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TWI589300B - 中和流感病毒ｈ３ｎ２之人類結合分子及其用途 - Google Patents

中和流感病毒ｈ３ｎ２之人類結合分子及其用途 Download PDF

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TWI589300B
TWI589300B TW099114829A TW99114829A TWI589300B TW I589300 B TWI589300 B TW I589300B TW 099114829 A TW099114829 A TW 099114829A TW 99114829 A TW99114829 A TW 99114829A TW I589300 B TWI589300 B TW I589300B
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羅伯特Ｈ Ｅ 佛瑞森
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傑森疫苗防護公司
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Description

中和流感病毒H3N2之人類結合分子及其用途
本發明係關於醫學領域。詳言之，本發明係關於能夠中和各種A亞型流感之人類結合分子，包括針對包含H3亞型之HA之流感病毒(諸如流感病毒H3N2)的中和型結合分子。詳言之，本發明係關於診斷、預防及/或治療由包含H3亞型之HA之流感病毒、尤其流感病毒H3N2引起的感染。
流感病毒為RNA正黏液病毒且由A型、B型及C型三種類型組成。儘管B型及C型流感病毒主要為人類病原體，但A型流感病毒感染多種禽類及哺乳動物，包括人類、馬、海洋哺乳動物、豬、白鼬及雞。在動物中，大部分A型流感病毒引起呼吸道及腸道之輕度局部感染。然而，亦存在高病原性A亞型流感(諸如H5N1)，其在家禽中引起全身感染，其中死亡率可達100%。A型流感病毒之若干亞型亦會引起人類的嚴重疾病。
可基於編碼表面醣蛋白(亦即為病毒附著及細胞釋放所需之血球凝集素(HA)及神經胺酸酶(NA))的兩個基因之抗原區域中的對偶基因變異來將A型流感病毒分類為亞型。其他主要病毒蛋白包括核蛋白、核衣殼結構蛋白、膜蛋白(M1及M2)、聚合酶(PA、PB及PB2)及非結構蛋白(NS1及NS2)。目前在A型流感病毒中已知有十六種HA亞型(H1-H16)及九種NA(N1-N9)抗原性變異體。流感病毒亞型可藉由參考其系統發生群來進一步分類。系統發生分析(Fouchier等人，2005)已顯示屬於兩個主群之HA亞類(Air，1981)：尤其系統發生群1中之H1、H2、H5及H9亞型以及尤其系統發生群2中之H3、H4及H7亞型(圖1)。
僅一些A亞型流感(亦即H1N1、H1N2及H3N2)在人之間傳播，但已在鳥禽類物種中鑑別出16種HA及9種NA亞型之全部組合。感染A型流感之動物通常充當流感病毒的傳染窩(reservoir)，且已證明某些亞型跨越種間障壁(species barrier)傳播至人類，諸如高病原性A型流感病毒株H5N1。
流感感染為人類已知的最常見疾病之一，其在全世界每年引起三百萬例至五百萬例之間的嚴重疾病及250,000例至500,000例之間的死亡。流感以季節性流行病形式快速傳播，其影響著5-15%人口，且健保成本負擔及生產力損失極大(世界衛生組織(WHO))。住院治療及死亡主要發生於高風險群體(老年患者、慢性病患者)中。
流感之年度流行在病毒表面蛋白質HA及NA之抗原性質變化時發生。改變之抗原性之機制為雙重的：由在宿主細胞之雙重感染後人類與動物病毒之間的遺傳重排引起之抗原性轉變(antigenic shift)，其會引起大流行病；及由病毒表面上HA及NA蛋白質之小變化引起之抗原性漂移(antigenic drift)，其會引起流感流行病。因該兩種機制引起變異病毒株出現為流感流行病之原因。在上個世紀，A型流感病毒主要在其HA組分方面經歷3次主要遺傳變化，導致全球大流行病及由疾病與死亡造成之重大損失。最聲名狼藉之大流行病為由流感病毒H1N1引起之「西班牙流感」，其影響著大部分世界人口且據說在1918年至1919年內殺死至少4千萬人。近年來，發生兩起其他A型流感大流行病，即1957年(「亞洲流感」，由流感病毒H2N2引起)及1968年(「香港流感」，由流感病毒H3N2引起)，且其在全球引起顯著的發病率及死亡率。與當前季節性流感流行病不同，此等大流行病亦在健康年輕人之中引起嚴重後果。
當前對付年度流感流行病之方法包括每年接種疫苗，較佳產生異型交叉保護。然而，如上所述，在人類中傳播之流感病毒易於發生永久抗原性變化，其要求每年改進流感疫苗調配物以確保流感疫苗株與流行性流感病毒株之間最接近的可能性匹配。
儘管每年接種流感疫苗為預防流感之最佳方法，但抗病毒藥物(諸如奧司他韋(oseltamivir)，Tamiflu)可有效地預防及治療流感。然而，對該奧司他韋顯示抗性之流感病毒株之數目正逐漸增加。
一種替代性方法為研發基於抗體之預防或治療手段來中和各種季節性流感病毒。防止流感病毒感染之中和型抗體之主要目標為含有受體結合位點但易於經由抗原結合位點處之胺基酸取代發生持續遺傳進化(抗原性漂移)的病毒HA蛋白質之球狀頭部(HA1部分)。最近已鑑別出識別系統發生群1中之A型流感病毒(例如H1及H5)的HA之較保守主幹區域的交叉中和型抗體(例如WO 2008/028946)。然而，在鑑別可中和系統發生群2中之一或多種A型流感病毒亞型(諸如H3病毒)之抗體方面的成果有限，而且其中和寬度狹窄且效能低下。
對特異性識別H3N2流感病毒株之抗體已有描述。於是，stberg及Pursch(1983年)描述了一種在1968年至1980年數年間能夠結合至且中和若干H3N2流感病毒株之人類單株抗體C28。Wang等人(2010年)描述了一種在數十年間中和H3病毒之抗HA2鼠類抗體，但已證實其不能中和任何非H3亞型病毒。
識別H3亞型之HA以及H4及H7亞型之HA且能夠活體外降低H3及H4流感病毒之流感病毒複製的交叉反應性抗HA2鼠類抗體已由Stropkovsk等人(2009年)描述。已證明此等抗體對天然病毒中之HA2抗原決定基的可及性較低，且該等抗體在其胰蛋白酶裂解及pH 5處理後對HA具有較高反應性(Varekov等人，2003a)，由此可解釋以下觀測結果：此等抗體對病毒複製之活體外抑制(Varekov等人，2003b)以及活體內效能相對較低(Gocnk等人，2007)。
在WO 2009/115972中揭示了一種人類單株抗體Fab28，其可識別HA主幹區域上之抗原決定基且對H1N1顯示中和活性，但對H3N2之中和活性較低。
鑒於由某些A型流感病毒引起之呼吸道疾病之嚴重性及始終存在的潛在大流行病之威脅以及季節性流行病之嚴重經濟衝擊，不斷需要可有效預防及治療各種A亞型流感之手段。因此需要有結合分子，較佳為廣泛中和型人類結合分子，其能夠中和季節性流感病毒亞型(包括包含H3亞型之HA的流感病毒，較佳為H3N2)，且不具有或具有較少先前技術中已知之抗體的缺點。
本發明提供此等結合分子，其可用於醫學領域，詳言之用於診斷、預防及/或治療由包含H3亞型之HA之流感病毒引起的感染，較佳為H3N2感染。本發明之一些結合分子在其於H3亞型內之中和活性寬度方面為獨特的。因此，本文中鑑別之一些結合分子能夠中和H3N2亞型內之若干種病毒株(包括至少一或多種新近發現之病毒株)且可用作季節性流感之通用預防劑及/或治療劑，而與致病流感H3N2病毒株無關。至少一些結合分子能夠活體外防止由胰蛋白酶引起之HA前驅體分子HA0之裂解。此外，至少一些本發明之結合分子能夠防止HA蛋白質之構形變化，該等變化被認為與流感病毒膜與受感染細胞之內體膜之膜融合有關。此外，至少一些本發明之結合分子的獨特之處在於其亦能夠交叉中和至少一種其他亞型之流感病毒，包括包含H7及/或H10亞型之HA的流感病毒，且因此可用作流感病毒之通用預防劑、診斷劑及/或治療劑，甚至與致病流感亞型無關。
本發明中使用之術語之定義如下。
如本文中使用之術語「包括」應視為後接有詞「但不限於」。
如本文中使用之術語「結合分子」係指包括單株抗體(諸如嵌合、人類化或人類單株抗體)之完整免疫球蛋白，或係指包含可與完整免疫球蛋白競爭特異性結合於免疫球蛋白之結合搭配物(例如，H3)的免疫球蛋白之片段的抗原結合及/或可變域。與結構無關，抗原結合片段與可由完整免疫球蛋白識別之同一抗原結合。抗原結合片段可包含肽或多肽，該肽或多肽包含結合分子之胺基酸序列之至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250個鄰接胺基酸殘基的胺基酸序列。
如本文中使用之術語「結合分子」包括此項技術中已知之所有免疫球蛋白類別及子類。視結合分子之重鏈之恆定域的胺基酸序列而定，結合分子可分為五種主要類別之完整抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等完整抗體中若干者可進一步分為子類(同型)，例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
抗原結合片段尤其包括Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、(多)肽(其至少含有足以賦予該(多)肽特異性抗原結合之免疫球蛋白的片段)等。可以合成方法或藉由酶促或化學裂解完整免疫球蛋白來產生上述片段或其可藉由重組DNA技術加以遺傳工程改造。產生方法在此項技術中已為吾人所熟知且描述於例如Antibodies: A Laboratory Manual,E. Harlow及D,Lane編(1988),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York中，該文獻以引用方式併入本文中。結合分子或其抗原結合片段可具有一或多個結合位點。若存在一個以上結合位點，則該等結合位點可能彼此相同或其可能不同。
結合分子可為裸結合分子或未接合型結合分子，但亦可為免疫接合物之一部分。裸結合分子或未接合型結合分子意欲指未與效應部分或標籤(尤其諸如有毒物質、放射性物質、脂質體、酶)接合、可操作地連接或以其他方式實體上或功能上締合的結合分子。應瞭解，裸結合分子或未接合型結合分子不排除經穩定化、多聚化、人類化或以任何其他方式處理(除與效應部分或標籤連接以外)之結合分子。因此，由此包括所有經轉譯後修飾之裸結合分子及未接合型結合分子，包括其中利用產生重組結合分子之細胞在天然的產生結合分子之細胞環境中進行修飾，且在最初結合分子製備後藉助於人類引入。當然，術語「裸結合分子或未接合型結合分子」不排除在向身體投藥後結合分子與效應細胞及/或分子形成功能性締合之能力，因為一些該等相互作用為發揮生物效應所必需。因此，缺乏相關效應組或標籤在定義上適用於活體外(而非活體內)的裸結合分子或未接合型結合分子。
如本文中使用之術語「生物樣本」涵蓋各種樣本類型，包括生物學來源之血液及其他液體樣本、實體組織樣本(諸如活檢標本或組織培養物)或源自上述者之細胞及其子代。該術語亦包括在獲取後已以任何方式處理(諸如藉由用試劑加工、增溶或增濃某些組分(諸如蛋白質或聚核苷酸)來處理)之樣本。該術語涵蓋自任何物種獲得之各種臨床樣本，且亦包括培養物中之細胞、細胞上清液及細胞溶解產物。
如本文中使用之術語「互補決定區」(CDR)意謂結合分子(諸如免疫球蛋白)之可變區內之序列，其通常在很大程度上促成在形狀及電荷分佈方面與抗原上識別之抗原決定基互補的抗原結合位點。CDR區可對蛋白質或蛋白質片段之線性抗原決定基、不連續抗原決定基或構形抗原決定基具特異性，該等抗原決定基如存在於呈天然構形之蛋白質上或在一些情況下存在於例如藉由溶解於SDS中而變性的蛋白質上。抗原決定基亦可由蛋白質之轉譯後修飾組成。
如本文中使用之術語「缺失」表示胺基酸或核苷酸序列之變化，其中與參考分子(通常為天然存在之分子)相比分別缺少一或多個胺基酸或核苷酸殘基。
如本文中使用之術語「調節表現之核酸序列」係指為可操作地連接之編碼序列在特定宿主有機體中之表現所必需及/或影響該表現的聚核苷酸序列。調節表現之核酸序列尤其諸如為：適當轉錄起始序列、終止序列、啟動子序列、強化子序列；抑制序列或活化序列；有效RNA加工信號，諸如拼接及聚腺苷酸化信號；穩定細胞質mRNA之序列；增強轉譯效率之序列(例如，核糖體結合位點)；增強蛋白質穩定性之序列；及在必要時增強蛋白質分泌之序列，其可為任何在所選宿主有機體中顯示具活性之核酸序列且可源自編碼蛋白質之基因，其可與宿主有機體同源或異源。調節表現之序列的鑑別及使用由熟習此項技術者按常規進行。
如本文中使用之術語「功能變異體」係指包含與參考結合分子之核苷酸及/或胺基酸序列相比一或多個核苷酸及/或胺基酸已發生變化之核苷酸及/或胺基酸序列且仍然能夠與參考結合分子競爭與結合搭配物(例如H3N2)結合的結合分子。換言之，參考結合分子之胺基酸及/或核苷酸序列之修飾不會顯著影響或改變由核苷酸序列編碼或含有胺基酸序列之結合分子之結合特徵，亦即，結合分子仍然能夠識別且結合其目標。功能變異體可具有保守性序列修飾，包括核苷酸及胺基酸取代、添加及缺失。此等修飾可藉由此項技術中已知之標準技術(諸如定點突變誘發及隨機PCR介導之突變誘發)來引入，且可包含天然以及非天然核苷酸及胺基酸。
保守性胺基酸取代包括胺基酸殘基由具有類似結構或化學性質之胺基酸殘基置換的取代。已在此項技術中定義具有類似側鏈之胺基酸殘基的家族。此等家族包括具有鹼性側鏈之胺基酸(例如，離胺酸、精胺酸、組胺酸)、具有酸性側鏈之胺基酸(例如，天冬胺酸、麩胺酸)、具有不帶電之極性側鏈的胺基酸(例如，天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、具有非極性側鏈之胺基酸(例如，甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、具有β分支型側鏈之胺基酸(例如，蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及具有芳族側鏈之胺基酸(例如，酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸)。熟練技工應知曉對胺基酸殘基家族亦可使用除上述所用分類法以外之分類法。此外，變異體可具有非保守性胺基酸取代，例如，以具有不同結構或化學性質之胺基酸殘基置換胺基酸。類似次要變異亦可包括胺基酸缺失或插入，或其兩者。可使用此項技術中熟知之電腦程式找到關於測定何種胺基酸殘基可在不會消除免疫活性之情況下經取代、插入或缺失的準則。
核苷酸序列之突變可為一基因座處發生之單一變化(點突變)，諸如轉換或顛換型突變，或者，可在單一基因座處插入、缺失或改變多個核苷酸。此外，可在核苷酸序列內任意數目之基因座處產生一或多種變化。可藉由此項技術中已知之任何適當方法進行突變。如本文中使用之術語「流感病毒亞型」係指特徵在於血球凝集素(H)及神經胺酸酶(N)病毒表面蛋白質之不同組合的A型流感病毒變異體。根據本發明，流感病毒亞型可根據其H數目來提及，諸如「包含H3亞型之HA的流感病毒」或「H3流感」，或根據H數目與N數目之組合來提及，諸如「流感病毒亞型H3N2」或「H3N2」。術語「亞型」特定地包括各亞型內之所有個別「病毒株」，其通常由突變產生且顯示不同的病原性概況。該等病毒株亦可稱為病毒亞型之不同「分離株」。因此，如本文中使用之術語「病毒株」與「分離株」可互換使用。人類流感病毒株或分離株之當前命名包括首次分離之地理位置、病毒株數目及分離年份，通常在括號中給出HA及NA之抗原性的描述，例如A/Moscow/10/00(H3N2)。非人類病毒株亦在命名中包括起源宿主。
流感病毒亞型可藉由參考其系統發生群來進一步分類。系統發生分析(Fouchier等人，2005)已顯示屬於兩個主群之HA亞類(Air,1981)：尤其系統發生群1中之H1、H2、H5及H9亞型以及尤其系統發生群2中之H3、H4及H7亞型(圖1)。
如本文中關於本發明之結合分子使用的術語「中和」係指結合分子可抑制流感病毒複製性感染目標細胞，而與達成中和之機制無關。因此，可例如藉由抑制病毒附著或黏附於細胞表面，或藉由在病毒附著於目標細胞後抑制病毒與細胞膜融合及其類似方法來達成中和。
如本文中關於本發明之結合分子使用的術語「交叉中和」係指本發明之結合分子中和不同亞型之A型流感病毒(諸如包含H3、H7及/或H10亞型之HA之流感病毒)的能力。
如本文中使用之術語「宿主」意欲指內部已引入有載體(諸如選殖載體或表現載體)之有機體或細胞。有機體或細胞可為原核或真核的。較佳的是，自宿主中分離出宿主細胞，例如培養物中之宿主細胞。術語「宿主細胞」僅表示細胞已經修飾而可用於(過)表現本發明之結合分子且包括最初表現此等結合分子及已藉由永生化、擴增、增強表現等而經修飾以過表現結合分子的B細胞。應瞭解，術語宿主不僅意欲指特定個體有機體或細胞，而且亦指該有機體或細胞之子代。因為可能由於突變或環境影響而在後代中存在某些修飾，所以該子代實際上可能不與母有機體或細胞相同，但其仍然包括在如本文中使用之術語「宿主」之範疇內。
術語「人類」當應用於本文中定義之結合分子時，係指分子直接源自人類或基於人類序列。當結合分子係源自人類序列或基於人類序列且隨後經修飾時，其仍應被視為如貫穿本說明書所用之人類結合分子。換言之，術語「人類」在應用於結合分子時意欲包括具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區或基於存在於人類或人類淋巴細胞中之可變區或恆定區且以某一形式經修飾的結合分子。因此，人類結合分子可包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基，包含取代及/或缺失(例如，由例如活體外隨機或位點特異性突變誘發或由活體內體細胞突變所引入之突變)。如本文中使用之「基於」係指核酸序列可完全自模板複製而來或具有次要突變(諸如藉由易錯PCR方法達成)或以合成方式製得使得與模板完全匹配或具有次要修飾的情形。基於人類序列之半合成分子亦被視為如本文中使用之人類分子。
術語「插入」(亦稱為術語「添加」)表示與母序列相比，分別引起一或多個胺基酸或核苷酸殘基之添加的胺基酸或核苷酸序列之變化。
術語「經分離」當應用於本文中定義之結合分子時，係指結合分子實質上不含其他蛋白質或多肽，特定言之不含具有不同抗原特異性之其他結合分子，且亦實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。舉例而言，當以重組方式產生結合分子時，其較佳實質上不含培養基組分，且當藉由化學合成產生結合分子時，其較佳實質上不含化學前驅體或其他化學物質，亦即，其與蛋白質合成中所涉及之化學前驅體或其他化學物質分離。當術語「經分離」當應用於本文中定義之編碼結合分子之核酸分子時，意欲指核酸分子中的編碼結合分子之核苷酸序列不含其他核苷酸序列，特定言之編碼可結合除H5N1以外之結合搭配物之結合分子的核苷酸序列。此外，術語「經分離」係指核酸分子與其他細胞組分(例如核糖體、聚合酶或與天然核酸分子締合之基因組序列)實質上分離，該等其他細胞組分天然伴隨天然宿主中之天然核酸分子。此外，「經分離」核酸分子(諸如cDNA分子)在藉由重組技術產生時可實質上不含其他細胞物質或培養基，或在藉由化學合成產生時實質上不含化學前驅體或其他化學物質。
如本文中使用之術語「單株抗體」係指具有單一特異性之抗體分子製劑。單株抗體對特定抗原決定基顯示單一結合特異性及親和性。因此，術語「人類單株抗體」係指顯示單一結合特異性之抗體，其具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列或基於人類生殖系免疫球蛋白序列或源自完全合成序列之可變區及恆定區。製備單株抗體之方法與結合特異性無關。
如本文中使用之術語「天然存在」當應用於物體時，係指可在自然界中發現物體之事實。舉例而言，存在於有機體中並可自自然界中之來源分離得到且未在實驗室中經人類有意修飾的多肽或聚核苷酸為天然存在的。
如本發明中使用之術語「核酸分子」係指核苷酸之聚合形式且包括RNA、cDNA、基因組DNA之有義鏈及反義鏈，以及上述者之合成形式及混合聚合物。核苷酸係指核糖核苷酸、脫氧核苷酸或任一種核苷酸之經修飾形式。該術語亦包括DNA之單鏈及雙鏈形式。此外，聚核苷酸可包括藉由天然存在及/或非天然存在之核苷酸鍵連接在一起的天然存在之核苷酸或經修飾之核苷酸或其兩者。熟習此項技術者應易於瞭解，核酸分子可以化學方法或生物化學方法加以修飾或可含有非天然或衍生之核苷酸鹼基。該等修飾包括例如標記、甲基化、一或多個天然存在之核苷酸經類似物取代、核苷酸間修飾，諸如不帶電的鍵聯(例如，膦酸甲酯、磷酸三酯、磷醯胺酯、胺基甲酸酯等)、帶電鍵聯(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、側接部分(例如，多肽)、插入劑(例如，吖啶、補骨脂素等)、螯合劑、烷化劑及經修飾之鍵聯(例如，α變旋異構核酸等)。上述術語亦意欲包括任何拓撲構形，包括單鏈、雙鏈、部分雙螺旋型、三螺旋型、髮夾型、環形及掛鎖式構形。亦包括可模擬聚核苷酸經由氫鍵結及其他化學相互作用結合於指定序列之能力的合成分子。該等分子在此項技術中為已知的且包括例如分子主鏈中肽鍵經磷酸酯鍵取代之分子。除非另有說明，否則對核酸序列之提及涵蓋其互補序列。因此，應理解，對具有特定序列之核酸分子的提及涵蓋其互補鏈及其互補序列。互補鏈亦適用於例如反義療法、雜交探針及PCR引子。
術語「可操作地連接」係指兩個或兩個以上核酸序列元件通常實體上連接且彼此具有功能關係。舉例而言，若啟動子能夠起始或調節編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接至編碼序列，在此情況下編碼序列應理解為「受啟動子控制」。
「醫藥學上可接受之賦形劑」意謂與諸如藥物、藥劑或結合分子之活性分子組合用於製備適當或便利劑型的任何惰性物質。「醫藥學上可接受之賦形劑」為在所用劑量及濃度下對接受者無毒且與包含藥物、藥劑或結合分子之調配物中之其他成分相容的賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑在此項技術中有廣泛應用。
如本文中關於結合分子(例如抗體)與其結合搭配物(例如抗原)之相互作用使用的術語「特異性結合」意謂該相互作用視結合搭配物上之特定結構(例如抗原決定子或抗原決定基)之存在而定。換言之，即使當結合搭配物存在於其他分子或有機體之混合物中時，抗體仍然優先結合或識別結合搭配物。結合可由共價相互作用或非共價相互作用或其兩者之組合介導。換言之，術語「特異性結合」意謂與一抗原決定子或抗原決定基免疫特異性結合且不與其他抗原決定子或抗原決定基免疫特異性結合。與抗原免疫特異性結合之結合分子可與具有較低親和性(如藉由例如放射免疫檢定(RIA)、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、BIACORE或此項技術中已知之其他檢定測定)之其他肽或多肽結合。與抗原免疫特異性結合之結合分子或其片段可與攜帶相同抗原決定基之相關抗原交叉反應。與抗原免疫特異性結合之結合分子或其片段較佳不與其他抗原交叉反應。
如本文中使用之「取代」表示一或多個胺基酸或核苷酸分別由不同胺基酸或核苷酸置換。
術語「治療有效量」係指可有效預防、改善及/或治療由H3亞型流感感染引起之病狀的本文中定義之結合分子之量。如本文中使用之「改善」可指流感感染之明顯或可察覺的病徵、病毒血症或任何其他可量測的表現得到緩解。
術語「治療」係指用以治癒疾病或中止或至少延緩疾病進程之治療性處理以及預防或預治性措施。需要治療之個體包括已罹患由包含H3亞型之HA之流感病毒感染引起的病狀的個體以及需要預防包含H3亞型之HA之流感病毒感染的個體。自H3流感感染部分或完全痊癒之個體亦可能需要治療。預防涵蓋抑制或減少包含H3亞型之HA之流感病毒的傳播或者抑制或減少與H3流感感染相關之一或多種症狀的發作、發展或進程。
術語「載體」表示以下特徵之核酸分子，可向其中插入第二核酸分子以引入宿主中，在該宿主中該第二核酸分子將被複製且在一些情況下被表現。換言之，載體能夠輸送已與其連接之核酸分子。如本文中使用之術語「載體」涵蓋選殖以及表現載體。載體包括(但不限於)質體、黏質體、細菌人造染色體(BAC)及酵母人造染色體(YAC)以及源自噬菌體或植物或動物(包括人類)病毒之載體。載體包含由推薦宿主識別之複製起點，且在表現載體之情況下，包含由該宿主識別之啟動子及其他調節區。藉由轉型、轉染或利用病毒進入機制將含有第二核酸分子之載體引入細胞中。某些載體能夠在其被引入之宿主中自發複製(例如，具有細菌複製起點之載體可在細菌中複製)。其他載體可在被引入宿主後整合於宿主之基因組中，且藉此與宿主基因組一起複製。
本發明提供能夠與包含H3亞型之HA之流感病毒株(包括H3N2)特異性結合且對該流感病毒呈現中和活性的人類結合分子。在一實施例中，本發明之結合分子的獨特之處在於其能夠高效能地中和流感病毒亞型H3(人類中最常見的流行亞型)之若干種病毒株，包括至少一或多種新近發現之病毒株，較佳為所有已知病毒株。在一個實施例中，結合分子與H3 HA蛋白質之主幹區域中的保守抗原決定基結合。在一實施例中，結合分子具有血球凝集抑制活性。在一實施例中，結合分子能夠阻止HA前驅體分子HA0之活體外裂解。在一實施例中，本發明之結合分子能夠防止為流感病毒膜與受感染細胞之內體膜之融合所需的HA蛋白質之構形變化。
