TWI585067B - 針對羧酸基團的快速衍生方法及肉鹼類化合物的分析方法 - Google Patents
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Landscapes
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Description
本發明係關於一種快速衍生方法及一種化合物之分析方法，特別關於一種針對羧酸基團的快速衍生方法及一種肉鹼類化合物的分析方法。
肉鹼(L-carnitine)，即維他命BT，為人體必需的營養物質，廣泛存在於脊椎動物、植物及酵母中。人體可以自飲食中的紅肉及乳製品攝取肉鹼，或在腎臟、肝臟和大腦中以丁基甜菜鹼(butyrobetaine)作為前驅物，進行生合成而製造肉鹼。
在人體中，肉鹼會參與長鏈脂肪酸的代謝，產生醯基肉鹼(acyl-L-carnitine)，例如乙醯肉鹼(acetyl-L-carnitine)。在健康成人體內，乙醯肉鹼與肉鹼之比值應為0.25以下，否則表示有代謝異常之情況發生。此外，目前已知肉鹼及乙醯肉鹼可以用於改善糖尿病、心臟疾病、癲癇及有機酸尿症等疾病。
依據上述，肉鹼、丁基甜菜鹼及醯基肉鹼等肉鹼類化合物對於人體而言係屬相當重要之分子。惟，肉鹼類化合物皆具有類似之化學結構，分子量小、極性高且缺乏發光基團，故較難以萃取以及偵測。
因此，必須先針對肉鹼類化合物開發合適之衍生反應，以使肉鹼類化合物帶有螢光發射基團，而使螢光偵檢器能夠偵測肉鹼類化合
物。詳言之，由於上述肉鹼類化合物皆具有羧酸基團，係能夠透過衍生反應將螢光發射基團接合於肉鹼類化合物之羧酸基團。
再且，習用萃取方法係將分析物自水性溶劑中萃取至有機溶劑中，適用於分析物之極性低，且基質含水量高之樣品。而肉鹼類化合物由於具有四級胺結構，故極性高，而無法以習用萃取方法萃取之。因此，必須針對肉鹼類化合物之四級胺結構特性，開發適當之萃取方法。
最後，方能夠綜合上述之衍生反應及萃取方法，加以整合並調整，以提供肉鹼類化合物之分析方法，測定人體內肉鹼、丁基甜菜鹼及乙醯肉鹼等肉鹼類化合物之含量，以及檢測其於藥物、針劑、血液樣品、食品及化妝品中之含量。
本發明提供一種針對羧酸基團的快速衍生方法，可以使一羧酸化合物進行衍生反應而帶有螢光發射基團者。
本發明提供一種肉鹼類化合物的分析方法，可以檢測一待測樣品中之肉鹼類化合物濃度者。
本案提供一種針對羧酸基團的快速衍生方法，係包含：提供一衍生溶液，該衍生溶液包含4-溴甲基聯苯、乙腈及一羧酸化合物，該羧酸化合物帶有羧酸基團；及將該衍生溶液置於80~100℃下3~13分鐘進行衍生反應，使4-溴甲基聯苯與該羧酸化合物之羧酸基團反應，形成帶有甲基聯苯基團之該羧酸化合物。藉此，本案可以達成「使該羧酸化合物適用於螢光偵檢器」及「使該羧酸化合物適用於逆相層析管柱」等功效。
本案針對羧酸基團的快速衍生方法，其中，該衍生溶液另包含一鹼劑。此外，該鹼劑為氫氧化鉀、碳酸鉀或碳酸氫鉀。藉此，本案可以達成「提升衍生反應效率」功效。
本案針對羧酸基團的快速衍生方法，其中，該衍生溶液可以
包含0.4~7mM之4-溴甲基聯苯，且該衍生溶液可以包含1.6μM之該羧酸化合物。藉此，本案可以達成「進一步提升衍生反應效率」功效。
本案針對羧酸基團的快速衍生方法，其中，係將該衍生溶液置於90~100℃下7分鐘進行衍生反應。藉此，本案可以達成「縮短衍生反應所需時間」功效。
本案又提供一種肉鹼類化合物的分析方法，係包含：提供一待測溶液，該待測溶液包含4-溴甲基聯苯、乙腈及一待測樣品，該待測樣品包含一肉鹼類化合物；將該待測溶液於80~100℃下3~13分鐘進行衍生反應以獲得一反應溶液，使4-溴甲基聯苯與該肉鹼類化合物之羧酸基團反應，形成帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物；於該反應溶液中加入甲苯與一水性溶劑，以形成一分散溶液，該水性溶劑係為水、去離子水或一鹽類水溶液；震盪該分散溶液，使該分散溶液形成霧化狀態；離心霧化狀態之該分散溶液，至該分散溶液分層為水相及有機相；抽取該分散溶液之水相；及以一逆向層析管柱配合一偵檢器偵測該分散溶液之水相。藉此，本案可以達成「檢測該待測樣品中之該肉鹼類化合物」功效。
