TWI666013B

TWI666013B - 一種化合物用於去除乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)藥物肝毒性之用途

Info

Publication number: TWI666013B
Application number: TW105124702A
Authority: TW
Inventors: 胡幼圃; 石東原
Original assignee: 財團法人國際教育基金會
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2019-07-21
Also published as: TW201707694A

Abstract

一種化合物用於去除乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)藥物肝毒性之用途，該化合物係選自於下列群組：Tween 20、微晶纖維素、磷酸氫二鈣、聚氧乙烯23月桂基醚、糖精、甘露醇、聚氧乙烯烷基醚、三氯蔗糖、吡咯烷酮、羥基乙酸澱粉鈉、丙烯酸樹脂S100、羧甲基纖维素鈉、聚氧乙烯聚氧丙烯、薄荷醇、低取代烴丙纖維素、預膠化澱粉、Dextrates NF hydrated、檸檬酸、蓖麻油聚氧乙烯醚、膠態二氧化矽、聚乙二醇單硬脂酸酯、山梨酸、檸檬油、羥丙基纖維素、山梨糖醇、乙鮮舒泛鉀、羥丙甲纖維素酞酸酯、單水合乳糖、麥芽糖糊精、Brij 58、Brij 76、Tween 80、Tween 40、PEG 400、PEG 4000、PEG 2000等。

Description

一種化合物用於去除乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)藥物肝毒性之用途

本發明係關於一種一種化合物用於去除乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)藥物肝毒性之用途，特別是利用細胞色素P450 2E1(CYP2E1)酵素抑制劑以降低對乙醯胺基酚之肝毒性等副作用。

對乙醯胺基酚(Acetaminophen，俗稱普拿疼)，又稱為paracetamol或N-acetyl-para-aminophenol，簡稱APAP，是市面上使用最普遍的解熱鎮痛劑，每年經常有許多因APAP使用不當而中毒或用於自殺的案例發生。APAP引起的肝臟損傷是造成重症及死亡的最主要因素。已有許多的臨床經驗證明APAP的肝毒性是可以預防的，早期的診斷和即時的給予解毒劑N-acetylcysteine簡稱NAC可有效預防肝毒性的發生。

對乙醯胺基酚服藥過量的早期發現是有必要的，因為在中毒後的8小時內給予解毒劑可達到最佳的預後效果。藥物中毒的早期徵兆包括身體不適、噁心和嘔吐，但有些病人對乙醯胺基酚的血中濃度己達中毒濃度且肝功能也有明顯異常，初期仍無症狀（第一期），肝毒性的徵兆如腹痛、持續嘔吐、黃膽、右上腹疼痛等，是在大量攝取後的24~48小時才會變得比較明顯(第二期)。血清的轉胺酶通常是在服用後的16小時開始上升，伴隨著臨床症狀開始出現。第三期大約是在服用後的3-4天才開始出現，此時肝損傷的程度和預後情形就可以被預估出來。肝毒性的症狀可以從輕微的症狀伴隨著肝功能值上升(AST＞1,000IU/L)到嚴重的猛暴性肝炎併發代謝性酸中毒、黃疸、低血糖、AST＞10,000IU/L、凝血異常及肝腦病變等。第四期會引發寡尿性腎衰竭，嚴重者會導致死亡。

有些對乙醯胺基酚中毒的病人其肝臟的傷害很輕，卻有嚴重的腎毒性產生，主要是因APAP直接在腎小管上的細胞色素P-450s (cytochrome P450s，簡稱CYPs)代謝造成腎毒性。但急性腎衰竭也有可能是因急性肝衰竭產生的肝腎症候群，此時可以利用鈉的排泄分率(fraction excretion of Na，簡寫FeNa)來分辨是原發性腎損傷 (FeNa＞1) 或是肝腎症候群 (FeNa ＜1)。FeNa的計算公式：(Sodiumurinary ÷ Creatinineurinary) ÷ (Sodiumplasma ÷ Creatinineplasma) × 100。

對乙醯胺基酚口服後1~2小時可達尖峰血中濃度，大部份是從肝臟代謝，90%以上是與glucuronide和sulfate結合形成無毒性的代謝產物。只有小於5%是經由不同的CYPs代謝，包括：CYP2E1、CYP1A2及CYP3A4，其中CYP2E1與CYP1A2是主要代謝酵素。經由這些酵素代謝所產生的代謝產物N-acetyl-p-benzoquinoneimine，簡稱 NAPQI(如圖一)是活性很強的親電物質(electrophile)。在正常情況下，NAPQI會立即和細胞內的glutathione反應形成無毒的硫醇化合物 (mercaptide)。當對乙醯胺基酚使用過量時，使得細胞內glutathione的消耗速率大於合成速率，細胞內glutathione含量低於正常的30%時，NAPQI便會和細胞內含有cysteine的大分子或核苷酸結合，導致肝細胞損傷。從細胞組織染色可以證明在肝細胞壞死前，NAPQI會和cysteine的硫醇基在肝小葉中心區域形成共價鍵結。

