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TWI516271B - 免疫調節胜肽用於治療或預防發炎相關疾病的方法 - Google Patents

免疫調節胜肽用於治療或預防發炎相關疾病的方法 Download PDF

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TWI516271B
TWI516271B TW102132635A TW102132635A TWI516271B TW I516271 B TWI516271 B TW I516271B TW 102132635 A TW102132635 A TW 102132635A TW 102132635 A TW102132635 A TW 102132635A TW I516271 B TWI516271 B TW I516271B
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方韶瓏
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Description

免疫調節胜肽用於治療或預防發炎相關疾病的方法
本發明關於一種利用調節免疫反應、阻止及減少症狀產生的組合物治療或預防發炎相關疾病的方法。另外，本發明亦關於一種利用一組合物改變基因表現量表示為免疫調解效果的方法。
人體內產生免疫反應之目的是清除致病微生物和惡性細胞，但過度免疫反應則會產生危及生命的臨床症狀。調節過度免疫反應可消除發炎現象，並使組織回復完整性。先前報告指出嗜酸性白血球增多症可由許多情況引起，例如早產兒、體內建立合成代謝狀態、藥物反應、對外來抗原反應、慢性肺病、紅血球生成素治療、全靜脈營養輸液及感染(Marc E.Rothenberg,(1998)NEJM,338：1592-1600)等。在造成嗜酸性白血球增多症過敏或血管炎的原因中，以嗜酸性白血球性肺疾病最值得注意，相關疾病包括急性與慢性嗜酸性白血球性肺炎、過敏性支氣管肺麴菌症、過敏性血管炎和肉芽腫(邱格及史特勞斯氏症(Churg-Strausssyndrome)-嗜酸性白血球增多症、氣喘、系統性血管炎和肺部浸潤)(Singh V et al.,(2009)IJASM,53：58-64,Ayalew Tefferi et al.,(2010)Mayo Clin Proc.,85：158-164)。
CCL-11(CC型趨化介素配體-11)會誘發嗜酸性白血球聚集、細胞內鈣離子含量上升及呼吸猝發(respiratory burst)。此外，CCL-11會增強嗜酸性白血球粘附於內皮細胞。已知鼻和鼻竇的慢性發炎疾病(包括鼻息肉、過敏性鼻炎和過敏性及非過敏性兩種鼻竇炎)具有大量嗜酸性白血球發炎性浸潤的特徵，這些疾病都可測得CCL-11蛋白質表現量上升(Rankin SM,et al.,(2000)Mol Med Today.,6：20-27)。在發炎性腸道疾病患者的病灶處發現CCL-11 mRNA表現量顯著上升，可說明疾病(如潰瘍性結腸炎和克隆氏症)嗜酸性白血球聚集機制(Rankin SM,et al.,(2000,Mol Med Today.6：20-27)。在Hodgkin氏病，組織嗜酸性白血球增多程度已證實與CCL-11蛋白質表現量直接關聯(Rankin SM,et al.,(2000)Mol Med Today.,6：20-27)。因此，迄今為止的臨床證據，都證明在各種嗜酸性白血球增多疾病中，CCL-11是潛在且重要的因子。CCL-11除了具嗜酸性白血球趨化作用外，亦能刺激骨髓釋放嗜酸性白血球及其前驅細胞，造成血中嗜酸性白血球快速增多。在發炎和胚胎發育過程中CCL-11能促使骨髓造血前驅細胞朝骨髓系細胞分化(Rankin SM,et al.,(2000)Mol Med Today.,6：20-27)。除了嗜酸性白血球增多之外，CCL-11可使轉移性癌細胞在癌症環境增殖和生長。在乳癌轉移小鼠模型中將癌細胞接種於小鼠股骨，血管內皮生長因子(VEGF)和CCL-11表現量顯著高於對照組小鼠(Sosnoski DM.et al.,(2012)Int J Breast Cancer 2012：160265)。因此，CCL-11是治療嗜酸性白血球增多症和癌細胞轉移疾病的首要標的。