本案肉鹼類化合物的分析方法，其中，該待測溶液另包含一鹼劑。此外，該鹼劑可以為氫氧化鉀、碳酸鉀或碳酸氫鉀。藉此，本案可以達成「提升衍生反應效率」功效。
本案肉鹼類化合物的分析方法，其中，該待測溶液可以包含0.4~7mM之4-溴甲基聯苯，且該待測溶液可以包含1.6μM之該肉鹼類化合物。藉此，本案可以達成「進一步提升衍生反應效率」功效。
本案肉鹼類化合物的分析方法，其中，係將該待測溶液置於80℃下9分鐘進行衍生反應；或者將該待測溶液置於90~100℃下7分鐘進行衍生反應。藉此，本案可以達成「縮短衍生反應所需時間」功效。
本案肉鹼類化合物的分析方法，其中，該鹽類為醋酸銨、氯
化銨、氯化鈉或碳酸氫銨。藉此，本案可以適用於各類型之待測樣品，達成「提升帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物之萃取效率」功效。
本案肉鹼類化合物的分析方法，其中，該偵檢器係為質荷比偵檢器或螢光偵檢器。本案藉由使用質荷比偵檢器，而能夠達成「降低偵測極限及提升靈敏度」功效；另藉由使用螢光偵檢器，可以達成「降低分析儀器成本」之功效。
依據上述，本案針對羧酸基團的快速衍生方法，藉由4-溴甲基聯苯及乙腈之添加，可以使該羧酸化合物與該4-溴甲基聯苯進行衍生反應，而使該羧酸化合物帶有螢光發射基團，達成「使該羧酸化合物適用於螢光偵檢器」功效。同時，由於該羧酸化合物與該4-溴甲基聯苯進行衍生反應，而使該羧酸化合物甲基聯苯基團，能夠改變該羧酸化合物之極性，延長其於逆相層析管柱之滯留時間，達成「使該羧酸化合物適用於逆相層析管柱」功效。
並且，本案針對羧酸基團的快速衍生方法，藉由將該衍生溶液置於80~100℃下3~13分鐘，可以促進衍生反應之進行，達成「縮短衍生反應所需時間」功效。
此外，本案針對羧酸基團的快速衍生方法，另藉由於該衍生溶液中添加該鹼劑，可以提供合適之鹼性環境，促進SN2反應之進行，達成「提升衍生反應效率」功效。
本案肉鹼類化合物的分析方法，確實能夠以該逆相層析管柱配合該偵檢器測得該肉鹼類化合物之訊號，達成「檢測該待測樣品中肉鹼類化合物」功效。
此外，本案肉鹼類化合物的分析方法，藉由使該肉鹼類化合物進行衍生反應而帶有螢光發射基團，而能夠配合螢光偵檢器使用，進而達成「降低分析儀器成本」之功效。或者，本案肉鹼類化合物的分析方法，
藉由使用質荷比偵檢器，而能夠達成「降低偵測極限及提升靈敏度」功效。
再且，本案肉鹼類化合物的分析方法，另藉由萃取帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物，而能夠提升帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物的濃度，進而達成「提升該肉鹼類化合物之偵測靈敏度」功效。
第1a圖：係肉鹼之化學結構圖。
第1b圖：係乙醯肉鹼之化學結構圖。
第1c圖：係丁基甜菜鹼之化學結構圖。
第1d圖：係4-溴甲基聯苯之化學結構圖。
第2圖：係4-溴甲基聯苯與肉鹼及乙醯肉鹼進行衍生反應之反應式。
第3圖：係第A11~A16及A21~A26組之峰面積比長條圖。
第4圖：係第B11~B16及B21~B26組之峰面積比長條圖。
第5圖：係第C10~C13及C20~C23組之峰面積比長條圖。
第6圖：係第C11及C21組於80℃下3~13分鐘之峰面積比長條圖。
第7圖：係第C11及C21組於90℃下3~13分鐘之峰面積比長條圖。
第8圖：係第C11及C21組於100℃下3~13分鐘之峰面積比長條圖。
第9圖：係第E11~E16及E21~E26組之峰面積比長條圖。
第10圖：係第F11~F16及F21~F26組之峰面積比長條圖。
第11圖：係第G10~G14及G20~G24組之峰面積比長條圖。
第12圖：係第H10~H14及H20~H24組之峰面積比長條圖。
為讓本發明之上述及其他目的、特徵及優點能更明顯易懂，下文特舉本發明之較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下：
本發明係關於一種針對羧酸基團的快速衍生方法，詳言之，
係針對一羧酸化合物進行衍生反應。該羧酸化合物係指具有至少一個羧酸基團之化合物，例如可以為醋酸、苯甲酸、肉鹼(如第1a圖所示)、乙醯肉鹼(如第1b圖所示)或丁基甜菜鹼(如第1c圖所示)等，係為本發明所屬技術領域之通常知識者可以理解。