對於有肝臟疾病、酗酒、或是有服用會誘導肝臟細胞色素 P450酵素活性，如: Carbamazepine、Ethanol、Isoniazid、Phenobarbital (possibly other barbiturates)、Phenytoin、Sulfinpyrazone、Sulfonylureas、Rifampin、Primidone等藥物的病人均屬於會引起APAP嚴重肝毒性之高危險群。此時病人若有成人呼吸窘迫症候群、腦水腫、無法控制的出血、感染或多器管衰竭等併發症產生時，就很容易造成死亡。以酒精為例，酒精主要是由肝臟的CYP2E1代謝，其誘發APAP中毒的機轉可分為三個階段，第一階段是酒精和APAP競爭肝臟CYP2E1的接受器，此時NAPQI的濃度會先降低，第二階段是酒精會使得CYP2E1的半衰期從7小時延長到37小時，使得肝臟CYP2E1的含量增加，此時NAPQI的濃度會慢慢回升；第三階段是當酒精戒斷時，肝臟有較多的CYP2E1來代謝對乙醯胺基酚，使得對乙醯胺基酚的毒性代謝產物明顯增加，造成肝細胞損傷。近年來研究證實，利用diallyl sulfide 可有效預防對乙醯胺基酚在小鼠體內所引起之肝毒性傷害，並進一步發現diallyl sulfide具抑制CYP2E1酵素活性作用，推論diallyl sulfide預防對乙醯胺基酚引起之肝毒性的傷害，其保護機制應是透過抑制對乙醯胺基酚產生活性中間產物NAPQI。

利用侵入式及非侵入式方法測試大鼠肝功能，以監測肝損害的發展以及篩選肝臟疾病，其中最常使用的方法包含測量血清中之天門冬氨酸轉胺酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸轉胺酶(alanine aminotransferase, ALT)以及鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase)數值，以及測量肝細胞產物如：膽紅素(bilirubin)、白蛋白(albumin)，以及利用量測前凝血素時間(prothrombin time)來檢測凝血因子(coagulation factors)等；肝功能定量測試是根據幾乎只經過肝臟代謝之受質在血清中的濃度而定，這些受質的清除是依肝門靜脈、肝動脈血流量以及由肝細胞對這些受質的作用而定，肝臟血流量與提供給肝臟的受質量有關，反之，該受質的清除則決定於肝臟代謝的能力。

半乳糖(galactose)是一種具有高萃取率(extraction ratio)、90%在肝臟中代謝的醣類，在肝臟中，半乳糖是由半乳糖激酶(galactokinase)經過差向立體異構化反應(epimerization)，將之轉換成1-磷酸葡萄糖(Glucose-1-phosphate)；半乳糖激酶的作用反應為肝細胞中半乳糖代謝途徑的速率決定步驟(rate-limiting step)。半乳糖的高萃取率使得依賴肝臟血流量及肝臟功能的半乳糖代謝作用成為檢測肝功能最主要的方式，目前並無一定的規則來評估大鼠之殘餘肝功能(residual liver function)，量測一確切化合物(如：半乳糖)之代謝能力，可推測肝臟中一代謝作用之速率決定步驟，亦可能取得殘餘肝功能之代表數質。

本案發明人以半乳糖單點法測試慢性肝炎、肝硬化以及肝癌病患，結果顯示半乳糖單點法可精確測出這些肝臟疾病；半乳糖單點法已被成功的應用到測試肝病患者排除如丙嗪(promazine)及抗生素頭孢酮(cefoperazone)等藥物之剩餘肝功能。此外，半乳糖單點法已在美國食品藥物管理局(FDA)所出版的指南(Guidance for Industry)中成為建議採用測試肝功能的方法之一。

由此可見，上述習用對乙醯胺基酚仍有諸多缺失，實非一良善之設計者，而亟待加以改良。

本案發明人鑑於上述習用對乙醯胺基酚所導致肝毒性等副作用的缺點，乃亟思加以改良創新，並經多年研究後，終於成功研發完成本件一種化合物用於去除乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)藥物肝毒性之用途。

本發明之目的即在於提供一種化合物用以去除對乙醯胺基酚(Acetaminophen, APAP)藥物肝毒性之用途，。

為達成前述發明目的，其中該化合物係選自下列群組中之至少一種或其任意組合：聚氧乙烯(20)山梨糖單月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate；Tween 20)、微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)、磷酸氫二鈣(Dicalcium phosphate dihydrate)、聚氧乙烯23月桂基醚(Brij 35)、糖精(Saccharin)、甘露醇(Mannitol)、聚氧乙烯烷基醚(Cremophor RH40)、三氯蔗糖(Sucralose)、吡咯烷酮(Crospovidone)、羥基乙酸澱粉鈉(Sodium starch glycolate)、丙烯酸樹脂S100(Eudragit S100)、羧甲基纖维素鈉(Croscarmellose sodium)、聚氧乙烯聚氧丙烯(Pluronic F68)、薄荷醇(Menthol)、低取代烴丙纖維素(Low-substituted hydroxypropyl cellulos)、預膠化澱粉(Pregelatinized starch)、Dextrates NF hydrated、檸檬酸(Citric acid)、蓖麻油聚氧乙烯醚(Cremophor EL)、膠態二氧化矽(Aerosil 200)、聚乙二醇單硬脂酸酯(Myrj 52)、山梨酸(Sorbic acid)、檸檬油(Lemon oil)、羥丙基纖維素(Hydroxypropyl cellulose)、山梨糖醇(Sorbitol)、乙鮮舒泛鉀(Acesulfame potassium)、羥丙甲纖維素酞酸酯(Hydroxypropyl methylcellulose)、單水合乳糖(Lactose monohydrate)、麥芽糖糊精(Maltodextrin)、Brij 58、Brij 76、Tween 80、Tween 40、PEG 400、PEG 4000、PEG 8000、Span 60、苯甲酸鈉(Sodium benzoate)、羥乙甲纖維素酞酸酯(Hydroxy ethylmethylcellulose)、甲纖維素酞酸酯(Methylcellulose)、Span 80、甜蜜素(Sodium cyclamate)、甘油山崳酸酯(Glyceryl behenate)、氧化鐵紅(Oxide red)、甘油單硬脂酸酯(Glycerin monostearate)、Copovidone K28、澱粉醋酸酯(Starch acetate)、硬脂酸鎂(Magnesium stearate)、月桂基硫酸鈉(Sodium lauryl sulfate)、Providone K30、及PEG 2000；以上化合物均為酵素P450抑制劑。

