TWI598105B - 一種具有抑制ＭＺＦ－１與Ｅｌｋ－１交互作用之醫藥組合物 - Google Patents

Description

一種具有抑制MZF-1與Elk-1交互作用之醫藥組合物

本發明是一種胜肽，特別是會中斷Elk-1與MZF-1交互作用，抑制癌症之胜肽。

轉錄因子Elk-1(Ets-like protein-1)是三重複合因子(ternary complex factor，TCF)之下，Ets區域蛋白質(Ets domain protein)的一員，TCF藉由分子間及分子內交互作用調節特定基因表現，TCF與SRF結合於SRE(serum response element)上形成ternary complex。Ets家族包含Elk-1、Sap1及Sap2，都具有一Ets區域及一翼狀螺旋-圈環-螺旋(winged helix-loop-helix，HLH)之DNA鍵結區域，Elk-1 N端之Ets DNA結合部位對DNA辨識十分重要，TCF有一段包含20個胺基酸之B部份(B box)與蛋白質-蛋白質交互作用有關，Elk-1之C端transactivation區域可被MAPK磷酸化，Elk-1之D與FxFD區域在與MAPK交互作用時之接受位置。Elk-1與調節經由增生因子活化型激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)所參與之細胞增生、分化與發育有關。

MZF(myeloid zinc finger，包括MZF-1、MZF-1B、MZF-1C)屬於Kruppel家族中之鋅指蛋白(zinc finger protein)，MZF-1通常位於骨髓之造血細胞(hematopoietic progenitor cells)中，MZF-1過度表現會引起癌細胞 遷移(Migration)和侵蝕(Invasion)。MZF-1對於調節體內平衡(hemopoiesis)扮演重要角色。活體外實驗中，以MZF-1轉殖之結果發現，MZF-1可調節體內平衡即非體內平衡之細胞轉錄作用，然而對MZF-1之生物功能仍不清楚。

乳癌是一種好發於女性的癌症，發生率有逐年提升的現象，所以乳癌成為女性死亡率上昇的一項主因。乳癌細胞大部分帶有雌激素受體(estrogen receptor，ER)、黃體激素受體(progesterone receptors，PR)或HER2這三個細胞表面受體。但是有15%的乳癌細胞同時缺少ER、PR和HER2的表現，稱作三陰性乳癌(triple-negative breast cancers，TNBC)。對於TNBC而言，因為ER與HER2皆不表現，所以用於抑制ER或抑制HER2標靶藥物的治療效果不佳，臨床上只能使用傳統化學藥物來治療，但對於癌症復發後的高轉移性，目前沒有有效的治療方法。許多研究認為癌症起始細胞(tumor-initiating cell，TIC)和癌症幹細胞(cancer stem cell，CTS)為癌症開始及復發的可能原因，與癌症發生、轉移、抗藥性有關，乳房腫瘤起始細胞(breast tumor-initiating cell，BTIC)被認為與治療後的復發有關。目前以TNBC/BTIC作為診斷依據的正確性很高，但仍缺少臨床治療上有效的數據。

蛋白激酶Cα(Protein kinase C alpha，PKC α)在乳房癌症幹細胞(breast cancer stem cell，BCSC)扮演調節者的角色，在細胞株與腫瘤樣品的研究發現，triple-negative breast cancer(TNBC)/breast tumor-initiating cells(TICs)上蛋白激酶Cα表現與病人存活率較差有關。所以PKC α被認為可以成為TNBC的一個癒後指標，甚至可以作為癌症治療標的。另外非幹細胞演化為Cancer stem cells(CSCs)時它的訊號傳遞功能會由上皮細胞生長因 子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)訊號傳遞轉成由血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor during progression，PDGFR)訊號傳遞負責蛋白激酶Cα表現有關，上皮細胞中胚轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)機制也與蛋白激酶Cα表現有關。

現有的PKC α抑制劑包括或學化合物(Riluzole)，反譯寡核苷酸(Aprinocarsen)和胜肽抑制劑(αV5-3)，這些蛋白激酶Cα抑制劑都不是只針對癌細胞作用，因此如何設計出一種胜肽，只針對癌細胞特有機制作用，進一步影響蛋白激酶Cα以抑制癌症，即成為本發明在此欲解決的一重要課題。

有鑒於過去抑制癌細胞的生長與研究，多著重於調節蛋白激酶Cα，但蛋白激酶Cα同時存在於癌細胞及正常細胞，故以抑制蛋白激酶Cα抑制癌細胞生長同時也抑制正常細胞生長，故如何只影響癌細胞中的蛋白激酶Cα而不影響正常細胞，是一困難挑戰，發明人經過長久的構思與研究，發現在三陰乳腺癌內MZF-1和Elk-1之間的協同相互作用會調節蛋白激酶Cα表達，同時我們也發現MZF-1和Elk-1各利用一段特定的區域，將兩個基因結合形成異源二聚體(heterodimer)，本發明的目的即在於提供一種新穎的胜肽，可以抑制內生性Elk-1或MZF-1表現，亦會中斷Elk-1與MZF-1的交互作用，減少蛋白激酶Cα表達，抑制癌細胞生長。

