TWI532842B

TWI532842B - 針對凝乳酶之適體及其用途

Info

Publication number: TWI532842B
Application number: TW099118847A
Authority: TW
Inventors: 中村義一; 金玲; 山崎聰子; 池田壽子; 村口正宏
Original assignee: 力博美科股份有限公司; 大塚製藥股份有限公司
Priority date: 2009-06-11
Filing date: 2010-06-10
Publication date: 2016-05-11
Also published as: MX2011013374A; CN102459588A; MY177984A; EP2441833A4; WO2010143714A1; AU2010259549A1; CO6480963A2; US9012420B2; ZA201109372B; CA2764472A1; UA107663C2; IL216865A0; TW201103983A; CN102459588B; RU2579667C2; AU2010259549B2; BRPI1010859A2; EP2441833A1; NZ597269A; JP5810356B2

Description

針對凝乳酶之適體及其用途

本發明關於針對凝乳酶之適體，及其使用方法等。

人類凝乳酶(EC. 3. 4. 21. 39)(類胰凝乳酶之絲胺酸蛋白酶)係儲存於肥大細胞分泌粒中。受到外部刺激後，肥大細胞立即經歷去粒作用，導致將人類凝乳酶以及廣泛種類的發炎媒介物釋出至細胞外。所釋出之人類凝乳酶專一性的辨識受質蛋白質與肽中所含之芳香胺基酸(例如苯丙胺酸與酪胺酸)，並切斷鄰接至該等胺基酸的肽鍵。人類凝乳酶之一種代表性受質為血管收縮素I(Ang I)。人類凝乳酶切斷Ang I而產生血管收縮素II(Ang II)(血管收縮因子)。

哺乳類凝乳酶於系統發生學上係分為二個亞科：α與β。靈長類(包括人類)只表現凝乳酶中的一種(屬於α科)。而囓齒類表現α與β兩科的凝乳酶。於小鼠中有複數種凝乳酶，其中之小鼠肥大細胞蛋白酶-4(mMCP-4)(屬於β科)，從其受質專一性與組織中的表現模式判斷，被認為是最與人類凝乳酶相關者。於倉鼠類中，倉鼠凝乳酶-1(也是β科的一員)係對應於人類凝乳酶。而mMCP-5與倉鼠凝乳酶-2(彼等如同人類凝乳酶屬於α科)具有類彈性蛋白酶活性，彼等就受質專一性來說係與人類凝乳酶不同。

凝乳酶係與轉形生長因子β(TGF-β)的活化極度相關。TGF-β(潛伏性TGF-β)以潛伏型式存在於上皮細胞與真皮細胞附近之細胞間基質中，並透過巨大潛伏性TGF-β結合蛋白(LTBP)而留在細胞間基質中。當被要求且活化後，TGF-β從細胞間基質釋出，且經活化之TGF-β對活有機體為具最重要地位之細胞素，據報導涉及細胞增生與分化以及組織損傷後的組織修復與再生。其訊息的失效導致廣泛種類疾病的發作與發展。據信，於此過程中凝乳酶涉及將潛伏性TGF-β自細胞間基質釋出以及將潛伏性TGF-β轉換成活性TGF-β。

已知凝乳酶與大範圍疾病有關，包括纖維化症、心血管疾病、發炎、過敏性疾病及器官黏連。纖維化症為一種以下述為特徵的病：於肺、心、肝、腎、皮膚等之細胞外物質係不正常代謝，其導致過量沉積結締組織蛋白質。例如，於肺纖維化症中，結締組織蛋白質(例如膠原蛋白)係過量沉積於肺中，導致肺胞費力收縮並接著發生呼吸性窘迫。已顯示肺纖維化症導因於塵肺症(係因暴露於大量塵埃所致)、藥物引起的肺炎(係因使用例如抗癌劑之藥物所致)、過敏性肺炎、肺結核、自體免疫疾病(例如膠原病)、等。然而、仍有不少原因未知的例子。

纖維化症於分子層級的發症機制尚未被徹底闡明。一般來說，於正常狀態下，纖維原母細胞的增生與功能受到良好控制。然而，在嚴重或持續發炎或損傷下，組織修復機制會過度工作，導致纖維原母細胞的不正常增生與結締組織蛋白質的過度製造。已知TGF-β為造成這些現象的因子。至於暗示此相關連的證據，已報導投藥抗-TGF-β中和抗體至纖維化症的動物模型導致膠原蛋白表現降低，並顯著抑制纖維化症。自發性肺纖維化症病患中，已觀察到TGF-β的量增加以及凝乳酶-陽性(chymase-positive)肥大細胞的計數提升。

同時，凝乳酶於纖維化症之相關性已藉由使用動物模型的實驗證實。在博來黴素引起的肺纖維化症的倉鼠模型中，促進之凝乳酶活性、增加之膠原蛋白III mRNA的表現、組織纖維化症及其他現象係顯著受凝乳酶抑制劑抑制。已在博來黴素引起的肺纖維化症的小鼠模型中觀察到相同作用；投藥凝乳酶抑制劑抑制了凝乳酶活性並降低了羥脯胺酸的含量。

藉由具有這些特徵，凝乳酶抑制劑可用來作為與凝乳酶相關之疾病(例如纖維化症)的預防性或治療性藥物。已開發出的凝乳酶抑制劑包括小分子化合物，例如TPC-806、SUN-13834、SUN-C8257、SUN-C8077、及JNJ-10311795(USP 6500835)。

近年來，將RNA適體作為治療性藥物、診斷試劑、以及檢驗試劑(test reagent)之應用已受到注意；某些RNA適體已處於臨床研究階段或實際應用。於2004年12月，世上第一個RNA適體藥物哌加他尼鈉(Macugen)於美國獲准作為老年黃斑部變性的治療性藥物。所謂的RNA適體意指專一性結合至目標分子(例如蛋白質)，且可使用系統性配位子指數增益演繹程序(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)(國際專利公開案號第WO91/19813、WO94/08050,WO95/07364號)方法製備的RNA。於SELEX方法中，從約10¹⁴個不同核苷酸序列之RNA池中選出專一性結合至目標分子的RNA。所使用之RNA具有約40個核苷酸的隨機序列，該序列側接引子序列。使此RNA池與目標分子混合，使用過濾器等而只分離出結合至目標分子的RNA。使用RT-PCR放大所分離出的RNA，將其用來作為下一循環的模板。藉由重複該操作約10次，可獲得專一性結合至目標分子的RNA適體。

類似抗體藥物，適體藥物可標靶細胞外蛋白質。參照許多科學性報告及於公開區域的其他參考資料，適體藥物在某些方面被判定成潛在優於抗體藥物。例如，適體對於目標分子通常具有比抗體為更高的親和性與專一性。適體不大可能發生免疫消除及抗體所特有的副作用，例如據報導，使用適體不大可能發生抗體依賴型細胞介導細胞毒性(ADCC)與補體依賴型細胞毒性(CDC)。從藥物遞送的觀點來看，因為適體的分子尺寸約為抗體的十分之一，它們可移動到組織，使得能夠更容易地遞送藥物至目標位置。由於適體係由化學合成法製造，它們允許了位置選擇性化學修飾，並使得能夠藉由大量製造降低成本。適體的其他優點包括長期儲存安定性、抗熱性與抗溶劑性。同時，適體的血液半衰期通常短於抗體的血液半衰期；然而，就毒性來看此性質有時是有利的。這些事實導出下述結論：即使標靶到相同的分子時，適體藥物潛在地優於抗體藥物。

本發明係針對提供凝乳酶的適體以及其利用方法等。

本案發明人勤奮地研究以解決上述問題並成功地製備出良好品質的凝乳酶適體，進而完成本發明。

據此，本發明提供下述：

[1]一種結合至凝乳酶以抑制凝乳酶活性之適體。

[2]根據[1]之適體，包含X₁GAUAGAN₁N₂UAAX₂(序列編號No：21；不論相同或不同，X₁與X₂各為A或G，且不論相同或不同，N₁與N₂各為A、G、C、U或T)所示之核苷酸序列。

[3]根據[2]之適體，其中N₁N₂為GA、GU、GC、UU、GT或CU。

[4]根據[2]之適體，其中X₁與X₂皆為A或皆為G。

[5]根據[3]或[4]之適體，其中該嘧啶核苷酸的至少一者係經修飾或變更(altered)。

[6]根據[1]之適體，包括下述核苷酸序列(a)、(b)與(c)的任一者：

(a)　包括選自序列編號No：4至34、38至57、59至65及69至72(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列之適體；

(b)　包括選自序列編號No：4至34、38至57、59至65及69至72(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列之適體，其中1至5個核苷酸係經取代、刪除、插入或加入；以及

(c)　與選自序列編號No：4至34、38至57、59至65及69至72(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列具有70%或更高同一性(identity)之核苷酸序列。

[7]根據[6]之適體，其中該適體所含之核苷酸的至少一者係經修飾或變更(altered)。

[8]根據[1]之適體，包括下述核苷酸序列(a’)、(b’)與(c’)的任一者：

(a’)選自序列編號No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)-56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列；

(b’)選自序列編號No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)-56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列，其中1至5個核苷酸係經取代、刪除、插入或加入；以及

(c’)與選自序列編號No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)-56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列具有70%或更高同一性之核苷酸序列。

[9]根據[1]之適體，其中，不論相同或不同，該適體所含之各嘧啶核苷酸於各自2’-位置的羥基，可經選自氫原子、氟原子及甲氧基所組成群組之原子或基取代。

[10]根據[1]之適體，其中，不論相同或不同，該適體所含之各嘌呤核苷酸於各自2’-位置的羥基，可經選自氫原子、氟原子及甲氧基所組成群組之原子或基取代。

[11]一種複合物，包括[1]至[10]中任一種適體以及官能物質。

[12]根據[11]之複合物，其中該官能物質為親和性物質、標識用物質、酵素、藥物遞送載劑或藥物。

[13]一種醫藥品，包括[1]至[10]中任一種適體或[11]或[12]中之複合物。

[14]根據[13]之醫藥品，其係用於預防與治療心血管疾病或纖維化症。

[15]一種診斷試劑，包括[1]至[10]中任一種適體或[11]或[12]中之複合物。

[16]一種凝乳酶偵測探針，包括[1]至[10]中任一種適體或[11]或[12]中之複合物。

[17]一種凝乳酶純化用固相載子，包括[1]至[10]中任一種適體或[11]或[12]中之複合物。

[18]一種偵測凝乳酶的方法，包括使用[1]至[10]中任一種適體或[11]或[12]中之複合物。

[19]一種純化凝乳酶的方法，包括使用[1]至[10]中任一種適體或[11]或[12]中之複合物。

本發明之適體或複合物適於作為凝乳酶所造成之各種疾病(例如纖維化症與心血管疾病)的醫藥品或試劑(例如診斷試劑)。本發明之適體或複合物亦適於作為純化及濃縮凝乳酶，以及偵測及定量凝乳酶。

本發明提供對凝乳酶具有結合活性之適體。本發明之適體可抑制凝乳酶的活性。

適體是指對特定目標分子具有結合親和性之核酸分子。適體也可藉由結合到特定目標分子而抑制特定目標分子之活性。本發明之適體對凝乳酶具有結合活性且能夠抑制凝乳酶的活性。本發明之適體可為RNA、DNA、經修飾核酸或其混合物。本發明之適體也可呈線狀或環狀。

凝乳酶，為一種公知絲胺酸蛋白酶，其係儲存於巨大細胞分泌粒中。凝乳酶深涉受巨大細胞調控之廣泛種類的生物反應，包括例如生物活性肽的製造以及降解、細胞間基質之重組、細胞素之網路、以及免疫。本發明之適體可具有對衍生自任何哺乳類的凝乳酶之抑制活性。該等哺乳類包括靈長類(例如人類、猴子)、囓齒類(例如大鼠、小鼠、天竺鼠、倉鼠)以及陪伴動物、家畜、及役畜(例如狗、貓、馬、牛、山羊、綿羊、豬)，較偏好者係人類。人類凝乳酶的胺基酸序列係顯示於登錄號AAB26828，且可為具有1至7個突變殘基之序列、其功能區部份(domain moiety)，或其肽部分。人類凝乳酶的結構可不僅為單體，也可為二聚體或聚合物。

本發明之適體於生理緩衝溶液中係結合至凝乳酶。雖然對於緩衝溶液的選擇沒有限制，較佳為具有pH約5.0至10.0之緩衝溶液。該緩衝溶液包括例如，下述溶液A與溶液C(見實施例1與2)。本發明之適體以可為下述任一種測試偵測之強度結合至凝乳酶。

結合強度係使用Biacore T100(由GE Healthcare製造)而測得。於一種測量方法中，先將適體固定於感測晶片上，被固定之適體量約為1000RU。注入20微升(μL)凝乳酶溶液作為分析物(製備成0.2μM)，偵測凝乳酶對適體的結合。將包含30或40個核苷酸之隨機核苷酸序列之RNA使用作為陰性對照。若凝乳酶結合至適體係等量於或是顯著強於結合至對照RNA，則斷定該適體具有與凝乳酶結合之能力。

於另一種方法中，先將凝乳酶固定於感測晶片上，被固定之凝乳酶量約為4000RU。注入20μL凝乳酶溶液作為分析物(製備成0.01μg/μL)，偵測適體結合至凝乳酶。將包含30或40個核苷酸之隨機核苷酸序列之RNA使用作為陰性對照。若凝乳酶結合適體係等量於或是顯著強於結合對照RNA，則斷定該適體具有與凝乳酶結合之能力。

針對凝乳酶具有抑制活性意指針對凝乳酶所具任何活性的抑制潛力。例如，對於水解並切割肽鏈的酵素活性(為凝乳酶的一種功能)係受到抑制。酵素活性之可接受受質並不限於出現於活有機體中之蛋白質與生物活性肽(例如AngI、潛伏性TGF-β等)，而是也包括與顯色物質或螢光物質接合之肽(含有前述肽之部分胺基酸序列)。顯色物質或螢光物質係為技術領域中具有通常知識者已知者。經由蛋白質與生物活性肽之降解反應所發生的現象包括膠原蛋白I/III之表現增加、羥脯胺酸之含量增加、IgE之表現增加等；對其之抑制性作用也包括於對凝乳酶之抑制活性中。另外，對凝乳酶之抑制活性亦包括對於嗜中性球、單核球、嗜酸性球移動到凝乳酶的抑制活性。再者，對凝乳酶之抑制活性亦包括針對下述之抑制作用：凝乳酶所引起的組織胺釋出促進、巨大細胞計數之提升、血管滲透性的增加、組織纖維化、發炎、血管新生、血管內膜增厚等。

