TWI539961B - 單核球或其前驅細胞分化之調節 - Google Patents
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Description
一般而言，本發明係關於藉由投與調節單核球或其前驅細胞分化之化合物來促進由樹狀細胞(DC)、且視情況M1型(巨噬細胞M1極化)驅動之免疫反應。本發明係關於能夠結合至CSF-1R之抗體之用途，其用於調節單核球或其前驅細胞分化、更特定而言誘導單核球或其前驅細胞向樹狀細胞及/或M1極化之巨噬細胞而非M2極化之巨噬細胞分化。本發明亦係關於在患者中評價能夠結合至CSF-1R之抗體之劑量效力之方法，其係藉由評估活體內或活體外單核球或其前驅細胞至巨噬細胞(M1-或M2型)及/或樹狀細胞之分化來達成。本發明進一步係關於評估能夠結合至CSF-1R之抗體對所治療個體之效應之治療後伴隨式測試(companion test)及分析。
在發炎期間，循環單核球被募集至發炎位點，在發炎位點其採用視具體細胞因子及生長因子之存在而定之巨噬細胞表現型。成熟巨噬細胞係分成兩個群體，即M1極化或「經經典活化」及M2極化或「經替代性活化」。巨噬細胞係重要的腫瘤浸潤性細胞，且在腫瘤生長及轉移中起關鍵作用。在大部分實體腫瘤中，巨噬細胞之存在對於腫瘤生長及轉移係有利的。當前研究表明腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)顯示M2表現型。該等腫瘤相關巨噬細胞(TAM)產生介白素IL-10並轉形生長因子(TGF)β以阻抑全身性抗腫瘤免疫反應。同時，TAM藉由
分泌促血管形成因子來促進腫瘤新血管形成，並界定侵襲性微環境以促使腫瘤轉移及散播。出於該等原因，認為M2 TAM之選擇性耗盡為抗癌療法之新穎方法(Sica等人，2006,European Journal of Cancer,42,717-727)。
巨噬細胞以極化方式參與對腫瘤之免疫反應。M1分化係由GM-CSF誘發，並進一步由干擾素-γ(IFN-γ)、細菌脂多糖(LPS)或腫瘤壞死因子α(TNFα)刺激，並由若干涉及信號轉導子與轉錄活化子(STAT)、經活化B細胞之核因子κ輕鏈增強子(NFκB)及有絲分裂誘致劑活化之蛋白激酶(MAPK)之信號轉導路徑調介。該等事件增強諸如反應性氧物質及一氧化氮(NO)等試劑之產生，並藉由提高抗原呈遞能力並藉助諸如IL12等細胞因子之產生誘導Th1免疫性來促進後續發炎性免疫反應。相比之下，M2巨噬細胞極化係用於以不同於M1極化之方式闡述巨噬細胞活化，包括IL4/IL13刺激之巨噬細胞、IL10誘導之巨噬細胞及免疫複合體誘發之巨噬細胞。在M1對M2極化間之許多分子差異中，IL12與IL10產生之比率對於辨別M1及M2巨噬細胞甚為重要。值得注意的係，TAM共享M2巨噬細胞之許多性質。
TAM呈現不僅由IL-12lowIL-10high表現型且亦由與調控功能相關之高FcR介導吞噬能力表徵之M2特徵(Schmieder等人，2012,Semin Cancer Biol.,22,289-297)。血紅素清道夫受體(haemoglobin scavenger receptor，CD163)已鑑別為M2極化之巨噬細胞之由TAM表現之標記(Ambarus等人，2012,375,196-206)。TAM可代表腫瘤微環境中最豐富之免疫阻抑細胞群，其係由CSF-1及CCL-2(MCP-1)募集(Sica等人，2006,Eur J Cancer.,42,717-727)。
類似地，經替代性活化之M2巨噬細胞已參與若干種病狀，最突出者係過敏及氣喘(Duffield,2003,Clin.Sci.104,27；Gordon,2003,Nat.Rev.Immunol.,3,23；Dagupta及Keegan,J.Innate Immun.,2012,
4,478)。
發明者現已顯示，藉由投與調節單核球或其前驅細胞分化之化合物，某些單株抗體能夠促進DC、且視情況M1型(巨噬細胞M1極化)免疫反應。其已顯示，該等單株抗體能夠下調表面FcγRI(CD64)及FcγRIII(CD16)以下調MCP-1(巨噬細胞趨化蛋白1，亦稱為CCL-2)、IL-6、MMP9及/或IL-10產生，並促進IL-12、IL-1β、TNF-α產生。其已進一步顯示，該等單株抗體抑制CD163+ M2型巨噬細胞自人類單核球之分化，且反而促進單核球至DC之分化且視情況巨噬細胞M1極化。
圖1：H27K15對分化巨噬細胞無細胞毒性，而其他抗CD115 mAb誘導大量細胞死亡
在利用GM-CSF及CSF-1在抗CD115 mAb或F(ab')2之存在或不存在下或利用GW2580將單核球或其前驅細胞培養6天後對細胞計數。對照包括利用利妥昔單抗(rituximab)或利妥昔單抗F(ab')2處理或不添加任何化合物之培養物。顯示在每一培養條件下獲得的於5個顯微鏡視野中之細胞計數之平均值±標準偏差。
圖2：對在單株抗體H27K15之存在下分化之人類巨噬細胞中之CD64(FcγRI)表現的抑制
藉由IC/FC針對CD64之表面表現分析在利用GM-CSF及CSF-1將來自3種不同血液供體之單核球或其前驅細胞培養6天後所獲得之巨噬細胞。上圖：來自供體1之利用單株抗體H27K15(左圖，粗線)或利用GW2580(右圖，粗線)或其各別陰性對照利妥昔單抗(左圖，細線)處理或無處理(右圖細線)的培養物中之CD64染色。下圖：將利用10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml*之測試化合物處理之巨噬細胞培養物中之螢光強度之中位數與相應陰性對照中之彼等比較：H27K15對利妥昔
單抗、源自H27K15之F(ab')2對源自利妥昔單抗之F(ab')2、mAb 2-4A5或9-4D2對大鼠IgG1、GW2580對無處理。CD64表現之減少百分比係計算為：100-[100×利用測試化合物之中位數螢光強度/利用對照之中位數螢光強度]。顯示來自3種血液供體之CD64表現之平均減少百分比。*以等莫耳濃度使用之F(ab')2除外：6.6μg/ml；0.6μg/ml；及0.06μg/ml。
圖3：H27K15對CD86bright SSClow巨噬細胞群之誘導
上圖：顯示來自供體3之在H27K15(左)或陰性對照利妥昔單抗(右)之存在下分化6天之巨噬細胞之CD86染色(x軸)及側向散射(SSC，y軸)的點圖。針對H27K15誘導之CD86bright SSClow細胞群設門。下圖：將利用10μg/ml、1μg/ml或0.1μg/ml*之測試化合物之CD86bright SSClow細胞之百分比與相應陰性對照中之彼等相比：H27K15對利妥昔單抗、源自H27K15之F(ab')2對源自利妥昔單抗之F(ab')2、GW2580對無處理。CD86bright SSClow細胞群之增加百分比係計算為：100×利用測試化合物之CD86bright SSClow細胞之百分比/利用對照之CD86bright SSClow細胞之百分比。顯示來自3種血液供體之CD86bright SSClow細胞群之平均增加百分比。*F(ab')2除外：6.6μg/ml；0.6μg/ml；及0.06μg/ml。
圖4：H27K15誘導IL-12p70分泌並增加巨噬細胞IL-12/IL-10比率
於來自在mAb H27K15(1μg/ml)、GW2580(1μM)或其各別陰性對照利妥昔單抗或無處理之存在下分化之第6天巨噬細胞之培養物上清液中滴定IL-12p70及IL-10。左圖：來自3種血液供體之巨噬細胞培養物中之IL-12p70及IL-10含量(pg/ml)右圖：針對每一血液供體及每一培養條件計算IL-12p70(pg/ml)/IL-10(pg/ml)比率。在IL-12p70不可檢測(低於11pg/ml之檢測極限)之樣品中，將其含量隨意設定於1pg/ml處用於計算IL-12p70/IL-10比率。
圖5：H27K15抑制巨噬細胞之MCP-1/CCL2及IL-6分泌
於來自在mAb H27K15(1μg/ml)、GW2580(1μM)或其各別陰性對照利妥昔單抗或無處理之存在下分化之第6天巨噬細胞之培養物上清液中滴定MCP-1及IL-6。針對3種血液供體將MCP-1(上圖)或IL-6產生(下圖)之減少百分比計算為：100-[100×利用測試化合物之細胞因子濃度(pg/ml)/利用對照之細胞因子濃度(pg/ml)]。
圖6. MMP-9產生因mAb H27K15之下調
在GM-CSF及CSF-1之存在下在利用或不利用mAb H27K15、利妥昔單抗或GW2580的情況下使自3種不同血液供體分離之單核球分化6天。將MAb H27K15或利妥昔單抗(0.1μg/ml、1μg/ml或10μg/ml)或等莫耳濃度之源自兩種mAb之F(ab)'2添加至培養物中。藉由ELISA(R&D Systems)於第6天培養物上清液中滴定MMP-9。
圖7. MAb H27K15抑制CD163+ M2型巨噬細胞之分化。
收穫利用GM-CSF及CSF-1培養6天後所獲得之細胞，並在4℃下利用含有人類IgG Fc片段之PBS培育20min以使Fc受體飽和。然後在4℃下將螢光染料偶聯之mAbs(抗CD14-PerCP-Cy5.5、抗CD163-PE、抗CD206-APC、抗CD1a-FITC，BD Biosciences)與每一樣品一起培育20min。使用FACS LSR-II(BD biosciences)並利用DIVA軟體實施FCM分析。呈現來自3種不同血液供體之數據。
圖8. M1：M2巨噬細胞比率因mAb H27K15之上調。
在1μg/ml之抗CD115 mAb H27K5或對照IgG1利妥昔單抗之存在或不存在下利用GM-CSF及CSF-1培養來自2種不同供體之單核球。細胞分化6天後測定巨噬細胞群中M1(CD14+CD163-)與M2(CD14+CD163+)型巨噬細胞間之比率。
圖9. MAb H27K15使單核球分化向DC而非巨噬細胞偏移。
收穫利用GM-CSF及CSF-1培養6天後所獲得之細胞，並在4℃下
利用含有人類IgG Fc片段之PBS培育20min以使Fc受體飽和。然後在4℃下將螢光染料偶聯之mAbs(抗CD14-PerCP-Cy5.5、抗CD163-PE、抗CD206-APC、抗CD1a-FITC，BD Biosciences)與每一樣品一起培育20min。使用FACS LSR-II(BD biosciences)並利用DIVA軟體實施FCM分析。呈現來自6種不同血液供體之數據。
圖10. H27K15處理增加利用GM-CSF及CSF-1分化之單核球之免疫刺激能力。