本發明之目的在於提供一種胜肽用於製備乳癌治療醫藥組合物之用途，該胜肽包含下列至少一者，或任意組合：(A)胜肽MZF-1_60-72，序列與SEQ ID NO：65相同； (B)胜肽Elk-1_145-157，序列與SEQ ID NO：66相同；該胜肽經由抑制MZF-1與Elk-1交互作用而具有乳癌治療效果。

其中，該醫藥組合物可進一步包含該藥學上可接受之載劑，其中該載劑包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。

其中，該醫藥組合物係以口服、浸泡、注射、塗抹或貼片方式投予。

其中，該乳癌係三陰性乳癌。

第1圖係以人類乳癌組織切片，以免疫組識染色分析MZF-1、Elk-1、蛋白激酶Cα表現。

第2圖係以人類肝癌組織切片，以免疫組織染色分析MZF-1、Elk-1、蛋白激酶Cα表現。

第3圖係以人類肺癌組織切片，以免疫組織染色分析MZF-1、Elk-1、蛋白激酶Cα表現。

第4圖係以人類膀胱癌組織切片，以免疫組織染色分析MZF-1、Elk-1、蛋白激酶Cα表現。

第5圖係以人類三陰性乳癌組織切片，以免疫組織染色分析MZF-1、Elk-1、蛋白激酶Cα表現。並以螢光活性分析轉殖正常MZF-1、Elk-1對 蛋白激酶Cα表現的影響。

第6圖係於HCC細胞中，以螢光活性分析轉殖正常與突變MZF-1、Elk-1對蛋白激酶Cα表現的影響。

第7圖係為野生型與突變型MZF-1/Elk-1於PRKCA啟動子作用位置之序列示意圖。

第8圖係以電泳遷移率分析(EMSA)分析人類三陰性乳癌DMA-MB-231細胞核萃取液中，以抗-Elk-1、抗-MZF-1抗體辨識，觀察野生型與突變型MZF-1/Elk-1之DNA-蛋白質結合能力。

第9圖係以電泳遷移率分析(EMSA)分析人類三陰性乳癌DMA-MB-231細胞核萃取液中，以抗-Elk-1、抗-MZF-1抗體辨識，觀察加入20-100倍沒有標記探針以競爭影響DNA與蛋白質之結合。

第10圖係以共免疫沉澱分析人類三陰性乳癌DMA-MB-231細胞之MZF-1/Elk-1結合能力，先以抗-MZF-1或抗-Elk-1抗體進行免疫沉澱(IP)，電泳後再以抗-MZF-1或抗-Elk-1抗體辨識。

第11圖係以共免疫沉澱分析人類三陰性乳癌DMA-MB-231細胞之MZF-1/Elk-1結合能力，細胞質體構築(Elk-1-c-Myc-ΔDBD、FLAG-MZF-1-ΔDBD)，先以抗-c-Myc或抗-FLAG抗體進行免疫沉澱(IP)，電泳後以抗-MZF-1或抗-Elk-1抗體辨識。

第12圖係以染色質免疫沉澱(ChIP)及二次染色質免疫沉澱(Re-ChIP)分析SK-Hep-1細胞MZF-1/Elk-1之DNA結合活性，第一次ChIP以抗-MZF-1或抗-Elk-1抗體吸附，二次ChIP先以抗-Elk-1抗體再以抗-MZF-1抗體吸附，PCR放大後，以電泳確認。

第13圖係以反譯股寡核苷酸(antisense oligonucleotides)抑制SK-Hep-1細胞Elk-1或MZF-1後MZF-1/Elk-1之結合活性，以染色質免疫沉澱(ChIP)及二次染色質免疫沉澱(Re-ChIP)分析。

第14圖，上圖為MZF-1不同長度片段之示意圖；下圖為HEK-293細胞轉染MZF-1不同長度片段，以免疫沉澱分析MZF-1/Elk-1之結合活性，先以抗-c-Myc抗體進行免疫沉澱(IP)，電泳後以抗-FLAG-1抗體辨識。

第15圖係為野生型與突變型MZF-1_60-72、MZF-1_1-72胺基酸序列示意圖。

第16圖係為野生型與突變型MZF-1_60-72與MZF-1/Elk-1之結合活性，以電泳遷移率分析(EMSA)分析。

第17圖，上圖為Elk-1不同長度片段之示意圖；下圖為HEK-293細胞轉染MZF-1不同長度片段，以免疫沉澱分析MZF-1/Elk-1之結合活性，先以抗-c-Myc抗體進行免疫沉澱(IP)，電泳後再以抗-FLAG-1抗體辨識。

第18圖係為野生型與突變型Elk-1_145-157、MZF-1_145-428胺基酸序列示意圖。

第19圖係為野生型與突變型Elk-1_145-157與MZF-1/Elk-1之結合活性，以電泳遷移率分析(EMSA)分析。

第20圖，左圖以顯微鏡檢視圖觀察MDA-MB-231細胞轉染表現MZF-1_60-72之型態改變，右圖為細胞中MZF-1、Elk-1、蛋白激酶Cα表現，β-actin為控制組，c-myc是轉殖細胞之標誌。

第21圖，以共軛焦顯微鏡分析(Confocal microscopy)，MDA-MB-231細胞轉染表現MZF-1_60-72之後，細胞中Elk-1、MZF-1表現，以抗-Elk-1抗體及FITC二次抗體辨識Elk-1蛋白質表現，以抗-MZF-1抗體及 rhodamine二次抗體辨識MZF-1蛋白質表現，Z軸切片厚度為0.5-0.6μm。