本發明係之針對羧酸基團的快速衍生方法包含提供一衍生溶液，該衍生溶液包含4-溴甲基聯苯(4-bromomethylbiphenyl，如第1d圖所示)、乙腈(acetonitrile)及該羧酸化合物，並將該衍生溶液置於80~100℃下3~13分鐘以進行衍生反應，以使該羧酸化合物帶有甲基聯苯基團。
於該衍生溶液中，4-溴甲基聯苯以聯苯作為螢光發射基團，並以溴甲基作為反應基團。該羧酸化合物之羧酸基團會於中性或鹼性環境下去質子化(deprotonation)作為親核性試劑，與4-溴甲基聯苯之溴甲基進行SN2反應，使甲基聯苯基團接合於該羧酸化合物之羧酸基團。而乙腈係為一種極性非質子性溶劑(polar aprotic solvent)，可以促進SN2反應之進行。以肉鹼及乙醯肉鹼為例，上述衍生反應之反應式係如第2圖所示。
於形成該衍生溶液時，可以同時混合4-溴甲基聯苯、乙腈及該羧酸化合物；或者，另可以先將4-溴甲基聯苯及該羧酸化合物分別溶於乙腈之中，以形成一4-溴甲基聯苯溶液及一羧酸化合物溶液，以便於進行溶液濃度及添加量之計算。例如，可以混合該羧酸化合物與乙腈以形成2μM之該羧酸化合物溶液，混合4-溴甲基聯苯及乙腈以形成2~35mM之該4-溴甲基聯苯溶液，續以20μl之該羧酸化合物溶液混合5μl之該4-溴甲基聯苯溶液以形成該衍生溶液。
本案研究過程中，發現並非所有螢光衍生試劑皆能夠與該羧酸化合物進行衍生反應。舉例而言，4-溴甲基-6,7-二甲氧基香豆素(4-bromomethyl-6,7-dimethoxycoumarin)、3-(溴乙醯基)香豆素(3-(bromoacetyl)coumarin)及二甲氨基萘磺醯氯(dansyl chloride)等螢光
衍生試劑無法與該羧酸化合物進行衍生反應。此外，並非所有極性非質子性之溶劑皆能夠加速SN2反應，例如丙酮(acetone)及二甲基亞碸(dimethylsulfoxide)等試劑皆不適用於本案。
此外，本案藉由額外提供熱量，可以加速反應之進行。於本實施例中，係以80~100℃之溫度，加熱3~13分鐘。更詳言之，於80℃下加熱9分鐘，或於90~100℃下加熱7分鐘，即可以迅速完成上述衍生反應。在避免溶劑蒸發之前提下，係能夠依據使用容器之受熱狀況，調整加熱時間。
由於該羧酸化合物之羧酸基團於鹼性環境下更容易去質子化，因此，該衍生溶液另可以包含一鹼劑。該鹼劑可以為氫氧化鉀、碳酸鉀或碳酸氫鉀等可以溶於乙腈之鹼性化合物，較佳係為氫氧化鉀，可以提供合適之鹼性，以獲得最佳之衍生效率。
此外，該鹼劑係可以直接與4-溴甲基聯苯、乙腈及該羧酸化合物混合；或者，同上所述，可以先將該鹼劑分別溶解於適量乙腈中以形成一鹼劑溶液，續與4-溴甲基聯苯及該羧酸化合物混合之。例如，混合該羧酸化合物與乙腈以形成2μM之該羧酸化合物溶液，混合4-溴甲基聯苯及乙腈以形成2~35mM之該4-溴甲基聯苯溶液，混合該鹼劑及乙腈以形成一飽合鹼劑溶液，及混合20μl之該羧酸化合物溶液、5μl之該4-溴甲基聯苯溶液與2μl之該飽合鹼劑溶液以形成該衍生溶液。
依據上述，本案針對羧酸基團的快速衍生方法，藉由選擇4-溴甲基聯苯作為衍生試劑，搭配乙腈作為溶劑，並以80~100℃之溫度加熱3~13分鐘以提供額外之熱量，能夠快速有效地使該羧酸化合物之羧酸基團接合甲基聯苯基團。藉此，該羧酸化合物能夠具有螢光發射基團，而可以被螢光偵檢器偵測之；另藉由接合甲基聯苯基團之接合，可以降低該羧酸化合物之極性，以利於後續之分析，例如可以延長於逆向層析管柱中
的滯留時間。再且，藉由於該衍生溶液中添加該鹼劑，可以進一步提升該衍生反應之效率。
本案另關於一種針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法，係用以萃取一四級胺化合物。詳言之，該四級胺化合物係為具有至少一四級胺結構之化合物，例如6-三甲基離氨酸(6-trimethyllysine)。此外，該四級胺化合物另可以具有羧酸基團，例如肉鹼、乙醯肉鹼、丁基甜菜鹼等，並可以先經過前述衍生反應而成為四級胺化合物之衍生物。
本案針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法，包含提供一分析溶液，該分析溶液包含一分析樣品及乙腈，該分析樣品包含一四級胺化合物，於該分析溶液中加入甲苯與一水性溶劑以形成一萃取溶液，震盪該萃取溶液，使該萃取溶液形成霧化狀態，離心霧化狀態之該萃取溶液，至該萃取溶液分層為水相及有機相，及抽取該萃取溶液之水相。