凝乳酶受質意指被凝乳酶水解分割的肽、蛋白質等。已知存在於活有機體中之凝乳酶受質包括肽及蛋白質諸如AngI、潛伏性TGF-β、幹細胞因子(SCF)、原膠原蛋白、原膠原蛋白酶、纖維結合素(fibronectin)、原間質金屬蛋白酶-1(promatrix metalloprotease-1,pro-MMP-1)、pro-MMP-9、間質金屬蛋白酶-1的組織抑制劑(TIMP-1)、脂蛋白元A-I(apoA-I)、apoE、磷脂質轉移蛋白、IL-1β先驅物、big-內皮素-1(big-ET-1)、big-ET-2、結締組織-活化肽III、IL-18先驅物、P物質、激脈腸肽(VIP)、胰激肽、緩激肽及C3a。本文中，凝乳酶受質不限於這些，而是包括含有專一性為凝乳酶所辨識之胺基酸殘基(例如Phe與Tyr)的人工設計模型肽，以及這些肽與顯色物質或螢光物質的接合物。

適體是否可抑制凝乳酶的酵素活性可藉由例如下述三種測試方法決定。

第一種方法使用合成受質。一種適用的凝乳酶受質為Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA(4-甲基香豆素基-7-醯胺基)(由Peptide Institute,Inc.所製造)，其含有4-胺基酸肽“Ala-Ala-Pro-Phe”，為類胰凝乳酶蛋白酶的標準受質。

使用96-孔盤(由Nunc製造之F16 Black Maxisorp Fluoronunc)以100μL體積之反應混合物(於緩衝溶液中，溶液C；參見下述實施例2)來實施此試驗。首先將各核酸配製於溶液C中而得到50μL溶液。將10μL配製於溶液C中之1 mM受質加入後，將該盤放到微量盤偵測儀SpectraMax190(Molecular Devices Corporation製造)中，並於37℃培養5分鐘。另外將0.05μg凝乳酶(SIGMA製造之重組體)稀釋於溶液C中，並將40μL的該稀釋液於37℃培養5分鐘。將凝乳酶溶液添加到核酸與受質的混合物中以起始酵素反應。將該含有反應化合物之盤放到微量盤偵測儀SpectraMax190(Molecular Devices Corporation製造)中，並調查於37℃、5分鐘之螢光強度之時間依賴性變化(激發波長380奈米(nm)，偵測波長460 nm)。產生藉由凝乳酶活性而自受質釋出之AMC(7-胺基-4-甲基香豆素)的螢光增加的線性近似，取其斜率作為起始反應速度。至於對照，以相同方式處理並分析兩種例子中之樣本：使用包含30或40個核苷酸之隨機核苷酸序列之核酸池(陰性對照)，以及使用抑凝乳酶素(chymostatin)，為已知類胰凝乳酶絲胺酸蛋白酶抑制劑(陽性對照)。取沒有核酸與抑制劑的起始反應速度作為100%酵素活性，計算各測試受質的抑制率，並決定造成50%酵素性活性抑制所需濃度(IC₅₀)。係將具有較抑凝乳酶素(一種已知抑制劑)所具有的IC₅₀值為更低值的適體判定為具有優異抑制活性。

第二種評估方法使用天然受質。一種適用的凝乳酶天然受質為血管收縮素(angiotensin)I。本文中，係將自血管收縮素I降解所釋出之肽片段His-Leu衍生帶螢光，並定量由之產生的螢光強度。

於此試驗中，酵素反應係於50μL溶液C中進行。首先，將0.3至0.75 ng凝乳酶(SIGMA製造之重組體；或Calbiochem製造之天然凝乳酶)稀釋於溶液C中，而得到5μL凝乳酶溶液。將各核酸配製於溶液C中而得到25μL溶液。混合各5μL凝乳酶稀釋液與各25μL核酸溶液，接著將該混合物於37℃培養5分鐘。另外配製20μL於溶液C中之125μM血管收縮素I(Peptide Institute,Inc.製造)，並於37℃培養5分鐘。將血管收縮素I溶液添加到核酸與凝乳酶的混合物中，而起始酵素反應。允許反應於37℃進行90分鐘後，添加25μL冰的30%三氯乙酸溶液來終止反應。將整個混合物於4℃，14000 rpm離心10分鐘，並將30μL所得上清液用於螢光衍生之後續反應。

將30μL所得上清液加到96-孔盤(black，由Costar製造)後，於各孔中混合15μL之2%鄰苯二甲酸(由SIGMA製造)之甲醇溶液以及170μL之0.3M NaOH溶液，並允許該盤於室溫靜置10分鐘。接著添加25μL之3M HCl溶液來終止反應。將該盤放到微量盤偵測儀SpectraMax190(Molecular Devices Corporation製造)中，並於激發波長355 nm與螢光波長460 nm決定螢光強度。

至於對照，以相同方式處理並分析兩種例子中的樣本：使用序列編號No：58(陰性對照)，以及使用抑凝乳酶素(chymostatin)，為已知類胰凝乳酶絲胺酸蛋白酶抑制劑(陽性對照)。於這兩種例子中，取0分鐘反應時點所獲得的螢光強度作為空白測定。取加入等量體積溶液C來取代各核酸所偵測到之凝乳酶酵素反應螢光強度作為100%，計算各測試受質的抑制率，並決定造成50%酵素性活性抑制所需濃度(IC₅₀)。係將具有較抑凝乳酶素(一種已知抑制劑)所具有的IC₅₀值為更低值的適體判定為具有優異抑制活性。

第三種評估方法使用含於細胞培養上清液中之天然受質。本文中，使用西方點墨法偵測到凝乳酶受質LTBP-1的降解。將冷凍的NHLF細胞(由Cambrex Bio Science製造)於37℃水浴中快速解凍，並接著懸浮於培養基(10% FBS/F-12)。於1200 rpm離心5分鐘後，移除所得上清液，再次將細胞懸浮於培養基。將10 mL總體積之培養基加入至離心後細胞，將細胞懸浮物移到細胞培養皿並於37℃，5% CO₂存在下培養。於顯微鏡下觀察細胞形態與生長狀態。當細胞達緻密生長(confluence)時，更換培養基為不含血清培養基(0.2% BSA/F-12)。更換培養基兩天後，收集、分裝該培養上清液，並儲存於-30℃。

取40μL NHLF培養上清液(於使用前新鮮解凍)到管子中後，於其中加入5μL稀釋於溶液C中之核酸溶液。至於陽性對照，以溶液C稀釋抑凝乳酶素，且此稀釋液以相同方式添加。至於陰性對照，單獨加入溶液C。接著加入5μL溶於溶液E(溶液C+0.1% BSA,0.05%疊氮化鈉)中之100 ng/mL凝乳酶稀釋液。至於對照，準備無凝乳酶管。於攪拌後，將樣本培養於37℃，1小時，並混入等體積電泳用溶胞緩衝液而終止反應。如下述西方點墨法的步驟偵測樣本中之LTBP-1。

將混於溶胞緩衝液中之樣本煮3分鐘，取10μL該樣本以5至20%丙烯醯胺膠進行電泳。完成電泳後，將該樣本轉移到硝化纖維素過濾膜上，之後以5%脫脂奶粉、50 mM Tris-HCl(pH 8.0)及0.05%疊氮化鈉封阻該過濾膜。使該過濾膜與2μg/mL之抗-LTBP-1單株抗體稀釋物於2% BSA,PBS以及0.05%疊氮化鈉中，於室溫反應過夜。清洗該過濾膜3次，並以二次抗體溶液(以0.1% BSA/PBS稀釋10000倍之HRP-標記之抗小鼠IgG抗體)於室溫培養2小時。清洗該過濾膜5次，並使用化學發光受質偵測之。

當根據LTBP-1條帶密度以及位置決定後，得自無凝乳酶之井之條帶即可作為陽性對照(+)，得自陰性對照之井之條帶即可作為陰性對照(-)。藉由目視檢查而檢驗各測試受質之抑制活性。

對本發明之適體並無限制，只要其可結合至任何凝乳酶的蛋白質而抑制其活性。

並未限制本發明之適體的長度，通常可為約10至約200個核苷酸，且例如可為不多於約100個核苷酸，較佳為不多於約50個核苷酸，更佳為不多於約40個核苷酸，最佳為不多於約30個核苷酸。當核苷酸的總數目越小，則其化學合成及大量製造變得更容易，就成本來看有其主要優勢。亦認為其化學放大係容易，於體內安定性高且毒性低。

含於本發明之適體中之各核苷酸，不論其相同或不同，可為於核糖(例如嘧啶核苷酸之核糖或嘌呤核苷酸之核糖)2’位置包括羥基之核苷酸(意即未經取代之核苷酸)，或為於核糖之2’位置經任何原子或基取代之核苷酸。作為該任何原子或基之實例，可提及經氫原子、氟原子或-O-烷基(例如-O-Me)、-O-醯基(例如-O-COMe)、或胺基(例如-NH₂基)取代之核苷酸。

本發明之適體具有X₁GAUAGAN₁N₂UAAX₂(序列編號No：21；其中不論相同或不同，X₁與X₂各為A或G，且不論相同或不同，N₁與N₂各為A、G、C、U或T，限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)所示序列。具有此序列之適體強力結合至凝乳酶而抑制凝乳酶活性。

於上式中，其中X₁與X₂較佳皆為A或皆為G；N₁N₂較佳為GA、GU、GC、UU、GT或CU(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)。

本發明之適體也可為其中至少一種(例如1、2、3或4種)核苷酸於核糖之2’位置包括羥基或上述之任何原子或基，例如至少二種(例如2、3或4種)選自氫原子、氟原子、羥基及甲氧基所組成群組之基。

於本發明之適體中，所有嘧啶核苷酸可為於核糖之2’位置經氟原子取代之核苷酸，或經上述之任何原子或基(較佳為選自氫原子、羥基及甲氧基所組成群組之原子或基，不論相同或不同)取代之核苷酸。

於本發明之適體中，所有嘌呤核苷酸可為於核糖之2’位置包括羥基之核苷酸，或經上述任何原子或基(較佳為選自氫原子、甲氧基及氟原子所組成群組之原子或基，不論相同或不同)取代之核苷酸。

本發明之適體也可為下述者：其中所有核苷酸於核糖之2’位置相同地包括羥基或上述任何原子或基，例如，該相同基係選自氫原子、氟原子及甲氧基所組成群組。

於本說明書中，於描述如何修飾核苷酸中之糖基時，係假設構成適體之核苷酸為RNA(意即，假設糖基為核糖)。然而，這並不表示從構成適體的核苷酸中排除DNA。當構成適體的核苷酸為DNA時，例如於核糖之2’位置之羥基係經X取代，應解讀成於去氧核糖之2’位置之氫原子係經X取代。

本發明之適體也可為：

(b)　包括選自序列編號No：4至34、38至57、59至65及69至72(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)核苷酸序列之適體，其中1至5個核苷酸係經取代、刪除、插入或加入；以及

(c)包括具有與選自序列編號No：4至34、38至57、59至65及69至72(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列為70%或更高(較佳為80%或更高，更佳為90%或更高，最佳為95%或更高)同一性之核苷酸序列之適體。本發明之適體也包括：

(d)選自下述所組成群組之接合物：複數個上述適體(a)之接合物、複數個上述適體(b)之接合物、複數個上述適體(c)之接合物、複數個上述適體(a)、(b)及(c)之接合物。

不僅是上述適體(a)，適體(b)至(d)也能夠結合至凝乳酶及/或抑制凝乳酶活性(凝乳酶酵素活性等)。

本發明之適體也可為：

(a’)包括選自序列編號No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)至56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列之適體；

(b’)包括選自序列編號.No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)至56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列之適體，其中1至5個核苷酸係經取代、刪除、插入或加入；以及

(c’)具有與選自序列編號No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)至56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可為胸腺嘧啶)之核苷酸序列為70%或更高同一性之核苷酸序列之適體。本發明之適體也包括：

(d’)選自下述所組成群組之接合物：複數個上述適體(a’)之接合物、複數個上述適體(b’)之接合物、複數個上述適體(c’)之接合物、複數個上述適體(a’)、(b’)及(c’)之接合物。再者，本發明之適體也包括：

(e)由選自上述適體(a)、(b)及(c)所組成群組之一種或多種適體及選自上述.適體(a’)、(b’)及(c’)所組成群組之一種或多種適體所組成之接合物。

上述適體(a)至(d’)以及適體(e)也能夠結合至凝乳酶及/或抑制凝乳酶活性(凝乳酶酵素活性等)。

於上述(b)與(b’)中，只要適體能夠結合至凝乳酶及/或抑制凝乳酶活性(凝乳酶酵素活性等)，係不對經取代、刪除、插入或加入之核苷酸的數目作限制。舉例來說，核苷酸的數目可為不超過30、較佳為不超過20、更佳為不超過10、又更佳為不超過5、最佳為4、3、2或1。

關於上述的(c)與(c’)，「同一性」意指於最佳比對(alignment)時相同核苷酸殘基對所有重疊核苷酸殘基的比例，其中二條核苷酸序列係使用技術領域中已知的數學演算法比對(較佳地，為了最佳比對，該演算法考量於該等序列中之一者或二者中引入間隔(gap))。

本發明說明書中之核苷酸序列相似度可藉由，例如，於下述條件使用同源性計算演算法(homology calculation algorithm)NCBI BLAST-2(生物技術資訊基礎局部比對檢索工具國家中心(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool))來比對二條核苷酸而計算：產生一個間隔=扣5分、延長一個間隔=扣2分、門檻值(X_dropoff)=50、期望值=10、過濾=開啟。

於上述的(d)、(d’)與(e)，接合可藉由串聯結合達成。可於接合中使用連接子。作為連接子，可提到的有核苷酸鏈(例如，1至20個核苷酸)，以及非核苷酸鏈(例如，-(CH₂)n-連接子、-(CH₂CH₂O)n-連接子、伸己二醇連接子、TEG連接子、含肽連接子、含-S-S-鍵連接子、含-CONH-鍵連接子、含-OPO₃-鍵連接子)。並未對上述複數個接合物所提及的複數作特別限制，只要其為二個或更多個，且舉例來說，複數可為2、3或4。上述(a)至(d)、(a’)至(d’)與(e)中的核苷酸各者，不論相同或不同，可為於核糖之2’位置包含羥基的核苷酸、或是於核糖(例如嘧啶核苷酸的核糖)之2’位置經任何基(例如氫原子、氟原子或-O-Me基)取代的核苷酸。

