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TWI504411B - 骨髓纖維化症治療劑 - Google Patents

骨髓纖維化症治療劑 Download PDF

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TWI504411B
TWI504411B TW098129737A TW98129737A TWI504411B TW I504411 B TWI504411 B TW I504411B TW 098129737 A TW098129737 A TW 098129737A TW 98129737 A TW98129737 A TW 98129737A TW I504411 B TWI504411 B TW I504411B
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TW
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sirna
bone marrow
carrier
hsp47
extracellular
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TW098129737A
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TW201023895A (en
Inventor
Yoshiro Niitsu
Takuya Matsunaga
Original Assignee
Nitto Denko Corp
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Description

骨髓纖維化症治療劑
本發明係有關於一種以骨髓中的細胞外間質生成細胞為標的之物質輸送用攜帶體(carrier)，以及一種利用了控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物而成之骨髓纖維化症治療劑及骨髓纖維化症之治療方法。
骨髓纖維化症，是在骨髓發生廣泛地瀰漫性纖維化之疾病的總稱，包含了原因不明的原發性骨髓纖維化症與具有基礎疾病的繼發性骨髓纖維化症。
原發性骨髓纖維化症的特徵在於，伴隨著全身的骨髓纖維化及肝、脾中之髓外造血，而可辨識出在周邊血液中出現幼顆粒細胞與紅血球母細胞的紅白母血球增加(leukoerythroblastosis)，原發性骨髓纖維化症係屬於慢性骨髓增殖性疾病。原發性骨髓纖維化症的本質，被認為是由於包含了在造血幹細胞階段發生的Jak2之基因突變在內之基因異常所致的單源(monoclonal)造血細胞之增殖。由所增殖之造血系細胞(主要是巨核細胞)產生的各種細胞介素(cytokines)作用於骨髓間質細胞，而產生骨髓之纖維化、骨硬化、血管新生等反應性的單源骨髓間質細胞之增殖。其結果，呈現出無效造血、周邊血液中淚滴狀紅血球之出現、紅白母血球增加、髓外造血所致之巨脾等具特徵 性的臨床症狀。
約40%的原發性骨髓纖維化症，是因為細胞介素之訊息傳導所不可或缺的酪胺酸激酶Jak2中發生基因突變，結果Jak2在沒有細胞介素之刺激的狀態中也持續被活化。除了Jak2以外，也存在有少數於c-mpl(血小板生成素之受體)具有基因突變的病例。
目前，原發性骨髓纖維化症被認為難以藉由藥物療法來治癒，而同種造血幹細胞移植則是唯一能治癒的治療法。但是，移植相關死亡率高達25~48%，隨之，總生存率停留於50%左右。最近，治療相關毒性較少的非骨髓破壞性幹細胞移植(迷你移植)的有用性受到矚目，但仍只有少數案例的探討，長期預後也仍不明。
作為藥物療法，雖然尚停留於對症療法，但下述藥物顯示出對於貧血或血小板減少症、脾腫大的有效性：丹納唑(danazol)、美替諾龍(Primobolan)等蛋白質同化荷爾蒙；沙利竇邁(thalidomide)、來那度胺(lenalidomide)等血管新生抑制劑；羥基脲(hydroxycarbamide)、阿那格雷(anagrelide)、伊馬替尼(imatinib)、2-氯去氧腺苷、黴法蘭(melphalan)、硫酸布他卡因(busulfan)、伊妥普賽(etoposide)等抗腫瘤劑；紅血球生成素等藥劑(參照非專利文獻1及2)。
另一方面，繼發性骨髓纖維化症則是由：急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、真性紅血球增加症、原發性血小板增多症、骨髓增生不良症候群、 多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、癌腫、全身性紅斑性狼瘡、進行性全身性硬皮症等疾病；或是放射線照射等所繼發而成，其會顯示出與原發性骨髓纖維化症同樣的骨髓影像。繼發性骨髓纖維化症的治療，焦點雖然是在於基礎疾病的改善，但因為基礎疾病也大多難以根治，所以對於由骨髓纖維化本身所致不良影響的減輕有著強烈需求。
在此種狀況下，對於骨髓纖維化症治療劑的開發投注了莫大的研究及努力，結果，已有報告指出下述藥劑在骨髓纖維化症動物模式或臨床試驗中已經收到某種程度的成果，該些藥劑係例如：酪胺酸激酶JAK2V617F之阻礙劑；TGF-β可溶性受體等TGF-β阻礙劑；硼替佐米(bortezomib)等NF κ B阻礙劑；地西他濱(decitabine)等DNA甲基轉移酶阻礙劑；曲古菌素A(trichostatin A)等組蛋白去乙醯酶抑制劑；PTK787/ZK222584、貝伐單抗(Bevacizumab)等VEGF阻礙劑(參照非專利文獻1)；某種抗人類淋巴球抗體(參照專利文獻1)等。然而，該些藥劑均尚無法令人滿意，因而謀求進一步的骨髓纖維化症治療劑之開發。
[專利文獻1]日本專利特公平8-2799號公報
[專利文獻2]國際公開第2006/068232號小冊子
[非專利文獻1]Hematology Am Soc Hematol Educ Program.2007；2007：346-54
[非專利文獻2]日本內科學會雜誌、第96卷、第7號、2007年7月10日、第1398-1404頁
本發明目的係提供一種新穎的骨髓纖維化症治療劑及骨髓纖維化症之治療方法。
本發明者在探求新穎的骨髓纖維化症治療劑之中，發現藉由投予一種於包含類視色素(retinoid)的攜帶體中攜帶細胞外間質生成阻礙劑的組成物，則能有效地治療骨髓纖維化症，而完成了本發明。
含有維生素A的攜帶體，雖然已知其會將藥物輸送至會貯藏維生素A的星狀細胞(參照專利文獻2)，但對於其與骨髓纖維化症的關係，則至今完全未知，而且亦無報告指出藉由將細胞外間質生成阻礙劑作為有效成分之組成物則可治療骨髓纖維化症，故此次的發現是令人驚異的。
亦即，本發明是關於下述。
(1)一種物質輸送用攜帶體，其係含有類視色素(retinoid)來作為標靶化劑，並係用以將物質輸送至骨髓中的細胞外間質生成細胞。
(2)如上述(1)之攜帶體，其中該類視色素包含視網醇(retinol)。
(3)如上述(1)或(2)之攜帶體，其中類視色素之含量是攜帶體全體的0.2~20重量%。
(4)如上述(1)~(3)中之攜帶體，其具有微脂粒 (liposome)的形態，且類視色素與微脂粒中所含脂質的莫耳比是8：1~1：4。
(5)一種骨髓纖維化症治療用組成物，其中含有控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物。
(6)如上述(5)之組成物，其中進而包含(1)~(4)中之攜帶體。
(7)如上述(5)或(6)之組成物，其中控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物，係選自由下述所構成之群組：選自由明膠酶A、明膠酶B及血管收縮素原所構成之群組中的生理活性物質之活性或生成阻礙劑；細胞活性抑制劑；增殖阻礙劑；細胞凋亡誘導劑；以及，以細胞外間質構成分子、或與該細胞外間質構成分子之生成或分泌有關之分子的至少1種為標的之siRNA、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸(chimera polynucleotide)或表現此等的載體(vector)。