該分析樣品則為包含該四級胺化合物之混合物，且可以預先經離心、乾燥等前處理。續進行萃取。該水性溶劑則可以為水、去離子水或一鹽類水溶液。
本案使用水性溶劑分散液液微萃取法(aqueous solvent dispersive liquid-liquid microextraction，簡稱ASDLLME)，為液液微萃取法之改良，適用於高極性之樣品，其萃取系統中包含分散劑、輔助劑及萃取劑。分散劑必須與輔助劑及萃取劑皆能夠互溶，用以溶解樣品；而萃取劑則為水性溶劑，以將樣品萃取至水性溶劑中。此外，萃取系統中需加入輔助劑，輔助劑為低密度且和萃取劑不互溶之有機溶劑，其於震盪後，會幫助萃取劑形成微小液滴分散於樣品中，產生霧化現象，以增加萃取劑與樣品之接觸面積。輔助劑另可以幫助分層，且由於輔助劑之密度小於水，故於離心之後，水相會分布於底層，方便抽取。
更詳言之，由於該四級胺化合物具有高極性，故本案以乙腈
作為分散劑，其係為極性有機溶劑。並以該水性溶劑作為萃取劑，其極性較乙腈更高，故於萃取後能夠使該四級胺化合物轉而分布於水相。此外，本案以甲苯作為輔助劑，使該萃取溶液於震盪後發生霧化現象，提升萃取效率，並於離心時幫助分層。離心後，抽取該萃取溶液之水相，即包含該四級胺化合物。
本案針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法適用於較小體積之樣品，例如為1μl~1ml之體積，且能夠於容積為1.5~10ml之離心管中進行，並以微量吸液管抽取水相。例如，係能夠以27μl之該分析溶液混合55~105μl之甲苯與5~15μl之該水性溶劑；或者，較佳以27μl之該分析溶液混合85μl之甲苯與5μl之該水性溶劑。本實施例中，較佳係使用去離子水，或以去離子水製備該鹽類水溶液，可以避免水中其他雜質造成污染。
本案於研究過程中，另嘗試數種低密度之有機溶媒作為輔助劑，例如嘗試使用乙酸乙酯或正己烷。惟，以酸乙酯會導致該萃取溶液無法分層；而正己烷則會使該萃取溶液分為三層，產生二個不互溶之界面。
此外，當該水性溶劑為該鹽類水溶液時，可以藉由鹽類解離後之離子特性，以幫助該四級胺化合物之萃取。舉例而言，該鹽類水溶液可以為醋酸銨水溶液、氯化銨水溶液、氯化鈉水溶液或碳酸氫銨水溶液等，且當該分析樣品為血液樣品時，該鹽類水溶液較佳為醋酸銨水溶液。此外，該鹽類水溶液之濃度較佳為1M。
依據上述，本案針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法，藉由將該四級胺化合物溶於乙腈中，選擇甲苯作為輔助劑，以及以該水性溶劑做為萃取劑，可以有效將該四級胺化合物萃取至水相，以利於後續分析、檢測之進行。此外，選擇該鹽類水溶液作為該水性溶劑，係能夠進一步提升萃取效率。
本案另關於一種肉鹼類化合物的分析方法，所述肉鹼類化合物係指具有與肉鹼類似結構之化合物，此類化合物應包含至少一羧酸基團及至少一四級胺結構。例如，該肉鹼類化合物可以為肉鹼、醯基肉鹼或丁基甜菜鹼，所述醯基肉鹼包含但不限於乙醯肉鹼、丙醯肉鹼(propionyl-L-carnitine)、丁醯肉鹼(butyryl-L-carnitine)、異戊醯肉鹼(isovaleryl-L-carnitine)、己醯肉鹼(hexanoyl-L-carnitine)、辛醯肉鹼(octanoyl-L-carnitine)、癸醯肉鹼(decanoyl-L-carnitine)、月桂醯肉鹼(lauroyl-L-carnitine)、肉豆蔻醯肉鹼(myristoyl-L-carnitine)、棕櫚醯肉鹼(palmitoyl-L-carnitine)及硬脂醯肉鹼(stearoyl-L-carnitine)。
本案之肉鹼類化合物的分析方法，係將包含該肉鹼類化合物之一待測樣品，經本案前述針對羧酸基團的快速衍生方法進行衍生反應，使該肉鹼類化合物帶有該甲基聯苯基團，續以本案前述針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法萃取該帶有甲基聯苯基團之肉鹼類化合物，而後，以一逆向層析管柱配合一偵檢器分析之。
