TWI518180B - 具有乳化能力以及對於苯和／或萘的清除能力的桃園假單胞菌ｓ０３分離株及其用途 - Google Patents
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Description
本發明是有關於一株具有乳化能力以及對於苯和/或萘的清除能力的桃園假單胞菌(Pseudomonas taoyuanensis)S03分離株，它以寄存編號BCRC 910562被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。該桃園假單胞菌S03分離株暨其繼代培養後代可被用於製備用以清除存在於一受污染的介質中之原油、石油精煉產物、苯和/或萘的微生物試劑。
芳香烴(aromatic hydrocarbon)[亦被稱為芳烴(arene)]是指一種具有一或多個苯環(benzene ring)的烴化合物(hydrocarbon compound)，並且可依據苯環的數目而被區分為單環芳香烴(monocyclic aromatic hydrocarbons,MAHs)以及多環芳香烴(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)。芳香烴普遍地存在於原油(crude petroleum)、石油
精煉產物(petroleum refined products)[例如，柴油(diesel)、重油(heavy oil)以及汽油(gasoline)]以及工業溶劑(industrial solvents)中，並且在製備醫藥品(pharmaceuticals)、農用化學品(agrochemicals)、聚合物、炸藥(explosives)以及許多日常生活用品的過程中經常被用來作為起始物質。然而，這些芳香烴的分子結構非常穩定，並且具有高熔點、高沸點以及不易分解的特性，因此當它們被釋出到環境中時會持續地累積並且存在於自然界與生物體內，進而對整個生態環境或人體造成嚴重的危害。
苯(benzene)、甲苯(toluene)、乙苯(ethylbenzene)以及二甲苯(xylene)皆屬於MAHs並且被統稱為BTEX化合物，它們是最常見的地下水污染物(groundwater contaminants)以及土壤污染物(soil contaminants)，其中苯被發現具有致癌性(carcinogenicity)因而倍受重視。苯(化學式為C6H6)是一種最簡單的MAHs，它在化學工業(chemical industry)上常被用來作為有機溶劑或者被用於製備苯衍生物(benzene derivatives)。當苯經由皮膚或眼睛的接觸、或者經由吸入(inhalation)以及攝入(intake)的方式而進入人體時，會抑制人體的中樞神經系統(central nervous system,CNS)並且產生困倦(sleepy)、頭暈(dizzy)、頭痛(headache)以及噁心(nausea)等症狀，若長期接觸甚至會影響紅血球、白血球以及血小板的形成，進而引發血癌(leukemia)。
萘(naphthalene)(化學式為C10H8)是一種由2個經融合的苯環(fused benzene ring)所構成的最簡單的
PAHs，它已被廣泛地應用於生產染料(dyestuff)、樹脂(resin)、溶劑(solvent)、消毒劑(disinfectant)、殺蟲劑(insecticide)、防腐劑(preservative)以及防蛀劑(mothproofing agent)等。當萘進入人體後可能會導致溶血性貧血(haemolytic anaemia)、噁心、嘔吐(vomiting)、腹瀉(diarrhea)、黃膽(jaundice)以及肝臟或腎臟損傷等症狀。
由於存在於環境中的苯和/或萘已嚴重地威脅到人類的健康並且造成生態環境的破壞，因此，如何有效地處理這些環境污染物即成為世界各國關注與研究的重點。目前已知的處理方法包括：固化法(solidification)、移除法(removing method)、焚化法(incineration)、活性碳吸附法(activated carbon adsorption)、觸媒還原法(catalytic reduction)、光分解法(photolysis)以及生物復育法(bioremediation)等等。
生物復育法主要是利用微生物的生物降解活性(biodegradative activities)來移除環境污染物與難分解的異生物毒素(recalcitrant xenobiotics)。生物復育法具有成本低廉、在降解環境污染物的過程中不會產生有毒的副產物而造成二次污染，以及可以在原地(in situ)進行操作等優點，因而已被廣泛地應用於受污染場址(contaminated site)的整治。在所有的生物復育技術(bioremediation techniques)當中，生物添加(bioaugmentation)特別受到重視，它主要是將具有生物降解活性的微生物額外添加至一受污染的環境中來降解污染物。然而，芳香烴具有低水溶性以及對於土壤
有強吸附作用(sorption)的特性，這會使得具有芳香烴降解活性的微生物對於芳香烴的生物可利用性(bioavailability)受到影響，進而限制芳香烴的降解速率。因此，在受芳香烴污染的環境中添加具有乳化能力(emulsifying activity)的微生物來提高芳香烴的脫附速率(desorption rate)以及在水相中的視溶解度(apparent solubility)可以增進芳香烴的生物可利用性，進而促進芳香烴的清除。
在原生性微生物(indigenous microorganisms)無法有效清除芳香烴的情況下，生物添加可能是唯一可達到生物復育的目的之方法。因此，分離與篩選出適合供用於生物復育法的微生物即成為本領域的相關研究人員所致力的目標。