同種PBMC與來自以4個不同濃度利用GM-CSF及CSF-1分化並利用mAb H27K15或利妥昔單抗處理之第6天單核球的細胞間之MLR。T(-)：未經刺激之PBMC。T(+)：經抗CD3 mAb(BD Pharmingen)及IL-2(125UI/ml)刺激之PBMC，與100%增殖相對應。增殖PBMC之百分比係如下計算：%利用測試mAb之CFSE-low細胞×100/%利用T(+)之CFSE-low細胞。
圖11. 單株抗體H27K15抑制利用CSF-1或IL-34培養之單核球產生MCP-1/CCL2
圖11A：於來自於48孔板中利用CSF-1或IL-34在單株抗體H27K15或同型對照利妥昔單抗(均為1μg/ml)之存在或不存在下培養6天後之源自單核球之細胞的培養物上清液中滴定MCP-1/CCL2。使用來自一種血液供體的細胞獲得所顯示結果，代表3種所測試供體。
圖11B：使用來自同一供體之於96孔板中利用類似條件培養之細胞平行評估細胞活力。活力僅略受H27K15抗體的影響。
本發明在廣義上係關於藉由調節單核球分化進行之免疫調節之方法。
更具體而言，本發明係關於藉由使適宜前驅細胞細胞、通常單核球或其前驅細胞暴露至有效劑量之能夠結合至CSF-1R之抗體中來
活體內或離體生成樹狀細胞之方法。由此生成之樹狀細胞可由樹狀細胞標記(例如CD1a、CD14、CD86、CD1b等)之表現來表徵。
在本發明之方法中，藉由使前驅細胞與有效劑量之能夠結合至CSF-1R之抗體接觸自前驅細胞、通常單核球生成樹狀細胞。前驅細胞可藉由業內已知方法自適宜生物樣品分離，且可於複雜細胞群中分離或提供。
除非上下文另外明確指明，否則整個申請案通篇使用之術語「一」(「a」及「an」)係在如下意義上使用：其意指「至少一個」、「至少第一」、「一或多個」或「複數個」所引用組份或步驟。例如，術語「細胞」包括複數個細胞，包括其混合物。
任何地方使用時，術語「及/或」包括「及」、「或」及「由該術語連接之成份之全部或任何其他組合」之含義。
本文中所使用之術語「約」或「大約」意指在給定值或範圍之20%、較佳地10%且更佳地5%內。術語「約x」進一步包括x值。
本文中所使用之「包含」(「comprising」及「comprise」)意欲表明各部分套組、產物、組合物及方法包括所引用組份或步驟但不排除其他組份或步驟。例如，「包含x及y之組合物」涵蓋任何含有x及y之組合物，無論其他什麼組份可存在於該組合物中。同樣，「包含x之步驟之方法」涵蓋任何其中實施x之方法，無論x係該方法中之唯一步驟或者其僅為步驟中之一者，無論可存在多少其他步驟且無論x與其相比多麼簡單或複雜。
當使用「基本上......由組成」定義產物、組合物及方法時，應意指排除有本質意義之任何其他組份或步驟。因此，基本上由所列舉組份組成之組合物將不排除痕量污染物及醫藥上可接受之載劑。「由......組成」應意指排除超過痕量元素之其他組份或步驟。
根據第一實施例，本發明係關於免疫調節方法，其藉由在罹患
與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀之患者中調節單核球或其前驅細胞分化來達成，其中該方法包含向該患者投與有效量之能夠結合至CSF-1R之抗體之步驟。更具體而言，本發明係關於此一用於免疫調節之方法，其中該患者進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀。
根據一具體實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於在(尤其)罹患與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀之患者中調節單核球或其前驅細胞分化。根據一具體實施例，該患者進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀。
本申請案係關於「調節單核球或其前驅細胞分化」。此術語意指本發明之調節抗體使得M2巨噬細胞極化池降低及/或樹狀細胞(DC)池、且視情況M1型(巨噬細胞M1極化)池增加，較佳地使得M2巨噬細胞極化池降低及樹狀細胞(DC)池增加。如本文中所揭示，此可由與M2巨噬細胞相關之因子之含量變化指示。該等因子之實例係諸如CD64或CD163等膜標記、諸如IL6、IL10或IL12等細胞因子、MCP-1、MMP9等。例如，此在患者中「調節單核球或其前驅細胞分化」可藉由在向患者投與本發明之能夠結合至CSF-1R之抗體後量測IL12/IL10比率之增加、MCP-1或IL-6含量來瞭解。
本文中所使用之樹狀細胞(DC)係指在淋巴或非淋巴組織中發現之形態類似細胞類型之不同群體之任一成員。樹狀細胞(DC)係起始T細胞介導之免疫反應之專門化抗原呈遞細胞(APC)。DC在誘導免疫性中之效率在組織培養及整體動物模型中較明顯。當T細胞處於靜息狀態或與特異性抗原(Ag)具有反應性之T細胞之前驅細胞頻率較低時，此尤其明顯。DC富含I類及II類主要組織相容性複合體(MHC)分子，且其共刺激及黏附分子向其提供比其他APC之性質更成熟且更強效之附加性質。
DC表現高含量之I類及II類MHC產物。該等分子係用於將肽片段
自蛋白質呈遞至T淋巴球。抗原呈遞本身不生成免疫性。需要額外的「第二信號」或輔助分子。許多該等輔助分子係與T細胞上之特異性受體相互作用之膜糖蛋白。該等輔助分子係以高含量於DC上表現，並包括：LFA-3(CD58)、B7-1(CD80)及B7-2(CD86)、ICAM-1(CD54)及ICAM-3(CD50)及CD40。其他APC可表現該等輔助分子，但於DC上之含量特別高。
DC具有遠低於其髓樣相關物之吞噬能力且因此缺乏針對免疫複合體(FcγR)或C3及其片段之受體。特定而言當DC未完全成熟時，可發現低含量之CD32 FcγR及CD11b C3biR。終末分化之DC表現標記CD1a，且缺乏CD14(一種於巨噬細胞上更豐富且介導吞噬細胞對脂多糖(LPS)及LPS結合蛋白之反應之受體)。本質上，DC分化之路徑犧牲吞噬細胞對極高含量之MHC產物及導致抗原至靜息T細胞之有效呈遞之輔助分子之許多清除及抗微生物性質。
本發明為表徵/或鑑別/或跟蹤DC發生對細胞表面進行之分析可根據一實施例使用單株抗體並使用流式細胞儀、磁珠分選及諸如此類實施。簡言之，將該等細胞與螢光染料直接偶聯之單株抗體組合，或與未經偶聯之一級抗體且隨後與與螢光染料偶聯之市售二級抗體組合。使用(例如)流式細胞儀(例如，如自Becton Dickinson,Mountain View,Calif.獲得)分析經染色細胞。DC之額外表現型特徵可進一步由藉由(例如)逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)進行之基因表現剖析表徵。
根據另一實施例，本發明係關於在患者、尤其罹患與不期望M2極化相關之病狀之患者中增加樹狀細胞(DC)池、且視情況M1型巨噬細胞池之方法，其中該方法包含向該患者投與有效量之能夠結合至CSF-1R之抗體之步驟。更具體而言，本發明係關於此一用於免疫調節之方法，其中該患者進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀。
根據具體實施例，該在罹患與不期望M2極化相關之病狀之患者
中增加樹狀細胞(DC)池、且視情況M1型巨噬細胞池之方法此外降低巨噬細胞M2池。
「患者」意指脊椎動物，例如哺乳動物，例如人類。哺乳動物包括(但不限於)人類、狗、貓、馬、牛及豬。根據本發明，「患者」係罹患與不期望M2極化相關之病狀，且根據特定實施例進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀。
更具體而言，本發明亦係關於一在患者中減少巨噬細胞促腫瘤功能(即致腫瘤性)及/或增加腫瘤阻抑活性之方法，其特別地藉由使其分化向DC偏移來達成，尤其在罹患與不期望巨噬細胞分化及M2極化相關之病狀及/或與CSF-1R活性相關之病狀及/或癌症誘導之免疫阻抑之患者中進行，其中該方法包含向該患者投與有效量之能夠結合至CSF-1R之抗體之步驟。
根據具體實施例，本發明之方法抑制至少一種選自由腫瘤侵襲、轉移、腫瘤細胞增殖、腫瘤生長、腫瘤存活、新血管形成、先天或繼承免疫性之阻抑及細胞外基質重塑組成之群中之巨噬細胞促腫瘤功能。
因此，參照本發明，「調節單核球或其前驅細胞分化」可進一步意指本發明之調節抗體減少至少一種選自由腫瘤侵襲、轉移、腫瘤細胞增殖、腫瘤生長、腫瘤存活、新血管形成、繼承或先天免疫性之阻抑及細胞外基質重塑組成之群中之巨噬細胞促腫瘤功能(即致腫瘤性)。
根據具體實施例，本發明之方法抑制分化單核球或其前驅細胞產生MCP-1、MMP-9及IL-6。
根據具體實施例，本發明之方法下調分化單核球或其前驅細胞上之表面FcγRI(CD64)及FcγRIII(CD16)表現。
根據具體實施例，本發明之方法促進分化單核球或其前驅細胞
產生IL-12(更特定而言IL-12 P70形式)及/或上調IL-12/IL-10比率。
根據具體實施例，本發明之方法藉助所分泌之因子調節單核球或其前驅細胞分化。
根據具體實施例，本發明之方法在患者中、尤其在罹患與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀之患者中減少以下各項中之至少一者：* TAM至腫瘤中之募集；* 至少一種巨噬細胞促腫瘤功能；* 腫瘤血管形成；* 腫瘤侵襲及轉移；* 腫瘤生長；* 腫瘤細胞增殖。
根據具體實施例，該患者進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀。
本發明亦係關於用於在患者中、尤其在罹患病狀與不期望巨噬細胞分化及M2巨噬細胞極化相關之患者中或在罹患病狀與CSF-1R活性及/或癌症誘導之免疫阻抑相關之患者中將巨噬細胞向樹狀細胞(DC)、且視情況M1型巨噬細胞免疫反應驅動及/或遠離M2型(巨噬細胞M2極化)免疫反應驅動之方法，其中該方法包含向該患者投與有效量之能夠結合至CSF-1R之抗體之步驟。
本發明進一步係關於用於在患者中、尤其在罹患病狀與不期望巨噬細胞分化及M2巨噬細胞極化相關之患者中或在罹患病狀與CSF-1R活性及/或癌症誘導之免疫阻抑相關之患者中將巨噬細胞向Th1免疫反應驅動或遠離Th2免疫反應驅動之方法，其中該方法包含向該患者投與有效量之能夠結合至CSF-1R之抗體之步驟。
本發明亦係關於能夠結合至CSF-1R之抗體之用途，其用於調節