詳言之，由於該肉鹼類化合物包含羧酸基團及四級胺結構，故該肉鹼類化合物可以進行上述衍生反應以帶有甲基聯苯基團，並且具有類似之極性，而可以藉由上述針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法進行萃取。藉由甲基聯苯基團之接合，可以改變該肉鹼類化合物之極性，使該肉鹼類化合物能夠由逆相層析管柱分離，進而能夠由該偵檢器分析之。
該待測樣品係包含一或數種該肉鹼類化合物，並且可以同時進行衍生反應、萃取及後續分析，以簡化分析流程並提升分析效率。該待測樣品可以為藥物、針劑、化妝品、食品或血液樣品等，且可以預先進行合適之前處理，例如離心或乾燥等。當該分析樣品為血液時，可以預先將血液離心以取得血漿，加入丙酮等蛋白質沉澱劑，續再次離心取上清液乾
燥，而後再進行上述衍生反應。
更詳言之，首先將該待測樣品混合4-溴甲基聯苯及乙腈，以形成一待測溶液，將該待測溶液置於80~100℃下3~13分鐘進行衍生反應以獲得一反應溶液，該反應溶液中即包含帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物。同上所述，另可以於該待測溶液中加入該鹼劑。衍生反應之原理、該鹼劑之選擇及加熱溫度等皆與本案前述針對羧酸化合物的快速衍生方法相同，於此不再贅述。
而後，係可以直接於該反應溶液中加入甲苯與該水性溶劑，以形成一分散溶液，並進行萃取。另可以選擇該鹽類水溶液作為該水性溶劑，以提升萃取效率。萃取之原理及過程係與前述針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法相同。抽取該分散溶液之水相，即包含帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物。
接著，係以該逆向層析管柱搭配該偵檢器，檢測該分散溶液之水相。舉例而言，該逆向層析管柱係可以選用搭配窄管式液相層析儀或奈米化液相層析儀等高壓液相層析系統。另可以適當稀釋該分散溶液之水相，或進行極性之調整，以及加入內標準品，再加入該逆向層析管柱中。於本實施例中，係將該分散溶液之水相加入甲醇，並加入9-氨基吖啶作為內標準品續抽取適量注入該逆向層析管柱中，以窄管式液相層析儀分析之。並且，為配合該肉鹼類化合物之極性，係選用0.2%之甲酸水溶液搭配甲醇進行梯度沖提。
此外，該偵檢器係可以為質荷比偵檢器，其偵測極限低且靈敏度高；或者，由於該肉鹼類化合物已經過衍生反應，而帶有甲基聯苯基團，故可以使用螢光偵檢器偵測之。於本實施例中，經實驗測定，該肉鹼類化合物之最大激發波長係為255nm，而最大發射波長係為317nm。
依據上述，本案肉鹼類化合物的分析方法，藉由將該待測樣
品中之肉鹼類化合物進行衍生反應，使該肉鹼類化合物帶有甲基聯苯基團，續萃取該肉鹼類化合物至水相中，而能夠使用逆相層析管柱及該偵檢器檢測該分析樣品中所包含之該肉鹼類化合物，並且可以同時對數種肉鹼類化合物進行定量，且可以應用於藥錠、針劑、化妝品及血液樣品。此外，本案藉由使用質荷比偵檢器，可以降低偵測極限並提高靈敏度；另藉由使用螢光偵檢器，可以降低分析儀器設備之價格。
為證實本案針對羧酸基團的快速衍生方法確實可以使該羧酸化合物之羧酸基團接合甲基聯苯基團；本案針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法確實能夠將該四級胺化合物萃取至該萃取溶液之水相中；且本案肉鹼類化合物的分析方法確實可以檢測該待測樣品中所包含之肉鹼類化合物，遂進行下述實驗：
(A)4-溴甲基聯苯濃度對衍生反應之影響
本實驗係以肉鹼(第A11~A16組)及乙醯肉鹼(第A21~A26組)作為該羧酸化合物/肉鹼類化合物，以配製該衍生溶液/待測溶液。其中，各組別之肉鹼、乙醯肉鹼及4-溴甲基聯苯濃度係如下第1表所示。
將上述第A11~A16及A21~A26組進行衍生反應後，續加入甲苯及水進行萃取，並於水相中加入9-氨基吖啶作為內標準品，以窄管式液相層析儀配合螢光偵檢器進行逆相層析。以各組之峰面積對照標準品之峰面積計算峰面積比，記錄如第3圖所示。