為達成前述發明目的，其中該化合物組成係選自下列群組中之至少一種或其任意組合，並限定其組合物之有效使用劑量：聚氧乙烯(20)山梨糖單月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate；Tween 20)其中含量為0.001~55克、微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)其中含量為0.001~55克、磷酸氫二鈣(Dicalcium phosphate dihydrate)其中含量為0.001~55克、聚氧乙烯23月桂基醚(Brij 35)其中含量為0.001~55克、糖精(Saccharin)其中含量為0.001~55克、甘露醇(Mannitol)其中含量為0.001~55克、聚氧乙烯烷基醚(Cremophor RH40)其中含量為0.001~55克、三氯蔗糖(Sucralose)其中含量為0.001~55克、吡咯烷酮(Crospovidone)其中含量為0.001~55克、羥基乙酸澱粉鈉(Sodium starch glycolate)其中含量為0.001~55克、丙烯酸樹脂S100 (Eudragit S100)其中含量為0.001~55克、羧甲基纖维素鈉 (Croscarmellose sodium)其中含量為0.001~55克、聚氧乙烯聚氧丙烯 (Pluronic F68) 其中含量為0.001~55克、薄荷醇(Menthol)其中含量為0.001~55克、低取代烴丙纖維素(Low-substituted hydroxypropyl cellulos)其中含量為0.001~55克、預膠化澱粉(Pregelatinized starch)其中含量為0.001~55克、Dextrates NF hydrated其中含量為0.001~55克、檸檬酸(Citric acid)其中含量為0.001~55克、蓖麻油聚氧乙烯醚(Cremophor EL)其中含量為0.001~55克、膠態二氧化矽(Aerosil 200)其中含量為0.001~55克、聚乙二醇單硬脂酸酯(Myrj 52)其中含量為0.001~55克、山梨酸(Sorbic acid)其中含量為0.001~55克、檸檬油(Lemon oil)其中含量為0.001~55克、羥丙基纖維素(Hydroxypropyl cellulose)其中含量為0.001~55克、山梨糖醇(Sorbitol)其中含量為0.001~55克、乙鮮舒泛鉀(Acesulfame potassium)其中含量為0.001~55克、羥丙甲纖維素酞酸酯(Hydroxypropyl methylcellulose)其中含量為0.001~55克、單水合乳糖(Lactose monohydrate)其中含量為0.001~55克、麥芽糖糊精(Maltodextrin)其中含量為0.001~55克、Brij 58其中含量為0.001~55克、Brij 76其中含量為0.001~55克、Tween 80其中含量為0.001~55克、Tween 40其中含量為0.001~55克、PEG 400其中含量為0.001~55克、PEG 4000其中含量為0.001~55克、PEG 8000其中含量為0.001~55克、Span 60其中含量為0.001~55克、苯甲酸鈉(Sodium benzoate)其中含量為0.001~55毫克、羥乙甲纖維素酞酸酯(Hydroxy ethylmethylcellulose)其中含量為0.001~55克、甲纖維素酞酸酯(Methylcellulose)其中含量為0.001~55克、Span 80其中含量為0.001~55克、甜蜜素(Sodium cyclamate)其中含量為0.001~55克、甘油山崳酸酯(Glyceryl behenate)其中含量為0.001~55克、氧化鐵紅(Oxide red)其中含量為0.001~55克、甘油單硬脂酸酯(Glycerin monostearate)其中含量為0.001~55克、Copovidone K28其中含量為0.001~55克、澱粉醋酸酯(Starch acetate)其中含量為0.001~55克、硬脂酸鎂(Magnesium stearate)其中含量為0.001~55克、月桂基硫酸鈉(Sodium lauryl sulfate)其中含量為0.001~55克、Providone K30其中含量為0.001~55克、及PEG 2000其中含量為0.001~55克。

為達成前述發明目的，其中該化合物係選自甘露醇(Mannitol)併用三氯蔗糖(Sucalose)組合為最佳。

為達成前述發明目的，其中該化合物與對乙醯胺基酚係經分開、同時或依序地使用。

為達成前述發明目的，其中該化合物係以膠、噴劑、軟錠劑、錠劑、可分散性片劑、膠囊、軟膠囊、丸劑、懸浮液、微球、口腔植入片、乳化針劑或植入劑及藥學上可行之形式投予。

為達成前述發明目的，其中該化合物被包含於醫藥包、套組或病患包。

本案發明人鑑於上述習用對乙醯胺基酚所導致肝毒性等副作用的缺點，乃亟思加以改良創新，並經多年苦心孤詣潛心研究後，終於成功研發完成本件一種化合物用於去除乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)藥物肝毒性之用途。

為達成上述發明目的之無肝副作用之對乙醯胺基酚新複方，本發明首先以對乙醯胺基酚新複方誘導大鼠產生肝毒性為模式，研究合併使用一或其任意組合之CYP2E1抑制劑對大鼠體內對乙醯胺基酚引發之肝毒性的影響；除使用一般肝毒性標記、病理組織切片外，以半乳糖單點法(GSP)進行大鼠的殘餘肝功能之定量量測，進一步評估。

本說明書中所述之所有技術性及科學術語，除非另外有所定義，皆為該所屬領域具有通常技藝者可共同瞭解的意義。

於用於本文中之時，術語“組合物(combination)”，於應用於量兩種或更多種化合物及/或藥劑(於本文中也稱為成分)之時，意欲定義其中有該兩種或更多種化合物/藥劑結合之材料。術語“組合” (“combined”和“combining”)於本文中皆據此詮釋。

