TWI510255B

TWI510255B - 阿莫西林之奈米粒子調配物

Info

Publication number: TWI510255B
Application number: TW103135006A
Authority: TW
Inventors: Weiwei Gao; Yu Chen Chen
Original assignee: San Heh Pharmaceutical Corp
Priority date: 2013-10-11
Filing date: 2014-10-08
Publication date: 2015-12-01
Also published as: TW201513897A; CN104546837A

Description

阿莫西林之奈米粒子調配物

本發明係關於一種包含奈米粒子之醫藥組成物，其中該等奈米粒子包含包覆阿莫西林的交聯聚葡萄胺糖。本發明亦係關於一種使用該醫藥組成物治療細菌感染的方法。

阿莫西林為半合成的經口吸收之廣譜抗生素。化學上，其為(2S,5R,6R)-6-[(R)-(-)-2-胺基-2-(對羥苯基)乙醯胺基]-3,3-二甲基-7-側氧基-4-硫-1-氮雜雙環[3.2.0]庚烷-2-甲酸三水合物。阿莫西林與第二抗生素及酸性抑制劑組合而廣泛用於與幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)感染相關的胃及十二指腸潰瘍之標準根除治療中。幽門螺旋桿菌(H.pylori)(流行人類特異性病原體)為慢性活動性胃炎、胃及十二指腸潰瘍以及胃腺癌中之病原體。幽門螺旋桿菌之治療仍然為具有挑戰性的命題。幽門螺旋桿菌之不完全根除之一個原因可能為劑型在胃中之較短滯留時間，從而在存在幽門螺旋桿菌之胃黏液層或上皮細胞表面中不能達到有效抗微生物濃度。另一原因可能為阿莫西林在胃酸中降解。多名研究者已製備並報告能夠在胃腸道中滯留較長延長時間段以達到更有效的幽門螺旋桿菌根除之新穎阿莫西林調配物，諸如漂浮錠劑、黏膜黏著錠劑及具有pH值敏感賦形劑之調配物。

需要用於在胃中遞送阿莫西林之阿莫西林組成物，其將提供長期滯留時間及持續作用，且提高藥物之效率。

本發明係關於包含交聯聚葡萄胺糖及阿莫西林之奈米粒子，其中藉由交聯聚葡萄胺糖包覆阿莫西林，且奈米粒子之平均直徑為100-600nm。在一個具體實例中，至少80%奈米粒子之直徑在50-800nm之間。在一個具體實例中，經包覆之阿莫西林為奈米粒子總重量之至少5%(w/w)。

本發明亦係關於一種製備奈米粒子之方法。該方法包含以下步驟：(a)在水性溶液中混合聚葡萄胺糖與阿莫西林直至聚葡萄胺糖及阿莫西林溶解；(b)向(a)中添加陰離子界面活性劑及油且混合，其中陰離子界面活性劑係選自由以下組成之群：磺基丁二酸鈉二辛酯、月桂基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉及月桂基硫酸鉀；(c)向(b)中添加交聯劑戊二醛或雙[磺基丁二醯亞胺基]辛二酸酯且混合以使聚葡萄胺糖交聯，及(d)形成奈米粒子，其中藉由交聯聚葡萄胺糖包覆阿莫西林。

本發明亦係關於治療細菌感染之方法。該方法包含以下步驟：鑑別罹患細菌感染之個體，及以有效治療細菌感染之量向個體經口投予本發明之奈米粒子。

圖1描繪本發明之用於經口遞送阿莫西林的奈米粒子之特徵。

圖2顯示奈米粒子之表徵。(A)顯示顆粒之平均流體動力學直徑為324.6nm且PDI為0.2。(B)顯示根據SEM，乾燥粉末具有粒子形態，，其中平均直徑為約300nm。

圖3顯示在各種初始藥物輸入濃度下奈米粒子調配物中之阿莫西林負載率。

圖4顯示在pH=2.0、5.0、6.0及7.4下奈米粒子調配物中之阿莫西林之釋放曲線。

圖5顯示在小鼠模型中呈自由藥物形式及呈經口給藥的奈米粒子調配物形式之阿莫西林之活體內藥物動力學曲線(對於各個群組，n=10)。插圖顯示0至5小時之間的藥物動力學曲線。