目前已有許多具有乳化能力和/或對於苯和/或萘具有清除能力的菌株從受污染的環境中被分離出來，它們大多是屬於假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)、假黃單孢菌屬物種(Pseudoxanthomonas spp.)、親脂環菌屬物種(Alicycliphilus spp.)、伯克氏菌屬物種(Burkholderia spp.)、羅爾斯頓氏菌屬物種(Ralstonia spp.)、無色桿菌屬物種(Achromobacter spp.)、噬氫菌屬物種(Hydrogenophaga spp.)、赤球菌屬物種(Rhodococcus spp.)、關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)、產鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)以及微球菌屬物種(Micrococcus spp.)等(Jeong Myeong Kim et al.(2008),Applied and Environmental Microbiology,74：7313-7320；Shuguang Xie et al.(2011),Biodegradation,
22：71-81；R.C.John et al.(2012),Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology,88：1014-1019)。例如，CN 103045502 A揭示一株分離自受石油污染的海底區域泥樣之紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis)T7-3(CGMCC編號6104)，該菌株被證實可以乳化和/或降解原油以及石油羥(petroleum hydrocarbon)[包括烷羥(alkane)以及芳香烴(諸如苯以及二甲苯)]，因而被預期可供應用於受石油污染的海洋之生物復育。CN 1519312 A揭示一株分離自受原油污染的土壤之赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868，該菌株被證實可以乳化和/或降解煤油以及石油羥[諸如苯、萘、蔥(anthracene)、菲(phenanthrene)以及芘(pyrene)]，因而被預期可供應用於含油廢水的處理以及受石油污染的土壤之生物復育。
在E.Deziel et al.(1996),Appl.Environ.Microbiol.,62：1908-1912中，E.Deziel等人從接收煉油廠廢棄物的沙坑中分離出23株具有PAH降解能力的細菌分離株，其中繡色假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)19SJ被發現可以利用萘或菲作為唯一受質而生成大量的醣脂質(glycolipid)。在進一步的實驗中，該菌株被發現可以透過生成該醣脂質而展現乳化能力來提高萘的視溶解度，俾以增進該菌株自身對於萘的降解與利用，進而又促進該醣脂質的生成。於是，E.Deziel等人認為生產具有界面-活性的化合物是菌株為了在低可利用性的受質上生長的策略。因
此，該菌株被預期可供應用於受萘和/或菲污染之環境的生物復育。
在Eun Young Lee et al.(2011),International Proceedings of Chemical,Biological & Environmental Engineering,20：37-41中，Eun Young Lee等人從用於廢水處理的蘆葦(reed)之根圈土壤(rhizosphere soil)中分離出戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)AY-10，該菌株被發現可以生長於含有苯、甲苯、乙苯或二甲苯作為唯一碳源的培養基中，並且完全地降解苯、甲苯、乙苯以及二甲苯。因此，Eun Young Lee等人認為該戀臭假單胞菌AY-10可供應用於受BTEX污染之環境的生物復育。
雖然已存在有上述文獻報導，申請人仍積極致力於篩選出具有乳化能力並且可以清除苯和/或萘的微生物以供環境保護之用。經研究，申請人意外地從受苯或萘污染的實廠土壤中分離出一株新穎的細菌分離株[它後來經過特徵鑑定而被命名為桃園假單胞菌(Pseudomonas taoyuanensis)S03]，它在種系上(phylogenetically)是不同於所屬菌屬中已公開的菌種，並且具有優越的乳化重油與柴油的能力以及對於苯與萘的清除能力。因此，該菌株被預期在整治受原油、石油精煉產物、苯和/或萘污染的環境上具有極大的潛力。
於是，在第一個方面，本發明提供一種具有乳
化能力以及對於苯和/或萘的清除能力的桃園假單胞菌(Pseudomonas taoyuanensis)S03分離株，它以寄存編號BCRC 910562被寄存於食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。
在第二個方面，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的微生物試劑，其包含有一如上所述的桃園假單胞菌S03分離株或其繼代培養後代。
在第三個方面，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之原油和/或石油精煉產物的微生物試劑，其包含有一如上所述的桃園假單胞菌S03分離株或其繼代培養後代。
在第四個方面，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的方法，其包括：使用一如上所述的桃園假單胞菌S03分離株或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之苯和/或萘被該桃園假單胞菌S03分離株或其繼代培養後代所降解和/或脫附。
在第五個方面，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之原油和/或石油精煉產物的方法，其包括：使用一如上所述的桃園假單胞菌S03分離株或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之原油和/或石油精煉產物被該桃園假單胞菌S03分離株或其繼代培養後代所乳化。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在
參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