氣喘、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管氣喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纖維化統稱為肺部疾病，這些疾病的特徵為 呼吸道阻塞。呼吸道阻塞定義為在用力呼氣期間氣流阻力增加，在氣喘症特別明顯(Stephen TH(2012)Nat.Med,18：673-683)。氣喘是呼吸道對特異性或非特異性刺激產生過度免疫反應引起呼吸道阻塞性失調的疾病。氣喘引起慢性呼吸道發炎現象需要許多細胞參與，例如上皮細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜酸性白血球、肥大細胞、T細胞及B細胞(Stanely J.S.et al.,(2012)J.Allergy Clin.Immunoll 29：S9-23)，其中嗜酸性白血球、肥大細胞和輔助2型(Th2)T細胞為氣喘發炎過程中最重要細胞。氣喘的病理學特徵係由對吸入的過敏原產生過度免疫反應，此特徵為呼吸道過度反應(AHR)的可逆性阻塞、呼吸道發炎及Th2相關或Th1相關細胞介素之失衡(Stevens,W.H.,et al.,(1995)Am J Respir Crit Care Med,151：1526-31)。Th1細胞分泌的細胞介素包括腫瘤壞死因子-β(TNF-β)和干擾素-γ(INF-γ)，這些細胞介素負責殺死細胞內寄生蟲和維持自體免疫反應；Th2細胞分泌的細胞介素包括介白素-4(IL-4)、IL-5及IL-13，這些細胞介素在過敏性氣喘疾病發揮重要作用，並已成為免疫治療性單株抗體之標的(Berger,A.,(2000)BMJ,321：424)。因此，在過敏性氣喘發炎過程中許多細胞介素都扮演關鍵角色(Besnard,A.G.,et al.,(2012)J Mol Cell Biol,4：3-10)。
目前氣喘治療方式(如吸入型皮質類固醇、β2-促效劑(β2-agonist)、M膽鹼受體拮抗劑或抗白三烯藥物)皆針對症狀緩解、反應分子與發炎介素減少或中和。這些療法對於急性病症與症狀緩解雖有療效，但長期的治療效果有限。而傳統過敏原免疫療法具有長期和顯著的療效，但需長年多次注射，且有注射失效及偶發性免疫球蛋白E(IgE)相關藥物不良反應的風險(Cox.L.(2006)Ann Allergy Asthma Immunol 97.126-137)。 因此，更有效且持久治療氣喘的方法應著重改變體內免疫反應和將過度免疫反應轉換為保護性免疫反應，從而緩和疾病的病程的發展策略。
嗜酸性白血球顆粒內蛋白質參與呼吸道重塑與AHR相關重度氣喘，這些蛋白質包括嗜酸性白血球過氧化酶(EPO)、主要鹼性蛋白(MBP)、嗜酸性白血球神經毒素(EDN)及嗜酸性白血球陽離子蛋白(ECP)。ECP有助於清除入侵微生物，如寄生蟲和病毒(Giembycz MA,et al,(1999)Pharmacol Rev 51：213-340)。此外，氣喘呼吸道過敏性發炎常見特徵是ECP與嗜酸性白血球分泌其他蛋白質造成呼吸道損傷(Gleich GH.(2000)J Allergy Clin Immunol,105：651-663)。這些蛋白質中ECP和EDN屬於人類核醣核酸酶A家族且具有核醣核酸酶活性，會傷害上皮細胞和神經元而造成呼吸道重塑及迷走神經功能障礙(Rosenberg HF,et al,(1989)J Exp Med 170：163-176)。ECP在抑制哺乳動物細胞株增殖扮演重要角色(Chang K.C.,et al,(2010)BMC Cell Biol.11：6)。關於ECP細胞毒性之機制尚未清楚，因為其核醣核酸酶活性遠低於EDN(Boix,E.,et al,(1999)J.Biol.Chem.274：15605-15614)。已有假說認為ECP的細胞毒性係因其影響細胞膜脂質失去穩定性，且細胞毒性程度和ECP濃度具直接相關性。細胞實驗顯示ECP會結合至細胞表面的碳水化合物(Chang K.C.,et al,(2010)BMC Cell Biol.11：6)對醣胺聚醣(GAG)結構(特別是肝素)具高度親和力。ECP對細胞表面缺乏硫酸肝素(HS)之細胞株的細胞毒性顯著下降(Fan T.C,et al,(2007)Traffic 8：1778-1795)。
