產生)。

完好的或完整的抗體，包含兩股重鏈，及兩股輕鏈。每一個重鏈係由可變區(V_H)及第一、第二及第三恆定區(C_H1、C_H2及C_H3)所組成，且每一個輕鏈係由一個可變區(V_L)及一個恆定區(C_L)所組成。

「抗原結合域」或「抗原結合片段」乙詞係指整個抗體分子之部分或區域，其負責與抗原結合。可被抗體所專一地結合或辨識之抗原的一部分，稱作「抗原結合基」。一種抗原結合域可包含重鏈可變區(V_H)及輕鏈可變區(V_L)；然而，其並不一定要包含兩者。該於兩股鏈中之可變區域典型地含有三個高可變性區域，稱作互補決定區域(complementarity determining regions；CDRs)。該三個CDRs係由框架區域(framework regions；FRs)所隔開，該FRs較CDRs更為高度保守。重鏈及輕鏈之恆定區與抗原結合無關，但存在著不同功能子之功用。抗體之分類係基於其重鏈之恆定區之胺基酸序列以分類。5種主要抗體類型或同型為IgG、IgM、IgA、IgD及IgE，其分別以重鏈之恆定區之γ、μ、α、δ及ε定義之。抗體之抗原結合片段之實例，包含：(1)一Fab片段，一具有V_L、V_H、C_L及C_H1域之單價片段；(2)一F(ab')₂片段，一具有兩個Fab片段之二價片段，係透過雙硫鍵於橋接區進行連結，即Fab之雙體；(3)一具有V_L及V_H域之Fv片段之單股抗體；(4)一單離的互補決定區(CDR)；(5)一單股的Fv(scFv)，一單股多胜肽鏈，係由V_H域及V_L域所組成，其透過胜肽連接子連結；及(6)一種(scFv)₂包含三個胜肽鏈；兩個V_H域藉由胜肽連接子及雙硫鍵與兩個V_L域結合。

「人類抗體」乙詞包含具有可變的及恆定區之抗體，本質上對應於，或衍生自人類生殖的免疫球蛋白序列。本發明之人類抗體，然而，可包含非編碼人類生殖免疫球蛋白序列之胺基酸殘基(如藉由隨機或體外特定位置突變所誘導之突變，或藉由體內之體突變)，例如於CDRs中。具體而言，該人類抗體可具有至少1、2、3、4、5或更多位置以胺基酸殘基替換，其非編碼人類生殖免疫球蛋白序列。

於部分具體實施例中，被應用於本文所述之任何方法之抗體，為可專一地與切割型態CFH結合之抗體，例如具有SEQ ID NO：2序列之CFH片段、具有SEQ ID NO：3序列之CFH片段、或由該兩個片段所形成之複合體。

一種抗體其可「專一地」與標的(如切割型態之CFH)結合，或與一抗原決定基結合，係為該領域所熟知之術語，且用於判斷該專一性結合之方法亦是該領域所習知的。若一分子與特定標的抗原(而不與其他標的)之反應或關聯更為頻繁、更為快速、更長時間及/或更高的親和性，則該分子被稱作具有「專一性結合」能力。若一抗體與其標的抗原(與其他物質相較)之結合，具有更高親和性、傾向、更快速、及/或更長時間，則該抗體可與標靶抗原「專一地結合」。例如，一抗體可專一地(或優選地)與切割型態之CFH結合，或其抗原決定基結合，則代表該抗體與其之標靶抗原(相較於其與其他抗原結合、或於相同抗原中之其他抗原決定基，如全長的CFH)具有更高之親和性、傾向、更快速、及/或更長時間之結合能力。應可被理解的是，藉由所示之定義，例如一與第一標的抗原專一結合之抗體，可能或可不專一地或優選地與第二標的抗原結合。如此，「專一的結合」或「優選結合」並非一定要獨占式結合(雖然可包括獨占式結合)。一般而言，但非必要，提及結合係指優選地結合。

於部分具體實施例中，用於本文所述方法之抗體，可專一地與CFH片段結合，該CFH可由短的同源重複(SCR)模組1至5所組成，其具有位於第340位置(Met-340)之甲硫胺酸作為C端殘基。於另一具體實施例中，該抗體可專一地與CFH片段結合，該CFH可由SCR模組6至20所組成，其具有位於第342位置(Arg-342)之精胺酸作為N端殘基。於部分具體實施例中，該抗體用於本文所述之方法，可專一地與由SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3結合。於其他實例中，該抗體可專一地與由SEQ ID NO：2及SEQ ID NO：3所形成之複合體結合。該抗體不會與全長之CFH結合。於一實例中，該抗體專一地與SEQ ID NO：2之C端、或SEQ ID NO：3之N端部分結合。例如，該抗體可與一SEQ ID NO：2，其含有C端胺基酸殘基之抗原決定基、或與一SEQ ID NO：3，其含有N端胺基酸殘基之抗原決定基結合。

任何本文所述之抗體，皆屬於本發明之範疇。

(ii)抗體製備

本文所述之抗體可與切割的CFH結合，其可藉由該領域所習知之任何方法製備。請參閱，如Harlow and Lane,(1988)Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York。

於部分具體實施例中，抗體專一地與一標靶抗原(如切割型態之CFH，如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3)結合，可藉由習知融合瘤技術而製備。全長標靶抗原或其片段，可視需要地與載體蛋白(如KLH)結合，以用於致免疫宿主動物，以產生可與該抗原結合之抗體。宿主動物之免疫時程及路徑，一般皆與已建立的及常規用於刺激抗體生成及產生之技術相同(本文進一步說明)。一般技術用於生產小鼠、人化的、及人類抗體，皆為該領域所習知者，且於本文所描述。應考慮的是，任何哺乳動物個體，包含人類或產生抗體之細胞，可被操作以作為生產哺乳動物包含人類之融合瘤細胞株之基礎。一般而言，該宿主動物以腹腔、肌肉、口服、皮下、足底、及/或皮內的方式，接種一定量之免疫原，包含本文所述者。