圖6顯示呈奈米粒子調配物形式及呈自由藥物形式之阿莫西林針對幽門螺旋桿菌細菌之抗微生物活性。(A)顯示最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值之測定。(B)顯示最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)值之測定。

定義

「約」定義為所述值之±10%。

「聚葡萄胺糖」定義為去乙醯化殼質或聚(D-葡萄糖胺)。其為由隨機分佈的β-(1-4)-鍵聯D-葡萄糖胺(去乙醯化單元)及N-乙醯基-D-葡萄糖胺(乙醯化單元)組成之線性多醣。用於本發明之較佳聚葡萄胺糖為至少60%或70%或80%、85%或90%去乙醯化。用於本發明之較佳聚葡萄胺糖之分子量為400-200,000道爾頓。舉例而言，可獲得分子量為約110,000-150,000道爾頓；60,000-120,000道爾頓；6,000-10,000道爾頓；1,000-5000道爾頓；或約40,000道爾頓或600道爾頓之聚葡萄胺糖。聚葡萄胺糖一般具有如下文所示之結構。

奈米粒子之「藥物負載率」定義為所包覆藥物之重量與包括賦形劑及藥物之藥物負載奈米粒子的總重量之比率(%)。

「奈米粒子」定義為直徑為小於1μm且在1-999奈米之間的粒子。

本發明人已發現包含交聯聚葡萄胺糖及阿莫西林之奈米粒子組成物，其中藉由交聯聚葡萄胺糖之奈米粒子基質包覆阿莫西林。本發明之奈米粒子組成物保護阿莫西林免於降解，增加在目標位點處之藥物滯留時間，增加經口投予之後的藥物滯留時間且因此改良生物可用性及阿莫西林之功效。

用於阿莫西林之經口遞送的奈米粒子具有優於自由阿莫西林之優勢或直徑大於1μm之較大尺寸微粒。歸因於較小尺寸及相對遷移，奈米粒子能夠滲透於胃腸道中之整個黏膜下層中，而微米尺寸之微粒主要定位於上皮內層中。由於滲透，可易於截留奈米粒子且保持在黏膜層處，從而增加在吸收位點處之滯留時間且提供阿莫西林之延長及控制釋放。另外，當與較大粒子比較時，奈米粒子具有較大表面與體積比率。當將聚葡萄胺糖調配成奈米粒子時，其暴露較大表面積用於黏膜黏著，進一步增加藥物吸收以實現有效阿莫西林遞送。

聚葡萄胺糖具有一些用於奈米粒子之聚合載體之理想性質，諸如黏膜黏著、生物相容性、生物可降解、無毒性及廉價。此外，其擁有正電荷且展現促進吸收作用。聚葡萄胺糖之體密度(<0.6g/cm³ )低於胃液。藉由使用獨特調配方法組合基於聚葡萄胺糖之聚合物系統，本發明之奈米粒子能夠維持負浮力且在胃中向上漂浮，從而增加經口投予之後的奈米粒子滯留。漂浮奈米粒子調配物賦予一系列針對藥物遞送之優勢，包括增強的藥物生物可用性、降低的給藥頻率及針對上部胃腸道中之局部病痛的靶向治療。

在本發明組成物中，經由聚葡萄胺糖之交聯實現藥物囊封。最佳化調配方法以便在交聯之後聚葡萄胺糖聚合物主鏈基本上完整且保留聚葡萄胺糖之獨特黏膜黏著性質。奈米粒子組成物之主要組份為聚葡萄胺糖，其使得粒子參與與胃腸道內層中之黏蛋白的黏膜黏著相互作用。此等相互作用複合來自靜電引力、氫鍵及疏水效應之作用。黏著性特徵使得奈米粒子主動結合至胃及胃腸道下方之黏膜層，從而增加活體內奈米粒子滯留。