醫藥套組(pharmaceutical kits)、醫藥包(pharmaceutical packs)或病患包(patient packs)，其中有兩種或更多種化合物/藥劑經共-包裝或共-呈現(如作為單位劑批的部份者)。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。本發明所用之藥物、生物材料皆市售易於取得，下列僅為示例可取得之管道。

本發明係以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下述實施例所限制。

實施例一

對乙醯胺基酚合併使用一種或其任意組合安全、藥學上可接受之常用賦型劑於改善藥物肝毒性動物試驗。

材料與方法

1. 試驗材料

所有的有機溶劑均為HPLC等級，購自Tedia有限公司(Fairfield, OH, USA)，APAP購自Sigma化學公司(St. Louis, MO USA)，半乳糖注射溶液由南光化學製藥股份有限公司製備，係將400克半乳糖(Sigma)溶於1公升含有適當緩衝溶液系統以及等張鹽類之蒸餾水中，供作注射使用。

2. 試驗動物

體重為175-280公克之雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠購自國家實驗動物中心(台灣)，動物實驗係遵照國衛院動物實驗指南進行，所有的大鼠均置於空氣/濕度調節環境下，光照與黑暗各12小時，水及飼料的供給不限，在試驗期間大鼠體重均持續監測，水分照常供給。

3. 試驗處理

挑選於體外篩選CYP2E1有效抑制劑，進行APAP不併服或併服抑制劑於改善APAP引起肝毒性之動物試驗。肝毒性試驗動物是以大鼠每公斤體重管餵給予APAP單一劑量1000毫克以產生肝毒性。肝保護實驗動物是以大鼠每公斤體重管餵給予磷酸氫二鈣1.67毫克；或每公斤體重管餵給予甘露醇1.67毫克；或每公斤體重管餵給予薄荷醇1.67毫克；或每公斤體重管餵給予HUEXC041 1.67毫克；或每公斤體重管餵給予甘露醇1.67毫克與三氯蔗糖1.67毫克；或每公斤體重管餵給予甘露醇0.83毫克與三氯蔗糖0.83毫克；或每公斤體重管餵給予甘露醇0.42毫克與三氯蔗糖0.42毫克；或每公斤體重管餵給予甘露醇0.17毫克與三氯蔗糖0.17毫克，併每公斤體重管餵給予APAP單一劑量1000毫克。以測量血漿中的天門冬氨酸轉胺酶(AST)與丙氨酸轉胺酶(ALT)來代表肝發炎指標；於給藥前與給藥後16小時進行測定半乳糖單點法(GSP)，分析定量大鼠剩餘肝功能；同時分析每一組試驗大鼠之肝臟組織病理變化，評估其肝損傷或肝保護的機制。

4. 血液樣本

處理完畢後，大鼠以乙醚麻醉犧牲，血液由大鼠尾動脈抽取，置於含有EDTA之試管中，血漿(plasma)以13,000g於4˚C離心15分鐘，分離後的血漿分裝到微量小管(Eppendorf tube)中並置於-80˚C中儲存。

5. 生化分析

肝細胞損傷以量測血漿中天門冬氨酸轉胺酶(AST)與丙氨酸轉胺酶(ALT)活性以進行定量，AST與ALT活性是肝臟毒性常用的指標，係以Synchron LXi 725系統來量測(Beckman Instruments, 美國)。

6. 光學顯微鏡

大鼠犧牲後肝臟隨即進行組織學分析；肝臟樣本以10%磷酸緩衝液配製之福馬林(phosphate-buffered formalin)固定，隨後脫水並包埋於石蠟(paraffin)中，以5 µm厚度切片，切片樣本以蘇木精(hematoxylin)與伊紅(eosin)染色，並進行肝糖染色試驗(Periodic acid Schiff stain, PAS)，染色後以光學顯微鏡進行組織學觀察。

7. 肝功能之定量測試

試驗結束後，所有大鼠均進行半乳糖單點法(GSP)測試，大鼠接受在30秒內的快速靜脈注射，注射0.4 g/ml BW半乳糖溶液0.5 g/kg；自注射後5、10、15、30、45以及60分鐘各採血一次，血液樣本取自尾部靜脈；以半乳糖脫氫酶比色法(colorimetric galactose dehydrogenase)量測半乳糖含量，測試濃度範圍為50至1,000 µg/ml，每個濃度的日內差異(within-day variation)係由標準偏差(standard deviation)以及變異係數(coefficient of variation, CV)百分比計算，最大容許的變異係數為10% CV；日間差異(day-to-day variation)則由比較標準檢量線(calibration curves)之斜率及截距來檢驗；半乳糖單點法(GSP)為30秒注射停止後60分鐘時血液中半乳糖濃度。

8. 統計分析

所有的數據皆以平均±標準偏差(SD)表示，試驗結果以單因子變異數分析(ANOVA)測試法來計算是否具有統計上的顯著差異，使用Statistical Package of the Social Science program (Version 13, SPSS Inc.)套裝軟體來計算；隨後使用事後比較(post hoc test)最小差異顯著性(least significant difference)方法做多重比較，以確認族群間的顯著差異；族群平均之顯著差異為p ＜ 0.05。