ECP序列已確認含有肝素結合序列(heparin-binding motif)(Fan,T.C.,et al.(2008)J Biol Chem 283：25468-25474、US7595374)，可 利用此特性減少ECP對支氣管上皮細胞的細胞毒性，用以治療氣喘(US8399416)。本專利細胞介素調節胜肽(CMP)為包含ECP主要肝素結合序列的胺基酸胜肽，具能將分子送入細胞的特性，且對支氣管上皮細胞無細胞毒性(Fang,S.l.,et al.(2013)PLoS One,8：e57318、US 8372951)。CMP具多種特性，如能與肝素/硫酸肝素、脂質及細胞結合的活性(Lien,P.C.,et al.(2013)Biomed Res Int,2013：170398)。在細胞實驗中CMP可運送小分子螢光化合物、重組蛋白和擬肽藥物進入上皮細胞內，在動物實驗CMP可運送重組蛋白進入BALB/c小鼠的肺部及腸道上皮組織內(Fang,S.l.,et al.(2013)PLoS One,8：e57318、US 8372951)。透過對細胞介素的調節，CMP的肝素結合和細胞穿透特性有助於減輕發炎相關疾病。因此，本發明對BALB/c小鼠塵蟎引起的呼吸道過敏性發炎具有免疫調節的功效。
以下詳細說明及附圖作為本實例的一種說明，而非表示建構或利用本實例的唯一形式。該說明闡述該些實例的功能與建構及操作該些實例的步驟之順序。然而，相同或相等的功能及序列可藉不同的實例達成。
本發明所用之術語「一」、「一個」及「該」意指「一個或多個」，且該術語亦包括複數，除非內文另有明確指明。
本發明提供一種於個體中透過調節該個體之CCL-11基因表現以治療或預防發炎相關疾病的方法，其包含施予該個體一醫藥有效劑量的組合物，該組合物包含一序列為SEQ ID NO：1的免疫調節胜肽(NYRWRCKNQN)。本發明之個體為患有癌症、自體免疫疾病、氣道發 炎、發炎異常、皮膚異常或由病原體引起的疾病之哺乳動物。病原體的實例包括但不限於細菌、病毒、黴菌、皮屑、真菌、塵蟎、倉儲蟎、螫刺昆蟲、蚊子/糠蚊、蟑螂或動物。自體免疫疾病的實例包括但並不限於多發性硬化症、氣喘、關節炎、重症肌無力症、關節炎、紅斑性狼瘡、天皰瘡、牛皮癬、結腸炎、移植器官排斥、異種移植的排斥反應或免疫缺乏疾病。癌症的實例包括但不限於結腸癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、轉移性胰腺癌、卵巢癌或乳癌。其中呼吸道發炎的實例包括但不限於氣喘、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管性氣喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病或肺纖維化。該施予的途徑選自舌下、經皮吸收、局部、粘膜、吸入、鼻內、噴霧劑、眼內、氣管內、皮膚貼劑或眼滴劑。
在較佳實施例中，該組合物可降低該個體中發炎、呼吸道阻塞、支氣管痙攣、呼吸道過度反應、病理組織學發炎分數、杯狀細胞增生或免疫球蛋白E量、趨化介素表現量、細胞介素表現量或TLR4途徑。
在另一較佳實施例中，該組合物可降低該個體中的呼吸道阻力。
在另一較佳實施例中，該組合物可降低該個體中白血球(巨噬細胞、嗜鹼性白血球、嗜中性白血球、嗜酸性白血球或淋巴細胞)聚集或趨化介素(CCL-26或CXCL-12)表現量或細胞介素(IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13或IL-18)表現量。
在另一較佳實施例中，該個體為患有氣管發炎或之前患有肺疾病的症狀之人類。
在另一較佳實施例中，該組合物可降低該個體中氣喘發作的 嚴重程度、呼吸道阻塞、支氣管痙攣、呼吸道過度反應、病理組織學發炎分數、杯狀細胞增生或免疫球蛋白E的量。
在另一較佳實施例中，本發明之方法進一步包含將該組合物與一試劑一併施予，該試劑選自類固醇、抗IgE抗體、抗IL-4抗體、抗IL-5抗體、白三烯抑制劑、脂氧合酶抑制劑、IL-13拮抗劑、細胞介素釋放抑制劑、抗組織胺及組織胺釋放抑制劑所組成的群組。
本發明亦提供一種於個體中抑制癌轉移或腫瘤生長的方法，其包含施予該個體一醫藥有效劑量的組合物，該組合物包含一序列為SEQ ID NO：1的免疫調節胜肽。在較佳實施例中，該癌轉移為肺癌轉移。在另一較佳實施例中，該個體為哺乳動物。
圖1表示CMP對細胞介素之轉錄的調控作用。將Beas-2B細胞於無血清培養基中培養24小時，然後將5μM ECP、5μM CMP或5μM ECP與5μM CMP在37℃分別共培養(A)6小時和(B)12小時。CCL-11、CCL-24和CCL-26之mRNA表現量由定量PCR進行量測。以未經任何處理的Beas-2B細胞作為對照組。實驗數據係以相對倍數表示，將未經任何處理的細胞mRNA表現量組設為1倍。該數據代表至少三次獨立的實驗，標準偏差(SD)以誤差條表示。
圖2表示CMP抑制ECP刺激Beas-2B細胞表現CCL-11。將Beas-2B細胞於無血清培養基中培養24小時，然後用ECP刺激(柱狀圖第2長條)。在37℃反應時以PBS為負對照組(第1長條)和ECP不加 CMP(第2長條)或加入CMP 1μM(第3長條)、2.5μM(第4長條)、5μM(第5長條)、10μM(第6長條)刺激細胞24小時。CCL-11蛋白質量則使用CCL-11抗體的ELISA試劑組測定。該數據代表至少三次獨立實驗的平均值±SD(標準偏差)。***表示P<0.001；**表示P<0.01。