單核球或其前驅細胞至DC、且視情況M1型巨噬細胞之分化。本發明亦係關於能夠結合至CSF-1R之抗體之用途，其用於驅動單核球或其前驅細胞向DC、且視情況M1型巨噬細胞分化以刺激免疫反應。本發明亦係關於能夠結合至CSF-1R之抗體之用途，其誘導分化單核球或其前驅細胞以刺激Th1型免疫反應。本發明亦係關於諸如醫藥組合物等之用途，該等組合物包含能夠結合CSF-1R之抗體，其用於調節單核球或其前驅細胞分化，用於驅動單核球或其前驅細胞向DC、且視情況M1型巨噬細胞分化，及/或誘導分化單核球或其前驅細胞以刺激Th1型免疫反應。
本文中所使用之術語「能夠結合至」係指決定在蛋白質及其他生物製劑之異質群體之存在下存在標靶蛋白之結合反應。因此，在指定分析條件下，本發明之抗體優先結合至至少一部分CSF-1R，且較佳不大量結合至測試樣品中所存在之其他組份。本發明抗體與CSF-1R標靶間之特異性結合意指結合親和力為至少103M-1且較佳地105M-1、106M-1、107M-1、108M-1、109M-1或1010M-1。
本文中所使用之術語「CSF-1R」係指人類CSF1受體。
本文中所使用之「抗體」或「Ab」係以最廣泛意義使用。因而，「抗體」或「Ab」可天然存在或人造的，例如藉由習用融合瘤技術、重組技術產生之單株抗體(mAb)及/或其功能片段。本發明抗體較佳為單株抗體(mAb)。
本文中所使用之術語「可變區」係指輕鏈(VL)或重鏈(VH)之可變區或結構域，其含有用於結合識別特異性之決定簇。可變結構域參與抗原識別，並形成抗原結合位點。重鏈及輕鏈二者之可變區分成包含四個框架亞區(FR1、FR2、FR3及FR4)之區段，其雜有三個超變序列段或互補決定區(CDR)，如Kabat數據庫中所定義，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4
之間。在未將特定亞區指定為FR1、FR2、FR3或FR4情況下，表示為其他形式之框架區代表天然存在之免疫球蛋白單鏈之可變區內的組合FR。本文中所使用之FR代表四個亞區中之一者，且FR代表構成框架區之四個亞區中之兩者或更多者。抗體之框架區係構成輕鏈及重鏈之組合框架區，並用於定位並比對CDR。CDR主要負責形成抗體中賦予對抗原表位之結合特異性及親和力之結合位點。在H或L鏈之提供抗原結合區之可變區內係因其在不同特異性之抗體間之極端可變性而稱為「超變」之較小序列。該等超變區亦稱為「互補決定區」或「CDR」區。該等CDR區負責抗體對特定抗原決定簇結構之基本特異性。所有抗體之可變重鏈及輕鏈各自具有3個CDR區，對於各別輕鏈(L)及重鏈(H)而言，每一CDR區與其他區(稱為L1、L2、L3、H1、H2、H3)係不連續的。
「共投與」意指彼此結合、一起、並列地投與，包括同時或依序投與兩種或更多種藥劑。
「有效量」通常意指提供期望局部或全身效應(例如可有效改善發炎之不期望效應，包括調節巨噬細胞之極化等)之量。例如，有效量係足以實現有益或期望臨床結果之量。有效量可在單一投與中一次性提供或以在若干次投與中提供有效量之分數量提供。將視為有效量之量的精確確定可基於每一個體之個別因素，包括其體型、年齡、損傷及/或所治療之疾病或損傷，及自損傷發生或疾病開始起之時間量。熟習此項技術者將能夠基於業內常規之該等考慮因素確定給定個體之有效量。本文中所使用之「有效劑量」意義與「有效量」相同。
根據另一實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於在患者中、尤其罹患與不期望M2極化相關之病狀且根據特定實施例進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀之患者中減少至少一種選自由腫瘤侵襲、轉移、腫瘤生長、腫瘤存活、新血管形
成、先天或繼承免疫性之阻抑及基質重塑(即致腫瘤性)及/或增加巨噬細胞腫瘤阻抑活性組成之群中之巨噬細胞促腫瘤功能。
根據另一實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於抑制巨噬細胞、尤其人類巨噬細胞產生MCP-1、MMP-9及IL-6。
根據另一實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於下調於巨噬細胞、尤其人類巨噬細胞上之表面FcγRI(CD64)及/或FcγRIII(CD16)表現。
根據另一實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於促進巨噬細胞、尤其人類巨噬細胞產生IL-12(更特定而言IL-12 P70形式)及/或上調IL-12/IL-10比率。
根據另一實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於藉助所分泌之因子調節巨噬細胞之極化狀態。
根據另一實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於在患者、尤其罹患與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀且根據特定實施例進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀之患者中減少TAM募集及/或腫瘤血管形成。
更具體而言，本發明亦係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於在患者、尤其罹患與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀且根據特定實施例進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀之患者中減少TAM募集及/或腫瘤侵襲及轉移。
更具體而言，本發明亦係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於在患者、尤其罹患與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀之患者且根據特定實施例進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀中減少TAM募集及/或腫瘤生長。
根據另一實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體
之用途，其用於在患者、尤其罹患與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀且根據特定實施例進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀之患者中驅動單核球或其前驅細胞向樹狀細胞(DC)、且視情況M1型(巨噬細胞M1極化)免疫反應分化及/或遠離M2型(巨噬細胞M2極化)免疫反應。
根據另一實施例，本發明係關於能夠結合至人類CSF-1R之抗體之用途，其用於在患者、尤其罹患與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀且根據特定實施例進一步罹患與CSF-1R活性相關之病狀及/或癌症誘導之免疫阻抑之患者中將驅動巨噬細胞向Th1免疫反應驅動及/或遠離Th2免疫反應驅動。
根據較佳實施例，該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係結合至至少一個位於SEQ ID NO：23之20位至41位胺基酸(即人類結構域D1之N-端部分)間之表位之抗體。在較佳實施例中，本發明抗體結合至一個位於SEQ ID NO：23之20位至39位胺基酸(即人類結構域D1之N-端部分)間的表位、SEQ ID NO：23之胺基酸Asn72、Ser94-Ala95-Ala96、Lys102、Asp131-Pro132-Val133及Trp159。
在另一實施例中，本發明抗體結合至一個位於SEQ ID NO：23之20位至41位胺基酸(即人類結構域D1之N-端部分)間之表位，且不結合至位於SEQ ID NO：23之42位至90位胺基酸間及/或91位至104位胺基酸間及/或105位至199位胺基酸間及/或200位至298位間胺基酸之任一表位。根據較佳實施例，本發明抗體能夠識別位於SEQ ID NO：23之20位至41位胺基酸(即人類結構域D1之N-端部分)間之最小表位、較佳地SEQ ID NO：23之20位至39位胺基酸間之表位。
在較佳實施例中，該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係不與IL-34配體競爭結合至CSF-1R受體之抗體。本文中所使用之術語「不與IL-34配體競爭」係指不抑制IL34配體與其受體CSF-1R結合。
在較佳實施例中，該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係與CSF-1配體部分競爭結合至CSF-1R受體之抗體。本文中所使用之術語「與CSF-1配體部分競爭」係指抑制CSF-1配體與其受體CSF-1R結合，此抑制少於100%，較佳地少於50%，且甚至更佳地少於20%，且有利地少於10%。此部分抑制劑僅減少但不完全排除配體結合，該抑制係稱為部分抑制。在較佳實施例中，該能夠結合至CSF-1R之抗體係能夠部分防止CSF1結合至其受體CSF-1R且不能夠完全抑制該結合之抗體。更特定而言，本發明抗體能夠使CSF-1與CSF-1R之結合降低大約5%至10%。
根據一實施例，該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係包含以下之抗體：(i)至少一個CDR，其中該CDR包含至少5個以下各項之連續胺基酸：於SEQ ID NO：1之45位開始且於54位結束之序列、於SEQ ID NO：1之66位開始且於87位結束之序列或於SEQ ID NO：1之117位開始且於126位結束之序列；或，(ii)至少一個CDR，其中該CDR包含至少5個以下各項之連續胺基酸：於SEQ ID NO：2之44位開始且於56位結束之序列、於SEQ ID NO：2之66位開始且於76位結束之序列或於SEQ ID NO：2之109位開始且於117位結束之序列。
根據較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含以下包含至少5個連續胺基酸之CDR：- 於SEQ ID NO：1之45位開始且於54位結束之序列，- 於SEQ ID NO：1之66位開始且於87位結束之序列，- 於SEQ ID NO：1之117位開始且於126位結束之序列，- 於SEQ ID NO：2之44位開始且於56位結束之序列，