本發明亦提供與在H3亞型所屬之系統發生群2內之流感亞型之間共有的血球凝集素蛋白質中之抗原決定基結合的結合分子，且因此係關於在基於H3-、H7-及/或H10流感之亞型與含有具有此等特定抗原決定基之HA蛋白質的其他流感亞型(較佳為系統發生群2中之所有亞型)之間交叉反應的結合分子。因此，本發明之若干結合分子的獨特之處在於其對一或多種其他A亞型流感病毒(諸如包含H7及/或H10亞型之HA的流感病毒)具有交叉中和活性。較佳的是，本發明之結合分子能夠交叉中和系統發生群2中之所有流感病毒亞型，包括H3、H7及H10亞型，且因此可用作屬於系統發生群2之流感病毒的通用預防劑、診斷劑及/或治療劑，甚至與系統發生群內之致病流感亞型無關。
吾人推測，本發明之結合分子與迄今未知的不易於或極少易於發生抗原性漂移或轉變之保守抗原決定基結合。因此，亦涵蓋使用本發明之結合分子來鑑別及/或表徵此等抗原決定基。本發明亦係關於至少編碼人類結合分子之結合區的核酸分子。本發明進一步提供本發明之人類結合分子用於預防及/或治療罹患H3流感感染(諸如H3N2流感感染)或具有罹患H3流感感染(諸如H3N2流感感染)之風險之個體的用途。此外，本發明係關於本發明之人類結合分子用於診斷/偵測該流感感染的用途。
在第一態樣中，本發明涵蓋能夠與A型流感病毒(特定言之為包含H3亞型之HA之A型流感病毒，尤其為H3N2)特異性結合且對該流感病毒具有中和活性之結合分子。該等結合分子較佳為人類結合分子。在一實施例中，本發明之結合分子能夠與若干種流感病毒H3N2病毒株(較佳為兩種或兩種以上不同H3N2病毒株，更佳為三種或三種以上，更佳為四種或四種以上，更佳為五種或五種以上不同H3N2病毒株)特異性結合及/或對該等病毒株具有中和活性。該等病毒株可自人類或非人類動物，例如禽類獲得。在一實施例中，該等結合分子可結合至且中和至少一或多種選自由A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005、A/Panama/2007/99及A/Johannesburg/33/94組成之群的新近發現之H3N2病毒株。在另一實施例中，該等結合分子亦可結合至且中和H3N2病毒株A/Hong Kong/1/68。最佳的是，該等結合分子可結合至1968年至2005年數年間之所有流感H3N2病毒株且對該等病毒株具有中和活性。較佳的是，該等結合分子至少對2010年1月20日前已知的流感病毒H3N2之所有天然存在之分離株具有中和活性。
本發明之結合分子能夠與HA蛋白質之HA0、HA1及/或HA2亞單位特異性結合。其能夠與HA蛋白質之HA0、HA1及/或HA2亞單位上之線性或結構及/或構形抗原決定基特異性結合。HA分子可自病毒中純化而得或以重組方式製得且視情況在使用之前加以分離。或者，HA可表現於細胞表面上。較佳的是，本發明之結合分子與包含H3HA蛋白質之HA2多肽的第19、25、27、33及34位處之胺基酸中之一或多者的抗原決定基結合。在一實施例中，當第19位上之胺基酸為天冬胺酸(D)，第25位上之胺基酸為麩醯胺酸(Q)，第27位上之胺基酸為甘胺酸(G)，第33位上之胺基酸為甘胺酸(G)及/或第34位上之胺基酸為麩醯胺酸(HA2編號之第1位係緊隨在構成HA1與HA2之間的裂解位點的精胺酸殘基之後開始)時，結合分子與HA2上之該抗原決定基結合。在一實施例中，當一或多個該等胺基酸發生變化時，結合分子不與HA2上之該抗原決定基結合。
在另一態樣中，本發明涵蓋至少能夠活體外防止HA1及HA2中H3 HA前驅體分子HA0之胰蛋白酶裂解的結合分子。
在另一態樣中，本發明涵蓋至少能夠活體外防止為流感病毒膜與受感染細胞之內體膜之膜融合所需的H3 HA蛋白質之構形變化的結合分子。
在另一態樣中，該等結合分子具有一些或所有以上列舉之性質，亦即交叉中和活性、與HA2主幹區域上之保守抗原決定基結合、活體外抑制HA0之胰蛋白酶裂解及/或抑制構形變化。
在一實施例中，本發明之結合分子具有所有或一些上述性質且此外不能夠結合至及/或中和包含H1亞型之HA之A型流感病毒，諸如H1N1。
本發明之結合分子能夠與例如流感病毒H3N2(其為有活力的、活的及/或感染性的或呈失活/減毒形式)特異性結合。使病毒(例如流感病毒H3N2)失活/減毒之方法在此項技術中已為吾人所熟知且包括(但不限於)用福馬林(formalin)、β-丙內酯(BPL)、硫柳汞(merthiolate)及/或紫外光處理。
本發明之結合分子亦能夠與流感病毒之一或多個片段特異性結合，該(等)片段尤其諸如為源自亞型H3N2之一或多種蛋白質及/或(多)肽之製劑或H3N2之一或多種以重組方式產生之蛋白質及/或多肽。對於H3N2感染之治療及/或預防方法，該等結合分子較佳能夠與H3N2之表面可及蛋白質(諸如為病毒附著及細胞釋放所需之表面醣蛋白血球凝集素(HA))特異性結合。
各種H3N2病毒株之蛋白質之核苷酸及/或胺基酸序列可見於GenBank資料庫、NCBI流感病毒序列資料庫、流感序列資料庫(ISD)、EMBL資料庫及/或其他資料庫中。在各別資料庫中找到該序列完全屬於熟習此項技術者之技能範圍內。
在另一實施例中，本發明之結合分子能夠與上述蛋白質及/或多肽之片段特異性結合，其中該片段至少包含由本發明之結合分子識別之抗原決定基。如本文中使用之「抗原決定基」為能夠以足夠高的親和力與本發明之結合分子結合以形成可偵測的抗原-結合分子複合物之部分。
本發明之結合分子可能能夠或可能不能夠與HA細胞外部分(本文中亦稱為可溶HA(sHA))特異性結合。
本發明之結合分子可為諸如多株或單株抗體之完整免疫球蛋白分子，或該等結合分子可為抗原結合片段，包括(但不限於)Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體、單鏈噬菌體抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、及至少含有足以賦予與流感病毒H3N2病毒株或其片段之特異性抗原結合的免疫球蛋白之片段的(多)肽。在一個較佳實施例中，本發明之結合分子為人類單株抗體。
本發明之結合分子可以未經分離或經分離之形式使用。此外，本發明之結合分子可單獨使用或以包含至少一種本發明之結合分子(或其變異體或片段)之混合物形式使用。換言之，結合分子可以組合形式使用，例如呈包含兩種或兩種以上本發明之結合分子、其變異體或片段之醫藥組合物形式。舉例而言，具有不同但互補的活性之結合分子可在單一療法中組合以達成所需預防、治療或診斷效果，但作為另一選擇，具有相同活性之結合分子亦可在單一療法中組合以達成所需預防、治療或診斷效果。視情況而定，混合物進一步包含至少一種其他治療劑。較佳的是，治療劑(諸如M2抑制劑(例如阿曼替丁(amantidine)、瑞曼他丁(rimantadine))及/或神經胺酸酶抑制劑(例如紮那米韋(zanamivir)、奧司他韋(oseltamivir)))適用於預防及/或治療流感病毒H3N2感染。
通常，本發明之結合分子與其結合搭配物(亦即流感病毒H3N2或其片段)結合之親和力常數(Kd值)可低於0.2×10-4 M、1.0×10-5 M、1.0×10-6 M、1.0×10-7 M，較佳低於1.0×10-8 M，更佳低於1.0×10-9 M，更佳低於1.0×10-10 M，甚至更佳低於1.0×10-11 M，且尤其低於1.0×10-12 M。抗體同型之親和力常數可能不同。舉例而言，IgM同型之結合親和力係指至少約1.0×10-7 M之結合親和力。舉例而言，親和力常數可使用表面電漿共振，例如使用BIACORE系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden)量測。
通常，如實例6中描述之活體外病毒中和檢定(VNA)所測定，本發明之結合分子具有10 μg/ml或以下，較佳為5 μg/ml或以下，更佳為2 μg/ml或以下，甚至更佳為1 μg/ml或以下之中和活性。
本發明之結合分子可與呈可溶形式(例如在樣本或懸浮液中)之流感病毒H3N2或其片段結合，或可與結合或附著至載體或基板(例如微量滴定板、薄膜及珠粒等)之流感病毒H3N2或其片段結合。載體或基板可由玻璃、塑膠(例如聚苯乙烯)、多醣、耐綸、硝化纖維或鐵氟龍(Teflon)等製得。該等支撐物之表面可為實心或多孔的且具有任何適宜的形狀。此外，結合分子可與呈經純化/分離或未經純化/分離之形式的流感病毒H3N2結合。
本發明之結合分子呈現中和活性。可例如如本文中所描述量測中和活性。量測中和活性之替代性檢定描述於例如WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance,Geneva: World Health Organisation,2005，第2002.5版中。
本發明係關於一種能夠識別及結合於流感血球凝集素蛋白質(HA)中之抗原決定基的經分離之人類結合分子，其特徵在於該結合分子對包含H3亞型之HA的A型流感病毒具有中和活性。含有H3亞型之HA之流感亞型的一個實例為H3N2。尤其較佳為可中和H3N2流感亞型之結合分子。在一實施例中，結合分子可中和至少一或多種新近發現之H3N2病毒株。在一實施例中，結合分子因此可至少結合至且中和一或多種選自由A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005、A/Panama/2007/99及A/Johannesburg/33/94組成之群的H3N2病毒株。在另一實施例中，結合分子亦可結合至且中和H3N2病毒株A/Hong Kong/1/68。最佳的是，結合分子可結合至1968年至2005年數年間之所有流感H3N2病毒株，較佳為該流感病毒亞型之所有已知病毒株且對該等病毒株具有中和活性。
在另一實施例中，本發明之結合分子亦對其他A亞型流感病毒之流感病毒，較佳為至少對包含H7亞型之HA之流感病毒(諸如病毒株A/Mallard/Netherlands/12/2000)及/或包含H10亞型之HA之流感病毒(諸如病毒株A/chick/Germany/N/49)具有中和活性。由此表明，本發明之一些結合分子交叉中和此等流感亞型。因此，本發明亦提供與在流感亞型之間共有及保守的血球凝集素蛋白質中之抗原決定基結合的結合分子，且因此係關於在基於H3-、H7-及/或H10流感之亞型與含有具有此等特定抗原決定基之HA蛋白質的其他流感亞型(較佳為系統發生群2中之所有流感病毒)之間交叉反應的結合分子。交叉中和結合分子較佳結合至且中和若干種H3、H7及/或H10亞型病毒株。在一實施例中，此等交叉中和結合分子可結合至且中和至少一或多種選自由A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005、A/Johannesburg/33/94及A/Panama/2007/99組成之群的新近發現之H3N2病毒株。在另一實施例中，結合分子亦可結合至且中和H3N2病毒株A/Hong Kong/1/68。最佳的是，結合分子可結合至1968年至2005年數年間之所有流感H3N2病毒株，較佳為所有已知的H3N2病毒株，且甚至更佳為未來發現之H3N2病毒株，且對該等病毒株具有中和活性。在另一實施例中，結合分子可中和該等其他流感病毒亞型之實質上所有的分離株。
在一實施例中，結合分子結合至且中和系統發生群2中之所有流感病毒亞型。
基於本文中揭示之內容，熟習此項技術者可確定抗體是否真正地與來自不同亞型之HA蛋白質交叉反應以及確定其是否能夠活體內中和不同亞型之流感病毒。
流感病毒藉由以下途徑感染細胞：與目標細胞之細胞表面上之唾液酸殘基結合，且接著藉由病毒膜與內體膜融合且向細胞中釋放基因組-轉錄酶複合物而轉移於內體中。受體結合與膜融合過程兩者均由HA醣蛋白介導。A型流感病毒之HA包含兩個結構上不同的區域，亦即球狀頭部區域，其含有負責病毒附著於目標細胞且與HA之血球凝集活性相關的受體結合位點；及主幹區域，其含有為病毒包膜與細胞內體膜之間的膜融合所必需的融合肽。HA蛋白質為三聚體，其中各單體由兩個在感染期間由前驅體(HA0)之蛋白水解分裂產生的二硫鍵連接之糖聚肽HA1及HA2組成。裂解為病毒感染性所必需的，因為需要裂解來啟動HA以進行膜融合，從而允許構形變化。經啟動分子之活化在內體中於低pH值(pH 5與pH 6之間)下進行，且需要HA結構之廣泛變化。預融合未裂解(I)、預融合已裂解(II)及融合後HA(III)構形之3維結構示意性展示於圖4中。HA在參與膜融合過程時之啟動及活化中之每一階段為例如單株抗體之抑制提供不同目標。
在本發明之一實施例中，結合分子在活體外檢定(例如以下在實例中描述之檢定)中至少能夠阻止HA前驅體分子HA0之裂解。如上所解釋，活化病毒感染性需要HA前驅體分子HA0藉由宿主蛋白酶裂解為HA1及HA2。因此，藉由本發明之結合分子阻止HA前驅體分子HA0之裂解可預防流感病毒感染。
在一實施例中，結合分子與包含H3 HA蛋白質之HA2多肽的第19、25、27、33及/或34位處之胺基酸的抗原決定基結合。在一實施例中，當第19位上之胺基酸為天冬胺酸(D)，第25位上之胺基酸為麩醯胺酸(Q)，第27位上之胺基酸為甘胺酸(G)，第33位上之胺基酸為甘胺酸(G)及/或第34位上之胺基酸為麩醯胺酸時，結合分子與HA2上之該抗原決定基結合。較佳的是，當一或多個該等胺基酸產生變化時，結合分子不與HA2上之該抗原決定基結合。胺基酸編號係基於來自Uniprot資料庫編號Q91MA7之血球凝集素序列(SEQ ID NO：260)。Q91MA7提供來自A/Hong Kong/1/1968之未成熟HA之全長序列。HA2序列於未裂解之HA未成熟蛋白質之G346處開始。在以上編號中，G346為HA2序列中之G1。
較佳為選自由以下組成之群的本發明之結合分子：
a)　包含SEQ ID NO:81之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:82之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:83之重鏈CDR3區域的結合分子；
b)　包含SEQ ID NO:87之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:88之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:89之重鏈CDR3區域的結合分子；
c)　包含SEQ ID NO:103之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:104之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:105之重鏈CDR3區域的結合分子；
d)　包含SEQ ID NO:109之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:110之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:111之重鏈CDR3區域的結合分子；
e)　包含SEQ ID NO:115之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:116之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:117之重鏈CDR3區域的結合分子；
f)　包含SEQ ID NO:121之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:122之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:123之重鏈CDR3區域的結合分子；
g)　包含SEQ ID NO:126之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:127之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:128之重鏈CDR3區域的結合分子；
h)　包含SEQ ID NO:132之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:133之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:134之重鏈CDR3區域的結合分子；
i)　包含SEQ ID NO:138之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:139之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:140之重鏈CDR3區域的結合分子；
j)　包含SEQ ID NO: 144之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:145之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:146之重鏈CDR3區域的結合分子；
k)　包含SEQ ID NO:150之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:151之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:152之重鏈CDR3區域的結合分子；
l)　包含SEQ ID NO:156之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:157之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:158之重鏈CDR3區域的結合分子；
m)　包含SEQ ID NO:162之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:163之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:164之重鏈CDR3區域的結合分子；
n)　包含SEQ ID NO:168之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:169之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:170之重鏈CDR3區域的結合分子；
o)　包含SEQ ID NO:173之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:174之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:175之重鏈CDR3區域的結合分子；及
p)　包含SEQ ID NO:179之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:180之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:181之重鏈CDR3區域的結合分子。
在一個較佳實施例中，本發明之結合分子可用作藥物且較佳用於流感感染之診斷性、治療性及/或預防性處理。引起流感感染且可用本發明之結合分子治療的流感病毒較佳為流感病毒亞型H3N2。本發明亦係關於一種包含本發明之結合分子及醫藥學上可接受之賦形劑的醫藥組合物。
在又一實施例中，本發明係關於本發明之結合分子之用途，其係用於製備用以診斷、預防及/或治療流感病毒感染之藥物。該等感染可在小群體內發生，但亦可以季節性流行病形式，或更糟地以全球大流行病形式在全世界傳播，其中數百萬個體處於風險之中。本發明提供可中和引起該季節性流行病以及潛在大流行病之流感病毒株感染的結合分子。重要的是，藉由本發明之結合分子，現可預見與各種流感亞型相關之保護及治療，因為已揭示本發明之結合分子能夠交叉中和系統發生群2中之各種流感亞型，包括亞型H3、H7及H10。
在一個較佳實施例中，本發明之人類結合分子之特徵在於該等人類結合分子係選自由以下組成之群：
a)　包含SEQ ID NO:81之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:82之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:83之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:84之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:85之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:86之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
b)　包含SEQ ID NO:87之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:88之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:89之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:90之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:91之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:92之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
c)　包含SEQ ID NO:87之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:88之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:89之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:93之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:94之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:95之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
d)　包含SEQ ID NO:87之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:88之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:89之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:96之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:97之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:98之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
e)　包含SEQ ID NO:87之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:88之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:89之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:99之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:100之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:101之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
f)　包含SEQ ID NO:87之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:88之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:89之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:102之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:85之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:86之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