本發明之適體可為一種其中各核苷酸的糖殘基(例如核糖)係經修飾以增加凝乳酶結合活性、安定性、藥物可遞送性等的適體。作為糖殘基中將被修飾的位置的例子可提到的有：具有以另一個原子置換於糖殘基之2’位置、3’位置及/或4’位置的氧原子者等。作為修飾的例子可提到的有：氟化、-O-烷化(例如一O一甲基化、-O-乙基化)、-O-芳香化、-S-烷化(例如一S一甲基化、-S-乙基化)、-S-芳香化及胺化(例如一NH₂)。所述於糖殘基的變更可藉由已知方法本身施行(參見例如Sproat et al.,(1991) Nucle. Acid. Res. 19,733-738；Cotton et a1.,(1991) Nucl. Acid. Res. 19,2629-2635；Hobbs et al.,(1973) Biochemistry 12,5138-5145)。

本發明之適體也可具有經變更(例如化學取代)以增加凝乳酶結合活性等之核酸鹼基(例如嘌呤或嘧啶)。作為該等變更的例子可提到的有：第5位置的嘧啶變更、第6及/或8位置的嘌呤變更、以環外胺變更、經4-硫基尿苷取代、以及經5-溴脲嘧啶或5-碘脲嘧啶取代。

可變更本發明之適體中所含的磷酸酯基以賦予對核酸酶與水解之抗性。舉例來說，P(O)O基可用下述取代：P(O)S(硫代酸(thioate))、P(S)S(二硫代酸(dithioate))、P(O)NR₂(醯胺代酸(amidate))、P(O)CH₃、P(O)BH₃、P(O)R、R(O)R’、CO或CH₂(甲縮醛(formacetal))或3’-胺(-NH-CH₂-CH₂-)[其中R或R’的各單元係獨立為H或經取代或未經取代的烷基(例如甲基、乙基)]。

連結基(joining group)係例如為-O-、-N-或-S-，且核苷酸可藉由這些連結基結合至鄰接核苷酸。

變更也可包括諸如於3’與5’封端之變更。

變更的實施可進一步藉由對末端(end)加上聚乙二醇、胺基酸、肽、倒排dT(inverted dT)、核酸、核苷酸、肉豆蔻醯基、石膽酸-油基、二十二烷醯基、十二醯基、十八醯基、棕櫚醯基、油醯基、次亞麻油醯基、其他脂類、類固醇、膽固醇、咖啡因、維生素、色素、螢光物質、抗癌劑、毒素、酵素、放射性物質、生物素等。對於這類變更，例如參見US專利第5,660,985號及第5,756,703號。

可如本文所述般合成本發明之適體以及藉由技術領域中以之方法本身合成本發明之適體。一種合成方法施用RNA聚合酶。化學合成具有所欲序列以及RNA聚合酶啟動子序列之DNA(其係作為模板)係藉由公眾已知方法轉錄而得到所欲RNA。也可使用DNA聚合酶合成本發明之適體。化學合成具有所欲序列之DNA(其係作為模板)係藉由公眾已知之聚合酶連鎖反應(PCR)方法擴增。此係藉由公眾已知之聚丙烯醯胺電泳或酵素處理方法而提供單股。當合成經修飾適體時，可藉由使用於特定位置突變之聚合酶來增加延長反應效率。如此所得的適體可輕易地藉由公眾已知方法純化。

可藉由諸如醯胺法(amidite method)以及亞磷醯胺法(phosphoramidite method)合成大量適體。這些合成方法係習知，例如Nucleic Acid(Vol.2)[1] Synthesis and Analysis of Nucleic Acid(edited by Yukio Sugiura,published by Hirokawa Publishing Company)等所描述者。具體來說，係使用諸如OligoPilot100或OligoProcess(由GE Healthcare Bioscience所製造)之合成儀。如此合成的適體可輕易地藉由諸如層析法之已知方法本身純化。

限制條件為，於藉由亞磷醯胺法等化學合成過程期間，將諸如胺基之活性基引入至適體中，可於合成後將官能性物質加入。例如，藉由將胺基引入至適體的末端，此可縮合併入羧基之聚乙二醇鏈。

適體係以廣泛種類的結合模式結合至目標分子，例如基於磷酸基的負電荷之離子性結合、基於核糖的疏水性鍵以及氫鍵、以及基於核酸鹼基的氫鍵與堆疊力。具體來說，基於磷酸基的負電荷之離子鍵(係以與構成核苷酸的數目相同數目存在)係強烈，且其結且合至出現在正價蛋白質的表面的離胺酸與精胺酸。基於此，不涉及直接鍵結至目標分子之核酸鹼基可經取代。具體來說，由於莖結構的區域已經形成鹼基對且面朝雙螺旋結構的內部，核酸鹼基不大可能直接鍵結至目標分子。因此，即使當鹼基對被置換成另一鹼基對，適體的活性通常不會降低。於其中沒有形成鹼基對之結構中，例如環(loop)結構，限制條件為核酸鹼基不涉及直接鍵結至目標分子，可進行鹼基取代。關於核糖2’位置的修飾，核糖2’位置的官能基係少有直接與目標分子作用，而於許多例子中，其係無任何關聯，且可經其他經修飾分子取代。因此，除非涉及直接鍵結至目標分子之官能基經取代或刪除，適體通常保留其活性。整體3D結構不大範圍地改變也很重要。

可藉由使用SELEX方法或其改良版(例如，Ellington et al.,(1990) Nature,346,818-822；Tuerk et al.,(1990) Science,249,505-510)來製備適體。於SELEX法中，藉由使選擇條件更嚴格(通過增加循環的次數或是使用競爭物質)，而濃縮並選出具有對目標分子更強結合潛力的適體。因此，於某些例子中，可藉由調整SELEX循環次數及/或改變競爭條件得到具有不同結合力之適體、具有不同結合模式之適體、以及具有相同結合力或結合模式但不同鹼基序列之適體。SELEX方法包含經PCR擴增之過程，於過程中藉由使用錳離子產生突變等，可以更高的歧異性實施SELEX方法。

藉由SELEX所得之適體為對目標分子具有高親和性之核酸，但這並不意味著抑制目標分子的生物活性。凝乳酶為鹼性蛋白質，一般認為核酸可能不專一性地結合至鹼性蛋白質，但除了強力結合至凝乳酶的特定位置之適體以外的適體並不會影響凝乳酶的活性。事實上，包含作為陰性對照使用之隨機序列之RNA，雖然其微弱地鍵結凝乳酶，卻不會抑制乳酶的活性。

基於如此選出之活性適體，可實施SELEX以獲得具有更高活性的適體。具體來說，於製備模板後(其中具有既定序列之適體被部份隨機化或是模板被摻雜約10至30%隨機序列)，再次實施SELEX。

藉由SELEX所得之適體具有約80核苷酸的長度，且其係難以就其原有樣子被製備成醫藥品。因此，必須重複試驗-錯誤工作以縮短適體長度至約50或更少的核苷酸，以利化學合成。後續最小化操作的容易與否，隨著對藉由SELEX所得之適體的引子設計而改變。除非成功設計引子，否則即使具有活性的適體已藉由SELEXU選出，將不可能進行後續發展。於本發明中，已得到即使具有23個核苷酸仍具有活性之適體。

由於適體允許使用化學合成法，很容易對其進行修飾。例如，可透過使用MFOLD程式推定其二級結構，或是藉由X-ray分析或是NMR分析推定之立體結構，而某種程度預測哪個核苷酸可經取代或是刪除，以及哪裡可插入新的核苷酸。可輕易地化學合成所推定之具有新序列適體，且可使用現有試驗系統確定該適體是否保有活性。

若對於所得適體與目標分子之結合為重要的區域係經上述重複試驗與錯誤工作識別出，則即使是將新的序列加到該序列的兩末端時，在許多例子中活性是維持不變的。不特別限制新序列的長度。

技術領域中具有通常知識者可進行大範圍的修飾設計或是修飾變更，類似序列。

如上所述，適體允許大範圍的修飾設計或是修飾變更。本發明也提供適體的製造方法，使得包含特定序列之適體的能夠大範圍的設計或是變更(例如對應於選自莖區域、內部環(loop)區域、突出(bulge)區域、髮夾彎(hairpin loop)區域以及單股區域中之蛋白質之序列，後文中依需要簡稱固定序列)。

例如，此種適體的製造方法包括，藉由使用單種核酸分子或是複數種核酸分子(例如具有不同數目“a”或“b”之核酸分子庫)製造由下式所示核苷酸序列所構成之包含固定序列之適體：

-(N)a-固定序列-(N)b-

[其中(N)a表示由“a”單元N所構成之核苷酸鏈；(N)b表示由“b”單元N所構成之核苷酸鏈；各N單元不論相同或是不同係選自A、G、C、U及T(較佳為A、G、C及U)所組成群組之核苷酸。“a”與“b”之各者，不論相同或是不同，可為任何數目，且可為例如1至約100，較佳為1至約50，更佳為1至約30，又更佳為1至約20或1至約10]，且引子對係分別對應於引子序列(i)與(ii)。

本發明也提供包括本發明之適體以及結合至適體之官能物質之複合物。本發明複合物中之適體與官能物質之間的鍵可為共價鍵或非共價鍵。本發明複合物可為其中本發明之適體以及與一個或多個(例如2或3)相同種類或是不同種類之官能物質鍵結在一起之複合物。不特別限制官能物質，只要它為本發明之適體新提供某種功能或是能夠改變(例如改良)本發明之適體所能具有的某種特性。作為官能物質的例子，可提及的有蛋白質、肽、胺基酸、脂質、糖類、單醣類、多核苷酸及核苷酸。作為官能物質的例子，可提及的有親和性物質(例如生物素、卵白素、對目標互補序列具有親和性之多核苷酸、抗體、麩胱甘肽、交聯瓊脂糖凝膠、組胺酸)、標識用物質(例如螢光物質、發光的物質、放射性同位素)、酵素(例如辣根過氧化酶、鹼性磷酸酯酶)、藥物遞送載劑(例如脂質體、微球體、肽、聚乙二醇)、藥物(例如，用於導彈療法中者，諸如刺孢黴素(calicheamycin)和倍癌黴素(duocarmycin)；氮芥類似物(例如塞克羅邁得(cyclophosphamide)、美法侖(melphalan)、依弗醯胺(ifosfamide)或是曲洛磷胺(trofosfamide)；伸乙亞胺，諸如沙奧特帕(thiotepa)；亞硝基脲，諸如卡芥氮(carmustine)；烷化劑諸如替莫唑胺(temozolomide)或達卡巴仁(dacarbazine)；類葉酸鹽代謝拮抗劑，例如胺甲葉酸(methotrexate)、雷替曲塞(raltitrexed)；嘌呤類似物，諸如硫鳥嘌呤、克拉屈濱(cladribine)或福達樂(fludarabine)；嘧啶類似物，諸如氟尿嘧啶、替加氟(tegafur)或吉西他濱(gemcitabine)；長春花生物鹼，諸如長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)或長春瑞賓(vinorelbine)，及其類似物；鬼臼毒素(podophyllotoxin)衍生物，諸如依妥普賽(etoposide)、紫杉烷(taxans)、多烯紫杉醇(docetaxel)或太平洋紫杉醇(paclitaxel)；蒽環類抗癌藥(anthracycline)，諸如杜薩魯比辛(doxorubicin)、依畢魯比辛(epirubicin)、艾達魯比辛(idarubicin)及邁杜蔥酮(mitoxantrone)，及其類似物；其他細胞毒性抗生素，諸如博來黴素(bleomycin)及絲裂黴素；鉑化合物，諸如順鉑(cisplatin)、卡鉑定(carboplatin)及奧沙利鉑(oxaliplatin)；噴司他丁(pentostatin)、米替福星(miltefosine)、雌莫司汀(estramustine)、拓撲替康(topotecan)、愛萊諾迪肯(irinotecan)及比卡魯胺(bicalutamide))，以及毒素(例如蓖麻毒素、里阿毒素(liatoxin)及維羅毒素(Vero toxin))。於某些例子中，這些官能分子最後被除去。再者，該等分子可能是可為酵素辨認並且切斷的肽，例如凝血酶，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)以及第十因素(Factor X)，且可能是可為核酸酶或者限制內切酶切斷的多核苷酸。

本發明之適體或是複合物可用來作為例如醫藥試劑或是診斷試劑，或是檢驗試劑或試劑。

本發明之適體或是複合物可具有抑制凝乳酶功能的活性。如上所述，凝乳酶與纖維化症及新血管疾病極度相關。因此，本發明之適體或是複合物適用於作為用來治療或預防伴隨纖維化症及新血管疾病的疾病的醫藥品。

本發明之適體或是複合物能夠專一性結合凝乳酶。因此，本發明之適體或是複合物適用於作為用來偵測凝乳酶的探針。該探針適用於活體內凝乳酶的顯影、凝乳酶的血液濃度測量、組織染色、ELISA等。該探針也適用來作為涉及凝乳酶之疾病(伴隨纖維化症及新血管疾病的疾病等)的診斷試劑、檢驗試劑、分析試劑等。

基於本發明之適體或是複合物對凝乳酶的專一性結合，它們可用來作為純化凝乳酶的配位子。

本發明之適體或是複合物可用來作為藥物遞送載劑。

涉及器管或組織之纖維化的疾病包括肺纖維化症、前列腺肥大、心肌纖維化症、肌肉骨骼纖維化症、骨髓纖維化症、子宮肌瘤、硬皮病、手術後黏連、手術後疤痕、燒傷疤痕、增生性疤痕、肥厚性瘢、異位性皮膚炎、腹膜硬化症、氣喘病、肝硬化、慢性胰臟炎、硬性胃癌、肝纖維化症、腎纖維化症、纖維化血管疾病、作為糖尿病併發症的纖維化微血管炎所引起的視網膜炎、神經症、腎病、腎小球性腎炎、腎小管間質纖維化腎炎(tubulointerstitial nephritis)、遺傳性腎疾病、動脈硬化性周圍動脈炎(arteriosclerotic peripheral arteritis)等。

心血管疾病包括血管病、主動脈瘤、腎功能不全、高血壓、動脈硬化、心肌梗塞、心肌肥大、心衰竭、於因經皮血管腔內血管成形術(percutaneous transluminal angioplasty)等所致血管病後的再狹窄(re-stenosis after angiopathies due to percutaneous transluminal coronary angioplasty and the like)、糖尿病和非糖尿病的腎病、周圍循環失調等等。