第22圖係為穩定表現MZF-1_60-72Hs578T與MDA-MB-231細胞，其MZF-1及Elk-1蛋白質表現變化。

第23圖係為穩定表現MZF-1_60-72Hs578T與MDA-MB-231細胞，其MZF-1降解速度。

第24圖係為MDA-MB-231細胞轉殖表現MZF-1_60-72之後，以染色質免疫沉澱(ChIP)分析對內生性MZF-1、Elk-1、蛋白激酶Cα表現之影響；上圖以抗-MZF-1抗體進行免疫沉澱(IP)，下圖以抗-Elk-1抗體進行免疫沉澱(IP)，電泳後以PCR辨識PRKCA啟動子。

第25圖係為抗癌藥物啶黃素(acriflavine)和順鉑(cisplatin)對轉染表現MZF-1_60-72之MDA-MB-231細胞之影響，上圖為對glycoprotein(P-gp)表現之影響，下圖為對細胞增生之影響。

第26圖係為MDA-MB-231細胞轉染MZF-1_60-72，上圖為細胞型態改變，下圖為對癌細胞遷移與增生之影響。

第27圖係為乳腺癌異種移植小鼠模型，MDA-MB-231和HS578T細胞轉染MZF-1_60-72注入小鼠體內(左上圖)，右上圖係為形成之腫瘤大小，下圖為腫瘤組織切片圖。

第28圖係為轉染MZF-1_60-72MDA-MB-231和HS578T細胞之上皮細胞中胚轉化(EMT)相關基因表現。

第29圖係為乳癌細胞MDA-MB-468與MCF-7(惡性程度較低)，以免疫轉漬分析轉染MZF-1_60-72對蛋白激酶Cα、皮細胞中胚轉化(EMT)等相關蛋白表現之影響。

第30圖係為細胞轉殖全長之蛋白激酶Cα，上圖為細胞型態改變，下圖為對癌細胞遷移之影響。

第31圖係為細胞轉染全長之蛋白激酶Cα，對蛋白激酶Cα、皮細胞中胚轉化(EMT)等相關蛋白表現之影響。

第32圖係為TAT融合野生型與突變型Elk-1、MZF-1胜肽之示意圖。

第33圖係為細胞TAT融合Elk-1、MZF-1胜肽，左圖為細胞型態改變，右圖為對癌細胞遷移之影響。

第34圖係為細胞TAT融合Elk-1、MZF-1胜肽，對蛋白激酶Cα、皮細胞中胚轉化(EMT)等相關蛋白表現之影響。

第35圖係為HEK-293細胞TAT融合Elk-1、MZF-1胜肽對MZF-1與Elk-1之交互作用之影響，以共免疫沉澱分析，以抗-c-Myc抗體進行免疫沉澱(IP)，電泳後以抗-c-Myc或抗-FLAG抗體辨識(IB)。

第36圖係為MZF-1與Elk-1之交互作用調節蛋白激酶Cα之示意圖。

本發明是以下面的實施例予以示範闡明，但本發明不受下列實施例所限制。

本發明揭露MZF-1與Elk-1之交互作用與癌症之相關性。提供MZF-1胜肽或Elk-1胜肽，以抑制MZF-1與Elk-1交互作用，可以抑制癌症。

質體構築(Plasmid Construction)

本實驗以pcDNA3.0(Invitrogen)做為表現載體，以巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)啟動子控制基因表現，人類MZF-1(GenBank Accession No.AF161886 10781-12235bp)及Elk-1(GenBank Accession No. AB016193 101-1384bp)基因之開放閱讀框架(open reading frame，ORF)全序列以RT-PCR從SK-Hep-1細胞取得，合成pcDNA-MZF-1和pcDNA-Elk-1，使用之引子(primer)序列及限制酶(restriction enzyme，E.Z.)如表一所列，PCR產物分離並轉殖入pcDNATM 3.1/myc-His載體(Invitrogen)。

細胞培養及生長條件

人類肝癌細胞(Hepatocellular carcinoma，HCC)HepG2(BCRC no.60434)，人類乳癌細胞Hs578T(BCRC no.60120)、MDA-MB-231(MB-231，BCRC no.60425)、MCF-7(BCRC no.60436)，人類胚胎腎細胞HEK-293(BCRC no.60019)，上述五株細胞購自食品工業發展研究所生物資原保存及研究中心(台灣新竹)；人類肝癌細胞SK-Hep-1(ATCC no.HTB-52)、Huh-7(ATCC no.JCRB-0403)、人類乳癌細胞MDA-MB-468(ATCC no.HTB-132)，上述三株細胞購自美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)；細胞株以添加10%胎牛血清、100units/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素之DMEM培養基(Gibco-BRL)中，於5% CO₂、37℃之下培養。

免疫組織染色分析(Immunohistochemical analyses)

癌症組織切片，以抗體染色，以抗-PKCα抗體(BD Biosciences)、抗-Elk-1抗體(Santa Cruz)、抗-MZF-1抗體(Santa Cruz)辨識，依據呈色強度將其相關性分為弱、中、強三種等級。

染色質免疫沉澱(Chromatin immunoprecipitation Assay，ChIP)