本發明之用於經口遞送阿莫西林的奈米粒子之特徵顯示於圖1中。

奈米粒子組成物

本發明係關於包含交聯聚葡萄胺糖及阿莫西林之奈米粒子，其中藉由交聯聚葡萄胺糖包覆阿莫西林。如本文所使用之「經包覆」係指阿莫西林係藉由交聯聚葡萄胺糖囊封或使阿莫西林連接至或結合至交聯聚葡萄胺糖。在奈米粒子中，交聯聚葡萄胺糖為形成奈米粒子之基質的主要聚合物(超過奈米粒子之50% w/w)。在一個具體實例中，可向奈米粒子基質中添加少量的其他聚合物(小於40%，較佳小於30%、20%、10%、 5%或1%)。在另一具體實例中，除交聯聚葡萄胺糖外，本發明之奈米粒子並不含有大量任何其他聚合物；亦即奈米粒子含有小於10%、5%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%(w/w)之任何其他聚合物，或奈米粒子含有0%之任何其他聚合物。其他聚合物包括(但不限於)海藻酸酯；肝素；聚(丙烯酸)；聚麩胺酸酯；Carbopol^® ；海藻糖；丙烯醯胺、丙烯酸、丹寧酸與甲基丙烯酸酯之共聚物。在另一具體實例中，本發明之奈米粒子並非藉由麩胺酸或麩胺酸酯交聯，或含有小於10%、5%、2%或1%之麩胺酸或麩胺酸酯。

本發明之奈米粒子之平均直徑為約50-900nm；較佳平均直徑為約100-600nm、150-500nm、200-450nm、250-400nm、或300-350nm。奈米粒子組成物中至少80%、較佳85%、90%或95%粒子之尺寸小於1微米。

在一個具體實例中，奈米粒子之平均直徑為約100-600nm，且粒度分佈為至少80%奈米粒子之直徑在50-800nm之間。在另一具體實例中，奈米粒子之平均直徑為約150-500nm、200-450nm、250-400nm或300-350nm，且粒度分佈為至少80%或85%或90%奈米粒子之直徑在100-600nm之間。

本發明之奈米粒子有效截留阿莫西林。定義為阿莫西林之重量/奈米粒子之總重量的負載率一般為至少1%，較佳至少2%、5%、10%、15%、20%、25%、30%或35%。舉例而言，經包覆阿莫西林為奈米粒子總重量之10%-35%、10%-25%、10%-15%、5%-35%、5%-25%、5%-20%、5%-15%、2%-10%、2%-5%或1%-5%(w/w)。奈米粒子之高負載率為有利的，因為可降低給藥頻率。

本發明之奈米粒子能夠滲透於胃腸道之整個黏膜下層中且保持在黏膜層處，從而增加阿莫西林之滯留時間使其超過24小時。

製備奈米粒子組成物的方法

生產阿莫西林奈米粒子之方法將聚合物交聯與反相乳化組合。最佳化該方法從而僅在高藥物負載效率及產率下產生奈米尺寸粒子。

該方法包含以下步驟：(a)在水性溶液中混合聚葡萄胺糖與阿莫西林直至聚葡萄胺糖及阿莫西林溶解；(b)向(a)中添加陰離子界面活性劑及油且混合以形成油包水乳液，(c)向(b)中添加交聯劑且混合；及(d)形成具有作為奈米粒子基質且包覆阿莫西林之交聯聚葡萄胺糖的奈米粒子。

在步驟(a)中，混合聚葡萄胺糖與阿莫西林以溶解於水性溶液中。水為較佳的水性溶液；然而，可向水中添加少量鹽或緩衝劑。若所用聚葡萄胺糖未完全溶解於水中，則可添加少量乙酸以提高聚葡萄胺糖之溶解度。一般而言，阿莫西林與聚葡萄胺糖之重量比為約0.01-0.5：1。舉例而言，阿莫西林之濃度為0.1-5mg/mL，且聚葡萄胺糖之濃度為5-20mg/mL。