圖3表示CMP抑制IL-4刺激Beas-2B細胞表現CCL-11。將Beas-2B細胞於無血清培養基中培養24小時後，用PBS(柱狀圖第1長條)或10ng/mL IL-4進行刺激(第2-7長條)。在37℃不同條件10ng/mL的IL-4不加CMP(第1長條)或加入CMP 1μM(第3長條)、2.5μM(第4長條)、5μM(第5長條)及10μM(第6長條)刺激24小時。CCL-11蛋白質量則使用CCL-11抗體的ELISA試劑組測定。該數據代表至少三次獨立實驗的平均值±SD(標準偏差)。***表示P<0.001(以IL-4刺激與PBS處理的Beas-2B細胞比較)。*表示P<0.05(以指定濃度的CMP刺激與PBS處理的Beas-2B細胞比較)。
圖4表示本發明之動物實驗設計簡圖。除對照組外的所有組別都於第1天和第8天用粗萃塵蟎過敏原進行免疫接種，接著在第15天在所有塵蟎處理組中於氣管內給予粗萃塵蟎過敏原，將BALB/c小鼠分為六組：(1)對照組(PBS)、(2)只有氣管內給予塵蟎(mIT，第15天加入塵蟎)、(3)只有鼻腔內給予CMP(eIN，第1至22天給予CMP)、(4)預防處理組(eIN+mIT，第1至14天給予CMP，第15天給予塵蟎)、(5)治療處理組(mIT+eIN，第15天給予塵蟎，第15至22天給予CMP及(6)預防和治療處理組(eIN+mIT+eIN，第1至22天給予CMP，第15天給予塵蟎)。
圖5表示CMP抑制塵蟎引起的呼吸道過度反應。測量甲基 膽鹼(MCh)對小鼠暴露在CMP含有及不含塵蟎蛋白質之中的呼吸道阻力(Penh)之效果。全部六種處理組分別以6.25、12.5或25mg/ml之MCh刺激1分鐘後測量呼吸道阻力(Penh)。以測得數值與各組別的呼吸道阻力基準線(MCh刺激前)的比值表示。每個結果以平均值±SD表示(n=4)。***表示P<0.001。
圖6表示CMP抑制塵蟎引起的發炎反應聚集。在過敏原誘發(allergen challenge)後，將取自不同處理組的肺部組織之代表切片進行免疫組織分析。將組織切片以蘇木精-伊紅(haematoxylin and eosin，H&E)染色觀察一般型態及細胞浸潤，或以過碘酸雪夫氏(periodic acid-Schiff，PAS)染色觀察杯狀細胞增生和黏蛋白產生。(A)周圍小支氣管、肺泡發炎和(B)PAS的分數根據組織切片決定。每個結果以平均值±SD表示(n=4)。***表示P<0.001。
圖7表示CMP抑制塵蟎引起支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的免疫細胞聚集。收集所有實驗組別的小鼠之支氣管肺泡灌洗液。細胞族群以迪夫快速(Diff-Quick)染色後於風乾之細胞離心的抹片鑑別，進行至少300個細胞的細胞分類計數鑑別巨噬細胞、嗜酸性白血球、嗜中性白血球或淋巴細胞。數據代表三次獨立實驗之一。每個結果以平均值±SD表示(n=4)。***代表P<0.001。
圖8表示CMP抑制塵蟎引起血清IgE表現。在最後鼻內(第23天)處理的24小時後從小鼠尾部(第18天)及下腔靜脈採集血液樣本並分離血清。利用酵素免疫吸附法(ELISA)測定血清Der p特異性IgE的量。每個結果以平均值±SD表示(n=4)。*表示P<0.05，**表示P<0.01。
圖9表示CMP抑制塵蟎引起肺部細胞介質及趨化介質表現。分析不同組別小鼠的肺蛋白質萃取物中指定的細胞介素。數據代表三次獨立實驗之一。利用酵素免疫吸附法(ELISA)測定處理組的小鼠肺蛋白質萃取物中的CCL-11、IL-5、IL-13及IL-17A/F的量。每個結果以平均值±SD表示(n=4)。**表示P<0.01，***表示P<0.001。
圖10表示CMP抑制腫瘤轉移活性。將A549、H460和小鼠大腸癌細胞在37℃加入CMP培養30分鐘後，每2×104細胞/孔的密度加至24孔盤中通孔膜(transwell membrane)之上腔室部分。數據代表從一個代表性實驗的三重複樣本之平均值±標準誤差(S.E.)。該實驗至少重複3次且具有相似結果。
實例1 CMP調控細胞介質之轉錄
實驗方式
定量即時PCR分析細胞介素之mRNA表現量