細胞以1%甲醛溶液(formadehyde)固定，以甘氨酸(Glycine)中止甲醛反應，溶於含有蛋白酶抑制劑的裂解液(0.1% SDS、1% sodium deoxycholate、150mM NaCl、10mM NaPO₄(pH 7.2)、2mM EDTA、0.2mM NaVO₃、1% NP-40)，以超音波震盪及以抗-MZF-1抗體或抗-Elk-1抗體進行免疫沉澱(IP)，再以protein A agarose取得染色質(chromatin)，PRKCA啟動子(promoter)的-760至-550區域，以正譯股5'-GGTACAGGCAGCTAAAACAC-3'，如序列SEQ ID NO：47，及反譯股5'-GTCTTCCTTCTCCCACTCC-3'，如序列SEQ ID NO：48，進行放大，產物大小為210bp，以2% agarose膠片跑電泳確認。

二次染色質免疫沉澱(Re-ChIP)為將第一次抗-Elk-1抗體或抗-MZF-1抗體免疫沉澱之沉澱複合物，以抗-MZF-1抗體或抗-Elk-1抗體進行免疫沉澱(IP)，再以protein A agarose取得染色質(chromatin)，由30μl ChIP elution buffer(50mM NaHCO₃,1% SDS)洗提，收集多次洗提液，離心收集上層液，洗提液以含有蛋白酶抑制劑緩衝液(1% Triton X-100,5mM EDTA,150mM NaCl,and 25mM Tris,pH 8)稀釋，其後續PCR及電泳分析方法同上述ChIP分析方法。

電泳遷移率分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)

使用LightShift^TM chemiluminescent EMSA試劑(Pierce)，取15μg細胞核萃取物，以生物素標記(Biotin-labeled)之雙股寡核苷酸(double-stranded oligonucleotides)用以當引子，序列如下：野生型為正常MZF-1/正常Elk-1(正譯股5’-CCTGAGGATGGGGAAGGGGCTTCCTGCTGCGGTG-3’，如序列SEQ ID NO：49，反譯股5’-CACCGCAGCAGGAAGCCCCTTCCCCATCCTCAGG-3’，如序列SEQ ID NO：50)，突變MZF-1/正常Elk-1(正譯股5’-CCTGCGTATTTTTAAGGGGCTTCCTGCTGCGGTG-3’，如序列SEQ ID NO：51，反譯股5’-CACCGCAGCAGGAAGCCCCTTAAAAATACGCAGG-3’，如序列SEQ ID NO：52)，正常MZF-1/突變Elk-1(正譯股5’-CCTGCGGATGGGGAAGGGGATTAATGATGAGGTG-3’，如序列SEQ ID NO：53，反譯股5’-CACCTCATCATTAATCCCCTTCCCCATCCGCAGG-3’，如序列SEQ ID NO：54)，突變MZF-1/突變Elk-1(正譯股5’-CCTGCGTATTTTTAAGGGGATTAATGATGAGGTG-3’，如序列SEQ ID NO：55，反譯股5’-CACCTCATCATTAATCCCCTTAAAAATACGCAGG-3’，如序列SEQ ID NO：56)。加入20-100倍濃度沒有生物素標記序列(如SEQ ID NO：49-56)競爭，以確認專一性結合，結合後DNA-蛋白質複合體以6% native polyacrylamide gel進行電泳，於100V跑3小時，使用緩衝液0.5倍Tris borate/EDTA緩衝液轉漬到positively-charged nylon membrane，以chemiluminescence呈色分析。

質體(Plasmid)轉殖(transfection)

細胞培養於6公分培養基中，於轉殖前18小時置換培養基為不含胎牛血清之DMEM，去除培養基後，加入1ml含有15μg Lipofectamine 2000 transfection reagent(Invitrogen)和不同濃度質體培養6小時候，置換培養基為含20%胎牛血清之DMEM，培養18小時後，置換培養基為不含胎牛血清，再繼續培養48小時，收集用於後續實驗。

穩定表達細胞株建立(Stable Clone Establishment)

以代數較早(low-passage)之細胞(3×10⁵ cells)培養於6公分培養基中，以Lipofectamine 2000轉殖5μg MZF-1_60-72質體，以geneticin(G418；600μg/ml)培養5週以選擇出穩定表達細胞株。

TAT融合胜肽(TAT-Fused Peptide)處理

TAT設計接入HIV TAT蛋白胺基酸序列的47-57殘基(residue)處，融合人類MZF-1蛋白胺基酸序列60-72(MZF-1_60-72)或人類Elk-1蛋白胺基酸序列145-157(Elk-1_145-157)，序列如下：TAT融合正常MZF-1(60-72；YGRKKRRQRRRGGGSDLRSEQDPTDED，如SEQ ID NO：57)、TAT融合突變MZF-1(60-72；YGRKKRRQRRRGGGAEATPAQESRLAS，如SEQ ID NO：58)、TAT融合正常Elk-1(145-157；YGRKKRRQRRRGGGLARSSRNEYMRSG，如SEQ ID NO：59)、TAT融合突變Elk-1(145-157；YGRKKRRQRRRGGGLAASSANEYMASG，如SEQ ID NO：60)；細胞長至密度50-60%，換為無血清培養基，加入指定濃度TAT融合胜肽，表現3天後，細胞用於後續實驗。

活體外腫瘤形成實驗(in vitro tumorgenesis assay)