在步驟(b)中，向(a)之混合物中添加陰離子界面活性劑及油。聚葡萄胺糖溶液不可與油混溶且界面活性劑有助於使水性聚葡萄胺糖溶液分散於油中。可使用有助於使水性溶液分散於油中以形成油包水乳液之任何適合之陰離子界面活性劑。適合之陰離子界面活性劑之實施例包括磺基丁二酸鈉二辛酯、月桂基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉及月桂基硫酸鉀。可使用可形成反相乳液之任何適合之油。適合之油包括礦物油、植物油、橄欖油、沙拉油及玉米油。在一個具體實例中，油之量為至少35%、40%、50%、60%、70%、75%、80%或90% v/v。舉例而言，油之量為乳液之35%-60%、40%-70%、50%-80%、60%-80%、70%-90%、75%-90%、80%-90%或85-95% v/v。使用足夠量之陰離子界面活性劑以形成油包水乳液。所用陰離子界面活性劑之量視所用油之量而定。一般而言，陰離子界面活性劑之量為約1%-15%，或1.5%-13%，或2%-10%，或3%-8%，或4%-7%，或5%-6%(w/v)。

在步驟(c)中，添加適合之交聯劑。可使用可使聚葡萄胺糖交聯之任何適合之交聯劑。交聯化學物質為此項技術中已知。適合之交聯劑之實例包括同型雙功能交聯劑，諸如戊二醛及BS3交聯劑(雙[磺基丁二醯亞胺基]辛二酸酯)。可組合諸如N-丁二醯亞胺基3-[2-吡啶基二硫基]-丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基6-[3-[2-吡啶基二硫基]-丙醯胺基]己酸酯(LC-SPDP)及丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)之異型雙功能交聯劑以使聚葡萄胺糖交聯。

在混合之後，形成油包水乳液且交聯聚葡萄胺糖及包覆阿莫西林之反應正在進行。所用交聯劑之量視所用特定交聯劑而定。一般而言，可使用1%-15%，或1.5%-13%，或2%-10%，或3%-8%，或4%-7%，或5%-6%(w/v)之交聯劑。舉例而言，約5%之戊二醛可用於交聯反應中。

在步驟(d)中，交聯反應完成，且含有經包覆阿莫西林之交聯聚葡萄胺糖形成奈米尺寸的粒子。可藉由離心自懸浮液分離奈米粒子且收集該等顆粒。視情況用適當有機溶劑(諸如己烷、石油醚、戊烷及乙醇)洗滌所分離的奈米粒子。隨後乾燥奈米粒子且儲存以供使用。

醫藥組成物

本發明提供包含阿莫西林奈米粒子及視情況選用之一或多種醫藥學上可接受之載劑的醫藥組成物。對於錠劑或散劑調配物而言，醫藥組成物中之奈米粒子一般為約1%-90%，較佳為20%-90%，或30%-80%，或40%-70%，或50%-60%。對於膠囊調配物而言，醫藥組成物中之奈米粒子一般為1%-100%，較佳為20%-100%、50%-100%、70%-100%、85%-100%、20%-90%、30%-80%、40%-70%、50%-60%。對於液體懸浮液調配物而言，醫藥組成物中之奈米粒子一般為1%-50%、5%-50%、5%-45%、5%-35%、5%-25%、5%-20%、10%-40%、10%-35%、10%-25%、10%-20%。

在一個具體實例中，醫藥組成物可呈諸如錠劑、膠囊、粒劑、細粒劑、散劑、懸浮液或類似者之劑型。可藉由習知方法製備上述醫藥組成物。

作為非活性成分之醫藥學上可接受之載劑可由熟習此項技術者使用習知準則來選擇。醫藥學上可接受之載劑可含有以下成分，包括(但不限於)：生理鹽水及水性電解質溶液；離子及非離子滲透試劑，諸如氯化鈉、氯化鉀、丙三醇及右旋糖；pH值調節劑及緩衝劑，諸如氫氧化物、磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽之鹽；及三乙醇胺；抗氧化劑，諸如亞硫酸氫鹽、亞硫酸鹽、偏亞硫酸氫鹽、硫代硫酸鹽、抗壞血酸、乙醯基半胱胺酸、半胱胺酸、麩胱甘肽、丁基化羥基大茴香醚、丁基化羥基甲苯、生育酚及抗壞血酸棕櫚酸酯之鹽、酸及/或鹼；諸如卵磷脂、磷脂之界面活性劑，包括(但不限於)磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺及磷脂醯肌醇；泊洛沙姆(poloxamer)及泊洛胺(ploxamines)，諸如聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯60及聚山梨醇酯20之聚山梨醇酯，諸如聚乙二醇及聚丙二醇之聚醚；諸如聚乙烯醇及聚乙烯吡咯啶酮(PVP，聚維酮)之聚乙烯；諸如甲基纖維素、羥丙基纖維素、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素及羥丙基甲基纖維素及其鹽之纖維素衍生物；諸如礦物油及白凡士林之石油衍生物；諸如羊毛脂、花生油、棕櫚油、大豆油之脂肪；單甘油酯、二甘油酯及三甘油酯；諸如右旋糖聚糖之多醣及諸如玻尿酸鈉之葡糖胺聚糖。此類醫藥學上可接受之載劑可使用熟知防腐劑來保藏以免受細菌污染，此等防腐劑包括(但不限於)氯化苯甲烴銨、乙二胺四乙酸及其鹽、苄索氯銨(benzethonium chloride)、氯己定(chlorhexidine)、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、硫柳汞及苯乙醇，或可調配為單次或多次使用之非保藏型調配物。