g)　包含SEQ ID NO:103之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:104之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:105之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:106之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:107之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:108之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
h)　包含SEQ ID NO:109之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:110之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:111之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:112之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:113之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:114之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
i)　包含SEQ ID NO:115之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:116之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:117之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:118之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:119之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:120之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
j)　包含SEQ ID NO:121之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:122之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:123之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:124之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:119之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:125之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
k)　包含SEQ ID NO:126之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:127之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:128之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:129之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:130之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:131之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
l)　包含SEQ ID NO:132之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:133之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:134之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:135之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:136之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:137之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
m)　包含SEQ ID NO:138之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:139之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:140之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:141之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:142之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:143之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
n)　包含SEQ ID NO:144之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:145之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:146之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:147之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:148之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:149之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
o)　包含SEQ ID NO:150之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:151之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:152之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:153之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:154之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:155之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
p)　包含SEQ ID NO:156之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:157之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:158之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:159之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:160之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:161之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
q)　包含SEQ ID NO:162之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:163之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:164之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:165之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:166之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:167之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
r)　包含SEQ ID NO:168之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:169之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:170之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:171之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:172之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:137之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
s)　包含SEQ ID NO:173之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:174之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:175之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:176之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:177之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:178之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子；
及
t)　包含SEQ ID NO:179之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO:180之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO:181之重鏈CDR3區域、具有SEQ ID NO:182之胺基酸序列之輕鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:183之胺基酸序列之輕鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:184之胺基酸序列之輕鏈CDR3區域的結合分子。
在一個特定實施例中，本發明之結合分子係選自由以下組成之群：包含具有SEQ ID NO:81之胺基酸序列之重鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:82之胺基酸序列之重鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:83之胺基酸序列之重鏈CDR3區域的結合分子；包含具有SEQ ID NO:109之胺基酸序列之重鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:110之胺基酸序列之重鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:111之胺基酸序列之重鏈CDR3區域的結合分子；包含具有SEQ ID NO:138之胺基酸序列之重鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:139之胺基酸序列之重鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:140之胺基酸序列之重鏈CDR3區域的結合分子；包含具有SEQ ID NO:144之胺基酸序列之重鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:145之胺基酸序列之重鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:146之胺基酸序列之重鏈CDR3區域的結合分子；及包含具有SEQ ID NO:173之胺基酸序列之重鏈CDR1區域、具有SEQ ID NO:174之胺基酸序列之重鏈CDR2區域及具有SEQ ID NO:175之胺基酸序列之重鏈CDR3區域的結合分子。
本發明之結合分子之CDR區域展示於表1中。CDR區域與Kabat等人(1991)如在Sequences of Proteins of Immunological Interest中所描述一致。在本發明之一實施例中，結合分子可包含1、2、3、4、5或所有6個如本文中揭示之CDR區域。本發明之結合分子較佳包含至少兩個如本文中揭示之CDR。
在又一實施例中，本發明之結合分子包含一重鏈可變區，該重鏈可變區包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:74及SEQ ID NO:78。在另一實施例中，本發明之結合分子包含一輕鏈可變區，該輕鏈可變區包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:76及SEQ ID NO:80。
本發明之另一態樣包括如本文中定義之結合分子之功能變異體。若某些分子能夠與「親本」或「參考」結合分子競爭與流感病毒H3N2或其片段特異性結合，則該等變異分子可視為本發明之結合分子之功能變異體。換言之，在功能變異體仍然能夠與流感病毒H3N2或其片段之同一或重疊抗原決定基結合時則如此。為了達成本申請案之目的，「親本」及「參考」可用作同義詞，意謂參考或親本分子之資訊，或實體分子自身可形成變異之基礎。功能變異體較佳能夠競爭與至少兩種(或兩種以上)可由參考結合分子特異性結合之不同流感病毒H3N2病毒株或其片段特異性結合。此外，若分子對流感病毒H3N2，較佳對至少兩種(或兩種以上)流感病毒H3N2病毒株(親本結合分子對該等流感病毒H3N2病毒株呈現中和活性)具有中和活性，則該等分子被視為本發明之結合分子之功能變異體。功能變異體包括(但不限於)在主要結構序列方面實質上類似之衍生物，包括在Fc受體或與效應功能相關之其他區域中具有修飾及/或含有例如未在親本結合分子中發現之活體外或活體內化學及/或生化修飾的衍生物。該等修飾尤其包括乙醯化、醯化、核苷酸或核苷酸衍生物之共價連接、脂質或脂質衍生物之共價連接、交聯、二硫鍵形成、糖基化、羥基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化及其類似修飾。
或者，功能變異體可為包含與親本結合分子之胺基酸序列相比含有一或多個胺基酸之取代、插入、缺失或其組合之胺基酸序列的如本發明中定義之結合分子。此外，功能變異體可包含胺基或羧基末端中之任一者或兩者處的胺基酸序列之截短。本發明之功能變異體與親本結合分子相比可具有相同或不同(較高或較低)結合親和力，但仍然能夠與流感病毒H3N2或其片段結合。舉例而言，本發明之功能變異體與親本結合分子相比對流感病毒H3N2或其片段可具有增加或降低之結合親和力。較佳的是，可變區(包括(但不限於)構架區、高變區，尤其CDR3區域)之胺基酸序列經修飾。通常，輕鏈及重鏈可變區包含三個高變區，該等高變區包含三個CDR；及更多保守區，所謂構架區(FR)。高變區包含來自CDR之胺基酸殘基及來自高變環之胺基酸殘基。意欲屬於本發明之範疇的功能變異體與如本文中定義之親本結合分子具有至少約50%至約99%、較佳至少約60%至約99%、更佳至少約70%至約99%、甚至更佳至少約80%至約99%、最佳至少約90%至約99%、尤其至少約95%至約99%且尤其至少約97%至約99%的胺基酸序列同源性。可使用熟習此項技術者已知的尤其諸如Gap或Bestfit之電腦演算法來最佳比對欲比較之胺基酸序列及定義類似或相同胺基酸殘基。可藉由使用此項技術中已知之一般分子生物學方法(包括(但不限於)易錯PCR、寡核苷酸引導之突變誘發、定點突變誘發及重鏈及/或輕鏈改組)改變親本結合分子或其部分來獲得功能變異體。在一實施例中，本發明之功能變異體對流感病毒H3N2具有中和活性。中和活性與親本結合分子相比可相同或較高或較低。此後，當使用術語「(人類)結合分子」時，其亦涵蓋(人類)結合分子之功能變異體。
在又一態樣中，本發明包括免疫接合物，亦即包含至少一種如本文中定義之結合分子且進一步包含至少一個標籤(尤其諸如可偵測部分/藥劑)之分子。本發明亦涵蓋本發明之免疫接合物之混合物、或至少一種本發明之免疫接合物與另一分子(諸如治療劑或另一結合分子或免疫接合物)之混合物。在另一實施例中，本發明之免疫接合物可包含一個以上標籤。此等標籤可彼此相同或不同且可與結合分子非共價結合/接合。標籤亦可經由共價結合與人類結合分子直接結合/接合。或者，標籤可藉助於一或多種連接化合物與結合分子結合/接合。用於使標籤與結合分子接合之技術為熟習此項技術者所熟知。
本發明之免疫接合物之標籤可為治療劑，但其亦可為可偵測部分/藥劑。適用於療法及/或預防之標籤可為毒素或其功能部分、抗生素、酶、其他可增強吞噬作用或免疫刺激之結合分子。可診斷性地使用包含可偵測藥劑之免疫接合物來例如評估個體是否已感染流感病毒H3N2病毒株或監視流感病毒H3N2感染之發展或進程，從而作為臨床試驗程序之一部分來例如測定既定治療療法之功效。然而，其亦可用於其他偵測及/或分析及/或診斷目的。可偵測部分/藥劑包括(但不限於)酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射性物質、正電子發射金屬及非放射性順磁性金屬離子。用於標記結合分子以用於偵測及/或分析及/或診斷目的之標籤視所使用之特定偵測/分析/診斷技術及/或方法而定，該等技術及/或方法尤其諸如為(組織)樣本之免疫組織化學染色、流式細胞偵測、掃描雷射細胞偵測、螢光免疫檢定、酶聯免疫吸附檢定(ELISA)、放射免疫檢定(RIA)、生物檢定(例如，吞噬作用檢定)、西方墨點應用等。適用於此項技術中已知的偵測/分析/診斷技術及/或方法之標記的選擇完全屬於熟習此項技術者之技能範圍內。
此外，本發明之人類結合分子或免疫接合物亦可附著至固體支撐物，該等固體支撐物尤其適用於流感病毒H3N2或其片段之活體外免疫檢定或純化。該等固體支撐物可為多孔或無孔的，平面或非平面的。本發明之結合分子可與標記物序列(諸如肽)融合以有助於純化。實例包括(但不限於)六組胺酸標籤、血球凝集素(HA)標籤、myc標籤或flag標籤。或者，抗體可與第二抗體接合形成抗體異接合物。在另一態樣中，本發明之結合分子可與一或多個抗原接合/連接。此等抗原較佳為可由被投與結合分子-抗原接合物之個體之免疫系統識別的抗原。該等抗原可相同，但亦可彼此不同。連接抗原與結合分子之接合方法在此項技術中已為吾人所熟知且包括(但不限於)使用交鍵劑。本發明之結合分子將與流感病毒H3N2結合且與結合分子連接之抗原將對接合物引發有力的T細胞攻擊，此將最終引起流感病毒H3N2之破壞。
緊接在以化學方法藉由經由例如連接子直接或間接接合來產生免疫接合物後，可產生呈包含本發明之結合分子及適當標籤之融合蛋白質形式的免疫接合物。可藉由此項技術中已知之方法產生融合蛋白質，例如以重組方式藉由構築包含與編碼適當標籤之核苷酸序列同框的編碼結合分子之核苷酸序列的核酸分子且接著表現該等核酸分子來產生。
本發明之另一態樣提供一種至少編碼本發明之結合分子、功能變異體或免疫接合物的核酸分子。該等核酸分子可用作中間物以用於選殖目的，例如在上述親和力成熟過程中。在一個較佳實施例中，核酸分子經分離或純化。
熟習此項技術者應瞭解，此等核酸分子之功能變異體亦意欲屬於本發明之一部分。功能變異體為可使用標準遺傳密碼直接轉譯以提供與親本核酸分子轉譯之胺基酸序列相同之胺基酸序列的核酸序列。
核酸分子較佳編碼包含如上所述之CDR區域的結合分子。在另一實施例中，核酸分子編碼包含本發明之結合分子之2、3、4、5或甚至所有6個CDR區域的結合分子。
在另一實施例中，核酸分子編碼包含一個包含如上所述可變重鏈序列之重鏈之結合分子。在另一實施例中，核酸分子編碼包含一個包含如上所述可變輕鏈序列之輕鏈之結合分子。本發明之結合分子的重鏈及輕鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列提供於下文中。
本發明之另一態樣提供載體，亦即核酸構築體，其包含一或多種本發明之核酸分子。載體可源自質體，尤其諸如F、R1、RP1、Col、pBR322、TOL、Ti等；黏質體；噬菌體，諸如λ、λ形、M13、Mu、P1、P22、Qβ、T偶數、T奇數、T2、T4、T7等；植物病毒。載體可用於選殖及/或表現本發明之結合分子，且甚至可用於基因療法目的。本發明亦涵蓋包含一或多個本發明核酸分子可操作地連接於一或多個調節表現之核酸分子的載體。載體之選擇視隨後重組程序及所用宿主而定。載體引入宿主細胞中尤其可由磷酸鈣轉染、病毒感染、DEAE-聚葡萄糖介導之轉染、脂染胺(lipofectamin)轉染或電穿孔來實現。載體可自發複製或可與整合該等載體之染色體一起複製。載體較佳含有一或多個選擇標記物。標記物之選擇可視所選宿主細胞而定，不過熟習此項技術者周知此對於本發明並不重要。標記物包括(但不限於)卡那黴素(kanamycin)、新黴素(neomycin)、嘌呤黴素(puromycin)、潮黴素(hygromycin)、勻黴素(zeocin)、單純疱疹病毒之胸苷激酶基因(HSV-TK)、小鼠之二氫葉酸還原酶基因(dhfr)。本發明亦涵蓋包含一或多個編碼如上所述之人類結合分子之核酸分子與編碼可用於分離人類結合分子之蛋白質或肽的一或多個核酸分子可操作地連接的載體。此等蛋白質或肽包括(但不限於)麩胱甘肽-S-轉移酶、麥芽糖結合蛋白、金屬結合聚組胺酸、綠色螢光蛋白質、螢光素及β-半乳糖苷酶。
含有以上所提及之載體之一或多個複本的宿主為本發明之另一標的。宿主較佳為宿主細胞。宿主細胞包括(但不限於)哺乳動物、植物、昆蟲、真菌或細菌起源之細胞。細菌細胞包括(但不限於)來自革蘭氏(Gram)陽性細菌或革蘭氏陰性細菌(諸如大腸桿菌屬(Escherichia)及假單胞菌屬(Pseudomonas)中之若干種類，諸如大腸桿菌(E. coli))之細胞。在真菌細胞群中，較佳使用酵母細胞。可藉由使用尤其諸如甲醇酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及漢森酵母(Hansenula polymorpha)之酵母菌株來達成酵母中之表現。此外，諸如來自果蠅及Sf9之細胞的昆蟲細胞可用作宿主細胞。此外，宿主細胞可為植物細胞，尤其諸如來自諸如森林植物之作物植物之細胞，或來自諸如穀類植物或藥用植物之提供食物及原材料之植物的細胞，或來自觀賞植物之細胞，或來自球莖花卉作物之細胞。藉由已知方法來產生經轉型(轉殖基因)之植物或植物細胞，該等方法例如為土壤桿菌屬(Agrobacterium)介導之基因轉移、葉盤之轉型、藉由聚乙二醇誘導之DNA轉移進行之原生質體轉型、電穿孔、音波處理、顯微注射或生物彈射擊基因轉移(bolistic gene transfer)。此外，適當表現系統可為桿狀病毒系統。使用諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、COS細胞、BHK細胞、NSO細胞或布茲(Bowes)黑素瘤細胞之哺乳動物細胞的表現系統在本發明中為較佳者。哺乳動物細胞提供具有轉譯後修飾之經表現蛋白質，其與哺乳動物起源之天然分子最類似。因為本發明係關於可向人類投與之分子，所以完全人類表現系統將尤其較佳。因此，宿主細胞甚至更佳為人類細胞。人類細胞之實例尤其為海拉(HeLa)、911、AT1080、A549、293及HEK293T細胞。在較佳實施例中，人類生產者細胞至少包含以可表現格式編碼腺病毒E1區域之核酸序列之功能部分。在甚至更佳的實施例中，該等宿主細胞係源自人類視網膜且用包含腺病毒E1序列之核酸永生化，諸如911細胞或1996年2月29日以編號96022940寄存於歐洲細胞培養物收藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC)(CAMR,Salisbury,Wiltshire SP4 OJG,Great Britain)且以商標PER.(PER.C6為Crucell Holland B.V.之註冊商標)市售的細胞株。為達成本申請案之目的，「PER.C6細胞」係指以編號96022940寄存之細胞或所寄存細胞之祖先、上游或下游子代以及祖先之子代、以及任一前述者之衍生物。可根據此項技術中熟知之方法在宿主細胞中產生重組蛋白質。使用以商標PER.市售之細胞作為相關蛋白質之產生平台已描述於WO 00/63403中，該文獻之揭示內容以全文引用方式併入本文中。