為了有效地處理環境污染物，避免環境以及生態繼續遭到嚴重的破壞，世界各國皆紛紛投入大量的人力與財力來尋求解決的方法。現今，在各種用於處理環境污染物的方法當中，生物復育法具有成本低廉、在降解環境污染物的過程中不會產生有毒的副產物而造成二次污染，以及可以在原地(in situ)進行操作等優點，因而已被廣泛地應用於受污染場址(contaminated site)的整治。
為了篩選出適合供應用於生物復育法的微生物，申請人從受柴油污染的實廠土壤中分離出35株細菌分
離株，接著將所得到的分離株分別接種至含有重油(heavy oil)的試管中並分析它們的乳化指數E24(emulsification index E24)，進而從中篩選出一株具有優異的乳化重油的能力的細菌分離株S03。申請人對該細菌分離株S03進行特徵鑑定並且參考Satoshi Yamamoto et al.(1995),Applied and Environmental Microbiology,61：1104-1109以及Li-Ting Wang et al.(2010),International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,60：2094-2098等微生物學相關文獻，而判斷該細菌分離株S03是屬於一種新穎的假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)，它被申請人命名為“桃園假單胞菌(Pseudomonas taoyuanensis)S03”，並已於西元2012年8月29日以寄存編號BCRC 910562被寄存於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。
申請人進一步經由實驗而發現到，本發明的桃園假單胞菌S03亦可以有效地乳化超級柴油(super diesel)。
基於上述，申請人認為：本發明的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代可供應用於受原油和/或石油精煉產物污染之環境的生物復育。於是，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之原油和/或石油精煉產物的微生物試劑，其包含有一如上所述的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代。
如本文中所用的，術語“原油(crude petroleum)”與“原油(crude oil)”可被交換地使用，並且意指自地球表面
下所發現之未經處理(untreated)或未經精煉(unrefined)的油，它是一種由具有各種不同分子量的烴(hydrocarbon)[包括脂族烴(aliphatic hydrocarbon)、環烴(cyclic hydrocarbon)以及芳香烴(aromatic hydrocarbon)]與其它有機化合物所構成的複雜混合物。
如本文中所用的，術語“石油精煉產物(petroleum refined product)”、“精煉石油(refined petroleum)”與“石油產物(petroleum product)”可被交換地使用。
依據本發明，該石油精煉產物包括，但不限於：柴油(diesel)、重油(heavy oil)、煤油(kerosene)、燃油(fuel oil)、汽油(gasoline)、液壓油(hydraulic oil)以及潤滑油(lubricating oil)。在本發明的一個較佳具體例中，該石油精煉產物是重油。在本發明的另一個較佳具體例中，該石油精煉產物是柴油。
依據本發明，該受污染的介質是一固態或液態的環境介質，這包括，但不限於：土壤(soil)、污泥(sludge)、沉積物(sediment)、蓄水層(aquifer)、水體(water body)以及廢水(waste water)。較佳地，該受污染的介質是選自於下列所構成的群組：農業用地(例如田地以及果園用地等)、放牧草地、林地、加油站用地、工業用地、人工的水體(例如井水、漁業養殖池、池塘以及水庫等)、天然的水體[例如地下水(groundwater)、河水、湖水以及海水等]、工廠廢水、生活污水以及污水處理廠的淤泥。
依據本發明的微生物試劑可進一步包含有至少一種可清除單環和/或多環芳香烴的微生物。
適用於本發明的可清除單環芳香烴的微生物包括，但不限於：假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)、假黃單孢菌屬物種(Pseudoxanthomonas spp.)、親脂環菌屬物種(Alicycliphilus spp.)、伯克氏菌屬物種(Burkholderia spp.)、羅爾斯頓氏菌屬物種(Ralstonia spp.)、無色桿菌屬物種(Achromobacter spp.)、噬氫菌屬物種(Hydrogenophaga spp.)、赤球菌屬物種(Rhodococcus spp.)以及關節桿菌屬物種(Arthrobacter spp.)。較佳地，該可清除單環芳香烴的微生物是選自於由下列所構成的群組：紅平紅球菌(Rhodococcus erythoropolis)T7-3、赤紅球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868、戀臭假單胞菌(Pseudomonas putida)AY-10，以及它們的組合。
適用於本發明的可清除多環芳香烴的微生物包括，但不限於：假單孢菌屬物種、赤球菌屬物種、關節桿菌屬物種、不動菌屬物種(Acinetobacter spp.)、黃桿菌屬物種(Flavobacterium spp.)、產鹼桿菌屬物種(Alcaligenes spp.)、微球菌屬物種(Micrococcus spp.)以及棒狀桿菌屬物種(Corynebacterium spp.)。較佳地，該可清除多環芳香烴的微生物是選自於由下列所構成的群組：赤紅球菌Em CGMCC No.0868、繡色假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)19SJ，以及它們的組合。
依據本發明的微生物試劑可選擇性地包含有對