舉例而言，活性化合物之錠劑調配物或膠囊調配物可含有不具有生物活性及不與活性化合物反應之其他賦形劑。錠劑或膠囊之賦形劑可包括填充劑、黏合劑、潤滑劑及滑動劑、崩解劑、潤濕劑及釋放速率調節劑。錠劑或膠囊之賦形劑之實例包括(但不限於)羧甲基纖維素、纖維素、乙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、甲基纖維素、卡拉亞膠(karaya gum)、澱粉、黃蓍膠、明膠、硬脂酸鎂、二氧化鈦、聚(丙烯酸)及聚乙烯吡咯啶酮。

舉例而言，錠劑調配物可含有諸如膠狀二氧化矽、交聯聚維酮、羥丙基甲基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素、聚乙二醇、羥基乙酸澱粉鈉及二氧化鈦之非活性成分。膠囊調配物可含有諸如明膠、硬脂酸鎂及二氧化鈦之非活性成分。散劑口服調配物可含有諸如矽膠、苯甲酸鈉、檸檬酸鈉、蔗糖及三仙膠之非活性成分。

使用方法

本發明係關於一種治療細菌感染之方法，該細菌感染為諸如幽門螺旋桿菌感染、大腸桿菌感染、沙門氏菌(salmonella)感染、耳感染、尿路感染(諸如膀胱感染及淋病)、皮膚感染(感染咬傷)、牙齒感染、上部呼吸道感染(諸如肺炎)、放線菌病、惡性水腫、氣性壞疽、丹毒、出血性敗血症、葡萄球菌症、鼻黏膜炎、巴氏桿菌病、嗜血桿菌流感、大腸桿菌病及由革蘭氏陽性或陰性細菌感染(gram positive or negative bacterial infection)所導致的一般化膿性病症；從而殺死細菌及防止其增長。本發明亦係關於一種治療與幽門螺旋桿菌感染相關之胃或十二指腸潰瘍的方法；從而減少或消除疾病之症狀。本發明進一步係關於一種根除幽門螺旋桿菌之方法。該方法包含選擇有需要之個體及向個體投予阿莫西林奈米粒子組成物之步驟。較佳投予途徑為經口投予。

本發明適用於人類藥物及獸醫藥物。本發明適用於治療人類及非人類動物。舉例而言，本發明適用於治療哺乳動物個體，諸如人類、馬、豬、貓及狗。本發明亦適用於治療家禽，諸如雞、鴨及火雞。

奈米粒子組成物之給藥係基於用於治療特定疾病及個體病症之阿莫西林之已知劑量。舉例而言，對於治療成年人類中之細菌感染而言，可經口投予含有250mg至500mg阿莫西林的奈米粒子一日三次歷時7天至21天；或者，可經口投予含有500mg至875mg阿莫西林的奈米粒子一日兩次。對於治療狗或貓中之細菌感染而言，每12-24小時投予含有5-10 mg阿莫西林/磅動物之奈米粒子。