使用一般體細胞雜和技術(Kohler,B.and Milstein,C.(1975)Nature 256：495-497或修改自Buck,D.W.,et al.,In Vitro,18：377-381(1982))，可自淋巴球及不死的骨髓瘤細胞以製備融合瘤。可取得之骨髓瘤細胞系，包含但不限於，X63-Ag8.653及該等源自Salk Institute,Cell Distribution Center,San Diego,Calif.,USA之細胞，皆可用於雜合。一般而言，該技術涉及使用融合劑以融合骨髓瘤細胞及淋巴細胞，該融合劑諸如聚乙二醇、或藉由電力方式，皆為該領域具有技藝者所熟知者。經融合後，將細胞自融合培養基中分離出來，並置於選擇性生長培養基中培養，像是次黃嘌呤-氨喋呤-胸苷(hypoxanthine-aminopterin-thymidine；HAT)培養基，以排出非融合之親代細胞。任何本文所述之培養基，可添加或不添加血清，可被用於培養融合瘤，其可分泌出單株抗體。該等融合瘤經增殖及繼代，如需要，可將上清液以常規免疫方法步驟(如放射免疫分析、酵素免疫分析、或螢光免疫分析)進行分析抗免疫原之活性。

融合瘤可做為抗體之來源，其包含所有衍生物，親代融合瘤之子代細胞，可產生單株抗體，其可與切割的CFH結合。可產生該等抗體之融合瘤可使用習知方式於體外或體內進行培養。該單株抗體可從培養基或體液中分離出來，藉由傳統免疫球蛋白純化步驟，像是硫酸銨沉澱、膠體電泳、透析、層析法、及超過濾，如果適用的話。若出現不欲之活性，則可將之移除，例如藉由將該製備物，以一由免疫原所製備之吸收物作用，該免疫原係貼附於一固相，並將所欲之抗體從該免疫原上洗提或釋放出來。使用標的抗原或與蛋白連結之含有標的胺基酸序列之片段，免疫一宿主動物，以獲得產製之抗體(如單株抗體)；其中該抗原係對於免疫物種具有免疫原性，如鑰孔蟲戚血藍蛋白、血清白蛋白、牛的甲狀腺球蛋白、或使用雙功能或衍生劑之豆胰蛋白酶抑制子，例如馬來醯亞胺基苯甲酸磺基琥珀醯亞胺酯(透過與半胱胺酸殘基連結)、N-羥基丁二醯亞胺(透過離胺酸殘基)、戊二醛、丁二酸酐、SOCl、或R1N=C=NR，其中R及R1為不同之烷基。

若需要，感興趣(如以融合瘤所生產)之抗體(如單株或多株)可進行定序，且該多核苷酸序列可被選殖至一載體中，用於表現或增殖。編碼感興趣抗體之序列可被維持於宿主細胞之載體中，且該宿主細胞可被增殖並冷凍以供未來使用。可擇地，該多核苷酸序列可被用於進行基因改造成「人化」抗體或改善其親和性(親合性成熟度)、或其他抗體之特徵。例如，若該抗體用於臨床試驗中，且對人類進行治療時，該恆定區可被改造以成為更與人類恆定區相似，以避免免疫反應。另外可能經由基因改造該抗體序列，以獲得對於標的抗原更高親和性，及偵測切割CFH更高之效率。對於該領域具有技藝者，應可理解的是，可對該抗體進行一種或多種多核苷酸之改變，且仍可維持其與標的抗原之結合專一性。

於其他具體實施例中，完整的人類抗體可使用市售可得小鼠以製備，其經改造可表現專一的人類免疫球蛋白。該轉殖基因動物係設計用於產生更多所欲(如完整人類抗體)、或更強的免疫反應，亦可用於生成人化或人類抗體。該技術之實例為Amgen,Inc.(Fremont,Calif.)之Xenomouse^RTM，及Medarex,Inc.(Princeton,N.J.)之HuMAb-MouseRTM及TC Mouse^TM。於另一種可能，該等抗體可藉由噬菌體表現或酵母菌技術以製備。請參閱，如，美國專利號5,565,332；5,580,717；5,733,743及6,265,150；及Winter et al.,(1994)Annu.Rev.Immunol.12：433-455。此外，噬菌體表現技術(McCafferty et al.,(1990)Nature 348：552-553)，源自未免疫之貢獻者之免疫球蛋白可變區(V)基因群，被用於產生人類抗體，及體外之抗體片段。

完整抗體(全長抗體)之抗原結合片段可藉由常規方法製備。例如，F(ab')₂片段可藉由胃蛋白酶消化抗體分子以製備，以及Fab片段可藉由還原F(ab')₂片段之雙硫鍵以生成。