於微生物生長有益的營養物，這包括，但不限於：甘油(glycerol)、核黃素(riboflavin)、酪蛋白(casein)、聚蛋白腖(polypeptone)、肉萃取物(meat extract)、大豆餅(soybean cake)、酵母萃取物(yeast extract)、纖維素、葡萄糖、玉米萃取物(corn extract)、乳清粉末(whey powder)、澱粉、維生素[諸如噻胺(thiamine)、生物素(biotin)、菸鹼醯胺(nicotinic acid amide)以及泛酸鈣(calcium panthotenate)]以及酵素[諸如澱粉酶(amylase)、蛋白酶(protease)以及脂肪酶(lipase)]。
依據本發明的微生物試劑可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合使用的形式，這包括，但不限於：培養液(culture solution)、懸浮液(suspension)、顆粒體(granules)、粉末(powder)、錠劑(tablet)、丸劑(pill)、膠囊(capsules)、濃漿(slurry)以及類似之物。此外，該微生物試劑也可以被固著(immobilized)在一不可溶的支撐物(insoluble support)上而被使用。
依據本發明的微生物試劑可進一步包含有一生物可相容的載體(biocompatible carrier)。
在本發明的一個較佳具體例中，該微生物試劑中的桃園假單胞菌S03被該生物可相容的載體捕獲在內(entrapped therein)。該生物可相容的載體包括，但不限於：矽膠(silica gel)、澱粉(starch)、瓊脂(agar)、幾丁質(chitin)、幾丁聚糖(chitosan)、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乳酸(polylactic acid)、藻酸(alginic acid)、聚丙烯醯胺
(polyacrylamide)、鹿角菜膠(carrageenan)、瓊脂糖(agarose)、明膠(gelatin)、纖維素(cellulose)、醋酸纖維素(cellulose acetate)、聚葡萄糖(dextran)以及膠原蛋白(collagen)。
在本發明的另一個較佳具體例中，該微生物試劑中的桃園假單胞菌S03被擔負(supported on)在該生物可相容的載體上。該生物可相容的載體包括，但不限於：玻璃(glass)、陶瓷(ceramic)、金屬氧化物(metal oxide)、活性碳(activated carbon)、高嶺石(kaolinite)、皂土(bentonite)、沸石(zeolite)、鋁(alumina)、無煙煤(anthracite)、戊二醛(glutaraldehyde)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚胺甲酸酯(polyurethane)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride)、離子交換樹脂(ion exchange resin)、環氧樹脂(epoxy resin)、光塑性樹脂(photosetting resin)、聚酯(polyester)以及聚苯乙烯(polystyrene)。
依據本發明的微生物試劑也可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一用於清除存在於一受污染的介質中之原油和/或石油精煉產物的生物反應器或裝置。有關生物反應器的製造可以參考，例如，US 5279963、US 5258303、US 5552051、US 5494574、US 6030533、US 2003/0008381 A1、US 2006/0270024 A1、EP 0609399 B1、EP 0867238，以及K.Ishii and T.Furuichi(2007),Journal of Hazardous Materials,148(3)：693-700。
本發明亦提供一種用於清除存在於一受污染的
介質中之原油和/或石油精煉產物的方法，其包括：使用一如上所述的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之原油和/或石油精煉產物被該桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代所乳化。
如本文中所用的，術語“乳化”意指藉由改變介面張力(interfacial tension)而將一具有低水溶性的物質以一微小液滴或顆粒(fine droplets or particles)的形式而分散至水相中，以形成一非均勻分散系統(heterogeneous dispersion system)。
在依據本發明的方法中，該桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代可與至少一種可清除單環和/或多環芳香烴的微生物來組合使用，而有關該可清除單環和/或多環芳香烴的微生物是如上面所描述者。
另外，申請人藉由模擬土壤整治環境的試驗而證實：該桃園假單胞菌S03可以藉由脫附作用(desorption)和/或降解作用(degradation)來清除存在於土壤中的苯以及萘。
基於上述，申請人認為：本發明的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代可供應用於受苯和/或萘污染之環境的生物復育。於是，本發明提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的微生物試劑，其包含有一如上所述的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代。
依據本發明，該受污染的介質、該微生物試劑
可進一步包含的物質[包括：可清除單環和/或多環芳香烴的微生物、營養物以及生物可相容的載體]以及該微生物試劑適合被製造成的形式與生物反應器或裝置等是如上面所描述者。
本發明亦提供一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的方法，其包括：使用一如上所述的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之苯和/或萘被該桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代所降解和/或脫附。