可由各種手段製備結合分子。產生本發明之結合分子的方法為本發明之另一部分。該方法包含以下步驟：a)在有助於表現結合分子之條件下培養本發明之宿主，及b)視情況回收經表現之結合分子。可自無細胞萃取物回收經表現之結合分子，但較佳自培養基回收經表現之結合分子。上述的產生方法亦可用於製備本發明之結合分子及/或免疫接合物之功能變異體。自無細胞萃取物或培養基回收蛋白質(諸如結合分子)之方法已為熟習此項技術者所熟知。可由上述方法獲得之結合分子、功能變異體及/或免疫接合物亦為本發明之一部分。
或者，緊接在宿主(諸如宿主細胞)中表現後，可以合成方式用習知肽合成器，或使用源自本發明之DNA分子之RNA核酸在無細胞轉譯系統中產生本發明之結合分子及免疫接合物。可用上述合成製備方法或無細胞轉譯系統獲得之結合分子及免疫接合物亦為本發明之一部分。
在又一實施例中，本發明之結合分子亦可在轉殖基因非人類哺乳動物(尤其諸如兔、山羊或母牛)中產生且分泌到例如其乳汁中。
在又一替代性實施例中，本發明之結合分子，較佳為與流感病毒H3N2或其片段特異性結合之人類結合分子，可由表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因非人類哺乳動物(例如轉殖基因小鼠或兔)產生。轉殖基因非人類哺乳動物較佳具有包含人類重鏈轉殖基因及人類輕鏈轉殖基因之基因組，該基因組編碼所有或一部分如上所述之人類結合分子。可使用流感病毒H3N2或其片段之經純化或增濃之製劑使轉殖基因非人類哺乳動物免疫。此項技術中已充分確立用於使非人類哺乳動物免疫之方案。參看Using Antibodies: A Laboratory Manual,E. Harlow,D. Lane編(1998),Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York及Current Protocols in Immunology,J.E. Coligan,A.M. Kruisbeek,D.H. Margulies,E.M. Shevach,W. Strober編(2001),John Wiley & Sons Inc.,New York，該等文獻之揭示內容以引用方式併入本文中。免疫方案常常包括多重免疫且使用或不使用諸如弗氏(Freund)完全佐劑及弗氏不完全佐劑之佐劑，但亦可包括裸DNA免疫。在另一實施例中，人類結合分子係由源自轉殖基因動物之B細胞、漿細胞及/或記憶細胞產生。在又一實施例中，人類結合分子係由融合瘤產生，融合瘤係藉由使自上述轉殖基因非人類哺乳動物獲得之B細胞與永生化細胞融合而製備。可自上述轉殖基因非人類哺乳動物獲得之B細胞、漿細胞及融合瘤以及可自上述轉殖基因非人類哺乳動物、B細胞、漿細胞及/或記憶細胞及融合瘤獲得之人類結合分子亦為本發明之一部分。
在另一態樣中，本發明提供一種鑑別與流感病毒H3N2特異性結合之結合分子(諸如人類結合分子，例如人類單株抗體或其片段)或編碼該等結合分子之核酸分子的方法且包含以下步驟：(a)在有助於結合之條件下使可複製遺傳包(genetic package)表面上之結合分子集合與流感病毒H3N2或其片段接觸，(b)至少選擇一次與流感病毒H3N2或其片段結合之可複製遺傳包，(c)自未與流感病毒H3N2或其片段結合之可複製遺傳包分離且回收與流感病毒H3N2或其片段結合之可複製遺傳包。如本文中使用之可複製遺傳包可為原核或真核的且包括細胞、孢子、酵母、細菌、病毒、(細菌)噬菌體、核糖體及多核糖體。較佳的可複製遺傳包為噬菌體。結合分子(例如單鏈Fv)呈現於可複製遺傳包上，亦即其被連接至位於可複製遺傳包之外表面的基團或分子。可複製遺傳包為包含欲被篩選之結合分子的可篩選單元，該結合分子與編碼該結合分子之核酸分子連接。該核酸分子應為活體內(例如，作為載體)或活體外(例如，藉由PCR、轉錄及轉譯)可複製的。活體內複製可為自發的(例如，細胞)，需藉助於宿主因子(例如，病毒)或需藉助於宿主與輔助病毒(例如，噬質體)兩者。藉由將編碼欲呈現之外源結合分子的核酸分子引入可複製遺傳包之基因組中以與通常自可複製遺傳包之外表面表現之內源蛋白質形成融合蛋白質來形成呈現結合分子之集合的可複製遺傳包。融合蛋白質之表現、傳輸至外表面及組裝引起自可複製遺傳包之外表面呈現外源結合分子。
可使用活的且仍然具有感染性的或失活的流感H3N2病毒進行本發明之方法中的選擇步驟。可藉由熟習此項技術者所熟知之病毒去活方法使流感病毒H3N2失活，該等方法尤其諸如為用福馬林、β-丙內酯(BPL)、硫柳汞及/或紫外光處理。測試流感病毒是否仍然存活、具有感染性及/或有活力或者部分或完全失活的方法已為熟習此項技術者所熟知。用於上述方法之流感病毒H3N2無需為純化形式，例如，可存在於受感染個體之血清及/或血液中。所用流感病毒H3N2亦可自適當培養基中之細胞培養物中分離得之。
在一實施例中，當與可複製遺傳包接觸時流感病毒H3N2位於懸浮液中。或者，當發生接觸時，其亦可與載劑偶合。在一實施例中，可對一種流感病毒H3N2病毒株進行第一及其他輪選擇。或者，可對不同流感病毒H3N2病毒株進行第一及其他輪選擇。或者，可在諸如細胞膜製劑、重組H3N2蛋白質或多肽、包含H3N2蛋白質或多肽之融合蛋白質、表現重組H3N2蛋白質或多肽之細胞及其類似者的流感病毒H3N2之片段存在下進行選擇步驟。此等蛋白質或多肽之細胞外曝露部分亦可用作選擇材料。流感病毒H3N2之片段可在使用前固定至適當物質或可以懸浮液形式使用。在一實施例中，可針對流感病毒H3N2之不同片段或不同流感病毒H3N2病毒株之片段進行選擇。發現適當的選擇組合完全屬於熟習此項技術者之技能範圍內。可藉由ELISA或FACS進行選擇。
在又一態樣中，本發明提供一種獲得與流感病毒H3N2病毒株或其片段特異性結合之結合分子或編碼該類結合分子之核酸分子的方法，其中該方法包含以下步驟：a)進行上述鑑別結合分子之方法，及b)自所回收之可複製遺傳包分離結合分子及/或編碼結合分子之核酸分子。可複製遺傳包表面上之結合分子集合可為scFv或Fab之集合。一旦藉由上述鑑別結合分子或編碼結合分子之核酸分子的方法建立或鑑別新scFv或Fab，則可自細菌或噬菌體分離出編碼scFv或Fab之DNA且藉由標準分子生物技術加以組合，以製備編碼scFv、二價scFv、Fab或具有所需特異性之完整人類免疫球蛋白(例如，IgG、IgA或IgM)之構築體。可將此等構築體轉染於適當細胞株中且最終可產生完整人類單株抗體(參看Huls等人，1999；Boel等人，2000)。
如前所述，較佳的可複製遺傳包為噬菌體。用於鑑別及獲得(人類)結合分子(例如(人類)單株抗體)之噬菌體呈現方法為熟習此項技術者已知的現今公認之方法。其例如描述於以下文獻中：美國專利第5,696,108號；Burton及Barbas,1994；de Kruif等人，1995b；及Phage Display: A Laboratory Manual. CF Barbas,DR Burton,JK Scott及GJ Silverman編(2001),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York。所有此等參考文獻據此以全文引用方式併入本文中。為了構築噬菌體呈現文庫，使人類單株抗體重鏈及輕鏈可變區基因之集合以例如單鏈Fv(scFv)或Fab格式表現於噬菌體(較佳為絲狀噬菌體)顆粒表面上(參看deKruif等人，1995b)。表現抗體片段之噬菌體的大文庫通常含有超過1.0×109種的抗體特異性且可自表現於經免疫或未經免疫之個體之B-淋巴細胞中的免疫球蛋白V區域組裝。在本發明之一個特定實施例中，由自獲自已接種流感病毒疫苗之個體、最近已接種不相干病原體疫苗之個體、最近罹患流感病毒H3N2感染之個體或健康個體的細胞分離之RNA製備結合分子之噬菌體文庫，較佳為scFv噬菌體文庫。可尤其自骨髓或末梢血液，較佳為末梢血液淋巴細胞或經分離之B細胞或甚至B細胞之亞群(諸如記憶B細胞，稱為CD24+/CD27+ B細胞)分離RNA。個體可為動物，較佳為人類。在一個較佳實施例中，可自由IgM記憶B細胞(稱為IgM+/CD24+/CD27+細胞)表現之免疫球蛋白V區域組裝文庫。
或者，可自已經活體外部分組裝之免疫球蛋白可變區構築噬菌體呈現文庫以便向文庫中引入其他抗體多樣性(半合成文庫)。舉例而言，活體外組裝之可變區在對抗體特異性重要之彼等分子區域(例如CDR區域)中含有若干段合成產生、隨機化或部分隨機化的DNA。對流感病毒H3N2具特異性之噬菌體抗體可藉由使病毒或其片段曝露於噬菌體文庫以允許結合表現對病毒或其片段具特異性之抗體片段之噬菌體而自文庫中選出。藉由洗滌移除未結合噬菌體且溶離結合噬菌體以供感染細菌大腸桿菌及後續繁殖之用。通常需要多輪選擇及繁殖以便充分增濃與病毒或其片段特異性結合之噬菌體。若有需要，則可在使噬菌體文庫曝露於病毒或其片段之前，首先藉由使噬菌體文庫曝露於非目標物質(諸如不同病毒株之病毒或其片段，亦即非H3N2流感病毒)來縮減噬菌體文庫。此等縮減病毒或其片段可與固相結合或可呈懸浮液形式。亦可選擇與複合抗原(諸如視情況補充有其他物質之H3N2蛋白質或(多)肽之複合混合物)結合的噬菌體。表現流感病毒H3N2之一或多種蛋白質或(多)肽之宿主細胞亦可用於選擇目的。可藉由在篩選期間經由添加過量不含目標分子或包含與目標分子類似但不相同之非目標分子的宿主細胞除去非相關結合物來擴展及改良使用此等宿主細胞之噬菌體呈現方法，且藉此大幅提高發現相關結合分子之可能性。當然，可在以病毒或其片段進行篩選之前、期間或之後進行縮減。該方法稱為方法(為Crucell Holland B.V.之註冊商標，亦參看美國專利案第6,265,150號，其以引用方式併入本文中)。
在又一態樣中，本發明提供一種獲得對流感病毒H3N2可能具有中和活性之結合分子的方法，其中該方法包含以下步驟：(a)進行上述獲得與流感病毒H3N2或其片段特異性結合之結合分子或編碼該類結合分子之核酸分子的方法，及(b)檢驗所分離之結合分子對病毒，較佳對至少一或多種選自由A/Hong Kong/1/68、A/Johannesburg/33/94、A/Panama/2007/99、A/Wisconsin/67/2005及A/Hiroshima/52/2005組成之群的流感病毒H3N2病毒株，較佳為所有H3N2病毒株，尤其所有已知及未來發現之H3N2病毒株是否具有中和活性。用於檢驗結合分子是否具有中和活性之檢定在此項技術中已為吾人所熟知(參看WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance,Geneva: World Health Organisation,2005 2002.5版)。
在另一態樣中，本發明係關於一種人類結合分子，其可由上述方法之一獲得且至少對包含H3亞型之HA的A型流感病毒具有中和活性。
在又一態樣中，本發明提供包含至少一種本發明之結合分子(較佳為人類單株抗體)、至少一種該結合分子之功能變異體、至少一種本發明之免疫接合物及/或其組合的組合物。除此以外，該等組合物可尤其包含穩定分子，諸如白蛋白或聚乙二醇，或鹽。所用鹽較佳為保留結合分子之所需生物活性且不會賦予任何不良毒物學效應的鹽。可在必要時將本發明之人類結合分子塗佈於物質中或物質上以保護該等人類結合分子免受酸或會使結合分子失活之其他天然或非天然條件之作用。
在又一態樣中，本發明提供包含至少一種如本發明中定義之核酸分子的組合物。該等組合物可包含水溶液，諸如含有鹽(例如NaCl或如上所述之鹽)、清潔劑(例如，SDS)及/或其他適當組分之水溶液。
此外，本發明係關於包含至少一種本發明之結合分子(諸如人類單株抗體)(或其功能性片段或變異體)、至少一種本發明之免疫接合物、至少一種本發明之組合物或其組合的醫藥組合物。本發明之醫藥組合物進一步包含至少一種醫藥學上可接受之賦形劑。醫藥學上可接受之賦形劑已為熟習此項技術者所熟知。本發明之醫藥組合物可進一步包含至少一種其他治療劑。適當治療劑亦為熟習此項技術者所熟知。
在一個較佳實施例中，本發明之醫藥組合物包含至少一種其他結合分子，亦即該醫藥組合物可為結合分子之混雜物或混合物。醫藥組合物可包含至少兩種本發明之結合分子，或至少一種本發明之結合分子及至少一種其他流感病毒結合及/或中和分子。在另一實施例中，可調配其他結合分子以用於同時獨立或連續投藥。
在一實施例中，醫藥組合物可包含兩種或兩種以上對包含H3亞型之HA的A型流感病毒(諸如H3N2)具有中和活性之結合分子。在一實施例中，結合分子在以組合形式使用時呈現協同中和活性。換言之，組合物可包含至少兩種具有中和活性之結合分子，其特徵在於該等結合分子在中和流感病毒H3N2時協同作用。如本文中使用之術語「協同」意謂結合分子在以組合形式使用時之組合效應大於其在個別使用時之疊加效應。協同作用的結合分子可與流感病毒H3N2之相同或不同片段上之不同結構結合。一種計算協同作用之方法為藉助於組合指數。組合指數(CI)之概念已由Chou及Talalay(1984)描述。組合物可例如包含一種具有中和活性之結合分子及一種非中和H3N2特異性結合分子。非中和H3N2特異性結合分子及中和H3N2特異性結合分子亦可在中和流感病毒H3N2時協同作用。
在一實施例中，醫藥組合物可包含至少兩種中和流感病毒之結合分子，其中至少一種結合分子能夠中和系統發生群1中之一或多種流感病毒亞型且其中至少一種結合分子能夠中和系統發生群2中之一或多種流感病毒亞型。
在一實施例中，醫藥組合物可包含至少一種本發明之結合分子及至少一種其他中和流感病毒之結合分子。
在另一實施例中，其他中和流感病毒之結合分子較佳能夠結合至且中和不同亞型之流感病毒，較佳為包含H1之HA的流感病毒(諸如H1N1)及/或包含H5亞型之HA的流感病毒(諸如H5N1)，諸如WO 2008/028946中揭示之結合分子。甚至更佳的是，該其他結合分子為針對系統發生群1中之(所有)流感病毒亞型(包括H1、H2、H5、H9)之交叉中和結合分子。在一較佳實施例中，該其他結合分子為WO 2008/028946中稱為CR6261之結合分子，其包含包括SEQ ID NO:186之胺基酸序列之胺基酸1-121的重鏈可變區，或其功能變異體，及/或包含SEQ ID NO:188之胺基酸1-112之輕鏈可變區。在又一實施例中，結合分子包含分別包含SEQ ID NO:186及sEQ ID NO:188之胺基酸序列的重鏈及輕鏈。因此醫藥組合物中之結合分子較佳能夠與不同亞型之流感病毒反應。結合分子應具有高親和力且應具有廣泛特異性。較佳的是，兩種結合分子均為交叉中和分子，因為其各自中和不同亞型之流感病毒。此外，其較佳能中和儘可能多的各不同流感病毒亞型之病毒株。
本發明之醫藥組合物可進一步包含至少一種其他治療劑、預防劑及/或診斷劑。醫藥組合物較佳包含至少一種其他預防劑及/或治療劑。該等其他治療劑及/或預防劑較佳為能夠預防及/或治療流感病毒H3N2感染及/或由該類感染引起之病狀的藥劑。治療劑及/或預防劑包括(但不限於)抗病毒劑。該等藥劑可為結合分子、小分子、有機或無機化合物、酶、聚核苷酸序列、抗病毒肽等。其他當前用於治療感染流感病毒H3N2之患者的藥劑為M2抑制劑(例如，阿曼替丁、瑞曼他丁)及/或神經胺酸酶抑制劑(例如，紮那米韋、奧司他韋)。此等藥劑可與本發明之結合分子以組合形式使用。「以組合形式」在本文中意謂以獨立調配物形式或以一種單一組合調配物形式同時投與，或根據相繼投藥方案以獨立調配物形式以任何次序投與。處於實驗階段的能夠預防及/或治療流感病毒H3N2感染及/或由該類感染引起之病狀的藥劑亦有可能用作適用於本發明之其他治療劑及/或預防劑。
在用於人類前，可在適當的動物模型系統中測試本發明之結合分子或醫藥組合物。該等動物模型系統包括(但不限於)小鼠、白鼬及猴。
通常，醫藥組合物在製造及儲存條件下須為無菌且穩定的。本發明之結合分子、免疫接合物、核酸分子或組合物可呈適於在傳遞前或在傳遞時用適當的醫藥學上可接受之賦形劑復原的散劑形式。在用於製備無菌可注射溶液之無菌散劑的情況下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，得到活性成分加上任何其他所需成分的來自其先前經無菌過濾之溶液之散劑。
或者，本發明之結合分子、免疫接合物、核酸分子或組合物可呈溶液形式且可在傳遞前或在傳遞時添加及/或混合適當的醫藥學上可接受之賦形劑以提供單位劑量的可注射形式。本發明所用之醫藥學上可接受之賦形劑較佳適用於高藥物濃度、可保持恰當的流動性且在必要時可延遲吸收。
醫藥組合物之最佳投藥途徑之選擇將受若干因素影響，包括組合物內活性分子之物理化學性質、臨床情形之緊急性及活性分子之血漿濃度與所需治療效果之關係。舉例而言，本發明之結合分子可在必要時用能保護其免於快速釋放之載劑來配製，諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼片及微囊封傳遞系統。尤其可使用生物可降解、生物相容性聚合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。此外，可能必需用能防止人類結合分子失活之物質或化合物塗佈結合分子或與結合分子共同投與。舉例而言，可用適當載劑(例如，脂質體或稀釋劑)向個體投與結合分子。
投藥途徑可分為兩種主要類別：口服及非經腸投藥。較佳投藥途徑為靜脈內投藥或吸入投藥。
口服劑型可尤其調配為錠劑、糖衣錠、口含錠、水性或油性懸浮液、可分散散劑或顆粒、乳液、硬膠囊、軟明膠膠囊、糖漿或酏劑、丸劑、糖衣藥丸、液體、凝膠或漿液。此等調配物可含有醫藥賦形劑，包括(但不限於)惰性稀釋劑、成粒劑及崩解劑、黏合劑、潤滑劑、防腐劑、著色劑、調味劑或甜味劑、植物油或礦物油、濕潤劑及增稠劑。
本發明之醫藥組合物亦可經調配以用於非經腸投藥。用於非經腸投藥之調配物可尤其呈水性或非水性、等張、無菌無毒的注射或輸注溶液或懸浮液形式。該等溶液或懸浮液可包含在所用劑量及濃度下對接受者無毒之藥劑，諸如1,3-丁二醇、林格氏溶液(Ringer's solution)、漢克氏溶液(Hank's solution)、等張氯化鈉溶液、油、脂肪酸、局部麻醉劑、防腐劑、緩衝劑、增大黏度或溶解度之助劑、水溶性抗氧化劑、油溶性抗氧化劑及金屬螯合劑。
在另一態樣中，本發明之結合分子(諸如人類單株抗體)(其功能性片段及變異體)、免疫接合物、組合物或醫藥組合物可用作藥物。因此，使用本發明之結合分子、免疫接合物、組合物或醫藥組合物來診斷、治療及/或預防流感病毒H3N2感染之方法為本發明之另一部分。上述分子可尤其用於流感病毒H3N2感染之診斷、預防、治療或其組合。其適用於治療尚未接受治療之罹患流感病毒H3N2感染之患者以及已接受或正在接受流感病毒H3N2感染治療之患者。
上述分子或組合物可與其他適用於診斷、預防及/或治療之分子結合使用。其可活體外、離體或活體內使用。舉例而言，本發明之結合分子(諸如人類單株抗體)(或其功能變異體)、免疫接合物、組合物或醫藥組合物可與對抗流感病毒H3N2之疫苗(若可用時)共同投與。或者，亦可在投與本發明之分子之前或之後投與該疫苗。代替疫苗，抗病毒劑亦可與本發明之結合分子結合使用。適當的抗病毒劑如上所述。
該等分子通常以治療或診斷有效量調配於本發明之組合物及醫藥組合物中。或者，其可獨立調配及投與。舉例而言，可全身施用諸如抗病毒劑之其他分子，而本發明之結合分子則可靜脈內施用。
治療可以對H3N2感染敏感之患者群為目標。該等患者群包括(但不限於)例如老年人(例如50歲、60歲，且較佳為65歲)、幼兒(例如5歲、1歲)、住院患者及已接受抗病毒化合物治療但顯示不充分的抗病毒反應之患者。
可調節給藥方案以提供最佳的所需反應(例如，治療反應)。適當的劑量範圍可為例如0.1-100毫克/公斤體重，較佳為1-50毫克/公斤體重，較佳為0.5-15毫克/公斤體重。此外，舉例而言，可投與單一大丸劑，可隨時間投與若干分次劑量，或可根據治療情形之緊急需要所指示按比例減少或增加劑量。本發明之分子及組合物較佳為無菌的。使此等分子及組合物無菌之方法在此項技術中已為吾人所熟知。可以與對本發明之結合分子所提議類似之給藥方案投與其他適用於診斷、預防及/或治療之分子。若獨立投與其他分子，則其可在投與一或多種本發明之人類結合分子或醫藥組合物之前(例如2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、2日、3日、4日、5日、7日、2週、4週或6週前)、同時或之後(例如2分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘、30分鐘、45分鐘、60分鐘、2小時、4小時、6小時、8小時、10小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、2日、3日、4日、5日、7日、2週、4週或6週後)投與患者。通常在人類患者臨床試驗期間選出精確給藥方案。
人類結合分子及包含人類結合分子之醫藥組合物在欲作為活體內治療劑投與人類時尤其適用且常為較佳者，此係因為接受者對所投與抗體之免疫反應常常將實質上小於由投與單株鼠類、嵌合或人類化結合分子引起之反應。
在另一態樣中，本發明係關於本發明之結合分子(諸如中和型人類單株抗體)(其功能性片段及變異體)、免疫接合物、核酸分子、組合物或醫藥組合物之用途，其係用於製備供流感病毒H3N2感染之診斷、預防、治療或其組合用的藥物。
因此，包含至少一種本發明之結合分子(諸如中和型人類單株抗體)(其功能性片段及變異體)、至少一種本發明之免疫接合物、至少一種本發明之核酸分子、至少一種本發明之組合物、至少一種本發明之醫藥組合物、至少一種本發明之載體、至少一種本發明之宿主或其組合的套組亦為本發明之一部分。本發明之套組之上述組分視情況封裝於適當容器中且針對診斷、預防及/或治療指定病狀而作標記。上述組分可以水溶液(較佳為無菌水溶液)形式或以適於復原之凍乾調配物(較佳為無菌調配物)形式儲存於單位或多劑量容器中。該等容器可由各種材料(諸如玻璃或塑膠)形成且可具有無菌進入孔(舉例而言，容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。套組可進一步包含更多包含醫藥學上可接受之緩衝劑之容器。其可進一步包括自商業及使用者觀點出發所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針、注射器、用於一或多種適當宿主之培養基及在可能情況下甚至至少一種其他治療劑、預防劑或診斷劑。該等套組可伴隨有通常包括於治療、預防或診斷產品之商業包裝中的說明書，其含有關於例如適應症、用法、劑量、製造、投藥、禁忌及/或關於使用該等治療、預防或診斷產品之注意事項的資訊。
本發明之結合分子亦可有利地用作活體外偵測系統發生群2亞型流感病毒之方法中的診斷劑。因此本發明進一步係關於一種偵測樣本中之流感病毒系統發生群2亞型流感病毒的方法，其中該方法包含以下步驟：(a)使樣本與診斷有效量之本發明之結合分子(其功能性片段及變異體)或免疫接合物接觸，及(b)測定結合分子或免疫接合物是否與樣本中之分子特異性結合。樣本可為生物樣本，包括(但不限於)來自(可能)受感染之個體的血液、血清、糞便、痰液、鼻咽抽出物、支氣管灌洗物、尿液、組織或其他生物物質；或諸如水、飲料等之非生物樣本。(可能)受感染之個體可為人類個體，但亦可能使用本發明之人類結合分子或免疫接合物測試疑似流感病毒系統發生群2亞型流感病毒攜帶者之動物體內病毒之存在。可首先處理樣本以使其更適合於偵測方法。處理尤其意謂以使得病毒將崩解為諸如蛋白質、(多)肽之抗原性組分或其他抗原性片段的方式處理疑似含有及/或確實含有病毒之樣本。較佳的是，使本發明之人類結合分子或免疫接合物在允許人類結合分子與樣本中可能存在之病毒或其抗原性組分之間形成免疫複合物的條件下與樣本接觸。接著藉由適當手段偵測及量測指示樣本中病毒之存在的免疫複合物之形成(若存在時)。該等方法尤其包括同質及異質結合免疫檢定，諸如放射免疫檢定(RIA)、ELISA、免疫螢光法、免疫組織化學、FACS、BIACORE及西方墨點分析。
較佳的檢定技術，尤其對於大規模臨床篩選患者血清及血液及血液衍生產物為ELISA及西方墨點技術。ELISA測試尤其較佳。在用作此等檢定中之試劑時，本發明之結合分子或免疫接合物宜與微量滴定孔之內表面結合。本發明之結合分子或免疫接合物可與微量滴定孔直接結合。然而，可能藉由在添加本發明之結合分子或免疫接合物之前用聚離胺酸預處理該等孔來達成本發明之結合分子或免疫接合物與孔之最大結合。此外，本發明之結合分子或免疫接合物可藉由已知手段與孔共價連接。通常，使用0.01 μg/ml至100 μg/ml之間的結合分子或免疫接合物用於塗佈，不過亦可使用較高以及較低量。接著向塗有本發明之結合分子或免疫接合物的孔中添加樣本。
此外，本發明之結合分子可用於鑑別流感病毒H3N2之特異性結合結構。該等結合結構可為蛋白質及/或多肽上之抗原決定基。其可為線性的，但亦可為結構及/或構形的。在一實施例中，可藉助於PEPSCAN分析來分析結合結構(尤其參看WO 84/03564、WO 93/09872、Slootstra等人，1996)。或者，可篩選包含來自流感病毒H3N2之蛋白質之肽的隨機肽文庫中能夠與本發明之結合分子結合的肽。所發現之結合結構/肽/抗原決定基可用作疫苗且用於診斷流感病毒H3N2感染。若除蛋白質及/或多肽以外的片段由該等結合分子結合，則可藉由質譜分析術、高效液相層析術及核磁共振鑑別結合結構。