結果

1. 生化分析結果

試驗結束時，測量試驗動物的體重及相對肝重量，與正常對照組動物相較之下並無顯著差異；血液生化分析結果如表一所示，除APAP肝毒性組血漿中的天門冬氨酸轉胺酶(AST)與丙氨酸轉胺酶(ALT)活性明顯高於正常對照組(正常對照組血漿中的AST活性為202±34 IU/L；APAP肝毒性組血漿中的AST活性為499±112 IU/L,p ＜ 0.005；正常對照組血漿中的ALT活性為56±14 IU/L；APAP肝毒性組血漿中的ALT活性為368± 71 IU/L,p ＜ 0.005)，顯示APAP肝毒性組產生生化上的肝損傷；除磷酸氫二鈣試驗組未如預期外，此肝損傷現象可被同時併用如甘露醇、薄荷醇、三氯蔗糖等常用安全賦形劑所改善，所測得肝發炎指標AST、ALT、GSP與代表病理組織切片肝病變嚴重程度Total HAI-score評估均有顯著性地下降，實驗數據如表一所示，其中又以甘露醇併用三氯蔗糖組合最佳，與正常對照組無異。

表一、正常對照組、APAP肝毒性組及磷酸氫二鈣、甘露醇、薄荷醇、三氯蔗糖等肝保護試驗組小鼠，於管餵單一劑量試驗後，半乳糖單點法(GSP)分析、天門冬氨酸轉胺酶(AST)、丙氨酸轉胺酶(ALT)活性與病理組織切片Total HAI-score，數值之計算為mean ± SD

2. 組織病理學

所改善的結果也反映在相對應的肝臟組織，在經過管餵單一口服劑量1000 mg/kg APAP之大鼠，其體內成功的產生肝毒性，APAP肝毒性組大鼠肝臟組織切片，中央靜脈周圍肝細胞呈現碎裂、空泡化現象明顯，細胞核少，甚至部分肝細胞產生壞死(necrosis)徵狀，相較於正常對照組肝細胞損傷嚴重(如圖二B所示)；相對的，在正常對照組大鼠體內的肝結構則較正常，其肝細胞完整，且排列整齊，無空泡現象(如圖二A所示)；而甘露醇、薄荷醇、三氯蔗糖等肝保護試驗組大鼠肝組織切片結果顯示，肝細胞較完整，細胞核明顯且空泡較少(如圖二C、D、F、G、H所示)，顯示甘露醇、薄荷醇、三氯蔗糖等肝保護試驗組大鼠肝組織較接近正常大鼠肝臟組織，其中以甘露醇併用三氯蔗糖組合保護效果最好，且與劑量呈正相關，劑量愈高保護效果愈佳。

3. 剩餘肝功能之量測

如表一所示，正常對照組與APAP肝毒性組大鼠之半乳糖單點法(GSP)值具有高度的顯著差異(正常對照組大鼠之GSP值為289±38 mg/L；APAP肝毒性組大鼠之GSP值848±123 mg/L,p ＜ 0.005)，此外，磷酸氫二鈣、甘露醇、薄荷醇與三氯蔗糖等肝保護試驗組大鼠之GSP值各為444±60 mg/L、253±29 mg/L、289±20 mg/L、218±31 mg/L，與APAP肝毒性組相較，甘露醇、薄荷醇與三氯蔗糖等肝保護試驗組大鼠之GSP值各與APAP肝毒性組大鼠具有高度的顯著差異(p ＜ 0.005)；單獨施用APAP產生肝毒性大鼠之GSP值明顯增加；然而，在APAP合併施用甘露醇、薄荷醇與三氯蔗糖等賦型劑之肝保護試驗組大鼠則可抵抗這種改變。

實施例二

細胞色素P450 2E1 (CYP2E1)抑制劑之篩選-鼠肝微粒體與人肝微粒體。

材料與方法

1. 試驗材料

本實施例係使用大鼠與人體物種肝臟製備微粒體進行CYP2E1抑制劑之體外篩選，針對55種常見且安全可食用之賦型劑進行細胞色素P450 2E1 (CYP2E1)抑制劑篩選，篩選出對大鼠或人類肝臟之CYP2E1有效抑制劑；該CYP2E1抑制劑篩選原理為：係利用物種肝臟所製備微粒體中CYP2E1與其專一性受質Chlorzoxazone (CZX)反應，加入測試樣品作用後，再偵測CYP2E1代謝物標準品6-OH-CZX (6-Hydroxy-Chlorzoxazone)的生成量，並以對照組(control)的6-OH-CZX生成量為基準，計算測試樣品的CYP 2E1抑制率。

各測試樣品均溶於10%甲醇(methanol)或是二次水中，測試不同濃度之賦形劑(66uM, 33uM, 16.5uM；0.167%, 0.08%, 0.042%, w/v)對CYP2E1的抑制率，所測試之賦型劑結果如表二所列。

本實施例利用大鼠肝臟或人類肝臟微粒體篩選細胞色素CYP2E1抑制劑所需的藥劑如下：（1） CYP2E1：100 mM potassium phosphate (pH 7.4)含有10 mg/mL P450 protein concentration。（2） Control Protein：10 mg/mL P450 Protein溶於100 mM Potassium Phosphate (pH 7.4)中。（3） Buffer Solution：0.5 M Potassium Phosphate (pH 7.4)。（4） Stop Solution：ice-acetonitrile。（5） Cofactors：含有100 mM NADP+以及10 mM Glucose 6-Phosphate。（6） Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase：2000 units/ml溶于無菌水。（7） Chlorzoxazone：受質(substrate)，16 mM Chlorzoxazone溶於10% 甲醇(methanol)。（8） DDTC (Diethyldithiocarbamic acid)：CYP2E1選擇性抑制劑 (陽性對照組)，20 mM DDTC溶於10%甲醇 (methanol)。（9） NADPH-regenerating System：於3.42 mL中加入530 uL Cofactors、40 uL G6PDH (Glucose 6-Phosphate Dehydrogenase Solution)以及100 uL Control Protein。