由第3圖可知，各組皆能夠進行衍生反應，並能夠經該逆相層析管柱及該偵檢器偵測之。此外，第A11~A14及第A21~A24組之中，隨著4-溴甲基聯苯濃度上升，衍生反應之效率亦隨之提高。而當4-溴甲基聯苯之濃度達到3mM(第A14、A24組)以上時，則無法再提升衍生反應之效率。因此，本案該衍生溶液/待測溶液中較佳係包含1.6μM之該羧酸化合物/肉鹼類化合物；且該衍生溶液/待測溶液中較佳包含0.4~7mM之4-溴甲基聯苯，最佳包含3mM之4-溴甲基聯苯。
(B)4-溴甲基聯苯添加量對衍生反應之影響
本實驗同樣以肉鹼(第B11~B16組)及乙醯肉鹼(B21~B26組)作為該羧酸化合物/肉鹼類化合物，並預先以2μM之濃度溶解於乙腈中，分別配製為肉鹼、乙醯肉鹼之乙腈溶液。另取4-溴甲基聯苯溶以15mM之濃度溶於乙腈中，配製4-溴甲基聯苯之乙腈溶液。以如下第2表所示之肉鹼、乙醯肉鹼之乙腈溶液及4-溴甲基聯苯之乙腈溶液添加量，分別配製第B11~B16組及第B21~B26組之該衍生溶液/待測溶液。
將上述第B11~B16及B21~B26組進行衍生反應後，續加入甲苯及水進行萃取，並於水相中加入9-氨基吖啶作為內標準品，以窄管式液相層析儀配合螢光偵檢器進行逆相層析。以各組之峰面積對照標準品之峰面積計算峰面積比，記錄如第4圖所示。
由第4圖可知，各組皆能夠進行衍生反應，並能夠經該逆相層析管柱及該偵檢器偵測之。其中，又以加入5μl上述4-溴甲基聯苯之乙腈溶液(第B12及B22組)，可以提供最佳之衍生反應效率。推測係由於5μl上述4-溴甲基聯苯之乙腈溶液即已提供足量之衍生試劑，而隨4-溴甲基聯苯之乙腈溶液體積增加，整體反應系統之體積亦增大，而導致碰撞效率降低，使衍生反應之效率下降。
(C)該鹼劑種類對衍生反應效率之影響
取上述(B)實驗所述肉鹼之乙腈溶液、乙醯肉鹼之乙腈溶液及4-溴甲基聯苯之乙腈溶液，另取氫氧化鉀、碳酸鉀及碳酸氫鉀作為該鹼劑，分別溶於乙腈中至飽和濃度，配製各鹼劑之乙腈溶液。取20μl上述肉鹼之乙腈溶液混合5μl上述4-溴甲基聯苯之乙腈溶液，另加入2μl各鹼劑之乙腈溶液作為第C10~C13組；及取20μl上述乙醯肉鹼之乙腈溶液混合5μl上述4-溴甲基聯苯之乙腈溶液，加入2μl各鹼劑之乙腈溶液作為第
C20~C23組，各組之鹼劑種類係如下第3表所示。
將上述第C10~C13及C20~C23組進行衍生反應後，續加入甲苯及水進行萃取，並於水相中加入9-氨基吖啶作為內標準品，以窄管式液相層析儀配合螢光偵檢器進行逆相層析。以各組之峰面積對照標準品之峰面積計算峰面積比，記錄如第5圖所示。
由第5圖可知，各組皆能夠進行衍生反應，並能夠經該逆相層析管柱及該偵檢器偵測之。其中，又以第C11及C21組之衍生反應效率最佳。顯示加入氫氧化鉀作為該鹼劑，可以提供適當之鹼性環境以輔助SN2反應之進行，進而提供最佳之衍生反應效率。
(D)加熱溫度及時間對衍生反應效率之影響
取上述第C11及C21組，分別以不同之加熱溫度及時間進行衍生反應後，續加入甲苯及水進行萃取，並於水相中加入9-氨基吖啶作為內標準品，以窄管式液相層析儀配合螢光偵檢器進行逆相層析。以各組之峰面積對照標準品之峰面積計算峰面積比，記錄如第6~8圖所示：於80℃下加熱3、5、7、9、11、13分鐘，記錄為第6圖；於90℃下加熱3、5、7、9、11、13分鐘，記錄為第7圖；及於100℃下加熱3、5、7、9、11、13分鐘，記錄為第8圖。
由第6~8圖可知，各組皆能夠進行衍生反應，並能夠經該逆相層析管柱及該偵檢器偵測之。其中，於80℃下，加熱9分鐘以上即能夠達到最佳效率；於90~100℃下加熱7分鐘以上即能夠達到最佳效率。
(E)甲苯體積對萃取之影響
取上述第C11、C21組作為該分析溶液/反應溶液，以進行
萃取。如上所述，第C11、C21組之體積皆為27μl。第C11組包含帶有甲基聯苯基團之肉鹼，第C21組包含帶有甲基聯苯基團之乙醯肉鹼，以作為該四級胺化合物/帶有甲基聯苯之該肉鹼類化合物。於C11組添加等量去離子水及不同體積之甲苯以作為第E11~E16組；另於第C21組添加等量去離子水及不同體積之甲苯以作為第E21~E26組，各組之去離子水及甲苯添加量係如下第4表所示。
第E11~E16及E21~E26組分別震盪霧化後，續離心並抽取水相，加入9-氨基吖啶作為內標準品，以窄管式液相層析儀配合螢光偵檢器進行逆相層析。以各組之峰面積對照標準品之峰面積計算峰面積比，記錄如第9圖所示。
由第9圖可知，各組皆能夠進行萃取，並能夠經該逆相層析管柱及該偵檢器偵測之。於第E11~E14及E21~E24組中，隨著甲苯體積上升，由於可以使萃取劑良好地分散於萃取系統中，而使萃取效率上升。惟，當甲苯體積大於85μl後，則不再對萃取效率造成影響，故係以每27μl