凝乳酶具有酵活性並且能切斷可作為受質的生物活性物質。至今為人所知受質的例子包括AngI、潛伏性TGF-β、SCF、原膠原、原膠原脢、原-MMP-9、IL-1β先驅物等。凝乳酶透過這些生物活性肽的生產或者降解的反應具有生物學的作用，包括胞外基質的再成型、具細胞素之網路、免疫和血管收縮。同時，凝乳酶它自己作用而活化巨大細胞並且促進組胺酸釋放，並且與發炎緊密相關。因此，本發明的適體和複合物不侷限於上述的受質，並且能被用作與凝乳酶接受的受質所介導的生物功能有關的疾病及涉及凝乳酶本身的疾病的醫藥品或者診斷試劑、測試試劑及分析試劑。

本發明的醫藥品可為調配有醫藥上可接受載劑者。作為醫藥上可接受載劑的例子可提及的有賦形劑，例如、蔗糖、澱粉、甘露醇、山梨醇、乳糖、葡萄糖、纖維素、滑石、磷酸鈣以及碳酸鈣；黏合劑，例如纖維素、甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚丙基吡咯啶酮、明膠、阿拉伯膠、聚乙二醇、蔗糖及澱粉；崩解劑，例如蔗糖、羧甲基纖維素、羥丙基澱粉、二醇澱粉鈉(sodium-glycol-starch)、碳酸氫鈉、磷酸鈣及檸檬酸鈣；潤滑劑，例如硬酯酸鎂、氣相二氧化矽(Aerosil)、滑石以及月桂基硫酸鈉；調味劑，例如檸檬酸、甲醇、甘草酸-銨鹽(glycyrrhizin-ammonium salt)、甘胺酸及柑橘粉；防腐劑，例如苯甲酸鈉、亞硫酸氫鈉、對羥苯甲酸甲酯、對羥苄酸丙酯；安定劑，例如檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸；懸浮劑，例如甲基纖維素、聚乙烯吡咯啶酮及硬酯酸鋁；分散劑，例如界面活性劑；稀釋劑，例如水、生理食鹽水以及柑橘汁；底臘，例如可可脂、聚乙二醇以及煤油；等，但不限於此。

並未限制本發明醫藥品的投藥路徑，本發明醫藥品可藉由例如口服投藥及非經腸投藥。

適用於口服投藥的製劑為藉由將有效量配位子溶解於稀釋劑(例如水、生理食鹽水或柑橘汁)中所製備之溶液；包含固體狀或粒狀之有效量配位子之膠囊、小袋(sachet)或錠；藉由將有效量活性組份懸浮於適當分散劑中所製備之懸浮物；藉由將有效量活性組份之溶液分散及乳化於適當分散劑中所製備之乳化物；促進水可溶物質之吸收之C10；等。

依需要可為了遮蔽味道、腸道溶解、持續釋放等目的藉由已知方法本身塗覆本發明的醫藥品。作為用於塗覆之塗覆劑的例子，可提及的有羥基丙基甲基纖維素、乙基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基纖維素、聚乙二醇、Tween 80、普朗尼克F-68(Pluronic F68)、纖維素乙酸酯酞酸酯(cellulose acetate phthalate)、羥丙基甲基纖維素酞酸酯、羥甲基乙酸酯琥珀酸酯(hydroxymethylcellulose acetate succinate)、尤特奇(Eudragit,由德國Rohm製造，甲基丙烯酸/丙烯酸共聚物)、色素(例如紅色氧化鐡、氧化鈦等)；等。本發明的醫藥品可為快速釋放製劑或持續釋放製劑。

作為適於非經腸投藥(例如靜脈投藥、皮下投藥、肌肉投藥、局部投藥、腹膜內投藥、鼻內投藥等)製劑，可用水性及非水性之等張無菌可注射液體，該液體可包含抗氧化劑、緩衝劑、制菌劑、等張劑等。也可提及者為水性及非水性無菌懸浮液，其可包含懸浮劑、助溶劑、增稠劑、安定劑、防腐劑等。可以單位劑量體積或數個可分割劑量將該製劑容置於容器中，例如安瓿或管。也可將活性組份及醫藥上可接受載劑予以冷凍乾燥並儲存於使用前可以適當無菌載劑溶解或懸浮的狀態。

持續釋放製劑也為適當製劑。持續釋放製劑的劑型包括持續地從埋於體內之載體或容置體(例如人工骨、生物可分解基劑或非生物可分解海綿、袋等)釋放出來。從體外全身性地或局部地之持續性或間歇性遞送的裝置(例如藥物泵及滲透壓泵)亦包括於持續釋放製劑的範圍內。生物可分解基劑包括脂質體、陽離子脂質體、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、組織修復用蛋白質(atherocollagen)、明膠、氫氧磷灰石、多糖西索菲蘭(polysaccharide sizofiran)。

除了液體注射、懸浮物及持續釋放製劑外，也可接受適於經肺投藥之吸入劑、適於經皮投藥之軟膏等。

於吸入劑例子中，係將凍乾狀態之活性組份微米化並經由使用適當吸入裝置而吸入投藥。可依需要使用傳統用界面活性劑、油、調味料、環糊精或其衍生物等而適當調配吸入劑。可根據傳統方法生產吸入劑。具體來說，可藉由下述生產吸入劑：粉末化或液體化本發明之適體或複合物、將之混拌於吸入推進劑及/或載體中，以及將之填入適當吸入管中。當上述之本發明適體或複合物為粉末時，可使用領域中慣用機器粉末吸入器；當為液體時，可使用諸如氣霧器(nebulizer)之吸入器。作為本文中之推進劑，可廣泛使用傳統已知者，可提及的有：氯氟碳系列化合物，例如氯氟碳-11、氯氟碳-12、氯氟碳-21、氯氟碳-22、氯氟碳-113、氯氟碳-114、氯氟碳-123、氯氟碳-124c、氯氟碳-134a、氯氟碳-227、氯氟碳-c318及1,1,1,2-四氟乙烷；烴類，例如丙烷、異丁烷及正丁烷；醚類，例如二乙醚；壓縮氣體，例如氮氣及二氧化碳氣體等。

本文中，作為界面活性劑的例子，可提及的有：油酸、卵磷脂、二乙二醇二油酸酯、四氫糠醇油酸酯、油酸乙酯、肉豆蔻酸異丙酯、甘油三油酸酯、甘油單月桂酸酯、甘油單油酸酯、甘油單硬酯酸酯、甘油單離胺酸酯(glyceryl monolysinoate)、鯨蠟醇、十八醇、聚乙二醇400、氯化鯨蠟吡啶、山梨醇三油酸酯(商品名Span 85)、山梨醇單油酸酯(商品名Span 80)、山梨醇單月桂酸酯(商品名Span 20)、聚氧乙烯硬化蓖麻油(商品名HCO-60)、聚氧乙烯(20)山梨醇單月桂酸酯(商品名Tween 20)、聚氧乙烯(20)山梨醇單油酸酯(商品名Tween 80)、天然來源的卵磷脂(商品名EPICLON)、油基聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij 92)、硬酯基聚氧乙烯(2)醚(商品名Brij 72)、月桂基聚氧乙烯(4)醚(商品名Brij 30)、油基聚氧乙烯(2)醚(商品名Genapol 0-020)、氧乙烯與氧丙烯之嵌段共聚物(商品名Synperonic)等。作為油的例子，可提及的有：玉米油、橄欖油、棉籽油、向日葵油等。就乳膏例子來說，係將合適的醫藥上可接受的基劑(黃的礦脂、白色的礦脂、石蠟油、液體石臘和聚乙烯的複合軟膏基劑(plastibase)、矽酮、白色乳膏、蜂蠟、豬油、植物油、親水性乳膏、親水性礦脂、淨化羊毛脂、水解的羊毛脂、吸水性軟膏、親水性液體石臘和聚乙烯的複合軟膏基劑、聚乙二醇(macrogol)軟膏等)與本發明的適體(為活性組分)混拌，並且作為製劑使用。

本發明之醫藥品的劑量係隨著活性組份的種類與活性、疾病嚴重度、作為投藥個體之動物物種、投藥個體之藥物耐受性、體重年齡等而變化，且基於活性組份的量計，成人每天的適用劑量可為約0.0001至約100毫克/公斤(mg/kg)，例如約0.0001至約10 mg/kg，較佳為約0.005至約1 mg/kg。

本發明也提供於其上固定有本發明適體及/或複合物之固相載體。作為固相載體的例子，可提及的有：基材、樹脂、板(例如多層板)、過濾器、筒、管柱及多孔材料。基材可為於DNA晶片、蛋白質晶片等所用者；可提及者為例如，鎳-PTFE(聚四氟乙烯)基材、玻璃基材、磷灰石基材，矽基材、氧化鋁基材等，以及藉由給這些基材塗覆聚合物等所製備的基材。作為樹脂的例子，可提及的有：瓊脂糖粒子、矽石粒子、丙烯醯胺和N,N’-亞甲雙丙烯醯胺的共聚物、聚苯乙烯交聯的二乙烯基苯粒子、以表氯醇交聯的類糊精粒子、纖維素纖維、芳基類糊精和N,N’-亞甲雙丙烯醯胺的交聯聚合物、單分散型合成聚合物、單分散型親水性聚合物、交聯瓊脂糖凝膠(Sepharose)、凝膠填料(Toyopearl)等；以及也包括藉由將各種官能基結合至這些樹脂所製備的樹脂。本發明之固相載體也適用於，例如純化、偵測並定量凝乳酶。

可藉由已知方法本身將本發明之適體及/或複合物固定至固相載體。可提及者為例如將親和性物質(例如上述者)或預定之官能基引入到本發明之適體及/或複合物，接著藉由親和性物質或預定之官能基將本發明之適體及/或複合物固定至固相載體。本發也提供該方法。預定之官能基可為可進行耦合反應之官能基；可提及者例如胺基、硫醇基、羥基及羧基。本發明也提供其中已引入官能基之適體。

本發明也提供一種純化及濃縮凝乳酶之方法。具體來說，本發明使得能夠自其他家族蛋白質的蛋白質分離出凝乳酶。本發明之純化及濃縮方法可包括將凝乳酶吸附至本發明之固相載體，並使用洗提液將所吸附之凝乳酶洗提出來。可藉由已知方法本身將凝乳酶吸附至本發明之固相載體。例如，將含凝乳酶樣本(例如細菌或細胞培養液或培養上清液、血液)導至本發明之固相載體或含有本發明之固相載體之組成物。可使用諸如中性溶液之洗提液將凝乳酶洗提出來。未對中性溶液加以限制，其可具有例如約6至約9，較佳為約6.5至約8.5，以及更佳為約7至約8之pH。中性溶液也可包括，例如，尿素、螯合劑(例如EDTA)鈉鹽(例如NaCl)、鉀鹽(例如KCl)、鎂鹽(例如MgCl₂)、界面活性劑(例如Tween 20、Triton、NP40)以及甘油。本發明之純化及濃縮方法可復包括於凝乳酶吸附後使用清洗溶液清洗固相載體。清洗溶液的例子包括那些含有尿素、螯合劑(例如EDTA)、Tris、酸、鹼、傳遞RNA、DNA、界面活性劑(例如Tween 20)、鹽類(例如NaCl)等。本發明之純化及濃縮方法又進一步可包括加熱固相載體。此步驟使得能再生與消毒固相載體。

本發明也提供一種偵測及定量凝乳酶的方法。具體來說，本發明使得能夠自其他家族蛋白質之蛋白質中偵測及定量出凝乳酶。本發明之偵測及定量方法可包括藉由使用本發明之適體而測量凝乳酶(例如藉由使用本發明之複合物與固相載體)。本發明之偵測及定量凝乳酶的方法可使用與免疫學方法相同之方式實施，除了使用本發明之適體來代替抗體。因此，藉由使用本發明之適體來代替抗體作為探針，可如同諸如酵素免疫分析法(EIA)(例如直接競爭ELISA、間接競爭ELISA、三明治ELISA)、放射性免疫分析法(RIA)、螢光免疫分析法(FIA)、西方點墨技術、免疫組織化學染色法以及細胞分選法之相同方式實施偵測及定量。本發明之適體也可用來作為PET等之分子探針。這些方法可適用於例如測量於活有機體或生物樣本中之凝乳酶含量，以及診斷與凝乳酶相關之疾病。

係將本文所提之所有公開件之揭露內容(包括專利及專利申請案說明書)以將它們全部已完整表達的程度之參考文件之方式併入本發明中。

本發明於後文中將藉由下列實施例更詳細描述，然而，該等實施例非限制本發明範圍。

實施例1：專一性結合凝乳酶之RNA適體的製備(1)

係使用SELEX方法製備專一性結合凝乳酶之RNA適體。所實施SELEX係為改良之Ellington等人的方法(Ellington and Szostak,Nature 346,818-822,1990)及Tuerk等人的方法(Tuerk and Gold,Science 249,505-510,1990)。使用固定於NHS-活化之Sepharose 4 Fast Flow(由GE Healthcare所製造)載體上之凝乳酶(人類皮膚，由Calbiochem所製造)作為目標分子。依照GE Healthcare之說明書的指示將凝乳酶固定至載體。以SDS-PAGE檢查固定前凝乳酶溶液及剛固定完之上清液確認已固定量。SDS-PAGE的結果顯示，於上清液中未偵測到任何凝乳酶條帶；其確認幾乎所有使用的凝乳酶都被耦合。意指約有167微微莫耳(pmol)的凝乳酶固定至約3微升(μL)的樹脂。

第一循環所用的RNA(40N)為使用DuraScribe^TM T7轉錄試劑組(由Epicentre所製造)轉錄化學合成DNA所獲得者。藉由此方法所獲得的RNA，其嘧啶核苷酸於核糖的2’位置係經氟取代。將下述長度為70個核苷酸的DNA(於兩端具有引子序列的40個核苷酸之隨機序列)作為DNA模板。所使用的DNA模板及引子是由化學合成所製備者。

DNA模板：

5’-GCGGCCGCTCTTCTATGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAATTCCTACCGT-3’(序列編號No：1)

順向引子：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGACGGTAGGAATTC-3’(序列編號No：2)

反向引子：5’-GCGGCCGCTCTTCTATG-3’(序列編號No：3)

DNA模板(序列編號No：1)中連續N為40個呈任意組合的核苷酸(40N：各N為A、G、C或T)，產生對所得的各個適體而言係獨特之序列區域。順向引子包含T7 RNA聚合酶之啟動子序列。於第一循環所使用之RNA池的變化程度係理論上為10¹⁴。