細胞色素P450 2E1 (CYP2E1)抑制劑之篩選

使用大鼠肝臟或人類肝臟微粒體進行細胞色素CYP2E1抑制劑篩選的實驗步驟如下所述：（1）在4^o C冰浴環境下，0.1M磷酸緩衝液 (pH 7.4) 包含0.5 mg/mL鼠肝或人肝微粒體、5 mM MgCl₂ 靜置15分鐘（2）此時實驗組加入細胞色素P450 2E1反應基質藥物16 mM Chlorzoxazone 以及欲篩選化合物；對照組以甲醇：無菌水=1：1取代；陽性對照組則以DDTC取代；（3）最後加入輔酶1 mM NADP+、10 mM G6P與2 IU G6PD。將反應液轉移至37oC水浴預溫 (pre-incubation) 1分鐘，活性測試實驗的反應時間為30分鐘；（4）反應完後以500 μL acetonitrile終止反應，樣品靜置1分鐘後加入內部標準品 (5 ug/mL 4-hydroxy-tobutamide)，離心後取上層液20 uL，以甲醇: 無菌水作稀釋十倍動作，取5 uL之回溶液注入LC/MS/MS系統進行分析。（5）結果分析：將LC/MS/MS測得的訊號數值換算成為CYP2E1代謝物標準品6-Hydroxy-Chlorzoxazone生成量(pmol)後，以對照組為基準，即對照組的CYP 2E1抑制率為0%，以下列公式計算各陽性對照組及試驗組的CYP 2E1抑制率：

結果

1. 陽性對照組

陽性對照組(DDTC)所測出之CYP 2E1抑制率如表二所示，由表可知當DDTC的濃度為100 μM時，CYP 2E1抑制率可達89.2%。

2. 試驗組CYP 2E1抑制率

賦型劑於鼠肝微粒體所測出之CYP 2E1抑制率如表二所示，由結果可知各賦型劑於不同濃度(66μM, 33μM, 16.5μM；0.167%, 0.08%, 0.042%, w/v)的條件下，對細胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以0.167% Brij 58抑制效果最佳(100.0±0.00%)。

表二、賦形劑於鼠肝微粒體體外篩選CYP 2E1抑制劑之抑制率

賦型劑於人肝微粒體所測出之CYP 2E1抑制率如表三所示，由結果可知各賦型劑於不同濃度(66μM, 33μM, 16.5μM；0.167%, 0.08%, 0.042%, w/v)的條件下，對細胞色素P450 2E1具有不同程度的抑制效果，其中以0.167% Brij 58抑制效果最佳(91.2±1.3%)。

表三、賦形劑於人肝微粒體體外篩選CYP 2E1抑制劑之抑制率

用以改善對乙醯胺基酚(Acetaminophen, APAP)藥物肝毒性之無肝副作用之新複方組合，各賦型劑於不同濃度(66μM, 33μM, 16.5μM)的條件下之有效使用劑量範圍分別為：聚氧乙烯(20)山梨糖單月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate；Tween 20)其中含量為0.17~5.5克、微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)其中含量為100~1000毫克、磷酸氫二鈣(Dicalcium phosphate dihydrate)其中含量為10~250毫克、聚氧乙烯23月桂基醚(Brij 35)其中含量為100~1000毫克、糖精(Saccharin)其中含量為10~40毫克、甘露醇(Mannitol)其中含量為10~250毫克、聚氧乙烯烷基醚(Cremophor RH40)其中含量為0.17~5.5克、三氯蔗糖(Sucralose)其中含量為10~250毫克、吡咯烷酮(Crospovidone)其中含量為0.17~5.5克、羥基乙酸澱粉鈉(Sodium starch glycolate)其中含量為0.17~5.5克、丙烯酸樹脂S100 (Eudragit S100)其中含量為0.17~5.5克、羧甲基纖维素鈉 (Croscarmellose sodium)其中含量為0.17~5.5克、聚氧乙烯聚氧丙烯 (Pluronic F68) 其中含量為1.4~5.5克、薄荷醇(Menthol)其中含量為8~34毫克、低取代烴丙纖維素(Low-substituted hydroxypropyl cellulos)其中含量為0.19~0.82克、預膠化澱粉(Pregelatinized starch)其中含量為1.7~5.5克、Dextrates NF hydrated其中含量為0.17~5.5克、檸檬酸(Citric acid)其中含量為10~42毫克、蓖麻油聚氧乙烯醚(Cremophor EL)其中含量為1.7~5.5克、膠態二氧化矽(Aerosil 200)其中含量為0.17~5.5克、聚乙二醇單硬脂酸酯(Myrj 52)其中含量為1.4~5.5克、山梨酸(Sorbic acid)其中含量為6~24毫克、檸檬油(Lemon oil)其中含量為0.17~5.5克、羥丙基纖維素(Hydroxypropyl cellulose)其中含量為0.17~5.5克、山梨糖醇(Sorbitol)其中含量為0.17~5.5克、乙鮮舒泛鉀(Acesulfame potassium)其中含量為1.4~5.5克、羥丙甲纖維素酞酸酯(Hydroxypropyl methylcellulose)其中含量為0.17~5.5克、單水合乳糖(Lactose monohydrate)其中含量為6~24毫克、麥芽糖糊精(Maltodextrin)其中含量為0.17~5.5克、Brij 58其中含量為0.17~5.5克、Brij 76其中含量為0.17~5.5克、Tween 80其中含量為0.17~5.5克、Tween 40其中含量為1.4~5.5克、PEG 400其中含量為1.4~5.5克、PEG 4000其中含量為1.4~5.5克、PEG 8000其中含量為1.4~5.5克、Span 60其中含量為1.4~5.5克、苯甲酸鈉(Sodium benzoate)其中含量為2.9~11.9毫克、羥乙甲纖維素酞酸酯(Hydroxy ethylmethylcellulose)其中含量為0.17~5.5克、甲纖維素酞酸酯(Methylcellulose)其中含量為0.17~5.5克、Span 80其中含量為1.4~5.5克、甜蜜素(Sodium cyclamate)其中含量為3.3~13.2毫克、甘油山崳酸酯(Glyceryl behenate)其中含量為17.4~69.9毫克、氧化鐵紅(Oxide red)其中含量為11.3~45.2毫克、甘油單硬脂酸酯(Glycerin monostearate)其中含量為1.4~5.5克、Copovidone K28其中含量為0.17~5.5克、澱粉醋酸酯(Starch acetate)其中含量為0.17~5.5克、硬脂酸鎂(Magnesium stearate)其中含量為9.7~39.0毫克、月桂基硫酸鈉(Sodium lauryl sulfate)其中含量為4.7~19.0毫克、Providone K30其中含量為0.18~0.73毫克、及PEG 2000其中含量為1.4~5.5克。