基因工程抗體，像是人化抗體、嵌合型抗體、單鏈抗體、及雙特異性抗體，可藉由如傳統重組技術製備。於一實例中，可單離一編碼單株抗體(對標的抗原具專一性)之DNA，並使用常規步驟定序(如藉由使用寡核苷酸探針，其可專一的與編碼單株抗體之重鏈及輕鏈之基因結合)。該融合瘤細胞可做為該等DNA之較佳來源。一旦分離後，該DNA可被置入一個或多個表現載體中，接著將其轉染至宿主細胞，像是大腸桿菌細胞、猿的COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、或骨髓瘤細胞，其不會產生免疫球蛋白，以從該等重組宿主細胞中取得合成之單株抗體。請參閱，如PCT專利公開號WO 87/04462。該DNA可接著被修飾，例如，藉由取代方式，將編碼人類重鏈及輕鏈恆定區之序列，置換成同源的鼠序列，Morrison et al.,(1984)Proc.Nat.Acad.Sci.81：6851，或藉由共價結合方式，將編碼免疫球蛋白之序列，全部或部分之編碼序列與一非免疫球蛋白多胜肽之序列連結。於此種方式中，基因工程改造之抗體，像是「嵌合的」或「融合的」抗體，可被製備，且可與標的抗原具專一性結合。

涉及製備「嵌合型抗體」之技術，皆為該領域所習知者。請參閱如Morrison et al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81,6851；Neuberger et al.(1984)Nature 312,604；及Takeda et al.(1984)Nature 314：452。

用於構築人化抗體之方法，亦為該領域所熟知者。請參閱，如Queen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86：10029-10033(1989)。於一實例中，親代非人類抗體之V_H及V_L可變區係以該領域所熟知方法進行三維分子模型分析。接著，框架胺基酸殘基被預測對於形成正確CDR結構是重要的，使用相同分子模型分析以辨識出該等框架胺基酸殘基。同時，人類V_H及V_L鏈具有之胺基酸序列，與該等親代非人類抗體係屬同源；該人類胺基酸序列係以親代V_H及V_L序列作為搜尋字，從各種抗體基因資料庫中所找出。接著挑選人類V_H及V_L接受器基因。

位於所挑選之人類接受器基因中之CDR區，可將之以親代非人類抗體之CDR區或其功能性變異體置換。當必需時，位於親代鏈之框架區中之殘基被預測為重要的，係用於與該CDR區交互作用(請參閱前述)，可被用於取代於人類接受器基因中之對應的殘基。

一單鏈抗體可藉由重組技術製備，藉由將編碼重鏈可變區之核苷酸序列，與一編碼輕鏈可變區之核苷酸序列連結。較佳地，一具彎折性之連接子可被加入該兩個可變區域間。或是，於(美國專利號4,946,778及4,704,692)所述之產生單股抗體之技術亦可被用於產生一噬菌體或酵母菌 scFv庫及scFv聚落，其對於切割的CFH具專一性，且可藉由常規方式從該資料庫中找出來。陽性聚落可接著進一步篩選以找出該等與切割CFH結合者。

從該領域所習知方法、及本文所述之方法以製得之抗體，可藉由該領域所習知方法以確認其特性。例如，一種方法係用於辨識與抗原結合之抗原決定基，或「抗原決定基圖譜」。於該領域中有著許多不同已知方法可用於定位及分析蛋白上抗原決定基之位置，包含將抗體抗原複合體結晶結構之解析、競爭式分析、基因片段表現分析、及合成胜肽分析，例如，如Harlow and Lane,Using Antibodies,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1999第11章所述者。於另一樣本中，抗原決定基圖譜可被用於決定抗體結合之序列。該抗原決定基可為一線性抗原決定基，例如，包含於一單股延伸之胺基酸中、或藉由三維的胺基酸交互作用以形成之構型抗原決定基，其可能不需包含於單股延伸支中(線性序列之主要結構)。可分離或合成(如重組地)不同長度之胜肽(如至少4-6個胺基酸長度)，及可用一抗體以進行結合分析。於另一實例中，該可被抗體結合之抗原決定基，可藉由使用重疊之胜肽(衍生自標的抗原序列)，於一系統性篩選中以判定，以決定抗體結合位置。根據基因片段表現分析，該開放式閱讀框架編碼標的抗原係經隨機片段化，或藉由特定基因構築以片段化，且所表現之抗原片段的反應性可使用抗體以測試判定之。該基因片段可能，例如，藉由PCR以製備之，接著於放射性胺基酸環境中，進行體外轉錄及轉譯成蛋白。抗體與已被放射性標記之抗原片段之結合與否，可藉由免疫沉澱法及膠體電泳判定。部分抗原決定基亦可使用展現於噬菌體顆粒表面之隨機胜肽序列之大型資料庫(噬菌體庫)中以辨識。此外，一個已分析之重疊胜肽片段資料庫，可於一簡單的結合試驗中，用於測試該測試抗體之結合情形。於另一實例中，抗原結合域之突變，可施行功能區切換試驗及丙胺酸篩選突變法以辨識所需、足夠、即/或必須之殘基，以供抗原決定基結合。例如，功能區切換試驗可使用標的抗原之一個突變以施行，其中一切割的CFH多胜肽之各種片段，係以一相近、但非抗原性不同之蛋白序列(如神經營養蛋白家族之另一成員)以取代(置換)之。藉由分析與該突變CFH結合之抗體，則可評估與特定抗原片段結合之抗體的重要性。與所欲之抗原決定基結合之抗體可藉由抗原決定基定位圖譜以辨識。