添加該RNA池至已固定有凝乳酶之載體，並允許於室溫靜置30分中。接著，移除未結合到凝乳酶之RNA，以溶液A清洗樹脂。於此，溶液A係145 mM氯化鈉、5.4 mM氯化鉀、1.8 mM氯化鈣、0.8 mM氯化鎂及20 mM Tris之混合溶液。將結合至凝乳酶的RNA於95℃加熱10分鐘，並加入溶液B作為洗提液，並自上清液中回收RNA。於此，溶液係B為7M尿素、3 mM EDTA以及100 mM Tris-HCl(pH 6.6)之混合液。以RT-PCR擴增所回收之RNA並使用DuraScribe^TM T7轉錄試劑組轉錄之，將此作為下一循環的池。將此過程視為1次循環，實行多次相同操作。完成SELEX後，將PCR產物純株化至pGEM-T Easy Vector(由Promega製造)，並將之轉形到大腸桿菌DH5α菌株(由Toyobo製造)中。將質體從單一純株中抽出後，使用DNA定序儀(3130x1基因分析儀，ABI製造)確定純株的鹼基序列。

SELEX 8次循環後，定序44個純株；可見到序列驅同(sequence convergence)。某些純株的序列係顯示於序列編號No：4至20。於這些序列中，有6個序列編號No：4所示序列，2個序列編號No：5所示序列，以及1個序列編號No：6至20所示序列。序列編號No：6與8只差一個鹼基。發現到序列編號No：4、13與14之序列含有序列編號No：21所示之共同序列，於該44個純株中，序列編號No：21所示序列出現在其中9個純株中。使用MFOLD程式(M. Zuker,Nucleic Acids Res. 31(13),3406-3415,2003)推定這些序列的二級結構；該共同序列部分所形成的部分具有相似環(loop)結構。於第1圖中提供該等序列編號No：4、5、12至14及18所示序列的推定二級結構，其中該由序列編號No：21所示之共同序列所形成的各部分係內含於一個圓中。

下面提供各核苷酸序列。除非另行指明，否則下述個別序列係以5’往3’之方向顯示，且嘌呤鹼基(A與G)呈2’-OH形式，嘧啶鹼基(U及C)呈2’-氟-修飾形式。於這些序列中，N₁與N₂之各者係指A、G、C與U之外的任何核苷酸，且X₁與X₂都為A或都為G。

序列編號No：4：GGGACGGUAGGAAUUCGUCCAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAACAAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：5：GGGACGGUAGGAAUUCCCACUUGUCUUUGAGGCAAGAAAUUGUAUUCCGAAGAAGCAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：6：GGGACGGUAGGAAUUCUACGGUCUGUGUGAAAUUGAAACACACAAAGAACAAUAGACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：7：GGGACGGUAGGAAUUCACCUUUCCAAUUGUGAAAGAAACACAAAAAGAAAUGACAUCAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：8：GGGACGGUAGGAAUUCUACGGUCUGUGUGAAAUUGAAACACACAAAGAACAAUAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：9：GGGACGGUAGGAAUUCCCGAAAAGCAACAAGCUUGCUAAAAUGAUUCCGAAAAAACACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：10：GGGACGGUAGGAAUUCCGCCGCCUAAAAAACGACGAUAUUACAGAAACGUCAAAUACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：11：GGGACGGUAGGAAUUCCCGACACGAAAUGUGUGAUUAAUUCCGAACAACAAAGUAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：12：GGGACGGUAGGAAUUCGCCGUCAACGUUACAUAAUGUAUAUACCAGGGUAACUAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：13：GGGACGGUAGGAAUUCCGCAACCAUCCCGUAACUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：14：GGGACGGUAGGAAUUCUCGUUCCUGACAGCAUUUGAGAUAGAUUUAAACAAACGCACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：15：GGGACGGUAGGAAUUCCCAGAAAAUAAAUUCCGAAGAAAACAACAAUUUUUGCAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：16：GGGACGGUAGGAAUUCCCAUGACUGAAAAACGUCAGUAAAAUCCGAAAAUCAUAUCAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：17：GGGACGGUAGGAAUUCCGUUCGCAGAAACGAACUUUUAAAAAAUGUACGUGGGAGCACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：18：GGGACGGUAGGAAUUCGAACGACAAAUUAUAGAACUUCGUUUGACAUUCCACACCACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：19：GGGACGGUAGGAAUUCCCACUGCAAUUCAGCAGAAAAAAUUCCGAAAAACACACACCAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：20：GGGACGGUAGGAAUUCAAAAUCAGCUGAUUUGUAAUUUUUUUACACAGGCAAAACACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：21：X₁GAUAGAN₁N₂UAAX₂

於上述8次循環後，於相似條件下續行SELEX。於完成第11次循環後，定序93個純株。某些純株的序列係顯示於序列編號No：22至27。一些序列係與某幾個8次循環後所得序列相同；有22個序列編號No：4所示序列及4個序列編號No：14所示序列。這表示序列編號No：21所示之共同序列被濃縮了。也有1個序列編號No：5所示序列、3個序列編號No：22所示序列及2個序列編號No：23與24所示序列。1個序列編號No：25至27所示序列。序列編號No：22與11只差一個鹼基。序列編號No：26與4只差一個鹼基。於該93個純株中，序列編號No：21所示之共同序列出現在其中35個純株中。帶有第11次循環才新出現之序列中，序列編號No：25與26所示序列含有序列編號No：21所示之共同序列。於第2圖中提供該等序列編號No：22至27所示序列的推定二級結構，其中該由序列編號No：21所示之共同序列所形成的各部分係內含於一個圓中。所有這些部分具有如第1圖所示特徵性環節構。

下面提供各核苷酸序列。除非另行指明，否則下述個別序列係以5’往3’之方向顯示，且嘌呤鹼基(A與G)呈2’-OH形式，嘧啶鹼基(U及C)呈2’-氟-修飾形式。

序列編號No：22：GGGACGGUAGGAAUUCCCGACACAAAAUGUGUGAUUAAUUCCGAACAACAAAGUAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：23：GGGACGGUAGGAAUUCAUAUGUACUCCGUCCUGACAAAAUGUCAAUGACAAACGUUCAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：24：GGGACGGUAGGAAUUCCCUUCAUAGUAGAAUGUUGGUUUCUACAAAAGCGACAAGCAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：25：GGGACGGUAGGAAUUCAGCUGACUCCAAUGCACACGUAGAUAGAGUUAAAACGUUGCAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：26：GGGACGGUAGGAAUUCGUCGAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAACAAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：27：GGGACGGUAGGAAUUCCGUCAUCGGUUGCAAAUUGAAAAUACAAAACAAGGACAACCAUAGAAGAGCGGCCGC

於上述8次循環SELEX後，使用固定於肝素Sepharose 6 Fast Flow(由GE Heal thcare所製造)載體上之凝乳酶(人類皮膚，由Calbiochem所製造)作為目標分子而續行SELEX。添加凝乳酶溶液至載體，並留置於室溫30分鐘，藉此使凝乳酶固定於載體。以SDS-PAGE檢查固定前凝乳酶溶液及剛固定完之上清液確認已固定量。SDS-PAGE的結果顯示，於上清液中未偵測到任何凝乳酶條帶；其確認幾乎所有使用的凝乳酶都被固定了。顯然約有100微微莫耳(pmol)的凝乳酶固定至約3微升(μL)的樹脂。

純株化第11次循環的池，並定出79個純株的序列。這些純株中的某些序列係顯示於序列編號No：28至34。其中一些序列係與上述8次循環後所得序列相同；有9個序列編號No：4所示序列及1個序列編號No：19所示序列。其中一些序列係與上述第11次循環後所得序列相同；有2個序列編號No：27所示序列。另外，有4個序列編號No：28所示序列、2個序列編號No：29所示序列及1個序列編號No：30至34所示序列。序列編號No：30與31只差一個鹼基。序列編號No：32為序列編號No：31刪除一個鹼基所得之序列。於該79個純株中，序列編號No：21所示之共同序列出現在其中14個純株中。帶有第11次循環才新出現之序列中，發現到序列編號No：30至32及34所示序列含有序列編號No：21所示之共同序列。於第3圖中提供該等序列編號No：28至34所示序列的推定二級結構，其中該由序列編號No：21所示之共同序列所形成的各部分係內含於一個圓中。所有這些部分(除了序列編號No：34所示純株外)具有如第1圖所示特徵性環節構。

下面分別為序列編號No：28至34所示核苷酸序列。除非另行指明，否則下述個別序列係以5’往3’之方向顯示，且嘌呤鹼基(A與G)呈2’-OH形式，嘧啶鹼基(U及C)呈2’-氟-修飾形式。

序列編號No：28：GGGACGGUAGGAAUUCAAUUUCUUUCUAUUCUCACCUGAGUAUAUCAGGCACAGUACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：29：GGGACGGUAGGAAUUCACGACCGCCCAAAAAAUGGUGACAUUUUAGAAACACCGAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：30：GGGACGGUAGGAAUUCGUCCCUCUUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：31：GGGACGGUAGGAAUUCGUCCCUCAUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：32：GGGACGGUAGGAAUUCGUCCUCAUGUCUAUUUUGCAGAUAGACUUAAAGCAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：33：GGGACGGUAGGAAUUCCUGUCUUUUCCCACGCAACAAAUUACAGAGCUUUGCAAAACAUAGAAGAGCGGCCGC

序列編號No：34：GGGACGGUAGGAAUUCUGCCGCAACCCAAUGAAAACGAAGAUAGAGAUAAAUCGAACAUAGAAGAGCGGCCGC

藉由使用Biacore T100(GE Healthcare製造)之表面電漿共振(surface plasmon resonance)方法確定序列編號No：4至20與22至34所示核酸對凝乳酶的結合活性。所使用的感測晶片為SA晶片，該晶片係具有固定於其上之卵白素。結合到卵白素的是帶有鍵結至其5’端的生物素之約1500 RU的16-核苷酸多dT。配位子核酸具有加至其3’端的16-核苷酸多A，且其係藉由T與A緩冷配對(annealing)而固定至SA晶片。以20μL/分鐘流速將20 μL之各核酸注入，而有約1000 RU核酸被固定。注入製配成0.2μM之20μL凝乳酶作為分析物。溶液A係用來作為運行緩衝液(running buffer)。

發現所有經試驗的序列都結合到凝乳酶(表1)。然而，發現到，於第1循環所用的核酸池(40N)(含有作為陰性對照的40個核苷酸之隨機序列)也對凝乳酶具有弱結合活性。因此，於表1中，將具有高於40N之結合活性的適體以++表示，而具有與40N相當之結合活性的適體以+表示。於第4圖中係提供顯示序列編號No：12與13所示之適體是如何鍵結至凝乳酶的感測圖。

不論序列編號No：21所示之共同序列是存在或是不存在，某些序列具有高於40N之結合活性，而其他序列則具有與40N相當之結合活性。序列編號No：4、13、14、25、26及30(包含此共同序列)係具有高於40N之結合活性，然而，序列編號No：31、32及34(包含相同之共同序列)係具有與40N相當之結合活性。已發現包含於序列編號No：21序列中之N₁N₂可為GA、GU、UU、或CU，以及包含於序列編號No：21序列中之X₁與X₂可都為A。

表1：對凝乳酶之結合活性

“++”表示一個序列係比陰性對照40N更強力地專一性結合至凝乳酶。“+”示一個序列係以與陰性對照40N相當之強度專一性結合至凝乳酶。於此，40N表示於第1循環所用的核酸池，其包含40個核苷酸的隨機序列。

實施例2：專一性結合凝乳酶之RNA適體的製備(2)

以實施例1相同的方式實施SELEX，但改使用具有30個核苷酸之隨機序列的模板，以及與實施例1所用者不同之引子序列。SELEX所用之目標分子為固定於NHS-活化之Sepharose 4 Fast Flow(由GE Heal thcare所製造)載體之凝乳酶(重組體，由SIGMA製造)。所用之模板與引子的序列係如下所示。DNA模板與引子為化學合成者。

DNA模板：

5’-TCACACTAGCACGCATAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCATCTGACCTCTCTCCTGCTCCC-3’(序列編號No：35)

順向引子：

5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGCAGGAGAGAGGTCAGATG-3’(序列編號No：36)

反向引子：

5’-TCACACTAGCACGCATAGG-3’(序列編號No：37)

DNA模板(序列編號No：35)中連續N為30個呈任意組合的核苷酸(30N：各N為A、G、C或T)，產生對所得的各個適體而言係獨特之序列區域。順向引子包含T7 RNA聚合酶之啟動子序列。於第一循環所使用之RNA池的變化程度係理論上為10¹⁴。

添加該RNA池至其上已固定有凝乳酶之載體，並允許於室溫留置30分中，接著，以溶液C清洗樹脂以移除未結合到凝乳酶之RNA。於此，溶液C係145 mM氯化鈉、5.4 mM氯化鉀、1.8 mM氯化鈣、0.8 mM氯化鎂、20 mM Tris(pH 7.6)及0.05% Tween 20之混合溶液。藉由加入溶液D作為洗提液以及於室溫攪拌混合物10分鐘，而回收結合至凝乳酶的RNA。於此，溶液係D係藉由將6M胍鹽酸鹽加到溶液C以獲得pH 7.6而製備。進行3次洗提。以RT-PCR擴增所回收之RNA並使用DuraScribe^TM T7轉錄試劑組轉譯之，將此作為下一循環的池。各循環的這些步驟重覆數次。完成SELEX後，將PCR產物純株化至pGEM-T Easy Vector(由Promega製造)，並將之轉形到大腸桿菌DH5 α菌株(由Toyobo製造)中。將質體從單一純株中抽出後，使用DNA定序儀(3130x1基因分析儀，ABI製造)將這些純株定序。

完成SELEX的8次循環後，定出該等序列；未見到序列驅同(sequence convergence)。因此，加入2 mg/mL之肝素作為競爭劑。續行SELEX至第11次循環。定出40個純株的序列；未見到序列驅同；發現到所有這40個純株的序列含有序列編號No：21所示之共同序列。這些純株中的某些序列係顯示於序列編號No：38至48。有6個序列編號No：38所示序列，2個序列編號No：39所示序列，及1個序列編號No：40至48所示序列。

於第5圖中提供序列編號No：38至40、43及48所示序列之適體的推定二級結構，其中由序列編號No：21所示之共同序列所形成的各部分係內含於一個圓中。這些部分的多者中，由序列編號No：21所示之共同序列形成類似於第1圖所示之特徵性環節構。

下面分別為序列編號No：38至48所示核苷酸序列。除非另行指明，否則下述個別序列係以5’往3’之方向顯示，且嘌呤鹼基(A與G)呈2’-OH形式，嘧啶鹼基(U及C)呈2’-氟-修飾形式。