(8)如上述(7)之組成物，其中與細胞外間質構成分子之生成或分泌有關之分子是HSP47。
(9)如上述(5)~(8)中之組成物，其係在醫療現場或其附近處將藥物與攜帶體混合而成。
(10)一種如上述(6)~(9)中之組成物的製備套組，其中包含1個或以上的容器，該容器係單獨或組合地含有：控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物；類視色素；以及視需要而含有的類視色素以外之攜帶體構成物質。
(11)一種siRNA，其係以下述為標的：選自序列編號13所示核酸序列之1130~1145位置、1485~1500位置、1501~1516位置、1654~1678位置、以及1951~1978位置的部分。
(12)如上述(11)之siRNA，其係由下述A~E之正義股(sense strand)與反義股(antisense strand)之組合中任一者所構成：A：5’-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3’(正義股，序列編號：1)與3’-UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC-5’(反義股，序列編號：2)之組合；B：5’-UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3’(正義股，序列編號：3)與3’-UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5’(反義股，序列編號：4)之組合；C：5’-GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG-3’(正義股，序列編號：5)與3’-UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU-5’(反義股，序列編號：6)之組合；D：5’-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3’(正義股，序列編號：7)與3’-UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA-5’(反義股，序列編號：8)之組合；E：5’-GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG-3’ (正義股，序列編號：9)與3’-UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU-5’(反義股，序列編號：10)之組合。
本發明之骨髓纖維化症治療用組成物的正確作用機制雖然尚未完全闡明，但可能是類視色素發揮作為對骨髓纖維母細胞等骨髓中的細胞外間質生成細胞之標靶化劑的機能，以將例如控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物等有效成分，輸送至該細胞，藉此發揮抗骨髓纖維化症的效果。
藉由本發明之攜帶體，因為能夠有效率地將有效成分輸送至作用部位、或進一步輸送至標的細胞，所以使骨髓纖維化症且特別是至今仍屬治療困難的原發性骨髓纖維化症等的治癒、加劇之抑制、或是發病之預防成為可能，此對於人類醫療及動物醫療的貢獻極大。
進而，本發明之組成物因為含有控制細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物作為有效成分，該藥物至今尚未被知道其對於骨髓纖維化症之有效性，因此能以異於以往的作用機制來治療骨髓纖維化症，而能期待以往之作用機制的藥劑所不具效果之病狀的改善、或藉由與該等以往之藥劑併用而得之治療效果的提升。
又，本發明之攜帶體因為能與任意藥劑(例如，既有的骨髓纖維化症治療藥)組合而提高其作用效率，所以也有著在製劑上的應用範圍廣泛、能簡便地進行有效的治療 劑之製造等優點。
[實施發明的較佳形態]
本發明係關於一種物質輸送用攜帶體，其係含有類視色素來作為標靶化劑，並係用以將物質輸送至骨髓中的細胞外間質生成細胞。
在本發明中，骨髓中的細胞外間質生成細胞，只要是存在於骨髓而具有生成細胞外間質能力的細胞，則無特別限定，但典型上係包含骨髓纖維母細胞。骨髓纖維母細胞是以α-SMA(α平滑肌肌動蛋白，α-smooth muscle actin)的表現為特徵。在本發明中的骨髓纖維母細胞，是藉由使用經標記而可檢出的抗α-SMA抗體之免疫染色等來鑑別。
在本發明中的類視色素，只要會促進對於骨髓中的細胞外間質生成細胞之物質輸送，則無特別限定，例如可使用：視網醇(維生素A)、依曲替酯(etretinate)、維A酸(tretinoin)、異維A酸(isotretinoin)、阿達帕林(adapalene)、依曲替酸(acitretin)、他扎羅汀(tazarotene)、視網醇棕櫚酸酯等類視色素衍生物；以及芬維A胺(fenretinide)(4-HPR)、蓓薩羅丁(bexarotene)等維生素A類似物。
本發明中之類視色素，會促進對於骨髓中的細胞外間質生成細胞之特異性物質輸送。藉由類視色素來促進物質輸送的機制雖然尚未完全地闡明，但可能是例如：與RBP (視網醇結合蛋白，retinol binding protein)特異性地結合的類視色素，透過位於骨髓中之細胞外間質生成細胞的細胞表面上之某種受體，而被攝入該細胞。
類視色素是具有由4個類異戊二烯(isoprenoid)單元以頭接尾(head to tail)方式連結之骨架的化合物群中的一員(參照G.P.Moss,“Biochemical Nomenclature and Related Documents,”2nd Ed.Portland Press,pp.247-251(1992))，維生素A則定性地顯示視網醇之生物學上活性，是類視色素的一般的描述(descriptor)。作為本發明中可使用的類視色素，並無特別限定，例如可舉出：視網醇、視網醛、視網酸(retinoic acid)、視網醇與脂肪酸之酯、脂肪族醇與視網酸之酯、依曲替酯、維A酸、異維A酸、阿達帕林、依曲替酸、他扎羅汀、視網醇棕櫚酸酯等類視色素衍生物；以及，芬維A胺(4-HPR)、蓓薩羅丁等維生素A類似物。
這些之中，從對骨髓中的細胞外間質生成細胞之特異性物質輸送效率的觀點而言，以下述為佳：視網醇、視網醛、視網酸、視網醇與脂肪酸之酯(例如乙酸視黃酯、棕櫚酸視黃酯、硬脂酸視黃酯、及月桂酸視黃酯等)、及脂肪族醇與視網酸之酯(例如視網酸乙酯等)。
類視色素的包含順式、反式的全部異性體，均涵蓋於本發明的範圍中。類視色素亦有以1或2個以上的取代基來取代者。本發明中之類視色素，被單離之狀態者自不待言，亦包含了在能將其溶解或保持之介質中呈溶解或混合狀態的類視色素。
本發明之攜帶體，可以僅由這些類視色素本身所構成，也可以是藉由使類視色素結合或包含於其他的攜帶體構成成分所構成。因此，本發明之攜帶體，亦可含有類視色素以外的攜帶體構成成分。作為該成分，並無特別限定，可以使用在醫藥及藥學領域中已知的任意者，但以能包含類視色素、或是能與其結合者為佳。
作為此種成分，可舉出脂質，例如可舉出：甘油磷脂質(glycerophospholipid)等磷脂質類；神經鞘磷脂(sphingomyelin)等神經脂質類；膽固醇等固醇類；大豆油、罌粟子油(poppy seed oil)等植物油；礦物油；蛋黄卵磷脂等卵磷脂類等，但並不限定於此。其中，以能構成微脂粒者為佳，例如：卵磷脂等天然磷脂質；二肉豆蔻磷脂醯膽鹼(DMPC)、二棕櫚磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂磷脂醯膽鹼(DSPC)等半合成磷脂質；二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二月桂磷脂醯膽鹼(DLPC)、膽固醇等。