本發明所提供之無肝副作用之對乙醯胺基酚新複方，與單獨使用對乙醯胺基酚之試驗結果相互比較時，在生化分析(ALT、AST值)、病理學分析及剩餘肝功能之量測(GSP值)等各方面之分析結果，都有明顯減少使用對乙醯胺基酚所造成的肝毒性副作用的功效。

上列詳細說明係針對本發明之一可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，例如：對乙醯胺基酚、細胞色素P450 2E1抑制劑、細胞色素P450 2E1抑制劑選用之種類、施用濃度及比例，以及等變化之等效性實施例，均應包含於本案之專利範圍中。

綜上所述，本案不但在對乙醯胺基酚的應用上確屬創新，並以併用常見且安全之常用賦型劑能來確實改善因使用對乙醯胺基酚所造成之肝毒性副作用，應已充分符合新穎性及進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

無

圖一為對乙醯胺基酚(APAP)在肝臟中之代謝途徑圖；圖二為(A)正常對照組、(B)APAP肝毒性組、(C)磷酸氫二鈣、(D)甘露醇、(E)薄荷醇、(F)三氯蔗糖、(G)甘露醇+三氯蔗糖 (1.67+1.67 mg/kg)與(H)甘露醇+三氯蔗糖 (0.83+0.83 mg/kg)肝保護試驗組，於管餵單一劑量後大鼠肝臟組織切片：(A)正常對照組肝組織型態；(B)在周圍中央靜脈(V)的肝細胞呈現碎裂，且有發炎細胞產生，產生壞死現象及空泡化；相較於APAP肝毒性組，肝保護試驗組大鼠，除磷酸氫二鈣試驗組外，其餘試驗組大鼠中央靜脈周圍肝細胞較為完整，細胞核明顯，且空泡較少(D、E、F、G、H) ，又以(F)、(G)最接近正常大鼠肝臟組織 (H&E染色，200X)。