以下實施例進一步說明本發明。此等實施例僅意欲說明本發明且不認為會限制本發明。

實施例

實施例1.製備阿莫西林奈米粒子

在室溫下將聚葡萄胺糖(10mg，來自Sigma-Aldrich)連同阿莫西林(3mg，來自Sigma-Aldrich)溶解於水(1mL)中。若所用聚葡萄胺糖非完全可溶於水，則添加足夠量之乙酸(0.1%-2%)以提高水溶解度。隨後在適度攪拌下向溶液中添加陰離子界面活性劑磺基丁二酸鈉二辛酯至最終濃度為5% w/v及礦物油或植物油至最終濃度>75% v/v。聚葡萄胺糖溶液不可與油混溶且界面活性劑起穩定聚葡萄胺糖奈米粒子之作用。隨後向混合物中添加戊二醛(來自Alfa-Aesar)至最終濃度為5%，接著立即混合30分鐘以形成乳化。在乳化期間，發生交聯且形成奈米粒子。當反應停止時，藉由離心(200×g)1-5分鐘自懸浮液分離粒子；收集顆粒且接著用己烷洗滌。隨後乾燥奈米粒子以供進一步分析或使用。

實施例2.奈米粒子表徵

使實施例1之奈米粒子以1mg/mL之濃度再懸浮於水中。使用Malvern Zetasizer(ZEN 3600)藉由動態光散射(dynamic light scattering，DLS)量測粒子之尺寸及粒度分佈。為進一步表徵形態，將一滴奈米粒子懸浮液置放於二氧化矽晶圓上且隨後風乾隔夜。隨後用鉻塗佈上面具有乾燥樣品之晶圓且藉由掃描電子顯微術(scanning electron microscopy，SEM)成像。

如圖2中所證實，粒子之平均流體動力學直徑為324.6nm且多分散指數(polydispersity index，PDI)為0.2(圖2A)。根據SEM，乾燥粉末顯示平均直徑為約300nm之粒子形態，其與DLS量測(圖2B)一致。

實施例3.測定阿莫西林負載率

為量測藥物負載率(藥物重量/奈米粒子之總重量)，按照描述於實施例1中之相同程序調配負載阿莫西林的奈米粒子，但使用0.1、1、2.5或5mg之不同初始藥物量。使用15mL水使1mg乾燥奈米粒子懸浮。在4℃下劇烈攪拌懸浮液12小時以完全釋放所負載的藥物。隨後藉由Amicon過濾管以10kDa分子量截止來過濾該懸浮液。量測濾液中之阿莫西林濃度且計算藥物負載率。

如圖3中所示，奈米粒子中之阿莫西林負載率隨著阿莫西林初始濃度之增加而增加。當阿莫西林輸入濃度為0.1、1、2.5及5mg/mL時，對應的負載率分別測定為3.9%、6.9%、14.2%及24.1%。當阿莫西林輸入濃度為3mg/mL(實施例1)時，負載率為20%。

實施例4.在不同pH值下量測活體外阿莫西林釋放動力學

將藥物負載率為20%之負載阿莫西林的奈米粒子(根據實施例1製備)用於此實驗中。

分別在pH=2.0、5.0、6.0及7.4下使用50mL 10mM Tris-HCl緩衝液來復原含有1mg阿莫西林之乾燥奈米粒子(總重量5mg，負載率20%)。懸浮液保持在4℃下同時劇烈攪拌。在各個時間點，獲取0.2mL懸浮液且藉由Amicon過濾器以100kDa分子量截止過濾該懸浮液以收集所釋放的藥物。藉由HPLC測定濾液中之阿莫西林濃度。將在24小時之時間點的阿莫西林之累積釋放用作100%釋放。

在不同pH值位準下，來自奈米粒子調配物的阿莫西林釋放顯示類似曲線(圖4)。隨著pH值自2.0增加至7.4，觀察到釋放速率之微小增加。根據釋放曲線，奈米粒子調配物之t₈₀ (釋放80%囊封阿莫西林之時間)測定為460(pH=2.0)、385(pH=5.0)、355(pH=6.0)及310(pH=7.4)分鐘。在小鼠中，阿莫西林之血漿半衰期報導為約40分鐘。