作為特佳的成分，可舉出能迴避網狀內皮系統所進行之捕捉的成分，例如可舉出：氯化N-(α-三甲基銨基乙醯)-二(十二烷基)-D-麩胺酸(TMAG)、N,N’,N”,N'''-四甲基-N,N’,N”,N'''-四棕櫚基精胺(spermine)(TMTPS)、2,3-二油醯氧基-N-[2(精胺羧醯胺)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷銨三氟乙酸酯(DOSPA)、氯化N-[1-(2,3-二油醯氧基)丙基]-N,N,N-三甲基銨(DOTMA)、氯化二(十八基)二甲基銨(DODAC)、溴化二(十二基)銨(DDAB)、1,2-二油醯氧基-3-三甲基銨丙烷(DOTAP)、3 β-[N-(N’,N’-二甲 基胺基乙烷)胺甲醯基]膽固醇(DC-Chol)、1,2-二肉豆蔻醯氧基丙基-3-二甲基羥乙基銨(DMRIE)、氯化O,O’-二四癸醯基-N-(α-三甲基銨基乙醯)二乙醇胺(DC-6-14)等陽離子性脂質。
類視色素對於本發明之攜帶體的結合或包含，可以是藉由化學性及/或物理性的方法，也可以是藉由使類視色素結合或包含於攜帶體的其他構成成分。或是，類視色素對於本發明之攜帶體的結合或包含，也可以是藉由在製備該攜帶體時，將類視色素與其以外的攜帶體構成成分混合。結合或包含於本發明之攜帶體的類視色素的量，可以設作在攜帶體構成成分中之重量比為0.01%~100%，以0.2%~20%為佳，更佳為1~5%。類視色素對於本發明之攜帶體的結合或包含，可以在使藥物等攜帶於該攜帶體之前進行，也可以藉由將攜帶體、類視色素及藥物等予以同時混合等來進行，或是也可以藉由將呈已攜帶藥物等之狀態的攜帶體與類視色素混合來進行。因此，本發明亦關於一種對骨髓中的細胞外間質生成細胞具特異性之製劑的製造方法，其中包含使類視色素結合於既有之任意的藥物結合攜帶體或藥物包覆攜帶體的步驟，該些既有之藥物結合攜帶體或藥物包覆攜帶體，是例如：DaunoXome(註冊商標)、Doxil、Caelyx(註冊商標)、Myocet(註冊商標)等微脂粒製劑。
本發明之攜帶體的形態，只要能將所期望的物質或物體搬運至作為標的之骨髓中的細胞外間質生成細胞，則任 何形態均可，例如，雖然並不受其限定，但可採下述中任一形態：高分子微胞(micelle)、微脂粒、乳劑(emulsion)、微球體(microsphere)、奈米球等。在本發明中，從輸送效率之高低、可輸送物質的選擇性之廣度、或製劑之容易性等觀點而言，這些之中以微脂粒的形態為佳，且其中又以含陽離子性脂質的陽離子性微脂粒為特佳。攜帶體是微脂粒之形態的情形中，類視色素與其以外之微脂粒構成脂質的莫耳比，若考量類視色素對於攜帶體之結合或包含的效率性，則以8：1~1：4為佳，較佳為4：1~1：2、更佳為3：1~1：1、特佳為2：1。
若所含之類視色素是以作為標靶化劑來發揮機能的態樣而存在，則本發明之攜帶體可以是於其內部包含搬運物、或附著於搬運物之外部、或與搬運物混合。在此，所謂的作為標靶化劑來發揮機能，意思是含類視色素的攜帶體會比不含其之攜帶體更迅速且/或大量地到達且/或被攝入骨髓中的細胞外間質生成細胞也就是標的細胞，此係例如可藉由下述方式來輕易地確認：將附著有標記、或含有標記之攜帶體，添加至標的細胞的培養物中，於規定時間後分析標記的存在部位。在構造上，例如若類視色素最遲於到達標的細胞為止時至少部分地暴露於含攜帶體之製劑的外部，便可充分具備上述要件。類視色素是否暴露於製劑之外部，可藉由使製劑接觸例如視網醇結合蛋白(RBP)等會與類視色素特異性地結合的物質，並調查其對製劑之結合，來進行評價。
本攜帶體輸送之物質或物體並無特別限制，以其大小是能在生物體內物理性地從投予部位移動至標的細胞所存在之病變部位者為佳。因此，本發明之攜帶體可搬運者，原子、分子、化合物、蛋白質、核酸等物質自不待言，當然亦可搬運載體、病毒粒子、細胞、由1個以上之要件所構成的藥物釋放系統、微機械(micromachine)等物體。前述物質或物體，較佳為具有給予標的細胞某些影響的性質，例如包括了將標的細胞予以標記者、或是控制(例如將其增強或抑制)標的細胞的活性或增殖者。
因此，在本發明的一個態樣中，輸送攜帶體之物是「控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物」。在此，所謂的骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性，雖然是指骨髓中的細胞外間質生成細胞所顯示的分泌、攝取、遊走等種種活性，但在本發明中，典型上意思是這些之中特別關於骨髓纖維化症之發病、加劇及/或復發等的活性。作為該活性，例如，並不受其限定而可舉出下述之生成與分泌：明膠酶A及B(分別是MMP(基質金屬蛋白酶，matrix metalloproteinase)2及9)、血管收縮素原等生理活性物質；膠原蛋白、蛋白多醣、肌糖蛋白(tenascin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、血小板活化蛋白(thrombospondin)、造骨蛋白(osteopontin)、骨連結蛋白(osteonectin)、彈性蛋白等細胞外間質成分等。
因此，所謂的控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物，意思是只要是直接或間接抑制有關骨髓 纖維化症之發病、加劇及/或復發之該細胞的物理性、化學性及/或生理性之作用等，則任一種藥物均可，並不加以限定，包含了：阻礙上述生理活性物質之活性或生成的藥物、巴馬司他(batimastat)等MMP阻礙劑、以及中和前述生理活性物質之抗體及抗體片段；抑制前述生理活性物質之表現的siRNA、微脂粒、反義核酸(包含RNA、DNA、PNA、或這些的複合物)等物質、顯性抑制突變體(dominant negative mutant)等具有顯性突變抑制效果的物質、或表現這些物質的載體；阻礙上述細胞外間質成分等之生成與分泌的藥物，例如：抑制細胞外間質成分之表現的siRNA、微脂粒、反義核酸(包含RNA、DNA、PNA、或這些的複合物)等物質；顯性抑制突變體等具有顯性突變抑制效果的物質、表現這些物質的載體、鈉通道阻斷劑等細胞活性抑制劑、烷化劑(例如依弗醯胺(ifosfamide)、尼莫司汀(nimustine)、環磷醯胺、達卡巴仁(dacarbazine)、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、雷莫司汀(ranimustine)等)、抗腫瘤性抗生物質(例如艾達魯比辛(idarubicin)、依畢魯比辛(epirubicin)、道諾魯比辛(daunorubicin)、杜薩魯比辛(doxorubicin)、畢拉魯比辛(pirarubicin)、博來黴素、培洛黴素(peplomycin)、邁杜蔥酮(mitoxantrone)、絲裂黴素C(mitomycin C)等)、代謝拮抗劑(例如吉西他濱(gemcitabine)、依諾他濱(enocitabine)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、替加氟-尿嘧啶(tegafur-uracil)、替加氟-吉莫斯特-氧酸鉀(tegafur,gimeracil,oteracil potassium)調配 劑、氟鐵龍(doxifluridine)、羥基脲、氟尿嘧啶、胺甲葉酸、硫醇嘌呤(mercaptopurine)等)；伊妥普賽、鹽酸愛萊諾迪肯(irinotecan hydrochloride)、酒石酸溫諾平(vinorelbine ditartrate)、歐洲紫杉醇(docetaxel)水合物、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、硫酸長春新鹼、硫酸長春地辛(vindesine)、硫酸長春花鹼(vinblastine)等生物鹼及卡鉑定(carboplatin)、順鉑(cisplatin)、奈達鉑(nedaplatin)等鉑錯合物等細胞增殖抑制劑；以及複方861(compound 861)、黴膠毒素(gliotoxin)、洛維汀(lovastatin)、Beractant等的細胞凋亡誘導劑。又，本發明中之「控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物」，可以是直接或間接地促進骨髓中的細胞外間質生成細胞的物理性、化學性及/或生理性之作用等的任一種藥物，其中該骨髓中的細胞外間質生成細胞的物理性、化學性及/或生理性之作用，係直接或間接關係到骨髓纖維化症之發病、加劇及/或復發的抑制。