III.新穎乳癌標記於診斷及預後之應用

如本文所述，經蛋白分解後之切割型態之CFH，意外地被發現，與乳癌之出現及發展有關係。因此，本文所述之用於診斷不同疾病時期之乳癌病患的方法、監控乳癌進展、及評估乳癌治療效率之方法，可使用切割型態之CFH作為一可信賴之生物標記。如上所述，本文所述之診斷方法可被用作一種初步的篩檢方法，供任何女性個體以檢測其是否具有非常早期之乳癌。藉由該方法所分析之個體，可為任何女性哺乳動物個體，像是人類個體。於部分實例，該個體可具有一種或多種與乳癌相關之症狀。於其他實例中，該個體可能具有患有發展成乳癌之風險，如帶有乳癌危險基因(像是於BRCA1及/或BRCA2基因之突變)、或具有乳癌、前列腺瘤、黑色素瘤、及胰臟癌之家族病史者。於另一實例中，該個體為無症狀的。於再一實例中，本文所述之診斷方法可被用作一常規篩檢方法，以供健康女性個體，如超過20、35、40、45、50或55歲之女性檢測，以監控潛在之乳癌風險或發展。

為了進行本文所述之方法，將取自一有需要之個體之生物樣本(如一人類病患其不具有任何乳癌之症狀、或一人類病患具有、疑似有、或患有乳癌之風險)偵測、或測量該樣本中切割型態之CFH，或其之量，係透過任何該領域所習知方法，像是該等本文所述者，如質譜分析及免疫分析。生物樣本可為生物性液體樣本，像是血液樣本或血漿樣本。切割的CFH可為量化的或質化的方式偵測。任何該領域之有效方法，以測量標記之存在與否、量、或活性，皆包含於本發明中。對於該領域具有通常技藝者具有能力可判定何種方法最適用於測量特定標記。

於一具體實施例中，從須進行測試之個體中取得之樣本，測試切割的CFH存在與否。若切割的CFH可於源自須測試之個體之樣本中測得，則代表該個體被診斷為具有或患有乳癌之風險。

於部分具體實施例中，源自候選個體之樣本中切割的CFH之量，可藉由與一標準值比較，以判斷是否該候選個體具有或患有乳癌之風險。該標準值代表對照組樣本中切割的CFH量。該對照樣本可取自一個體(如一女性個體)，其不具有乳癌。此外，該對照組樣本可取自該等個體之混合物。可擇地，該等對照組個體與候選個體於，如年齡、性別、及/或種族背景相符。較佳地，該對照組樣本及該候選個體之生物樣本為同一種類之樣本。於部分具體實施例中，若該切割的CFH被測得、或切割的CFH之量較標準值高(如高於標準值約10%或更多)，則該候選個體可能被診斷為具有、疑似有、或患有乳癌之風險。於部分實例中，使用常規方法，如該等本文所述者，於對照組樣本之切割的CFH的量係於對照組樣本中無法測得的(標準值係為0)。於此例子中，使用相同方法偵測源自一個體之生物樣本中，具有切割的CFH，係指該個體具有、疑似有、或患有乳癌之風險。

於部分具體實施例中，源自候選個體(如乳癌病患)之多個樣本中，其切割的CFH量可藉由測量，以判定疾病之進展。例如，至少兩個生物樣本(如血清樣本或血漿樣本)可自候選個體中，於不同時間點取得。切割的CFH之量，於該至少兩個生物樣本中，可藉由本文所述進行測量。若觀察到該切割CFH量之趨勢，隨著時間(如於較晚獲得之樣本中之切割的CFH量，相較於較早獲得之樣本為高時)呈現增加的，該個體係被診斷具有、疑似有或有罹患乳癌之風險。若該個體為乳癌病患，則切割CFH量呈現增加的趨勢時，則代表乳癌進展中。

當一個體如人類病患，被診斷為具有、疑似有或患有乳癌風險後，該個體可進行進一步之檢驗(如常規物理檢測，包含影像法，如X光乳房攝像、核磁共振成像(MRI)、或超音波、乳頭分泌物檢驗、或以針頭或手術進行活組織檢驗)以確認疾病之發生及/或判定乳癌之時期及種類。

於部分具體實施例中，本文所述之方法可進一步包含治療該乳癌病患達到至少舒緩與該疾病有關之症狀。該治療可為任何傳統抗乳癌療法，包含放射療法、化學療法及外科手術。示例性抗乳癌化學療法藥劑包含但不限於，阿伯利斯(Abraxane)、安美達錠(Anastrozole)、安美達錠(Arimidex)、諾曼癌素(Aromasin)、癌思停(Avastin)、多西他賽(Docefrez)、剋癌易(Docelaxel)、艾倫斯(Ellence)、泛艾黴素(Epirubicin)、艾瑞布林(Eribulin)、依西美坦(Exemestane)、法樂通(Fareston)、氟維司群(Faslodex)、復乳納錠(Femara)、氟維司群(Fulvestrant)、吉西他濱(Gemcitabine)、健澤(Gemzar)、賀樂維(Halaven)、賀癌平(Herceptin)、易莎平(Lxabepiline)、伊沙匹隆(Lxempra)、泰嘉錠(Lapatinib)、復乳納膜衣錠(Letrozole)、甲地孕酮(Megestrol)、紫杉醇(Paclitaxel)、泰莫西芬(Tamoxifen)、剋癌易(Taxotere)、托瑞米芬(Toremifene)、賀癌平(Trastuzumab)、及嘉泰錠(Tykerb)。

於另一具體實施例中，於此提供之方法，用於評估於乳癌病患中所施予之乳癌治療之效力。例如，可從進行乳癌治療之乳癌病患，於治療期間，收集多個生物樣本。若經治療期間，該切割CFH量呈現減少的趨勢，即切割的CFH於較晚獲得之生物樣本中之量，相較於較早獲得之生物樣本之切割的CFH量低的話，則代表該治療對於乳癌病患是有效的。相反的，若該切割的CFH量，經治療期間，仍被維持或增加，則代表該治療對於該病患無效。