在另一態樣中，本發明提供一種篩選與流感病毒H3N2的與由本發明之人類結合分子結合之抗原決定基相同的抗原決定基特異性結合之結合分子(或其功能性片段或變異體)的方法，其中該方法包含以下步驟：(a)使欲篩選之結合分子、本發明之結合分子及流感病毒H3N2或其片段接觸，(b)量測欲篩選之結合分子是否能夠與本發明之結合分子競爭與流感病毒H3N2或其片段特異性結合。在另一步驟中，可測定所篩選之能夠競爭與流感病毒H3N2或其片段特異性結合的結合分子是否具有中和活性。能夠與本發明之結合分子競爭與流感病毒H3N2或其片段特異性結合的結合分子為本發明之另一部分。在上述篩選方法中，「與相同抗原決定基特異性結合」亦涵蓋與由本發明之結合分子結合之抗原決定基實質上或基本上相同的抗原決定基特異性結合。阻斷本發明之結合分子與流感病毒H3N2結合或與本發明之結合分子競爭與流感病毒H3N2結合的能力通常表明欲篩選之結合分子結合於與由本發明之結合分子免疫特異性識別之流感病毒H3N2上之結合位點結構上重疊的流感病毒H3N2上之抗原決定基或結合位點。或者，此可表明欲篩選之結合分子結合於與由本發明之結合分子免疫特異性識別之結合位點充分接近以便在空間上或以其他方式抑制本發明之結合分子與流感病毒H3N2結合的抗原決定基或結合位點。
一般而言，藉助於檢定量測競爭性抑制，其中將抗原組合物(亦即包含流感病毒H3N2或其片段之組合物)與參考結合分子(亦即本發明之結合分子)及欲篩選之結合分子混合。通常，欲篩選之結合分子過量存在。基於ELISA及西方墨點之方案適用於該等簡單的競爭研究。藉由使用第二物種或同型抗體，吾人將僅能夠偵測所結合的參考結合分子，其結合將由於識別實質上相同的抗原決定基之欲篩選之結合分子之存在而減少。在進行參考結合分子與任何欲篩選之結合分子之間的結合分子競爭研究時(與物種或同型無關)，吾人可首先用可偵測標記(諸如生物素、酶、放射性標記或其他標記)來標記參考結合分子以實現後續鑑別。由此等競爭檢定鑑別之結合分子(「競爭性結合分子」或「交叉反應性結合分子」)包括(但不限於)與參考結合分子(亦即本發明之結合分子)所結合之抗原決定基或結合位點結合的抗體、抗體片段及其他結合劑，以及與由參考結合分子所結合之抗原決定基充分接近以便在欲篩選之結合分子與參考結合分子之間發生競爭性結合的抗原決定基或結合位點結合的抗體、抗體片段及其他結合劑。較佳的是，本發明之競爭性結合分子在過量存在時對參考結合分子與所選目標物質之特異性結合的抑制率將為至少10%，較佳為至少25%，更佳為至少50%且最佳為至少75%-90%或甚至更高。鑑別與本發明之結合分子所結合之抗原決定基大約相同、實質上相同、基本上相同或相同之抗原決定基結合的一或多種競爭性結合分子為簡單的技術問題。當相較於參考結合分子(亦即本發明之結合分子)鑑別競爭性結合分子時，應瞭解，為了鑑別結合至與參考結合分子相同或實質上相同之抗原決定基的競爭性結合分子，在任何情況下均無需實際上測定參考結合分子及競爭性結合分子所結合之抗原決定基。進一步以以下實例及圖式說明本發明。該等實例不意欲以任何方式限制本發明之範疇。
實例 實例1 使用自記憶B細胞萃取之RNA構築scFv噬菌體呈現文庫
藉由靜脈穿刺自正常健康供體收集末梢血液於EDTA抗凝結樣本管中。如WO 2008/028946中所描述獲得scFv噬菌體呈現文庫，該案以引用方式併入本文中。自天然B細胞(CD24+/CD27-)及記憶T細胞(CD24-/CD27+)分離記憶B細胞(CD24+/CD27+)，且在下一步驟中，使用IgM表現自轉換記憶B細胞(IgM-)分離IgM記憶B細胞(IgM+)。自所製備之IgM記憶B細胞及cDNA分離RNA。
使用表1及表2中所示之引子組，應用一種兩輪PCR擴增方法自各別供體譜系分離免疫球蛋白VH及VL區域。
使用表1中所提及之引子組對各別cDNA進行第一輪擴增，分別針對VH、VK及Vλ區域產生具有約650個鹼基對之7、6及9種產物。對於IgM記憶B細胞VH區域擴增，將OCM恆定引子與OH1至OH7組合使用。第一輪擴增之熱循環程式為：2分鐘96℃(變性步驟)，30秒96℃/30秒55℃/60秒72℃之30次循環，10分鐘72℃最終伸長及4℃冷凍。將產物裝載於凝膠萃取管柱(Qiagen)上且自1%瓊脂糖凝膠分離，並用50 μl 1 mM Tris-HCl pH 8.0溶離。使用表2中所提及之引子對10%第一輪產物(5 μl)進行第二輪擴增。使此等引子延伸有限制性位點，從而使各別VL及VH區域能夠定向選殖到噬菌體呈現載體PDV-C06中。第二輪擴增之PCR程式如下：2分鐘96℃(變性步驟)，30秒96℃/30秒60℃/60秒72℃之30次循環，10分鐘72℃最終伸長及4℃冷凍。首先根據免疫球蛋白基因產物中發現之J片段之天然存在率合併第二輪產物(約350個鹼基對)，分別對於VH、VK及Vλ可變區產生7、6及9種池(參看表3及表4)。為獲得免疫文庫中免疫球蛋白序列之正規化分佈，根據表3中所示之百分比混合6種VK及9種Vλ輕鏈池。用SalI及NotI限制酶消化此單一最終的VL池(3 μg)隔夜，裝載於Qiagen凝膠萃取管柱上且自1.5%瓊脂糖凝膠分離(約350個鹼基對)，並如下接合於SalI-NotI切割PDV-C06載體(約5000個鹼基對)中：10 μl PDV-C06載體(50 ng/μl)、7 μl VL插入物(10 ng/μl)、5 μl 10X接合緩.衝液(NEB)、2.5 T4 DNA連接酶(400 U/μl)(NEB)、25.5 μl超純水(載體與插入物比率為1:2)。在16℃水浴中進行接合隔夜。接著，添加水使體積加倍，用等體積苯酚-氯仿-異戊醇(75：24：1)(Invitrogen)萃取，接著用氯仿(Merck)萃取且在-20℃下用1 μl Pellet Paint(Novogen)、10 μl乙酸鈉(3 M，pH 5.0)及100 μl異丙醇促使沈澱，持續2小時。隨後在4℃下以20.000xg離心分離所得樣本30分鐘。用70%乙醇洗滌所得沈澱且在室溫下以20.000xg離心分離10分鐘。藉由真空抽吸移除乙醇且風乾離心塊歷時若干分鐘，接著溶解於含有10 mM Tris-HCl(pH 8.0)之50 μl緩衝液中。使用設定為1.7 kV、200 Ohm、25 μF(時間常數為約4.5 msec)之Genepulser II裝置(Biorad)，在經冷卻之0.1 cm電穿孔小槽(Biorad)中，使用1 μl接合混合物來使40 μl TG-1電感受態細胞(Stratagene)轉型。在脈衝之後，立即在37℃下用含有5%(重量/體積)葡萄糖(Sigma)之1000 μl SOC培養基(Invitrogen)自小槽沖洗出細菌且轉移至15 ml圓底培養管中。再使用500 μl SOC/葡萄糖自小槽沖洗出殘餘細菌且添加至該培養管中。藉由在220 rpm之振盪培養箱中在37℃下培養剛好1小時來回收細菌。將經轉型之細菌塗於含有補充有50 μg/ml安比西林(ampicillin)及5%(重量/體積)葡萄糖(Sigma)之200 ml 2TY瓊脂(16 g/l細菌用胰化蛋白腖，10 g/l細菌用酵母抽提物，5 g/l NaCl，15 g/l瓊脂，pH 7.0)的大型240 mm正方形皮氏培養皿(petridish)(NUNC)上。將1:1000稀釋物塗於含有相同培養基之15 cm皮氏培養皿上以用於計數目的。繼續重複此轉型程序20次且將完整文庫塗於總共三十個大型正方形皮氏培養皿上且在37℃培養爐中生長隔夜。通常，使用上述方案可獲得約1×107個cfu。藉由經板將細菌輕輕地刮入10 ml 2TY培養基中而自板獲得中間VL輕鏈文庫。藉由OD600量測測定細胞塊且根據製造商說明書使用兩個P500 maxiprep管柱(Qiagen)使用2×500 OD之細菌來製備大量質體DNA。
與VL可變區類似，首先將第二輪VH-JH產物混合在一起以獲得一般J片段使用的分佈(參看表4)，產生稱為PH1至PH7之7個VH子池。使用表4中所示之百分比混合各池以獲得正規化序列分佈，得到一個VH部分，其經SfiI及XhoI限制酶消化且接合於如上所述獲得之SfiI-XhoI切割PDV-VL中間文庫中。TG1之接合的建立、純化方法、後續轉型及細菌之獲取完全如關於VL中間文庫所述(參看上文)。使用側接插入VH-VL區域之引子組藉由群落PCR檢驗最終文庫(約5×106個cfu)之插入頻率。超過95%之群落顯示恰當長度的插入(參看表5)。群落PCR產物用於後續DNA序列分析以檢驗序列變化及評估顯示完整ORF之群落之百分比。此百分比通常高於70%(參看表5)。亦分析V基因突變之頻率。在50個序列中，47個(94%)不呈指示成熟過程的生殖系構型且與用作文庫RNA源的B細胞之記憶表型一致。最終，藉由使用CT輔助噬菌體援救及擴增文庫(參看WO 02/103012)且藉由下文描述之淘選方法用於噬菌體抗體選擇。
實例2 攜帶針對A亞型流感H3及H7及B型流感之單鏈Fv片段之噬菌體的選擇
使用基本上如上所述而建構之抗體噬菌體呈現文庫以及基本上如美國專利案第6,265,150號及WO 98/15833(該兩者均以引用方式併入本文中)中所描述之一般噬菌體呈現技術及技術選擇抗體片段。此外，本發明中使用如WO 02/103012(其以引用方式併入本文中)中描述之方法及輔助噬菌體。
對A亞型流感H3(A/Wisconsin/67/2005)及H7(A/Netherlands/219/2003)或B型流感之重組血球凝集素(HA)進行選擇。用PBS稀釋HA抗原(5.0 μg/ml)，添加至MaxiSorpTM Nunc-Immuno管(Nunc)中且在轉輪上於4℃下培育隔夜。倒空免疫管(immunotube)且在阻斷緩衝液(含2%脫脂乳粉(ELK)之PBS)中洗滌3次。隨後，用阻斷緩衝液完全填充免疫管且在室溫下培育1-2小時。在室溫下在補充有10%非熱失活胎牛血清及2%小鼠血清之阻斷緩衝液中阻斷噬菌體呈現文庫之等分試樣(500-1000 μl，0.5×1013至1×1013個cfu，使用CT輔助噬菌體擴增(參看WO 02/103012))1-2小時。向免疫管添加經阻斷之噬菌體文庫，在室溫下培育2小時且用洗滌緩衝液(含0.05%(體積/體積)Tween-20之PBS)洗滌以移除未結合之噬菌體。藉由在室溫下與1 ml 100 mM三乙胺(TEA)一起培育10分鐘而自各別抗原溶離結合之噬菌體。隨後，使經溶離噬菌體與0.5 ml 1 M Tris-HCl pH 7.5混合以中和pH值。使用此混合物來感染已在37℃下生長至約0.3之OD 600 nm的5 ml XL1-藍大腸桿菌培養物。允許在37℃下用噬菌體感染XL1-藍細菌30分鐘。接著，在室溫下以3000xg離心分離混合物10分鐘且使細菌離心塊再懸浮於0.5 ml 2-胰化蛋白酵母萃取物(2TY)培養基中。將所得細菌懸浮液分配於2個補充有四環素、安比西林及葡萄糖之2TY瓊脂板上。在37℃下培育各板隔夜後，自板刮落群落且用於製備經增濃之噬菌體文庫，此基本上如De Kruif等人(1995a)及WO 02/103012所描述。簡言之，使用所刮落細菌接種含有安比西林、四環素及葡萄糖之2TY培養基且在37℃之溫度下生長至約0.3之OD 600 nm。添加CT輔助噬菌體且感染細菌，接著將培養基更換為含有安比西林、四環素及卡那黴素之2TY。繼續在30℃下培育隔夜。次日，藉由離心分離自2TY培養基移除細菌，接著使用聚乙二醇(PEG)6000/NaCl沈澱培養基中之噬菌體。最終，用2 ml含1%牛血清白蛋白(BSA)之PBS溶解噬菌體，過濾滅菌且用於下一輪選擇。對相同HA亞型或對不同亞型之HA進行第二輪選擇。
在分離個別單鏈噬菌體抗體前進行連續兩輪選擇。第二輪選擇後，使用個別大腸桿菌群落製備單株噬菌體抗體。基本上，使個別群落以96孔板格式生長至對數期且用VCS-M13輔助噬菌體感染，接著進行噬菌體抗體產生隔夜。含有噬菌體抗體之上清液直接在ELISA中用於與HA抗原結合。或者，噬菌體抗體經PEG/NaCl沈澱及過濾滅菌以用於ELISA及流動式細胞量測分析。
實例3 H A特異性單鏈噬菌體抗體之驗證
用ELISA驗證上述篩選中獲得之所選含有單鏈噬菌體抗體之上清液的特異性，亦即與不同HA抗原之結合。為達成此目的，向MaxisorpTM ELISA板塗佈桿狀病毒表現之重組H3(A/Wisconsin/67/2005)、H7(A/Netherlands/219/2003)及B(B/Ohio/01/2005)HA(Protein Sciences,CT,USA)。塗佈後，用含有0.1% v/v Tween-20之PBS洗滌板3次且在室溫下在含有3% BSA或2% ELK之PBS中阻斷1小時。在含有4% ELK之等體積PBS中培育所選單鏈噬菌體抗體1小時以獲得經阻斷之噬菌體抗體。倒空板，用PBS/0.1% Tween-20洗滌3次且將經阻斷之單鏈噬菌體抗體添加至孔中。進行培育1小時，用PBS/0.1% Tween-20洗滌板且用與過氧化酶接合之抗M13抗體偵測(使用OD 492 nm量測)結合之噬菌體抗體。作為對照，同時在無單鏈噬菌體抗體情況下及用不相干陰性對照單鏈噬菌體抗體執行程序。自藉由IgM記憶B細胞文庫對不同HA抗原所作之選擇，獲得6種對重組H3 HA及H7 HA兩者具特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-001、SC08-003、SC08-006、SC08-014、SC08-017及SC08-018)。此外，分離出2種對重組H3 HA具特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-015及SC08-016)及5種對重組H7 HA具特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-007、SC08-009、SC08-010、SC08-011及SC08-013)。參看表6。
或者，使用經PEG/NaCl沈澱及過濾滅菌之噬菌體抗體來驗證ELISA結合及特異性。為達成此目的，向MaxisorpTM ELISA板塗佈桿狀病毒表現之重組A型流感H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisconsin/67/2005)、H5(A/Vietnam/1203/2004)、H7(A/Netherlands/219/2003)及B型流感(B/Ohio/01/2005、B/Malaysia/2506/2004、B/Jilin/219/2003)HA(Protein Sciences,CT,USA)。塗佈後，用含有0.1% v/v Tween-20之PBS洗滌板3次且在室溫下在含有3% BSA或2% ELK之PBS中阻斷1小時。在含有4% ELK之等體積PBS中培育所選單鏈噬菌體抗體1小時以獲得經阻斷之噬菌體抗體。倒空板，用PBS/0.1% Tween-20洗滌3次且將經阻斷之單鏈噬菌體抗體添加至孔中。進行培育1小時，用PBS/0.1% Tween-20洗滌板且用與過氧化酶接合之抗M13抗體偵測(使用OD 492 nm量測)結合之噬菌體抗體。作為對照，同時在無單鏈噬菌體抗體情況下及用陰性對照單鏈噬菌體抗體執行程序。自藉由IgM記憶B細胞文庫對不同HA抗原所作之選擇，獲得2種對重組H1、H3及H7 HA具特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-001及SC08-014)。此外，分離出6種對重組H3HA具特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-003、SC08-006、SC08-015、SC08-016、SC08-017及SC08-018)及5種對重組H7HA具特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-007、SC08-009、SC08-010、SC08-011及 SC08-013)。參看表7。
或者，使用經PEG/NaCl沈澱及過濾滅菌之噬菌體抗體，藉由FACS分析驗證結合及特異性。為達成此目的，使全長重組A亞型流感H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)、H5(TV)、H7(A/Netherlands/219/2003)及B型流感(B/Ohio/o1/2005)HA表現於PER.C6細胞表面上。用單鏈噬菌體抗體培育細胞1小時，接著用PBS+0.1% BSA進行三個洗滌步驟。使用FITC接合之M13抗體偵測結合之噬菌體。自藉由IgM記憶B細胞文庫對不同HA抗原所作之選擇，分離出1種對A亞型流感H1、H3及H7 HA具特異性之單鏈噬菌體抗體(SC08-001)。此外，分離出6種對H3HA具特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-003、SC08-006、SC08-015、SC08-016、SC08-017及SC08-018)、4種對H7 HA具特異性之獨特單鏈噬菌體抗體(SC08-007、SC08-010、SC08-011及SC08-013)。參看表8。其中，6種噬菌體抗體(SC08-001、SC08-003、SC08-015、SC08-016、SC08-017、SC08-018)用於構築完整人類免疫球蛋白以用於進一步表徵(參看實例5)。
實例4 A型流感(H3N2)HA特異性永生化B細胞純名之選擇及驗證
除噬菌體呈現外，亦可藉由其他方法分離本發明之結合分子，例如使用永生化B細胞，此如例如WO 2007067046中所描述。用經APC標記之H3HA染色自接種疫苗之供體獲得的永生化IgM記憶細胞(CD19+/CD27+，IgD+)，且將單一細胞分選於有限稀釋培養物中。在回收及細胞擴增後，藉由固相ELISA量測H3HA分選之細胞之上清液的H1、H3及H7免疫反應性。
接著，針對結合活性及中和作用表徵目標特異性B細胞。藉由有限稀釋法選殖B細胞以產生單一純系。將純系接種於培養板中且培養細胞14天。針對與表現H1、H3、H5及H7源性HA之HA轉染293細胞結合的抗HA單株抗體之產生篩選純系之上清液。作為非特異性或背景染色之對照，使用未轉染之293細胞。
為測定上述篩選中獲得之含有IgM或IgG抗體之所選B細胞純系上清液是否能夠阻斷A型流感(H3N2)感染，進行活體外病毒中和檢定(VNA)。對MDCK細胞(ATCC CCL-34)進行VNA。在MDCK細胞培養基(補充有抗生素、20 mM Hepes及0.15%(重量/體積)碳酸氫鈉之MEM培養基(完全MEM培養基)，補充有10%(體積/體積)胎牛血清)中培養MDCK細胞。將用於檢定之病毒株H3N2(A/Wisconsin/67/2005)稀釋至5.7×103 TCID50/ml之效價(50%組織培養物感染劑量/毫升)，其中根據Spearman及Karber之方法計算效價。在一式四份的孔中在完全MEM培養基中連續2倍稀釋(1:2-1:64)IgG或IgM製劑。使25 μl各別IgG稀釋物與25 μl病毒懸浮液(100 TCID50/25 μl)混合且在37℃下培育1小時。接著一式四份地轉移懸浮液至含有含匯合MDCK培養物之50 μl完全MEM培養基之96孔板上。使用前，在MDCK細胞培養基中以3×104個細胞/孔接種MDCK細胞，生長直至細胞達到匯合，用300-350 μl PBS pH 7.4洗滌且最終向各孔添加50 μl完全MEM培養基。在37℃下培養經接種之細胞3-4天且每日針對細胞病變作用(CPE)之發展進行觀測。與陽性對照比較CPE。
在所測試之187種IgG上清液中，發現43種IgG上清液中和此檢定中所用之H3N2(A/Wisconsin/67/2005)病毒株。其中，14種IgG上清液用於如實例5中所述之人類IgG免疫球蛋白之構築。
實例5 自所選單鏈Fv及B細胞純系構築完整人類免疫球蛋白分子(人類單株抗體)
自所選特異性單鏈噬菌體抗體(scFv)純系獲得質體DNA且根據標準技術測定核苷酸及胺基酸序列，藉由用於IgG表現載體pIg-C911-HCγ1(參看SEQ ID NO:189)、pIG-C909-Cκ(參看SEQ ID NO:190)或pIg-C910-Cλ(參看SEQ ID NO:191)中之表現的限制性消化直接選殖scFv之重鏈及輕鏈可變區。藉由用於IgG表現載體pIg-C911-HCγ1(參看SEQ ID NO:190)、pIG-C909-Cκ(參看SEQ ID NO:191)或pIg-C910-Cλ(參看SEQ ID NO:192)中之表現的限制性消化直接PCR擴增及選殖B細胞純系之重鏈及輕鏈可變區。測定scFv之VH及VL基因一致性(參看Tomlinson IM等人，V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering(1997))(參看表9)。
根據熟習此項技術者已知的標準技術檢驗所有構築體之核苷酸序列。使所得編碼人類IgG1重鏈及輕鏈之表現構築體在293T細胞中以組合形式短暫表現且使用標準純化程序獲得及產生含有人類IgG1抗體之上清液。針對H3、H7或B抗原在10 μg/ml與0.003 μg/ml之間的濃度範圍內滴定人類IgG1抗體(資料未展示)。包括不相干抗體作為對照抗體。
所選免疫球蛋白分子之重鏈及輕鏈之CDR的胺基酸序列提供於表9中。重鏈及輕鏈可變區之核苷酸序列及胺基酸序列提供於下文中。免疫球蛋白包含CR6261之重鏈及輕鏈恆定區，如下文提供。
實例6 藉由H3N2結合IgG活體外中和流感病毒(病毒中和檢定)
為測定所選IgG是否能夠阻斷A型流感(H3N2)感染，進行一項活體外病毒中和檢定(VNA)。對MDCK細胞(ATCC CCL-34)進行VNA。在MDCK細胞培養基(補充有抗生素、20 mM Hepes及0.15%(重量/體積)碳酸氫鈉之MEM培養基(完全MEM培養基)，補充有10%(體積/體積)胎牛血清)中培養MDCK細胞。將用於檢定之病毒株H3N2(A/Wisconsin/67/2005)稀釋至5.7×103 TCID50/ml之效價(50%組織培養物感染劑量/毫升)，其中根據Spearman及Karber之方法計算效價。在一式四份的孔中在完全MEM培養基中連續2倍稀釋(1:2-1:512)IgG製劑(200 μg/ml)。使25 μl各別IgG稀釋物與25 μl病毒懸浮液(100 TCID50/25 μl)混合且在37℃下培育1小時。接著將懸浮液一式四份地轉移至含有含匯合MDCK培養物之50 μl完全MEM培養基之96孔板上。使用前，在MDCK細胞培養基中以3×104個細胞/孔接種MDCK細胞，生長直至細胞達到匯合，用300-350 μl PBS pH 7.4洗滌且最終向各孔添加50 μl完全MEM培養基。在37℃下培養經接種之細胞3-4天且每日針對細胞病變作用(CPE)之發展進行觀測。與陽性對照比較CPE。
對實例5之人類抗H3 HA及/或抗H7 HA抗體進行上述VNA。在此等抗體中，除CR8040、CR8052及CR8069以外的所有抗體均中和A/Wisconsin/67/2005 H3N2病毒株。表11中提供此等抗體保護MDCK培養物免於CPE所需的濃度(μg/ml)。
實例7 抗H3N2 IgG之交叉結合反應性
用ELISA驗證如上所述之H3N2中和型IgG抗體的結合特異性，亦即與不同HA抗原結合。為達成此目的，向MaxisorpTM ELISA板塗佈桿狀病毒表現之重組A型流感H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisconsin/67/2005、A/New York/55/2004、A/Wyoming/3/2003)及H7(A/Netherlands/219/2003)HA(Protein Sciences,CT,USA)。塗佈後，用含有0.1% v/v Tween-20之PBS洗滌板3次且在室溫下在含有3% BSA或2%ELK之PBS中阻斷1小時。倒空板，用PBS/0.1% Tween-20洗滌3次且將IgG抗體添加至孔中。培育進行1小時，用PBS/0.1% Tween-20洗滌板且用與過氧化酶接合之抗人類IgG抗體偵測(使用OD 492 nm量測)結合噬菌體。作為對照，使用不相干IgG CR4098。
在所選H3N2中和型抗體中，CR8001顯示與所測試之所有重組HA之異源亞型交叉結合，CR8020、CR8021、CR8041、CR8043及CR8057顯示與所有3種經測試之H3HA以及H7HA之異源亞型交叉結合。CR8003、CR8015、CR8016、CR8017、CR8018、CR8038、CR8039、CR8040、CR8049、CR8050、CR8052及CR8069顯示與所有3種經測試H3HA之交叉結合。一種抗體，即CR8019，顯示僅與H3HA中之2者結合。參看表12。
此外，使用所選H3N2中和型抗體，藉由FACS分析來測試異源亞型結合。為達成此目的，使全長重組A亞型流感H1(A/New Caledonia/20/1999)、H3(A/Wisonsin/67/2005)及H7(A/Netherlands/219/2003)HA表現於PER.C6細胞表面上。用IgG抗體培育細胞1小時，接著用PBS+0.1% BSA進行三個洗滌步驟。使用PE接合之抗人類抗體偵測結合抗體。作為對照，使用未轉染之PER.C6細胞。