本發明中之「控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物」之中，較佳者為會阻礙下述成分之生成與分泌的藥物：膠原蛋白、蛋白多醣、肌糖蛋白、纖維連接蛋白、血小板活化蛋白、造骨蛋白、骨連結蛋白、彈性蛋白等細胞外間質成分等，特佳為HSP47(Heat Shock Protein(熱休克蛋白質)47)之阻礙劑、且特別是針對HSP47之siRNA。
作為本發明之攜帶體的輸送物，也並不受限定，可舉出抑制骨髓纖維化症之發病、加劇及/或復發之上述以外 的藥物，例如，並不受其限定而可舉出：丹納唑、美替諾龍等蛋白質同化荷爾蒙；沙利竇邁、來那度胺等血管新生抑制劑；羥基脲、阿那格雷、伊馬替尼、2-氯去氧腺苷、黴法蘭、硫酸布他卡因、伊妥普賽等抗腫瘤劑；紅血球生成素；酪胺酸激酶JAK2V617F之阻礙劑；TGF-β可溶性受體等TGF-β阻礙劑；硼替佐米等NF κ B阻礙劑；地西他濱等DNA甲基轉移酶阻礙劑；曲古菌素A等組蛋白去乙醯酶抑制劑；PTK787/ZK222584、貝伐單抗等VEGF阻礙劑；專利文獻1所記載之抗人類淋巴球抗體等。
本發明之攜帶體所輸送之物質或物體，有被標記或未被標記均可。藉由標記化，則可監測搬運之成敗、標的細胞之增減等，因而在試驗、研究層級上特別有用。標記係可選擇發明所屬技術領域中具通常知識之人所習知的任意者，例如可選自：任意的放射性同位素、磁性物、與標記化物質結合之物質(例如抗體)、螢光物質、螢光團(fluorophore)、化學發光物質、及酵素等。
本發明中，所謂的「骨髓中的細胞外間質生成細胞用」或「骨髓中的細胞外間質生成細胞輸送用」，意思是適合於將骨髓中的細胞外間質生成細胞使用作為標的細胞，此包含了例如對於該細胞，能相較於其他細胞(例如正常細胞)而更迅速、高效率且/或大量地輸送物質。例如，本發明之攜帶體，能對骨髓中的細胞外間質生成細胞，相較於其他細胞以1.1倍以上、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、2倍以上、進而以3倍以上的速度及/或效率來輸送物質。
本發明又係關於一種組成物，該組成物包含了前述控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物，而用以控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖、或用以治療骨髓纖維化症，本發明並係關於一種前述控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物於這些組成物之製造中的用途。上述藥物可以單獨包含於組成物中，亦可與藥學上可容許之攜帶體一起包含於組成物中。本發明之組成物，為了有效率地輸送至成為標的之骨髓中的細胞外間質生成細胞，而亦可將該細胞予以標的化。標的化，只要是會促進本發明之組成物向例如骨髓纖維母細胞之骨髓中的細胞外間質生成細胞之輸送者，則無特別限定，例如包含了類視色素之附加。因此，本發明組成物的較佳態樣，是包含將類視色素作為標靶化劑而成者，更佳為包含一包含將上述類視色素作為標靶化劑之攜帶體而成者。
本發明中的骨髓纖維化症，不僅包含原發性骨髓纖維化症，而亦包含繼發性骨髓纖維化症。繼發性骨髓纖維化症並無特別限定，包含了：急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、真性紅血球增加症、原發性血小板增多症、骨髓增生不良症候群、多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、癌腫、全身性紅斑性狼瘡、進行性全身性硬皮症等疾病；或是放射線照射等所繼發而成者。
本發明中之骨髓纖維化症，可以是藉由該技術領域中所知之任一手法來診斷而得者。骨髓纖維化症最具特徵的 病狀是骨髓的纖維化，此可藉由在骨髓穿刺中無法採取骨髓液(乾抽，dry tap)而進行某種程度的判斷。確定診斷則是藉由以骨髓穿刺切片來確認骨髓之纖維化及/或骨小梁(trabecula)之增加來進行(參照第1圖)。原發性骨髓纖維化症中，其他尚可辨識出：貧血；肝脾腫大；周邊血液中出現紅白母血球增加、淚滴狀紅血球等畸形紅血球、母血球(blast cell)、巨大血小板、巨核細胞；血清LDH(乳酸去氫酶，lactate dehydrogenase)之上升、骨髓閃爍造影術所致之往肝脾之攝入的增加、偶有出血傾向、腹部膨脹感、發熱、全身倦怠感、體重減少等。又，繼發性骨髓纖維化症方面，大多會先出現基礎疾病的症狀。基礎疾病的具體症狀，則所屬技術領域中具有通常知識之人已經熟知。
本發明之組成物中，只要攜帶體所含之類視色素是以作為標靶化劑來發揮機能的態樣而存在，則本發明之攜帶體可以是於其內部包含輸送物、或附著於輸送物之外部、或與搬運物混合。因此，可以視投予路徑或藥物釋放方式等，來將上述組成物以適當的材料來被覆，例如以腸溶性的包覆料或經時分解性的材料來被覆，或是亦可搭配適當的藥物釋放系統。
本發明之組成物，可以以包含經口及非經口之兩者的各種路徑來投予，例如，並不受其限定而可舉出：經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、肺內、呼吸道內、氣管內、支氣管內、經鼻、直腸內、動脈內、門脈內、心室內、骨髓內、淋巴結內、淋巴管內、腦內、腦脊液腔內、腦室內、 經黏膜、經皮膚、鼻內、腹腔內及子宮內等路徑，並可以適合於各投予路徑的劑型來製劑。該劑型及製劑方法，可適當採用任意的習知者(例如參照由渡邊喜照等人編輯並由南江堂於2003年出版的標準藥劑學)。
例如，作為適合於經口投予的劑型，並不受其限定而可舉出：散劑、顆粒劑、錠劑、膠囊、液劑、懸濁劑、乳劑、膠劑、糖漿等，又，作為適合於非經口投予的劑型，則可舉出溶液性注射劑、懸濁性注射劑、乳濁性注射劑、用時製備型注射劑等注射劑。非經口投予用製劑，可以是水性或非水性之等張性無菌溶液或懸濁液的形態。
本發明之組成物，亦可包含能治癒骨髓纖維化症、或是能減輕其發病、加劇及/或復發及/或症狀的1種或2種以上的任意其他藥劑，或是亦可與該藥劑併用。作為該藥劑，並無限定而例如可包含：丹納唑、美替諾龍等蛋白質同化荷爾蒙；沙利竇邁、來那度胺等血管新生抑制劑；羥基脲、阿那格雷、伊馬替尼、2-氯去氧腺苷、黴法蘭、硫酸布他卡因、伊妥普賽等抗腫瘤劑；紅血球生成素；酪胺酸激酶JAK2V617F之阻礙劑；TGF-β可溶性受體等TGF-β阻礙劑；硼替佐米等NF κ B阻礙劑；地西他濱等DNA甲基轉移酶阻礙劑；曲古菌素A等組蛋白去乙醯酶抑制劑；PTK787/ZK222584、貝伐單抗等VEGF阻礙劑；專利文獻1所記載之抗人類淋巴球抗體等。在併用的情形中，是將本發明之組成物與上述其他藥劑同時、在其之前、或在其之後進行投予。投予路徑可相同，亦可不同。例如， 本發明之組成物是非經口投予，則其他藥劑可以是經口投予等。
本發明之攜帶體或組成物，雖然以任一形態來給予均可，但從保存安定性的觀點而言，較佳為能夠於用時製備的形態，例如能夠在醫療的現場或其附近，由醫師及/或藥師、護士、或其他醫務人員等製備的形態來提供。此時，本發明之攜帶體或組成物，係以1個或2個以上的容器來提供，該容器含有本發明之攜帶體或組成物之必須構成要素的至少一個，並係於使用之前，例如24小時前以內、較佳為3小時前以內、以及更佳為正要使用前製備。於製備之際，可適當地使用在製備場所中通常可獲得的試藥、溶劑、調劑器具等。