- 於SEQ ID NO：2之66位開始且於76位結束之序列- 或於SEQ ID NO：2之109位開始且於117位結束之序列。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含至少一個彼此獨立地選於如以下所闡述之CDR之群中之CDR：- 於SEQ ID NO：1之45位開始且於54位結束之序列，- 於SEQ ID NO：1之66位開始且於87位結束之序列，- 於SEQ ID NO：1之117位開始且於126位結束之序列，- 於SEQ ID NO：2之44位開始且於56位結束之序列，- 於SEQ ID NO：2之66位開始且於76位結束之序列及- 於SEQ ID NO：2之109位開始且於117位結束之序列。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含如以下所闡述之CDR：- 於SEQ ID NO：1之45位開始且於54位結束之序列，- 於SEQ ID NO：1之66位開始且於87位結束之序列，- 於SEQ ID NO：1之117位開始且於126位結束之序列，- 於SEQ ID NO：2之44位開始且於56位結束之序列，- 於SEQ ID NO：2之66位開始且於76位結束之序列及- 於SEQ ID NO：2之109位開始且於117位結束之序列。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含至少一個包含如SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10中之任一者中所闡述之胺基酸序列之CDR。
根據較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含含有如SEQ ID NO：5、6、7、8、9或10中所闡述之胺基酸序列之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至
人類CSF-1R之抗體，且包含(i)至少一個包含如SEQ ID NO：11、12或13中之任一者中所闡述之胺基酸序列之CDR；或(ii)至少一個包含如SEQ ID NO：14、15或16中之任一者中所闡述之胺基酸序列之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含含有如SEQ ID NO：11、12、13、14、15或16中所闡述之胺基酸序列之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含(i)至少一個包含如SEQ ID NO：17、18或19中之任一者中所闡述之胺基酸序列之CDR；或(ii)至少一個包含如SEQ ID NO：20、21或22中之任一者中所闡述之胺基酸序列之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含至少一個包含如SEQ ID NO：17、18、19、20、21或22中之任一者中所闡述之胺基酸序列之CDR。
根據一較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含含有如SEQ ID NO：17、18、19、20、21或22中所闡述之胺基酸序列之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區包含三個如SEQ ID NO：5、6及7中所闡述之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區包含三個如SEQ ID NO：8、9及10中所闡述之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區包含三個SEQ ID
NO：11、12及13中所闡述之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區包含三個如SEQ ID NO：14、15及16中所闡述之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區包含三個如SEQ ID NO：17、18及19中所闡述之CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區包含三個如SEQ ID NO：20、21及22中所闡述之CDR。
根據一較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區包含三個如SEQ ID NO：3中所闡述之胺基酸序列。
在更佳實施例中，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區係如SEQ ID NO：3中所闡述。
在另一較佳實施例中，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其中該可變區包含如SEQ ID NO：4中所闡述之胺基酸序列。
在另一更佳實施例中，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含可變區，其中該可變區係如SEQ ID NO：4中所闡述。
根據較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含：- 包含三個如SEQ ID NO：5、6及7中所闡述之CDR之可變區，及- 包含三個如SEQ ID NO：8、9及10中所闡述之CDR之可變區。
根據較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含：- 包含三個如SEQ ID NO：11、12及13中所闡述之CDR之可變區，及- 包含三個如SEQ ID NO：14、15及16中所闡述之CDR之可變區。
根據較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含：- 包含三個如SEQ ID NO：17、18及19中所闡述之CDR之可變區，及- 包含三個如SEQ ID NO：20、21及22中所闡述之CDR之可變區。
根據較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含：- SEQ ID NO：3中所闡述之可變區及- SEQ ID NO：4中所闡述之可變區。
根據較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含：(i)包含以下之重鏈可變區：- 於SEQ ID NO：1之45位開始且於54位結束之序列中所定義之CDR1，- 於SEQ ID NO：1之66位開始且於87位結束之序列中所定義之CDR2及- 於SEQ ID NO：1之117位開始且於126位結束之序列中所定義之CDR3；及
(11)包含之輕鏈可變區：
- 於SEQ ID NO：2之44位開始且於56位結束之序列中所定義之CDR1，- 於SEQ ID NO：2之66位開始且於76位結束之序列中所定義之CDR2及- 於SEQ ID NO：2之109位開始且於117位結束之序列中所定義之CDR3。
熟習此項技術者可藉由使用Chothia及Lesk,1987,J.Mol.Biol.,196,901-917或Kabat及Wu,1991,J.of Immunology,147,1709-1719或Lefranc and al.,2003,Development and Comparative Immunology,27,55-77或Lefranc等人，1999,Nucleic Acid Research,27,209-212之熟知教示容易地在一已知抗體胺基酸序列中界定CDR。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含(i)包含三個如SEQ ID NO：5、6及7中所闡述之CDR之重鏈可變區，及(ii)包含三個如SEQ ID NO：8、9及10中所闡述之CDR之輕鏈可變區。
根據另一實施例，本發明抗體特異性結合至CSF-1R，且包含(i)包含三個如SEQ ID NO：11、12及13中所闡述之CDR之重鏈可變區，及(ii)包含三個如SEQ ID NO：14、15及16中所闡述之CDR之輕鏈可變區。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含(i)包含三個如SEQ ID NO：17、18及19中所闡述之CDR之重鏈可變區，及(ii)包含三個如SEQ ID NO：20、21及22中所闡述之CDR之輕鏈可變區。
根據較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，且包含(i)如SEQ ID NO：3中所闡述之重鏈可變
區及(ii)如SEQ ID NO：4中所闡述之輕鏈可變區。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含：
(a)由下式定義之第一可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1具有至少5個連續胺基酸，且定義於在SEQ ID NO：1之45位開始且於54位結束之序列中；CDR2具有至少5個連續胺基酸，且定義於在SEQ ID NO：1之66位開始且於87位結束之序列中；且CDR3具有至少5個連續胺基酸，且定義於在SEQ ID NO：1之117位開始且於126位結束之序列中；及
(b)由下式定義之第二可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1具有至少5個連續胺基酸，且定義於在SEQ ID NO：2之44位開始且於56位結束之序列中；CDR2具有至少5個連續胺基酸，且定義於在SEQ ID NO：2之66位開始且於76位結束之序列中；且
CDR3具有至少5個連續胺基酸，且定義於在SEQ ID NO：2之109位開始且於117位結束之序列中。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含：