在H3N2中和型抗體中，CR8001對A亞型流感H1、H3及H7 HA而非野生型PER.C6細胞顯示交叉結合活性。此外，CR8020及CR8041對H3及H7 HA兩者顯示強結合。CR8043及CR8057對H3 HA顯示強結合且對H7 HA顯示弱結合。CR8055對PER.C6細胞顯示低度背景染色。其餘13種抗體顯示僅與H3.轉染細胞結合。參看表12。
實例8 抗H3N2 IgG之交叉中和活性
為測定所選IgG是否能夠阻斷多種A型流感病毒株，進行額外活體外病毒中和檢定(VNA)。對MDCK細胞(ATCCCCL-34)進行VNA。在MDCK細胞培養基(補充有抗生素、20 mM Hepes及0.15%(重量/體積)碳酸氫鈉之MEM培養基(完全MEM培養基)，補充有10%(體積/體積)胎牛血清)中培養MDCK細胞。用於檢定之H1N1(A/New Caledonia/20/1999、A/Brisbane/59/2007及A/Solomon Islands/IVR-145)、H3N2(A/Hong Kong/1/68、A/Johannesburg/33/94、A/Panama/2000/1999、A/Hiroshima/52/2005及A/Wisconsin/67/2005)、H7N3(A/Mallard/Netherlands/12/2000)及H10(A/Chick/Germany/N/49)病毒株全部稀釋至5.7×103 TCID50/ml(50%組織培養物感染劑量/毫升)之效價，其中根據Spearman及Karber之方法計算效價。在一式四份的孔中在完全MEM培養基中連續2倍稀釋(1:2-1:512)IgG製劑(80 μg/ml)。使25 μl各別IgG稀釋物與25 μl病毒懸浮液(100 TCID50/25 μl)混合且在37℃下培育1小時。接著將懸浮液一式四份地轉移至含有含匯合MDCK培養物之50 μl完全MEM培養基之96孔板上。使用前，在MDCK細胞培養基中以3×104個細胞/孔接種MDCK細胞，生長直至細胞達到匯合，用300-350 μl PBS pH 7.4洗滌且最終向各孔添加50 μl完全MEM培養基。在37℃下培養經接種之細胞3-4天且每日針對細胞病變作用(CPE)之發展進行觀測。與陽性對照比較CPE。
在H3N2中和型抗體組中，CR8020及CR8041對所有經測試A亞型流感H3、H7及H10病毒而非H1病毒顯示異源亞型交叉中和活性。此外，CR8043對所有經測試H3及H10病毒株顯示交叉中和。CR8039、CR8041、CR8043及CR8057顯示對所有經測試H3病毒株之交叉中和。其他13種抗體對經測試H3病毒株中超過1者顯示交叉中和。參看表13。
實例9 抗H3N2抗體與HA之預融合構形結合
為測定所選IgG是否能夠與HA分子之預融合構形或融合後構形結合，進行一項活體外pH位移實驗。
為達成此目的，使全長重組A亞型流感H3(A/Wisonsin/67/2005)HA表現於PER.C6細胞表面上。為在不同結構HA構形下檢定特異反應性，在室溫下用含10 μg/ml胰蛋白酶-EDTA之DMEM處理3×105個細胞30分鐘，洗滌且在酸化PBS(pH 4.9)中培育5分鐘，洗滌且接著在室溫下在20 mM DTT存在下培育20分鐘。在各步驟時分離細胞且使未經處理之附著細胞再懸浮於0.05% EDTA中。用抗H3N2 IgG CR8001、CR8020、CR8041、CR8043及CR8057培育各處理之細胞部分30分鐘。接著用接合藻紅素之抗IgG(Southern Biotech)培育細胞30分鐘。使用FACS Calibur藉由CELLQuest Pro軟體(Becton Dickinson)分析經染色細胞。在相繼用胰蛋白酶(條紋型條柱)、pH 4.9緩衝介質(實心白色條柱)及DTT(十字型條柱)連續處理後量測IgG1與表面表現H3 rHA之FACS結合且以與未經處理之rHA(實心黑色條柱)之結合百分率表示。參看圖2。
抗體CR8001、CR8020、CR8041及CR8043在pH位移後均顯示結合有顯著的降低，表明僅在HA分子之低pH值誘導之構形變化前存在對抗原決定基之特異性。抗體CR8057僅在DTT處理後顯示結合降低，表明僅當HA1存在時可獲得對構形獨立抗原決定基之特異性。
實例10 抗H3N2抗體CR8041防止HA0裂解
為測定所選IgG是否能夠保護HA分子免於蛋白酶裂解，進行一項活體外蛋白酶易感性檢定。
為達成此目的，在37℃下對7.5 μg重組可溶A亞型流感H3(A/Wisonsin/67/2005)HA(Protein Sciences,CT,USA)進行不同pH值(4.9、5.3及8.0)處理歷時1小時。培育後，中和反應物。用0.5 μg胰蛋白酶在7.5 μg CR8041或CR8057 Fab片段存在下及不存在下消化樣本隔夜。藉由添加具有SDS之緩衝液淬滅反應物。向各樣本添加3 μl Nupage還原劑(Invitrogen)。用含4-12% BisTris凝膠之1x MOPS緩衝液處理樣本。藉由膠體藍染色劑顯現蛋白質帶(參看圖3)。不存在Fab片段時，H3 HA分子在pH 4.9或5.3而非pH 8.0下易於轉化為其蛋白酶易感性融合後形式。存在Fab片段CR8057時，在pH 4.9下H3 HA之降解不受抑制且因此構形變化不受抑制。相反，Fab CR8041之存在不僅在低pH下阻止H3 HA構形變化及降解，且亦阻止HA0 pH獨立分裂為HA1及HA2。此等結果顯示出分裂位點上或接近分裂位點之CR8041之抗原決定基。抗H3N2抗體組之競爭性實驗(結果未展示)指示CR8001、CR8020及CR8043抗體之重疊抗原決定基及類似工作機制。
實例11 本發明之結合分子之作用機制
HA醣蛋白為三聚體，其中各單體由兩個在感染期間由前驅體(HA0)之蛋白水解分裂產生的二硫鍵連接之糖聚肽(稱為HA1及HA2)組成。裂解為病毒感染性所必需的，因為需要裂解來啟動HA以進行膜融合，從而允許構形變化。
經啟動分子之活化在內體中於低pH值(pH 5與pH 6之間)下進行，且需要HA結構之廣泛變化。預融合未裂解(I)、預融合已裂解(II)及融合後HA(III)構形之3維結構示意性展示於圖4中。
活體外，可使用表面表現HA之哺乳動物細胞模擬HA分子之構形變化。首先，可藉由向細胞添加胰蛋白酶來觸發蛋白水解分裂。其次，可藉由降低pH來達成預融合至融合後構形變化。此外，可藉由添加諸如DTT之還原劑來移除分子之HA1部分。藉此且藉由在特定階段添加抗體，可研究抗體在何階段干擾感染過程。在此，用具有來自A/Wisonsin/67/2005之HA的H3 HA表現構築體轉染PER.C6細胞且進行不同處理，如實例10所描述。
對於此實驗，在胰蛋白酶裂解前首先用抗H3 mAb培育細胞且接著如上所述進行處理(參看圖5)。
根據標準方案用接合PE之抗人類抗體偵測抗H3 mAb之結合。藉由FACS分析量測螢光信號。「僅細胞」意謂在mAb與未經處理之細胞結合後獲得信號且設定為100%。如可於圖5中發現，在不同處理後mAb仍與HA結合。因為以上實例10中顯示H3 mAb CR8020、CR8041及CR8043僅與預融合狀態(亦即，在由較低pH引起之構形轉變前)結合，可推斷抗體之結合實際上至少活體外抑制胰蛋白酶裂解(亦參看實例10)且因此亦抑制引起構形變化及融合之後續步驟。結合接近受體連接位點之HA分子之HA1部分的抗體CR8057能夠在構形轉變後與HA結合，且如所預期，在藉由DTT處理破壞HA1域與HA2域之間的二硫鍵後移除HA1部分時失去。
隨後在不同活體外實驗中確認對胰蛋白酶裂解之抑制。首先，進行時程實驗以測定應使用胰蛋白酶培育H3 HA多久以達成HA0適當分裂為HA1及HA2。因此，在pH 8.0下在含有6.7 μg/mL胰蛋白酶及1% N-十二烷基-β-麥芽糖苷之4 mM Tris.HCl緩衝液中培育重組可溶解H3 HA(A/Wisconsin/67/2005；Protein Sciences,CT,USA)。在若干時間點時藉由添加1% BSA停止胰蛋白酶消化。用SDS-page凝膠(經還原)處理樣本且根據標準方法進行墨點分析。使用兔類抗H3HA多株抗體(Protein Sciences,CT,USA)偵測HA0、HA1及HA2帶。圖6顯示由還原凝膠上HA1及HA2帶之出現可證明2小時的培育足以發生接近完全的裂解。接著，用CR8020、CR8041、CR8043或CR8057培育重組可溶解H3 HA且接著在pH 8.0下經受胰蛋白酶裂解。再次在若干時間點時藉由添加1% BSA停止胰蛋白酶消化。用SDS-page凝膠(還原型)處理樣本且進行墨點分析。使用抗H3多株抗體偵測HA0、HA1及HA2帶。結果顯示所有3種mAb CR8020、CR8041及CR8043均防止活體外胰蛋白酶裂解，因為結合於抗體之H3 HA與胰蛋白酶一起培育會保護凝膠上HA之HA0形式(圖7)。相反，在相同條件下用對照mAb(CR8057)培育H3 HA引起HA0帶消失。此實驗證實實例10中關於CR8041論述之資料且將此觀測結果延伸至CR8020及CR8043抗體。因此本發明結合分子至少阻止HA0分子之胰蛋白酶裂解(至少活體外)。然而，應注意此不排除亦由CR8020、CR8041及CR8043 mAb介導額外抑制效果，CR8020、CR8041及CR8043 mAb位於感染過程中更下游處且引起對pH值誘導之構形轉變及/或融合過程之干擾。
為研究此情況是否屬實，重複上述實驗，但現僅在胰蛋白酶裂解後向表現H3HA之細胞添加抗體CR8043或抗體CR8057(作為對照)。培育後，接著如實例10所描述在低pH緩衝液中培育細胞且如所描述用DTT處理。若作用機制限於胰蛋白酶裂解之抑制，可預期mAb CR8043在pH處理後失去結合，因為吾人已在實例10中確定抗體不與HA之融合後構形結合。相反，如由圖8可見，在曝露於低pH值及後續DTT處理後仍偵測到mAb CR8043結合，表明CR8043亦至少活體外抑制pH值誘導之構形轉變。已顯示與HA之HA1區域結合的CR8057如所預期起作用且在DTT處理後HA1部分失去時不再能偵測到。
為研究抗體CR8020及CR8041是否亦能夠阻斷HA之pH值誘導之構形變化，重複上述實驗。現在在上述所有處理後，在低pH值培育前或在胰蛋白酶裂解前向表現A/Hong Kong/1/1968、A/Hong Kong/24/1985或A/Wisconsin/67/2005亞型H3HA之細胞添加抗體CR8020、CR8041及CR8043或抗體CR8057(作為對照)。如先前關於A/Wisconsin/67/2005 H3HA所示，CR8020、CR8041及CR8043僅在低pH處理前識別抗原決定基存在。此抗原決定基在此實驗中所用之三個HA中為保守的，如由圖9c中可見。若作用機制將限於胰蛋白酶裂解之抑制，可預期mAb CR8020、CR8041及CR8043在pH處理後失去已分裂HA之結合，因為吾人已在實例10中確定抗體不與HA之融合後構形結合。相反，如由圖9b可見，在曝露至低pH值及後續DTT處理後對所有3種不同H3 HA仍偵測到mAb結合，表明CR8020、CR8041及CR8043亦至少活體外抑制pH值誘導之構形轉變。已顯示與HA之高度可變HA1區域結合的CR8057不顯示與A/Hong kong/1/1968及A/Hong Kong/24/1985 HA結合。
實例12 活體外產生之逃逸突變體表明抗原決定基之位置與H3 HA中之保守序列一致
為研究CR8020、CR8041及CR8043與HA中哪一區域結合，嘗試在活體外培養物中產生逃逸突變體。在有限量單株抗體存在下在MDCK細胞培養物中繼代接種A/Hong Kong/1/1968病毒。首先，測定何種濃度抗體在用與不同量單株抗體混合之100個TCID50單元接種MDCK細胞且培育3天後引起病毒感染降低3個對數單位。在連續繼代中向接種物添加此濃度抗體且每一通道後，在不存在抗體情況下及存在不同量抗體情況下溶菌斑滴定病毒以測定病毒仍對抗體介導之中和敏感。對mAbs CR8020、CR8041及CR8043中之每一者進行此程序。可由噬菌斑檢定自各培養物分離逃逸病毒且在各者之兩種分離物中，萃取病毒RNA且用於測定HA序列。所觀測突變胺基酸如下：CR8020：兩種經分析噬菌斑中之D19N及Q27L；CR8041：兩種噬菌斑中之G33E；CR8043：一種噬菌斑中之R25M及另一種噬菌斑中之Q34R。
所有3種單株抗體在與融合肽相鄰之HA主幹區域的HA2部分中之類似區域中顯示逃逸突變。存在於此區域中NCBI流感資料庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/Database/select.cgi)中之H3N2病毒之胺基酸序列之比較顯示序列之顯著保守。表14描繪胺基酸W14與K39之間HA2區域中之序列變化，其中強調所觀測之逃逸突變。N=具有特異序列之病毒株之數目。此外，指示分離年份(年數)以及在使用H3抗體之中和實驗中測試為陽性之病毒株(Pa=A/Panama/2000/1999；Wis=A/Wisconsin/67/2005；Hs=A/Hiroshima/52/2005；HK=A/HongKong/1/1968)。在存在於資料庫中之含有所提及HA2序列之1363種H3病毒中，大多數(81%)病毒具有顯示被中和之病毒株中存在之序列。在其餘序列中，大部分序列具有被認為保守變化之胺基酸。對於其他突變，需要功能性中和測試以確定變化是否影響抗體之官能基。重要地，在逃逸病毒實驗中產生的3種胺基酸變化(R25、G33及Q34)在天然流感序列中不存在且其他兩種突變僅以組合(D19及Q27)呈現，該組合亦不存在於天然序列中。此可意謂突變對病毒適應度具有負影響。總而言之，可推斷抗體與H3亞型病毒之間高度保守之HA2上的抗原決定基相互作用，證實單株抗體之廣泛中和能力。
實例13 用於活體內實驗之單株抗體之製備
為了實現對作為潛在活體內治療抗體之IgG進行表徵及後續驗證，需要製造IgG且以足夠量純化。在25 L Wave袋中細胞中產生IgG且獲得培養物。使用蛋白質A親和層析及緩衝液交換步驟自澄清所得物純化IgG。在0.2 μm無菌過濾之前及之後，經純化之緩衝液交換IgG之單體含量均為約99%。如上文所描述，用所得不同抗體製劑進行其他活體外病毒中和檢定(VNA)。結果展示於表15中。
實例14 人類IgG單株抗體對活體內致死H3N2攻擊之預防活性
使用雌性129X1/SvJ小鼠(Jackson Labs)中之流感A/HK/1/68-MA20(H3N2)病毒在小鼠致死攻擊模型中針對預防功效測試MAb CR8020、CR8041及CR8043(MA=適應性小鼠)。自Prof.E.G. Brown,University of Ottawa,Ottawa,Ontario,Canada;Brown,E.G等人，(2001)獲得A/HK/1/68-MA20病毒。在用於小鼠實驗前，受精雞蛋中繼代一次。在開始實驗前，所有小鼠經適應環境且維持至少4天時段。
在攻擊的前1日在尾靜脈(靜脈尾骨肌)中以30、10、3及1 mg/kg靜脈內投與MAb，假定平均體重為每隻小鼠18 g且固定劑量體積為0.2 mL。接著在第0日用25 LD50A/HK/1/68-MA20(H3N2)病毒藉由鼻內接種對小鼠(每組n=8)進行攻擊。藉由滴定來自動物之接種完成後剩餘接種物之少量複製樣本來估計投與之病毒之實際劑量。用MDCK細胞測定接種物之病毒效價(TCID50/mL)。結果表明在接種物之製備或投藥期間未無意地發生病毒失活。自攻擊的前1日直至第21日研究結束，每日測定臨床症狀及體重。藉由評分系統對臨床症狀進行評分(0=無臨床徵象；1=皮毛粗糙；2=皮毛粗糙，反應性較低，在處理期間被動；3=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動；4=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當仰臥躺下時不能翻身為俯臥)。評分為4之動物接受安樂死。為在第0日分析mAb血漿含量及在第21日測定血球凝集抑制(HI)抗體之存在，在第0日即將攻擊前及感染後第21日自所有小鼠抽取血液樣本。
在2個獨立實驗中測試mAb。在每一實驗中亦使用陰性對照抗體(CR3014)組，以30 mg/kg給藥。在第一實驗中測試mAb CR8020，在第二實驗中測試mAbs CR8041及CR8043。
在適應環境期期間所有小鼠均活躍且顯得健康，不顯示疾病徵兆。圖10展示在mAb投藥後小鼠之存活率。觀測到明顯劑量-反應關係，其中以30、10或3 mg/kg之劑量投與CR8020、CR8041或CR8043之所有組顯示100%存活，而在1 mg/kg CR8020情況下，25%小鼠存活且在1 mg/kg CR8041及CR8043組中無小鼠存活。兩個對照mAb組顯示0%存活。第一實驗中，與對照組相比，mAb CR8020之投藥在所有四種測試濃度下引起存活時間之統計上顯著的差異(p<0.005；對數等級測試(Log Rank Test))。第二實驗中，與對照組相比，mAb CR8041及CR8043之投藥亦在所有四種測試濃度下引起存活時間之統計上顯著的差異(兩種mAb情況下p<0.001；對數等級測試)。
圖11展示在mAb投藥後21天研究期期間小鼠之平均體重變化。與存活率類似，體重損失與所用抗體之劑量之間存在明顯的反比關係。當抗體濃度增加時，體重損失降低，以30、10或3 mg/kg之劑量投與CR8020、CR8041或CR8043之組中之小鼠自第0日至第21日顯示約10-15%之平均體重增加，與年齡相關的體重增加一致，而在1 mg/kg組及對照mAb組中，小鼠之平均體重在研究期內下降。藉由曲線下面積(AUC)分析更詳細地分析體重變化。為達成此分析之目的，若小鼠在研究之追蹤期間死亡/接受安樂死，則最末次觀測之體重進位至第21日。簡言之，第0日之小鼠平均體重用作基線值且相對於基線測定自第0日至第21日之體重變化。AUC定義為基線上面積之總和及基線下面積之總和。藉由丹氏調整(Dunnet's adjustment)使用變異數分析比較mAb劑量組與各別對照組之平均AUC值以用於多重比較(表16)。分析顯示投與CR8020、CR8041及CR8043之3、10及30 mg/kg組之平均AUC與相應對照組統計上顯著不同(P<0.001)(表16)。當與對照組相比時，對於CR8041以及CR8043 1 mg/kg劑量組發現統計上顯著的差異(分別為p=0.004及p<0.001)。然而，由於CR8020 1 mg/kg劑量組中兩隻小鼠倖存，觀測到體重變化增加且因此當與對照組相比時不可證明統計上顯著的差異。進行其他分析以藉由使用變異數分析(使用塔氏調整(Tukey's adjustment))比較每一抗體的每抗體濃度之平均AUC值來研究體重損失降低中之劑量反應以用於多重比較(表16)。對於mAb CR8020及CR8041兩者，1 mg/kg組中之體重損失統計上顯著高於(p<0.001)各別3 mg/kg組中之體重損失，而3、10及30 mg/kg組之間不存在統計上顯著的差異(p>0.05)。對於mAb CR8043，1 mg/kg組中之體重損失統計上顯著高於3 mg/kg組(p<0.001)且3 mg/kg組之體重損失顯著高於10 mg/kg組(p<0.001)。CR8043之10 mg/kg組與30 mg/kg組之平均AUC不顯著不同(p=0.997)。
圖12展示小鼠之中值臨床分數。以30 mg/kg及10 mg/kg投與CR8020、CR8041或CR8043之小鼠不顯示任何臨床症狀，如由2項研究之21天研究期內中值臨床分數始終為0所指示。MAb 8020亦在3 mg/kg劑量組中顯示臨床分數為0，而在mAb 8041及8043之3 mg/kg劑量組中分別觀測到臨床分數增加至中值分數為1及3。在所有3種mAb之1 mg/kg劑量組中，所有組之臨床分數增加達到中值分數為4。觀測到臨床評分為4之小鼠在當天接受安樂死。CR8020 1 mg/kg劑量組中之2隻存活小鼠在研究之第7日生病且分別顯示最大臨床分數為1及3。兩隻小鼠均完全康復。CR8041及CR8043 3 mg/kg劑量組中，體重損失概況顯示與臨床分數概況類似之模式。
此等結果顯示如本文中所揭示經鑑別及開發的至少3種人類抗H3N2抗體(CR8020、CR8041及CR8043)能夠各自獨立地活體內提供對致死劑量之流感H3N2之保護。觀測到所投與之各抗體量與存活率之間的明顯劑量-反應關係。結果顯示當在感染前一天以10 mg/kg或更高劑量投與時，抗H3N2 IgG抗體CR8041及8043能夠預防小鼠中H3N2感染之臨床表現。當在感染前一天以3 mg/kg或更高劑量投與時，mAb CR8020能夠預防小鼠中H3N2感染之臨床表現。
實例15 人類IgG單株抗體對活體內致死H3N2攻擊之保護及治療活性
進行研究以測試感染後模型中本文中揭示之單株抗體(由CR8020例示)對活體內致死H3N2 A/HK/1/68-MA20流感病毒攻擊之治療效應。在攻擊的前1日(第1組：預防陽性對照)或在攻擊後第1、2、3、4、5或6日(第2-7組)在尾靜脈(靜脈尾骨肌)中以15 mg/kg向小鼠(每組n=10)靜脈內投與mAb CR8020，假定平均體重為每隻小鼠18 g且固定劑量體積為0.2 mL。第8組在攻擊後第1日接受陰性對照mAb CR3014(15 mg/kg)。接著在第0日用25 LD50(2.8對數單位TCID50)A/HK/1/68-MA20(H3N2)病毒藉由鼻內接種對小鼠進行攻擊。病毒批次及類型以及小鼠之年齡與實例14中所用相同。自攻擊的前1日直至第21日研究結束，每日測定臨床症狀及體重。
圖13A展示靜脈內投與mAb CR8020(所有組中15 mg/kg)或對照mAb(15 mg/kg)後小鼠之存活率。當在攻擊前第1日或攻擊後第1或2日投與15 mg/kg mAb CR8020時，所有動物在病毒攻擊後存活，而對照mAb組中存活率為0%。當在攻擊後第3或4日投與15 mg/kg mAb CR8020時，分別觀測到50%及10%存活。此等組中之每一組之存活時間與對照組相比統計上顯著不同(第3日組：p<0.001及第4日組p=0.002；對數等級測試)。在第5日或第6日用15 mg/kg CR8020治療之組顯示存活率為0%。第5日經處理之組或第6日經治療之組與對照組相比不存在存活時間之統計上顯著的差異(分別為p=0.648及p=0.342，對數等級測試)。
圖13B展示21天研究期期間小鼠之相對於第0日之平均體重變化。與存活率類似，體重損失與15 mg/kg mAb CR8020投藥時間之間存在明顯關係：當在較晚時間點時投與15 mg/kg mAb CR8020治療時，則體重損失增加。使用曲線下面積(AUC)分析更詳細地統計分析體重變化(表17)。對於曲線下面積分析，若小鼠在研究之追蹤期間死亡/接受安樂死，則最末次觀測之體重進位至第21日體重。簡言之，第0日之小鼠平均體重用作基線值且相對於基線測定自第0日至第21日之體重變化。AUC定義為基線上面積之總和及基線下面積之總和。
圖13C展示小鼠之中值臨床分數。在攻擊的前1日經15 mg/kg CR8020治療之小鼠中，所有小鼠均存活且在觀測週期期間不顯示任何臨床症狀。在攻擊後第1日經15 mg/kg CR8020治療之小鼠顯示100%存活，然而，10隻動物中之4隻顯示臨床症狀，達到1與3之間的最大臨床分數。在攻擊後第2日經15 mg/kg CR8020治療之動物全部存活。然而，10隻動物中之9隻顯示臨床症狀，達到最大臨床分數為2或3。在攻擊後第3日經15 mg/kg CR8020治療之動物顯示50%存活。存活者(n=5)中，所有動物顯示臨床症狀，其中最大臨床分數為3。在攻擊後第4日經15 mg/kg CR8020治療之動物中，除一隻小鼠外全部死亡。存活小鼠顯示達到最大臨床分數為2之臨床症狀。所有在治療組中存活之小鼠在第21日無症狀。
使用GENMOD程序(SAS)分析臨床分數以使模型適於重複量測，其中小鼠作為個體且用順序尺度量測資料(表18)。因為曲線具有不同圖案，因此此模型中變數「日」記錄為類變數。在其中100%小鼠存活之在攻擊的前1日及攻擊後第1日及第2日經15 mg/kg mAb CR8020治療之組中，在大部分21日研究期期間中值臨床分數與對照mAb組顯著不同(對於所有3個組p0.001)。在其中分別50%及10%小鼠存活之在攻擊後第3日或第4日經15 mg/kg mAb CR8020治療之組中，在大部分21日研究期期間中值臨床分數亦與對照mAb組顯著不同(對於兩個組p<0.05)。在攻擊後第5日或第6日經15 mg/kg mAb CR8020治療之組中，中值臨床分數僅在第3日與對照mAb組顯著不同(p0.001)。儘管統計上顯著，但不認為此差異相關。
總之，使用15 mg/kg mAb CR8020之療法在致死H3N2小鼠模型中攻擊後至多第2日提供100%保護。當在攻擊後第3日或第4日投藥時，使用15 mg/kg mAb CR8020之治療提供部分保護。當在攻擊後第5日或第6日投藥時，在致死H3N2小鼠模型中未觀測到15 mg/kg mAb CR8020之保護效果。
此等結果顯示使用針對H3N2流感病毒之單株抗體(如本文中揭示且以抗體CR8020例示)的感染後治療可在用致死劑量之H3N2流感病毒攻擊後拯救哺乳動物個體，如此處在小鼠中所示。甚至在後期，亦即感染後4天，抗體仍能夠部分保護小鼠免受由流感H3N2病毒引起之致死感染。令人驚奇的是，在感染後第21日，所有存活之經抗體治療之動物達到正常體重程度且不顯示任何殘餘臨床症狀。
實例16 人類IgG單株抗體對活體內致死H7N7攻擊之預防活性