因此，本發明又係關於一種攜帶體或組成物的製備套組，其中包含1個或2個以上的容器，該容器係單獨或組合地含有：類視色素、及/或輸送物、及/或類視色素以外的攜帶體構成物質，本發明亦有關於以此種套組之形態來提供的攜帶體或組成物的必要構成要素。本發明之套組，除了上述之外，亦可包含關於本發明之攜帶體及組成物之製備方法或投予方法等的說明書、或CD、DVD等電子記錄媒體等。又，本發明之套組雖然亦可包含用以完成本發明之攜帶體或組成物的全部構成要素，但並不一定需含有全部的構成要素。因此，本發明套組亦可不含有在醫療現場或實驗設施等通常可獲得的試藥或溶劑，例如無菌水、或生理食鹽水、葡萄糖溶液等。
本發明進而關於一種用以控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖、或用以治療骨髓纖維化症的方法，其中包含將前述組成物的有效量投予至需要其之對象。在此，所謂的有效量，例如對於後者，是抑制骨髓纖維化症的發病或復發、減輕症狀、或是延緩或停止其加劇的量，較佳為預防骨髓纖維化症的發病及復發、或治癒其的量。又，以不會產生超過投予所致利益之不良影響的量為佳。該量可藉由使用培養細胞等的體外(in vitro)試驗、或是在小鼠、大鼠、狗或豬等模式動物中的試驗來適當地決定，此種試驗法係為所屬技術領域中具通常知識之人所熟知。又，攜帶體中所含的類視色素、及本發明之方法所使用之藥物的用量，可以是所屬技術領域中具通常知識之人所習知，或可以藉由上述的試驗等來適當地決定。
本發明之方法中所投予的組成物之具體用量，是考慮關於需要治療之對象的各種條件才能決定，該條件係例如症狀的嚴重度、對象的一般健康狀態、年齡、體重、對象的性別、用餐、投予的時期及頻率、所併用的醫藥、對治療的反應性、及對治療的遵從性等。
作為投予路徑，係包含經口及非經口之兩者的各種路徑，例如包含：經口、靜脈內、肌肉內、皮下、局部、肺內、呼吸道內、氣管內、支氣管內、經鼻、直腸內、動脈內、門脈內、心室內、骨髓內、淋巴結內、淋巴管內、腦內、腦脊液腔內、腦室內、經黏膜、經皮膚、鼻內、腹腔內及子宮內等路徑。
投予頻率則係依照所使用之組成物的性狀、或上述般的對象的條件而異，例如1日多次(亦即1日2、3、4次或5次以上)、1日1次、每數日(亦即每2、3、4、5、6、7日等)1次、1週內數次(例如1週內2、3、4次等)、每隔1週、每隔數週(亦即每2、3、4週等)即可。
在本發明之方法中，用語「對象」的意思是任意的生物個體，較佳為動物、更佳為哺乳動物、且更佳為人之個體。在本發明中，雖然對象可以是健康或罹患某種疾病者，但在計畫治療骨髓纖維化症的情形中，典型上意思是正罹患著骨髓纖維化症、或是具有罹患風險的對象。例如，希望預防原發性骨髓纖維化症的情形中，並不受其限定而以在Jak2及/或c-mpl具有基因突變的對象為典型例子，而希望預防繼發性骨髓纖維化症的情形中，並不受其限定而以已罹患急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、真性紅血球增加症、原發性血小板增多症、骨髓增生不良症候群、多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤、癌腫、全身性紅斑性狼瘡、進行性全身性硬皮症等疾病的對象，或是受到放射線照射等的對象為典型例子。
又，用語「治療」，係以疾病之治癒、暫時性之緩解或預防等為目的，而包含了醫學上所容許之全部種類的預防性及/或治療性之介入。例如，「治療」之用語，含有骨髓纖維化症之加劇的延緩或停止、病變之消退或消失、骨髓纖維化症發病之預防或復發之防止等，而包含了各種目的之醫學上可容許之介入。
本發明又係關於一種對於骨髓中之細胞外間質生成細胞的藥物輸送方法，其係利用上述攜帶體。此方法並不受限定，而係例如含有下述步驟：使輸送物攜帶於上述攜帶體之步驟；以及，將已攜帶輸送物之攜帶體，投予或添加至含有骨髓中之細胞外間質生成細胞的生物或介質(例如培養基等)之步驟。這些步驟，可依循習知的任意方法、或本說明書中所記載之方法等來適當地達成。上述輸送方法，也可以與例如以骨髓為標的之其他輸送方法等其他輸送方法互相組合。又，上述方法包含了在體外(in vitro)進行之態樣，也包含了以體內的骨髓中之細胞外間質生成細胞為標的之態樣。
本發明又係關於一種對於小鼠HSP47為新穎的siRNA，其較佳為以下述為標的：選自序列編號13之1130~1145位置、1485~1500位置、1501~1516位置、1654~1678位置、以及1951~1978位置的部分。為了抑制基因表現而針對該基因之特定區域來設計及製作siRNA的方法，雖然是該技術領域中所熟知，但一般而言要預測以基因的哪個部分為標的是不可能的，僅能以實驗來確認。在本發明中，從該HSP47表現抑制效果的強度而言，較佳為以序列編號13之1501~1516位置作為標的之siRNA、及以1951~1978位置為標的之siRNA。本發明之新穎siRNA的數個較佳例，是由以下的正義股與反義股之組合所構成：序列A：5’-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3’(正義，序 列編號：1)與3’-UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC-5’(反義，序列編號：2)之組合；序列B：5’-UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3’(正義，序列編號：3)與3’-UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5’(反義，序列編號：4)之組合；序列C：5’-GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG-3’(正義，序列編號：5)與3’-UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU-5’(反義，序列編號：6)之組合；序列D：5’-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3’(正義，序列編號：7)與3’-UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA-5’(反義，序列編號：8)之組合；序列E：5’-GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG-3’(正義，序列編號：9)與3’-UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU-5’(反義，序列編號：10)之組合。
該等之中，序列C及D由其HSP47表現抑制效果的強 度而言為特佳。
本發明的siRNA可以是具有天然型的RNA結構，也可以是以生物體內安定性之提升、與標的序列之結合性之改善為目的而具有各種修飾。作為該修飾並無限定，而包含：根據末端之胺基、硫醇基、膽固醇、長鏈烷基、糖鏈、胜肽等所進行的修飾、去鹼基部位之形成；鎖核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、例如2’-O-烷基、2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟修飾核苷酸等在糖之2’位置經修飾之核苷酸等的修飾核酸之導入。
本發明之siRNA，在小鼠中之HSP47之表現抑制、及伴隨發生的膠原蛋白之生成抑制上極為有用，而特別適合用於使用小鼠之研究、實驗、試驗。
(實施例)
實施例1 骨髓纖維化症模式小鼠中病狀之確認