(a)由下式定義之第一可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：5、11及17；CDR2具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：6、12及18；且CDR3具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：7、13及19；及
(b)由下式定義之第二可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：8、14及20；CDR2具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：9、
15及21；且CDR3具有選自由以下組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：10、16及22。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含以下(i)、(ii)或(iii)中之任一者：
(i)
(a)由下式定義之第一可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1係如SEQ ID NO：5中所闡述；CDR2係如SEQ ID NO：6中所闡述；且CDR3係如SEQ ID NO：7中所闡述；及
(b)由下式定義之第二可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1係如SEQ ID NO：8中所闡述；CDR2係如SEQ ID NO：9中所闡述；且CDR3係如SEQ ID NO：10中所闡述；或
(ii)(a)由下式定義之第一可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1係如SEQ ID NO：11中所闡述；CDR2係如SEQ ID NO：12中所闡述；且CDR3係如SEQ ID NO：13中所闡述；及
(b)由下式定義之第二可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1係如SEQ ID NO：14中所闡述；CDR2係如SEQ ID NO：15中所闡述；且CDR3係如SEQ ID NO：16中所闡述；或
(iii)(a)由下式定義之第一可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：
CDR1係如SEQ ID NO：17中所闡述；CDR2係如SEQ ID NO：18中所闡述；且CDR3係如SEQ ID NO：19中所闡述；及
(b)由下式定義之第二可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1係如SEQ ID NO：20中所闡述；CDR2係如SEQ ID NO：21中所闡述；且CDR3係如SEQ ID NO：22中所闡述。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含：- 包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之第一可變區；及- 包含SEQ ID NO：4之胺基酸序列之第二可變區。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含：- 包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列之第一可變區；及- 包含SEQ ID NO：2之胺基酸序列之第二可變區。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含：- 選於存在於SEQ ID N0：24及SEQ ID NO：25中之群中之重鏈，及- 選於存在於SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27及SEQ ID NO：28
中之群中之輕鏈。
根據另一實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含：- 選於存在於SEQ ID NO：29及SEQ ID NO：30中之群中之第一可變區；及- 選自由SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32及SEQ ID NO：33組成之群中之第二可變區。
根據一較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含(a)存在於SEQ ID NO：24中之重鏈及(b)存在於SEQ ID NO：26中之輕鏈。
根據另一較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含(a)存在於SEQ ID NO：25中之重鏈及(b)存在於SEQ ID NO：27中之輕鏈。
根據一有利實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含(a)存在於SEQ ID NO：24中之重鏈及(b)存在於SEQ ID NO：28中之輕鏈。該單株抗體之實例係單株抗體H27K15。
根據一較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含(a)存在於SEQ ID NO：29中之第一可變區及(b)存在於SEQ ID NO：31中之第二可變區。
根據另一較佳實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含(a)存在於SEQ ID NO：30中之第一可變區及(b)存在於SEQ ID NO：32中之第二可變區。
根據一有利實施例，該能夠結合至CSF-1R之抗體係特異性結合至人類CSF-1R之抗體，其包含(a)存在於SEQ ID NO：29中之第一可變區及(b)存在於SEQ ID NO：33中之第二可變區。該單株抗體之實
例係單株抗體H27K15。
本發明之抗體、更具體而言人類抗體可具有不同同型，例如IgG、IgA、IgM或IgE。在較佳實施例中，本發明之抗體、更具體而言人類抗體係IgG。
本發明抗體可經糖基化或未經糖基化。
本文中所使用之術語「糖基化」係指共價附接至抗體之碳水化合物單元之存在。
根據具體實施例，本發明係關於活體內或離體生成樹狀細胞之方法，此藉由使適宜前驅細胞、通常單核球或其前驅細胞暴露至有效劑量之能夠結合至CSF-1R之抗體中來達成。可活體內或離體接觸細胞。
出於離體目的，可使有效劑量之能夠結合至CSF-1R之抗體與細胞接觸約6小時、約12小時、約24小時、約48小時或更久之時間。可將細胞維持於離體培養中1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更多天。
前驅細胞可自淋巴組織獲得，包括骨髓、血液、動員外周血液、脾、淋巴結及臍帶血。前驅細胞(例如單核球、單核球前驅細胞或包含單核球及/或單核球前驅細胞之複合群體)可處於各種發展狀態，例如幹細胞、骨髓定向祖細胞、單核球等。
出於活體內目的，劑量可根據遞送途徑、患者體型、狀況、抗原及諸如此類而變。投與可靶向於(例如)受感染病灶、腫瘤、肺、皮膚等，或可為全身性的，例如肌內、靜脈內、腹膜內、真皮內、經口等。
投與可與所關注抗原組合於共調配物中或分開的並行調配物中。能夠結合至CSF-1R之抗體之投與可視需要(例如，每半天、每天、每半周等)重複投與1次、2次、3次、4次、5次、6次或更多次。
可通常經血管內於任何生理上可接受之培養基中向個體投與藉由本發明方法離體生成之DC，但亦可將其引入至靶向位點中，其中該等細胞回至發炎位點。所投與細胞之量可視所治療疾病之性質及/或所關注抗原而在寬範圍內變化。由此，所投與DC之量可包括至少約1×105個DC、至少約1×106個DC、至少約1×107個DC、至少約1×108個DC、至少約1×109個DC或更多。另外，可以單一劑量或定時間隔投與DC。可藉由注射、導管或諸如此類引入該等細胞。可將該等細胞冷凍於液氮溫度下，並長時期儲存，從而能夠解凍使用。
特別感興趣之使用本發明離體方法之條件涉及缺乏對抗原之T細胞介導之反應(例如，慢性病毒或細菌感染)、缺乏對腫瘤抗原之免疫反應及諸如此類。在本發明之一態樣中，該抗原係腫瘤抗原，且用於增強對體內存在之腫瘤細胞之宿主免疫反應。
本發明方法、尤其藉由使適宜前驅細胞、通常單核球或其前驅細胞暴露至有效劑量之能夠結合至CSF-1R之抗體中來活體內生成樹狀細胞之彼等進一步用於治療與不期望巨噬細胞分化及/或M2極化相關且與CSF-1R相關之病狀。本發明方法係用於治療涉及癌症誘導之免疫阻抑且與CSF-1R相關之疾病。
本發明之罹患與不期望M2巨噬細胞極化相關之病狀之患者指定癌症、尤其轉移性癌症、進行性纖維變性疾病(例如，自發性肺纖維化(IPF)、肝纖維化或全身性硬化症(Wynn及Barron,2010,Semin.Liver Dis.,30,245))、過敏及氣喘、動脈粥樣硬化及阿茲海默氏病(Altzheimer's disease)。
根據另一實施例，本發明係關於如下方法：在罹患癌症之患者中驅動單核球或其前驅細胞向DC、且視情況M1型巨噬細胞(M1極化)分化，以刺激免疫反應並抑制M2型巨噬細胞(M2極化)驅動之免疫反應。
根據另一實施例，本發明係關於如下方法：在罹患進行性纖維變性疾病之患者中驅動單核球或其前驅細胞向DC、且視情況M1型巨噬細胞(M1極化)分化，以刺激免疫反應並抑制M2型巨噬細胞(M2極化)驅動之免疫反應。
根據另一實施例，本發明係關於如下方法：在罹患過敏之患者中驅動單核球或其前驅細胞向DC、且視情況M1型巨噬細胞(M1極化)分化，以刺激免疫反應並抑制M2型巨噬細胞(M2極化)驅動之免疫反應。
根據另一實施例，本發明係關於如下方法：在罹患氣喘之患者中驅動單核球或其前驅細胞向DC、且視情況M1型巨噬細胞(M1極化)分化，以刺激免疫反應並抑制M2型巨噬細胞(M2極化)驅動之免疫反應。