實施例5.評估活體內藥物動力學

對雄性及雌性ICR小鼠(6-8週)進行實驗以評估血清中之阿莫西林濃度。向各個小鼠經口投予約0.3mL含有10mg藥物負載率為20%之奈米粒子(實施例1)的奈米粒子懸浮液。管飼之後，在5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時及24小時時自各個小鼠收集50μ L血液。同時亦測試相同劑量之自由阿莫西林(2mg)作為對照。各個測試群組含有10隻小鼠(五隻雄性及五隻雌性)。藉由HPLC測定各個收集之血清樣品中之阿莫西林之濃度。結果顯示於圖5中。

當投予自由阿莫西林時，阿莫西林之血清濃度在15分鐘時達到峰值，且隨後在1小時之後降至低於峰值之50%且在2小時之後低於20%。相比之下，當投予奈米粒子調配物時，阿莫西林之血清濃度在1小時處達到峰值，且在8小時之後保持高於峰值濃度之50%。此系統性藥物濃度之顯著延長將增加阿莫西林之治療性持續時間。基於此等結果，預期當與自由阿莫西林比較時，阿莫西林之奈米粒子調配物將使治療持續時間增加至少5-10倍。曲線下面積代表循環中之藥物的總量測量。值得注意的是，當與奈米粒子調配物之面積相比時，自由阿莫西林顯示較小面積，其可能歸因於胃中及經由系統性腎臟清除進行之藥物清除。

實施例6.活體外MIC(最小抑制濃度)及MBC(最小殺菌濃度)

細菌培養. 在研究中，首先於瓊脂培養盤上培養大腸桿菌細菌。隨後將新製菌落傳送至LB培養基且在37℃下在適度可逆搖晃下培育隔夜。在37℃下在微好氧條件(10% CO₂ 、85% N₂ 及5% O₂ )下將幽門螺旋桿菌SS1菌株維持於補充有5%裂解馬血(Thermo Scientific)之Columbia瓊脂上。藉由將來自瓊脂培養盤之新製菌落繼代培養至含有5%胎牛血清之腦心浸出液(brain heart infusion，BHI)中來製備幽門螺旋桿菌之液體培養物，且在37℃下在微好氧條件下伴以適度可逆搖晃培育隔夜。

奈米粒子調配物之活體外MIC測試. 以5000×g離心幽門螺旋桿菌SS1或大腸桿菌之隔夜液體培養物10分鐘以獲得細菌顆粒。調整顆粒使其在600nm處之光學密度(optical density at 600nm，OD600)為1.0，對應於約1×10⁸ 菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)/mL。在96孔培養盤中使用添加體積之培養基將負載阿莫西林的奈米粒子懸浮液(如實施例5相同製備)稀釋至各種濃度，且隨後添加濃度為1×10⁷ CFU/mL之細菌。樣品置放在培養條件下且在37℃下培育。藉由微量培養盤讀取器經72小時時間跨度量測OD 600吸收。同時測試自由阿莫西林作為對照。

奈米粒子調配物之活體外MBC測試. 以5000×g離心幽門螺旋桿菌SS1或大腸桿菌之隔夜液體培養物10分鐘以獲得細菌顆粒。調整顆粒使其在600nm處之光學密度(OD600)為1.0，對應於約1×10⁸ 菌落形成單位(CFU)/mL。隨後向含有190μ L補充有5% FBS之BHI培養基連同各種濃度之負載阿莫西林的奈米粒子之96孔培養盤中添加10微升/孔的含有1×10⁶ CFU細菌之細菌懸浮液。在37℃下在微好氧條件下於可逆振盪器上培育該培養盤。在培育30分鐘之後，製備細菌懸浮液之一系列10倍稀釋液(1：10至1：10⁵ )，且將5μ L每種經稀釋樣品接種至具有適當補充劑之Columbia瓊脂培養盤上。在保溫箱中培養該等培養盤4天，隨後對菌落進行計數。同時測試自由阿莫西林作為對照(參見圖6A及圖6B)。

結果

當與自由阿莫西林比較時，奈米粒子調配物顯示類似的針對幽門螺旋桿菌之抗菌活性(圖6)。MIC研究顯示在奈米粒子調配物之阿莫西林濃度為0.4mg/mL時完全抑制細菌生長(圖6A)。在MBC研究中，當阿莫西林濃度達到2mg/mL時，觀察到幽門螺旋桿菌細菌之根除(圖6B)。