對於細胞介素表現分析，將Beas-2B細胞在三種不同條件：1)5μM ECP、2)5μM CMP及3)5μM ECP與5μM CMP共培養，在37℃刺激6小時和12個小時。經過培養之後，使用RNA TRIzol試劑(Invitrogen,Inc)及MoMLV-反轉錄酶(Promega,Madison,Wis)萃取RNA。利用SYBR綠螢光染料(SYBR Green)為基礎的定量即時PCR定量目標基因，目標基因的相對表現比例以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)表現量進行標準化。藉由使用StepOneTM擴增檢測系統(Life Technologies Corporation)的定量 時PCR(real time PCR)測量細胞介素表現的變化。數據利用StepOneTM定量程式軟體(版本2.22，Life Technologies Corporation)分析，並以平均值±SD表示。顯著分析以具有雙尾分佈的兩樣本不等變異數t檢驗進行。顯著性設為P<0.05。
ECP是最為人熟知的氣喘標記蛋白質，參與觸發支氣管上皮細胞的細胞介素表現。進行即時定量PCR分析在ECP或不加CMP的治療後細胞介素表現量。支氣管上皮的Beas-2B細胞在含有5μM ECP、5μM CMP及5μM ECP與5μM CMP兩者的無血清培養基中分別培養6和12小時，利用即時定量PCR監測細胞介素和趨化介素的基因變化。未經任何處理Beas-2B細胞在相同條件培養6和12小時作為陰性對照組。本實例分析了趨化介素之基因表現量的變化，包括CCL-11、CCL-24和CCL-26。值得注意的是，在6小時ECP刺激Beas-2B細胞中CCL-11和CCL-26的基因表現量分別增加了9倍和2倍(圖1A)，而在12小時，ECP刺激Beas-2B細胞中CCL-11基因表現量增加了2.8倍(圖1B)。只有培養CMP的組沒有影響Beas-2B趨化介質表現量。此外，ECP和CMP兩者共培養6小時會造成Beas-2B細胞中ECP誘導的CCL-11基因表現顯著降低，表示CMP可能會干擾支氣管上皮細胞中的ECP所刺激的CCL-11免疫反應，並進一步減少氣喘症狀。
實例2 CMP對CCL-11的免疫調控
實驗方式
人類CCL-11酵素免疫吸附法(ELISA)試劑組
CCL-11 ELISA試劑組(R&D)是定量細胞培養上清液中人類CCL-11濃度的酵素免疫吸附法。此分析採用對塗覆在96孔盤的人類CCL-11具專一性抗體。孔槽中50μL標準品或樣品在室溫培養2.5小時。用1×洗滌溶液洗滌5次後，將200μL CCL-11複合物加入每個孔槽中持續1小時。再次洗滌後，將100μL TMB一步基質試劑(One-Step Substrate Reagent)加入每個孔槽中，在室溫反應30分鐘。最後將50μL反應終止液中加入每個孔槽中，並立即使用分光光度計在450nm讀取。本分析的偵測極限為5pg/mL。
為了確認CMP是否會影響ECP所刺激的CCL-11表現，Beas-2B細胞分別5μM ECP不加CMP或是加入1μM、2.5μM、5μM及10μM CMP刺激，在37℃培養24小時。結果顯示5μM ECP刺激細胞釋放17.8pg/mL CCL-11(圖2)。而在1或2.5μM CMP誘導並沒有減少ECP刺激細胞釋放CCL-11。但在5或是10μM CMP誘導，ECP刺激的CCL-11顯著降低到7.55pg/mL和8.94pg/mL(圖2)。
為了進一步探討CMP是否影響其他物刺激Beas-2B細胞產生CCL-11，將去除血清的Beas-2B細胞單獨加入10ng/mL IL-4(刺激CCL-11的主要細胞介素)刺激，或同時加入濃度為1、2.5、5及10μM的CMP，在37℃培養24小時。結果顯示10ng/mL IL-4刺激細胞釋放73.2pg/mL CCL-11(圖3)，而1或2.5μM CMP沒有減少IL-4刺激的細胞釋放CCL-11(圖3)，而5或10μM CMP分別減少細胞釋放CCL-11量48.1pg/mL及30.2pg/mL(圖3)。這些結果顯示ECP與IL-4會刺激Beas-2B細胞釋放趨化介素CCL-11，且加入5和10μM的CMP可負調控ECP與IL-4 所誘導的CCL-11表現。
實例3 降低肺部呼吸道過度反應
實驗方式
將小鼠分為6組：1)對照組(n=10)、2)只有氣管內給予塵蟎粗萃過敏原(mIT)(n=10)、3)只有鼻腔內給予CMP(eIN)(n=12)、4)預防處理組(eIN+mIT；n=12)、5)治療處理組(mIT+eIN；n=12)及6)預防和治療處理組(eIN+mIT+eIN；n=18)(圖4)。所有接受mIT的組別於第1天和第8天用粗萃塵蟎過敏原進行免疫接種，接著在第15天氣管內給予粗萃塵蟎過敏原。eIN和eIN+mIT+eIN組自第1天至第22天接受eIN；eIN+mIT組從第1天到第15天(給予mIT前)接受eIN；且mIT+eIN組從第15天(給予mIT後)至第22天接受eIN。所有小鼠皆於第23天犧牲。動物使用方式經機構的實驗動物照護及使用委員會審查與核准(IACUC核准號：La-95279)。