如本文中所用的，術語“降解”意指將一化合物代謝性地分解成一較不複雜(less complex)的分子。
如本文中所用的，術語“脫附”意指藉由破壞附著力(adhesive forces)而令一吸附於一固體表面上的化合物自該固體表面上被釋放。
在依據本發明的方法中，該桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代可與至少一種可清除單環和/或多環芳香烴的微生物來組合使用，而有關該可清除單環和/或多環芳香烴的微生物是如上面所描述者。
本發明之其他的特徵及功效，將於參照圖式的實施方式中清楚地呈現，其中：圖1顯示本發明的桃園假單胞菌(Pseudomonas taoyuanensis)S03之部分的16S rDNA的核苷酸序列；圖2顯示本發明的桃園假單胞菌S03之部分的gyr B基
因的核苷酸序列；圖3顯示本發明的桃園假單胞菌S03在模擬管柱裝置中對於含有苯的土壤樣品的苯清除率，其中對照組表示未被導入桃園假單胞菌S03之含有苯的土壤樣品；圖4顯示本發明的桃園假單胞菌S03在模擬管柱裝置中對於含有苯的土壤樣品的苯降解率，其中對照組表示未被導入桃園假單胞菌S03之含有苯的土壤樣品；圖5顯示本發明的桃園假單胞菌S03在模擬管柱裝置中對於含有萘的土壤樣品的萘清除率，其中對照組表示未被導入桃園假單胞菌S03之含有萘的土壤樣品；以及圖6顯示本發明的桃園假單胞菌S03在模擬管柱裝置中對於含有萘的土壤樣品的萘降解率，其中對照組表示未被導入桃園假單胞菌S03之含有萘的土壤樣品。
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
在下面實施例中所使用的基礎瓊脂培養基具有下面表1所示的配方。
在下面實施例中所使用的胰蛋白酶大豆肉湯培養基具有下面表2所示的配方。
在下面的實施例中，各個待測樣品中的揮發性有機化合物(volatile organic compounds,VOCs)(亦即苯以
及萘)是使用一吹氣捕捉裝置(purge and trap device)(型號4560，OI Analytical)來進行收集，接著使用一氣相層析儀(gas chromatograph,GC)(型號6890，Agilent Technologies)來對所收集到的苯或萘進行濃度的測定。有關吹氣捕捉裝置以及氣相層析儀的操作條件分別被顯示於下面的表3以及表4中。
此外，為供比對，分別使用苯(5000μg/mL)以及萘(5000μg/mL)來作為對照標準品(control standard)並進行相同的分析，這些化學物質是購自於思必可有限公司。
在本實驗中所使用之用於篩選試驗菌株的實廠土壤樣品是取自於桃園縣觀音鄉整治場址之受柴油污染的土壤(收集深度約1公尺)。
首先，將10g之實廠土壤樣品加入至一含有500mL無菌水的培養瓶中，繼而藉由超音波處理(ultrasonication)來充分散浮該土壤樣品，接著將所得到的懸浮液置於一恆溫振盪培養箱(28℃、50rpm)中進行培養歷時7天。之後，將所形成的培養物進行10倍連續稀釋(10-fold serial dilution)，而得到具有不同稀釋倍數(106至108倍)的液態培養物，繼而對各個含有不同稀釋倍數的液態培養物分別取0.1mL，並將之均勻塗佈於一基礎瓊脂培養基上，接著於30℃下靜置培養歷時48至72小時。然後，申請人分別以肉眼與顯微鏡來觀察各個基礎瓊脂培養基上的菌落型態以及菌株的生長情形，繼而從中挑選出35個菌落(colonies)並以四區劃線法(four-quadrant streak method)的方式分別塗佈於一基礎瓊脂培養基上，接著於30℃下靜置培養歷時48至72小時。上述菌株純化步驟被重複進行數次，而得到35株經純化的細菌分離株，其中包括：菌株編號S01至S35。之後，將該等細菌分離株分別接種至適量之胰蛋白酶大豆肉湯培養基(TSB)中，並置於一恆溫振盪培養箱(30℃、50rpm)中進行培養歷時48至72小時，接著對
所形成的細菌培養物加入適量的甘油(glycerol)至一最終濃度為10%(v/v)，繼而將之冷凍保存於-80℃下備用。
將依據上面「A、試驗菌株的來源與分離」中所得到的35株細菌分離株以一為0.4%(v/v)的接種量分別接種至5mL YM培養基[含有0.4%酵母菌萃取物(yeast extract)、1%麥芽萃取物(malt extract)以及0.4%右旋糖(dextrose)](Difco 0711-01，啟新生物科技有限公司)中，並於30℃下進行培養歷時18小時。之後，將所得到的菌液依序地以200mL YM培養基以及20L YM培養基來進行菌株的擴增培養，而由此所形成的培養物被使用作為下面實施例中的細菌分離株的接種源。
將4mL之依據上面「B、製備細菌分離株的接種源」所得到的35株細菌分離株的接種源分別接種至35支含有6mL重油(購自於台灣中油股份有限公司)的試管中並且予以充分震盪混合歷時2分鐘，接著於室溫下對所形成的混合溶液進行靜置培養歷時24小時。之後，測量試管中的乳化層(emulsified layer)以及油層(oil layer)的高度。以上實驗被重複進行2次。
乳化指數E24(emulsification index E24)是藉由將所測得的乳化層以及油層的高度代入下面的公式(1)而被計算出：公式(1)：A=(B/C)×100
其中：A=乳化指數E24(%)
B=乳化層的高度(cm)
C=油層的高度(cm)若所測得的乳化指數E24越高，代表細菌分離株的乳化能力越強。
實驗結果顯示：在所純化出的35株細菌分離株當中，細菌分離株S03對於重油具有一極為優異的乳化能力(數據未顯示)，申請人據此而認為：細菌分離株S03是一最具有開發潛力的菌株，因此將它拿來進行下面的特徵鑑定。
為了確認在上面的實施例1中所篩選出的細菌分離株S03之所屬菌種，細菌分離株S03被拿來進行下面的初步試驗、微生物脂肪酸鑑定系統分析、16S rDNA序列分析、DNA旋轉酶次單元B(subunit B of DNA gyrase,gyrB)基因序列分析以及DNA-DNA雜交分析(DNA-DNA hybridization analysis)。