之該分析溶液/反應溶液混合5μl之水與85μl之甲苯為最佳。
(F)水添加量對萃取之影響
取上述第C11、C21組作為該分析溶液/反應溶液，以進行萃取。如上所述，第C11、C21組之體積皆為27μl。第C11組包含帶有甲基聯苯基團之肉鹼，第C21組包含帶有甲基聯苯基團之乙醯肉鹼，以作為該四級胺化合物/帶有甲基聯苯之該肉鹼類化合物。於C11組添加等量甲苯及不同體積之去離子水以作為第F11~F16組；另於第C21組添加等量甲苯及不同體積之去離子水以作為第F21~F26組，各組之去離子水及甲苯添加量係如下第5表所示。
第F11~F16及F21~F26組分別震盪霧化後，續離心並抽取水相，加入9-氨基吖啶作為內標準品，以窄管式液相層析儀配合螢光偵檢器進行逆相層析。以各組之峰面積對照標準品之峰面積計算峰面積比，記錄如第10圖所示。
由第10圖可知，各組皆能夠進行萃取，並能夠經該逆相層
析管柱及該偵檢器偵測之。當該水性溶劑之添加量在5~15μl時，皆能夠產生霧化現象；惟該水性溶劑之添加量越小，能夠產生較高的濃縮效率，而使峰面積比上升。然而，當該水性溶劑之添加量小於5μl時，則會導致水相難以抽取，故最佳係以每27μl之該分析溶液/反應溶液混合5μl之該水性溶劑與85μl之甲苯。
(G)該鹽類水溶液之種類對萃取之影響
取上述第C11、C21組作為該分析溶液/反應溶液，以進行萃取。如上所述，第C11、C21組之體積皆為27μl。第C11組包含帶有甲基聯苯基團之肉鹼，第C21組包含帶有甲基聯苯基團之乙醯肉鹼，以作為該四級胺化合物/帶有甲基聯苯之該肉鹼類化合物。於C11組添加85μl之甲苯及1M鹽類水溶液5μl以作為第G10~G14組；另於第C21組添加85μl之甲苯及1M鹽類水溶液5μl以作為第G20~G24組，各組之鹽類種類係如下第6表所示。
第G10~G14及G20~G24組分別震盪霧化後，續離心並抽取水相，加入9-氨基吖啶作為內標準品，以窄管式液相層析儀配合螢光偵檢器進行逆相層析。以各組之峰面積對照標準品之峰面積計算峰面積比，記錄如第11圖所示。
由第11圖可知，各組皆能夠進行萃取，並能夠經該逆相層析管柱及該偵檢器偵測之。其中，又以第G10、G20組之去離子水(無鹽類添加)最佳，第G11、G21組之醋酸銨水溶液次之。
(H)該鹽類水溶液之種類對血液樣品萃取之影響
取人體血液樣品經離心抽取上清液，並加入蛋白質沉澱劑去
除蛋白質後，溶於乙腈中並分別加入肉鹼(第H10~H14組)、乙醯肉鹼(第H20~H24組)及丁基甜菜鹼(第H30~H34組)，以4-溴甲基聯苯進行衍生反應。取等量經衍生反應之血液樣品，分別加入等量之甲苯，以及等量、不同種類之1M鹽類水溶液，各組之鹽類種類係如下第7表所示。
第H10~H14、H20~H24及H30~H34組分別震盪霧化後，續離心並抽取水相，加入9-氨基吖啶作為內標準品，以窄管式液相層析儀配合螢光偵檢器進行逆相層析。以各組之峰面積對照標準品之峰面積計算峰面積比，記錄如第12圖所示。
由第12圖可知，各組皆能夠進行萃取，並能夠經該逆相層析管柱及該偵檢器偵測之。其中，對於血液樣品而言，又以第H11、H21、H31組之醋酸銨水溶液最佳，第H12、H22、H32組之氯化銨水溶液次之。
(I)以質荷比偵檢器分析人類血漿檢品
取1μl血漿檢品，依據上述進行前處理、衍生反應及萃取，此處係以水做為萃取劑。於萃取後，續進行逆向管柱層析，並以質荷比偵檢器分析之，紀錄如下第8表。
第8表：血漿檢品分析結果
由第8表可知，本案肉鹼類化合物的分析方法確實能夠使用質荷比偵檢器，並同時偵測到人體內多達13種肉鹼類化合物。
依據上述實驗，可以證實本案針對羧酸基團的快速衍生方法，藉由4-溴甲基聯苯及乙腈之添加，確實可以使該羧酸化合物與該4-溴甲基聯苯進行衍生反應，而使該羧酸化合物帶有螢光發射基團，達成「使該羧酸化合物適用於螢光偵檢器」功效。同時，由於該羧酸化合物與該4-溴甲基聯苯進行衍生反應，而使該羧酸化合物甲基聯苯基團，能夠改變該羧酸化合物之極性，延長其於逆相層析管柱之滯留時間，達成「使該羧酸化合物適用於逆相層析管柱」功效。
並且，本案針對羧酸基團的快速衍生方法，藉由將該衍生溶