本實驗採用4-6週大雌裸鼠(BALB/c)購自國家衛生研究院(台灣台北)，飼養於無菌環境，以無菌水及飼料餵食裸鼠，以胰蛋白酶(trypsin)作用收集培養盤癌細胞，將1×10⁷個細胞(於100μl DMEM)注入right posterior flank，養殖2-3月後，犧牲裸鼠，取出腫瘤。腫瘤體積計算公式：0.5236×L1(L2)²,L1代表長度，L2代表寬度，腫瘤抑制率=(tumor volume in control group-tumor volume in test group)/(tumor volume in control group)× 100%。

細胞增殖(Cell proliferation)試驗

細胞增殖試驗以氯化三苯基四氮唑(tetrazolium)分析法(MTT assay)進行，將1×10⁴細胞培養在24 well的培養皿，以含有10%血清之DMEM培養過夜，將此細胞以various plasmids培養24或48小時，置換新鮮的培養基後，加入MTT(1mg/ml)作用3小時，再加入1ml DMSO作用30分鐘。以分光光度計分析波長570nm之吸光值。

細胞移動(Cell migration)試驗

在細胞移動實驗中，將無血清DMEM中之細胞(2×10⁵/well)置於48孔波登槽(48-well Boyden chamber，Neuro Probe)之上層，其下層放入含20%血清之DMEM，細胞於37℃、5% CO₂培養12小時，細胞以甲醇固定，以0.05% Giemsa染色1小時後以顯微鏡觀察。

細胞侵蝕(Cell invasion)試驗

48孔波登槽上層先以10μg/ml Matrigel(BD Biosciences)處理，將無血清DMEM中之細胞(2×105/well)置於48孔波登槽之上層，其下層放入含20%血清之DMEM，細胞於37℃、5% CO₂培養24小時，細胞以甲醇固定，以0.05% Giemsa染色1小時後以顯微鏡觀察。

反譯股抑制表現測定(Antisense Knockout Assays)

反譯股抑制表現測定所使用之反譯股及正譯股(對照組)序列如下：Elk-1(反譯股5'-CAGCGTCACAGATGGGTCCAT-3'，如序列SEQ ID NO：61，正譯股5'-ATGGACCCATCTGTGACGCTG-3'，如序列SEQ ID NO：62)、MZF-1(反譯股5'-TACACAAGGGGACCATTCATTC-3'，如序列SEQ ID NO：63，正譯股5'-GAATGAATGGTCCCCTTGTGTA-3'，如序列SEQ ID NO：64)。

實施例1

蛋白激酶Cα表現與MZF-1/Elk-1之相關性

人類乳癌(第1圖)、肝癌(第2圖)、肺癌(第3圖)、膀胱癌(第4圖)檢體，以免疫組織染色法(irmmunohistochemical staining)分析蛋白激酶Cα表現與MZF-1/Elk-1之相關性，人類乳癌與肝癌組織中，蛋白激酶Cα表現量與MZF-1或Elk-1表現量有中-強度之正相關，多數中-強度正相關的結果來自第2期與第3期癌症的檢體；但肺癌與膀胱癌的檢體中，蛋白激酶Cα表現量與MZF-1或Elk-1表現量沒有相關。以癌細胞株進一步分析確認蛋白激酶Cα表現與MZF-1/Elk-1相關性，在TNBC乳癌(MDA-MB-231)與肝癌(SK-Hep-1)細胞株，以siRNA干擾Elk-1蛋白質表現會同時使蛋白激酶Cα蛋白質表現量降低，但是在肺癌(A549)與膀胱癌(bladder 5637)細胞株，以siRNA干擾Elk-1蛋白質表現不會改變蛋白激酶Cα蛋白質表現量。TNBC乳癌檢體以免疫組織染色法進行分析，結果如第5圖所示，其蛋白激酶Cα表現量與MZF-1或Elk-1表現量也有中-強度之正相關。進一步於TNBC乳癌(MDA-MB-231及Hs578T)細胞株，以基因轉殖增加MZF-1或/和Elk-1表現，發現蛋白激酶Cα轉錄活性有數倍增加。由以上結果可以推論，在肝癌、乳癌甚至TNBC中，MZF-1/Elk1可以調節蛋白激酶Cα表現。

實施例2

MZF-1/Elk-1複合物與PRKCA啟動子區域之結合

二種肝癌細胞(hepatocellular carcinoma，HCC，Huh-7和HepG2)細胞轉殖全長的MZF-1或Elk-1，發現其蛋白激酶Cα的轉譯活性 (transtriptional activity)增加，如第6圖所示，HCC細胞同時轉殖全長的MZF-1和Elk-1使PKC α的轉譯活性更高，但若以DNA質體構築使Elk-1之DNA結合區域(DNA binding domain，Elk-1ΔDBD，Elk-1_87-428)或MZF-1之DNA結合區域(MZF-1ΔDBD，MZF-1_1-72)刪除不影響蛋白激酶Cα的轉譯活性，結果顯示於MZF-1/Elk-1直接與PRKCA啟動子區域結合以調節蛋白激酶Cα的轉譯活性。