序列編號No：38：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGAUAGAGUUAAGAUCUGGCUGGCGCAUUAGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：39：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGUUACGGAUAGAGUUAAGGUAACGGUACGGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：40：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGAACGGAUAGAGCUAAGAGUUCGUCAGAGGGGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：41：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGUGAGAUAGAGUUAAACACCACAAUAGUAGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：42：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGCGUGAUCGUGCAAGGCGGAUAGAGUUAAGGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：43：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGAUGCCAAGAUAGAUUUAAAUGGCGUUUGGGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：44：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGUUAGACCAAAGCAUAGGAGAUAGAGUUAAACCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：45：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGACCACCGAUGGGCAAGAUAGAGUUAAAUGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：46：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGGACAGAUAGAGUUAAAGUCCGUUACGUGGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：47：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGGUGAUAGAUAGAGUUAAAAUCGCUGAAUGGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

序列編號No：48：GGGAGCAGGAGAGAGGUCAGAUGUGAAGAUAGAGAUAAAUCACAUACAGUCGGCCUAUGCGUGCUAGUGUGA

藉由表面電漿共振方法評定序列編號No：38至48所示核酸對凝乳酶的結合活性。於評定序列編號No：38至48時，以如實施例1相同的方式進行測量。將溶液C用來作為運行緩衝液(running buffer)。測量結果顯示於表2。

序列編號No：38至48所示核酸經識別為顯著比30N更強力地結合凝乳酶之適體已發現包含於序列編號No：21共同序列中之X₁與X₂可都為A或都為G，以及包含於共同序列中之N₁N₂可為GU、GC、GA或UU。

表2：對凝乳酶之結合活性

“++”表示一個序列係比陰性對照30N顯著更強力地結合至凝乳酶。於此，30N表示於第1次循環所用的核酸池，其包含30個核苷酸的隨機序列。

實施例3：使用合成受質之凝乳酶抑制活性之確定

係如下所述般確定序列編號No：4至20、22至34及38至48所示核酸是否抑制凝乳酶之活性。所使用之凝乳酶受質為Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA(由Peptide institute,Inc.所製造)，其係含有4-胺基酸肽Ala-Ala-Pro-Phe，為一種類胰凝乳酶之蛋白酶的標準受質。於此，Suc為保護性琥珀醯基，而MCA為4-甲基香豆基-7醯胺基；一旦切斷苯丙胺酸的C-端側，AMC(7-胺基-4-甲基香豆素)會釋出。藉由偵測AMC螢光，可確定凝乳酶的酵素活性。此試驗係使用96-孔盤(F16 Black Maxisorp Fluoronunc，由Nunc製造)，以在作為緩衝液之溶液C之100μL反應混合物體積中進行。首先，將各核酸序列稀釋於溶液C中呈0.0027至2μM濃度，而獲得50μL溶液。加入製備於溶液C中之10μL之1 mM受質後，將盤設於微盤讀取器SpectraMax190(Molecular Devices Corporation製造)上，並於37℃培養5分鐘。另外，將0.05μg(或0.005μg)之凝乳酶(重組體，SIGMA製造)稀釋於溶液C，而獲得40μL凝乳酶溶液，並於37℃培養5分鐘。將此凝乳酶溶液加入到核酸與受質之混合液中以起始酵素反應。於反應混合物中之最終凝乳酶濃度為16.7 nM(或1.67 nM)，而最終受質濃度為100μM。將含反應混合物之盤設於微盤讀取器SpectraMax190(Molecular Devices Corporation製造)上，並調查5分鐘(或30分鐘)於37℃螢光強度之時間依賴性變化(或30分鐘)(激發波長380 nm，偵測波長460 nm)。產生因凝乳酶活性而自受質釋出之AMC的螢光增加的線性近似，取其斜率作為起始反應速度(V_max)。至於對照，以相同方式處理並分析兩種例子中之樣本：使用30N或40N(具30或40個由N表示連續鹼基的核苷酸；N為A、G、C或T)核酸池(陰性對照)，以及使用抑凝乳酶素(Chymostatin)，為已知類胰凝乳酶絲胺酸蛋白酶抑制劑(陽性對照)。取沒有核酸與抑制劑的起始反應速度(V₀)作為100%酵素活性，使用下式計算各測試受質的抑制率：

抑制率(%)=(1-V_max/V₀)×100

決定造成50%酵素性活性抑制所需抑制劑濃度(IC₅₀)。結果顯示於表3。

表3：對凝乳酶的抑制活性(IC₅₀)

“>0.5”表示於濃度高達0.5μM並未觀測到抑制活性。各IC₅₀值為2至3次測量的平均值。

陰性對照30N或40N並未顯示抑制活性(IC₅₀>0.5μM)。陽性對照抑凝乳酶素顯示IC₅₀值為0.1μM至0.2μM。

綜上，許多表3所列適體顯示對凝乳酶的抑制活性。具體來說，顯示IC₅₀值為0.1μM或更低之適體，可判定為具有優異抑制效果。包含序列編號No：21所示共同序列之適體皆顯示抑制活性。這些發現證實包含於共同序列中之X₁與X₂可都為A或都為G，以及N₁N₂可為下列任一：GA、GU、GC、UU及CU。

實施例4：適體的截斷

係將序列編號No：4、12、13與14所示之適體截斷。序列編號No：4、13與14所示之適體包含序列編號No：21所示共同序列。序列編號No：12為不包含共同序列之適體。經截斷適體之序列係顯示於序列編號No：49至57。第6圖係提供序列編號No：49、51及55至57所示之適體的推定二級結構，其中由序列編號No：21所示之共同序列所形成的各部分係內含於一個圓中。

下面分別為序列編號No：49至57所示核苷酸序列。除非另行指明，否則下述個別序列係以5’往3’之方向顯示，且嘌呤鹼基(A與G)呈2’-OH形式，嘧啶鹼基(U及C)呈2’-氟-修飾形式。

序列編號No：49：(藉由縮短序列編號No：4所示之純株成29-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列)GGUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAACC

序列編號No：50：(藉由縮短序列編號No：4所示之純株成35-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列)GGCAUUCUACAGAUAGAGAUAAAGUAGAAUUUAAC

序列編號No：51：(藉由縮短序列編號No：12所示之純株成45-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列)CGUUACAUAAUGUAUAUACCAGGGUAACUAAACAUAGAAGAGCGG

序列編號No：52：(藉由縮短序列編號No：12所示之純株成26-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列)CCGUAUAUACCAGGGUAACUAAACGG

序列編號No：53：(藉由縮短序列編號No：13所示之純株成42-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列)GGGUAACUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAGAAGACCC

序列編號No：54：(藉由縮短序列編號No：13所示之純株成36-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列)UAACUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAGAAGA

序列編號No：55：(藉由縮短序列編號No：13所示之純株成29-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列))CUAUGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCAUAG

序列編號No：56：(藉由縮短序列編號No：13所示之純株成23-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列)GGGUUAGAUAGAGUUAAAAACCC

序列編號No：57：(藉由縮短序列編號No：14所示之純株成27-核苷酸長度而製備之包括該共同序列之序列)GCAUUUGAGAUAGAUUUAAACAAACGC

序列編號No：49至57之核酸皆為化學合成者。

這些核酸是否結合至凝乳酶係藉由表面電漿共振方法確定。測量係如下所述般使用Biacore T100(GE Heal thcare製造)進行。使用胺耦合試劑組將約4000 RU的凝乳酶(重組體，SIGMA製造重組體)固定至CM5晶片的感測晶片表面。將製備成0.3μM之20μL的各核酸溶液作為分析物，以20μL/分鐘之流速注入。使用溶液C作為運行緩衝液。測量的結果顯示於表4。所用的評括方法係與實施例1同。

結果，除了序列編號No：52以外的核酸係經識別為顯著比控制組40N更強力地結合凝乳酶之適體(表4)。於第7圖中係提供顯示序列編號No：13、55與56所示之適體是如何鍵結至凝乳酶的感測圖。

以如實施例3之相同方式確定對凝乳酶的抑制活性。各自的IC₅₀係顯示於表4中。

除了序列編號No：52以外的核酸係顯示強力抑制活性(表4)。序列編號No：51與52的結果顯示序列編號No：12所示之適體(不含共同序列)於縮短成45-核苷酸長度後仍保留其活性，並於縮短成26-核苷酸長度後失去活性。

同時，序列編號No：56的結果顯示序列編號No：13所示之適體(包含共同序列)可被縮短至23-核苷酸長度。這證實序列編號No：21所示之共同序列對於對凝乳酶的結合與抑制活性係關鍵。

由於序列編號No：49與57也顯示抑制活性，這顯示含於共同序列中之N₁N₂不限於GU，且對第6圖之序列編號No：56莖結構所含之序列沒有特別限制，只要有保留該莖結構。

認為這些適體適於作為凝乳酶抑制劑。

表4：對凝乳酶的結合與抑制活性(IC₅₀)

“++”表示一個序列係比陰性對照40N更強力地結合至凝乳酶。“+”示一個序列係以與陰性對照40N相當之強度結合至凝乳酶。於此，40N表示於第1次循環所用的核酸池，其包含40個核苷酸的隨機序列。“>1”表示於濃度高達1μM並未觀測到抑制活性。各IC₅₀值為2至3次測量的平均值。

陰性對照40N濃度高達1μM並未顯示抑制活性(IC₅₀>1μM)。陽性對照抑凝乳酶素顯示IC₅₀值為0.1μM至0.2μM。

綜上，除了序列編號No：52以外，表4所列適體顯示對凝乳酶的抑制活性。具體來說，顯示IC₅₀值為0.1μM或更低之該等核酸，可判定為具有優異抑制效果。

實施例5：縮短之適體的鹼基取代、刪除效果

於序列編號No：56所示之適體中引入突變或刪除，並檢視其對結合活性與抑制活性的影響。該等序列係顯示於序列編號No：58至68。

於下係顯示由下述序列編號No：58至68所示之適體的個別核苷酸序列。除非另行指明，否則下述個別序列係以5’往3’之方向顯示，對核糖之2’位置之修飾係以括弧表示(例如U(F)指以F修飾核糖之2’位置之脲嘧啶)，其中F為氟原子。

序列編號No：58：(其中含有序列編號No：56所示純株之共同序列中所含之隨機置放的13個核酸鹼基之序列)GGGU(F)U(F)GAAGAU(F)AU(F)U(F)AAAGAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：59：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列中所含之N₂係]取代之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGAU(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：60：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列中所含之N₂係經取代之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGC(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號NO：61：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列中所含之N₁係經取代之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAU(F)U(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：62：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列中所含之X₁與X2係經取代之序列)GGGU(F)U(F)GGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAGAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：63：(其中序列編號No：56所示純株所含之除了共同序列以外鹼基係經取代之序列)GC(F)U(F)AC(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAGU(F)AGC(F)

序列編號No：64：(其中序列編號No：56所示純株所含之除了共同序列以外鹼基係經取代之序列)GU(F)C(F)AC(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAGU(F)GAC(F)

序列編號No：65：(其中序列編號No：56所示純株所含之除了共同序列以外鹼基係部分經取代或部分經刪除之序列)GGC(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAGC(F)C(F)

序列編號No：66：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列中所含之嘌呤鹼基係經嘧啶鹼基取代之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)CGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：67：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列中所含之嘌呤鹼基係經嘧啶鹼基取代之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)ACAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：68：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列中所含之嘌呤鹼基係經嘧啶鹼基取代之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGUGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

所有序列編號No：58至68之核酸係由化學合成所製備。係以如實施例4相同之方式藉由表面電漿共振方法試驗這些核酸是否結合凝乳酶。係以如實施例3相同之方式測量對凝乳酶之抑制活性。結果顯示於表5。

結果發現，於表5所示之核酸中，序列編號No：59至65之核酸保留強結合力以及強抑制活性。

由於序列編號No：58的結合活性與抑制活性下降至約與實施例1與2中所用之40N/30N相同程度，這顯示序列編號No：21所示共同序列對於對凝乳酶之結合與抑制活性來說是重要的。由這些結果，係使用序列編號No：58作為下述實施例(實施例5至9)中縮短之適體的陰性對照。

從序列編號No：59至61的結果顯示，共同序列中所含N₁與N₂可為任何一種核苷酸，較佳為GU、GA、GC及UU。從序列編號No：62的結果顯示，共同序列中所含X₁與XN₂可為任何一種核苷酸，較佳為A及G，更佳為皆為A或皆為G。

從序列編號No：63至65的結果顯示，除共同序列外，其所含之莖結構之鹼基對序列(例如第6圖中之序列編號No：56)可為任何一種核苷酸，只要有莖結構保持且長度較佳為3個鹼基對或更長。

從序列編號No：66至68的結果來說，由於將突變引入共同序列中會降低活性，再次顯示共同序列的重要。

表5凝乳酶結合活性與凝乳酶抑制活性(IC₅₀)

於結合活性，“++”表示比作為陰性對照之序列編號No：58更顯著地結合至凝乳酶，而“+”表示如作為陰性對照序列編號No：58之相似結合程度。於抑制活性，“>1”表示於濃度高達1μM並未觀測到抑制活性。各IC₅₀值為2次測量的平均值。

序列編號No：58於濃度高達1μM時並未顯示抑制活性(IC₅₀>1μM)。此外，作為陽性對照之抑凝乳酶素的IC₅₀值為0.1μM至0.2μM。從上述結果，明顯地，於表5所列的適體中，序列編號No：59至65所示之適體具有強凝乳酶抑制活性(IC₅₀<0.1μM)。

實施例6：縮短適體的變更-1

為增強序列編號No：56所示之適體(具有末端修飾之經變更適體)的核酸酶抗性，製備下述經變更適體：其中序列的核糖之2’位置的嘌呤鹼基以0-甲基或F修飾之經變更適體，以及其中係引入硫代磷酸酯(phosphorothioate)之經變更適體。該等序列係顯示於序列編號No：56(1)至56(14)、56(17)至56(19)。此外，係製備下述經變更適體：其中將序列編號No：56所示適體的共同序列所包含的嘧啶核苷酸修飾體(2’-F，核糖之2’位置之F修飾)改變成天然形式(2’-OH)者，且對修飾的必要性進行評括。其序列係顯示成序列編號No：56(15)、56(16)。

下面提供各核苷酸序列。除非另行指明，否則下述個別序列係以5’往3’之方向顯示，且對核糖之2’位置之修飾係以括弧表示，F為氟原子，MO-甲基。於各序列的端點，idT表示經倒排-dT修飾，而PEG表示經40 kDa分枝聚乙二醇修飾。於序列中，s表示核苷酸間之磷酸酯基的硫代磷酸酯化(phosphorothioation)。