無

Claims

一種化合物用於製備供改善或去除藥品肝毒性之藥物的用途，其中該化合物係選自由下列所組成之群組：聚氧乙烯(20)山梨糖單月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate；Tween 20)、微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)、磷酸氫二鈣(Dicalcium phosphate dihydrate)、聚氧乙烯23月桂基醚(Brij 35)、糖精(Saccharin)、甘露醇(Mannitol)、聚氧乙烯烷基醚(Cremophor RH40)、三氯蔗糖(Sucralose)、吡咯烷酮(Crospovidone)、羥基乙酸澱粉鈉(Sodium starch glycolate)、丙烯酸樹脂S100(Eudragit S100)、羧甲基纖维素鈉(Croscarmellose sodium)、聚氧乙烯聚氧丙烯(Pluronic F68)、薄荷醇(Menthol)、低取代烴丙纖維素(Low-substituted hydroxypropyl cellulose)、預膠化澱粉(Pregelatinized starch)、Dextrates NF hydrated、檸檬酸(Citric acid)、蓖麻油聚氧乙烯醚(Cremophor EL)、膠態二氧化矽(Aerosil 200)、聚乙二醇單硬脂酸酯(Myrj 52)、山梨酸(Sorbic acid)、檸檬油(Lemon oil)、羥丙基纖維素(Hydroxypropyl cellulose)、山梨糖醇(Sorbitol)、乙鮮舒泛鉀(Acesulfame potassium)、羥丙甲纖維素酞酸酯(Hydroxypropyl methylcellulose)、單水合乳糖(Lactose monohydrate)、麥芽糖糊精(Maltodextrin)、Brij 58、Brij 76、Tween 80、Tween 40、PEG 400、PEG 4000、PEG 8000、Span 60、苯甲酸鈉(Sodium benzoate)、羥乙甲纖維素酞酸酯(Hydroxy ethylmethylcellulose)、甲纖維素酞酸酯(Methylcellulose)、Span 80、甜蜜素(Sodium cyclamate)、甘油山崳酸酯(Glyceryl behenate)、氧化鐵紅(Oxide red)、甘油單硬脂酸酯(Glycerin monostearate)、Copovidone K28、澱粉醋酸酯(Starch acetate)、硬脂酸鎂(Magnesium stearate)、月桂基硫酸鈉(Sodium lauryl sulfate)、Providone K30、PEG 2000及其任意組合，其中該藥品係選自由下列所組成之群組：對乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)、酒精及組合。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物之單次使用劑量之有效量如下：聚氧乙烯(20)山梨糖單月桂酸酯(Polyethylene glycol sorbitan monolaurate；Tween 20)之含量為0.001~55克、微晶纖維素(Microcrystalline cellulose)之含量為0.001~55克、磷酸氫二鈣(Dicalcium phosphate dihydrate)之含量為0.001~55克、聚氧乙烯23月桂基醚(Brij 35)之含量為0.001~55克、糖精(Saccharin)之含量為0.001~55克、甘露醇(Mannitol)之含量為0.001~55克、聚氧乙烯烷基醚(Cremophor RH40)之含量為0.001~55克、三氯蔗糖(Sucralose)之含量為0.001~55克、吡咯烷酮(Crospovidone)之含量為0.001~55克、羥基乙酸澱粉鈉(Sodium starch glycolate)之含量為0.001~55克、丙烯酸樹脂S100(Eudragit S100)之含量為0.001~55克、羧甲基纖維素鈉(Croscarmellose sodium)之含量為0.001~55克、聚氧乙烯聚氧丙烯(Pluronic F68)之含量為0.001~55克、薄荷醇(Menthol)之含量為0.001~55克、低取代烴丙纖維素(Low-substituted hydroxypropyl cellulose)之含量為0.001~55克、預膠化澱粉(Pregelatinized starch)之含量為0.001~55克、Dextrates NF hydrated之含量為0.001~55克、檸檬酸(Citric acid)之含量為0.001~55克、蓖麻油聚氧乙烯醚(Cremophor EL)其中含量為0.001~55克、膠態二氧化矽(Aerosil 200)之含量為0.001~55克、聚乙二醇單硬脂酸酯(Myrj 52)之含量為0.001~55克、山梨酸(Sorbic acid)之含量為0.001~55克、檸檬油(Lemon oil)之含量為0.001~55克、羥丙基纖維素(Hydroxypropyl cellulose)之含量為0.001~55克、山梨糖醇(Sorbitol)之含量為0.001~55克、乙鮮舒泛鉀(Acesulfame potassium)之含量為0.001~55克、羥丙甲纖維素酞酸酯(Hydroxypropyl methylcellulose)之含量為0.001~55克、單水合乳糖(Lactose monohydrate)之含量為0.001~55克、麥芽糖糊精(Maltodextrin)之含量為0.001~55克、Brij 58之含量為0.001~55克、Brij 76之含量為0.001~55克、Tween 80之含量為0.001~55克、Tween 40之含量為0.001~55克、PEG 400之含量為0.001~55克、PEG 4000之含量為0.001~55克、PEG 8000之含量為0.001~55克、Span 60之含量為0.001~55克、苯甲酸鈉(Sodium benzoate)之含量為0.001~55克、羥乙甲纖維素酞酸酯(Hydroxy ethylmethylcellulose)之含量為0.001~55克、甲纖維素酞酸酯(Methylcellulose)之含量為0.001~55克、Span 80之含量為0.001~55克、甜蜜素(Sodium cyclamate)之含量為0.001~55克、甘油山崳酸酯(Glyceryl behenate)之含量為0.001~55克、氧化鐵紅(Oxide red)之含量為0.001~55克、甘油單硬脂酸酯(Glycerin monostearate)之含量為0.001~55克、Copovidone K28之含量為0.001~55克、澱粉醋酸酯(Starch acetate)之含量為0.001~55克、硬脂酸鎂(Magnesium stearate)之含量為0.001~55克、月桂基硫酸鈉(Sodium lauryl sulfate)之含量為0.001~55克、Providone K30之含量為0.001~55克、PEG 2000之含量為0.001~55克。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係選自由下列所組成之群組：Brij 58、Brij 76、糖精、Brij35、Tween 20、PEG400、微晶纖維素、磷酸氫二鈣、三氯蔗糖、甘露醇、聚氧乙烯烷基醚、羥基乙酸澱粉鈉、PEG2000、PEG4000、Tween 40、吡咯烷酮、Tween 80、丙烯酸樹脂S100、羧甲基纖维素鈉、聚氧乙烯聚氧丙烯、薄荷醇及其任意組合。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係選自由下列所組成之群組：磷酸氫二鈣、薄荷醇、甘露醇、三氯蔗糖及其任意組合。
如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該化合物係選自由下列所組成之群組：甘露醇、三氯蔗糖及其組合。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其中該化合物與該藥品係經分開、同時或依序地使用。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其中該化合物為選自於該群組的任何兩種或以上者，且該化合物各自可分開、同時或依序地使用。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其中該化合物係以膠、噴劑、軟錠劑、錠劑、可分散性片劑、膠囊、軟膠囊、丸劑、懸浮液、微球、口腔植入片、乳化針劑、植入劑或其他藥學上可行之形式投予。
如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之用途，其中該化合物與該藥品係以醫藥包、套組或病患包之形式存在。
一種改善或去除藥品肝毒性之複方組合，其包括該藥品及如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的化合物，其中該化合物存在於該複方組合中的量能有效地改善或去除該藥品產生的肝毒性，其中該藥品係選自由下列所組成之群組：對乙醯胺基酚(Acetaminophen，APAP)、酒精及組合。
如申請專利範圍第10項所述之複方組合，其中該化合物與該藥品係以醫藥包、套組或病患包之形式存在。
如申請專利範圍第10項所述之複方組合，其中該藥品存在於該複方組合中的量係高於該藥品單獨使用時的劑量。
如申請專利範圍第10項所述之複方組合，其中該藥品存在於該複方組合中的量係低於該藥品單獨使用時的劑量。
如申請專利範圍第10至13項中任一項之複方組合，其中對乙醯胺基酚單次使用劑量可達10克。
如申請專利範圍第10至13項中任一項之複方組合，其中對乙醯胺基酚單次使用劑量為大於500毫克至10克。