將PRKCA啟動子與MZF-1結合區域之核苷酸鳥嘌呤(guanine，G)全部置換為胸腺嘧啶(thymine，T)，與Elk-1結合區域之核苷酸胞嘧啶(cytosine，C)全部置換為腺嘌呤(adanine，A)，如第7圖所示，以電泳速度變動分析法(electrophoresis mobility shift assay，EMSA)分析DNA與蛋白質之結合，結果如第8圖所示，其中，P：表示只有探針(probe)，V：表示只有細胞核萃取液，N：表示細胞核萃取液加上探針，FP：游離探針，三陰性乳癌細胞(MDA-MB-231)細胞核萃取物進行EMSA分析，由較慢的移動速度可以判讀野生型PRKCA啟動子探針會與MZF-1或Elk-1結合，相反的，PRKCA啟動子MZF-1結合區域或Elk-1結合區域核苷酸被取代後與MZF-1或Elk-1結合能力下降，結果如第9圖所示，其中，P：表示只有探針(probe)，N：表示細胞核萃取液加上探針，FP：游離探針。由這些結果，可以證明MZF-1或/與Elk-1會與PRKCA啟動子結合而影響其轉譯活性。

以共免疫沉澱法(co-immunoprecipitation)可以利用抗-Elk-1抗體由複合體中發現MZF-1，結果如第10圖所示，相反的，也可以利用抗-MZF-1抗體由複合體中發現Elk-1。另外，將DMA-MB-231細胞轉染Elk-1質體構築(Elk-1-c-Myc-ΔDBD經缺失突變而缺少N端區域)，在以抗-c-Myc 抗體免疫沉澱的複合物中發現MZF-1蛋白質結果如第11圖所示，細胞轉染Flag-MZF-1 ΔDBD質體，在以抗-FLAG抗體免疫沉澱的複合物中發現Elk-1蛋白質，結果顯示，全部細胞株中都發現Elk-1與MZF-1的N端區域結合，且MZF-1與Elk-1的N端區域結合，推測MZF-1/Elk-1會形成一異體複合物(heterodimeric complex)。

以染色質免疫共沈澱(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)分析，經免疫沉澱以抗-Elk-1或抗-MZF-1抗體可以放大複合體中PRKCA啟動子片段，以Re-ChIP assay分析，結果顯示Elk-1與MZF-1形成一複合體且與PRKCA啟動子結合，結果如第12圖所示；以反譯股寡核苷酸(antisense oligonucleotides)抑制Elk-1或MZF-1表現，抑制複合體與PRKCA啟動子結合，結果如第13圖所示，其中，S：表示正譯股(sense)、AS：表示反譯股(anti-sense)，結果表示需要先形成Elk-1與MZF-1之異體複合物以與PRKCA啟動子區域結合。

由結果得知，Elk-1與MZF-1形成一複合體且與PRKCA啟動子結合，進而抑制蛋白激酶Cα的轉譯活性。

實施例3

MZF-1酸性區域(Acidic Domain)與Elk-1的肝素結合區域(Heparin-Binding Domain)的相互作用

MZF-1酸性區域在第60-72個胺基酸位置，設計不同的MZF-1胜肽片段，結果如第14圖所示，以共免疫沉澱法(co-immunoprecipitation assay)分析，其中包含MZF-1酸性區域之全長MZF-1、MZF-1_1-72、MZF-1_1-141、MZF-1_60-72都會與Elk-1結合，但MZF-1_1-60、 MZF-1_73-485不會與Elk-1結合，可以確認MZF-1酸性區域第60-72個胺基酸胜肽片段為與Elk-1的結合位置。設計突變MZF-1_60-72、MZF-1_1-72，如第15圖所示，其中胺基酸序列第61、67、70、72個位置帶正電之天冬胺酸(Aspartic acid，Asp，D)以不帶電之丙胺酸(Alanine，Ala，A)取代，其與Elk-1的結合能力降低。

以由飽和的蛋白質-蛋白質結合結構域(saturating the protein-protein binding domains)與對應於MZF-1_60-72片段胜肽甘擾內生性Elk-1和MZF-1，從EMSA結果顯示，MZF-1_60-72可降低Elk-1和MZF-1之DNA結合活性，且有劑量依存性，結果如第16圖所示，該片段的突變型式並不影響它們的結合活性，這些研究結果進一步驗證了MZF-1通過其酸性區域與Elk-1相互作用。

建造數個Elk-1片段，如第17圖所示，Elk-1第145-157個氨基酸的胜肽片段為肝素結合區域，Elk-1_145-157會與MZF-1相互作用，此外，Elk-1_145-157使Elk-1和MZF-1之DNA結合活性減少，且具劑量依存性，突變型式則沒有此特性，結果顯示Elk-1胺基酸145-157之肝素結合區域為與MZF-1結合位置，以該區域經與MZF-1相互作用。設計突變Elk-1_145-157、MZF-1_145-428，如第18圖所示，其中胺基酸序列第147、150、155個位置之精胺酸(Arginine，Arg，R)以丙胺酸(Alanine，Ala，A)取代，其與MZF-1的結合能力降低。添加Elk-1_145-157降低MZE-1及Elk-1與DNA結合活性，結果如第19圖所示。