作為骨髓纖維化症的模式小鼠，係使用下田和哉博士與原田實根博士所開發的血小板生成素(TPO)基因轉殖小鼠(以下記載為TPO小鼠(參照Leukemia Research 29：761-769,2005))。此小鼠由於自TPO基因導入細胞中過剩地生成TPO，所以骨髓中的巨核細胞增多，而增多的巨核細胞中過剩地生成轉形生長因子β(transforming growth factor-beta、TGF-beta)，其會刺激骨髓纖維母細胞，促進來自纖維母細胞的膠原蛋白分泌，而發生骨髓纖維化(參照第2圖)。
以一般的飼育條件來飼育TPO小鼠(由九州大學實驗設施部所供應)，在出生後4、7、9或12個月將其安樂死，採取骨髓而製作組織標本，分別以蘇木素伊紅(HE)染色(hematoxylin-eosin staining)、Gitter染色(Gitter staining)、或是Azan染色(Azan staining)來進行染色，並藉由光學顯微鏡來觀察骨髓影像。結果顯示於第3~5圖。
雖然在出生後4個月(4M)中，完全未辨識出骨髓的纖維化，但在出生後7個月(7M)中，則骨小梁之肥厚雖然不明顯(HE)，但可辨識出網狀纖維之增生(Gitter)與膠原蛋白之沉積(Azan)(參照第3圖)。
在出生後9個月(9M)及出生後12個月(12M)中，均可明顯辨識出骨小梁之肥厚(HE)、網狀纖維之增生(Gitter)與膠原蛋白之沉積(Azan)。另外，相較於9M，12M中骨髓纖維化與骨小梁之肥厚則更為加劇(惡化)(參照第4圖)。
在TPO小鼠的骨髓HE標本中，從出生後9個月(9M)起骨小梁開始肥厚，在出生後12個月(12M)骨小梁之肥厚進而惡化(參照第5圖)。
如同上述，在TPO小鼠中，確認了有表現骨髓纖維化症的症狀。
實施例2 siRNA之製作
作為抑制骨髓中的細胞外間質生成細胞之活性的藥物，而製作以小鼠HSP47為標的之siRNA(HSP47 siRNA)。 具體而言，是製作具有以下序列的5種HSP47 siRNA(HSP47 siRNA-A~E)與隨機siRNA(Random siRNA)，而使用於之後的實驗。另外，HSP47 siRNA是購自iGENE股份有限公司(東京)(HSP47 siRNA的目標序列係設計自2006年11月登錄之Refseq資料庫(GeneBank Accession No.NM_009825))。Random siRNA也是購自iGENE股份有限公司(商品名：dsRNA scramble)。
HSP47 siRNA-A：
5’-UGGAUGGGAAAGAUGCAGAAGAAGGAG-3’(正義，序列編號：1)
3’-UAACCUACCCUUUCUACGUCUUCUUCC-5’(反義，序列編號：2)
HSP47 siRNA-B：
5’-UGUCUGAGUGGGUAUUUUUAGACAGAG-3’(正義，序列編號：3)
3’-UAACAGACUCACCCAUAAAAAUCUGUC-5’(反義，序列編號：4)
HSP47 siRNA-C：
5’-GAUGCGAGAUGAGUUGUAGAGUCCAAG-3’(正義，序列編號：5)
3’-UACUACGCUCUACUCAACAUCUCAGGU-5’(反義，序列編號：6)
HSP47 siRNA-D：
5’-CAGAACUGCCCAUCCUUAAAAUGAUAG-3’(正義，序 列編號：7)
3’-UAGUCUUGACGGGUAGGAAUUUUACUA-5’(反義，序列編號：8)
HSP47 siRNA-E：
5’-GAGACAAGAUGCGAGAUGAGUUGUAAG-3’(正義，序列編號：9)
3’-UACUCUGUUCUACGCUCUACUCAACAU-5’(反義，序列編號：10)
Random siRNA：
5’-CGAUUCGCUAGACCGGCUUCAUUGCAG-3’(正義，序列編號：11)
3’-UAGCUAAGCGAUCUGGCCGAAGUAACG-5’(反義，序列編號：12)
又，亦製作在5’側以螢光色素6’-羧基螢光素(6-FAM)標記的siRNA。
實施例3 TPO小鼠初代培養骨髓纖維母細胞之性質
在添加有15%之胎牛血清(fetal calf serum，FCS)之MEM(最低必需培養基)(Minimum Essential Medium Eagle，Sigma公司)中將4~6週齡之TPO小鼠的骨髓細胞培養4星期，而獲得初代培養的骨髓纖維母細胞。第6圖是顯示以倒裝顯微鏡(inverted microscope)觀察的細胞形態，細胞是纖維母細胞中典型的紡錘形。第7圖是顯示對於波形蛋白(Vimentin)也就是間葉系細胞之標記、及α SMA的表現，以使用了其各自之抗體(anti-Vimentin antibody(Santa Cruz Biotechnology公司)、anti-α SMA antibody(Santa Cruz Biotechnology公司))的流式細胞儀(flow cytometry)來解析的結果，結果可確認到兩者的表現。此係顯示，在上述培養所獲得的細胞是典型的骨髓纖維母細胞。另外，用以解析的流式細胞儀是FACS calibur(Becton Dickinson公司)，測定數據則是使用CellQuest軟體(Becton Dickinson公司)來解析。
實施例4 HSP47 siRNA對於NIH3T3細胞(小鼠纖維母細胞株)的效果
使1×105 個NIH3T3細胞懸浮於添加有10%小牛血清(Calf serum，CS)的Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM，Life Technologies公司)，並接種於6孔培養皿。於24小時後，使用Lipotrust(北海道System Science公司)將HSP47 siRNA轉染於呈50~60%群集生長(confluent)的NIH3T3細胞。具體而言，是將以振盪器(vortex)混合20nM之Lipotrust與50nM之Random siRNA或HSP47 siRNA而得者予以轉染。經轉染的NIH3T3細胞，以無血清之OPTI-MEM(GIBCO公司)將其培養4小時。以DMEM清洗該NIH3T3細胞，再以添加10%之CS的DMEM進而培養24小時，並抽出蛋白質。之後，以西方墨點法來解析HSP47的表現。亦即，用4/20 SDS(十二烷基磺酸鈉)-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)將自NIH3T3抽出的蛋白 質予以分劃後，轉印至硝化纖維膜。首先，以對於HSP47之1次抗體(Stressgen公司)或以對於β-肌動蛋白之1次抗體進行偵測(probe)，進而以結合有過氧化酶的2次抗體(Oncogene Research Product公司)進行偵測，最後使用ECL(增強型化學冷光檢測)(Amersham Life Science公司)來使其呈色。
其結果，在HSP47 siRNA導入至NIH3T3後24小時的時間點上，明顯可知若相較於A、B及E時，HSP47 siRNA-C及D的效果較強(參照第8圖之A)。因此，在以下的實驗中，是以HSP47 siRNA-C或D來作為HSP47 siRNA。
實施例5 HSP47 siRNA對於來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞的效果