有關細菌分離株S03的初步試驗是委託食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)來代為進行，試驗項目包括：革蘭氏染色(gram staining)、型態觀察(morphological observation)、觸酶(catalase)反應、氧化酶(oxidase)反應、運動性(mobility)以及在好氧(aerobic)與厭氧(anaerobic)條件下之生長情形。
依據初步試驗結果，該細菌分離株S03為革蘭氏陰性桿菌、具觸酶、不具氧化酶、具運動性、於好氧環境下會生長、於厭氧環境下不會生長，以及不會產生孢子。
有關細菌分離株S03的微生物脂肪酸鑑定系統分析是使用一MIDI Sherlock®微生物鑑定系統(MIDI Sherlock® Microbial Identification System)(MIDI,Inc.,Newark,DE,USA)並且委託食品工業發展研究所(FIRDI)來代為進行。
該細菌分離株S03的微生物脂肪酸鑑定系統分析結果被顯示於下面的表5中，分析結果顯示：該細菌分離株S03的主要脂肪酸為C18：1 ω 7c以及C16：1 ω 6c和/或C16：1 ω 7c，並且具有C16：0、C10：0 3OH、C12：0 2OH以及C12：0 3OH，而缺乏C16：0 2OH以及C16：0 3OH。
有關細菌分離株S03的16S rDNA序列分析是委
託食品工業發展研究所(FIRDI)來代為進行。
該細菌分離株S03之部分的16S rDNA序列分析結果被顯示於圖1中。該細菌分離株S03之部分的16S rDNA序列(序列辨識編號：1)被拿來與NCBI網站上的基因資料庫中之假單孢菌屬物種的標準菌株(type strain)的16S rDNA序列進行比對分析，而分析結果被顯示於下面的表6中。從表6可見，該細菌分離株S03之部分的16S rDNA序列(序列辨識編號：1)與6種假單孢菌屬物種(Pseudomonas spp.)的菌株(亦即Pseudomonas toyotomiensis、食油假單胞菌lubricantis亞種、嗜鹼假單胞菌、門多薩假單胞菌、Pseudomonas composti以及鰻敗血假單胞菌)的16S rDNA序列之間具有高度的序列相似性(sequence similarity)。
依據上面第A至C項的實驗結果，本發明的細菌分離株S03被初步鑑定是屬於假單孢菌屬的菌株，而為了進一步確認該細菌分離株S03是否為一種新穎的假單孢菌屬物種的菌株，該細菌分離株S03被進一步拿來進行下面第D與E項的分析。
有關細菌分離株S03的gyrB基因序列分析是委託食品工業發展研究所(FIRDI)來代為進行。
該細菌分離株S03之部分的gyrB基因序列分析結果被顯示於圖2中。申請人依據上面第C項的分析結果，挑選6種在16S rDNA序列上具有較高序列相似性的假單孢菌屬物種的菌株(亦即Pseudomonas toyotomiensis、食油假單胞菌lubricantis亞種、嗜鹼假單胞菌、門多薩假單胞菌、Pseudomonas composti以及鰻敗血假單胞菌)作為比對對象，並將該細菌分離株S03之部分的gyrB基因序列(序列辨識編號：2)拿來與NCBI網站上的基因資料庫中之該6種假單孢菌屬物種之標準菌株的gyrB基因序列進行比對分析，而分析結果被顯示於下面的表7中。從表7可見，該細菌分離株S03之部分的gyrB基因序列與各個標準菌株的gyrB基因序列之間皆具有一較低的序列相似性。
有關細菌分離株S03的DNA-DNA雜交分析是使用9株購自於食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)的假單孢菌屬物種之標準菌株[亦即Pseudomonas toyotomiensis、食油假單胞菌lubricantis亞種、嗜鹼假單胞菌、門多薩假單胞菌、Pseudomonas composti、鰻敗血假單胞菌、Pseudomonas benzenivorans、棲稻假單胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)以及Pseudomonas japonica]來進行比對，並委託食品工業發展研究所(FIRDI)來代為進行。
該細菌分離株S03與各個標準菌株之間所測得的DNA親源數值(DNA relatedness value)被顯示於下面的表8中。從表8可見，該細菌分離株S03與各個標準菌株
之間的DNA親源數值皆低於60%，這表示，該細菌分離株S03與各個標準菌株之間具有一較遠的親緣關係。
綜合以上各項的特徵鑑定結果，同時參考Satoshi Yamamoto et al.(1995),Applied and Environmental Microbiology,61：1104-1109以及Li-Ting Wang et al.(2010),International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,60：2094-2098等微生物學相關文獻，申請人認為：本發明的細菌分離株S03是一種新穎的假單胞菌屬物種的菌株，它被申請人命名為“桃園假單胞菌(Pseudomonas taoyuanensis)S03”，並已於西元2012年8
月29日以寄存編號BCRC 910562被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)(300新竹市食品路331號，台灣)。
在本實施例中，本發明的桃園假單胞菌S03大體上是參照實施例1的第C項「篩選具有乳化重油的能力的細菌分離株」當中所述的方法來進行乳化能力的分析，不同之處在於：以6mL的超級柴油(購自於台灣中油股份有限公司)來取代重油。
實驗結果顯示：被接種以桃園假單胞菌S03的超級柴油在培養歷時24小時後所測得的乳化指數E24高達105%。由此可見，本發明的桃園假單胞菌S03具有一優異的乳化超級柴油的能力。
為了確認本發明的桃園假單胞菌S03在模擬土壤整治的環境中是否具有清除存在於受污染的土壤中之苯與萘的能力，下面的實驗被進行。
將9mg亞硫酸鈉(Na2SO3)以及1mg氯化亞鈷(CoCl2)加入1L無菌水中並予以混合均勻，繼而置於室溫下反應歷時2分鐘，所得到的去氧水被拿來作為一模擬流
經土壤中的地下水。