由上述結果得知，MZF-1通過其酸性區域與Elk-1相互作用，Elk-1通過其肝素結合區域與MZF-1相互作用。

實施例4

MZF-1/ELK-1異二聚體(heterodimer)對蛋白激酶Cα表現之影響

MZF-1和ELK-1異二聚體的形成經由減少蛋白激酶Cα表現而降低乳腺癌細胞的之抗藥性和惡性表型，因為MZF-1_60-72與內源性MZF-1競爭Elk-1結合位置並降低內源DNA結合活性而對蛋白激酶Cα表現的影響，於三陰性乳癌細胞中穩定表現MZF-1_60-72與未表現MZF-1_60-72之控制組細胞相比，形態更圓，結果如第20圖所示。此外，MDA-MB-231細胞穩定表現MZF-1_60-72細胞之蛋白激酶Cα和MZF-1的表現量減少而Elk-1濃度保持相對不變，以免疫螢光染色經共軛交顯微鏡(confocal microscopy)分析，其中Elk-1/MZF-1主要分布在細胞質，而控制組細胞Elk-1/MZF-1平均分布在細胞核與細胞質中，穩定表現MZF-1_60-72細胞之Elk-1/MZF-1位於細胞質，結果如第21圖所示，其中，N：表示細胞核，C：表示細胞質。

以免疫墨點法(Immunoblotiing)分析，乳癌細胞(Hs578T與MDA-MB-231)穩定表現MZF-1_60-72，細胞之Elk-1磷酸化沒有改變，但入核(nuclear translocation)被抑制，結果如第22圖所示。環己亞醯胺(cycleheximide)和蛋白酶體抑製劑(proteasome inhibitor MG132)處理後，由於蛋白質降解增加導致MZF-1減少，結果如第23圖所示，這些現象指出兩個內源轉錄因子MZF-1和Elk-1之間的相互作用，促進MZF-1蛋白質的穩定性和其進入細胞核。

以ChIP實驗分析，穩定表現MZF-1_60-72的三陰性乳癌細胞(MDA-MB-231)會降低抗-Elk-1或抗-MZF-1抗體免疫沉澱放大之PRKCA啟 動子，結果如第24圖所示。P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是多藥耐性相關蛋白，穩定表現MZF-1_60-72的三陰性乳癌細胞(MDA-MB-231)中P-gp顯著降低，結果如第25圖所示。由以上結果可以得知，MZF-1_60-72因為與內生性Elk-1結合而中斷內生性Elk-1和MZF-1之間的相互作用，和抑制它們與PRKCA啟動子結合。

穩定表達MZF-1_60-72的MDA-MB-231細胞用一般乳腺癌藥物啶黃素(acriflavine)和順鉑(cisplatin)處理，測量細胞存活率，結果如第25圖所示，啶黃素的半抑制濃度(IC₅₀)由2.43μM降至1.49μM，順鉑IC₅₀由27.97μM降至21.14μM，由以上結果可以推測，MZF-1_60-72抑制內源性Elk-1和MZF1交戶作用以減少與PRKCA啟動子的結合，從而降低蛋白激酶Cα及P-gp的表現、增加對化療藥物的敏感性。

在穩定表現MZF-1_60-72的乳腺癌細胞(MDA-MB-231和HS578T)之細胞遷移距離較控制組降低80-90%(有顯著)，結果如第26圖所示，但細胞生長沒有增加。在一個乳腺癌異種移植小鼠模型中分析MZF-1_60-72致癌功效，小鼠注射穩定表現MZF-1_60-72轉植的乳癌細胞(MDA-MB-231-M(v4)和HS578T-M(s3))形成腫瘤速度比較慢，結果如第27圖所示(左上圖)。在穩定表現MZF-1_60-72的MDA-MB-231細胞，腫瘤生長的最大抑制率為91.0%±5.2%(n=5)，在穩定表現MZF-1_60-72的HS578T細胞，腫瘤生長的最大抑制率為控制組HS578T細胞之90.7%±4.6%(n=5)。在穩定表現MZF-1_60-72的Hs578T細胞，平均腫瘤生長抑制為85.6%±4.1%，在穩定表現MZF-1_60-72的MDA-MB-231細胞，平均腫瘤生長抑制為84.4%±6.7%，注射入穩定表現MZF-1_60-72細胞生成腫瘤之重量也顯著降低，結果如 第27圖所示(右上圖)，由腫瘤中分離之細胞顯示許多間質性組織(interstitial tissue)一開始形成為管狀結構，結果如第27圖所示(下圖)，也發現腫瘤外層有白血球浸潤，表示腫瘤生長受限制，由結果推論，MZF-1_60-72影響MZF-1/Elk-1交互作用與PRKCA轉譯活性，而對腫瘤有抑制功效。

大量提供胜肽MZF-1或Elk-1抑制內生性MZF-1或Elk-1生成，影響MZF-1/Elk-1交互作用與抑制PRKCA轉譯活性，從而對腫瘤有抑制功效。

實施例5

抑制MZF-1/Elk-1異二聚體形成使上皮變間質型轉換(epithelial-mesenchymal transition，EMT)