進行研究以測試本文中揭示之單株抗體(由CR8020例示)對活體內H7N7流感病毒之致死攻擊之預防效應。用小鼠適應性流感A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7)病毒(Central Veterinary Institute(CVI),Lelystad,The Netherlands)在小鼠致死攻擊模型中測試mAb CR8020之預防功效。在3次肺至肺繼代後小鼠適應A/CH/NL/621557/03(H7N7)病毒。在CVI實驗室中受精雞蛋中傳播小鼠適應H7N7繼代3病毒。所有小鼠(Balb/c，雌性，年齡6-8週，每組n=8)在實驗開始前接受適應環境且維持至少4天時段。在攻擊的前1日在尾靜脈(靜脈尾骨肌)中以30、10、3或1 mg/kg靜脈內投與mAb CR8020，假定平均體重為每隻小鼠18 g或固定劑量體積為0.2 mL。亦使用以30 mg/kg投與陰性對照mAb CR3014之對照組。接著在第0日用25 LD50 A/CH/NL/621557/03(H7N7)病毒藉由鼻內接種對小鼠進行攻擊。藉由滴定來自動物之接種完成後剩餘接種物之少量複製樣本來估計投與之病毒之實際劑量。用MDCK細胞測定接種物之病毒效價(TCID50/mL)。自攻擊的前1日直至第21日研究結束以與實例14中所描述相同之方法每日測定臨床症狀及體重。為在第0日分析mAb血漿含量及在第21日測定血球凝集抑制(HI)抗體之存在，在第0日即將攻擊前及感染後第21日自所有小鼠抽取血液樣本。
在適應環境期期間所有小鼠均活躍且顯得健康，不顯示疾病徵兆。圖14A展示在mAb投藥後小鼠之存活率。投與1 mg/kg或更高劑量之mAb CR8020的小鼠顯示100%存活率，而對照mAb組中0%存活。
圖14B展示mAb投藥後21天研究期期間小鼠之平均體重變化。在mAb CR8020 3、10及30 mg/kg組中小鼠在21日研究期內不損失體重，而在mAb CR8020 1 mg/kg及對照mAb組中觀測到體重損失，其中mAb CR8020 1 mg/kg組中之小鼠之平均體重在第21日恢復至基線程度。藉由曲線下面積(AUC)分析更詳細地分析體重變化(表19)。對於曲線下面積分析，若小鼠在後續研究期間死亡/接受安樂死，則最末次體重進位至第21日體重。簡言之，第0日之小鼠平均體重用作基線值且相對於基線測定自第0日至第21日之體重變化。AUC定義為基線上面積之總和及基線下面積之總和。
體重損失與所用抗體之劑量之間存在明顯的反比關係。當抗體濃度增加時，體重損失降低。與對照mAb相比，mAb CR8020 1、3、10及30 mg/kg組中之體重損失平均差分別為47.44、79.75、86.71及80.48公克*日。所有差異均為統計上顯著的(p<0.001)。
圖14C展示小鼠之中值臨床分數。在攻擊後第1日各組內所有(除1隻或2隻外)動物顯示臨床症狀(分數=1)。此或許並非與病毒攻擊有關，因為一同用於研究之未經攻擊組在第1日顯示類似效應(資料未展示)。
在攻擊的前1日經3、10或30 mg/kg mAb CR8020治療之小鼠中，所有小鼠均存活且沒有動物在觀測週期期間顯示任何臨床症狀(自感染後第2日至第21日)。在攻擊的前1日經1 mg/kg mAb CR8020治療之小鼠顯示100%存活率，但8隻小鼠中之8隻顯示達到最大臨床分數為3之臨床症狀。
此等結果顯示如本文中所揭示經鑑別及開發的人類抗H3N2抗體CR8020(CR8020)能夠活體內提供對致死劑量之流感H7N7之異源亞型保護。當在感染前1天以3 mg/kg或更高劑量投與時，mAb CR8020能夠完全預防小鼠中H7N7感染之臨床表現。在感染前1天以1 mg/kg劑量投與CR8020情況下，所有小鼠在致死攻擊後存活且觀測之體重損失及臨床症狀在21日研究期結束時完全消除。
進行第二研究以評估及比較H7N7小鼠模型中mAb CR8020、CR8041及CR8043之預防功效。用小鼠適應性流感A/Chicken/Netherlands/621557/2003(H7N7)病毒(Central Veterinary Institute(CVI),Lelystad,The Netherlands)在小鼠致死攻擊模型中測試mAb CR8020、CR8041及CR8043(細胞中產生)之預防功效。簡言之，所有小鼠(Ba1b/c，雌性，年齡6-8週，每組n=8)在實驗開始前接受適應環境且維持至少4天時段。在攻擊的前1日在尾靜脈(靜脈尾骨肌)中以10、3或1 mg/kg靜脈內投與mAb CR8020，假定平均體重為每隻小鼠18 g或固定劑量體積為0.2 mL。以30、10、3或1 mg/kg以相同方式投與mab CR8041及CR8043。亦使用以30 mg/kg投與陰性對照mAb CR3014之對照組。mAb投藥後，在第0日用25 LD50小鼠適應A/CH/NL/621557/03(H7N7)病毒藉由鼻內接種對小鼠進行攻擊。自攻擊的前1日直至第21日研究結束，每日測定臨床症狀及體重。
圖15展示mAb之預防性投藥後小鼠之存活率、體重變化百分比及臨床分數。如圖15A所示，在接受3或10 mg/kg CR8020、10或30 mg/kg CR8041之組及接受30 mg/kg CR8043之組中觀測到100%存活。在對照mAb組中，存活率為0%。與對照mAb組相比，所有3種劑量下CR8020之預防性投藥及所有4種劑量下CR8041之預防性投藥提供統計上顯著改良之存活時間(對數等級，p<0.002)。與對照mAb組相比，1 mg/kg CR8043之預防性投藥不引起存活時間之統計上顯著的改良(對數等級，p=0.692)。與對照mAb組相比，增加CR8043劑量至3 mg/kg或更多引起存活時間之統計上顯著的改良(對數等級，p0.034)。
在後續分析中，比較mAb CR8020、CR8041及CR8043之最低劑量組之存活時間。與1 mg/kg CR8041及1 mg/kg CR8043相比，1 mg/kg CR8020之預防性投藥引起存活時間之統計上顯著的改良(對數等級，分別為p=0.029及p<0.001)。此外，當與1 mg/kg CR8043相比時，1 mg/kg CR8041之預防性投藥引起存活時間之統計上顯著的改良(對數等級，p=0.004)。
圖15B展示mAb之預防性投藥後21天研究期期間小鼠之平均體重變化。在mAb CR8020及mAb CR8041 1 mg/kg組中觀測到可與對照mAb組比較之嚴重體重損失。在mAb CR8020及CR8041之較高劑量組中，21日研究期間之體重損失有限或不存在體重損失。在投與mAb CR8043之組中，在所有組中觀測到嚴重體重損失，其中以30 mg/kg劑量給藥之組之平均體重在第21日幾乎恢復至基線程度。藉由曲線下面積(AUC)分析更詳細地分析體重變化(表21)。體重損失與所用抗體之劑量之間存在明顯的反比關係。當抗體濃度增加時，體重損失降低。在1 mg/kg CR8020情況下，與對照組相比不存在體重損失之統計上顯著的降低(p=0.356)。與對照組相比，增加劑量至3或10 mg/kg引起體重損失之統計上顯著的降低(兩種情況下p<0.001)。在1 mg/kg CR8041情況下，與對照組相比不存在體重損失之統計上顯著的降低(p=1)。
與對照組相比，增加劑量至3、10或30 mg/kg CR8041造成統計上顯著降低之體重損失(所有3種情況p<0.001)。與對照組相比，以1、3或10 mg/kg CR8043無統計上顯著降低之體重損失(分別為p=0.997、p=0.510及p=0.992)。與對照組相比，增加劑量至30 mg/kg造成統計上顯著降低之體重損失(p<0.001)。在體重變化資料之平均AUC之另外分析中，使用變異數之單變數分析比較mAbs CR8020、CR8041及CR8043，其中模型中包括抗體及劑量作為固定因素。因為研究中不包括30 mg/kg劑量之CR8020，所以比較限於1、3及10 mg/kg之抗體劑量。藉由斯氏(Sidak)調整使用邊際平均值估計抗體之間的差異用於多重比較。在所考慮之3種劑量抗體中，使用CR8020之治療與CR8041及CR8043相比造成統計上顯著改良降低之體重損失(邊際平均值中平均差為23.73及68.29公克*日，分別為p=0.013及p<0.001)。此外，當與CR8043相比時，使用CR8041之治療造成統計上顯著改良降低之體重損失(邊際平均值中差異為44.56公克*日，p<0.001)。
圖15C展示小鼠之中值臨床分數。除1隻小鼠在第0日(3 mg/kg CR8020組)外，所有小鼠均自第0日至第3日顯示臨床症狀(分數=1，皮毛粗糙)。在適應環境期及第-1日未觀測到此增加。此增加臨床分數之原因並不清楚。在攻擊前第-1日經3或10 mg/kg mAb CR8020治療之組中，在攻擊後第9日中值臨床分數返回至0，而對照組中值臨床分數在第8日達到4，其中所有小鼠在第9日死亡或安樂死。CR8020 1 mg/kg組自第4日至第13日顯示中值臨床分數為3，在第15日返回至0。在攻擊前第-1日經3、10或30 mg/kg mAbCR8041治療之組中，中值臨床分數分別在攻擊後第9日、第10日或第12日返回至0。CR8041 1 mg/kg組在攻擊後第10日達到中值臨床分數為4。在經1、3或10 mg/kg CR8043治療之組中，中值臨床分數分別在第9日、第9日或第12日達到4，而30 mg/kg CR 8043組之中值臨床分數自第6日至第13日達到3且在第14日返回至0。
上述結果清楚表明人類抗H3N2抗體CR8020、CR8041及CR8043能夠活體內提供對致死劑量流感H7N7之異源亞型保護。基於隨後存活時間及體重變化之分析結果，發現mAb CR8020在3種針對小鼠適應性流感A/CH/NL/621557/03(H7N7)病毒之mAb中最為有效。在感染前1天投與3或10 mg/kg劑量之mAb CR8020情況下，100%小鼠在致死攻擊後存活且H7N7感染之臨床表現顯著降低。在感染前1天投與1 mg/kg劑量CR8020情況下，此實驗中75%小鼠在致死攻擊後存活且存活小鼠之臨床症狀在21日研究期中第15日完全消除。
實例17 人類IgG單株抗體對活體內致死H7N7攻擊之治療活性
進行此項研究以評估H7N7模型中mAb CR8020之治療功效及治療窗。用小鼠適應性流感(H7N7)病毒(中央獸醫研究所(Central Veterinary Institute)(CVI),Lelystad,The Netherlands)在小鼠致死攻擊模型中測試mAb CR8020(PER.C細胞中產生)之治療功效。簡言之，所有小鼠(Balb/c，雌性，年齡6-8週，每組n=8)在實驗開始前接受適應環境且維持至少4天時段。在攻擊的前1日(第1組：預防陽性對照)或在攻擊後第1、2、3、4、5或6日(第2-7組)在尾靜脈(靜脈尾骨肌)中以15 mg/kg靜脈內投與mAb CR8020，假定平均重量為每隻小鼠18 g且固定劑量體積為0.2 mL。第8組在攻擊後第1日接受陰性對照mAb CR3014(15 mg/kg)。接著在第0日用25 LD50小鼠適應A/CH/NL/621557/03(H7N7)病毒藉由鼻內接種對小鼠進行攻擊。自攻擊的前1日直至第21日研究結束，每日測定臨床症狀及體重。
圖16A展示靜脈內投與mAb CR8020(所有組中15 mg/kg)或對照mAb(15 mg/kg)後小鼠之存活率。當在攻擊前第1日或攻擊後第1日或第3日投與15 mg/kg mAb CR8020時，所有動物在病毒攻擊後存活，而對照mAb組中存活率為0%。當在第2日或第4日投與15 mg/kg mAb CR8020時，分別觀測到87.5%及50%存活。此等組之存活時間與對照mAb組之存活時間統計上顯著不同(分別為p=0.002及p=0.014)。在第5日或第6日經15 mg/kg CR8020治療之組經歷存活率為0%且此等組之存活時間與對照mAb組相比不存在統計上顯著的差異(分別為p=0.837及p=0.876)。
圖16B展示21日研究期期間小鼠之相對於第0日之平均體重變化。通常，當在攻擊後較晚時間點時投與mAb CR8020時，平均體重損失增加。然而，由於第2日治療組中之單一未存活小鼠，mAb CR8020第2日及第3日治療組之平均體重曲線在第10日相交。體重變化之曲線下面積分析顯示與第4日至第6日治療相比第-1日至第3日治療之間的平均重量損失之急劇變化(表22)。與對照組相比，在攻擊的前1日或攻擊後第1、2或3日用15 mg/kg CR8020治療引起體重損失之統計上顯著的降低(對於所有4個組p<0.001)。與對照組相比，在第4、5或6日用15 mg/kg CR8020治療不引起體重損失之統計上顯著的降低(分別為p=0.566，p=0.979及p=0.858)。
圖16C展示小鼠之中值臨床分數。在攻擊的前1日用15 mg/kg CR8020治療之動物中，所有動物均存活且在觀測週期期間均不顯示任何臨床症狀。在攻擊後第1日接受治療之動物顯示100%存活，然而，8隻動物中之7隻顯示達到最大臨床分數為1之臨床症狀。第8隻動物達到最大臨床分數為3。在攻擊後第2日接受治療之動物中除一隻動物外其餘全部存活。存活動物(8隻中之7隻)顯示達到最大臨床分數為1(n=4)或3(n=3)之臨床症狀。在攻擊後第3日接受治療之動物顯示100%存活且所有動物顯示最大臨床分數為3之臨床症狀。在攻擊後第4日接受治療之動物中，50%在致死攻擊後存活。存活動物顯示達到最大臨床分數為3之臨床症狀。在攻擊後第5日或第6日接受治療之動物未存活。使用GENMOD程序(SAS)分析臨床分數以使模型適於重複量測，其中小鼠作為個體且用順序尺度量測資料(表23)。在攻擊的前1日及攻擊後第1、2、3或4日經15 mg/kg mAb CR8020治療之組中，在大部分21日研究期期間中值臨床分數與對照mAb組統計上顯著不同(第8日至第21日，對於所有4個組p0.038)。在攻擊後第5日經15 mg/kg mAb CR8020處理之群中，中值臨床分數僅在第8日與對照mAb組顯著不同(p0.001)。儘管統計上顯著，但不認為此差異相關。15 mg/kg mAb CR8020第6日治療組之中值臨床分數不與對照組統計不同。
此研究清楚表明使用15 mg/kg mAb CR8020之療法當在致死H7N7小鼠模型中攻擊後至多第3日投與時提供87.5-100%保護。當在攻擊後第4日投藥時，使用15 mg/kg mAb CR8020之治療提供部分保護。當在攻擊後第5日或第6日投藥時，在致死H7N7小鼠模型中未觀測到15 mg/kg mAb CR8020之保護效果。換言之，當在死亡前4天或更多天投與時，CR8020在此致死小鼠模型中提供保護。
實例18 可有效中和來自系統發生群1及2之多種流感亞型的單株抗體之混合物
每一年季節性流感疫苗由誘發對A型流感病毒株之免疫性的兩種不同製劑組成，一種代表循環H1亞型且一種代表循環H3病毒株。此現象之根本原因在於來自H1及H3亞型之流感病毒株顯著不同使得自任一類型製備之疫苗不誘發針對另一亞型之保護。理想地，用於治療流感之廣泛保護性單株抗體將有效對抗來自系統發生群1(H1)及系統發生群2(H3)兩者之流感病毒株。然而，又由於HA分子之間的序列差異，因此難以發現該單抗體。舉例而言，WO 2009/115972中描述之Fab28抗體相比於H3亞型病毒極較佳地結合及中和H1亞型病毒，或許由於與系統發生群內病毒相比群1與群2之間抗原決定基之保守性較低。為達成單一產物有效對抗來自兩系統發生群之多種流感亞型之目標，因此吾人可能需要在混合物中組合兩種或兩種以上不同抗體。為能夠成功，該製劑應由不彼此干擾之抗體組成。
可有效中和來自H1、H5及H9亞型之病毒的抗體已描述於WO 2008/028946中，其中抗體CR6261及CR6323作為典型實例。已使用H1或H5 HA分子與CR6261之共結晶詳細說明CR6261之結合區域(抗原決定基)(亦參看PDB資料庫條目3GBM及http：//www.pdb.org之3GBM及Ekiert等人，2009)。為研究本發明之單株抗體是否可與先前描述之CR6261抗體組合使用，測試抗體是否能夠與來自系統發生群1及系統發生群2兩者之亞型結合。因此，使用H1及H5亞型以及H3及H7亞型之HA分子以及CR6261、CR6323、CR8001、CR8020、CR8041及CR8043如實例7所描述進行Elisa及FACS結合實驗。結果概述於表20中且顯示廣泛中和群1之病毒的抗體不與群2之病毒結合且反之亦然。因為抗體不彼此干擾，所以可預期抗體對各別亞型之中和效能將保持，引起群1及群2亞型兩者之有效中和。
因此，一方面包含CR6261及/或CR6323且另一方面亦包含CR8020、CR8041及/或CR8043之混合物將有效對抗至少兩種亞型H1及H3之病毒。因此，可使用一製劑提供對於來自系統發生群1及系統發生群2之流感亞型的有效保護。
實例19 結合分子之結合動力學
使用來自ForteBio之Octet RED系統及抗生蛋白鏈菌素生物感測器量測CR8020及CR8043的木瓜酶裂解之Fab片段之親和力。對H3亞型A/Wisconsin/67/2005(Protein Science)及A/Brisbane/10/2007(Protein Science)之流感血球凝集素抗原作生物素標記以固定至抗生蛋白鏈菌素生物感測器(ForteBio)。分別對CR8020及CR8043在動力學緩衝液(ForteBio,18.5032)中使用2.3 nM至150 nM及0.16 nM至30 nM之間的範圍內之濃度重複Fab結合實驗5次。使用Octet量測親和力之實驗的建立如下：將經生物素標記之血球凝集素固定至抗生蛋白鏈菌素生物感測器歷時1800秒，接著締合經連續稀釋之Fab CR8020及CR8043歷時1200秒且接著在動力學緩衝液中解離1800秒。使用1:1模型藉由Octet分析軟體分析結合資料。
結合分子對H3亞型之HA的親和力常數(Kd值)展示於表24中。
表1：第一輪Vκ、Vλ及VH擴增
表 2：第二輪Vκ、Vλ及VH擴增
表 3：第二輪VL區域擴增概要
表 4：第二輪VH區域擴增概要
表 5：個別IgM記憶B細胞文庫之特徵
表 6：藉由ELISA(ELISA效價；OD 492 nm)量測之單鏈噬菌體抗體與不同HA亞型之HA分子的交叉結合活性。×=未測定；H3=H3亞型之HA；H7=H7亞型之HA；HB=B型流感病毒之HA。
表 7：藉由ELISA(OD 492 nm)量測之經PEG/NAC1沈澱及過濾滅菌之噬菌體抗體與不同HA亞型之HA分子的交叉結合活性。H1=H1亞型之HA，H3=H3亞型之HA，H5=H5亞型之HA，H7=H7亞型之HA，B(O)=流感病毒B/Ohio/01/2005之HA。
表 8：經PEG/NAC1沈澱及過濾滅菌之噬菌體抗體的FACS分析結果(以MFI=平均螢光強度表示)。PER.C6=未經轉染之PER.C6細胞(對照物)；mH1、mH3、mH5、mH7、mHB分別為亞型H1、H3、H5、H7及B亞型流感之膜結合HA。
表 9：HA特異性免疫球蛋白之CDR區域之資料(SEQ ID NO)
表 10：A特異性IgG之資料(重鏈及輕鏈可變區之核苷酸及胺基酸序列之SEQ ID NO)
表 11：所選IgG對流感病毒H3N2之活體外中和
表 12：抗H3N2 IgG之交叉結合反應性。NCal.=A/New Caledonia/20/1999(H1N1)；Wisc.=A/Wisconsin/67/2005(H3N2)；NY.=A/New York/55/2004(H3N2)；Wyo.=A/Wyoming/3/2003(H3N2)；Neth.=A/Netherlands/219/2003(H7N7)；ND=未進行
表 13：抗H3N2 IgG之交叉中和活性；ND=未進行
表 14：H3 mAb CR8020、CR8041及CR8043之結合區域周圍之序列保守性
表 15：對各種A型流感病毒株之中和效價
所 有SK50效價單位為ug/ml；小鼠適應性病毒株；Ma「大流行病」H7病毒株 表16：自第0日之基線起的體重變化之曲線下之平均面積
表 17：自第0日之基線起的體重變化之曲線下之平均面積
a藉由丹氏調整使用變異數分析比較15 mg/kg mAb CR8020劑量組與對照mAb組之平均AUC值以用於後續分析中之多重比較。與對照組相比，使用15 mg/kg mAb CR8020之預防性治療使得體重損失有統計上顯著的降低(p<0.001)。與對照組相比第1日、第2日或第3日使用15 mg/kg mAb CR8020之治療性處理亦使得體重損失有統計上顯著的降低(分別為p<0.001，p<0.001及p=0.003)。與對照組相比，第4日、第5日或第6日使用15 mg/kg mAb CR8020之治療未使得體重損失有統計上顯著的降低(對於所有3個組p>0.05)。
表18：中值臨床分數
列出時間間隔以及與對照mAb組相比臨床分數之間的顯著差異(例如，第-1日15 mg/kg與對照組之間，自第4日起臨床分數之差異為顯著的)。
表 19：自第0日之基線起的體重變化之曲線下之平均面積
表 20：對流感病毒HA具特異性之單株抗體之結合及中和性質的概要
表21：自第0日之基線起的體重變化之曲線下之平均面積
表 22：自第0日之基線起的體重變化之曲線下之平均面積
表 23：中值臨床分數
表 24：結合動力學
重 鏈及輕鏈可變區之核苷酸及胺基酸序列：
>CR6261 HC蛋白質(SEQ ID NO：186)
>CR6261 LC DNA(SEQ ID NO：187)
>CR6261 LC蛋白質(SEQ ID NO：188)
載體pIg-C911-HCγ1(SEQ ID NO：189)
載體pIg-C909-Cκ(SEQ ID NO：190)
載體pIg-C910-Cλ(SEQ ID NO：191)
來自A/Hong Kong/1/1968之未成熟HA之序列(SEQ ID NO：260)
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<211> 1353
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> CR6261 HC DNA
<400> 185
<210> 186
<211> 451
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> CR6261 HC蛋白質
<400> 186
<210> 187
<211> 663
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> CR6261 LC DNA
<400> 187
<210> 188
<211> 221
<212> PRT
<213> 人造
<220>
<223> CR6261 LC蛋白質
<400> 188
<210> 189
<211> 10515
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 載體pIg-C911-HCγ1
<400> 189
<210> 190
<211> 8777
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 載體pIg-C909-Cκ
<400> 190
<210> 191
<211> 8792
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> 載體pIg-C910-Cλ
<400> 191
<210> 192
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK1(HuVK1B)
<400> 192
<210> 193
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK2(HuVK2)
<400> 193
<210> 194
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK3(HuVK2B2)
<400> 194
<210> 195
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK4(HuVK3B)
<400> 195
<210> 196
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK5(HuVK5)
<400> 196
<210> 197
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK6(HuVK6)
<400> 197
<210> 198
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OCK(HuCK)
<400> 198
<210> 199
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL1(HuVL1A)＊
<400> 199
<210> 200
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL1(HuVL1B)＊
<400> 200
<210> 201
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL1(HuVL1C)＊