若一乳癌療法被認為對於一乳癌病患無效時，則可調整治療策略，如增加藥劑量、治療頻率、或改變更適合之療法。

IV套組

本發明亦提供施行該方法之套組，其包含本文所述之抗體。該套組可進一步包含供使用該套組之說明，偵測帶有Arg-341移除之CFH蛋白或其形成之胜肽片段之存在或量，藉此偵測乳癌，及亦可用於監控乳癌進展、或評估於乳癌病患所施用之治療效果。

再者，本發明提供一種用於治療患有乳癌個體之方法，包含施予該個體一本文所述之抗體量，並搭配一抗癌藥物。

此外，本發明亦提供一種方法，供所需診斷個體，於體內施行診斷，包含施予該個體一本文所述之抗體量，並搭配一抗癌藥物。

V.抗切割型態之CFH抗體於治療及診斷乳癌之用途

本文所述之任何抗體，其可專一地與切割型態之CFH結合，用於治療乳癌或體內診斷乳癌。例如，該抗體可共軛於抗乳癌藥物(如本文所述者)，用於治療乳癌。此外，該抗體可共軛於可測得之標記(如該領域所習知之體內顯像劑)結合，用於診斷之目的。

為了施行本文所述之診斷或治療方法，可透過適用之路徑，如靜脈注射，如滴丸或連續式灌流一段時間，或藉由肌肉內的、腹腔內的、腦脊髓內的、皮下的、關節內的、滑膜內的、脊椎內的、經口的、吸入的、或局部的路徑，施予一需要治療之個體(如人類)有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含抗切割型態之CFH抗體，其共軛於抗乳癌藥物或可測得之標記。市售可得之供液態配方使用之噴霧器，包含噴射式噴霧器、及超音波噴霧器，皆可用於施予。液態配方可被直接霧化，及凍乾粉末可於回溶後進行霧化。

以本文所述之診斷方法或治療方法所治療之個體可為一女性哺乳動物，較佳地為一人類女性個體。哺乳動物包含，但不限於農場動物、運動動物、寵物、靈長類、馬、狗、貓、小鼠及大鼠。一個需要該治療之人類個體，可能為一患有乳癌之人類病患、疑似患有乳癌之人類病患、或患有乳癌風險之人類病患。該病患可藉由常規醫療方式或本文所述之診斷方法以辨識。

本文所用之「有效量」係指每一個活性物質之量，可於該個體上賦予療效，無論是單獨使用或與一種或多種其他活性物質合併使用。有效量可能會有所不同，須由該領域具有技藝者判斷，根據需施予時之特定情況、情況之嚴重性、個別病患參數，包含年齡、生理狀況、大小、性別及重量、治療時程、(如果有的話)併行療法的本質、特定施予路徑及其他醫療人員之知識及專業內判斷之可能因素。該等因素對於該領域具有通常技藝者而言為習知的，且可引入而無須進一步常規實驗。一般較佳地為，使用個別組成或其組合物之最大劑量，即為根據明智的醫學判斷之最高安全劑量。應可理解的是，該領域中具有通常技藝者，然而，一病患可能基於醫療理由、生理反應或其他可能的理由，堅持使用較低劑量或可忍受劑量。

根據經驗考量，像是半衰期，一般認為影響劑量之決定。例如，與人類免疫系統相容的抗體，像是人化的抗體、或完全的人類抗體，可以延長抗體之半衰期，及避免該抗體被宿主免疫系統所攻擊。施予的頻率可根據治療期間判定及調整，一般而言，如非必須，可根據治療及/或抑制，及/或改善乳癌以調整施予頻率。此外，持續性釋放之抗切割的CFH配方亦可適用之。用於維持釋放之各種不同配方及裝置，皆為該領域所習知的。

根據施予路徑，結合的抗體可與適用之醫藥可接受載劑混合，以形成適合的配方。

可注射型之組合物可能含有不同的載劑，像是植物油、二甲基乙醯胺、二甲基甲醯胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、乙醇、及多元醇(甘油、丙二醇、液態聚乙二醇及其類似物)。為了靜脈注射，可藉由點滴方式施予水溶的抗體，係藉由注入含有抗體及生理可接受賦形劑之醫藥配方。生理可接受之賦形劑可包含，例如5%葡萄糖、0.9%生理食鹽水、Ringer’s溶液或其他適用之賦形劑。肌肉內用之配方，如一滅菌配方，其抗體為適用可溶之鹽類，可藉由施予醫藥賦形劑(如供注射用水、0.9%生理食鹽水、或5%葡萄糖溶液)以溶解。

不須進一步詳述，吾人相信該領域具有通常技藝者，可基於以上說明，可應用本發明至其最完整之延伸範圍。因此，以下特定具體實施例僅用於闡述，而非意欲以任何方式來限制本發明之可用範圍。所有本文所引用之文獻，皆以引用之目的或參考文獻方式引用於本文中。

實施例1：於乳癌病患中之補體因子H之特定的蛋白分解片段

首先，透過修飾的二維膠體電泳系統(數據未顯示)，吾人發現來自部分乳癌病患之血漿中，具有補體因子H(因數H或CFH蛋白)之兩個片段。因子H含有20個sushi域，其亦稱為補體控制蛋白(CCP)模組或短同源重複序列(SCR)。透過LC-MS/MS分析其胰蛋白酶解產物，吾人發現該較小的片段，帶有之分子量約為40kDa，含有從CCP-1至CCP-5模組之胺基酸序列，而較大之140kDa片段，含有從CCP-6至CCP-20之序列(圖6)。該等數據顯示該兩個CFH多胜肽可能為蛋白分解過程之產物。