使5×105 個來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞懸浮於添加有15%之FCS的MEM，並接種於6孔培養皿。於24小時後，使用Lipotrust將HSP47 siRNA轉染於呈50~60%群集生長的骨髓纖維母細胞。亦即，是將以振盪器混合20nM之Lipotrust與50nM之Random siRNA或5~50nM之HSP47 siRNA-C或D而得者，或是將該等進而在5分鐘後與40nM之維生素A(視網醇，Sigma公司)以振盪器混合而得者予以轉染。經結合維生素A或未結合維生素A之微脂粒HSP47 siRNA轉染的骨髓纖維母細胞，以無血清之OPTI-MEM將其培養4小時。之後，以MEM清洗該骨髓纖維母細胞，再以添加15%之FCS的MEM進而培 養48小時，並抽出蛋白質。又，在其他實驗中，經50nM之結合維生素A之微脂粒HSP47 siRNA-D(VA-Lip-HSP47 siRNA-D，以下分別將「結合維生素A」省略為「VA」、將「微脂粒」省略為「Lip」)轉染的骨髓纖維母細胞，以無血清之OPTI-MEM將其培養4小時後，以MEM清洗，再以添加15%之FCS的MEM進而培養24~96小時，並抽出蛋白質。之後，將抽出的蛋白質以西方墨點法來針對HSP47之表現進行解析。亦即，用4/20 SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)將自骨髓纖維母細胞抽出的蛋白質予以分劃後，轉印至硝化纖維膜。之後與實施例4同樣地，以對於HSP47或β-肌動蛋白之1次抗體進行偵測，進而以結合有過氧化酶的2次抗體進行偵測，最後用ECL來使其可視化。結果顯示於第8圖的B及C。
使用初代培養骨髓纖維母細胞的情形中，HSP47 siRNA-C(第8圖之a)及HSP47 siRNA-D(第8圖之b)雖然在單獨使用時均無法辨識出效果，但藉由使其與維生素A(VA)結合，則可確認到HSP47 siRNA-C(VA-Lip-HSP47 siRNA-C)若以50nM、VA-Lip-HSP47 siRNA-D若以25nM以上之濃度則會出現效果。也就是說，明顯可知，為了有效率地將HSP47 siRNA導入至初代培養骨髓纖維母細胞，則必須使用VA-Lip-HSP47 siRNA，以及相較於VA-Lip-HSP47 siRNA-C而言，VA-Lip-HSP47 siRNA-D對於HSP47的抑制效果較為強力。因此，在之後的實驗中，是使用VA-Lip-HSP47 siRNA-D。
又，明顯可知，VA-Lip-HSP47 siRNA-D(50nM)的效果持續時間是72小時(參照第8圖之C)。
實施例6 維生素A(VA)對於將微脂粒包埋HSP47 siRNA(Lip-HSP47 siRNA)導入至來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞的效果
在添加有10%之CS的OPTI-MEM之培養液中，對於來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞，在10mg/ml之抗視網醇結合蛋白質抗體(anti-RBP-Ab，BD Pharmingen公司)的存在或不存在下，導入50nM之經結合羧基螢光素(FAM，carboxy fluorescein)的Lip-HSP47 siRNA或VA-Lip-HSP47 siRNA(Lip-HSP47 siRNA-FAM或VA-Lip-HSP47 siRNA-FAM)，並於30分鐘後以流動式細胞計數法來解析。經導入之細胞的平均螢光強度(mean fluorescence intensity，MFI)是以FACS calibur來測定，並以CellQuest軟體(Becton Dickinson公司)來解析。將5×105 個來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞接種於6孔培養皿。在24小時後，添加50nM之VA-Lip-HSP47 siRNA-FAM或Lip-HSP47 siRNA-FAM。在添加有10%之FCS的OPTI-MEM中，將該等細胞培養30分鐘。之後，將該等細胞以PBS(Phosphate buffered saline，磷酸鹽緩衝溶液)清洗，並以4%之三聚甲醛進行固定(25℃、15分鐘)。固定後，將該等細胞以DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole，4',6-二脒基-2-苯基吲哚) 進行1分鐘之核染色。細胞內之FAM的所在處，係以螢光顯微鏡來進行評價。於第9圖之A中顯示具代表性的流式細胞儀的圖形，並於第9圖之B中顯示經FAM標記之siRNA於細胞內所在處的代表性結果。另外，MFI係如同第9圖之A所示。明顯可知，相較於Lip-HSP47 siRNA，VA-Lip-HSP47 siRNA對於來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞的導入效率較優異(A及B)。又，VA-Lip-HSP47 siRNA之導入會由於anti-RBP-Ab而部分地被抑制(A)，此暗示了部分的VA-Lip-HSP47 siRNA會透過骨髓纖維母細胞之RBP(視網醇結合蛋白質，Retinol binding Protein)受器而被攝入的可能性。
實施例7 siRNA HSP47對於來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞之膠原蛋白分泌的效果。
使5×105 個初代培養骨髓纖維母細胞懸浮於添加有15%之FCS的MEM，並接種於6孔培養皿。於24小時後，導入50nM之Lip-siRNA Random(siRNA ran)、Lip-HSP47 siRNA-D(siRNA D)、VA-Lip-siRNA Random(VA-siRNA ran)或VA-Lip-HSP47 siRNA-D(VA-siRNA D)。於4小時後，將培養液換成添加15%之FCS的MEM，進而培養48小時。之後，去除培養液，用無血清的OPTI-MEM進而培養4小時。之後，首先用Sircol(TM)Collagen Assay kit(膠原蛋白分析套組，Biocolor公司)來測定培養上清液中的膠原蛋白之量。亦即，將培養上清液與染料溶液混合30分 鐘。之後，將該溶液以10,000×g離心10分鐘。去除無結合的染料溶液後，在已結合的染料中添加1ml之鹼性試劑，以振盪器混合10分鐘，再基於藉吸光光度計(540nm)所測定之吸光度來進行定量。接著，將沉積於黏接在培養皿之纖維母細胞膠原蛋白之量，於添加天狼星紅染料(Sirius red dye)後，基於藉吸光光度計(540nm)所測定之吸光度來進行定量。
結果顯示於第10圖。另外，在圖中，「培養上清液」係表示纖維母細胞之培養上清液中的膠原蛋白量，「培養皿(培養上清液去除後)」係表示培養上清液去除後沈積於纖維母細胞的膠原蛋白之量，「全部」則係表示「培養上清液」與「培養皿(培養上清液去除後)」之總和。數據是以三種培養物之平均值±標準偏差來表示(＊ P<0.05)。
其結果，明顯可知，導入VA-Lip-HSP47 siRNA-D的初代培養纖維母細胞所分泌至培養上清液中的膠原蛋白之量，相較於其他細胞而顯著較少，而在導入VA-Lip-HSP47 siRNA-D的細胞中，其沈積於培養皿的膠原蛋白之量，雖然相較於其他細胞而較少，但並無顯著差異，又，導入VA-Lip-HSP47 siRNA-D的纖維母細胞所分泌至培養上清液中的膠原蛋白之量與培養上清液去除後沈積於纖維母細胞的膠原蛋白之量的總和，相較於其他細胞而顯著較少。
實施例8 siRNA HSP47對於TPO小鼠之骨髓纖維化的體內效果
使用出生後7個月的TPO小鼠，來探討VA-Lip-HSP47 siRNA-D在體內之骨髓纖維化改善效果。將12.5mg/小鼠之HSP47 siRNA-D以間隔一天而共計4次的方式，使用結核菌素注射器(tuberculin syringe)而自眼窩靜脈叢進行靜脈注射。亦即，於12.5mg/小鼠之siRNA(8μL)及12.5nM之Lipotrust(12.5μL)中，添加或不添加25nM之維生素A(2.5μL)，再進而添加RNAase free PBS(無RNA酶之磷酸鹽緩衝溶液)使其總計為100μL，將此作為一次之量而投予於小鼠。於開始投予HSP47 siRNA-D後之第8天將小鼠安樂死，採取骨髓而製作組織標本，分別以蘇木素伊紅(HE)染色(hematoxylin-eosin staining)、Gitter染色(Gitter staining)、Azan染色(Azan staining)來進行染色，並以光學顯微鏡觀察骨髓影像。結果顯示於第11~14圖。