液置於80~100℃下3~13分鐘，可以促進衍生反應之進行，達成「縮短衍生反應所需時間」功效。
此外，本案針對羧酸基團的快速衍生方法，另藉由於該衍生溶液中添加該鹼劑，可以提供合適之鹼性環境，促進SN2反應之進行，達成「提升衍生反應效率」功效。
另依據上述實驗，可以證實本案針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法，藉由乙腈與水之添加，及以甲苯作為輔助劑，可以使該四級胺化合物自乙腈中轉而分散於該水性溶劑中，達成「自該分析樣品中萃取該四級胺化合物」功效。
此外，本案針對四級胺化合物之水性溶劑分散液液微萃取法，藉由以該鹽類水溶液作為該水性溶劑，係能夠透過鹽類於水中解離而提供之離子特性，適用於各類型之分析樣品，達成「提升該四級胺化合物之萃取效率」功效。
再且，依據上述實驗，可以證實本案肉鹼類化合物的分析方法，確實能夠以該逆相層析管柱配合該偵檢器測得該肉鹼類化合物之訊號，達成「檢測該待測樣品中肉鹼類化合物」功效。
此外，本案肉鹼類化合物的分析方法，藉由使該肉鹼類化合物進行衍生反應而帶有螢光發射基團，而能夠配合螢光偵檢器使用，進而達成「降低分析儀器成本」之功效。或者，本案肉鹼類化合物的分析方法，藉由使用質荷比偵檢器，而能夠達成「降低偵測極限及提升靈敏度」功效。
本案肉鹼類化合物的分析方法，另藉由萃取帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物，而能夠提升帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物的濃度，進而達成「提升該肉鹼類化合物之偵測靈敏度」功效。
雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述
實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
Claims (12)
- 一種針對羧酸基團的快速衍生方法，係包含：提供一衍生溶液，該衍生溶液包含4-溴甲基聯苯、乙腈及一羧酸化合物，該羧酸化合物帶有羧酸基團；及將該衍生溶液置於80~100℃下3~13分鐘進行衍生反應，使4-溴甲基聯苯與該羧酸化合物之羧酸基團反應，形成帶有甲基聯苯基團之該羧酸化合物。
- 如申請專利範圍第1項所述之針對羧酸基團的快速衍生方法，其中，該衍生溶液另包含一鹼劑。
- 如申請專利範圍第2項所述之針對羧酸基團的快速衍生方法，其中，該鹼劑為氫氧化鉀、碳酸鉀或碳酸氫鉀。
- 如申請專利範圍第1項所述之針對羧酸基團的快速衍生方法，其中，該衍生溶液包含0.4~7mM之4-溴甲基聯苯。
- 如申請專利範圍第1項所述之針對羧酸基團的快速衍生方法，其中，該衍生溶液包含1.6μM之該羧酸化合物。
- 如申請專利範圍第1項所述之針對羧酸基團的快速衍生方法，其中，係將該衍生溶液置於90~100℃下7分鐘進行衍生反應。
- 一種肉鹼類化合物的分析方法，係包含：提供一待測溶液，該待測溶液包含4-溴甲基聯苯、乙腈及一待測樣品，該待測樣品包含一肉鹼類化合物；將該待測溶液於80~100℃下3~13分鐘進行衍生反應以獲得一反應溶液，使4-溴甲基聯苯與該肉鹼類化合物之羧酸基團反應，形成帶有甲基聯苯基團之該肉鹼類化合物；於該反應溶液中加入甲苯與一水性溶劑，以形成一分散溶液，該水性溶劑係為水、去離子水或一鹽類水溶液； 震盪該分散溶液，使該分散溶液形成霧化狀態；離心霧化狀態之該分散溶液，至該分散溶液分層為水相及有機相；抽取該分散溶液之水相；及以一逆向層析管柱配合一偵檢器偵測該分散溶液之水相。
- 如申請專利範圍第7項所述之肉鹼類化合物的分析方法，其中，該待測溶液另包含一鹼劑。
- 如申請專利範圍第8項所述之肉鹼類化合物的分析方法，其中，該鹼劑為氫氧化鉀、碳酸鉀或碳酸氫鉀。
- 如申請專利範圍第7項所述之肉鹼類化合物的分析方法，其中，係將該待測溶液置於90~100℃下7分鐘進行衍生反應。
- 如申請專利範圍第7項所述肉鹼類化合物的分析方法，其中，該鹽類水溶液為醋酸銨水溶液、氯化銨水溶液、氯化鈉水溶液或碳酸氫銨水溶液。
- 如申請專利範圍第7項所述之肉鹼類化合物的分析方法，其中，該偵檢器係為質荷比偵檢器或螢光偵檢器。
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