為了判定該等結果，以及進一步瞭解將該等蛋白片段之特性，吾人進行西方墨點法，以抗CFH蛋白之抗體分析血漿蛋白。

西方墨點分析

將收集自人類個體之血漿樣本中之蛋白與6X Laemmli樣本緩衝液混合，該緩衝液含有120mM Tris-HCl、pH 6.8、2% SDS(w/v)及10%蔗糖(w/v)。於部分樣本，另外加入1%之2-巰基乙醇。經過電泳分離，使用標準技術將蛋白轉移至Immobilon PVDF膜(Millipore Corp.)上。將點墨後之膜以阻斷緩衝液(含有1%山羊血清)進行阻斷，於室溫作用1小時，接著以鼠抗因數H(Abnova)抗體作用。經三次以Tris緩衝之生理食鹽水(含有0.1% Tween 20)清洗後，將膜以過氧化酶結合之山羊抗鼠IgG(Sigma-Aldrich)作用。化學冷光係使用LAS-4000(Fujifilm，日本)偵測。

結果

西方墨點分析顯示，源自健康個體及乳癌病患之血漿中之補體因子H，於非還原狀態下，移動像似一個約150kDa之多胜肽。此膠體移動與已知長度之該多胜肽相符。於該等樣本中，因子H之移動無明顯差異。然而，當該蛋白進行還原態之SDS-PAGE分析，於健康個體，其移動像似一個約190kDa之多胜肽。於相同電泳分析(還原狀態下)，於乳癌病患樣本中偵測到另一個因子H，約140kDa大小。吾人亦以二維差異凝膠電泳(2D-DIGE)分析，此偵測可同時分析40kDa CFH之出現與否(數據未呈現)。吾人使用相同方法以檢查經治療及化學治療之相同病患的血漿蛋白。有趣地，當癌消失後，該140kDa之蛋白也消失了。綜合該等數據指出，40及140kDa蛋白皆出現在該等癌症病患之血漿中，且很可能為該疾病之良好狀況的指標(圖2及圖7)。既然該兩種蛋白於對照組樣本中，於非還原分析下並無觀察到，因此該兩蛋白很有可能係透過雙硫鍵相連，也因此於非還原狀態下，膠體移動如同完整的多胜肽。簡言之，該等數據支援吾人之發現，補體因子H之特定蛋白分解片段可被作為一乳癌之診斷指標，且可做為監測疾病狀態之指標。

實施例2：乳癌病患中之補體因子H之特定蛋白分解片段結構分析

為了探討40及140kDa蛋白是否確實經由將補體因子H蛋白分解而來的，因此吾人應用液相色譜法-質譜聯用(LC-MS/MS)以檢查該兩種因數H片段之詳細結構。

為了標記出該兩片段之末端，吾人進一步製備了其胰島酶解之型態，分別為Arg-C及Lys-C酶解產物，並將之送入LC-MS/MS進行分析。

膠體內蛋白酶解

將含有本研究之多胜肽的膠體片以1ml 25mM NH₄HCO₃清洗10分鐘，接著以1ml 25mM NH₄HCO₃/50%乙腈脫水10分鐘。丟棄該清洗溶液，並將該膠體片於真空揮發離心機SpeedVac(Sovant)中乾燥20分鐘。將乾燥後之膠體片以1% β-巰基乙醇作用20分鐘，並將5%之4-乙烯基吡啶加入，於黑暗中再作用20分鐘。將膠體片以1ml 25mM NH₄HCO₃清洗10分鐘，接著以1ml 25mM NH₄HCO₃/50%乙腈處理10分鐘。將該膠體片置於SpeedVac中進行完全乾燥，接著每個樣本以含有50ng之胰蛋白酶之50μl 25mM NH₄HCO₃進行作用。經整夜培養後，將溶液轉移至一新的管子中，並以300μl 25mM NH₄HCO₃、接著以25mM NH₄HCO₃/50%乙腈之順序進行膠體萃取。將蛋白水解物及兩個萃取物皆混在一起，並進行完全乾燥。將樣本存於-20℃備用。

質譜分析

將蛋白水解物置於LTQ-Orbitrap複合式串聯質譜儀(ThermoFisher,USA)中進行分析，並與Agilent 1200奈米流HPLC系統搭配。該HPLC系統與LC包裝C18 PepMap100(長度：5mm；內(直)徑：300μm；珠子大小：5μm)一同設置，作為捕捉管柱，以及加熱毛細管，並搭配自家之5μm C18珠子(YMC ODS-AM)作為滴入式管柱。流動相由(A)溶於水中之0.1%甲酸及(B)溶於乙腈之0.1%甲酸所組成。收集以LTQ進行之10個MS/MS掃描，並接著以Orbitrap進行完整的MS掃描。使用自家程式已擷取該MS/MS資訊，及計算前驅離子之電荷及質量。使用TurboSequest程式，搜尋所有對應人類蛋白資料庫之MS/MS數據，含有約440,000個蛋白資料，係於2010年5月5日自國家生物資訊中心(NCBI)下載而得。使用自家程式(以Microsoft Excel 2013 VBA撰寫)以註解串聯質譜結果。