本文中所使用之術語「癌症」係指(但不限於)腺癌、腺泡細胞腺癌、腎上腺皮質癌瘤、肺泡細胞癌瘤、未分化癌瘤、基底細胞樣癌瘤、基底細胞癌瘤、枝氣管癌瘤、枝氣管源癌瘤、腎岩癌瘤(renaladinol carcinoma)、胚癌瘤、子宮內膜癌(anometroid carcinoma)、纖維板層型肝細胞癌瘤、濾泡癌瘤、巨細胞癌瘤、肝細胞癌瘤、表皮內癌瘤、上皮內癌瘤、軟腦膜癌瘤、髓質癌瘤、黑色素癌瘤、腦膜癌瘤、中後腎性癌(mesometonephric carcinoma)、燕麥狀細胞癌瘤、鱗狀細胞癌瘤(squamal cell carcinoma)、汗腺癌瘤、移行細胞癌瘤、腎小管細胞癌瘤、成釉細胞肉瘤、血管結石性肉瘤、葡萄形肉瘤、子宮內膜基質肉瘤、尤因肉瘤(ewing sarcoma)、纖維束肉瘤、巨細胞肉瘤、顆粒球性肉瘤(granulositic sarcoma)、免疫母細胞肉瘤、近皮質骨源性肉瘤(juxaccordial osteogenic sarcoma)、矮林肉瘤(coppices sarcoma)、白血球肉瘤(白血病)、淋巴肉瘤(lymphatic sarcoma、lympho sarcoma)、髓質肉瘤、骨髓肉瘤(顆粒球性肉瘤)、聲
源性肉瘤(austiogenci sarcoma)、骨膜肉瘤、網狀細胞肉瘤(組織細胞性淋巴瘤)、圓細胞肉瘤、紡錘狀細胞肉瘤、滑膜肉瘤、毛細管聽覺肉瘤、勃兒基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、NPDL、NML、NH及彌漫性淋巴瘤。根據較佳實施例，本發明之方法係關於骨轉移性癌症之治療，其中轉移性癌症係乳癌、肺癌、腎癌、多發性骨髓瘤、甲狀腺癌、前列腺癌、腺癌；血液細胞惡性腫瘤，包括白血病及淋巴瘤；頭頸癌；腸胃癌，包括食道癌、胃癌、結腸癌、腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胰臟癌、肝癌、膽管癌或膽囊癌；女性生殖道之惡性腫瘤，包括卵巢癌瘤、子宮內膜癌、陰道癌及宮頸癌；膀胱癌；腦癌，包括神經胚細胞瘤；肉瘤、骨肉瘤；及皮膚癌，包括惡性黑色素瘤或鱗狀細胞癌。
本發明進一步係關於改良經受利用癌症治療劑之化學療法治療之癌症患者之治療的方法，其包含連同上文所揭示之方法共同治療該患者。
本發明進一步係關於改良經受利用癌症治療疫苗之免疫療法治療之癌症患者之治療的方法，其包含連同上文所揭示之方法一起共同治療該患者。根據較佳實施例，該癌症治療疫苗係基於病毒之治療疫苗。更佳地該基於病毒之治療疫苗係基於MVA之治療疫苗。甚至更佳地，該基於MVA之治療疫苗攜帶並表現人類乳頭狀瘤病毒16(HPV16)E6及E7腫瘤蛋白及人類介白素-2(例如TG4001產物)，或表現Muc1抗原及人類介白素-2(例如TG4010產物)。
本發明進一步包括治療後監測分析，此在向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體後進行，以評估該治療之效力及/或評價該治療之臨床結果。
監測分析包括(但不限於)針對由DC、且視情況M1型或M2極化之巨噬細胞表現及/或分泌之循環因子之分析。
巨噬細胞M2型極化狀態中所表現之因子包括(但不限於)IL-10、IL-6及MCP-1。亦可藉由(例如)量測IL-12含量、更特定而言IL-12 P70形式含量來分析DC、且視情況M1型(巨噬細胞M1極化)狀態中所表現之因子。在患者中驅動單核球或其前驅細胞向DC、且視情況M1型巨噬細胞(M1極化)並遠離M2型巨噬細胞(M2極化)分化以刺激免疫反應可藉由量測在向患者投與本發明之能夠結合至CSF-1R之抗體後IL12/IL10比率之增加來瞭解。
該等測試可源自患者之血清、血液、組織等。
本發明進一步包括治療後監測分析，此在向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體後進行，以監測單核球或其前驅細胞分化並確立及/或維持適當劑量方案。
在此情形下，藉由如下方式可獲得基線含量：直接或藉助由活化巨噬細胞表現及/或分泌之因子分析組織中樹狀細胞(DC)、巨噬細胞M1及/或M2之存在，且然後在治療期間投與能夠結合至CSF-1R之抗體後一或多次監測組織(腫瘤或正常組織)中DC及/或M1對M2巨噬細胞之存在。然後可確定將導致自M2型巨噬細胞向DC及/或M1型巨噬細胞反應偏移之治療之最佳化劑量。
本發明提供使用生物標記(biological marker、biomarker)評估涉及向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體之治療之效力的材料及方法，該等生物標記已確定為與期望免疫反應相關之實質上可靠之特徵。生物標記存在於自患者獲得之生物樣品中。在起始治療後不久預測其臨床結果之能力將使內科醫師及患者能夠鑑別無效療法，做出關於治療過程之精明決定，包括放棄還是允許替代療法實施方案。
本發明提供評估涉及對患者之能夠結合至CSF-1R之抗體之治療之效力的離體方法。
根據本發明，術語「評估」應理解為「監測、改善或調節」涉及向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體之治療。
在某些態樣中，該方法包括基於在免疫療法治療後患者中干擾素γ之含量評估能夠結合至CSF-1R之抗體之效力。
該等監測分析包括(但不限於)對由DC及/或M1及/或M2型之巨噬細胞表現及/或分泌之循環因子之分析。
巨噬細胞M2型極化狀態中所表現之因子包括(但不限於)IL-6、MMP9及MCP-1。亦可藉由(例如)量測IL-12含量、更特定而言IL-12 P70形式含量或IL-12/IL-10比率來分析巨噬細胞M1型極化狀態中所表現之因子。
在某些態樣中，該方法包括在向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體後量測患者之介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量；及基於介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量評估該治療之效力。
在某些態樣中，該方法包括在向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體後若干週至少一次量測患者之介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量；及基於介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量評估免疫療法治療之效力。
在某些態樣中，該方法可進一步包括在投與能夠結合至CSF-1R之抗體之前量測患者之介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量。根據較佳實施例，在該投與能夠結合至CSF-1R之抗體之前所量測的患者之介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量之值係本發明之「截止值」。
能夠結合至CSF-1R之抗體之投與與介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1量測之間之時間可為1天至約48週或更久(例如約1天至約1週、約1週至約2週、約2週至約4週、約4週至約8週、約8週至
約12週、約12週至約16週、約16週至約24週、約24週至約48週或更久)。在本發明之較佳實施例中，時間間隔為約5週。類似地，額外量測(即，第三次、第四次、第五次等量測)可在第二次量測後以類似時間間隔進行。
在相關態樣中，該方法包括在向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體後測定患者中之介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量；將該等含量與截止值比較；及基於與「截止值」相比之介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量評估免疫療法治療之效力。
根據具體實施例，本發明係關於評估涉及向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體之之效力治療的方法，其包含：(i)向該個體投與一或多個劑量之該能夠結合至CSF-1R之抗體；(ii)在至少一次該投與後量測該個體體內之介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1含量。
根據本發明之替代實施例，本發明之方法進一步包含存在於在投與能夠結合至CSF-1R之抗體之前量測患者體內之介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1含量中之初始步驟。
根據本發明，在自患者獲得之生物樣品中量測介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量。生物樣品包括(但不限於)血液、血清、組織及生物來源之其他液體樣品、實體組織樣品(例如生檢試樣)。在較佳實施例中，生物樣品係血液、血漿或血清，在此情形下自患者獲得樣品係相對簡單且非侵襲性之程序。獲得血液或血清之方法為業內熟知且並非本發明之一部分。
另外，已知許多檢測及量化聚肽之方法(包括本發明生物標記)。該等方法包括(但不限於)基於抗體之方法、更具體而言基於單株抗體之方法。檢測及量化生物標記之特定方法對於本發明並不重要。例
如，本發明之材料及方法可利用Luminex技術(Luminex公司，Austin，Tex.)或酶聯免疫吸附分析(ELISA，許多ELISA套組由(例如)CliniScience,Diaclone,Biosource售出)使用。
根據本發明之一實施例，藉由使用抗體測定介白素-6、介白素-12、MMP9及/或MCP-1之含量。
根據本發明之一具體實施例，該或該等抗體對介白素-6、介白素-12、MMP9或MCP-1具有特異性。
根據本發明之一具體實施例，該等抗體係單株抗體。
根據本發明之一具體實施例，該等抗體係藉由(例如)螢光、放射性標記、酶、生物素或經設計以使得經該等抗體標記之細胞可檢測的任何其他方法標記。該等技術為業內廣泛使用並已知。
當在投與能夠結合至CSF-1R之抗體後在患者中所量測之介白素-6、MMP9及/或MCP-1之含量分別低於在該投與之前在患者中所量測之介白素-6及/或MCP-1之含量(即截止值)時，將認為本發明之免疫療法治療有效。
或者，當在投與能夠結合至CSF-1R之抗體後在患者中所量測之介白素-12之含量高於在該投與前在患者中所量測之介白素-12之含量(即截止值)時，將認為本發明之免疫療法治療有效。
本發明進一步包括治療後監測分析，此在向患者投與能夠結合至CSF-1R之抗體後進行，監測巨噬細胞極化並確立及/或維持恰當劑量方案。