在穩定表現MZF-1_60-72的三陰性乳癌細胞HS578T-M(S3)和MDA-MB-231-M(v4)，進行22203個基因的分析，在HS578T-M(S3)細胞，有1209個基因表現達2倍增加，有1557個基因表現達2倍減少，結果如第28圖所示，在表達MDA-MB-231-M(v4)細胞，有1272基因表現達2倍增加，有1494基因表現2倍減少，二細胞中同時有821基因表現為增加，有931基因表現為降低，受影響基因包含EMT的基因，如24 EMT-core-upregulated genes(CDH11,CTGF,EMP3,FBN1,FN1,FSTL1,HAS2,LOX,MAP1B,MYL9,PLAT,PMP22,PRKCA,PTX3,RGS4,SERPINE1,-SERPINE2,SNAI2,SRGN,TFPI,TGM2,VIM,ZEB1,and ZEB2)降低、24 EMT-core-downregulated genes(AGR2,ANK3,CA2,CD24,CDH1,CDS1,CXCL16,ELF3,EPCAM,FGFR2,FXYD3,JUP,MAP7,MPZL2,MTUS1,OCLN,PRRG4,S100P,SLC27A2,ST6GALNAC2,TMEM30B,TPD52L1,TSPAN1,and ZHX2)增加，PKCα、Slug(SNAI2)、Vimentin(VIM)蛋白質量顯著降低，cadherin(CDH1)蛋白質量增加，PKCδ蛋白質量沒有改變，結果 如第29圖所示。

為了驗證EMT中蛋白激酶Cα的功能，結果如第30圖所示，MDA-MB-231-M(V4)和HS578T-M(S3)細胞轉植表現全長之蛋白激酶Cα，表現蛋白激酶Cα者細胞遷移速度顯著增加，由5%增加至41%(MDA-MB-231-M(V4))，由9%增加至62%(Hs578T-M(s3)cells)，EMT相關基因(Slug、Vimentin、E-cadherin)表現量增加，結果如第31圖所示。

這些結果可以推測在癌細胞內中斷了MZF-1/Elk-1交互作用，降低蛋白激酶Cα負調節，因此影響EMT相關基因。

實施例6

TAT(HIV trans-activating regulatory protein)融合胜肽對MZF-1/Elk-1異二聚體形成之影響

HS578T和MDA-MB-231細胞以TAT-融合胜肽MZF-1_60-72，或TAT-融合胜肽Elk-1_145-157，序列設計如第32圖所示，使細胞遷移減少，結果如第33圖所示，EMT-相關蛋白(PKCα,Slug and Vimentin)增加、中胚上皮細胞轉化(mesenchymal-epithelial transition，MET)相關蛋白(E-cadherin)減少，結果如第34圖所示。若以TAT-融合突變胜肽(如第16圖)，則不會影響蛋白質表現，由共免疫沉澱分析發現MZF-1_60-72和Elk-1_145-157降低MZF-1與Elk-1結合，有濃度依存性，使用TAT-融合突變胜肽則不會造成影響，結果如第35圖所示。

由結果可以證明TAT-融合胜肽抑制MZF-1/Elk-1異二聚體形成，MZF-1和Elk-1交互作用在腫瘤進展扮演重要角色，中止MZF-1和Elk-1交互作用有治療癌症效果。

本發明中，發現癌細胞中有MZF-1和Elk-1交互作用，其作用機制如第36圖所示，且會結合於PRKCA啟動子上；若以胜肽MZF-1或Elk-1抑制內生性肽MZF-1或Elk-1生成，即可抑制MZF-1和Elk-1交互作用，抑制蛋白激酶Cα轉譯活性，抑制癌症；因此本發明中之胜肽，會抑制癌細胞特有的MZF-1和Elk-1的交互作用，進一步影響蛋白激酶Cα表現，對非癌細胞沒有任何影響，因此較現有蛋白激酶Cα抑制劑有更好之潛力解決癌症治療問題。

上列詳細說明係針對本發明之可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性與進步性之法定發明專利要件，爰依法提出申請，懇請 貴局核准本件發明專利申請案。

<110> 中國醫藥大學

<120> 胜肽抑制MZF-1和Elk-1的交互作用

<160> 66

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 60

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 51

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 54

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 54

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 57

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 54

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 41

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 42

<210> 43

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 43

<210> 44

<211> 27

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 44

<210> 45

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 45

<210> 46

<211> 30

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 46

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 47

<210> 48

<211> 19

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 48

<210> 49

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 49

<210> 50

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 50

<210> 51

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 52

<210> 53

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 54

<210> 55

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 55

<210> 56

<211> 34

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 57

<210> 58

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

<210> 60

<211> 27

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 21

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 64

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

Claims (4)

1. 一種胜肽用於製備乳癌治療醫藥組合物之用途，該胜肽包含下列至少一者，或任意組合：(A)胜肽MZF-1_60-72，序列為Ser Asp Leu Arg Ser Glu Gln Asp Pro Thr Asp Glu Asp(SEQ ID NO：65)；(B)胜肽Elk-1_145-157，序列為Leu Ala Arg Ser Ser Arg Asn Glu Tyr Met Arg Ser Gly(SEQ ID NO：66)；該胜肽經由抑制MZF-1與Elk-1交互作用而具有乳癌治療效果。
2. 如申請專利範圍第1項之用途，該醫藥組合物可進一步包含該藥學上可接受之載劑，其中該載劑包含賦形劑、稀釋劑、增稠劑、填充劑、結合劑、崩解劑、潤滑劑、油脂或非油脂的基劑、介面活性劑、懸浮劑、膠凝劑、輔助劑、防腐劑、抗氧化劑、穩定劑、著色劑或香料。
3. 如申請專利範圍第1項之用途，其中該醫藥組合物係以口服、浸泡、注射、塗抹或貼片方式投予。
4. 如申請專利範圍第1項之用途，該乳癌係三陰性乳癌。