在本實驗中所使用的模擬管柱裝置包含有一個可充填土壤的直立圓柱形管柱(長30cm，內徑5cm)、二個可分別用於密封該管柱的頂端以及底端的鐵氟龍塞、一連接至位於該管柱的底端的鐵氟龍塞並且可供用於將去氧水導入至該管柱中的蠕動泵浦(型號323U，WATSON-MARLOW)，以及一連接至位於該管柱的頂端的鐵氟龍塞並且可供用於收集流出物(effluent)的導管。
將取自於一苗栗縣整治場址之受苯污染的土壤(收集深度約5公尺)以一木槌進行破碎處理，接著予以風乾(air-dried)歷時7至10天，繼而以一孔徑為0.85mm的篩網來進行過篩，由此所得到之經過篩的土壤樣品是依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法而被測量到具有一為1231.1mg/kg的苯濃度，繼而將之保存於4℃下備用。
將取自於一高雄市整治場址之受萘污染的土壤(收集深度約1公尺)以一木槌進行破碎處理，接著予以風乾歷時7至10天，繼而以一孔徑為0.85mm的篩網來進行過篩，由此所得到之經過篩的土壤樣品是依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法而被測
量到具有一為191.7mg/kg的萘濃度，繼而將之保存於4℃下備用。
首先，在該管柱的底端的內側鋪設一紗布以防止土壤漏出，繼而以一鐵氟龍塞予以密封，然後依序地將下列物質充填至該管柱中：最下層由下至上依序是直徑為0.1cm、0.2cm以及0.5cm的玻璃圓珠(填充高度約為2cm)，中間層是653.85g含有苯的土壤樣品(具有一為1231.3mg/kg的苯濃度，而填充高度約為20cm)，以及最上層由下至上依序是直徑為0.5cm、0.2cm以及0.1cm的玻璃圓珠(填充高度約為2cm)。接著，以一鐵氟龍塞來密封該管柱的頂端。
之後，利用該蠕動泵浦並以一為0.2mL/分鐘的速率連續地將去氧水從該管柱的底端導入該管柱中。當流出物自該管柱的頂端的導管中穩定地流出時，利用該蠕動泵浦而將適量的過氧化鈣(calcium peroxide,CaO2)(1000mg/L)導入至該管柱中，以使該管柱中的土壤樣品的溶氧量是落在6至7mg/L的範圍內。接著，使用該蠕動泵浦而將適量之桃園假單胞菌S03的接種源導入至該管柱中，而使得該管柱中的土壤樣品具有一為1×105CFU/g的細菌濃度。此外，為供比較，未導入桃園假單胞菌S03之含有苯的土壤樣品被拿來作為對照組，並進行相同的實驗。
之後，收集流出物並且藉由使用一溶氧(DO)測
定儀[dissolved oxygen(DO)meter](型號DO200，CLEAN)來測量溶氧量以及使用pH測定儀(pH meter)來測量pH值。另外，依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定」當中所述的方法來量測該流出物的苯濃度，然後將所得到的苯濃度乘以該流出物的體積，而得到該流出物的苯含量(g)。
整個實驗期間總共歷時15天，每天依據上述方式來收集流出物並且測量它的溶氧量、pH值以及苯含量，同時持續地監測所測得的溶氧量並依據上述方式來調整該管柱中的土壤樣品的溶氧量，而流出物的pH值則是被維持在一為6.0至7.5的範圍內，俾以確保該菌株是在一好氧且具有較佳pH值的環境下生長。在整個實驗結束之後，將每天所測得的流出物的苯含量(g)相加，而得到流出物的總苯含量(g)。
另外，在導入桃園假單胞菌S03之後的第15天，從該管柱中取出適量的土壤樣品，並依據上面“一般實驗方法”的「1.苯以及萘濃度的測定_」當中所述的方法來測量苯濃度，然後將所測得的苯濃度乘以該土壤樣品的重量，而得到該土壤樣品的殘餘苯含量(g)。另外，在實驗開始之前，該土壤樣品的初始苯含量(g)亦參照上述方式而被計算出來。以上實驗被重複進行2次。
有關苯清除率(benzene clearance rate)(%)是藉由將上面所得到的各個苯含量(g)代入下面的公式(2)而被計算出：
公式(2)：D=(E-F)/E×100
其中：D=苯清除率(%)
E=含有苯的土壤樣品的初始苯含量(g)
F=含有苯的土壤樣品的殘餘苯含量(g)
此外，有關苯降解率(benzene degradation rate)(%)是藉由將上面所得到的各個苯含量(g)代入下面的公式(3)而被計算出：公式(3)：G=(E-F-H)/E×100
其中：G=苯降解率(%)
E=含有苯的土壤樣品的初始苯含量(g)
F=含有苯的土壤樣品的殘餘苯含量(g)
H=流出物的總苯含量(g)
有關清除土壤樣品中的萘之試驗大體上是參照上面“實驗方法”的「A、清除土壤樣品中的苯之試驗」當中所述的方法與步驟來進行，不同之處在於：在充填管柱時是以653.85g之含有萘的土壤樣品(具有一為184.6mg/kg的萘濃度)來取代含有苯的土壤樣品。相同地，整個實驗期間總共歷時15天，每天收集流出物並且測量它的溶氧量、pH值以及萘含量，並且在實驗的最後一天計算出流出物的總萘含量(g)。此外，有關含有萘的土壤樣品的初始萘含量(g)以及殘餘萘含量(g)亦是參照上面“實驗方法”的「A、清除土壤樣品中的苯之試驗」當中所述的方法來進行測量與計算。
有關萘清除率(naphthalene clearance rate)(%)是藉由將上面所得到的各個萘含量(g)代入下面的公式(4)而被計算出：公式(4)：I=(J-K)/J×100
其中：I=萘清除率(%)
J=含有萘的土壤樣品的初始萘含量(g)
K=含有萘的土壤樣品的殘餘萘含量(g)
此外，有關萘降解率(naphthalene degradation rate)(%)是藉由將上面所得到的各個萘含量(g)代入下面的公式(5)而被計算出：公式(5)：L=(J-K-M)/J×100
其中：L=萘降解率(%)
J=含有萘的土壤樣品的初始萘含量(g)
K=含有萘的土壤樣品的殘餘萘含量(g)
M=流出物的總萘含量(g)
圖3顯示桃園假單胞菌S03在模擬管柱裝置中對於含有苯的土壤樣品的苯清除率。由圖3可見，在與對照組相較之下，被導入有桃園假單胞菌S03的土壤樣品所測得的苯清除率顯著地被增加(2次的實驗結果皆達到95%以上)。這個實驗結果顯示：桃園假單胞菌S03可以有效地清除存在於土壤中的苯。
圖4顯示桃園假單胞菌S03在模擬管柱裝置中