現已以完整、清楚、簡明及確切的術語描述了本發明以及製造及使用本發明之方式及方法以便使任何熟習本發明所屬技術之人員能夠製造及使用本發明。應瞭解，上文描述本發明之較佳具體實例且可在不偏離如申請專利範圍所述之本發明之範疇的情況下對其進行修改。為了特別指出且清楚地主張視為本發明之標的，以下申請專利範圍歸納本說明書。

Claims

一種製備包含交聯聚葡萄胺糖及阿莫西林之奈米粒子的方法，其包含以下步驟：(a)在水性溶液中混合聚葡萄胺糖與阿莫西林直至聚葡萄胺糖及阿莫西林溶解；(b)向(a)中添加陰離子界面活性劑及油且混合以形成油包水乳液，其中該陰離子界面活性劑係選自由以下組成之群：磺基丁二酸鈉二辛酯、月桂基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉及月桂基硫酸鉀且該陰離子界面活性劑的量為該乳液之1-15%(w/v)；(c)向(b)中添加交聯劑戊二醛或雙[磺基丁二醯亞胺基]辛二酸酯至1-15%(w/v)的最終濃度且混合以使聚葡萄胺糖交聯，及(d)形成具有平均直徑為100-600nm之奈米粒子，其中該奈米粒子包含藉由該交聯聚葡萄胺糖包覆的阿莫西林。
如申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括藉由離心來分離該等奈米粒子且收集該等顆粒之步驟(e)。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該水性溶液為水。
如申請專利範圍第1項之方法，其中向步驟(a)中添加足量乙酸以提高聚葡萄胺糖在該水性溶液中之溶解度。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該油為植物油、橄欖油、沙拉油、礦物油及玉米油。
如申請專利範圍第5項之方法，其中該油為植物油。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該陰離子界面活性劑為磺基丁二酸鈉二辛酯且該交聯劑為戊二醛。
如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟(b)中該陰離子界面活性劑的量為該乳液的2-10%(w/v)。
如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟(c)中該交聯劑具有2-10%(w/v)的最終濃度。
一種包含交聯聚葡萄胺糖及阿莫西林之奈米粒子，其以如申請專利範圍第7項之方法製備，其中藉由該交聯聚葡萄胺糖包覆阿莫西林，且該等奈米粒子之平均直徑為100-600nm。
如申請專利範圍第10項之奈米粒子，其中該等奈米粒子的粒度分佈為至少80%該等奈米粒子之直徑在50-800nm之間。
如申請專利範圍第10項之奈米粒子，其中該等奈米粒子之平均直徑為250-400nm。
如申請專利範圍第12項之奈米粒子，其中該等奈米粒子的粒度分佈為至少80%該等奈米粒子之直徑在100-600nm之間。
如申請專利範圍第10項之奈米粒子，其中該經包覆阿莫西林之重量為該等奈米粒子之總重量的至少5%。
一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第10項之奈米粒子及醫藥學上可接受之載劑，其中該組成物呈膠囊、錠劑、散劑或懸浮液之口服形式。
如申請專利範圍第15項之醫藥組成物，其呈散劑或錠劑之形式。
一種用於治療細菌感染之醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第10項之奈米粒子。
如申請專利範圍第17項之醫藥組成物，其中該細菌感染係選自由以下組成之群：幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)感染、大腸桿菌(E.coli)感染、沙門氏菌(salmonella)感染、耳感染、尿路感染、皮膚感染、牙齒感染、放線菌病(actinomycosis)、惡性水腫、氣性壞疽、丹毒、肺炎、出血性敗血症、葡萄球菌症(staphylococcosis)、鼻黏膜炎、巴氏桿菌病(pasteurelosis)、嗜血桿菌(hemophilus)流感、大腸桿菌病(Colibacillosis)及由革蘭氏陽性或陰性細菌感染(gram positive or negative bacterial infection)所導致的一般化膿性病症，從而殺死該等細菌且阻止其生長。
如申請專利範圍第17項之醫藥組成物，其治療與幽門螺旋桿菌感染相關之胃或十二指腸潰瘍；從而減少或消除該疾病之症狀。