在此情形下，可藉由如下方式獲得基線含量：直接或藉助由活化巨噬細胞表現及/或分泌之因子分析循環中DC及/或M1及/或M2巨噬細胞之存在，且然後在治療期間投與能夠結合至CSF-1R之抗體後一或多次監測循環中巨噬細胞之存在。
然後可確定將導致單核球或其前驅細胞分化自M2型巨噬細胞向
DC及/或M1型巨噬細胞偏移以(特別地)刺激免疫反應之治療之最佳化劑量。
本發明方法係用於治療涉及發炎且與CSF-1R相關之疾病。
在整個研究中使用以下市售單株抗體：抗人類CD115 mAb 2-4A5-4(大鼠IgG1,κ,Santa Cruz)、9-4D2(大鼠IgG1,Biolegend)及同型對照大鼠IgG1(R&D Systems)。mAb 1.2 SM係專利申請案WO 2009/026303中所公佈之序列1.2 SM之抗CD115 mAb。自Roche獲得利妥昔單抗。在Transgene藉由單株抗體之胃蛋白酶消化、接著藉由凝膠過濾之純化產生F(ab')2。
由Etablissement Français du Sang(EFS,Strasbourg)提供膚色血球層。藉由離心在聚蔗糖梯度上獲得外周血液單核細胞(PBMC)。藉由使用塗覆CD14-抗體之珠粒(Miltenyii)進行免疫磁珠細胞分選來純化單核球。富含單核球之懸浮液係超過95%純。在48孔板(3×105細胞/孔)中於補充有10%熱不活化胎牛血清及1%三抗生素混合物(青黴素、鏈黴素、新黴素)之RPMI-GlutamaxTM培養基中使單核球分化6天。在第0天至第3天於細胞培養培養基中添加GM-CSF(10ng/ml)。在第0天添加H27K15、其他抗體或內部對照GW2580(LC Labs)。在分離後第3天，用PBS洗滌單核球，並進一步於補充有CSF-1(10ng/ml)及GM-CSF(2ng/ml)之培養基中在抗體或GW2580之存在或不存在下培養。在第6天，收集上清液並儲存於-20℃下。自塑膠分離細胞，且藉由IC/FC(免疫細胞化學/流式細胞術)分析一式三份池之細胞大小以及FcγR及CD86之表現。藉由多工(Bioplex,Bio-Rad)或藉由ELISA量化培養物上清液中之細胞因子及趨化因子。
為研究mAb H27K15是否可影響巨噬細胞分化，在已知分別誘導M1-及M2型巨噬細胞之GM-CSF及CSF-1之存在下將經純化CD14+單核球培養7天(Akagawa K.S.，2002；Verreck F.A.等人，2004)。在培養開始時並在3天後再次將三種不同劑量之mab H27K15或同型對照利妥昔單抗(0.1μg/ml；1μg/ml或10μg/ml)添加至培養培養基中。以相等莫耳濃度平行測試自H27K15或利妥昔單抗生成之F(ab')2。測試自mAb 1.2 SM(WO 2009/026303)生成之F(ab')2用以與源自H27K15或利妥昔單抗之F(ab')2相比較。分析人類CD115之已知阻斷mAb 2-4A5或非阻斷mAb 9-4D2(Sherr C.J.等人，1989)，並與同型對照大鼠IgG1相比較。作為另一對照，將小分子CD115酪胺酸激酶抑制劑GW2580以1μM(先前顯示抑制人類單核球的CSF-1依賴性增殖及活體外鼠類巨噬細胞之分化之濃度)添加至一些培養物中(Conway J.G.等人，2005；Paniagua R.T.等人，2010)。
第6天培養物之顯微鏡觀測顯示在用H27K15、利妥昔單抗、mAb 9-4D2、IgG1、H27K15 F(ab')2或利妥昔單抗F(ab')2處理之孔間、與未經處理細胞相比較無明顯差異，此與血液供體無關。對於用mAb SM1.2 F(ab')2處理之孔，針對3個所評價劑量(0.066μg/ml、0.66μg/ml及6.6μg/ml)所有供體均觀測到完全細胞毒性。對於用mAb 2-4A5處理之孔，在2個所測試之最高劑量(1μg/ml及10μg/ml)下所有供體均觀測到完全細胞毒性。對於最低劑量(0.1μg/ml)，僅存在部分細胞毒性。該等結果合起來並不揭露任何抗體的任何毒性，mAb SM1.2 F(ab')2及mAb 2-4A5除外。對於利用1μM(取決於顯微鏡視野)對照GW2580之細胞，相對細胞毒性係顯現為碎片，且在所有血液供體中觀測到較低細胞密度。在第6天藉由對該板之每一孔中之5個顯微鏡視
野(一個視野在該孔中心且四個視野在該孔之中心與側面間的中間距離處)進行計數來分析細胞活力。基於以上觀測，亦對經呈現部分或完全細胞毒性之化合物(mAb SM1.2 F(ab')2、mAb 2-4A5及GW2580)處理之孔進行記數。圖1顯示藉由個別孔±標準偏差計數之5個視野之平均值。一些抗體呈現部分或完全細胞毒性。因此，與各別對照相比較，源自mAb SM1.2之F(ab')2在所有濃度下誘導大量細胞死亡，且mAb 2-4A5亦顯著減少巨噬細胞數量。在GW2580之存在下，與未經處理培養物相比較，在第6天保持大約70%之巨噬細胞數量。
藉由IC/FC針對活化FcγR CD64(FcγRI)及活化標記CD86之表面表現分析第6天培養物。如圖2上所顯示，在用H27K15或GW2580處理時CD64之表面表現大幅減少。在所測試之所有劑量下，H27K15幾乎完全抑制CD64表現。大鼠抗人類CD115 mAb 2-4A5亦降低表面CD64表現，但係呈劑量依賴性方式。非CD115阻斷mAb 9-4D2並未改善CD64表現水平。令人感興趣的，源自H27K15之F(ab')2亦下調CD64表現，但相比於完全mAb效力較低且僅當在1μg/ml或10μg/ml下測試時如此，此表明H27K15之效應為部分Fc依賴性的。
當在第6天巨噬細胞中分析活化標記/共刺激分子CD86之表現時，發現用mAb H27K15或GW2580處理之培養物中已出現由CD86bright SSClow表現型表徵之細胞子群(圖3)。利用源自H27K15之F(ab')2未觀測到此表現高含量CD86之圓形細胞群體之誘導，此表明在此現象中對H27K15 Fc區之作用。針對此群體之門控顯示CD86bright SSClow細胞主要為CD64low至CD64陰性(數據未顯示)。
於第6天培養物上清液中滴定IL-12p70及IL-10。來自3種所測試供體之巨噬細胞在利用人類IgG1利妥昔單抗培養或不利用試劑培養後不產生任何可檢測IL-12p70。在mAb H27K15之存在下之培養誘導來自3種血液供體中之2種之巨噬細胞的IL-12p70分泌。相比之下，IL-
12p70在利用GW2580處理後為不可檢測的(圖4)。由來自所有供體之靜息巨噬細胞產生之IL-10在來自供體1之巨噬細胞中因H27K15而上調，但在供體2中並不上調，且在供體3中僅略有增加。因此，IL-12p70/IL-10比率在3種所測試血液供體中上調(圖4，右圖)。小分子GW2580亦增加IL-12p70/IL-10比率，但歸因於IL-10產生之抑制。
該等結果顯示，利用分化巨噬細胞上之mAb H27K15靶向CD115不僅大幅下調CD64/FcγRI之表現，且亦誘導表現高含量CD86活化標記之SSClow細胞群體。另外，H27K15可在所有供體中誘導IL-12p70產生，並上調IL-12p70/IL-10比率，此指示巨噬細胞向M1型極化。
顯著地，發現當使巨噬細胞在mAb H27K15或GW2580之存在下分化時，趨化因子MCP-1/CCL2之產生幾乎受到完全阻抑(圖5，上圖)。H27K15之MCP-1分泌之抑制在3種所測試供體中係有效的，並在74%至99%範圍內。小分子GW2580與H27K15一樣有效阻抑MCP-1產生。第6天巨噬細胞培養物上清液中之IL-6之含量在所有供體中亦因H27K15或GW2580而減少(圖5，下圖)。IL-6產生之抑制在H27K15(27%至70%)之情況下相比於在GW2580(75%至96%)之情況下較不明顯。巨噬細胞MCP-1及IL-6產生(M2巨噬細胞極化所涉及之兩種可溶因子)之H27K15介導之抑制(Roca H.等人，2009)係指示抗CD115 mAb使巨噬細胞向M1再極化之另一證據。
已知腫瘤相關巨噬細胞產生MMP-9(基質金屬蛋白酶9)，其促進藉由降解細胞外基質達成之腫瘤細胞轉移及藉由誘導腫瘤微環境中之VEGF釋放達成之新血管形成二者。由巨噬細胞產生之MMP-9係腫瘤中血管形成開關之主要調節劑。
使來自3種不同供體之CD14+單核球在GM-CSF及CSF-1二者(已知
誘導巨噬細胞分別向M1-及M2型分化)之存在下分化。將MAb H27K15或利妥昔單抗(用作陰性對照)以0.1μg/ml、1μg/ml或10μg/ml添加至培養物中。平行分析等莫耳濃度之源自兩種mAb之F(ab)'2。在相同分析中測試先前顯示抑制人類單核球之CSF-1依賴性殖及活體外鼠類巨噬細胞之分化之酪胺酸激酶抑制劑GW2580。在培養6天後，藉由ELISA於上清液中量測MMP-9濃度(圖6)。在3種所測試供體中之2種中，當用mAb H27K15或GW2580處理培養物時，MMP-9產生出現劑量依賴性降低。利用源自H27K15之F(ab)'2，在相同的2種供體中存在抑制效應。因此，mAb H27K15能夠降低分化M2巨噬細胞之MMP-9分泌。
巨噬細胞培養物中之觀測該等表明向癌症患者投與之H27K15可下調腫瘤微環境中之MMP-9濃度。
血紅素清道夫受體(CD163)已鑑別為M2極化之巨噬細胞之標記，其由TAM、特別地於乳癌中表現。藉由流式細胞術於利用GM-CSF及CSF-1培養之第6天源自人類單核球之巨噬細胞中分析CD163之表面表現。圖7顯示經分化培養物中CD163陽性細胞之百分比。利用mAb H27K15之培養在所有3種所測試供體中抑制CD163+巨噬細胞群之分化。在1μg/ml H27K15之存在下，與用利妥昔單抗處理之對照培養物相比較CD163陽性細胞之百分比降低至2/5至1/4。GW2580在僅2/3供體中具有相同效應。源自H27K15之F(ab)'2對CD163表現具有較弱效應或無效應，此指示抗CD115 mAb之Fc區參與其作用模式。
如藉由表面CD163表現之該等變化所證明且與先前結果一致，利用mAb H27K15靶向CD115抑制M2型巨噬細胞之分化。
在利用GM-CSF及CSF-1在mAb H27K15或利妥昔單抗之存在或不
存在下培養之源自單核球之細胞中分析M1與M2巨噬細胞間之比率。在將來自3種不同血液供體之細胞培養6天後，藉由流式細胞術量化M1(CD14+CD163-)對M2(CD14+CD163+)巨噬細胞。圖8顯示在CD14+巨噬細胞群中針對每一培養條件所計算之M1/M2巨噬細胞比率。與相同濃度之對照IgG1利妥昔單抗或未經處理培養物相比較，1μg/ml之MAb H27K15增加來自3種所測試供體之巨噬細胞中之M1/M2比率。