呼吸道阻力(Penh)之測量
將有意識、自主呼吸的小鼠在第22天(即最後一次誘發處理的1小時後)使用全身體積描記系統(Buxco,Wilmington,NC,USA)測量呼吸道反應性，如先前文獻所述(Maeda T,et al,Eur J Biochem 2002,269,307-316)。簡言之，將老鼠個別放置在腔室內，並靜置3-5分鐘。透過連接到電腦數據獲取系統的傳感器連續測量腔室-壓力-時間波形。在呼吸道阻力(Penh)基準線讀取>3分鐘後，將小鼠藉由吸入方式依序暴露於霧化的甲基膽鹼(MCh，於PBS中，濃度分別為0、6.25、12.5及25mg/ml；Sigma,St Louis,MO,USA)持續1分鐘。Penh值在MCh霧化之後的前3分鐘內測 量呼吸道阻力、潮氣量及呼吸頻率(次/分鐘)的變化，取平均值並用於比較所有六個處理組之間的反應。
氣喘主要特徵是支氣管痙攣，會造成呼吸道阻塞和呼吸道過度反應(AHR)，然後降低氣流(Stephen T.H.(2012)Nat.Med,18：673-683)。AHR是氣喘的臨床特徵之一，且與疾病嚴重程度成比例(Chang,Y.J.et al.(2011)Nat.Immunol.12：631-638)。測量在所有實驗小鼠的呼吸道阻力變化評估CMP對塵蟎誘發的氣喘之影響。對照吸入的甲基膽鹼劑量增加的反應檢測eIN+mIT、mIT+eIN及eIN+mIT+eIN之處理小鼠的AHR反應(圖5)。12.5和25mg/ml MCh刺激後，mIT組呼吸道阻力變化較對照組、eIN+mIT+eIN及eIN組更大。相較於25mg/ml MCh處理的塵蟎組，eIN+mIT和mIT+eIN的呼吸道阻力變化較低，但12.5mg/ml MCh處理的則否。這些結果顯示CMP可減少呼吸道阻塞、支氣管痙攣及增加過敏原誘導的AHR中的氣流。總而言之，CMP可在氣喘小鼠模型中發揮其預防和治療的效果。
實例4 肺部組織的病理變化
組織病理學分析
將蘇木精-伊紅染色(H&E)之福馬林固定的肺切片利用三個隨機選擇將肺泡、周圍小支氣管和發炎指區域的三個獨立的分數的平均值之計算。各個切片由兩個醫生獨立且盲檢的方式分別判讀，並按照先前呼吸道發炎的評分系統(Ford JG,et al,(2001)J Immunol 167：1769-77)。為了評估杯狀細胞增生，呼吸道切片用過碘酸-希夫式(PAS)染色進行檢測。兩位判讀者獨立且隨機的對每個玻片的10個區域評分，每一個肺利用數值間的平均之計算，每個呼吸道中PAS陽性的杯狀細胞含量的分數 (Padrid P,et al,(1995)Am J Respir Crit Care Med 151：184-9)決定如下：0，5%的杯狀細胞；1，5-25%；2，25-50%；3，50-75%；4，75%。
為了測定AHR之抑制是否可代表更完整的的病理狀況，將六組小鼠之間的肺組織切片進行比較。周圍小支氣管和肺泡發炎的分數如圖6A所示，mIT組在肺部的周圍支氣管及肺泡區域中發現細胞浸潤層。eIN+mIT+eIN組的周圍小支氣管和肺泡的分數顯著低於mIT組。杯狀細胞增生的分數示於圖6B，eIN+mIT+eIN組的分數低於mIT組。eIN+mIT+eIN組對周圍小支氣管、肺泡發炎和杯狀細胞增生相較於eIN+mIT和mIT+eIN組有更佳的抑制效果。動物實驗的證據可證實CMP確實有降低過敏原刺激造成的呼吸道發炎及杯狀細胞增生的效果。
實例5 抑制肺部免疫細胞聚集
支氣管肺泡灌洗液及免疫細胞計數
支氣管插管，接著沖洗兩次，每次1.0毫升磷酸鹽緩衝液通過套管導入肺部並回收收集細胞，每次沖洗的支氣管肺泡灌洗液(BALF)放置於冰上的聚丙烯管。接著將收集的BALF在4℃轉速300×g離心7分鐘。除去上清液後，將細胞再懸浮於1.0毫升的磷酸鹽緩衝液(pH7.4)。總細胞數用血球計數器計數，並將1-5 x 103的細胞離心塗於顯微鏡載玻片(細胞離心塗片，Shandon Scientific,Cheshire,UK)。將玻片於空氣乾燥24小時，固定並用瑞氏染劑(Wright stain)染色。根據形態學標準對每玻片至少300個細胞進行細胞分類計數，計算細胞數並以絕對細胞數表示。
為了瞭解過敏原誘發環境免疫細胞聚集於呼吸道的程度，測量支氣管肺泡灌洗液免疫細胞數量。如圖7所示，eIN+mIT+eIN組的巨噬 細胞、嗜酸性白血球和淋巴細胞計數較mIT組低。eIN+mIT組的嗜酸性白血球計數低於mIT組。CMP處理後，肺部的免疫細胞聚集明顯減少，表示CMP會抑制氣喘小鼠的呼吸道發炎現象。