對於含有苯的土壤樣品的苯降解率。由圖4可見，在與對照組相較之下，被導入有桃園假單胞菌S03的土壤樣品所測得的苯降解率顯著地被增加(2次的實驗結果皆達到60%以上)。這個實驗結果顯示：桃園假單胞菌S03具有優異的苯降解能力。
依據圖3與圖4的結果，申請人認為桃園假單胞菌S03可以藉由脫附作用(desorption)與降解作用來清除存在於土壤中的苯。
圖5顯示桃園假單胞菌S03在模擬管柱裝置中對於含有萘的土壤樣品的萘清除率。由圖5可見，在與對照組相較之下，被導入有桃園假單胞菌S03的土壤樣品所測得的萘清除率顯著地被增加(2次的實驗結果皆達到72%以上)。這個實驗結果顯示：桃園假單胞菌S03可以有效地清除存在於土壤中的萘。
圖6顯示桃園假單胞菌S03在模擬管柱裝置中對於含有萘的土壤樣品的萘降解率。由圖6可見，在與對照組相較之下，被導入有桃園假單胞菌S03的土壤樣品所測得的萘降解率是些微高於對照組所具者。
經由比較圖5與圖6可發現，桃園假單胞菌S03的萘清除率是顯著地高於萘降解率，這表示桃園假單胞菌S03主要是藉由將土壤中的萘脫附至水相中來達到清除的效用。
綜合上面的實驗結果，申請人認為：本發明的
桃園假單胞菌S03具有一優異的乳化能力，並且能藉由脫附和/或降解作用來清除存在於土壤中的苯與萘，進而達至生物復育之目的。因此，本發明的桃園假單胞菌S03具有發展成為一供用於清除存在於一受污染的介質(特別是土壤)中之原油、石油精煉產物(例如柴油與重油)、苯和/或萘的微生物試劑的高潛力。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
1.桃園假單胞菌(Pseudomonas taoyuanensis)S03：食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)；2012年8月29日；BCRC 910562。
(無)
<110> 龐仁傑 何一正 周錦東 柴浣蘭
<120> 具有乳化能力以及對於苯和/或萘的清除能力的桃園假單胞菌(PSEUDOMONAS TAOYUANENSIS)S03分離株及其用途
<130> 桃園假單胞菌S03
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1489
<212> DNA
<213> 桃園假單胞菌S03
<400> 1
<210> 2
<211> 995
<212> DNA
<213> 桃園假單胞菌S03
<400> 2
Claims (16)
- 一種桃園假單胞菌(Pseudomonas taoyuanensis)S03，其以寄存編號BCRC 910562被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
- 一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的微生物試劑，其包含有一如請求項1的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代。
- 一種用於清除存在於一受污染的介質中之原油和/或石油精煉產物的微生物試劑，其包含有一如請求項1的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代。
- 如請求項3的微生物試劑，其中該石油精煉產物是選自於由下列所構成的群組：重油、柴油、煤油、燃油、汽油、液壓油以及潤滑油。
- 如請求項2或3的微生物試劑，其中該受污染的介質是選自於由下列所構成的群組：土壤、污泥、沉積物、蓄水層、水體以及廢水。
- 如請求項5的微生物試劑，其中該受污染的介質是選自於由下列所構成的群組：田地、果園用地、放牧草地、林地、加油站用地、工業用地、井水、漁業養殖池、地下水、河水、湖水、海水、工廠廢水、生活污水以及污水處理廠的淤泥。
- 如請求項2或3的微生物試劑，其進一步包含有至少一種可清除單環和/或多環芳香烴的微生物。
- 如請求項2或3的微生物試劑，其被製造成一選自於由 下列所構成之群組的劑型：培養液、懸浮液、顆粒體、粉末、錠劑、丸劑、膠囊以及濃漿。
- 如請求項2或3的微生物試劑，其進一步包含有一生物可相容的載體。
- 如請求項9的微生物試劑，其中該桃園假單胞菌S03被該生物可相容的載體捕獲在內。
- 如請求項10的微生物試劑，其中該生物可相容的載體是選自於由下列所構成的群組：矽膠、澱粉、瓊脂、幾丁質、幾丁聚糖、聚乙烯醇、聚乳酸、藻酸、聚丙烯醯胺、鹿角菜膠、瓊脂糖、明膠、纖維素、醋酸纖維素、聚葡萄糖以及膠原蛋白。
- 如請求項9的微生物試劑，其中該桃園假單胞菌S03被擔負在該生物可相容的載體上。
- 如請求項12的微生物試劑，其中該生物可相容的載體是選自於由下列所構成的群組：玻璃、陶瓷、金屬氧化物、活性碳、高嶺石、皂土、沸石、鋁、無煙煤、戊二醛、聚丙烯酸、聚胺甲酸酯、聚氯乙烯、離子交換樹脂、環氧樹脂、光塑性樹脂、聚酯以及聚苯乙烯。
- 一種用於清除存在於一受污染的介質中之苯和/或萘的方法，其包括：使用一如請求項1的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之苯和/或萘被該桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代所降解和/或脫附。
- 一種用於清除存在於一受污染的介質中之原油和/或石 油精煉產物的方法，其包括：使用一如請求項1的桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代來處理該受污染的介質，而使得存在於該受污染的介質中之原油和/或石油精煉產物被該桃園假單胞菌S03或其繼代培養後代所乳化。
- 如請求項14或15的方法，其中該受污染的介質是選自於由下列所構成的群組：土壤、污泥、沉積物、蓄水層、水體以及廢水。
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-
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| CN114058554B (zh) * | 2021-12-10 | 2022-09-13 | 青岛蔚蓝赛德生物科技有限公司 | 一种堆肥假单胞菌株及其应用 |
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