針對單核球-巨噬細胞標記CD14以及CD163及CD206(M2型巨噬細胞之常見標記)之表現藉由FC分析在GM-CSF及CSF-1之存在下培養6天後所獲得之源自單核球之細胞的表現型(Porcheray等人，2005,Clin Exp Immunol.；142(3)：481-489.；Schmieder等人，2012.Semin Cancer Biol.；22(4)：289-297)。由於已報導CSF-1連同IL-6一起抑制DC之分化(Menetrier-Caux等人，1998,Blood.；92(12)：4778-4791)，故針對DC標記CD1a之細胞表面表現分析培養物。圖9A顯示儘管CD14+CD163+CD206+ M2-巨噬細胞在用H27K15處理之培養物中已消失，但伴隨誘導CD1a+CD14-細胞群體。圖9B顯示CD14+CD1a-對CD14-CD1a+群體之百分比，在第6天於來自3種不同血液供體之培養物中量測。在3/3供體中，在利用mAb H27K15之單核球分化後，CD1a+CD14-樹狀細胞代替CD1a-CD14+巨噬細胞。
該等結果顯示mAb H27K15可使M2極化之巨噬細胞之分化向DC偏移。
利用GM-CSF及CSF-1在mAb H27K15之存在下培養6天之單核球導致缺乏M2型巨噬細胞但包含DC之細胞群。已知在刺激T細胞反應反面DC或M1型巨噬細胞比M2極化之巨噬細胞強效(Chomarat等人，
2000,Nat Immunol.；1(6)：510-514；Duluc等人，2007 Blood.；110(13)：4319-4330)。因此測試在混合淋巴球反應(MLR)中第6天培養物刺激同種淋巴球增殖之能力。利用LPS將在利用mAb H27K15或利妥昔單抗培養後所獲得之源自單核球之細胞刺激48h，收穫，並與CFSE標記之同種PBMC共培養5天。藉由於CFSE-low細胞上門控來量測在共培養物中已增殖之PBMC之百分比使用FC。圖10顯示與利妥昔單抗相比較，在與在H27K15之存在下分化之單核球共培養時，增殖PBMC之百分比增加。
此結果顯示利用GM-CSF及CSF-1在mAb H27K15之存在下分化之單核球具有增加之誘導淋巴球增殖之能力，此與M2型巨噬細胞之抑制及DC之誘導相關。該等數據表明mAb H27K15可促進所治療患者中之免疫反應。
介白素-34(IL-34)已鑑別為另一CD115配體，其生物效應與CSF-1之彼等相當(Droin及Solary,2010,J；Leukoc Biol 87：745-7)。將經純化CD14+單核球培養於48孔或96孔板中補充有CSF-1或IL-34之培養基(50ng/ml,Peprotech)中。在第0天及第3天將MAb H27K15或利妥昔單抗添加至一些孔中。在第6天，對來自48孔板之培養物上清液取樣，且藉由ELISA(R&D Systems)滴定趨化因子MCP-1/CCL2。於96孔板中使用CellTiter-Glo®發光細胞活力分析(Promega)量測細胞活力。
圖11A顯示IL-34以及CSF-1能夠誘導單核球產生MCP-1/CCL2。與同型對照(利妥昔單抗)或未經處理培養物相比較，MAb H27K15在兩種培養條件中大幅減少趨化因子含量。此結果顯示mAb H27K15可抑制由CSF-1或IL-34達成之CD115刺激，並強效下調MCP-1/CCL2之產生。已知此趨化因子在M2極化之TAM之募集中起主要作用(Sica等人，2006,Eur J Cancer 42：717-27)。
MCP-1/CCL2產生之此抑制並非歸因於細胞毒性，如藉由細胞活力量測所顯示(圖11B)。如先前針對在GM-CSF及CSF-1之存在下分化之單核球所顯示(圖1及5)，mAb H27K15下調MCP-1產生，而不耗盡利用單獨CSF-1或IL-34培養之單核球。
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Claims (26)
- 一種能夠結合至人類群落刺激因子1受體(CSF-1R)之抗體之用途，其用於製造用以活體內生成樹狀細胞之醫藥，該活體內生成係藉由使單核球或其前驅細胞暴露至該醫藥來達成，其中該抗體與CSF-1配體部分地競爭結合至該人類CSF-1R受體，且其中該抗體包含：(a)由下式定義之第一可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1包含如SEQ ID NO：5中所述之胺基酸序列；CDR2包含如SEQ ID NO：6中所述之胺基酸序列；且CDR3包含如SEQ ID NO：7中所述之胺基酸序列；及(b)由下式定義之第二可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1包含如SEQ ID NO：8中所述之胺基酸序列；CDR2包含如SEQ ID NO：9中所述之胺基酸序列；且 CDR3包含如SEQ ID NO：10中所述之胺基酸序列。
- 如請求項1之用途，其中該醫藥在罹患與不期望巨噬細胞分化及M2極化相關之病狀之患者中增加樹狀細胞池。
- 如請求項1或2之用途，其中該醫藥降低巨噬細胞M2池。
- 如請求項1或2之用途，其中該醫藥進一步增加M1型巨噬細胞池。
- 如請求項1或2之用途，其中該醫藥抑制巨噬細胞巨噬細胞趨化蛋白1(MCP-1)、介白素10(IL10)及介白素-6(IL-6)產生。
- 如請求項1或2之用途，其中該醫藥下調巨噬細胞上之表面FcγRI(CD64)及FcγRIII(CD16)表現。
- 如請求項1或2之用途，其中該醫藥上調選自由血液樣品、血清樣品、組織樣品、生物來源之液體樣品及生檢試樣組成之群的患者樣品中之IL-12/IL10比率。
- 如請求項7之用途，其中該患者樣品係血液樣品。
- 如請求項1或2之用途，其中該醫藥減少以下各項中之至少一者：(i)腫瘤相關巨噬細胞(TAM)至腫瘤中之募集；(ii)至少一種巨噬細胞促腫瘤功能；(iii)腫瘤血管形成；(iv)腫瘤侵襲及轉移；(v)腫瘤生長；(vi)腫瘤細胞增殖。
- 如請求項2之用途，其中該等與不期望M2極化相關之病狀係選自由癌症、氣喘、過敏及進行性纖維化疾病組成之群中。
- 如請求項1或2之用途，其中該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係結合至至少一個位於SEQ ID NO：23之20位至41位胺基酸間之表 位的抗體。
- 如請求項1或2之用途，其中該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係結合至一個位於SEQ ID NO：23之20位至39位胺基酸間之表位、SEQ ID NO：23之胺基酸Asn72、Ser94-Ala95-Ala96、Lys102、Asp131-Pro132-Val133及Trp159的抗體。
- 如請求項1或2之用途，其中該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係不與IL-34配體競爭結合至CSF-1R受體之抗體。
- 如請求項1或2之用途，其中該能夠結合至人類CSF-1R之抗體包含(a)存在於SEQ ID NO：24中之重鏈及(b)存在於SEQ ID NO：28中之輕鏈。
- 一種用於活體外生成樹狀細胞之方法，其係藉由使單核球或其前驅細胞暴露至有效劑量之能夠結合至人類CSF-1R之抗體中來達成，其中該抗體與CSF-1配體部分地競爭結合至CSF-1R受體，且其中該抗體包含：(a)由下式定義之第一可變區FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1包含如SEQ ID NO：5中所述之胺基酸序列；CDR2包含如SEQ ID NO：6中所述之胺基酸序列；且CDR3包含如SEQ ID NO：7中所述之胺基酸序列；及(b)由下式定義之第二可變區 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4；其中：FR1、FR2、FR3及FR4各自為框架區；CDR1、CDR2及CDR3各自為互補決定區；其中：CDR1包含如SEQ ID NO：8中所述之胺基酸序列；CDR2包含如SEQ ID NO：9中所述之胺基酸序列；且CDR3包含如SEQ ID NO：10中所述之胺基酸序列。
- 如請求項15之方法，其中該方法降低巨噬細胞M2池。
- 如請求項15或16之方法，其中該方法進一步增加M1型巨噬細胞池。
- 如請求項15或16之方法，其中該方法抑制巨噬細胞MCP-1、IL10及IL-6產生。
- 如請求項15或16之方法，其中該方法下調巨噬細胞上之表面FcγRI(CD64)及FcγRIII(CD16)表現。
- 如請求項15或16之方法，其中該方法上調選自由血液樣品、血清樣品、組織樣品、生物來源之液體樣品及生檢試樣組成之群的患者樣品中之IL-12/IL10比率。
- 如請求項20之方法，其中該患者樣品係血液樣品。
- 如請求項15或16之方法，其中該方法減少以下各項中之至少一者：(vii)TAM至腫瘤中之募集；(viii)至少一種巨噬細胞促腫瘤功能；(ix)腫瘤血管形成；(x)腫瘤侵襲及轉移；(xi)腫瘤生長； (xii)腫瘤細胞增殖。
- 如請求項15或16之方法，其中該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係結合至至少一個位於SEQ ID NO：23之20位至41位胺基酸間之表位的抗體。
- 如請求項15或16之方法，其中該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係結合至一個位於SEQ ID NO：23之20位至39位胺基酸間之表位、SEQ ID NO：23之胺基酸Asn72、Ser94-Ala95-Ala96、Lys102、Asp131-Pro132-Val133及Trp159的抗體。
- 如請求項15或16之方法，其中該能夠結合至人類CSF-1R之抗體係不與IL-34配體競爭結合至CSF-1R受體之抗體。
- 如請求項15或16之方法，其中該能夠結合至人類CSF-1R之抗體包含(a)存在於SEQ ID NO：24中之重鏈及(b)存在於SEQ ID NO：28中之輕鏈。
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