實例6 抑制塵蟎特異性血清IgE量
測量血清Der P特異性IgE量
自小鼠尾巴(第18天)及處理完成後自下腔靜脈(第23天)採集血液樣本並將血清分離。將塵蟎蛋白(5微克)在4℃塗覆於培養盤隔夜。然後，將第18天和第23天的血清加入經塗覆的培養盤，標準抗IgE抗體購自B.D.(San Diego,CA,USA)。透過酵素免疫吸附法(ELISA)測量血清塵蟎特異性IgE量。
為了進一步分析CMP對塵蟎所引起氣喘的治療效果，所有六個處理組皆測量小鼠的血清塵蟎特異性IgE的量。血清取自尾巴(第18天)及下腔靜脈(IVC)(第23天)(圖8)。第18天時，mIT組有較eIN+mIT、mIT+eIN和eIN+mIT+eIN組高的IgE量。第23天時，eIN+mIT+eIN組的IgE量較mIT組低很多。CMP降低了關鍵分子-特異性IgE，說明對氣喘小鼠呼吸道發炎的抑制機制。
實例7 抑制肺部萃取物輔助2型T細胞介白素
製備肺組織上清液
將左肺於1.0毫升的冷磷酸鹽緩衝液均質化，並在使用前保存在冰浴。將肺部物質在4℃轉速20000×g離心5分鐘。接著將肺部均質物上清液用PBS稀釋至最終蛋白質濃度為500μg/ml並保存於-80℃。
使用ELISA進行細胞介素分析
利用ELISA測量肺蛋白質萃取物的細胞介素的量。使用BD OptEIATM組小鼠IL-5、IL-10、IL-13、IFN-γ及轉化生長因子-β(TGF-β)試劑組(BD Bioscience,San Jose,CA,USA)和DuoSet小鼠嗜酸性白血球趨化蛋白(eotaxin)、IL-17A/F、血管內皮生長因子(VEGF)和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)試劑組(R&D,Minneapolis,MN,USA)。將微孔盤送入ELISA測讀儀(Thermo Labsystems,Waltham,MA,USA)在450mm進行讀值。
塵蟎透過誘導由Th1向Th2細胞的免疫偏差(immune deviation)，可誘發BALB/c小鼠產生過敏性氣喘(Stevens,W.H.,et al.,(1995)Am J Respir Crit Care Med,151：1526-31)。最近的研究指出，在BALB/c模式，由Th2細胞介素(IL-13)和Th17細胞介素(IL-17A/F)兩者調控氣喘的呼吸道發炎(Mukherjee S,et al.(2011)Am J Pathol 179：248-58)。Th17細胞調控Th2細胞在氣喘發展過程非常重要。在中度至重度氣喘患者的支氣管粘膜下層IL-17A/F的表現增加(Doe C,et al.(2011)Chest 138：1140-1147)。為了檢驗CMP是否能夠回復Th1/Th2/Th17偏差，測量了BALF的不同細胞介素表現量。eIN+mIT、mIT+eIN和eIN+mIT+eIN這三個組別之CCL-11濃度較mIT組低；IL-5表現量在mIT+eIN與eIN+mIT+eIN組也比較低，與eIN+mIT組相同；eIN+mIT、mIT+eIN和eIN+mIT+eIN組的IL-13濃度皆較mIT組低(圖9)。這三組老鼠肺部IL-17A/F量也是遠低於mIT組(圖9)。CMP處理的小鼠肺部CCL-11、IL-5和IL-13表現亮降低，表示CMP可減輕細胞介素調控的呼吸道發炎並影響嗜酸性白血球活化。另一個有趣的發現是，CMP能降低肺部IL-17A/F表現。因此，CMP和IL-17之間的調控關聯，顯示CMP是一種新式治療方式。這些證據顯示CMP可 作為目前肺疾病患者之抗發炎藥物的替代治療方法。
實例8 CMP對腫瘤細胞轉移之抑制
轉移分析
CMP對癌細胞轉移抑制分析是在24孔成對培養盤(companion plate)(Becton Dickinson)由細胞培養嵌入物(直徑6.4毫米，孔隙8微米的聚乙烯對苯二甲酸酯膜[Becton Dickinson])組成的24孔穿孔腔室進行。先將3×104之癌細胞懸浮與5或是12.5μM的CMP共培養30分鐘，總體積為200μL。再將細胞懸浮液接種到嵌入物的上腔室、將含5%胎牛血清(FBS)的培養基作為趨化因子加入底部腔室的培養盤孔、並置入37℃含有5% CO2培養箱培養18小時。用棉籤除去上部膜表面未轉移的細胞，而貼附至下部膜表面之轉移細胞用4%多聚甲醛固定，並用0.2%結晶紫染色。轉移的細胞之數目在4個隨機選擇的高倍率區域於顯微鏡計數。顯示的數據代表三個個別的孔槽的統計結果。