序列編號No：56(1)：(其中序列編號No：56所示純株之兩末端都經idT修飾之序列)idT-GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(2)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列以外的3個位置之序列)G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(3)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列以外的2個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAA(M)A(M)C(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(4)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)A(M)GAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(5)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的2個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)A(M)A(M)AAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(6)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AG(M)AU(F)AGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(7)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGA(M)U(F)AGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(8)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AG(M)AGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(9)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGA(M)GU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(10)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)A(M)GAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(11)：(s其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAA(M)AAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(12)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAG(M)U(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(13)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AG(F)AGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(14)：(其中將修飾引入序列編號No：56所示純株之共同序列的1個位置之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGA(F)GU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(15)：(其中序列編號No：56所示純株之的第9個核苷酸U(F)係以U取代之序列)GGGU(F)U(F)AGAUAGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(16)：(其中序列編號No：56所示純株之的第15個核苷酸U(F)係以U取代之序列)GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGU(F)UAAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(17)：(其中序列編號No：56所示純株之末端經PEG與idT修飾之序列)PEG-GGGU(F)U(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(18)：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列的磷酸酯基係硫代磷酸酯化之序列)GGGU(F)U(F)sAGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(19)：(其中序列編號No：56所示純株之共同序列的磷酸酯基係硫代磷酸酯化之序列)GGGU(F)U(F)AsGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)

所有序列編號No：56(1)至56(19)之核酸係化學合成製備者。係以如實施例4相同之方式藉由表面電漿共振方法試驗這些核酸是否結合凝乳酶。結果顯示於表6。

結果發現，除了序列編號No：56(8)、56(10)、56(13)、56(14)以外之核酸係顯示較作為陰性對照之序列編號No：58更顯著之凝乳酶結合活性。

係以如實施例3相同之方式測量抑制活性，IC₅₀值係顯示於表6。發現到雖然抑制活性程度間有差異，除了序列編號No：56(8)、56(10)、56(13)、56(14)以外之核酸係顯示抑制活性。藉由比較IC₅₀值得知，序列編號No：56(1)至56(7)、56(11)、56(12)之抑制活性係維持在約與序列編號No：56相同之程度。另一方面，相較於序列編號No：56，序列編號No：56(9)、56(15)、56(16)、56(17)之抑制活性係下降，且序列編號No：56(8)、56(10)、56(13)、56(14)顯示抑制活性消失。再者，相較於序列編號No：56，序列編號No：56(18)、56(19)顯示抑制活性增加。

從序列編號No：56(1)、56(17)之結果發現，末端修飾對活性的影響係小。從序列編號No：56(2)、56(3)之結果顯示，修飾莖序列不影響活性。關於含於共同序中之核苷酸，56(4)至56(7)、56(11)、56(12)的修飾允許維持抑制活性，而序列編號No：56(8)、56(9)、56(10)、56(13)、56(14)的修飾則使抑制活性降低(或滅絕)。

從上述發現，至少一個序列編號No：56所示之適體的核苷酸可經修飾以增加適體穩定性。作為核苷酸修飾，除了2’-O一甲基修飾外，可提及的例如為2’-胺基修飾等。

另一方面，從序列編號No：56(15)、56(16)之結果發現，抑制活性因改變序列編號No：56所示之純株之共同序列中所含的任一個經修飾核苷酸(第9個或第15個)之適體(U(F))為天然核糖核苷酸(U)而降低。通常，核苷酸修飾增加適體對核酸酶的抗性。因此，較佳地，至少一個共同序列中所含的嘧啶核苷酸(序列編號No：56所示純株的第9個U以及第15個U)為經修飾核苷酸。

再者，從序列編號No：56(8)、56(9)、56(10)、56(13)及56(14)之結果發現，由於在其中引入修飾會降低抑制活性，較佳地第6個A、第11個G及第12個A中的至少一個序列編號No：56所示純株之共同序列所含天然嘌呤鹼基係為天然核糖核苷酸。

再者，從序列編號No：56(18)、56(19)之結果發現，除對糖殘基修飾外，將硫代磷酸酯引入至少一個位置作為對磷酸酯的修飾會增加抑制活性。

表6凝乳酶結合活性與凝乳酶抑制活性(IC₅₀)。於結合活性，“++”表示比作為陰性對照之序列編號No：58更顯著地結合至凝乳酶，而“+”表示如作為陰性對照序列編號No：58之相似結合程度。“n.d.”表示未確定。於抑制活性，“>1”表示於濃度高達1μM並未觀測到抑制活性。各IC₅₀值為2次測量的平均值。

序列編號No：58(作為陰性對照)於濃度高達1μM時並未顯示抑制活性(IC₅₀>1μM)。此外，作為陽性對照之抑凝乳酶素的IC₅₀值為0.1μM至0.2μM。

從上述結果，於表6所列的適體中，尤其是IC₅₀值為0.1μM或更低者係具有強凝乳酶抑制活性且暗示其適於作為凝乳酶抑制劑。

實施例7：縮短適體的變更-2

序列編號No：56所示之適體依照實施例6之結果進一步變更。係進行引入2’-O-甲基、各種末端修飾、引入硫代磷酸酯、將核糖核苷酸取代成DNA等、及該等修飾之組合而合成經變更之適體。其序列係顯示於序列編號No：56(20)至56(47)、61(1)、69、69(1)、69(2)、70至74、74(1)、75至77、77(1)、77(2)、78至82。

下面顯示各核苷酸序列。除非另行指明，否則下述個別序列係以5’往3’之方向顯示，大寫字母顯示RNA，而小寫字母顯示DNA。對核糖之2’位置之修飾係以括弧表示，F為氟原子，MO-甲基。於各序列的端點，idT表示經倒排-dT修飾；PEG表示經40 kDa分枝聚乙二醇修飾；Cho表示經膽固醇修飾；而B表示經生物素修飾。肽1表示於C-端側的Phe-Cys接合，肽2表示於N-端側的Cys-Phe接合，且各肽係透過二硫鍵接合至核酸的5’端。於序列中，s表示核苷酸間之磷酸酯基的硫代磷酸酯化(phosphorothioation)。

序列編號No：56(20)：G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAGU(F)U(F)A(M)A(M)AA(M)A(M)C(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(21)：G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(22)：G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)sAG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(23)：G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AsG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)

序列編號No：56(24)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AGAU(F)AGAGU(F)U(F)AAAA(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(25)：idT-GGGU(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAGU(F)U(F)AAAAAC(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(26)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(27)：PEG-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(28)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AsG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(29)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)sAsG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(30)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AGA(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(31)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)AU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(32)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AGAU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(33)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AsGA(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(34)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AsG(M)AU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(35)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AsGAU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(36)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AGsAU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(37)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AsGsAU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(38)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)sAsGAU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(39)：PEG-GG(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(40)：idT-GG(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(41)：idT-GG(M)G(M)U(F)U(F)AsG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(42)：Cho-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(43)：肽-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(44)：肽2-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(45)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-PEG

序列編號No：56(46)：B-idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(47)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT-B

序列編號No：56(48)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)ccc-idT

序列編號No：56(49)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)aG(M)AU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(50)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)aU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(51)：B-idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)aU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：56(52)：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AgaU(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：61(1)：G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAU(F)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)

序列編號No：69：PEG-A(M)A(M)A(M)G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：69(1)：idT-A(M)A(M)A(M)G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AsG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：69(2)：idT-A(M)A(M)A(M)G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：70：idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)U(F)U(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：71：idT-G(M)G(M)G(M)U(F)U(F)AG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)tU(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)C(F)C(F)C(F)-idT

序列編號No：72：idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)tU(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)ccc-idT

序列編號No：72(1)：idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)aU(F)A(M)GAG(M)tU(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)ccc-idT

序列編號No：72(2)：idT-G(M)G(M)G(M)ttAsG(M)aU(F)A(M)GAG(M)tU(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)ccc-idT

序列編號No：72(3)：idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)A(M)U(F)A(M)GAgtU(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)ccc-idT

序列編號No：72(4)：idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)tU(F)aA(M)A(M)A(M)A(M)ccc-idT

序列編號No：72(5)：idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)tU(F)A(M)aA(M)A(M)A(M)ccc-idT

序列編號No：72(6)：idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)A(M)U(F)A(M)GAG(M)tU(F)A(M)A(M)aA(M)A(M)ccc-idT

序列編號No：72(7)：idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)aU(F)A(M)GAG(M)tU(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)ccc-PEG

序列編號No：72(8)：B-idT-G(M)G(M)G(M)ttAG(M)aU(F)A(M)GAG(M)tU(F)A(M)A(M)A(M)A(M)A(M)ccc-idT

所有序列編號No：56(20)至56(52)、61(1)、69、69(1)、69(2)、70至72、72(1)至72(8)之核酸係化學合成製備者。係以如實施例4相同之方式藉由表面電漿共振方法試驗這些核酸是否結合凝乳酶。結果顯示於表7。

結果發現，所有核酸(排除未定核酸)係顯示較陰性對照更顯著之凝乳酶結合活性。

係以如實施例3相同之方式測量抑制活性，IC₅₀值係顯示於表7。結果所有表7所示核酸係顯示強抑制活性。

從序列編號No：56(27)與56(45)結果顯示末端修飾，例如PEG，可引入5’端與3’端中任一者。

再者，從序列編號No：56(43)、56(44)、56(46)及56(47)之結果發現，除了實施例6所示之idT與PEG之外，末端修飾可為肽、胺基酸或諸如生物素之化合物等。

又，從序列編號No：56(26)、69(2)、56(27)及69與56(28)及69(1)之結果發現，諸如藉由聚核苷酸鏈之idT與PEG之末端修飾不影響抑制活性。作為這類間隔子，可使用任何聚核苷酸鏈，例如烷基類的間隔子。

亦發現藉由將一部分F-形式取代成DNA-形式會增加抑制活性。

表7凝乳酶結合活性與凝乳酶抑制活性(IC₅₀)。於結合活性，“++”表示比作為陰性對照之序列編號No：58更顯著地結合至凝乳酶。“n.d.”表示未確定。各IC₅₀值為2次測量的平均值。

從上述結果，所有表7所列的適體係具有強凝乳酶抑制活性，且暗示其適於作為凝乳酶抑制劑。

總結上述實施例1至7的結果，有效作為凝乳酶抑制劑之適體具體滿足下述條件之至少一者：

(1)　其含有序列編號No：21所示之共同序列(X₁GAUAGAN₁N₂UAAX₂)。

(2)　當共同序列所含嘧啶核苷酸可為天然核苷酸時，該等嘧啶核苷酸的一部分較佳為經修飾核苷酸或DNA。

(3)　當N₁N₂可為任何核苷酸時，其較佳為GU、GA、GC、UU、CU或GT。

(4)　當X₁與X₂可為任何核苷酸時，不論相同或不同，它們較佳為A或G，更佳為皆為A或皆為G。

(5)　當莖結構(例如第6圖中之序列編號No：56)中之鹼基對序列可為任何核苷酸時，只要維持有該莖結構且其長度較佳為3個鹼基對或更長。

(6)　除了一部分核苷酸(序列編號No：56的第6個A、第11個G及第12個A)外，各核苷酸係部份經修飾或部分經DNA取代。

(7)　引入末端修飾。

(8)　核苷酸間之部分磷酸酯基可經硫代磷酸酯化。

實施例8：使用血管收縮素I作為受質之凝乳酶抑制活性之測量

為了進一步評價本發明之核酸的抑制活性，根據下述方法使用血管收縮素I而測量凝乳酶活性，血管收縮素I為凝乳酶的天然受質。血管收縮素I被凝乳酶轉換成血管收縮素II，於此過程期間會釋出His-Leu肽片段。由於His-Leu肽係以鄰苯二甲酸衍生衍生成帶螢光，可定量式測量其螢光強度。

該試驗中酵素反應的總體積設為50μL，反應係於溶液C緩衝液中進行。首先，將0.3至0.75 ng凝乳酶(SIGMA製造之重組體；或Calbiochem製造之天然凝乳酶)稀釋於溶液C中，而得到5μL凝乳酶溶液。於此，該重組體凝乳酶為酵母表達的凝乳酶，而天然凝乳酶係自人類巨大細胞純化而得者。將核酸序列稀釋於溶液C中呈0.0027至2μM濃度，而獲得25μL溶液。將凝乳酶溶液(5μL)與核酸溶液(25μL)混合，並將混合液於37℃培養5分鐘。另一方面，於溶液C中製備125 mM血管收縮素I(PEPTIDE INSTITUTE,INC.製造)而得20μL，並將之於37℃培養5分鐘。將血管收縮素I溶液加入凝乳酶與核酸的混合液中以開始酵素反應。於此反應溶液中之最終凝乳酶濃度為0.2至0.5 nM，而最終受質濃度為50μM。於37℃反應90分鐘後，添加25μL冰的30%三氯乙酸溶液來終止反應。將整個混合物於4℃，14000 rpm離心10分鐘，並將30μL上清液用於後續螢光誘導反應。

將30μL上述上清液加到96-孔盤後(black，由Costar製造)，於各孔中加入2%鄰苯二甲酸(由SIGMA製造)之甲醇溶液(15μL)以及170μL之0.3M NaOH溶液，並允許該混合物於室溫培養10分鐘。接著添加25μL之3M HCl溶液來終止反應。將該盤放到微量盤偵測儀SpectraMax190(Molecular Devices Corporation製造)中，並於激發波長355 nm，偵測波長460 nm測量螢光強度。

使用序列編號No：58作為控制組(陰性對照)，以及使用抑凝乳酶素(chymostatin)，為已知類胰凝乳酶絲胺酸蛋白酶抑制劑(陽性對照)，進行相似處理與測量。於各條件下，取0分鐘反應時點的螢光強度作為空白。取加入等量體積溶液C來取代核酸所偵測到之凝乳酶酵素反應螢光強度作為100%，依下式計算各測試受質的抑制率。

抑制率(%)=[1-{(有受測試受質的螢光強度一有受測試受質之空白組的螢光強度)/(沒有受測試受質的螢光強度-沒有受測試受質之空白組的螢光強度)}]×100

決定造成50%酵素性活性抑制所需濃度(IC₅₀)。結果顯示於表8。

表8：使用血管收縮素I作為受質之凝乳酶抑制活性(IC₅₀)。IC₅₀為一次測量結果。

作為陰性對照使用之序列編號No：58並未顯示抑制活性(IC₅₀>1μM)。此外，作為陽性對照之抑凝乳酶素的IC₅₀值為0.35μM至0.5μM(天然)，0.45至0.6μM(重組)。與未接合PEG之適體相比，接合有PEG之適體係具有相對較低之凝乳酶抑制活性。此為具有與適體(分子量約10,000)相比更大尺寸的PEG(分子量約40,000)所造成的一般現象。由於有PEG-接合顯著改善體內藥物動力學，即使於體外效能有某種程度的下降，仍可預期體內作用。