由處理後之Gitter染色標本(第11圖)可明顯得知，相較於未處理之小鼠(未處理)、投予Lip-siRNA HSP47之小鼠(Lip-siRNA HSP47)、及投予VA-Lip-siRNA Random之小鼠(VA-Lip-siRNA ran)而言，投予VA-Lip-siRNA HSP47之2隻小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)及(2))的骨髓之網狀纖維增生有顯著改善。進而，將藉由該siRNA-HSP47之網狀纖維增生的改善度，以KS-400軟體(Carl Zeiss公司)進行測定而數值化。亦即，自處理後之Gitter染色標本中選擇10個視野，並測定網狀纖維之點在各視野中全部之點當中所佔比例(網狀蛋白纖維化區域之百分率(percentage of reticulin fibrosis area))來作為網狀 纖維增生的指標之際，可確認到，相較於未處理之小鼠(未處理)、投予Lip-siRNA HSP47之小鼠(siRNA D)、及投予VA-Lip-siRNA Random之小鼠(VA-siRNA ran)而言，投予VA-Lip-siRNA HSP47-D之小鼠(VA-siRNA D)的骨髓之網狀纖維增生有顯著改善(參照第12圖)。
又，從第13圖所示之處理後的Azan染色標本可明顯得知，相較於未處理之小鼠(未處理)、投予Lip-siRNA HSP47之小鼠(Lip-siRNA HSP47)、及投予VA-Lip-siRNA Random之小鼠(VA-Lip-siRNA ran)而言，投予VA-Lip-siRNA HSP47之2隻小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)及(2))的骨髓之膠原蛋白增生有顯著改善。
進而，從第14圖所示之處理後的HE染色標本可明顯得知，相較於未處理之小鼠(未處理)、投予Lip-siRNA HSP47之小鼠(Lip-siRNA HSP47)、及投予VA-Lip-siRNA Random之小鼠(VA-Lip-siRNA ran)而言，投予VA-Lip-siRNA HSP47之2隻小鼠(VA-Lip-siRNA HSP47(1)及(2))的骨小梁之肥厚有顯著改善。
由以上的結果，暗示了使用以HSP47作為標的之siRNA來治療骨髓纖維化症可能是有用的。又，若考慮到siRNA基本上是在細胞質內進行作用，則上述結果顯示，藉由類視色素作為對骨髓中的細胞外間質生成細胞的標靶化劑而發揮機能、並有效率地將藥物輸送至該細胞，將可顯著地改善骨髓纖維化症的病狀。
第1圖是顯示特發性骨髓纖維化症狀患者之骨髓影像的照片；於患者1與患者2中，均分別可辨識出HE染色(左列)中之骨小梁的肥厚、Gitter染色(中央)之網狀纖維的增生、Azan染色(右列)中膠原蛋白的沉積。
第2圖是顯示骨髓纖維化症模式小鼠中病狀之發病原理的圖。
第3圖是顯示出生後4個月及7個月之TPO基因轉殖小鼠之骨髓影像的照片；左列是HE染色影像、中央是Gitter染色影像、右列是Azan染色影像。
第4圖是顯示出生後9個月及12個月之TPO基因轉殖小鼠之骨髓影像的照片；左列是HE染色影像、中央是Gitter染色影像、右列是Azan染色影像。
第5圖是顯示TPO基因轉殖小鼠之骨小梁肥厚之轉變的照片；左上是出生後4個月(4M)、右上是出生後7個月(7M)、左下是出生後9個月(9M)、右下是出生後12個月(12M)中之骨髓的HE染色影像。
第6圖是顯示以倒裝顯微鏡觀察來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞之細胞形態的照片(倍率為400倍)。
第7圖是顯示以流式細胞儀解析來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞中之波形蛋白與α SMA之表現之結果的圖。
第8圖是顯示各種siRNA HSP47對於NIH3T3細胞(A) 及來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞(Primary fibroblasts，B及C)之HSP47表現之效果的西方墨點法影像。
第9圖是顯示維生素A對於微脂粒包埋HSP47 siRNA(Lip-siRNA)導入至來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞之效果的圖；A是分別顯示藉由流動式細胞計數法之解析結果、B則分別顯示螢光顯微鏡影像。
第10圖是顯示siRNA HSP47對於來自TPO小鼠之初代培養骨髓纖維母細胞之膠原蛋白分泌之效果的圖表。
第11圖是顯示siRNA HSP47對於TPO小鼠之骨髓纖維化之體內(in vivo)效果的Gitter染色標本之顯微鏡檢驗影像。
第12圖是藉由影像解析而將由siRNA HSP47所得之TPO小鼠中網狀纖維增生之改善度予以數值化的圖表；縱軸是網狀纖維之點於各視野中全部之點當中所佔比例。
第13圖是顯示siRNA HSP47對於TPO小鼠之骨髓纖維化之體內效果的Azan染色標本之顯微鏡檢驗影像。
第14圖是顯示siRNA HSP47對於TPO小鼠之骨髓纖維化之體內效果的HE染色標本之顯微鏡檢驗影像。

Claims (8)

  1. 一種作為標靶化劑之類視色素(retinoid)的用途，其中，該類視色素存在於物質輸送用攜帶體，並係用以將物質特異地輸送至骨髓中的細胞外間質生成細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該類視色素包含視網醇(retinol)。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中所含之類視色素是攜帶體全體的0.2~20重量%。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中攜帶體係具有微脂粒(liposome)的形態，類視色素與微脂粒中所含脂質的莫耳比是8：1~1：4。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中藉由物質輸送用攜帶體特異地輸送至骨髓中的細胞外間質生成細胞的物質是控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物，該控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物係選自由下述所構成之群組：增殖阻礙劑；細胞凋亡誘導劑；以及，以細胞外間質構成分子、或與該細胞外間質構成分子之生成或分泌有關之分子的至少1種為標的之siRNA、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌 合多核苷酸(chimera polynucleotide)或表現前述siRNA、核糖酶、反義核酸、DNA/RNA嵌合多核苷酸的載體(vector)。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中，細胞外間質構成分子是由膠原蛋白、蛋白多醣、肌糖蛋白(tenascin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、血小板活化蛋白(thrombospondin)、造骨蛋白(osteopontin)、骨連結蛋白(osteonectin)、彈性蛋白所構成之群組中選出。
  7. 如申請專利範圍第5項所述之用途，其中與細胞外間質構成分子之生成或分泌有關之分子是HSP47。
  8. 如申請專利範圍第5項所述之用途，標靶化劑、攜帶體及控制骨髓中的細胞外間質生成細胞的活性或增殖之藥物係能夠於用時製備的形態。
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