結果

從40kDa蛋白之胰島酶解物中，LC-MS/MS分析顯示幾乎所有源自胰島酶解之胜肽。僅有一個胜肽，即³³²HGGLYHENM³⁴⁰(SEQ ID NO：4)，具有不尋常之C端(圖3)。LC-MS/MS分析其Arg-C酶解物顯示另一帶有獨特末端Met-340之胜肽，即³²⁰CTLKPCDYPDIKHGGLYHENM³⁴⁰(SEQ ID NO：5)(圖4)。合計判斷，這些數據表示Met-340位於40kDa CFH蛋白之羧基末端(圖6)。另一方面，LC-MS/MS分析顯示一胰島水解胜肽帶有主要結構³⁴²RPYFPVAVGK³⁵¹(SEQ ID NO：6)，係位於140kDa多胜肽之N端。既然相同胜肽係於Lys-C分解物中被辨識出(圖5)，該等數據代表Arg-342是該140kDa CFH多胜肽之胺基端。值得注意的是，無論於40kDa或140kDa CFH蛋白之任何酶解物中，皆無Arg-341被觀察到。因此，吾人結論Arg-341係經蛋白分解移除，以導致於乳癌病患中產生兩種CFH片段(圖6)。

此想法係與以下事實相符，於Cys-325及Cys-374之硫醇基間係存在雙硫鍵，其分別位於40及140kDa蛋白中。該C325-C374連結係為分子力以將該兩個蛋白水解片段可於非還原狀態下保持連結在一起，當藉由還原劑作用後，其之斷裂可導致40及140kDa片段同時出現(圖2)。

實施例3：補體因子H之特定蛋白分解片段可作為乳癌生物標記

吾人認為40kDa及140kDa蛋白係透過將Arg-341蛋白分解移除以產生，該兩個新的多胜肽端應自補體因子H內所生成。經生化分析該兩個胜肽端可有助於從其他健康狀態中分辨出乳癌，該兩個胜肽端之結構為候選的新穎乳癌生物標記。小型蛋白分解片段之C端(即C端之Met殘基)係被稱為乳癌蛋白分解標記1(BCPM1)，以及大型片段之N端(即N端之Arg殘基)係被稱為乳癌蛋白分解標記2(BCPM2)。

為了加速BCPM1及BCPM2真的可作為乳癌生物標記之確認，吾人首先合成對應於該兩個胜肽端之胜肽，並用它們生成兔子抗血清。使用親和性純化方法，以分離出多株抗體，以標靶個別之胜肽端(即於40kDa片段之C端Met殘基及於140kDa片段之N端Arg殘基)。

製備兔子之多株抗體

使用合成胜肽HGGLYHENM，其羧酸基為Met末端，以誘發兔子產生抗BCPM1之抗體。使用合成胜肽RPYFPVAVGK，其胺基為N端Arg，以免疫兔子以產生BCPM2抗體。將抗體接著進行親和性純化，並使用墨點法及西方墨點法測試其之專一性。取得該兩種專一的抗體，即BCPM1抗體可專一地標靶40kDa片段之C端Met殘基，及BCPM2抗體可專一地標靶140kDa片段之N端Arg殘基，並用於之後的西方墨點分析。

西方墨點分析

以BCPM1及BCPM2抗體作為一級抗體，以從健康個體及乳癌病患樣本中，將血漿蛋白進行染色，並以SDS-PAGE分解進行試驗。

結果及討論

如前述，生成專一之多株抗體抗BCPM1以辨識40kDa蛋白分解片段之C端，且另一專一多株抗體抗BCPM2係用於辨識140kDa蛋白之N端。使用西方墨點分析，吾人發現於乳癌病患血漿中，抗BCPM1可辨識一種蛋白，其分子量約為40kDa。根據其分子量，吾人認為該抗體可與BCPM1結構進行反應。既然於該等樣本中無其他訊號可觀察到，因此可認為抗BCPM1對於其目標抗原決定基(如40kDa蛋白分解片段之C端)具有高度的專一辨識性。相同的，吾人使用抗BCPM2及西方墨點法以分析同組血漿樣本，僅可觀察到一約140kDa之條帶。該訊號之分子量使我們相信，吾人成功生成抗BCPM2之抗體。該抗BCPM2抗體之高專一性，藉由觀察得以證實，於膠片上之其他位置幾乎無法觀察到或無任何訊號可被觀察到。

實施例4：血漿樣本以BCPM1及BCPM2抗體進行西方墨點分析

吾人進一步使用專一的BCPM1及BCPM2抗體以分析，從健康個體或患有不同時期之乳癌或不同類型癌症之病患中之血漿樣本中，是否有專一的生物標記BCPM1及BCPM2存在。表1顯示其結果。

如表1所示，該專一的BCPM1或BCPM2抗體，分別可標靶40kDa片段之C端Met殘基，及140kDa片段之N端Arg殘基，可成功偵測不同時期之乳癌病患(從第0期至第IV期)，但不會於健康個體或帶有其他種類癌症之病患中偵測到。

吾人證實該專一的蛋白分解切割之補體因子H係在Arg-341，導致兩個分離的蛋白分解片段，即40kDa及140kDa片段，係僅在乳癌病患中會發生之事件，且可被作為篩檢乳癌之生物標記。因此，本發明為第一個提出一種乳癌篩檢方法，其可辨識患有乳癌、疑似患有乳癌、或可能患有乳癌風險之病患，可於早期(即於任何症狀發生前)、或經進一步之物理檢查、或經乳癌治療後，皆可適用之。

實施例5：乳癌生物標記偵測之ELISA實驗

5.1材料及方法-三明治ELISA方法

將捕捉型抗體(抗BCPM1或抗BCPM2)貼附在96孔盤之孔底，並以PBST(含有Tween 20之PBS)稍作清洗孔洞。將源自病患之血清及序列稀釋之抗原(合成胜肽)加入孔中，並與貼附之捕捉型抗體反應。將與HRP(辣根過氧化酶，horseradish peroxidase)連結之偵測型抗體加入孔中，並與抗原或源自病患之血清反應。HRP與TMB(3’,3’,5’5’-四甲基聯苯胺)反應 2O分鐘後加入停止反應溶液。以吸光值為450nm之波長，來偵測每一個孔洞中之樣本溶液(含有抗原或來自不同時期之乳癌病患的血清)。