從上述結果，由於即使是使用天然受質血管收縮素I時任何表8所含的核酸都顯示強凝乳酶抑制活性，因此預期任何表8所含的核酸係作為用於預防及/或治療各種涉及血管收縮素之疾病的藥物。

實施例9：使用正常人類肺纖維原母細胞(Normal Human Lung Fibroblast,NHLF)之LTBP-1降解抑制活性的測量

凝乳酶深涉TGF-β的活化，TGF-β的活化為造成纖維化症的重要因素之一。這暗示TGF-β的過程中，凝乳酶降解LTBP-1而釋出潛伏性TGF-β(潛伏性TGF-β以潛伏型式存在於細胞間基質中)且係涉及將潛伏性TGF-β轉換成活性TGF-β之反應。係藉由下述方法試驗本發明之核酸是否對凝乳酶降解LTBP-1具有抑制活性。

將極冷保藏NHLF細胞(Cambrex Bio Science製造)於37℃水浴中快速解凍，並將之懸浮於培養液中(10% FBS/F-12)。離心(1200 rpm，5分鐘)後，移除上清液，並將細胞再次懸浮於培養液中。將培養液添加達總體積為10 mL，將此混合液倒到細胞培養之培養盤，並於37℃，5% CO₂培養細胞。以顯微鏡觀察到細胞形態與增生狀態，當細胞達緻密生長時，更換培養液為不含血清培養液(0.2% BSA/F-12)。更換培養液兩天後，收集、分裝該培養上清液，並儲存於-30℃。

於使用時將已解凍LNHLF培養上清液(40μ)分裝到管子中，於其中加入5μL以溶液C稀釋為50μM之核酸溶液。至於陽性對照，以溶液C稀釋抑凝乳酶素，且此稀釋液以相同方式添加。接著加入5μL以溶液E(溶液C+0.1% BSA,0.05%疊氮化鈉)稀釋至100 ng/mL之凝乳酶。於反應溶液中之凝乳酶最終濃度為10 ng/mL(0.33 nM)，而最終核酸濃度為5μM。至於對照，準備無凝乳酶管。於吸放混合後，將樣本培養於37℃，1小時，並混入等量電泳用溶胞緩衝液而終止反應。接著，如下述西方點墨法的步驟偵測樣本中之LTBP-1。

將混於溶胞緩衝液中之樣本煮3分鐘，取10μL該樣本以5至20%丙烯醯胺膠進行電泳。完成電泳後，將該混合物轉移到硝化纖維素過濾膜上，之後以5%脫脂奶粉、50 mM Tris-HCl(pH 8.0)及0.05%疊氮化鈉封阻該過濾膜。使該過濾膜與2μg/mL之抗-LTBP-1單株抗體(以2% BSA,PBS以及0.05%疊氮化鈉稀釋)於室溫反應過夜。清洗該過濾膜3次，並以二次抗體溶液(以0.1% BSA/PBS稀釋10000倍之HRP-標記之抗小鼠IgG抗體)於室溫反應2小時。清洗該過濾膜5次，並使用化學發光受質偵測之。

基於LTBP-1條帶密度以及位置(分子量)決定各測試受質是否具抑制活性。此分析以三次獨立實驗證實。取無添加凝乳酶之孔的條帶作為陽性對照(+)，取陰性對照之孔的條帶作為陰性對照(-)。藉由目視各測試受質的孔的調帶決定各測試受質使否具抑制活性。西方點墨法的分析結果顯示於第8圖中，而確定抑制活性的結果顯示於表9。

表9：是否對凝乳酶降解LTBP-1具有抑制活性。“+”顯示有偵測到一條帶具有與對照之LTBP-1條帶相同程度的密度，而“-”顯示如陰性對照般乾淨沒有偵測到LTBP-1條帶。

序列編號No：58並未顯示抑制活性(-)。陽性對照抑凝乳酶素顯示抑制活性(+)。除了序列編號No：58之外的所有適體(表9所含適體)顯示對LTBP-1降解的抑制活性。

從上述結果發現，本發明之適體抑制凝乳酶對LTBP-1降解。因此，已顯示本本發明之適體可適用於預防及/或治療各種涉及TGF-β活化之疾病，例如纖維化症。

商業上應用性

本發明之適體與複合物可適用於作為諸如心臟血管疾病、纖維化症等疾病的醫藥品、診斷試劑或試劑。本發明之適體與複合物可適用於凝乳酶之純化及濃縮，以及凝乳酶之偵測與定量。

本申請案係基於於2009年6月11日申請之日本專利申請案第2009-140585號，將其內容併入本案作為參考。

<110>　力博美科股份有限公司大琢製藥股份有限公司

<120>　針對凝乳酶之適體及其用途

<130>　****

<150>　JP2009-140585

<151>　2009-06-11

<160>　72

<170>　PatentIn version 3.3

<210>　1

<211>　70

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　用於產生凝乳酶之適體的DNA模板

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(18)..(57)

<223>　n為a,c,g,或t

<400>　1

<210>　2

<211>　33

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　用於產生凝乳酶之適體的引子

<400>　2

<210>　3

<211>　17

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　用於產生凝乳酶之適體的引子

<400>　3

<210>　4

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　4

<210>　5

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　5

<210>　6

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　6

<210>　7

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　7

<210>　8

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　8

<210>　9

<211>　74

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　9

<210>　10

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　10

<210>　11

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　11

<210>　12

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　12

<210>　13

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　13

<210>　14

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　14

<210>　15

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　15

<210>　16

<211>　72

<212>　RNA

<213>　入工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　16

<210>　17

<211>　74

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　17

<210>　18

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　18

<210>　19

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　19

<210>　20

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　20

<210>　21

<211>　13

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體的共同序列

<220>

<221>　misc_feature

<223>　n為a,c,g,或t

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(1)..(1)

<223>　n為a,c,g,或u

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(8)..(9)

<223>　n為a,c,g,或u

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(13)..(13)

<223>　n為a,c,g,或u

<400>　21

<210>　22

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　22

<210>　23

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　23

<210>　24

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　24

<210>　25

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　25

<210>　26

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　26

<210>　27

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　27

<210>　28

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　28

<210>　29

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　29

<210>　30

<211>　71

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　30

<210>　31

<211>　71

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　31

<210>　32

<211>　70

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　32

<210>　33

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　33

<210>　34

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　34

<210>　35

<211>　72

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　用於產生凝乳酶之適體的DNA模板

<220>

<221>　misc_feature

<222>　(20)..(49)

<223>　n為a,c,g,或t

<400>　35

<210>　36

<211>　40

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　用於產生凝乳酶之適體的引子

<400>　36

<210>　37

<211>　19

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　用於產生凝乳酶之適體的引子

<400>　37

<210>　38

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　38

<210>　39

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　39

<210>　40

<211>　73

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　40

<210>　41

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　41

<210>　42

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　42

<210>　43

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　43

<210>　44

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　44

<210>　45

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　45

<210>　46

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　46

<210>　47

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　47

<210>　48

<211>　72

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　48

<210>　49

<211>　29

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　49

<210>　50

<211>　35

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　50

<210>　51

<211>　45

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　51

<210>　52

<211>　26

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　52

<210>　53

<211>　42

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　53

<210>　54

<211>　36

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　54

<210>　55

<211>　29

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　凝乳酶之適體

<400>　55

<210>　56

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　56

<210>　57

<211>　27

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　57

<210>　58

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　58

<210>　59

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　59

<210>　60

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　60

<210>　61

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　61

<210>　62

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　62

<210>　63

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　63

<210>　64

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　64

<210>　65

<211>　19

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　65

<210>　66

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　66

<210>　67

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　67

<210>　68

<211>　23

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　68

<210>　69

<211>　26

<212>　RNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　69

<210>　70

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　70

<210>　71

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　71

<210>　72

<211>　23

<212>　DNA

<213>　人工序列

<220>

<223>　針對凝乳酶之適體

<400>　72

第1圖顯示由MFOLD程式所推定之序列編號No：4、5、12至14、18所示之適體的二級結構，其中以圓圈圈住之部分顯示由序列編號No：21所示之共同序列。

第2圖顯示由MFOLD程式所推定之序列編號No：22至27所示之適體的二級結構，其中以圓圈圈住之部分顯示由序列編號No：21所示之共同序列。

第3圖顯示由MFOLD程式所推定之序列編號No：28至34所示之適體的二級結構，其中以圓圈圈住之部分顯示由序列編號No：21所示之共同序列。

第4圖顯示序列編號No：12與13所示之適體是如何結合至凝乳酶，其中40N意指含有40個核苷酸之隨機序列之RNA池。各適體或該陰性對照40N係經固定作為捕捉分子；人類凝乳酶係注入作為分析物。使用Biacore T100(由GE Healthcare製造)獲得測量值。

第5圖顯示由MFOLD程式所推定之序列編號No：38至40、43、48所示之適體的二級結構，其中以圓圈圈住之部分顯示由序列編號No：21所示之共同序列。

第6圖顯示由MFOLD程式所推定之序列編號No：49、51、55至57所示之適體的二級結構，其中以圓圈圈住之部分顯示由序列編號No：21所示之共同序列。

第7圖顯示序列編號No：15、55與56所示之適體是如何結合至凝乳酶，其中40N意指含有40個核苷酸之隨機序列之RNA池。凝乳酶係經固定於晶片表面；各適體或該負調控組40N係注入作為分析物。使用Biacore T100(由GE Healthcare製造)獲得測量值。

第8圖顯示藉由LTBP-1是如何被凝乳酶降解以及LTBP-1的降解是如何受到表9所列適體抑制之西方點墨法的偵測結果。第1、8、9、23與31號電泳道所示為標幟物，第6、21與29號電泳道所示為陰性對照的結果(無抑制劑)，第7、22與30號電泳道所示為不含凝乳酶對照的結果。

由於本案的圖為實驗數據圖及序列圖，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims

一種適體，係結合至凝乳酶以抑制凝乳酶活性，且係包括以X₁GAUAGAN₁N₂UAAX₂(序列編號No：21；不論相同或不同，X₁與X₂各為A或G，且不論相同或不同，N₁與N₂各為A、G、C、U或T)所示之共同核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項所述之適體，其中N₁N₂為GA、GU、GC、UU、GT或CU。
如申請專利範圍第1項所述之適體，其中X₁與X₂皆為A或皆為G。
如申請專利範圍第2或3項所述之適體，其中該嘧啶核苷酸的至少一者係經修飾或變更。
如申請專利範圍第1項所述之適體，包括下述核苷酸序列(a)、(b)與(c)的任一者：(a)選自序列編號No：4、13、14、25、26、30至32、34、38至50、53至57、59至65及69至72(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)之核苷酸序列；(b)選自序列編號No：4、13、14、25、26、30至32、34、38至50、53至57、59至65及69至72(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)核苷酸序列，其中1至5個核苷酸係經取代、刪除、插入或加入，該核苷酸序列包含該共同核苷酸序列；以及(c)具有與選自序列編號No：4、13、14、25、26、30至32、34、38至50、53至57、59至65及69至72(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)之核苷酸序列為70%或更高同一性之核苷酸序列，該核苷酸序列包含該共同核苷酸序列。
如申請專利範圍第5項所述之適體，其中該適體所含之核苷酸的至少一者係經修飾或變更。
如申請專利範圍第1項所述之適體，包括下述核苷酸序列(a’)、(b’)與(c’)的任一者：(a’)選自序列編號No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)至56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)之核苷酸序列；(b’)選自序列編號No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)至56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)之核苷酸序列，其中1至5個核苷酸係經取代、刪除、插入或加入，該核苷酸序列包含該共同核苷酸序列；以及(c’)具有與選自序列編號No：56(1)至56(7)、56(9)、56(11)、56(12)、56(15)至56(52)、61(1)、69(1)、69(2)及72(1)至72(8)(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)之核苷酸序列為70%或更高同一性之核苷酸序列，該核苷酸序列包含該共同核苷酸序列。
一種適體，係結合至凝乳酶以抑制凝乳酶活性，且係包括下述核苷酸序列(a)、(b)與(c)的任一者： (a)選自序列編號No：5、6、8、9、11、12、15、17至20、22至24、28、33及51(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)之核苷酸序列；(b)選自序列編號No.：5、6、8、9、11、12、15、17至20、22至24、28、33及51(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)之核苷酸序列，其中1至3個核苷酸係經取代、刪除、插入或加入；以及(c)具有與選自序列編號No.：5、6、8、9、11、12、15、17至20、22至24、28、33及51(限制條件為脲嘧啶可經胸腺嘧啶置換)之核苷酸序列為90%或更高同一性之核苷酸序列。
如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之適體，其中，不論相同或不同，該適體所含之各嘧啶核苷酸於各自2’位置的羥基，可經選自氫原子、氟原子及甲氧基所組成群組之取代基取代。
如申請專利範圍第1項至第8項中任一項所述之適體，其中，不論相同或不同，該適體所含之各嘌呤核苷酸於各自2’位置的羥基，可經選自氫原子、氟原子及甲氧基所組成群組之取代基取代。
一種複合物，包括申請專利範圍第1至10項中任一項所述之適體以及結合至該適體之官能物質，其中該官能物質為親和性物質、標識用物質、酵素、藥物遞送載劑或藥物。
一種醫藥品，包括申請專利範圍第1至10項中任一項所述之適體或申請專利範圍第11項所述之複合物。
如申請專利範圍第12項所述之醫藥品，其係用於預防與治療心血管疾病或纖維化症。
一種診斷試劑，包括申請專利範圍第1至10項中任一項所述之適體或申請專利範圍第11項所述之複合物。
一種凝乳酶偵測探針，包括申請專利範圍第1至10項中任一項所述之適體或申請專利範圍第11項所述之複合物。
一種凝乳酶純化用固相載體，包括申請專利範圍第1至10項中任一項所述之適體或申請專利範圍第11項所述之複合物。
一種偵測凝乳酶的方法，包括使用申請專利範圍第1至10項中任一項所述之適體或申請專利範圍第11項所述之複合物。
一種純化凝乳酶的方法，包括使用申請專利範圍第1至10項中任一項所述之適體或申請專利範圍第11項所述之複合物。