<400> 201
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL2(HuVL2B)
<400> 202
<210> 203
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL3(HuVL3A)
<400> 203
<210> 204
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL4(HuVL3B)
<400> 204
<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL5(HuVL4B)
<400> 205
<210> 206
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL6(HuVL5)
<400> 206
<210> 207
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL7(HuVL6)
<400> 207
<210> 208
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL8(HuVL7/8)
<400> 208
<210> 209
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL9(HuVL9)#
<400> 209
<210> 210
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL9(HuVL10)#
<400> 210
<210> 211
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OCL(HuCL2)X
<400> 211
<210> 212
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OCL(HuCL7)X
<400> 212
<210> 213
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH1(HuVH1B7A)+
<400> 213
<210> 214
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH1(HuVH1C)+
<400> 214
<210> 215
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH2(HuVH2B)
<400> 215
<210> 216
<211> 18
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH3(HuVH3A)
<400> 216
<210> 217
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH4(HuVH3C)
<400> 217
<210> 218
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH5(HuVH4B)
<400> 218
<210> 219
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH6(HuVH4C)
<400> 219
<210> 220
<211> 23
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH7(HuVH6A)
<400> 220
<210> 221
<211> 24
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OCM(HuCIgM)
<400> 221
<210> 222
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK1S(HuVK1B-SAL)
<400> 222
<210> 223
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK2S(HuVK2-SAL)
<400> 223
<210> 224
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK3S(HuVK2B2-SAL)
<400> 224
<210> 225
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK4S(HuVK3B-SAL)
<400> 225
<210> 226
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK5S(HuVK5-SAL)
<400> 226
<210> 227
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OK6S(HuVK6-SAL)
<400> 227
<210> 228
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJK1(HuJK1-NOT)
<400> 228
<210> 229
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJK2(HuJK2-NOT)
<400> 229
<210> 230
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJK3(HuJK3-NOT)
<400> 230
<210> 231
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJK4(HuJK4-NOT)
<400> 231
<210> 232
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJK5(HuJK5-NOT)
<400> 232
<210> 233
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL1S(HuVL1A-SAL)＊
<400> 233
<210> 234
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL1S(HuVL1B-SAL)＊
<400> 234
<210> 235
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL1S(HuVL1C-SAL)＊
<400> 235
<210> 236
<211> 38
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL2S(HuVL2B-SAL)
<400> 236
<210> 237
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL3S(HuVL3A-SAL)
<400> 237
<210> 238
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL4S(HuVL3B-SAL)
<400> 238
<210> 239
<211> 38
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL5S(HuVL4B-SAL)
<400> 239
<210> 240
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL6S(HuVL5-SAL)
<400> 240
<210> 241
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL7S(HuVL6-SAL)
<400> 241
<210> 242
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL8S(HuVL7/8-SAL)
<400> 242
<210> 243
<211> 41
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL9S(HuVL9-SAL)#
<400> 243
<210> 244
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OL9S(HuVL10-SAL)#
<400> 244
<210> 245
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJL1(HuJL1-NOT)
<400> 245
<210> 246
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJL2(HuJL2/3-NOT)
<400> 246
<210> 247
<211> 48
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJL3(HuJL7-NOT)
<400> 247
<210> 248
<211> 56
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH1S(HuVH1B-SFI)+
<400> 248
<210> 249
<211> 56
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH1S(HuVH1C-SFI)+
<400> 249
<210> 250
<211> 56
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH2S(HuVH2B-SFI)
<400> 250
<210> 251
<211> 51
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH3S(HuVH3A-SFI)
<400> 251
<210> 252
<211> 56
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH4S(HuVH3C-SFI)
<400> 252
<210> 253
<211> 56
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH5S(HuVH4B-SFI)
<400> 253
<210> 254
<211> 56
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH6S(HuVH4C-SFI)
<400> 254
<210> 255
<211> 56
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OH7S(HuVH6A-SFI)
<400> 255
<210> 256
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJH1(HuJH1/2-XHO)
<400> 256
<210> 257
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJH2(HuJH3-XHO)
<400> 257
<210> 258
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJH3(HuJH4/5-XHO)
<400> 258
<210> 259
<211> 36
<212> DNA
<213> 人造
<220>
<223> OJH4(HuJH6-XHO)
<400> 259
<210> 260
<211> 566
<212> PRT
<213>
<220>
<223> 來自A/Hong Kong/1/1968之未成熟HA之序列
圖1展示亞型層面上之胺基酸序列之系統樹。圖上顯示將亞型按群劃分。H1分枝(尤其包含H1亞型)及H9分枝(包含H9亞型)形成系統發生群1，且H7(尤其包含H7亞型)及H3分枝(尤其包含H3亞型)形成系統發生群2；
圖2為展示在相繼用胰蛋白酶(條紋型條柱)、pH 4.9緩衝介質(實心白色條柱)及DTT(十字型條柱)處理後藉由FACS分析量測且用與未經處理之rHA(實心黑色條柱)之結合百分率表示的IgG1與表面表現之H3 rHA之結合的柱狀圖；
圖3展示活體外蛋白酶易感性檢定之結果。使樣品在1x MOPS緩衝液中於4-12% Bis Tris凝膠上跑膠。藉由膠體藍染色顯現蛋白質帶；
圖4為感染過程期間HA蛋白質之不同構形之示意性圖示；
圖5為展示在相繼用胰蛋白酶(條紋型條柱)、pH 4.9緩衝介質(實心白色條柱)及DTT(十字型條柱)處理後藉由FACS分析量測且用與未經處理之rHA(實心黑色條柱)之結合百分率表示的在不同處理後H3 mAb與HA表現細胞之結合之柱狀圖；
圖6展示實例11中描述之用於測定將HA與胰蛋白酶一起培育以達成H3 HA之裂解所需之時間的時程實驗之結果；
圖7展示如實例11中所述用胰蛋白酶消化經mAb預培育之H3 HA樣本的結果；
圖8為證明CR8043抑制H3 HA中pH值誘導之構形變化的柱狀圖；
圖9顯示CR8020及CR8041亦能夠阻斷pH值誘導之HA之構形變化：A.在胰蛋白酶裂解前添加mAb；B.在胰蛋白酶裂解後添加mAb；C.在所有處理後添加mAb；
圖10展示卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)存活概率曲線。在攻擊的前一日靜脈內投與1 mg/kg至30 mg/kg劑量範圍內之抗體。以30 mg/kg投與對照Ab(灰色)，接著在第0日用25 LD50 A/HK/1/68-MA20(H3N2)進行致死性攻擊。在與CR8041(B)及CR8043(C)不同之研究中測試CR8020(A)，CR8041(B)及CR8043(C)係在實驗1中評估。因此對B及C使用相同對照抗體組；
圖11展示相對於第0日之平均體重變化(%)。在攻擊的前一日靜脈內投與1 mg/kg至30 mg/kg劑量範圍內之抗體。以30 mg/kg投與對照Ab(灰色)，接著在第0日用25 LD50 A/HK/1/68-MA20(H3N2)進行致死性攻擊。條棒表示平均值之95% CI。若小鼠在研究之追蹤期間死亡/接受安樂死，則推進末次觀測之體重。在與CR8041(B)及CR8043(C)不同之研究中測試CR8020(A)，CR8041(B)及CR8043(C)係在實驗1中評估。因此對B及C使用相同對照抗體組；
圖12展示中值臨床評分。在攻擊的前一日靜脈內投與1 mg/kg至30 mg/kg劑量範圍內之抗體。以30 mg/kg投與對照Ab(灰色)，接著在第0日用25 LD50 A/HK 1/68-MA20(H3N2)進行致死性攻擊。條棒表示四分位數間距。在與CR8041(B)及CR8043(C)不同之研究中測試CR8020(A)，CR8041(B)及CR8043(C)係在實驗1中評估。因此對B及C使用相同對照抗體組。臨床評分註釋：0=無臨床徵象；1=皮毛粗糙；2=皮毛粗糙，反應性較低，在處理期間被動；3=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動；4=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當仰臥躺下時不能翻身為俯臥。觀測到臨床評分為4之小鼠在當天接受安樂死；
圖13展示mAb CR8020在以A型流感/HK/1/68-MA20(H3N2)進行致死性攻擊之小鼠模型中的治療功效。在攻擊的前1日或在攻擊後第1日、第2日、第3日、第4日、第5日或第6日向129X1/SvJ小鼠(n=10隻/組)靜脈內投與單一劑量之mAb CR8020(15 mg/kg)。在攻擊後第1日投與對照mAb(15 mg/kg)。在第0日用25 LD50 A/HK/1/68-MA20(H3N2)對小鼠進行攻擊且監視21日。圖A：卡普蘭-邁耶存活概率曲線。圖B：相對於第0日之平均體重變化(%)。條棒表示平均值之95% CI。若小鼠在研究之追蹤期間死亡/接受安樂死，則推進末次觀測之體重。圖C：中值臨床評分。條棒表示四分位數間距。0=無臨床徵象；1=皮毛粗糙；2=皮毛粗糙，反應性較低，在處理期間被動；3=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動；4=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當仰臥躺下時不能翻身為俯臥。觀測到臨床評分為4之小鼠在當天接受安樂死；
圖14展示mAb CR8020在以小鼠適應性A型流感/CH/NL/621557/03(H7N7)進行致死性攻擊之小鼠模型中的預防功效。圖A：卡普蘭-邁耶存活概率曲線。圖B：相對於第0日之平均體重變化(%)。條棒表示平均值之95% CI。若小鼠在研究之追蹤期間死亡/接受安樂死，則推進末次觀測之體重。圖C：中值臨床評分。條棒表示四分位數間距。0=無臨床徵象；1=皮毛粗糙；2=皮毛粗糙，反應性較低，在處理期間被動；3=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動；4=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當仰臥躺下時不能翻身為俯臥。觀測到臨床評分為4之小鼠在當天接受安樂死；
圖15展示mAb CR8020、CR8041及CR8043在以小鼠適應性A型流感/CH/NL/621557/03(H7N7)進行致死性攻擊之小鼠模型中的預防功效。在攻擊的前1日向雌性Ba1b/c小鼠(n=8隻/組)靜脈內投與MAb，劑量範圍為1 mg/kg至10 mg/kg(CR8020)或1 mg/kg至30 mg/kg(CR8041及CR8043)。在前一日以30 mg/kg投與對照mAb(灰色)。在第0日以25 LD50小鼠適應性A/CH/NL/621557/03(H7N7)藉由鼻內接種進行致死性攻擊且隨後監視小鼠21日。圖A：卡普蘭-邁耶存活概率曲線。圖B：相對於第0日之平均體重變化(%)。條棒表示平均值之95% CI。若小鼠在研究之追蹤期間死亡/接受安樂死，則推進末次觀測之體重。圖C：中值臨床評分。條棒表示四分位數間距。0=無臨床徵象；1=皮毛粗糙；2=皮毛粗糙，反應性較低，在處理期間被動；3=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動；4=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當仰臥躺下時不能翻身為俯臥。觀測到臨床評分為4之小鼠在當天接受安樂死；及
圖16展示mAb CR8020在以小鼠適應性A型流感/CH/NL/621557/03(H7N7)進行致死性攻擊之小鼠模型中的治療功效。在攻擊的前1日或在攻擊後第1日、第2日、第3日、第4日、第5日或第6日向雌性Balb/c小鼠(n=8隻/組)靜脈內投與單一劑量之mAb CR8020(15 mg/kg)。在攻擊後第1日投與對照mAb(15 mg/kg)。在第0日用25 LD50小鼠適應性A/CH/NL/621557/03(H7N7)對小鼠進行攻擊且監視21日。圖A：卡普蘭-邁耶存活概率曲線。圖B：相對於第0日之平均體重變化(%)。條棒表示平均值之95% CI。若小鼠在研究之追蹤期間死亡/接受安樂死，則推進末次觀測之體重。圖C：中值臨床評分。條棒表示四分位數間距。0=無臨床徵象；1=皮毛粗糙；2=皮毛粗糙，反應性較低，在處理期間被動；3=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，在處理期間被動；4=皮毛粗糙，蜷縮，呼吸困難，當仰臥躺下時不能翻身為俯臥。觀測到臨床評分為4之小鼠在當天接受安樂死。
(無元件符號說明)

Claims (19)

  1. 一種經分離之人類抗體或抗原結合片段，其能夠特異性識別及結合於流感血球凝集素蛋白質(HA)中之抗原決定基，對包含H3亞型之HA之流感病毒具有中和活性，及至少對包含H7亞型之HA之流感病毒及/或包含H10亞型之HA之流感病毒具有交叉中和活性，其中該抗體或抗原結合片段係選自由以下組成之群：a)包含SEQ ID NO：109之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO：110之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO：111之重鏈CDR3區域；及SEQ ID NO：112之輕鏈CDR1區域、SEQ ID NO：113之輕鏈CDR2區域及SEQ ID NO：114之輕鏈CDR3區域的抗體；b)包含SEQ ID NO：138之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO：139之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO：140之重鏈CDR3區域；及SEQ ID NO：141之輕鏈CDR1區域、SEQ ID NO：142之輕鏈CDR2區域及SEQ ID NO：143之輕鏈CDR3區域的抗體；及c)包含SEQ ID NO：144之重鏈CDR1區域、SEQ ID NO：145之重鏈CDR2區域及SEQ ID NO：146之重鏈CDR3區域；及SEQ ID NO：147之輕鏈CDR1區域、SEQ ID NO：148之輕鏈CDR2區域及SEQ ID NO：149之輕鏈CDR3區域的抗體。
  2. 如請求項1之抗體或抗原結合片段，其對包含H3亞型之HA之流感病毒具有中和活性，其特徵在於該抗體或抗原 結合片段至少對一或多種選自由A/Wisconsin/67/2005、A/Hiroshima/52/2005、A/Panama/2007/99及A/Johannesburg/33/94組成之群的H3N2病毒株具有中和活性。
  3. 如請求項2之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段進一步對H3N2病毒株A/Hong Kong/1/68具有中和活性。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠在活體外防止胰蛋白酶裂解HA1及HA2中H3 HA前驅體分子HA0。
  5. 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段能夠防止病毒膜與受感染細胞之內體(endosomal)膜融合所需的H3 HA蛋白質之構形改變。
  6. 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合片段，其中該抗體或抗原結合片段不能夠結合及中和包含H1亞型之HA之A型流感病毒。
  7. 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合片段，其係用作藥物。
  8. 如請求項1至3中任一項之抗體或抗原結合片段，其係用作用於診斷性、治療性及/或預防性處理由包含H3亞型之HA之流感病毒引起的流感感染之藥物。
  9. 一種免疫接合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段，該免疫接合物進一步包含至少一個標籤。
  10. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至8中任一項之抗體 或抗原結合片段及/或如請求項9之免疫接合物，以及醫藥學上可接受之賦形劑。
  11. 一種如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段及/或如請求項9之免疫接合物的用途，其係用於製備用以診斷、預防及/或治療流感病毒感染之藥物。
  12. 如請求項11之用途，其特徵在於流感感染係由包含H3亞型H3之HA的流感病毒引起。
  13. 如請求項10之醫藥組合物，其包含至少一種其他結合分子。
  14. 如請求項13之醫藥組合物，其特徵在於該其他結合分子能夠中和包含H1及H5亞型之HA之流感病毒，或其功能變異體。
  15. 一種核酸分子，其編碼如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段。
  16. 一種載體，其包含至少一種如請求項15之核酸分子。
  17. 一種宿主細胞，其包含至少一種如請求項16之載體。
  18. 如請求項17之宿主細胞，其中該宿主細胞為人類細胞。
  19. 一種產生如請求項1至8中任一項之抗體或抗原結合片段的方法，其中該方法包含以下步驟：a)將如請求項17或18之宿主細胞在有助於該抗體或抗原結合片段表現的條件下培養，及視情況，b)回收所表現之抗體或抗原結合片段。
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