5.2結果

以三明治ELISA套組，於吸光值450nm偵測血清(取自第I期至第IV期之乳癌病患)，顯示較源自不具有乳癌之健康個體，乳癌病患存在更高之吸光值。

5.3結論

本發明關於兩個新穎之生物標記，及對應之兩個新穎的抗體(抗BCPM1或抗BCPM2)，可用於乳癌診斷套組，可被應用於篩檢乳癌之發生。

序列資訊

補體因子H(智人)-全長(SEQ ID NO：1)

補體因子H(智人)-40kDa片段(SEQ ID NO：2)

補體因子H(智人)-140kDa片段(SEQ ID NO：3)

<110> 豐宥科技股份有限公司

<120> 乳癌生物標記

<130> OLC0001TW

<150> US61/885,103

<151> 2013-10-01

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1231

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

<210> 2

<211> 340

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

<210> 3

<211> 890

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

<210> 4

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

<210> 5

<211> 21

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

<210> 7

<211> 90

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Claims

一種診斷乳癌之方法，包含：(a)提供來自個體之生物樣本；及(b)分析該樣本中之切割型態之補體因子H(CFH)，並基於分析結果判斷乳癌之發生或風險，其中該切割型態之CFH係SEQ ID NO：2之胜肽及/或SEQ ID NO：3之胜肽，其中在該樣本測得該切割型態之CFH之存在、或該切割型態之CFH之量相較於來自健康個體的生物樣本的相應的切割型態之CFH之量更高的話，則可判斷該個體患有乳癌或有罹患乳癌之風險。
如請求項1之方法，其中在步驟(b)，該切割型態之CFH係以試劑偵測，該試劑可專一地結合至該切割型態之CFH。
如請求項2之方法，其中該可專一地結合至該切割型態之CFH之試劑為抗體。
如請求項3之方法，其中該抗體專一地結合至SEQ ID NO：4之抗原決定基。
如請求項3之方法，其中該抗體專一地結合至SEQ ID NO：6之抗原決定基。
如請求項3之方法，其中該抗體不會與完整型態的CFH結合。
如請求項1之方法，其中該生物樣本為體液樣本、組織樣本、或生物檢體樣本。
如請求項7之方法，其中該生物樣本為體液樣本，係選自由血液樣本、血漿樣本、肝素化血漿樣本、EDTA-血漿樣本、血清樣本、尿液樣本、唾液樣本、淚液樣本、腦脊髓液樣本、及腹水樣本所組成之群組。
如請求項1之方法，其中在步驟(b)，該分析係以質譜分析或免疫分析法進行。
一種監控乳癌病患之乳癌發展之方法，該方法包含：(a)於第一時間點，提供源自該病患之第一生物樣本，(b)於第二時間點，提供源自該病患之第二生物樣本，其中該第二時間點係晚於第一時間點，(c)分析第一及第二生物樣本中之切割型態之補體因子H(CFH)，以測量於第一及第二生物樣本中之切割型態之CFH之量，其中該切割型態之CFH係SEQ ID NO：2之胜肽及/或SEQ ID NO：3之胜肽；以及(d)基於第一及第二生物樣本中之切割型態之CFH之量，診斷該病患中之乳癌進程，其中相較於第一生物樣本，若第二生物樣本中之切割型態之CFH的量較為提高的話，則代表乳癌發展中。
如請求項10之方法，其中該第一及第二生物樣本可取自於該病患被施予抗乳癌療法的治療前後，或治療期間。
如請求項11之方法，進一步包含評估施用於該病患之該抗乳癌療法之效力，其中若經治療後、或於療程期間，該切割型態之CFH之量降低的話，則代表該療法對於該病患有效。
如請求項10之方法，其中在步驟(c)，該切割型態之CFH係以試劑偵測，該試劑可專一地結合至該切割型態之CFH。
如請求項13之方法，其中該可專一地結合至該切割型態之CFH之試劑為抗體。
如請求項14之方法，其中該抗體專一地結合至SEQ ID NO：4之抗原決定基。
如請求項14之方法，其中該抗體專一地結合至SEQ ID NO：6之抗原決定基。
如請求項14之方法，其中該抗體不會與完整型態的CFH結合。
如請求項10之方法，其中該生物樣本為體液樣本、組織樣本、或生物檢體樣本。
如請求項18之方法，其中該生物樣本為體液樣本，係選自由血液樣本、血漿樣本、肝素化血漿樣本、EDTA-血漿樣本、血清樣本、尿液樣本、唾液樣本、淚液樣本、腦脊髓液樣本、及腹水樣本所組成之群組。
如請求項10之方法，其中在步驟(c)，該分析係以質譜分析或免疫分析法進行。
一種切割型態之補體因子H(CFH)或其抗原決定基，其中該切割型態之CFH係SEQ ID NO：2之胜肽、或SEQ ID NO：3之胜肽，以及其中該切割型態之CFH之抗原決定基係SEQ ID NO：4之胜肽、或SEQ ID NO：6之胜肽。
一種多株抗體，其可專一地結合至如請求項21所述之切割型態之補體因子H(CFH)之抗原決定基。
如請求項22之抗體，其中該抗體不會與完整型態的CFH結合。
一種用於進行如請求項1至20中任一項所述之方法之套組，包含如請求項22或23所述之抗體，及進行該方法之說明。
一種可專一地結合至如請求項22或23所述之抗體在製造供乳癌診斷之偵測劑的用途，其中該抗體係連結至偵測標記。