HS和硫酸軟骨素(CS)的醣胺聚多醣(GAGs)已被報導可吸引參與細胞生長、發育和基質重塑的生長因子，推測CMP能於胞外捕捉生長調控因子從而抑制癌症轉移。CMP與人類肺癌A549，H460細胞株或小鼠結腸癌細胞共培養，實驗具抑制癌症轉移活性。實驗開始前30分鐘，先將5或12.5μM CMP加入細胞培養液，放置18小時後，檢測細胞轉移量。實驗結果發現濃度5μM的CMP可降低A549和小鼠結腸癌細胞60%的移動活性，而濃度12.5μM可降低H460之50%移動活性(圖10)。
由上述實施例的說明可了解其僅為例示方式，熟習此技藝者可能採用各種修改。上述說明書、實例及數據提供本發明之例示性實施例 的結構及用途的完整敘述。雖然本發明的各種實施例已敘述具有一定特殊性或參照一或多個個別實施例，但熟習此技藝者可能在不脫離本創作之精神和範圍內對揭示的實施例作些許之變更。
本文所提及的任何出版物、專利和專利申請案都是全文引用的方式加入本文，並應視為是明確的和獨立的方式全文引用每一個別的出版物、專利或專利申請案。
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<160> 1
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<211> 1
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CMP
<220>
<221> 胜肽
<222> (1)..(10)
<400> 1

Claims (18)

  1. 一種組合物用於製備調控CCL-11基因表現之藥物的用途，其中該組合物包含一序列為SEQ ID NO：1的免疫調節胜肽。
  2. 根據專利申請範圍第1項所述之用途，其中該藥物經由選自舌下、經皮吸收、局部、粘膜、吸入、鼻內、噴霧劑、眼內、氣管內、皮膚貼劑或眼滴劑的途徑施予一個體。
  3. 根據專利申請範圍第1項所述之用途，其中CCL-11基因表現的相關疾病為癌症、自體免疫疾病、發炎異常、呼吸道發炎、皮膚異常或由病原體引起的疾病。
  4. 根據專利申請範圍第3項所述之用途，其中該自體免疫疾病為多發性硬化症、氣喘、關節炎、重症肌無力症、關節炎、紅斑性狼瘡、天皰瘡、牛皮癬、結腸炎，移植器官排斥、異種移植排斥反應或免疫缺陷性疾病。
  5. 根據專利申請範圍第3項所述之用途，其中該癌症為結腸癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、轉移性胰腺癌、卵巢癌或乳腺癌。
  6. 根據專利申請範圍第3項所述之用途，其中該呼吸道發炎為氣喘、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管性氣喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病或肺部纖維化。
  7. 根據專利申請範圍第1項所述之用途，其中該CCL-11基因表現和嗜酸性白血球增多症有關。
  8. 根據專利申請範圍第2項所述之用途，其中該組合物減少該個體中發炎、白血球聚集、趨化介素表現量或細胞介素表現量。
  9. 根據專利申請範圍第8項所述之用途，其中該白血球為巨噬細胞、嗜鹼性白血球、嗜中性白血球、嗜酸性白血球或淋巴細胞。
  10. 根據專利申請範圍第8項所述之用途，其中該趨化介素為CCL-26或CXCL-12。
  11. 根據專利申請範圍第8項所述之用途，其中該細胞介素為IL-1β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13或IL-18。
  12. 根據專利申請範圍第2項所述之用途，其中該組合物降低該個體中氣喘發作的嚴重程度、呼吸道阻塞、支氣管痙攣、呼吸道過度反應、病理組織學發炎分數、杯狀細胞增生或免疫球蛋白E量。
  13. 根據專利申請範圍第2項所述之用途，其中該組合物降低該個體中的呼吸道阻力。
  14. 根據專利申請範圍第1項所述之用途，其中該藥物進一步包括一試劑選自類固醇、抗IgE抗體、抗IL-4抗體、抗IL-5抗體、白三烯抑制劑、脂氧合酶抑制劑、IL-13拮抗劑、細胞介素釋放抑制劑、抗組織胺及組織胺釋放抑制劑所組成的群組。
  15. 根據專利申請範圍第2項所述之用途，其中該個體為哺乳動物。
  16. 一種組合物用於製備抑制癌轉移或腫瘤生長之藥物的用途，其中該組合物包含一序列為SEQ ID NO：1的免疫調節胜肽。
  17. 根據專利申請範圍第16項所述之用途，其中該癌轉移為肺癌轉移。
  18. 根據專利申請範圍第16項所述之用途，其中該藥物係施予一哺乳動物。
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